Мониторинг циркуляции вирусов гриппа в регионах России в 2006-2010 гг.

Трушакова, Светлана Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Мониторинг циркуляции вирусов гриппа в регионах России в 2006-2010 гг.
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Мониторинг циркуляции вирусов гриппа в регионах России в 2006-2010 гг."

На правах рукописи

004Ь1Ь£1?

ТРУШАКОВА СВЕТЛАНА ВИКТОРОВ! 1Л

МОНИТОРИНГ ЦИРКУЛЯЦИИ ВИРУСОВ ГРИППА В РЕГИОНАХ РОССИИ в 2006-2010 гг.

03.02.02 - вирусологии

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-9ЯЕи т

Москва-2010

004616219

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минестерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор биологических наук Иванова Валерия Тимофеевна Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Мезенцева Марина Владимировна доктор медицинских наук Маркушин Станислав Георгиевич

Ведущая организация:

ФГУ ГИСК им. Л.А.Тарасевича Минздравсоцразвития РФ, г. Москва

Защита состоится «_» декабря 2010 года в_часов на заседании Диссертационного

Совета Д.001.020.01 в ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития РФ по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития РФ

Автореферат разослан «_» ноября 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор медицинских наук

Б.И. Бурцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Грипп и острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) остаются одной из самых актуальных медицинских и социально экономических проблем. Грипп является опасной высококонтагиозной инфекцией, распространенной по всему миру и вызывающей заболевания у человека, многих видов млекопитающих и птиц. Во время эпидемии заболевает не менее 20-30% детей и 5-10 % взрослого населения, при пандемии - до 40-60% (Potter C.W., 1998; Slepushkin A.N. et al., 2004; Гендон Ю.З., 2007). Основная причина этого связана со способностью вируса гриппа преодолевать иммунитет, вызванный предшествующей гриппозной инфекцией или вакцинацией, благодаря естественной изменчивости генома возбудителя (Wilson I.A., Сох N., 1990; Гендон Ю.З., 2008).

Реассортация генов вирусов гриппа человека, птиц и свиней, последующая реассортация вирусов гриппа свиней американской и евроазиатской генетических линий (WHO, 2009; Morens et al., 2009) привела к возникновению нового вируса A(HlNl)v, его активному распространению среди людей в странах разных континентов. Это вынудило экспертов ВОЗ объявить в июне 2009г. о начале новой пандемии XXI века. Благодаря современному транспортному сообщению, произошло быстрое проникновение вирусов в Российскую Федерацию из других стран. В России первый пандемический вирус гриппа был выделен в мае 2009г. от больного, вернувшегося из США, уже через два месяца после обнаружения первого случая заболевания в мире (Львов Д.К. и др., 2009). Развитие пандемического процесса в России вызвало необходимость проведения исследований по изоляции и изучению молекулярно-биологических свойств пандемических штаммов из разных регионов.

Распространение высокопатогенного вируса гриппа A(H5N1) среди дикой и домашней птицы, а также регистрация случаев инфицирования этим вирусом людей (Сох N., 2003; WHO, 2005; Webster R.G.&Govorkova Е„ 2006) также может привести к возникновению антигенного варианта вируса гриппа - нового потенциального кандидата в пандемические штаммы (Львов Д.К. и др., 2004; Webster R.G. et al., 2006; WER, 2008; MMWR, 2009). Быстрое проникновение вирусов гриппа A(H5N1) в нашу страну обусловлено соседством России со странами, где выделено большинство таких штаммов (WHO, 2010).

В связи с этим крайне важными направлениями борьбы с гриппом являются надзор за распространением инфекции, своевременная диагностика возбудителя и профилактика заболевания. Степень защищенности человеческой популяции зависит от возможности прогнозирования появления кардинально новых в антигенном отношении вирусов гриппа.

Для характеристики возбудителей проводятся вирусологические и серологические исследования. Выделение, типирование, изучение различных свойств современных циркулирующих штаммов вирусов гриппа позволяет определить направление антигенной изменчивости вирионных белков, установить эволюционные связи с ранее циркулировавшими эпидемическими и эталонными штаммами. Изучение динамики популяционного иммунитета в зависимости от периода эпидемического цикла показывает степень защиты населения к циркулирующим эпидемическим вирусам гриппа.

Данные об эпидемических актуальных штаммах необходимы как для расшифровки причин текущих и прогнозирования грядущих эпидемий, так и для проведения профилактических и противоэпидемических мероприятий, в том числе - подбора кандидатов в вакцинные штаммы и при разработке диагностических препаратов.

В настоящее время для выявления и идентификации вирусов широко используют молекулярные методы, специфичность которых основана на уникальности нуклеотидных последовательностей вирусных геномов (leven М., 2007, Kesson A.M., 2007). Наиболее распространенными методами являются различные модификации полимеразной цепной реакции (ПЦР). В настоящее время в России стали активно разрабатывать тест-системы на основе ПЦР для выявления вирусов гриппа и других ОРВИ. Сравнение чувствительности и специфичности, оценка способности этих систем выявлять вирусы гриппа в различных биологических образцах с учетом особенностей современного периода позволит усовершенствовать надзор за гриппом. Кроме того, важным направлением исследований является разработка новых подходов для диагностики гриппозной инфекции.

Таким образом, совокупность вирусологических и серологических данных в сравнении с циркулирующими штаммами в мире позволит получать сведения о циркуляции и изменчивости вирусов гриппа на территории России.

Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования является изучение распространения, молекулярно-биологических и иммуногенных свойств эпидемических и пандемических штаммов вирусов гриппа, циркулировавших в разных регионах России с 2006 по 2010гг., а также усовершенствование лабораторной диагностики гриппа. Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

1. Изолировать и изучить антигенные и биологические свойства новых вариантов вирусов гриппа, циркулировавших в России в период 2006-2010 гг., определить их эволюционные связи с эталонными штаммами, рекомендованными ВОЗ в этот период.

2. Изучить изоляты пандемических штаммов вируса гриппа A(HlNl)v в России, определить их антигенные и молекулярно-биологические свойства.

3. Изучить чувствительность различных систем, используемых для изоляции (культура клеток MDCK и куриные эмбрионы (КЭ) и идентификации вирусов гриппа (эритроциты человека и кур), к эпидемическим и пандемическим штаммам, изолированным в период 2006-2010гг.

4. Определить влияние температурного воздействия на активность НА эпидемических и пандемических штаммов, изолированных в период 2006-2010гг. и обладающих разными антигенными свойствами.

5. Изучить состояние популяционного иммунитета населения к современным штаммам вирусов гриппа А и В в зависимости от периода эпидемического цикла.

6. Оценить возможность использования новых отечественных ПЦР тест-систем для мониторинга за современными эпидемическими и пандемическими штаммами вирусов гриппа.

7. Установить возможность использования метода поверхностного плазмонного резонанса для детекции нуклеиновых кислот и белков вирусов гриппа в растворах.

Научная новизна работы

-Впервые в России получены приоритетные данные: выявлены представители пандемического варианта вируса гриппа А(НШ1)у, антигенно родственного вирусу гриппа свиней. Установлено начало пандемического процесса в Российской Федерации в 2009г., обусловленного появлением на территории нашей страны пандемического штамма.

-На основании результатов вирусологических и серологических исследований определена этиологическая структура эпидемий гриппа в России с 2006г. по 2010г., установлена социркуляция вирусов гриппа А(НШ1), А(НЗК2) и В в течение всего периода.

-Впервые установлено появление в 2006г. штаммов вирусов гриппа А(НШ1), антигенно родственных новому эталону А/Соломоновы Острова/3/О6. Определена дальнейшая эволюция белков НА этих вирусов гриппа в направлении НА эталонного штамма А/Брисбен/59/07.

-Установлена эволюция вирусов гриппа А(НЗК2) в период с 2006 по 2009гг. Выявлена ежегодная смена антигенных вариантов, родственных новым эталонам А/Висконсин/67/05 и А/Брисбен/10/07.

-Впервые в России выявлены новые антигенные варианты, подобные В/Флорида/04/06 эволюционной линии В/Ямагата/16/88, при этом установлена социркуляция представителей двух эволюционных линий вирусов гриппа В в эпидемическом сезоне 2006-2007гг. и чередование циркуляции в следующие сезоны 2007-2008 и 2008-2010гг.

-Установлено, что системы изоляции КЭ и МИСК чувствительны к пандемическим штаммам вируса гриппа А(НШ1)у; культура клеток ЛТОСК продолжает оставаться приоритетной системой для изоляции эпидемических штаммов вирусов гриппа из носоглоточных смывов.

-Выявлена чувствительность эритроцитов человека 0(1) группы крови и кур к пандемическим штаммам А(НШ1)у и увеличение чувствительности эритроцитов кур к современным эпидемическим штаммам вирусов гриппа А(НШ1), А(НЗК2) и В, изолированным в период с 2006 по 2010гг.

-Впервые в России разработаны и апробированы 2 ПЦР тест-системы для идентификации и дифференциации Н1 и НЗ, N1 и N2 эпидемических штаммов вирусов гриппа А и эволюционных линий вирусов гриппа В.

-Впервые проведена детекция нуклеиновых кислот, комплексов вирусов гриппа с антителами в растворах методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием пленок полианилина в качестве элемента-сенсора.

Практическая значимость работы

Установлено, что начало пандемического процесса в Российской Федерации в конце мая 2009г. обусловлено появлением на территории нашей страны нового пандемического штамма вируса гриппа А(НШ1)у. По материалам диссертации подана заявка на изобретение №2009129374/10 «Штамм вируса гриппа А/ИУ-Мо5Сои</01/2009 (НШ1)5\у1 для разработки средств и методов биологической защиты» (дата подачи 30.07.2009г.). Решение о выдаче патента РФ на изобретение получено 15.09.2010г.

Полученные данные по идентификации и изучению особенностей вирусов гриппа, циркулировавших на территории России и за рубежом, а также по определению основных направлений эволюции гемагглютинина этих вирусов учитывались при прогнозировании эпидемий и отборе кандидатов в вакцинные штаммы. Результаты анализа антигенной структуры и биологических свойств циркулировавших штаммов вирусов гриппа включались в информационные материалы, отсылавшиеся в ВОЗ, НИИ гриппа, Роспотребнадзор Минздравсоцразвития РФ, базовые областные ТУ Роспотребнадзора и в их ФГУЗ «Центры гигиены и эпидемиологии».

В рамках сотрудничества с ВОЗ в штаб-квартиру ВОЗ в Женеве (Швейцария) и Всемирные справочные центры по гриппу в Лондоне (Англия) и Атланте (США) высылались ежегодные отчеты и наиболее актуальные отечественные штаммы, которые затем входили в состав коллекций вирусов этих центров.

В Государственную коллекцию вирусов депонированы оригинальные штаммы, которые определили новые этапы в распространении и изменчивости вирусов гриппа: 3 эпидемических штамма вирусов гриппа А/Москва/68/2007 (Н1Ш) (ГКВ№2610), А/Москва/40/2008 (НШ1) (ГКВ№2612), А/Москва/45/2007 (НЗШ) (ГКВ№2611); 82 пандемических штамма вирусов гриппа А(НШ1)у, полученных в соавторстве с сотрудниками НИИ вирусологии. Вирусы могут быть использованы в качестве кандидатов в вакцинные штаммы, а также для приготовления диагностикумов.

Обосновано применение культуры клеток 1УГОСК для изоляции современных эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В и КЗ - для пандемических штаммов, использование эритроцитов человека 0(1) группы крови при их индикации и идентификации.

Результаты анализа и апробации 10 отечественных ПЦР тест-систем позволяют рекомендовать их как эффективные и специфичные системы для мониторинга циркулирующих современных эпидемических и пандемических штаммов вирусов гриппа в дополнении к классическим методам. Внедрение этих тест-систем в лабораторную практику будет способствовать усовершенствованию лабораторной диагностики гриппа и повышению уровня надзора за гриппом в России.

Результаты исследования нуклеиновых кислот и комплексов антиген-антитело методом ППР могут быть использованы при разработке сенсорных систем для определения вирусов гриппа и противогриппозных антител в растворах.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В эпидемический период 2006-201 Orr. в России социркулировали вирусы гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В. Антигенный дрейф поверхностных белков НА происходил в направлении эталонных штаммов, рекомендованных ВОЗ.

2. Выявлена общая тенденция к увеличению тропизма эпидемических штаммов вирусов гриппа периода 2006-2009гг. к эритроцитам кур, по сравнению с предыдущими периодами наблюдения. Вирусы гриппа A(H1N1) и В сохраняют тропизм к системе изоляции КЭ, а вирусы гриппа A(H3N2) практически полностью утратили тропизм к КЭ.

3. С мая 2009г. в России установлен факт циркуляции представителей вирусов гриппа A(HlNl)v, вызвавших пандемию гриппа XXI века в мире. По антигенным свойствам эти штаммы близкородственны эталону A/California/07/09. Пандемические штаммы имеют ярко выраженный тропизм к эритроцитам кур и тканям КЭ и MDCK.

4. Отечественные ПЦР тест-системы, предназначенные для выявления фрагментов генов различных белков вирусов гриппа, могут быть использованы для мониторинга вирусов гриппа человека в вирусологических лабораториях.

5. Для обнаружения нуклеиновых кислот, вирусов и комплексов вирусов гриппа с антителами может быть применен метод ППР с использованием в составе сенсора пленок, содержащих полианилин.

Апробация работы

Результаты работ были представлены на международных симпозиумах и конференциях: Всероссийской научной конференции «Эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика вирусных инфекций» (Санкт-Петербург, 2005); IV, VII, VIII Российских конгрессов детских инфекционистов «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей» (Москва, 2005, 2008, 2009); Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006); International Conference Infections and digestive tract diseases (France, Paris, 2006); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); X International Symposium on Respiratory Viral Infections (Singapore, 2008); I, II, III Конференции молодых ученых НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (Москва, 2008, 2009, 2010); V Конференции молодых ученых с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008); IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008); Third European Influenza Conference (Vilamoura, Portugal, 2008); Пятом московском международном конгрессе «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009); XVI и XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009, 2010); II Научно-практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ» (Москва, 2009); ERS Annual Congress (Austria, Vienna, 2009); 14th Congress of the APSR and 3ri Joint Congress

of the APSR/ACCP (Korea, Seoul, 2009); Всероссийской научной конференции «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2009); Options for the Control of Influenza VII (Hong Kong SAR, China, 2010); Rusnanotech. Nanotechnology. Internationa] Forum (Москва, 2010); Всероссийская научно-практическая конференция «Вакцинология-2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней (Москва, 2010).

В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела экологии вирусов с Центром экологии и эпидемиологии гриппа и апробационного совета ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского 21 октября 2010г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 31 научная работа, в том числе 9 статей в реферируемых российских научных журналах, 1 заявка на патент и материалы докладов в сборниках российских и международных конгрессов и конференций.

Объем и струетура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 4 глав собственных исследований, их обсуждения и выводов. Список литературы включает 240 отечественных и зарубежных источников. Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста, включая 43 таблицы и 22 рисунка.

Ключевые слова: пандемические, эталонные, эпидемические штаммы, вирусы гриппа A, A(HlNl)v, В, куриные эмбрионы, MDCK, ОТ-ПЦР, ПЦР, ПЦР в реальном времени, иммунные сыворотки, популяционный иммунитет, поверхностный плазмонный резонанс.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Вирусы, сыворотки и носоглоточные смывы. В работе использовано 25 эталонных штаммов вирусов гриппа человека А и В, а также 2 эталонных штамма вируса гриппа свиней: А/свинья/Айова/15/30 и А/свинья/Висконсин/1/76, полученные из Государственной коллекции вирусов, из коллекции вирусов Центра экологии и эпидемиологии гриппа ФГУ НИИ вирусологии РАМН, а также из справочных центров ВОЗ. Исследовано 208 эпидемических штаммов вирусов гриппа человека А и В, циркулировавших в России в период с 1977г. по 2010г., из них A(H1N1) - 102 штамма, A(H3N2) - 64 штамма, В - 42 штамма; пандемических A(HlNl)v, изолированных в 2009-2010гг. - 96 штамма. Серологические исследования включали изучение сывороток (1145), полученных от доноров города Москвы за 3 эпидсезона с 2006 по 2010г. и доноров Приморья и ЕАО (сезон 20052006). Кроме того, в работе исследовали 1925 носоглоточных смывов для выявления РНК вирусов гриппа и других респираторных вирусов методом ПЦР и для дальнейшей изоляции штаммов вирусов гриппа в MDCK и КЭ. Носоглоточные смывы были получены от больных с диагнозом грипп и ОРВИ в период с 2006г. по 2010г. из 13 городов России.

ПЦР тест-системы, сорбенты и сиалилолигосахарнды. Для проведения ПЦР и ПЦР в реальном времени использовали коммерческие и в стадии разработки тест-системы (таб.2). В качестве сорбентов использовали производные полианилина ПАн-0 (основание), ПАННО и ПАн-ПАМПСК (соль ПАн и поли-(2-акриламидо-2-метил-1-пропан-сульфоновой кислоты ПАМПСК)) в виде порошков. Полимеры синтезированы д.х.н. Ивановым В.Ф. (Институт физической химии и электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН, Москва). Кроме того в работе использовали 9 синтетических сиалилолигосахаридов, коньюгированных на полиакриламиде, с молекулярным весом 1-2 мил. kDa, любезно предоставленных профессором, д.х.н. Бовиным Н.В. (Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва).

Изоляцию и культивирование вирусов проводили согласно рекомендациям ВОЗ, методу Davies et al., (1978) и методическим рекомендациям «Выделение вирусов в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация» (С.Пб, 2006). Носоглоточным смывом, а также секционным материалом (ткани легкого или бронхов) заражали 10-11 дневные куриные эмбрионы и культуру клеток MDCK. Заражение осуществляли в аллантоисную и амниогическую полость КЭ. Гемагглютинирукицую активность вирусов определяли в РГА по общепринятой методике, рекомендованной ВОЗ, с использованием 0,75% эритроцитов 0(1) группы крови человека.

Определение антигенной активности гемагглютинииа (НА) вирусов гриппа проводили в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с использованием референс-штаммов, а также приготовленных к ним сывороток и стандартных сывороток из диагностических наборов ВОЗ. Реакцию ставили по общепринятому методу, рекомендованному ВОЗ, и «Методам определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа» (28.09.2003 г.).

Термочувствительность поверхностных белков НА определяли по изменению гемагглютинирующего титра в РГА по отношению к исходной активности после прогревания вируссодержащей жидкости при 56°С в течение 60 мин.

Получение очищенных препаратов вирусов гриппа дифференциальным центрифугированием проводили в ультрацентрифуге L5-50, ротор Ti-35, v=25000o6./mhh., t=l4ac; очищали в градиенте концентрации сахарозы 10-50%, v=22000o6./mhh, ротор SW 27.1, t=l4ac. Вирус ресуспензировали в буфере STE (0,01М Tris-HCl, 0,1М NaCl, 0.001М ЭДТА; рН=7,4).

Изучение рецепторной специфичности поверхностных белков (ПА) проводили твердофазным иммуноферментным анализом (ТФА) с использованием панели синтетических сиалилолигосахаридов по методике (Gambaryan A.S. and Matrosovich M.N, 1992).

Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) осуществляли, руководствуясь инструкциями, предложенными в комплекте к тест-системам. Детекцию результатов реакции проводили электрофорезом в 2% агарозном геле. Гели фотографировали и анализировали, используя трансиллюминатор с ультрафиолетовым светом с длиной волны А=254 нм.

ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) проводили на приборе Rotor-Gene 6000 (Costar, Австралия). Температурные параметры ПЦР устанавливали в соответствии с предложенной инструкцией к тест-системе. Результаты реакции отслеживали на экране монитора компьютера в виде графиков.

Анализ нуклеотидных последовательностей генов НА проводили с помощью компьютерных программ BioEdit. 7.0.1.(Hall, 1999), MEGA_4xl_Beta3 (Kumar, Tamura, Nei, 2008), Vector NT18 («InforMax Inc.», США), а также интернет программы BLAST (NCBI, Национальный центр биотехнологической информации, США). Нуклеотидные последовательности генов НА были получены из банков данных GenBank (www.ncbi.nlrn.nih.gov) и ISD (Influenza Sequence Database, www.flu.lanl.gov).

Поверхностный плазменный резонанс (ППР) проводили, руководствуясь методическим пособием «Метод спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса для исследования физико-химических характеристик веществ на твердых подложках» (Райтман О.А., 2010), на базе Института физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН. Для ППР-измерений использовали спектрофотометр "Biosuplar-2" (Analytical-System, Германия) с лазерным диодом с длиной волны Х=670нм и выходной мощностью 0,2 мВт.

Статистическую обработку значений титров вирусов и титров антител у доноров проводили по методу Стьюдента, который включал вычисление показателей иммуногенности: средних геометрических титров вирусов, средних квадратичных отклонений согласно Белякову и др. (1981).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Антигенные свойства вирусов гриппа А и В, циркулировавших в России с 2006 по 2010гг.

Как показали исследования, период 2006-2010гг. был уникальный по составу возбудителей. В России социркулировали вирусы гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В. С целью расшифровки этиологии эпидемий гриппа и определения направления антигенного дрейфа в молекуле НА был проведен антигенный анализ свойств этих вирусов.

В период 2000-2006гг. в РФ как и в мире циркулировали вирусы гриппа A(H1N1), подобные А/Новая Каледония/20/99 (Иванова В.Т. и др., 2006, 2008). Ситуация резко изменилась в эпидсезоне 2006-2007гг., когда наряду со штаммами А/Новая Каледония/20/99-подобными началась циркуляция вирусов гриппа, родственных новому эталону А/Соломоновы Острова/3/О6. Эти вирусы отличались по структуре НА в 14 аминокислотных позициях. Отмечено появление штаммов, которые слабо взаимодействовали с сыворотками к обоим эталонам (<1/16-1/64 гомологичного титра), что указывало на дальнейшие дрейфовые изменения. В следующем эпидемическом сезоне 2007-2008гг. наблюдалась социркуляция штаммов, родственных эталонам А/Соломоновы Острова/3/О6 и А/Брисбен/59/07. Выявлено 2 штамма, слабо взаимодействовавших с сыворотками к обоим эталонам. В течение периода 2008-2009гг. регистрировали незначительную циркуляцию штаммов A(H1N1) на территории Приморья и Сибири, 45% из них были подобны вакцинному штамму А/Брисбен/59/07. При

этом 12 штаммов обладали значительными отличиями в структуре НА и взаимодействовали с иммунной сывороткой к этому эталону до 1/8-1/16 гомологичного титра.

Анализ вирусов гриппа A(H3N2), изолированных в период 2006-2009гг„ показал, что в молекуле НА идет активный антигенный дрейф. В эпидемическом сезоне 2006-2007гг. наблюдали социркуляцию вирусов гриппа, родственных эталонам А/Калифорния/7/04 и А/Висконсин/67/05. Следует отметить, что активность распространения вирусов A(H3N2) и A(H1N1) в РФ в этом сезоне была примерно одинаковой (рис.1), в отличие от некоторых стран Европы и Азии, где основными возбудителями гриппа были вирусы A(H3N2), подобные эталону А/Висконсин/67/2005 (WER, 2007, 10). В сезоне 2007-2008гг. популяция вирусов A(H3N2) в РФ также бьиа гетерогенна, часть штаммов оставалась антигенно родственна эталону А/Висконсин/67/05, а часть была подобна новому эталону А/Брисбен/10/07. И только наличие 2 штаммов, слабо взаимодействовавших с гомологичной сывороткой к А/Брисбен/10/07, свидетельствовало о происходящих изменениях в структуре НА. В период 2008-2009гг. вирусы А/Брисбен/10/07-подобные составляли основную массу изолированных штаммов. При этом, 39% популяции вирусов A(H3N2) представляли собой уже дрейф-варианты А/Брисбен/10/07 и нейтрализовались сывороткой к этому эталону до 1/8 гомологичного титра.

Среди вирусов гриппа В на протяжении всего периода 2006-2010гг. циркулировали представители двух эволюционных ветвей. В сезоне 2006-2007гг. они были представлены дрейф-вариантами современных эталонов В/Малайзия/2506/04 (В/Виктория/2/87-ветвь) и В/Флорида/4/06 (В/Ямагата/16/88-ветвь), а в следующие эпидсезоны наблюдали доминирование вирусов одной из ветвей. Период 2007-2008гг. характеризовался циркуляцией штаммов, родственных эталону В/Флорида/4/06, их регистрировали во многих странах и континентах (WER, 2008). В конце эпидемического сезона 2007-2008гг. нами выделен только один штамм В/Москва/115/08, подобный эталону В/Малайзия/2506/04, который стал предвестником возвращения представителей В/Виктория/2/87 ветви в следующем эпидсезоне 2008-2009гг. Вирусы этой ветви (17 штаммов) были изолированы в спорадических случаях в трех регионах РФ (Дальний Восток, Сибирь, Центрально-Европейский). Они реагировали с иммунной сывороткой к эталону В/Малайзия/2506/04 от 1 до 1/64 гомологичного титра, что указывает на произошедший антигенный дрейф в молекуле НА. Полученные результаты стали обоснованием для рекомендаций экспертов ВОЗ о включении нового эталона В/Брисбен/60/2008 (В/Виктория/2/87 ветвь) в состав гриппозных вакцин на эпидсезон 2009-2010гг. (WHO, 2009). Весной 2010 года вирусы гриппа В активно изолировали в разных регионах России. Детальное типирование 62 штаммов, выделенных в ЦЭЭГ (23 шт.) и присланных из г.Владивостока (39 шт.) показало, что 56 из них были антигенно родственны новому эталону В/Брисбен/60/2008 (В/Виктория/2/87 ветвь) и реагировали с иммунной сывороткой к нему от 1 до 1/4 гомологичного титра; 6 штаммов (10%) - до 1/8 гомологичного титра. С помощью тест-системы «Influenza В virus. Дифференциация линий» в ЦЭЭГ был подтвержден единственный случай вируса гриппа В (штамм В/Владивосток/2/10) ветви В/Ямагата/16/88 в сезоне 2010г.

Первый случай заболевания гриппом А(НШ1)у в РФ выявлен нами 21.05.2009г. методом ПЦР-РВ с помощью тест-системы СОС&Р (Атланта, США) у россиянина, прибывшего из США. 24.05.2009г. изолирован штамм вируса гриппа А/ПУ-Мо5со\у/01/2009 (Н1Ш)5\у1 (ГКВ№2452). В период пандемии 2009-2010гг. в культуре клеток МДСК и КЭ изолировано 96 пандемических штаммов А(НШ1)у. Изучение антигенных свойств НА этих вирусов показало их родство с эталонным штаммом А/СаНГогта/07/2009, а также первым штаммом А/1ГУ-Мо5СО\у/01/2009 (ШЖ^уЛ. Выявлено только 2 штамма, реагировавших до 1/8 гомологичного титра с сывороткой к эталону А/СаНй)ппа/07/2009. Эти данные свидетельствуют о происходящем антигенном дрейфе в молекуле НА пандемических вирусов. Мы провели анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей НА 7 пандемических штаммов вирусов гриппа, выделенных в г.Москве (АЛ1У-Мозсо\у/1,2,3,4,5/2009) и г.Владивостоке (А/ГГУ-УМУовЮк/П, 18/2009), для сравнения между собой и с данными по НА референс-штамма А/СаШопна/04/09. Установлено, что у российских штаммов имеются, по крайней мере, от 3 до 5 замен в аминокислотных последовательностях НА. При этом штамм А/1ГУ-Мо5со\у/02/2009 является наиболее отличным от калифорнийского штамма и от остальных проанализированных московских штаммов (У2511), которые были идентичны по аминокислотной последовательности НА между собой. Штаммы из Владивостока более близки московским вирусам, выявлены 2 замены Ь491 и Т2208, в то время как с эталоном А/СаНй)гша/04/09 они имеют различия в 4 аминокислотных позициях НА.

Таким образом, вирусы гриппа, циркулировавшие в России в 2006-2010гг. характеризовались большим разнообразием антигенных свойств поверхностного белка НА. В период 2009-2010гг. в РФ, как и в других странах, в основном, циркулировали пандемические штаммы вируса гриппа А(НШ1)у.

Состояние популяционного иммунитета к современным штаммам вирусов гриппа А и В с 2006г. по 2010г. у доноров Московского региона.

Результаты серологических исследований популяционного иммунитета у доноров

Московского региона за 3 эпидсезона (2006-2007, 2007-2008, 2008-2009гг.) представлены на рис.2. Самые высокие показатели СГТ регистрировали к вирусам гриппа А(НШ1) и А(НЗШ) в период 2006-2007гг, что объясняется резкой сменой антигенных свойств циркулировавших вирусов, родственных новым эталонным штаммам. Появление в сезоне 2007-2008гг. в России штаммов, подобных А/Брисбен/59/07 (НШ1) и А/Брисбен/10/07 (НЗК2), и активная их циркуляция в течение эпидсезона 2008-2009гг., также отразилось на росте серологических показателей, однако, он был не столь ярко выражен. Что касается вирусов гриппа В, то увеличение уровней СГТ наблюдалось к штаммам, представителям обеих эволюционных ветвей в эпидсезон 2006-2007гг., что подтвердило вирусологические данные об их социркуляции в этот период. Во время эпидсезона 2007-2008гг. прирост антител наблюдался к вирусам гриппа В/Ямагата/16/88-подобным, для вирусов гриппа ветви В/Виктория/2/87 не регистрировали значительного увеличения уровней СГТ (5,6 - 5,8 ^2), что подтверждает вирусологические данные о низкой циркуляции вирусов, представителей этой эволюционной линии.

140 120 100 80 60 40 20 0

А(Н1 N1)

2006-2007

□

и дрейф-варианты

□ А/Брисбен/59/07

□ А/Соломоновы Острова/3/О6

□ А/Новая Каледония/20/99

2007-2008 эпидсезоны

140

е 120

¡100

^ 80 о

г бо

% 40

1 20 " 0

А(НШ2)

2006-2007

□ дрейф-варианты р А/Брисбен/10/07

□ А/Висконсин/67/05 а АЖа лифорния/7/04

2007-2008 эпидсезоны

2008-2009

£ 150

§ 100

о 100

? § 80

0 ь ш с;

1 §

2006-2007 2007-2008 2008-2009 2009-2010 эпидсезоны

и дрейф-варианты

□ В/Брисбен/60/08 (В/Виктория-ветвь)

□ В/Малайзия/2506/04 (В/Виктория-ветвь) ■ В/Фпорида/4/06 (В/Ямагата-ветвь)

60 40

пандемический сезон 2009-2010

□ А/СаМогта/7/09

о дре йф-ва рианты

Рис. 1. Изоляция и антигенное сходство эпидемических и пандемических штаммов вирусов гриппа А и В, циркулировавших в России в 2006-2010гг., с эталонными штаммами.

Изоляция штаммов

8,4

Изоляция штаммов

1У-У.2007 УН.2007 1Х-Х11.07| 1-111.2008 ! У.2008 периоды исследований ]А(Н1№|) □ А(НЗЫ2) □ В/Виктория/2/87-ветвь ■ В/Ямагата/16/88-ветвь

Рис.2. Динамика популяционного иммунитета у доноров Московского региона к современным эпидемическим штаммам вирусов гриппа А и В с 2006 г. по 2009 г.

На протяжении всего периода 2006-2009гг. самые высокие значения СГТ регистрировали к вирусам гриппа В/Ямагата/16/88-ветви, не смотря на их отсутствие в популяции в эпидсезон 2008-2009гг., что свидетельствует о сохраняемом продолжительном иммунном ответе, вызываемом этими вирусами.

В период 2009-2010гг. в Московском регионе уровень СГТ к пандемическому штамму A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swI поднялся с 3,0 до 4,6 Iog2, т.е. в 1,5 раза. Процент лиц с антителами к этому вирусу с защитным титром >1/40 увеличился с 8 до 40% в постпандемический период по сравнению с предпандемическим периодом. Уровни СГТ к эпидемическим штаммам, подобным эталонам 2008-2009гг. - А/Брисбен/59/07 (H1N1) и А/Брисбен/10/07 (H3N2), снижались к концу пандемического периода в 1,08 раза (рис.3).

s 60 J^ 50

i Г-Я / А "6,5

!.: Г| П álL

Ufa I L

I M ■ 16,7 \ Щ

i ■ »J 0 III

до изоляции (январь- период изоляции (май- после активной изоляции

апрель 2009) декабрь 2009) (январь-март 2010)

□ A/IIV-Moscow/01/09 □ А/Брисбен/59/07(Н1№1) □ А/Брис6ен/10/07(НЗМ2)

Рис.3. Процент доноров Московского региона с защитными титрами антител (> 1:40) к штаммам вирусов гриппа А в зависимости от пандемического процесса.

Установлено, что 77% лиц, имевших в сыворотках защитные титры антител к пандемическим штаммам, имели защитный титр антител и к эталону А/Брисбен/59/07 (H1N1). Возможно, это связано с выработкой антител к общим зонам молекулы НА вирусов гриппа A(HlNl)v и A(H1N1). Таким образом, анализ серологических данных популяционного иммунитета у доноров нескольких регионов РФ подтвердил вирусологические данные общей картины циркуляции вирусов гриппа в стране. Биологические свойства современных штаммов вирусов гриппа, изолированных в период с 2006 по 2010гг.

Следующим направлением наших исследований было изучение чувствительности

разных биологических систем изоляции и идентификации вирусов гриппа к современным эпидемическим штаммам, изолированным в 2006-2009гг. Результаты исследований представлены в табл. 1.

Установлено, что вирусы гриппа A(H3N2) практически утратили тропизм к КЭ. За весь период не было изолировано ни одного штамма из носоглоточных смывов на КЭ. В экспериментах по адаптации штаммов, изолированных на MDCK, 2 штамма из 20 исследованных удалось перевести на КЭ. В отличие от вирусов гриппа A(H3N2) некоторые современные штаммы вирусов гриппа A(H1N1) и В сохраняют чувствительность к системе

изоляции КЭ. Нам удалось выделить на КЭ из носоглоточных смывов 6% штаммов A(H1N1) и 3% штаммов вирусов гриппа В за весь исследованный период. Также нами адаптировано к КЭ большая часть изолированных на MDCK штаммов вирусов гриппа A(H1N1) (23 из 27 исследованных) и В (7 из 11 исследованных). В период пандемии 2009-2010гг. из 13 носоглоточных смывов, в которых была обнаружена РНК вируса A(HlNl)v, нам удалось изолировать на КЭ 5 штаммов. После изоляции на MDCK почти все штаммы A(HlNl)v были адаптированы к КЭ. Из секционного материала пандемические штаммы изолировали исключительно на КЭ, что может быть связано с изменением тропизма этих вирусов к рецепторам нижних (а2-3-связь) отделов респираторного тракта человека.

Проведенные нами исследования чувствительности эритроцитов человека 0(1) группы крови и кур к эпидемическим и пандемическим штаммам, циркулировавшим с 2006г. по 2010г., показали, что вирусы гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В наиболее активно взаимодействовали с эритроцитами человека. При этом регистрировали рост чувствительности эритроцитов кур к эпидемическим штаммам по сравнению с предыдущими периодами (Матюшина P.O., 2007). В период пандемии был исследован 21 штамм вирусов гриппа A(HlNl)v, изолированных как на культуре клеток MDCK, так и на КЭ. Не было выявлено существенных различий (ДСГТ=0,31о»2) в чувствительности эритроцитов человека и кур к пандемическим штаммам вируса гриппа (табл.1). Таким образом, эритроциты человека продолжают оставаться более чувствительными к современным вирусам гриппа. Однако, увеличение тропизма вирусов гриппа к эритроцитам кур может говорить о происходящих эволюционных изменениях в рецепторсвязывающем сайте НА.

Для определения степени гетерогенности вирусной популяции были проведены исследования чувствительности к нагреванию белка НА вирусов гриппа А и В, циркулировавших с 2006г. по 2010г. Среди вирусов гриппа A(H1N1) и В преобладали штаммы с термостабильным НА. Популяция вирусов гриппа A(H3N2) была гетерогенна по этому признаку, процент штаммов с термостабильным НА варьировал от 23 до 58% в зависимости от эпидемического сезона. Характерно, что в предыдущие сезоны количество таких штаммов было гораздо выше (73-92%) (Иванова В.Т. и др., 2006). Большинство штаммов вирусов гриппа A(HlNl)v обладали термолабильным НА (табл.1).

Критической стадией адаптации вируса гриппа к новому хозяину является изменение его рецепторного сайта связывания в молекуле НА. Мы исследовали рецепторную специфичность НА первых трех пандемических штаммов A/IIV-Moscow/01,02,03/2009 (HlNl)swl, изолированных в России, с панелью синтетических сиалилолигосахаридов. Штаммы A/IIV-Moscow/01/2009 и A/IIV-Moscow/02/2009 обладают ярко выраженным сродством к 6'SLN, по сравнению с 3'SLN, что указывает на «человеческую» природу этих штаммов. В то время как штамм A/IIV-Moscow/03/2009 эффективно связывается с обоими сиалозидами, что соответствует специфичности вирусов гриппа свиней.

Таблица 1. Биологические свойства эпидемических и пандемических штаммов вирусов гриппа Л и В, изолированных на 1УШСК в

2006-2010гг.

Тип вируса Эпидсезоны Эталонные штаммы N №и сгт гемагглютинирующей активности вирусов с эритроцитами, ДСП-активности вирусов с эритроцитами, 1ОЙ2 Термочувствительность НА при нагревании 56°С, 1 час Изоляция из носоглоточных смывов на КЭ Адаптация вирусов, изолированных на МОСК, к КЭ

Группы крови человека 0(1) Кур человека 0(1) и кур №н Число штаммов с термостабильным НА (%) Ыс Число штаммов, изолированных наКЭ N111 Число штаммов, перешедших наКЭ

А(НШ1) 2006-2007 А/Новая Каледония/20/99 101 15 6,3±0,4 1,7 ±0,6 4,6 32 32(100%) 24 0 14 10

А/Соломоновы Острова/3/О6

2007-2008 129 16 5,8+0,3 2,9±0,5 2,9 17 16 (94%) 20 3 9 9

А/Брисбен/59/07

2008-2009 53 9 6,6±0,3 4,4±0,3 2,2 9 8 (89%) 20 1 4 4

ИТОГО: 283 40 58 56 (97%) 64 4 (6%) 27 23(85%)

А(ПШ1)у 2009-2010 А/СаНГогша/07/09 96 21 4,9±0,2 4,6±0Д 03 21 1 (4,8%) 13 5 (38%) 14 13 (93%)

А(НЗ№) 2006-2007 А/Калифорния/7/04 98 12 6,1 ±0,5 3,2±0,6 2,9 13 3 (23%) 28 0 11 2

А/Висконсин/67/05

2007-2008 59 10 5,0+0,4 3,3±0,6 1,7 21 9 (43%) 4 0 3 0

А/Брисбен/10/07

2008-2009 67 12 5,1 ±0,3 3,3±0,7 1,8 12 7 (58%) 4 0 6 0

ИТОГО: 224 34 46 19(41%) 36 0 (0%) 20 2 (10%)

В 2006-2007 В/Малайзия/2506/04(В)* 60 7 5,7±0,3 3,6±0,5 2,1 7 6 (86%) 8 0 3 3

В/Флорида/4/06 (Я)** 10 6,2+0,8 4,5 ±0,7 1,7 10 8 (80%)

2007-2008 157 6 7,3+0,6 6,8±0,5 0,5 7 7 (100%) 8 0 4 4

2008-2009 В/Малайзия/2506/04(В) 17 7 6,3±0,4 4,7±0,3 1,6 7 6 (86%) 15 1 4 0

ИТОГО: 234 30 31 27 (87%) 31 1 (3%) 11 7 (64%)

Примечание: * - В/Виктория/2/87 линия, ** - В/Ямагата/16/88 линия; К- число изолированных штаммов; Ыш- число исследованных штаммов; Ые- число исследованных смывов; ДСГТ - разница средних геометрических титров гемагглютинирующей активности вирусов при взаимодействии с разными эритроцитами.

Исследование рецелторсвязывающей активности после изоляции пандемических штаммов из смывов на КЭ и перехода с культуры клеток MDCK на КЭ показало, что сродство к SiAa-2,ЗОа1-содержащим группировкам резко возросло. Вирусы, выделенные на КЭ, хорошо распознают как «человеческий» так и «птичий» рецепторы. Эти результаты согласуются с ранее опубликованными данными (Matrosovich М. et al., 1997, 2000; Гамбарян A.C., 2007). Применение отечественных ПЦР тест-систем для диагностики гриппа. Следующим предметом наших исследований была оценка возможностей отечественных ПЦР тест-систем для диагностики и мониторинга вирусов гриппа человека. Проведенные нами исследования эталонных, эпидемических и пандемических штаммов показали, что все тест-системы определяют РНК в препаратах вирусов гриппа А и В различной степени очистки, независимо от выбранной системы культивирования - КЭ или MDCK, антигенной структуры поверхностных белков и эпидемического периода. Тест-системы успешно выявляли как современные штаммы вирусов гриппа А, так и изолированные более 30 лет назад, что является важным фактором ввиду высокой изменчивости генома этих вирусов. Для подтверждения возможности использования тест-систем для обнаружения вируса гриппа в клиническом материале от больных нами были проверены образцы, собранные на территории РФ в период с 2006 по 2010гг. Результаты ПЦР сравнивали с данными по изоляции вирусов гриппа на культуре клеток MDCK и КЭ (табл.2). Полученные данные свидетельствуют, что почти все тест-системы по чувствительности превосходят метод выделения вирусов на культуре. Несовпадение результатов можно объяснить нарушением условий сбора, хранения или транспортировки инфекционного материала перед выполнением анализа, наличием ингибиторов ПЦР. Кроме того, материал мог содержать нежизнеспособные вирусные частицы, РНК которых детектировалась только методом ПЦР.

Внедрение ПЦР тест-систем в лабораторную диагностику позволило провести мониторинг циркуляции вирусов гриппа и оценить эпидемиологическую обстановку в Московском регионе. С помощью тест-системы «АмплиСенс Influenza virus A/B-FL», выявлена социркуляция вирусов гриппа А и В в сезоне 2007-2008гг. и доминирование вирусов гриппа А в сезоне 2008-2009гг. Эти результаты подтверждают вирусологические данные, приведенные ранее (рис.1). Применение системы «МультиРесп» в эпидсезонах 20082009гг. и 2009-2010гг. позволило выявить не только циркуляцию вирусов гриппа А и В, а также других респираторных вирусов. Тест-системы «АмплиСенс Influenza virus A/Hl-swine-FL» и «ПАН H1N1» активно применялись в период пандемии 2009-2010гг. в России для первичной диагностики гриппа A(HlNl)v. С помощью этих тест-систем из 1755 исследованных образцов было выявлено 519 случаев заболевания, вызванные этим вирусом, из которых 81 образец - секционный материал. Представленные результаты позволяют утверждать, что отечественные ПЦР тест-системы для обнаружения вирусов гриппа А и В могут быть использованы для мониторинга гриппа в нашей стране. Применение ПЦР с использованием изученных тест-систем в качестве дополнительного к классическим методам (изоляция вирусов и РТГА) в референс-лабораториях по надзору за распространением гриппа существенно упростит и ускорит расшифровку эпидемиологической обстановки.

Таблица 2. Диагностическая чувствительность ПЦР тест-систем в сравнении с изоляцией вирусов гриппа на МРСК и КЭ

Название тест-системы Разработчик Детекция гриппа Детект. участок гена Метод детекции N Вирус определен в

MDCK (%) ПЦР (%)

1 Тест-система для обнаружения вируса гриппа А ЗАО НПФ «НАРВАК» НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского А NP электрофорез 65 43 (66) 34 (52)

2 АмплиСенс Influenza virus А/В- Eph ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора А и В Ml (грипп А) NS (грипп В) 27 16 (59) 14(52)

3 АмплиСенс Influenza virus A/H5N1-FL A/H5N1 Ml, H5.N1 ПЦР-РВ 29 18 (62) 15 (52)

4 АмплиСенс Influenza virus A/B-FL А и В Ml (гриппА) NS (грипп В) 160 92 (58) 141 (88)

5 АмплиСенс Influenza virus A/Hl-swine-FL A(HlNl)v HI 217 62 (29) 217 (100)

6 АмплиСенс Influenza virus А-тип-FL H1N1 и H3N2 Н1,НЗ, N1.N2 н/и н/и н/и

7 *MultiResp PCR-test НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова Грипп А и В; ВПГ 1,2,3,4 тип; АДВ; PCB; РВ; ЭВ Ml ПЦР-РВ 226 84 (37) 101 (45)

8 Пан H1N1 ЗАО НПФ «ДНК-технология» A(HlNl)v N1 ПЦР-РВ 38 И (29) 36 (95)

8 ■"Influenza A virus А Ml 38 11(29) 37 (97)

9 ■"Influenza В virus В Ml 37 25 (68) 37(100)

10 ■"Influenza В virus. Дифференциация линий Эволюц. линии В/Ямагата/16/88 В/Виктория/2/87 НА 37 25 (68) 37 (100)

Примечание: н/и- не исследовано; *- тест-система находится в стадии регистрации; N- число исследованных образцов; ВПГ- вирус парагриппа; АДВ- аденовирус; PCB- респираторно-синцитиальный вирус; РВ- риновирус; ЭВ- энтеровирус.

Использование поверхностного плазменного резонанса для детекции нуклеиновых кислот, вирусов гриппа и комплексов антиген-антитело в растворах.

Следующий раздел работы был посвящен усовершенствованию методов диагностики вируса гриппа, частности использование нового для биологии метода плазменного резонанса (ППР). Этот метод обладает рядом преимуществ: быстрая регистрация реально текущих взаимодействий без введения специальных меток в исследуемые молекулы, возможность качественного и количественного определения протеин-протеиновых, лиганд-рецепторных и др. взаимодействий, отсутствие специальной подготовки образцов. Схема метода представлена на рис.4. В ячейку, дно которой представляет собой сенсор, помещается раствор с образцами У=200мкл. Сенсор представляет собой золотую пластину толщиной 50 нм (проводник - содержащий большое количество свободных электронов), покрытую электрохимически синтезированной пленкой интерполимерного комплекса полианилина. Толщина пленки варьировала от 30 до 105 нм. Электроны под воздействием светового луча с резонансной длиной волны отражают луч, который проходя через призму, определяется детектором. В зависимости от состояния окружающей электроны среды (связывания с сенсором исследуемых объектов) у отраженного луча изменяется длина волны и соответственно направление выхода из призмы. Изменение угла отраженного луча света является параметром, определяющим наличие и количество препаратов - белков, комплексов антиген-антитело в растворах.

Рис.4. Схема детекции вирусов гриппа методом ППР.

I | - пленка ПАн

- пластина золота 5> - вирусы гриппа

Создание веществ, способных формировать пленки, сорбирующие биологические препараты, является отдельной задачей. Ранее было установлено, что порошки соли и основания полианилина (ПАн) с низкомолекулярной кислотой, а также пленки интерполимерные комплексы ПАн различного строения эффективно сорбируют вирусы гриппа из различных растворов (Иванова В.Т. и др., Патент РФ 2372951, 2007). Методом электрофореза в агарозе нами было показано, что нуклеиновые кислоты, в частности кДНК вирусов гриппа, также способны сорбироваться из раствора на ПАн (рис.5А).

Объектами исследования методом ППР были кДНК, очищенные препараты вируса гриппа А/Новая Каледония/20/99 (НШ1), иммунные сыворотки к штамму А/Новая Капедония/20/99 и штамму В/Флорида/04/06. Показано, что иммобилизованные на ПАн пленку молекулы кДНК, вирусы гриппа и антитела сорбируются на пленку сенсора и не десорбируются с ее поверхности при промывке буферным (рН=8) раствором и водой в

отличие от золота (рис.5В). Это соответствовало изменению угла отражения Д0 в 25 мин. При сорбции антител или вирусов Дб составляло 22 и 25 мин., соответственно. В случае гомологичных систем: при последовательной сорбции антител и вирусов или вирусов затем антител с образованием комплексов, Л0 изменялось на 10 или 49 мин. (табл.3). При взаимодействии вирусов гриппа А с негомологичными антителами сыворотки к вирусу гриппа В, комплексы не образовывались и соответственно отклика сигнала ППР не наблюдалось Д0=2мин. Очевидно, что сорбция вируса обусловлена связыванием поверхностного белка НА с полимерами пленки различного рода химическими и физическими взаимодействиями, например, ионными, донорно-акцепторными, кислотно-основными и др.

БТЕ- Сорбция ЭТЕ-

Рис.5. А) Электрофореграмма сорбции продуктов ПЦР (ампликоиов кДНК) вирусов гриппа А(НШ1) наноразмерными частицами ПАн. Дорожки 1,2 - до сорбции; 4 -после сорбции на ПАн-О, 5 после сорбции на ПАн-НС1; 3 - положительный контроль. В) Сеисограмма сорбции кДНК вирусов гриппа: 1-пластина золота (контрольный эксперимент); 2- пленка ПАн; Эгея - резонансный угол отражения (1 градус = 60 угловых мин.)

Таблица 3. Определение методом ППР биологических образцов в растворах

Схема нанесения кДНК Антитела + вг вг + антитела к вг В + антитела к вг А

Образцы кДНК □ Антитела к вирусу А(НШ1) Вирусы А(НШ1) Вирусы АДОМ) Антитела к вирусу В Антитела к вирусу АДОМ)

ДО, мин 25 22 10 25 2 49

Примечание: ДО- изменения угла отражения луча (угловые мин.) после нанесения образцов на пленки сенсора, содержащих полианилин, после каждого этапа нанесения, вг - вирусы гриппа

В литературе имеется ограниченное число работ по применению ППР в вирусологии. Этим методом ТакетоЮ Э. е1 а1. (1996) изучали взаимодействия НА вирусов гриппа с аналогами клеточных рецепторов, используя в качестве сенсора производные декстрана. N¡135011 С.Е. е1 а1. (2010) предложили использовать ППР для количественной оценки НА в вакцинных препаратах, Сафенкова И.В. (2010) - для определения вирусов растений.

Проведенные нами исследования показали, что на основе метода ППР тонкие пленки полианилина и его комплексов могут быть применены в качестве матрицы для создания чувствительных сенсорных систем для определения вирусов гриппа и его компонентов.

ВЫВОДЫ

1. Результаты вирусологических и серологических исследований показали, что эпидемии вирусов гриппа в регионах России были обусловлены социркуляцией вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В в эпидсезоны 2006-2009гг. и циркуляцией пандемических A(HlNl)v и сезонных вирусов гриппа В в 2009-2010гг. Уровень популяционного иммунитета изменялся в течение всего периода 2006-2010гг. и коррелировал с этиологией эпидемий.

2. Показано, что наиболее интенсивные изменения в структуре НА, зарегистрированы у вирусов гриппа A(H1N1), вызваны последовательным появлением штаммов, подобных новым эталонам А/Соломоновы Острова/3/О6 и А/Брисбен/59/07. Антигенный дрейф НА вирусов гриппа A(H3N2) проходил в направлении НА эталонов А/Калифорния/7/04 -А/Висконсин/67/05 - А/Брисбен/10/07. Представители эволюционных линий вирусов гриппа В социркулировапи в эпидсезоне 2006-2007гг, выявлены штаммы, подобные новому эталону В/Флорида/04/06 (В/Ямагата/16/88-линии). В следующих сезонах 20072010гг. доминировали штаммы, родственные одной из линий: В/Ямагата/16/88 или В/Виктория/2/87.

3. Установлено, что наиболее чувствительной системой для изоляции современных эпидемических штаммов остается культура клеток MDCK: вирусы гриппа A(H1N1) и В сохраняют тропизм к системе изоляции КЭ, в то время как вирусы гриппа A(H3N2) практически полностью его утратили.

4. Выявлена общая тенденция к уменьшению различий при взаимодействии эпидемических штаммов вирусов гриппа, изолированных в 2006-2009гг., с эритроцитами кур и человека 0(1) группы крови, по сравнению с предыдущими периодами наблюдения. Наибольшие отличия зафиксированы у вирусов гриппа А, и незначительные отличия или их отсутствие у вирусов гриппа В. Популяции вирусов гриппа А и В гетерогенны по термочувствительности поверхностных белков НА.

5. Показано, что пандемический процесс в РФ в 2009-2010гг. обусловлен циркуляцией штаммов вирусов гриппа, антигенно родственных эталону A/California/07/09. Методом ПЦР выявлен первый штамм A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl, который депонирован в ГКВ (№2452). Уровень популяционного иммунитета к пандемическим штаммам увеличивался к концу сезона 2009-2010гг.

6. Показано, что для изоляции штаммов A(HlNl)v можно использовать культуру клеток MDCK и КЭ. Не выявлено существенных различий в чувствительности эритроцитов человека 0(1) группы крови и кур к пандемическим вирусам. Штаммы A/IIV-Moscow/01/2009 и A/IIV-Moscow/02/2009 (HlNl)swl эффективней связываются с а2-6, чем с а2-3 сиапозидами. Штамм A/IIV-Moscow/03/2009 (HlNl)swl распознает оба типа рецепторов. В популяции вирусов гриппа A(HlNl)v преобладали штаммы с термолабильным НА.

7. На основе испытания клинических образцов и штаммов вирусов гриппа человека показано, что 10 отечественных ПЦР тест-систем, отличающихся между собой по

выявляемым фрагментам генов, кодирующих различные белки вирусов гриппа А и В, могут применяться для мониторинга эпидемических и пандемических вирусов гриппа. Впервые в России апробированы тест-системы «АмплиСенс Influenza virus А-тип-FL» и «Influenza В virus. Дифференциация линий», которые позволяют субтипировать (идентифицировать субтипы H INI и H3N2) вирусов гриппа А и вирусы гриппа В по генетической принадлежности к эволюционным ветвям В/Ямагата/16/88 и В/Виктория/2/87 методом ПЦР-РВ.

8. Чувствительность метода поверхностного плазменного резонанса с использованием пленок полианилина в качестве элемента-сенсора позволяет выявлять кДНК вирусов гриппа и комплексы вирусов гриппа с антителами в растворах.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванова В.Т, Ракутина P.O., Слепушкин А.Н., Оскерко Т.А., Кордюкова Л.В., Федорова Н.В., Черкасов Е.Г., Трушакова C.B. Современные методы исследования эпидемических штаммов вируса гриппа. // Материалы Всероссийской научной конференции «Эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика вирусных инфекций», Санкт-Петербург, 1-2 декабря 2005г., с. 145-146.

2. Трушакова C.B., Хомик Д.С., Иванова В.Т., Гребенникова Т.В., Бурцева Е.И. Слепушкин А.Н. Определение вирусов гриппа А в разных образцах с использованием ПЦР. // Материалы Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных», Ульяновск, 21-23 июня 2006г., с.256-260.

3. Ivanova V.T., Rakutina R.O., Slepushkin A.N., Burtseva E.I., Kolobuhina L.V., Oskerko T.A., Zagorskaya J.V., Trushakova S.V. Peculiarity of human influenza viruses at the beginning of XXI century in Russia // «Infections and digestive tract diseases», Paris, 7-8 December, 2006, 46/07.

4. Иванова B.T., Ракутина P.O., Слепушкин A.H., Бурцева Е.И., Оскерко Т.А., Шевченко Е.С., Федорова Л.В., Кордюкова Л.В., Трушакова C.B., Черкасов Е.Г., Меркулова Л.Н., Феодоритова Е.Л. Свойства эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В, циркулировавших в эпидемическом сезоне 2004-2005гг. в России. // Вопросы вирусологии №6, 2006, с.27-30.

5. Трушакова C.B., Хомик Д.С., Иванова В.Т., Киреев Д.Е., Гребенникова Т.В., Бурцева Е.И. Слепушкин А.Н. Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) для детекции вирусов гриппа А в разных биологических материалах. // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 26-27 апреля, 2007, с.266.

6. Kurochkina Y.E., Ivanova V.T., Trushakova S.V., Burtseva E.I.. Activation of influenza viruses A(H1N1) in epidemic season 2006-2007 in Russia // X International Symposium on Respiratory Viral Infections in Singapore, 28 February - 2 March, 2008, P-17.

7. Трушакова C.B., Курочкина Я.Е., Киреев Д.Е., Иванова В.Т. Детекция антигенов вирусов гриппа и антител к ним в различных биологических материалах. II V Конференция молодых ученых с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, ММА им. И.М.Сеченова, 19-22 мая, 2008, с.438-439 (с докладом).

8. Матюшина P.O., Трушакова C.B., Иванова В.Т., Иванов В.И., Бурцева Е.И.. Современные подходы к диагностике и изучению вирусов гриппа. // Материалы IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, 2-4 июня, 2008, с.23.

9. Trushakova S.V., Ivanova V.T., Kireev D.E., Burtseva E.I. Detection of influenza A viruses in clinical samples by PCR. // Third European Influenza Conference in Vilamoura, Portugal, 1417 September 2008, p.8, Addenium&Participants list.

10. Ivanova V.T., Kurochkina Y.E., Burtseva E.I., Trushakova S.V., Oskerko T.A., Matyusina R.O., Slepushkin A.N. Spread and biological properties of Influenza viruses in Russia in period 2003-2008. // Third European Influenza Conference in Vilamoura, Portugal, 14-17 September 2008, p. 142.

11. Иванова B.T., Матюшина P.O., Слепушкин A.H., Бурцева Е.И., Оскерко Т.А., Шевченко Е.С., Трушакова C.B., Курочкина Я.Е., Загорская Ю.В., Черкасов Е.Г., Меркулова Л.Н., Феодоритова Е.Л. Эпидемические штаммы вирусов гриппа А и В в сезоне 2005—2006 гг. в России. // Вопросы вирусологии, 2008, №4, с.13-18.

12. Иванова В.Т., Курочкина.Я.Е., Бурцева Е.И., Оскерко Е.А., Трушакова C.B., Шевченко Е.С., Черкасов Е.Г., Щелканов М.Ю., Матюшина P.O., Колобухина Л.В., Феодоритова Е.Л., Слепушкин А.Н. Распространение и биологические свойства эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В, циркулировавших в сезоне 2006-2007 гг. в России. // Вопросы вирусологии, 2008, № 5 с. 19-23.

13. Трушакова C.B., Иванова В.Т., Бурцева Е.И., Яцышина С.Б. Использование полимеразной цепной реакции для диагностики вируса гриппа у детей. Il VII Конгресс детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей», Москва, 3-5 декабря 2008, с. 146.

14. Иванов В.Ф., Иванова В.Т., Тимофеева A.B., Симакова A.A., Ильина М.В., Курочкина Я.Е., Трушакова C.B., Грибкова О.Л., Шнейдер М.М., Катруха Г.С. Сорбция различных биологических объектов наноразмерными частицами полианилина. // Материалы Пятого Московского международного конгресса «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития», Москва, 16-20 марта, 2009, том 2, с.107.

15. Трушакова C.B., Шевченко Е.С., Никонова A.A. Применение отечественных тест-систем на основе ОТ-ПЦР для детекции вирусов гриппа в клинических материалах от больных во время эпидемий гриппа в России. // Материалы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, МГУ им. М.В.Ломоносова, 14 - 17 апреля 2009 г., с.41-42.(с докладом).

16. Никонова A.A., Лободанов С.А., Трушакова C.B., Шевченко Е.С., Файзулоев Е.Б. Совершенствование методов выявления респираторных вирусов в клинических образцах. // II Научно-практическая конференция «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ», Москва, 28-29 мая 2009, с.24.

17. Trushakova S., Ivanova V., Oskerko T., Minenko A., Shevchenko E., Burtseva E. The methods of detection and study of influenza viruses, antibodies to them in Russia. // ERS Annual Congress, Austria, Vienna, 12-16 September 2009, v.34 (54), abstract E3395.

18. Львов Д.К., Бурцева Е.И., Прилипов А.Г........Трушакова C.B., Иванова В.Т., Белякова

Н.В., Оскерко Т.А., Алипер Т.И. Изоляция 24.05.2009 и депонирование в Государственную коллекцию вирусов (ГКВ №2452 от 24.05.2009) первого штамма A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl, подобного свиному вирусу A(H1N1) от первого выявленного 21.05.2009 больного в Москве. // Вопросы вирусологии, 2009, т.54, №5, с.10-14.

19. Иванова В.Т., Трушакова C.B., Оскерко Т.А., Шевченко Е.С., Колобухина Л.В., Вартанян Р.В., Белякова Н.В., Яцышина С.Б., Феодоритова Е.Л., Зуева Н.Д., Бурцева Е.И. Характеристика циркулировавших в России в сезоне 2007-2008 гг. эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В. // Вопросы вирусологии, 2009, т.54, №5, с.28-33.

20. Яцышина С.Б.,. Миненко А.Н, Прадед М.Н., Волошина П.В., Трушакова C.B., Браславская С.И., Бурцева Е.И., Шипулин Г.А., Малеев В.В., Покровский В.И. Диагностика гриппа: новый вариант A/H1N1 в России. // Эпидемиология и инфекционные болезни, 2009, №6, с.56-62.

21. Nikonova A., Lobodanov S., Trushakova S., Shevchenko E., Faizuloev E. Multiplex Real-time PCR for Improvement Diagnosis of the Respiratory Tract Infections. // 14th Congress of the APSR and 3rd Joint Congress of the APSR/ACCP, Korea, Seoul, November 14-18 2009, v.14, P.A235.

22. Иванова B.T., Бурцева Е.И., Трушакова C.B., Прилипов А.Г. и др. Особенности этиологии эпидемии гриппа 2008-2009 гг. в России, начало новой пандемии. // Всероссийская научная конференция «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций», Санкт-Петербург, 19-20 ноября 2009, с. 157-158.

23. Трушакова C.B., Лаврищева В.В., Иванова В.Т., Бурцева Е.И., Колобухина Л.В., Щелканов М.Ю., Львов Д.К. Диагностика гриппа, вызванного высокопатогенным штаммом A(HlNl)swl. // VIII Конгресс детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей», Москва, 14-16 декабря 2009, с.291.

24. Трушакова C.B. Идентификация и изучение биологических свойств вирусов гриппа A(HlNl)swl, циркулировавших в РФ в 2009-2010гг. // Материалы докладов XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, МГУ им. М.В.Ломоносова, 12 - 15 апреля 2010 г., абстракт 58-980-3968.

25. Львов Д.К., Бурцева Е.И., Прштипов А.Г., Щелканов М.Ю., ...... Трушакова C.B.,

Лаврищева В.В. и др. Распространение нового пандемического вируса гриппа A(HlNl)v в России. // Вопросы вирусологии, 2010, №3, с.4-9.

26. Львов Д.К., Яшкулов К.Б., Прилипов А.Г., Бурцева Е.И., ...... Трушакова C.B.,

Лаврищева В.В. и др. Обнаружение аминокислотных замен аспарагиновой кислоты на глицин и аспарагин в рецепторсвязывающем сайте гемагглютинина в вариантах пандемического вируса гриппа A/H1N1 от больных с летальным исходом и со среднетяжелой формой заболевания. // Вопросы вирусологии, 2010, №3, с.15-18.

27. Львов Д.К., Бурцева Е.И., Прилипов А.Г., Богданова B.C., ...... Трушакова C.B.,

Лаврищева В.В. и др. Возможная связь летальной пневмонии с мутациями пандемического вируса гриппа A/HlNlswl в рецепторсвязывающем сайте субъединицы НА1 гемагглютинина. // Вопросы вирусологии, 2010, №4, с.4-9.

28. Burtseva Е., Lvov D., Ivanova V., Kolobukhina L., Merkulova L., Lavrischeva V., Shevchenko E., Trushakova S., Oskerko T., Feodoritova L., Schelkanov M., Fedyakina I., Petrova E., Samokhvalov E., Alkhovsky S., Grebennikova T., Prilipov A. Some peculiarities of 2009 pandemic influenza A(H1N1) viruses circulated during 2009-2010 season in Russia. // Options for the Control of Influenza VII, Hong Kong SAR, China, 3-7 September 2010, P-371, p.268.

29. Заявка Роспатент №2009129374/10 «Штамм вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl для разработки средств и методов биологической защиты», получено решение о выдаче патента на изобретение.

30. Исакова A.A., Иванов В.Ф., Иванова В.Т., Райтман О.А, Трушакова C.B., Грибкова О.Л., Некрасов A.A., Арсланов В.В., Ванников A.B. Многофункциональные пленки наноструктурированных комплексов полианилина для детекции вирусов гриппа. // Rusnanotech. Nanotechnology. International Forum, Moscow, 1-3 November 2010, р.б.

31. Абрамов Д.Д., Трушакова C.B., Алексеев Л.П. Разработка тест-системы для дифференциации эволюционных линий гриппа В (influenza В virus) методом ПЦР в режиме реального времени. // Всероссийская научно-практическая конференция «Вакцинология-2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 9-10 ноября 2010, с.15.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю доктору биологических наук, ведущему научному сотруднику Ивановой Валерии Тимофеевне за научное руководство.

Автор выражает особую благодарность зав. лабораторией этиологии и эпидемиологии гриппа д.м.н. Бурцевой Е.И. за научные консультации и предоставленную возможность выполнения работы, к.м.н. Беляеву А.Л., к.б.н. Федякиной И.Т., к.б.н. Исаевой Е.И. за консультативную помощь (НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского).

Основные результаты получены в соавторстве с к.м.н. Шевченко Е.С., с.н.с. Оскерко Т.А., м.н.с. Беляковой Н.В., м.н.с. Лаврищевой В.В., к.б.н. Киреевым Д.Е. (НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского), к.б.н. Никоновой A.A. (НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН).

Автор выражает глубокую благодарность д.х.н. Иванову В.Ф., к.х.н. Исаковой A.A., к.х.н. Райтману O.A. (Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН), д.х.н. Бовину Н.В., тех.-лаб. Возновой Г.П. (Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН) за предоставленные материалы и оборудование, а также за консультативную и практическую помощь в выполнении работы.

Кроме того автор выражает особую благодарность д.б.н. Гребенниковой Т.В. (НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского), к.б.н. Яцышиной С.Б. (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), к.б.н. Абрамову Д.Д. (НПО «ДНК-технология»), к.б.н. Файзулоеву Е.Б. (НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН) за оказанную помощь в выполнении работы. Автор глубоко признателен и благодарен своим соавторам за внимание и ценные консультации при выполнении работы.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ГКВ - Государственная коллекция вирусов при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.

Ивановского» Минздравсоцразвития РФ

ЦЭЭГ - Центр экологии и эпидемиологии гриппа

ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция

НК - нуклеиновая кислота

нм-нанометр; 1нм=10'9м

кДНК - комплиментарная ДНК

КЭ - куриные эмбрионы

РГА - реакция гемагглютинации

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

СГТ - средний геометрический титр

ПАн - полианилин

ППР - поверхностный плазмонный резонанс ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция с флуоресцентной детекцией в реальном времени НА - гемагглютинин

MDCK (Madin-Darby canine kidney) - перевиваемая культура клеток почек собаки породы спаниель

Заказ № 87-а/11/2010 Подписано в печать 11.11.2010 Тираж 120 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Трушакова, Светлана Викторовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ГЕНОМА ВИРУСОВ ГРИППА.

1.1. Классификация вирусов гриппа, морфология, структура и функции генома.

1.2. Структура и свойства поверхностных вирионных белков: (НА и NA).

1.3. Структура и свойства внутренних вирионных белков.

1.3.1. Матриксный белок (М1) и мембранный белок (М2), нуклеопротеинСКР).

1.3.2. Внутренние белки вируса гриппа (РВ2,РВ1,РА, PB1-F2) и неструктурные белки (NSI, NS2).

ГЛАВА 2. ОСОБЕННОСТИ ЭПИДЕМИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ПРИ ГРИППЕ.

2.1. Факторы, обусловливающие изменчивость вирусов гриппа.

2.2. Рецепторная специфичность вирусов гриппа.

2.3. Эпидемии и пандемии гриппа XX века.

2.4. Циркуляция и антигенные свойства вирусов гриппа на рубеже XX-XXI веков.

2.5. Инфицирование людей вирусами гриппа птиц.

2.6. Инфицирование людей вирусами гриппа свиней. Начало пандемии XXI века.

ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ ПРОТИВОГРИППОЗНОГО ИММУНИТЕТА.

3.1. Характеристика постинфекционного иммунитета.

3.2. Популяционный иммунитет населения к вирусам, как показатель интенсивности циркуляции вирусов.

ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСОВ ГРИППА

4.1. Классические методы диагностики.

4.2. Методы индикации антигенов вирусов гриппа и антител к ним.

4.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

4.3.1. ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.

4.3.2. ПЦР с флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени.

4.3.3. Коммерческие тесты на основе ПЦР для диагностики гриппа.

4.4. Применение ДНК-микрочипов в диагностике гриппа.

4.5. Использование поверхностного плазмонного резонанса в диагностике гриппа.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И НАБЛЮДЕНИЯ.

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1.1. Эпидемические, пандемические и эталонные штаммы.

1.2. Клеточные линии.

1.3. Носоглоточные смывы.

1.4. Сыворотки доноров.

1.5. Сиалилолигосахариды.

1.6. Наборы реактивов и тест-системы ПЦР.

1.7. Сорбенты.

1.8. Стандартные методики, использованные в работе.

1.8.1. Изоляция и культивирование вирусов в КЭ.

1.8.2. Культивирование вирусов на культуре клеток МБСК.

1.8.3. Реакция гемагглютинации (РГА).

1.8.4. Получение иммунных сывороток к вирусам гриппа.

1.8.5. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА).

1.8.6. Определение термочувствительности поверхностного белка НА.

1.8.7. Изучение рецепторной специфичности НА.

1.8.8. Получение очищенных препаратов вирусов гриппа дифференциальным центрифугированием.

1.8.9. Определение специфических антител к современным вирусам гриппа у доноров.

1.8.10. Выделение вирусных нуклеиновых кислот.

1.8.11. Проведение реакции обратной транскрипции (ОТ).

1.8.12. Проведение полимеразной цепной реакции.

1.8.13. Электрофорез кДНК в агарозном геле.

1.8.14. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.

1.8.15.Секвенировани е.

1.8.16.Статистическая обработка серологических данных.

1.8.17. Поверхностный плазмонный резонанс.

ГЛАВА 2. ЭВОЛЮЦИЯ ВИРУСОВ ГРИППА А И В, ЦИРКУЛИРОВАВШИХ В РОССИИ В ПЕРИОД 2006-20Югг.

2.1. Антигенные свойства вирусов гриппа А и В, циркулировавших в

России с 2006г. по 20 Юг.

2.2. Биологические свойства эпидемических штаммов вирусов гриппа, изолированных в период с 2006 г. по 2009 г.

2.2.1. Чувствительность систем изоляции культуры клеток МБ С К и КЭ к современным эпидемическим штаммам вирусов гриппа.

2.2.2. Чувствительность эритроцитов человека и кур к эпидемическим штаммам вирусов гриппа.

2.2.3. Влияние температурного воздействия на активность поверхностного белка НА эпидемических штаммов вирусов гриппа.

2.3. Состояние популяционного иммунитета населения к эпидемическим штаммам вирусов гриппа А и В в зависимости от периода эпидемического цикла.

2.3.1. Сравнительные исследования популяционного иммунитета к вирусам гриппа А и В населения Приморского края и Еврейского автономного округа России в октябре 2006гг.

2.3.2.Состояние популяционного иммунитета к современным эпидемическим штаммам вирусов гриппа А и В с 2006 г. по 2009 г. у населения (доноров) г.Москвы и Московской области.

ГЛАВ A3. ОСОБЕННОСТИ ПАНДЕМИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА В РОССИИ.

3.1. Выявление первых случаев заболевания, вызванного вирусом гриппа A(HlNl)v подобного свиному.

3.2. Развитие пандемии на основе анализа материалов от больных методом ПЦР в течение 2009-2010гг.

3.3. Антигенные свойства пандемических штаммов вирусов гриппа A(HlNl)v, циркулировавших в России в 2009-20 Югг.

3.4. Биологические свойства пандемических штаммов вирусов гриппа A(HlNl)v, изолированных в России в период с 2009 по 20 Югг.

3.5. Состояние популяционного иммунитета к пандемическим штаммам вирусов гриппа A(HlNl)v у населения (доноров) г.Москвы и Московской области в период

2009-20Югг.

ГЛАВА 4. ПРИМЕНЕНИЕ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ГРИППОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ.

4.1. Тест-система Нарвак.

4.2. Тест-системы АмплиСенс.

4.3. Тест-система МультиРесп.

4.4. Тест-системы ДНК-технология.

4.5. Использование иммунносорбции и поверхностного плазмонного резонанса для детекции белков вирусов гриппа в растворах.

4.5.1. Сорбция кДНК на полианилинсодержащие сорбенты.

4.5.2. Определение кДНК и комплексов антиген-антитело вирусов гриппа в растворах методом поверхностного плазмонного резонанса.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мониторинг циркуляции вирусов гриппа в регионах России в 2006-2010 гг."

Актуальность проблемы

Грипп и острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) остаются одной из самых актуальных медицинских и социально экономических проблем. Грипп является опасной высококонтагиозной инфекцией, распространенной по всему миру и вызывающей заболевания у человека, многих видов млекопитающих и птиц. Во время эпидемии заболевает не менее 20-30% детей и 5-10 % взрослого населения, при пандемии - до 40-60% (Potter, 1998; Slepushkin et al., 2004; Гендон, 2007). Основная причина этого связана со способностью вируса гриппа преодолевать иммунитет, вызванный предшествующей гриппозной инфекцией или вакцинацией, благодаря естественной изменчивости генома возбудителя (Wilson & Сох, 1990; Гендон, 2008).

Реассортация генов вирусов гриппа человека, птиц и свиней, последующая реассортация вирусов гриппа свиней американской и евроазиатской генетических линий (WHO, 2009; Morens et al., 2009) привела к возникновению нового вируса A(HlNl)v, его активному распространению среди людей в странах разных континентов. Это вынудило экспертов ВОЗ объявить в июне 2009г. о начале новой пандемии XXI века. Благодаря современному транспортному сообщению, произошло быстрое проникновение вирусов в Российскую Федерацию из других стран. В России первый пандемический вирус гриппа был выделен в мае 2009г. от больного, вернувшегося из США, уже через два месяца после обнаружения первого случая заболевания в мире (Львов и др., 2009). Развитие пандемического процесса в России вызвало необходимость проведения исследований по изоляции и изучению молекулярно-биологических свойств пандемических штаммов из разных регионов.

Распространение высокопатогенного вируса гриппа A(H5N1) среди дикой и домашней птицы, а также регистрация случаев инфицирования этим вирусом людей (Сох, 2003; WHO, 2005; Webster&Govorkova, 2006) также может привести к возникновению антигенного варианта вируса гриппа - нового потенциального кандидата в пандемические штаммы (Львов и др., 2004; Webster et al., 2006; WER, 2008; MMWR, 2009). Быстрое проникновение вирусов гриппа A(H5N1) в нашу страну обусловлено соседством России со странами, где выделено большинство таких штаммов (WHO, 2010).

В настоящее время для выявления и идентификации вирусов широко используют молекулярные методы, специфичность которых основана на уникальности нуклеотидных последовательностей вирусных геномов (leven, 2007, Kesson, 2007). Наиболее распространенными методами являются различные модификации полимеразной цепной реакции (ПЦР). В настоящее время в России стали активно разрабатывать тест-системы на основе ПЦР для выявления вирусов гриппа и других ОРВИ. Сравнение чувствительности и специфичности, оценка способности этих систем выявлять вирусы гриппа в различных биологических образцах с учетом особенностей современного периода позволит усовершенствовать надзор за гриппом. Кроме того, важным направлением исследований является разработка новых подходов для диагностики гриппозной инфекции.

Цели и задачи исследования

Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

2. Изучить изоляты пандемических штаммов вируса гриппа А(НШ1)у в России, определить их антигенные и молекулярно-биологические свойства.

3. Изучить чувствительность различных систем, используемых для изоляции (культура клеток МОСК. и куриные эмбрионы (КЭ) и идентификации вирусов гриппа (эритроциты человека и кур), к эпидемическим и пандемическим штаммам, изолированным в период 2006-2010гг.

4. Определить влияние температурного воздействия на активность НА эпидемических и пандемических штаммов, изолированных в период 20062010гг. и обладающих разными антигенными свойствами.

Научная новизна работы

-На основании результатов вирусологических и серологических исследований определена этиологическая структура эпидемий гриппа в России с 2006г. по 2010г., установлена социркуляция вирусов гриппа А(НШ1), А(НЗИ2) и В в течение всего периода.

-Установлена эволюция вирусов гриппа А(НЗ^) в период с 2006 по 2009гг. Выявлена ежегодная смена антигенных вариантов, родственных новым эталонам А/Висконсин/67/05 и А/Брисбен/10/07.

-Установлено, что системы изоляции КЭ и МБСК чувствительны к пандемическим штаммам вируса гриппа А(НШ1)у; культура клеток МЕ)СК продолжает оставаться приоритетной системой для изоляции эпидемических штаммов вирусов гриппа из носоглоточных смывов.

-Выявлена чувствительность эритроцитов человека 0(1) группы крови и кур к пандемическим штаммам А(Н1Ш)у и увеличение чувствительности эритроцитов кур к современным эпидемическим штаммам вирусов гриппа А(НШ1), А(НЗШ) и В, изолированным в период с 2006 по 2010гг.

Практическая значимость работы

Установлено, что начало пандемического процесса в Российской Федерации в конце мая 2009г. обусловлено появлением на территории нашей страны нового пандемического штамма вируса гриппа А(НШ1)у. По материалам диссертации подана заявка на изобретение №2009129374/10 «Штамм вируса гриппа А/11У-Мозсо\у/01/2009 (НШ1)8\у1 для разработки средств и методов биологической защиты» (дата подачи 30.07.2009г.). Решение о выдаче патента РФ на изобретение получено 15.09.2009г.

В Государственную коллекцию вирусов депонированы оригинальные штаммы, которые определили новые этапы в распространении и изменчивости вирусов гриппа: 3 эпидемических штамма вирусов гриппа А/Москва/68/2007 (НШ1) (ГКВ№2610), А/Москва/40/2008 (НШ1) (ГКВ№2612), А/Москва/45/2007 (Н3№) (ГКВ№2611); 82 пандемических штаммов вирусов гриппа А(НШ1)у, полученных в соавторстве с сотрудниками НИИ вирусологии. Вирусы могут быть использованы в качестве кандидатов в вакцинные штаммы, а также для приготовления диагностикумов.

Обосновано применение культуры клеток МБСК для изоляции современных эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В и КЭ - для пандемических штаммов, использование эритроцитов человека 0(1) группы крови при их индикации и идентификации.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В эпидемический период 2006-2010гг. в России социркулировали вирусы гриппа А(НШ1), А(НЗЫ2) и В. Антигенный дрейф поверхностных белков НА происходил в направлении эталонных штаммов, рекомендованных ВОЗ.

2. Выявлена общая тенденция к увеличению тропизма эпидемических штаммов вирусов гриппа периода 2006-2009гг. к эритроцитам кур, по сравнению с предыдущими периодами наблюдения. Вирусы гриппа А(НШ1) и В сохраняют тропизм к системе изоляции КЭ, а вирусы гриппа A(H3N2) практически полностью утратили тропизм к КЭ.

Апробация работы

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 31 научных работ, в том числе 9 статей в реферируемых российских научных журналах, 1 заявка на патент и материалы докладов в сборниках российских и международных конгрессов и конференций.

Объем и структура диссертации

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Трушакова, Светлана Викторовна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рассматривая в целом картину распространения вирусов в России в период с 2006 по 2009 год по вирусологическим и серологическим данным и сопоставляя ее с литературными данными, показано, что эпидемии гриппа в России были обусловлены циркуляцией и социркуляцией вирусов гриппа А(НШ1), А(НЗШ) и В, родственных референс-штаммам, аналоги которых циркулировали в мире в рассматриваемый период. Зарегистрировано не полное соответствие свойств вакцинных и эпидемических штаммов: в сезоне 2007-2008 гг. и 2008-2009 гг. - по вакцинному штамму вируса гриппа В; 2007-2008 гг. - по обоим вакцинным штаммам вирусов гриппа А. Наибольшее несоответствие состава вакцинных штаммов с циркулировавшими вирусами наблюдалось в эпидсезоне 2007-2008гг. Это связано с трудностями по выделению новых антигенных вариантов современных эпидемических штаммов на куриных эмбрионах. Наши исследования показали, что эволюционные изменения происходили в структуре вирионных белков и приводили к изменению не только антигенных, но и других биологических свойств.

Внедрение в лабораторную практику тест-систем на основе ПЦР позволило нам выявить появление в РФ пандемического штамма А(НШ1)у и провести мониторинг циркуляции этих вирусов в период пандемии 2009-2010гг. Разработка новых тест-систем является важным шагом к усовершенствованию лабораторной диагностики и эпидемиологического надзора за распространением гриппа в целом.

Для обнаружения нуклеиновых кислот и комплексов антиген-антитело впервые предложен метод ППР с использованием пленок содержащих полианилин, который может быть применен в диагностике не только гриппа, но и других инфекций.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Трушакова, Светлана Викторовна, Москва

1. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. 3-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 1982, с.464

2. Букринская А.Г. Вирусология. М.: Медицина, 1986, с.336

3. Бурцева Е.И., Иванова В.Т., Оскерко Т.А., Слепушкин А.Н. Свойства вирусов гриппа А и В, выделенных на куриных эмбрионах и в культуре клеток MDCK. Вопр. вирусол. 2001, № 1, с.29-32.

4. Гайдамович С.Я. Классификация вирусов. В кн.: Общая и частная вирусология. М. Медицина, 1982, с.26-60.

5. Гамбарян A.C. Рецепторная специфичность вирусов гриппа разных хозяев. Автореферат диссертации, М.-2007.

6. Гендон Ю.З. Вакцины и химиопрепараты для профилактики гриппа. Вопр. вирусол., 2007, №1, с.4-10.

7. Гендон Ю.З. Пандемия гриппа: предположения и факты. Журн. микробиол., 2008, №5, с. 109-118.

8. Говоркова Е.А., Кизина A.A., Крылов В.Ф., Смирнов Ю.А. Уровень иммунитета населения к вирусам гриппа с гемагглютинином подтипа Н2. ЖМЭИ. 1993, N 6, с.58-59.

9. Гребенникова Т.В. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике и мониторировании лечения инфекционных заболеваний. Метод, указания для студентов мед.фак. РУДЫ, 2005, с.39.

10. Ю.Гринбаум Е.Б., Литвинова О.М., Банников А.И. и др. Полиморфизм популяции современных вирусов гриппа А и В человека. Вестник РАМН. 1994, N 9, с.36.

11. Зубов В.П. Капустин Д В. Композиционные сорбенты для выделения и очистки биополимеров -http://www.expo.ras.ru/base/proddata.asp?prodid=2178

12. Иванова В.Т., Бурцева Е.И., Слепушкин А.Н.и др. Особенности вирусов гриппа, обусловивших эпидемический подъем заболеваемости в России в 2002-2003 гг. Возврат в циркуляцию вирусов гриппа, подобных В/Виктория/2/87.// Вопросы вирусологии, 2004, №3, с. 12.

13. Иванова В.Т., Ракутина P.O., Слепушкин А.Н. и др. Свойства эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В, циркулировавших в эпидемическом сезоне 2004-2005 гг. в России. Вопр. вирусол., 2006, №6, с.27-30.

14. Иванова В. Т., Матюшина Р. О., Слепушкин А. Н., Бурцева Е. И. и др. Эпидемические штаммы вирусов гриппа А и В в сезоне 2005—2006 гг. в России. Вопр. вирусол., 2008 А, №4, с. 13-18.

15. Иванова В.Т, СапуринаИ.Ю., ИвановВ.Ф и др. Сорбция биологических объектов на нанокомпозиты полианилина и углеродных нанотрубок. Международный форум по нанотехнологиям, Москва, 6-8 октября 2009 г., С. 274-275.

16. Иванов В.Ф., Грибкова O.JL, Чеберяко К.В. и др. Матричный синтез полианилина в присутствии поли- (2-акриламидо-2-2метил-1-пропан)-сульфовой кислоты. Электрохимия.- 2004.- т.40.-№3.-с. 339-345.

17. Капустин Д.В., Ягудаева Е.Ю., Завада Л.Л., Жигис Л.С., Зубов В.П., Ярошевская Е.М., Плобнер Л., Лайзер Р.-.М., Брем Г. Композиционный полианилинсодержащий кремнеземный сорбент для выделения ДНК. Биоорг. хим., 2003, с.310-315.

18. Киреев Д. Е., Аканина Д. С., Гребенникова Т. В., Забережный А. Д., Щелканов М. Ю., Львов Д. К. Разработка тест-систем для выявления и типирования вируса гриппа А на основе полимеразной цепной реакции. Вопр. вирусол., 2007, №4, с. 17-22.

19. Киреев Д.Е. Разработка тест-систем на основе ПЦР для мониторинга вирусов гриппа А. Автореферат на соискание ученой степени к.б.н. 2007.

20. Князев Д.Г. Организация липид-белковых структур на примере вирусного белка Ml: электрохимический подход. 2008. Автореферат на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук.

21. Козлов Ю.В., Шилов A.A., Курманова А.Г., Горбунов В.Г. и др. Рекомбинантное происхождение эпидемического штамма А/СССР/90/77 вируса гриппа. ДАН. 1981, т.257, стр.721-724.

22. Ленинджер А. Биохимия. -М.: Мир.-1974.-с.68.

23. Литвинова О.М., Лузянина Т.Я. Этиология гриппа. Грипп. С.-П., 2001, с.7-31.

24. Львов Д.К., Ямникова С.С., Федякина И.Т. и др. Экология и эволюция вирусов гриппа в России в 1979-2002гг. Вопр. вирусол. 2004, №3, с. 17-24.

25. Матюшина Р.О., Трушакова С.В., Иванова В.Т., Иванов В.И., Бурцева Е.И. Современные подходы к диагностике и изучению вирусов гриппа. Материалы IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, 2008, с.23.

26. Михайлов И.Ф., Дьяков С.И. Люминесцентная микроскопия. М., 1961, с.106-110.

27. Найхин А.Н., Царицына И.М., Сыроедова Л.Г. и др. Антинейраминидазные сывороточные антитела при естественном инфицировании гриппом А и иммунизации гриппозными вакцинами. Вопр. вирусол.- 1983.-№ 3,- с.154-159.

28. Найхин А.Н., Царицына И.М., Олейникова Е.В. и др. Формирование и защитные функции антител к нейраминидазе вируса гриппа А. Вопр. вирусол.-1985.-№ 1.-С.35-39.

29. Никонова А. Выявление и идентификация респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени. Автореферат на соискание ученой степени к.б.н. 2008.

30. Нимадава П., Дондог Н., Алтанхуяг С., и др. Эпидемиологическая и этиологическая характеристика вспышки ОРЗ в апреле мае 1979 года в городе Улан-Баторе. Научно-практическая конференция, Улан-Батор. 1979, стр.23-24.

31. Перейра М., Ассад Ф.А., Делон П.Д. Эпидемический надзор за гриппом. Бюллетень ВОЗ. 1978, т.56, N 2, стр. 146-153.

32. Плиева Ф.М., Исаева Е.И., Лозинский В.И. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии.У1. Биоафинные сорбенты на основе сверхмакропористого носителя для работы с вирусными частицами //«Биотехнология», 1998, №5, с.3237.

33. Райтман O.A. Методическое пособие «Метод спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса для исследования физико-химических характеристик веществ на твердых подложках», 2010.

34. Сафенкова И.В. Взаимодействие вирусов растений с антителами: количественные закономерности и практическое применение. Автореферат на соискание ученой степени к.б.н., 2010.

35. Ровнова З.И. Получение специфических противогриппозных сывороток. Вопросы вирусологии, 1959, №4, с.465-470.

36. Слепушкин А.Н., Ритова В.В. и др. Гуморальный иммунитет к вирусам гриппа А и В в сыворотках крови детей моложе 14 лет в 1981 году. Вопр. вирусол. 1983, N5, с.564.

37. Слепушкин А. Н. Современные особенности эпидемиологии и профилактики гриппа. Журн. микробиол. 2001. № 1, с.95-99.

38. Ямникова С.С., Петров H.A., Нимадава П., Яхно М.А., Львов Д.К. Характеристика вирусов гриппа A(H1N1), родственных A/PR/8/34, изолированных в МНР. Вопр. вирусол. 1991, N 3, стр.188-191.

39. Яцышина С.Б.,. Миненко А.Н, Прадед М.Н., Волошина П.В., Трушакова C.B., Браславская С.И., Бурцева Е.И., Шипулин Г.А., Малеев В.В., Покровский В.И.

40. Диагностика гриппа: новый вариант A/H1N1 в России. Эпидемиология и инфекционные болезни, 2009, №6, с.56-62.

41. Яхно М.А., Исаченко В.А., Молибог Е.В., Ямникова С.С. и др. Реверсия в естественной изменчивости вируса гриппа А. Вопр. вирусол. 1978, N 2, с. 146151.

42. Яхно М.А., Закстельская Л.Я., Молибог Е.В. и др. Сравнительная характеристика эпидемических штаммов вирусов гриппа В 1980-1981гг. выделения. Вопр. вирусол. 1982, N 6, стр.656-661.

43. Ada G. L., Perry В. Т., Abbot A. J. Gen. Microbiol., 1958, v. 19, p. 23.

44. Adcock P. M., Stout G. G., Hauck M. A. et al. Effect of rapid viral diagnosis on the management of children hospitalized with lower respiratory tract infection. Pediatr. Infect. Dis. J. 1997,№16, p.842-846.

45. Allander Т., Jartti Т., Gupta S. et al. Human bocavirus and acute wheezing in children. Clin Infect Dis. 2007, №44, p.904-910.

46. Allen H.J., Mc.Cauley, Waterfleld M., Gething M.J. Influenza virus RNA segment 7 has the coding capacity for two polypeptides. Virology. 1980, N 107, p.438-442.

47. Allwinn R, Preiser W, Rabenau H, Buxbaum S, Sturmer M, Doerr HW. Laboratory diagnosis of influenza—virology or serology? Med Microbiol Immunol (Berl), 2002, 191, p.157-160.

48. Air G.M., Gibbs A.J., Laver W.G., Webster R.G. Evolutionary changes in influenza В are not primary governed by antibody selection. Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 1990, N 87, p.3884-3888.

49. Baltimor D. Expression of animal virus genomes. Bacterial Rev. 1971, v.35, p.235-241.

50. Berton M.T., Webster R.G. The antigenic structure of the influenza В virus hemagglutinin: Operation and topological mapping with monoclonal antibodies. Virology, 1985, 143, p.583-594.

51. Bidez R., Li S., MacDiarmid A.G. et al. Biomater.Sci.Polymer.Edn.2006.-V.17.- N 1-2.-P.212.

52. Biere В., Bauer В., Schweiger B. Differntiation of influenza В virus lineages Yamagata and Victoria by Real-time PCR. J.Clin.Microbiology, 2010, p.1425-1427.

53. Bridges C.B., Lim W., Primmer J.H., et al. Risk of influenza A(H5N1) infection among poultry workers, Hong Kong, 1997-1998. J. Infect. Dis. 2002; 185:1005-1010.

54. Bo Meng, Anthony C.Marriott, Nigel J.Dimmock. The receptor preference of infuenza viruses. Infuenza and Other Respiratory Viruses, 2010, 4(3), 147-153.

55. Boom R., Sol C.J., Salimans M.M. et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 1990. №28. p.495-503.

56. Buckler-White A.J., Murphy B.R. Nucleoproteide sequence analysis of nucleoprotein genes of an avian and a human virus strain identifies two classes of nucleoproteins. Virology, 1986, 155, p. 345-355.

57. Cafen A.C., Browelee G.C., Yewbell J.W. et al. The antigenic structure of the A/PR/8/34 hemagglutinin HI subtype virus. Cell. 1982, v.31, p.417-427.

58. CDC update: Influenza Activity United States, August 30, 2009 - March 27, 2010, and Composition of the 2010-11 Influenza Vaccine, MMWR, 2010, April 16, v. 59 №14, p .423-430

59. Chen W. et al. A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death. Nature Med., 2001, 7, p.1306-1312.

60. Chizhikov V., Wagner M., Ivshina A., et al. Detection and genotyping of human group A rotaviruses by oligonucleotide microarray hybridization. J.Clin.Microbiol. 2002, v.40, p.2398-2407.

61. Chonmaitree T., Mann L. Respiratory infections. Human Enterovirus Infections. Rotbart H.A. Washington, 1995, ch.5, p.255-270.

62. Choppin P.W., Schild A. The role of viral glycoproteine in adsorption, penetration and pathogenicity of viruses. Rev. Infect. Diseases. 1980, v.2, N 1, p.40-61.

63. Chuvakova Z.K., Rovnova Z.I., Isaeva E.I., Kim E.V., Ignat'eva T.V. 3 cases of isolating the influenza A virus with human hemagglutinin Hswl in 1983 in Alma-ta. Vopr. Virusol., 1985, v.30, p.530-536.

64. Claas E.C., Kawaoka Y., Jong J.C., Masurel N., Webster R.G. Infection of children with avian-human reassortant influenza virus from pigs in Europe. Virology, 1994, v.204, p.453-457.

65. Cinatl J Jr, Michaelis M, Doerr HW. The threat of avian influenza A (H5N1). Part IV: development of vaccines. Med Microbiol Immunol (Berl), 2007, 196, p.213-225

66. Compans R.W., Content J., Duesberg P.H. Structure of the ribonucleoprotein of influenza virus. J.Virol. 1972, N 10, p.795-900.

67. Coiras M.T., Aguilar J.C., Garcia M.L. et al. Simultaneous detection of fourteen respiratory viruses in clinical specimens by two multiplex reverse transcription nested-PCR assays. J Med Virol. 2004, №72, p.484-495.

68. Couch R.B. Scientific Aspects of influenza vaccination. In Abstracts et Final Program of the First International Conference on Influenza Vaccines for the World, 2004, Lisbon, Portugal

69. Davenport F., Minuse E., Henessy A. et al. Interpretation influenza patterns of man. Bull. WHO, 1969, v.41, p.453-460.

70. Dawood F.S., Finelli L., Shaw M.W., Lindstorm S. et al. Emergence of a novel Swine-Origin Influenza A(H1N1) virus in humans. N Engl J Med, 2009, v.360(25), p. 2605-2615.

71. Dawson, E. D., C. L. Moore, J. A. Smagala, D. M. Dankbar, M. Mehlmann, M. B. Townsend, C. B. Smith, N. J. Cox, R. D. Kuchta, and K. L. Rowlen. 2006. MChip: A new tool for influenza surveillance. Analytical Chemistry, v.78, p.7610-7615.

72. Ellis J, Iturriza M, Allen R, Bermingham A, Brown K, Gray J, Brown D. Evaluation of four real-time PCR assays for detection of inluenza A(HlNl)v viruses. Euro Surveill. 2009; 14(22):pii=l 9230.

73. Falsey A. R., Criddle M. C., Walsh E. E. Detection of respiratory syncytia! virus and human metapneumovirus by reverse transcription polymerase chain reaction in adults with and without respiratory illness. J. Clin. Virol. 2006, №35, p.46-50.

74. Field S., Winter G., Wraunlee G.C. Structure of the neuraminidase gene in human influenza virus A/PR/8/34. Nature. 1981, v.290, p.213-217.

75. Freymuth F., Quibriac M., Petitjean J. et al. Viruses responsible for respiratory infections in pediatrics. Evaluation of 3,480 nasal aspirates performed in children over a 6-year period. Ann Pediatr (Paris). 1987. - №34. - p.493-501.

76. Fronhoffs S., Totzke G., Stier S. et al. A method for the rapid construction of cRNA standard curves in quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction. Mol Cell Probes. 2002, №16, p.99-110.

77. Frutos A.G., Corn R.M., Anal. Chem. News&Feat. 1998, July, 449-455

78. Gambaryan, A.S. and M.N.Matrosovich. 1992. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J.Virol. Methods 39:111-123.

79. Gambaryan F., Yamnikova S., Lvov D. et al. Receptor specifity of influenzaviruses from birds and mammalians: new data in involvment of the inner fragmentsof the carboxylate chane.// Virolgy.-2005.-V.334.-P .276-283.

80. Gaydos J.C., Hodder R.A., Top F.H. et al. Swine influenza A at Fort Dix, New Jersey (January-Februery 1976). II. Transmission and morbidity in units with cases. J.Infect.Dis. 1977, v. 136 (Suppl.), p.S363-S368.

81. Ginocchio C.C. Detection of respiratory viruses using non-molecular based methods. Journal of Clinical Virology, 2007, v.40, № 1, p.l 1-14.

82. Gregory V., Bennett M., Thomas Y., et al. Human infection by a swine influenza A(H1N1) virus in Switzerland. Arch.Virol., 2003, v.143, p.793-802.

83. Gregory V., Lim W., Cameron K., et al. Infection of a child in Hong Kong by influenza A H3N2 virus closely related to viruses circulating in European pigs. J.Gen.Virol., 2001, v.82, p.1397-1406.

84. Hampson A. W., Mackenzie J. S. The influenza viruses. MJA. 2006. - V.185. -№10. -P.39-43.

85. Herrler, G. & Klenk, H. D. Structure and function of the HEF glycoprotein of influenza C virus. Adv Virus Res., 1991, 40, p.213-234.

86. Hidari KI, Shimada S, Suzuki Y, Suzuki T. Binding kinetics of influenza viruses to sialic acid-containing carbohydrates. Glycoconj J. 2007,24(9), p.583-90.

87. Hongo, S., Ishii, K., Mori, K., Takashita, E., Muraki, Y., Matsuzaki, Y. & Sugawara, K. Detection of ion channel activity in Xenopus laevis oocytes expressing influenza C virus CM2 protein. Arch Virol, 2004,149, p.35-50.

88. Jong J.C., Paccaud M.F., Ronde-Verloop F.M. et al. Isolation of swine-like influenza A(H1N1) viruses from man in Switzerland and The Netherlands. Ann.Inst.Pasteur.Virol.1988, v. 139, p.429-437.

89. Kantarovich-Prokudina E.N., Semyonova N.P., Yamnikova S.S., Berezina O.N., Zhdanov V.M. DNA Sequences in influenza virions. J. Gen. Virol. 1978, v.41, p.405-409.

90. Kawakami K., Ishihsha A., Hamaguchi M. RNA polymerase of Influenza virus comparisson of the virion associated RNA polymerase activity of verious strains of Influenza virus. J. Biochem. 1981, v.89, p. 1751-1757.

91. Kaverin N.V., Klenk H.-D. The effect of cell Denstity on influenza virus replication in CV-1 cell. J.Molecul.genet., 1995, N 2, p.26-33.

92. Kessler N., Ferraris O., Palmer K., et al. Use of the DNA Flow-Thru chip, a three dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses. J. Clin. Microbiol. 2004, v.32, p.2173-2185.

93. Kesson A. M. Respiratory virus infections. Pediatric respiratory reviews, 2007, №8, p.240-248.

94. Kida H., Ito T., Yasuda J. et al. Potential for transmission of avian influenza viruses to pigs. J. Gen. Virol., 1994, v.75, p.2183-2188.

95. Kilander A, R Rykkvin , S G Dudman , O Hungnes. Observed association between the HA1 mutation D222G in the 2009 pandemic influenza A(H1N1) virus and severe clinical outcome, Norway 2009-2010. Euro Surveill. 2010;15(9):pii=19498.

96. Klenk H.D., Carten W., Bosch F.X., Rott R. Virol, glycoproteins as determinents of pathogenicity. Med.microbiol. and immunol. 1982, v.170, N 3, p.145-153.

97. Kluska V., Macku M., Mensik J. Demonstration of antibodies against swine influenza viruses in man. Cesk Pediatr., 1961, v. 16, p.408-416.

98. Kordyukova L., Serebryakova M., Baratova A. and Michael Veit. S Acylation of the Hemagglutinin of Influenza Viruses: Mass Spectrometry Reveals Site-Specific Attachment of Stearic Acid to a Transmembrane Cysteine. J Virol. 2008, v.82(18), p. 9288-9292.

99. Krejnusova I, Gocnikovä H, Bystricka M, Blaskovicova H, Poläkovä K, Yewdell J, Bennink J, Russ G. Antibodies to PB1-F2 protein are induced in response to influenza A virus infection. Arch Virol. 2009, 154(10), p. 1599-604.

100. Krug R.M., Alonso-Cazlin F.X., Julkenen I., Katz M.C. Expression and replication of the influenza virus genom. The influenza viruses. Plenum Press, New York. 1988, p.89-132.

101. Lamb R.A. The Influenza virus RNA segments and their encoded proteins. In book: Genetic of Influenza viruses. Edds. Palese P., Kingsburg D.W. Springer-Verlay, Wien. New York. 1983, p.21-70.

102. Lamb R.A. Genes and proteins of the influenza viruses in the Influenza viruses., Edited by R.M. Krug, New York -London: Plenum Press, 1989, p.1-87.

103. Lamb R.A., Krug R.M. Orthomyxoviridae: The viruses and their replication// Fundamental virology /Knipe D.M., Howley P.M. Philadelphia, 2001. - Ch. 24. -P.725-769.

104. Lamb R.A., Zebedee L.S., Richardson C.D. Influenza virus protein in an integral membrane protein expressed on the infected cell surface. Cell. 1985, v.40, p.627-633.

105. Laver W.G., Valentine R.G. Morphology of the isolated hemagglutinin and neuraminidase subunits of influenza virus. Virology. 1969, v.38, p.105-119.

106. Lazarowitz S.G., Compans R.W., Choppin P.W. Influenza virus structural and nonstructural proteins in infected cells and their plasma membranes. Virology. 1971, v.46, p.830-843.

107. Lee W.M., Grindle K., Pappas T. et al. High-throughput, sensitive, and accurate multiplex PCR-microsphere flow cytometry system of large-scale compehensive detection of respiratory viruses. J Clin Microbiol., 2007, №45, p.2626-2634.

108. Li H., McCormac M.A., Estes R.W. et al. Simultaneous detection and high throughput identification of a panel of RNA viruses causing respiratory tract infections. J Clin Microbiol. 2007, №45, p. 2105-2109.

109. Li S., Shulman J., Itamaurra S., Palese P. Glycosylation of neuraminidase determines the neuraminidase determines the neuravirulence of influenza A/WSN/33 virus. J. Virol., 1993, v. 67,N 11 , p.6667-6673.

110. Lipshutz R.J., Fodor S.P., Ginderas T.R., and Lockhart D.J. High density synthetic oligonucleotide arrays. Nat.Genet. 1999, v.21, p.20-24.

111. Liu C., Elhelberger M.C., Compans R.W., Air G.M. Influenza type A virus neuraminidase does not play a role in viral entry, replication, assembly or budding. J. Virol. 1995, v.69, N 2, p.1099-1100.

112. Lodes M. J., Suciu D., Wilmoth J. L. at al. Identification of Upper Respiratory Tract Pathogens Using Electrochemical Detection on an Oligonucleotide Microarray. PLoS ONE. 2007, №9, p. 1-11.

113. Lvov D.K., Yamnikova S.S., Petrov N.A., Kawaoka Y., Webster R.G. Vatiety of influenza viruses isolated from atypical situations. Option for the control of Influenza II, Excepta Medica, eds. C.Hannoun et al. 1993, p.208-216.

114. Mackay I.M., Arden K.E., Nitsche A. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res. 2002, №30, p.1292-1305.

115. Mahony J., Chong S., Merante F. et al. Development of a respiratory virus panel (RVP) test for the detection of twenty human respiratory viruses by using multiplex PCR and a fluid microbead-based assay. J Clin Microbiol. 2007, №45, p.2965-2670.

116. Mackie P. L. The classification of viruses infecting the respiratory tract. Paediatric reviews. 2003. - № 4. - P.84-90.

117. MacKenzie D. Bird flu may spread within families. New Scientist.com news service, 8 April 2008 at: www:newscientist:com.

118. Mantripragada K.K., Buckley P.G., de Stahl T.D. et al. Genomic microarrays in the spotlight. Trends Genet. 2004, v.20, №2, p.87-94.

119. Masurel N. Serological characteristics of a "new" serotype of influenza A virus: the Hong Kong strain. Bull. WHO, 1969, v.41, p.461-468.

120. Masurel N., Marine W. Recycling of Asian and Hong Kong influenza A virus hemagglutinin in man. Am. J. Epidemiol., 1973, v.91, p.44-49.

121. Matrosovich M., Gambaryan A., Tuzikov et al. Probing of the receptor binding sites of the HI and H3 influenza A and B viruses hemagglutinins by synthetic and natural sialosides. Virology, 1993, v. 196, p. 111 -121.

122. Matrosovich M., Krauss S., Webster R. // Virology. 2001. V. 281. P. 156.

123. Matrosovich M. N., T. Y. Matrosovich, T. Gray, N. A. Roberts, and H.-D. Klenk. Human and avian influenza viruses target different cell types in cultures of human airway epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004 A, 101:4620-4624.

124. McKeon K.D., Lewis A., Freeman J. W. Electrospun Poly(D,L-lactide) and Polyaniline Scaffold Characterization. Wiley InterScience,2009. www.interscience.wiley.com

125. Mandenius CF, Wang R, Alden A, Bergstrom G, Thebault S, Lutsch C, Ohlson S. Monitoring of influenza virus hemagglutinin in process samples using weak affinity ligands and surface plasmon resonance. Anal Chim Acta. 2008, 623(1), p.66-75.

126. Meng Bo, Marriott Anthony, Dimmock Nigel. The receptor preference of influenza viruses. Influenza and other respiratory virus 4(3), p. 147-153.

127. Michaelis M., Doerr H.W., Cinatl J. Of chickens and men: avian influenza in humans. Curr Mol Med, 2009, v.9, p. 131-151.

128. Michaelis M., Doerr H.W., Cinatl J. Novel swune-pandemic influenza A virus in humans: another pandemic knocking at the door. Med Microbiol Immunol, 2009, v.198, p.175-183.

129. Mir-Shekary S.Y.,Asford D.A.,Harvey D.J.,Dwek R.A.,Shulze I. The glycosylation of the influenza A virus hemagglutinin by mammalian cell-a site specific study.J.Biol.Chem., 1997, v.212, p.4027-4036.

130. Morbidity and Mortality Weekly Report (MMWR). Update: Swine A(H1N1) infection in two children southern California. March-April 2009.// CDC.-2009.-Vol.58.-N.17.-p.400-402/

131. Murphy B.R., Clements M.L. The systemic and mucosal response of humans to influenza A virus. Curr.Top.Microbiol.Immunol.-1989.-V.146.-P. 107-116.

132. Murphy B.R., Webster R.G. Ortomyxoviruses. Fields' Virology, 3rd edn., eds Fields B.N., Knipe D.M et al.-1996.-Lippincott-Raven, Philadelphia.-P.1397-1445.

133. Murti K.G., Webster R.G., Jonest I.M., Localization of RNA polymerases on influenza viral ribonucleoproteins by immunogold labeling. Virology. 1988, v. 164, p.562-566.

134. Myers K.P., Olsen K.W., Gray G.C. Cases of swine influenza in humans: a review of the literature. 2007, Clinical Inf. Disease, v.44, p. 1084-1088.

135. Nakagawa Y., Kimuro N., Toyoda T., Mizumoto K. et al. The RNA PB2 subunit is not required for replication of the influenza virus genom, but is involved in capped mRNA synthesis. J. Virol. 1995, v.69, N 2, p.728-733.

136. Nakamura K., Compans R.W. Glycopeptide components of influenza viral glycoproteins. Virology. 1978 6, v.96, p.432-442.

137. Neumann G., Noda T., Kawaoka Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Reviews. Nature, 2009. v.459, p.931-938.

138. Nilsson C.E., Abbas S., Bennemo M., Larsson A., Hàmàlâinen M.D., Frostell-Karlsson A. A novel assay for influenza virus quantification using surface plasmon resonance. Vaccine. 2010 Jan 8;28(3), p.759-66.

139. Normile D. Pandemics skeptics warn against crying wolf. Science, 2005, 310, p.l 112-1113.164.01sen C.W., Karasin A.I., Carman S. et al. Triple reassortant H3N2 influenza A viruses, Canada, 2005. Emerg. Infect. Dis. 2006, v.12, p. 1132-1135.

140. Palese P., Shulman J.L. Mapping of the influenza virus genome: identification of the hemagglutinin and the neuraminidase genes. PNAS USA. 1976, v.73, p.2142-2146.

141. Palese P., Ritchey M.B., Shulman J.L. Mapping of the influenza virus genome 11 Identification of the P1,P2 and P3 gene. Virology. 1977, v.76, p.l 14-1121.

142. Patriarca P.A., Kendal A.P., Zakowsky P.C. et al. Lack of significant person-to-person spread of swine influenza-like virus following fatal infection in an immunocompromised chold. Am.J.Epidem.-1984.V.l 19.-N.2.-P. 152-158.

143. Porter A.G., Smith J.C., Emtage J.S. The sequence of influenza virus RNA segment 8 indicates that the coding regions for the NS1 and NS2 protein overlap. PNAS USA. 1980, v.77, p.5074-5078.

144. Potter C.W. Chronicle of Influenza pandemics. In: Nicholson KG, Webster RG, Hay AJ, editors. Textbook of influenza. Oxford: Blackwell Science, 1998, p.3-18.

145. Ungchusak K, Auewarakul P, Dowell SF, et al. «Probable person-to-person transmission of avian influenza A (H5N1)». N Engl J Med, 2005, 352 (4), p. 333^10.

146. Rohm C., Zhou N., Suss J., Mackenzie J., Webster R. Characterization of novel influenza hemagglutinin HI5, criteria for determination of influenza A subtypes. Virology. 1996, v 217, p.508-516.

147. Rogers G., D'Souza B. Receptor binding properties of human and animal HI influenza virus isolates. Virology, 1989, v.173, p.317-322.

148. Rosenberg MR, Casarotto MG. Coexistence of two adamantane binding sites in the influenza A M2 ion channel. Proc Natl Acad Sci USA. 2010,107(31), p.13866-71.

149. Rosenthal, P. B., Zhang, X., Formanowski, F., Fitz, W., Wong, C. H., Meier-Ewert, H., Skehel, J. J. & Wiley, D. C. Structure of the haemagglutinin-esterase-fusion glycoprotein of influenza C virus. Nature, 1998, 396, p.92-96.

150. Rota P.A., Hemphill M.L., Whistler H.L., Regnery H.L., Kendal A.P. Antigenic and genetic characterization of two hemagglutinins recent cocirculationg strains of influenza type B virus. J. Gen. Virol. 1992, v.73, p.2737-2742.

151. Richardson J., Akkina R. NS2 protein of influenza virus is found in purified virus and phosphorylated in infected cells. Arch. Virol. 1991. - №116. - P.69-80.

152. Rimmelzwaan G., Jong J., Bestebroer T. et al. Antigenic and genetic characterization of swine influenza A(H1N1) viruses isolated from pneumonia patients in The Netherlands. Virology, 2001, v.282, p. 301-306.

153. Sasaki S., R. Nagata, B. Hock, I. Karube, Anal. Chim. Acta 1998, 368, 71-76

154. Scholtissek C. Pigs as the 'mixing vessel' for the creation of new pandemic influenza A virus. Med Princip Prac, 1990, 2, p.65-71.

155. Schulze I. Virology. 1970, v.42, p.890.

156. Schulze I.T. Effect of glycosylation of influenza virus gemagglutinin. J.of Infection Disiases. 1997, v.176, p.24-28.

157. Schulze I.T., Fitch W.M., Ludwig S. et al. Evolution of pig viruses. Virology, 1991, v.183, p.61-73.

158. Sengupta S., Onodera K., Lai A., and Melcher U. Molecular detection and identification of influenza viruses by oligonucleotide microarray hybridization. J.Clin.Microbiol. 2003, v.41, p.4542-4550.

159. Shaw M.W., Lamb R.A., Erickson B.W., Briedis D.J. and Choppin P.W. Complete nucleotide sequence of the neuraminidase gene of influenza B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982a, v.79, p.6817-6821.

160. Schofield DJ, Dimmock NJ. Determination of affinities of a panel of IgGs and Fabs for whole enveloped (influenza A) virions using surface plasmon resonance. J Virol Methods. 1996, 62(1), p.33-42.

161. Shope R., Lewis P. Swine influenza: experimental transmission and pathology. J.Exp.Med. 1931, v.54, p.349-359.

162. Shinde V., Bridges C.B., Uyeki T.M., Shu B. et all. Triple-reassortant swine inXuenza A (HI) in humans in the United States, 2005-2009. N Engl J Med, 2009, v.360, N 25, p.2616-2625.

163. Simonsen L., Clarcke M.J., Williamson G.D., et al. The impact of influenza epidemics on mortality: introducing a severity index. Am. J. Public Health, 1997, v.87, p.1944-1950.

164. Skehel J. J., Waterfield M.D. Studies on the primary structure of the influenza virus hemagglutinin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975, v.72, N 1, p.93-97.

165. Skehel J.J., Stevens D.J., Daniels R.S. et al. A carbohydrate side chain on hemagglutinins of Hong Kong influenza viruses inhibits recognition by monoclonal antibody. PNAS USA,1984,v.81, N 6, p.1779-1783.

166. Smith W., Andrews C.H., Laidlaw P.P. A virus obtained from influenza patients. Lancet, 1933, v.225, p.66-68.

167. Smith T.F., Burgert E.O., Dowdle W.R., Noble G.R. et al. Isolation of swine influenza virus from autopsy lung tissue of man. N.Engl. J.Med., 1976, v.294, p.708-710.

168. Smirnov Yu.A., Kuznetsova M.A., Kaverin N.V. The genetic aspects of Influenza virus filamentous particle formation. Arch. Virol. 1991, v.l 18, p.279-284.

169. Song J., Cheng Q., Zhu S., Stevens R.C. "Smart" materials for biosensing devices: cell-mimcking supramolecular assemblies and colorimetric detection of pathogenic agents. Biomedical Microdevices: 4:3. 2002. p. 213-221.

170. Sota H., Hasegawa Y., Iwakura M. Anal. Chem. 1998, 70, 2019-2024

171. Soundararajan V, Tharakaraman K, Raman R, Raguram S, Shriver Z, Sasisekharan V, Sasisekharan R. Extrapolating from sequence—the 2009 H1N1 'swine' influenza virus. Nat Biotechnol. 2009 Jun;27(6):510-3.

172. Stieneke-Grober A, Vey M, Angliker H, Shaw E, Thomas G, Roberts C, Klenk HD, Garten W. Influenza virus hemagglutinin with multibasic cleavage site is activated by furin, a subtilisin-like endoprotease. EMBO J, 1992, 11, p.2407-2414.

173. Takemoto D.K., Skehel J.J., Wiley D.C. A surface Plasmon resonance assay for binding of influenza virus hemagglutinin to its sialic acid receptor. Virology, 1996, v.217, N2, p.452-458.

174. Taubenberger J.K., Reid A.H., Lourens R.M., Wang R., Jin G. & Fanning T.G. Characterization of the 1918 influenza virus polymerase genes. Nature, 2005, v.437, p.889-893.

175. Templeton K.E., Scheltinga S.A., van den Eeden W.C. Improved diagnosis of the etiology of community acquired pneumonia with real-time polymerase chain reaction//Clin Infect Dis. 2005. - №41. - P.345-351.

176. Thompson W.W., Shay D.K., Weintraub E., Brammer L., Cox N., Anderson L.J., Fukuda K. Mortality associated with influenza and respiratory syncytial virus in the Unated States. JAMA, 2003, v.289, p. 179-186.

177. Tsoi P.Y., Yang J., Sun Y., S. Sui, M. Yang, Langmuir 2000,16, 6590-6596

178. Tumpey TM, Basler CF, Aguilar PV, Zeng H, Solorzano A, Swayne DE, Cox NJ, Katz JM, Taubenberger JK, Palese P, Garcia-Sastre A. Characterization of the reconstructed 1918 Spanish influenza pandemic virus. Science, 2005, v.310, p.77-80.

179. Ulman I., Broni B., Krug R.M. Role of two of the influenza virus core proteins in recognizing virus RNA transorphion PNAS USA. 1981, v.78, p.7355-7359.

180. Underwood P.A. Antigenic map of the hemagglutinin of the influenza Hong Kong subtype H3N2 constructed using mouse monoclonal antibodies. Mol.Immunol., 1983, v.126, p.370-375.

181. Underwood P.A. Antigenic map of the hemagglutinin of the influenza Hong Kong subtype H3N2 constructed using mouse monoclonal antibodies. Mol.Immunol., 1984, v.21, p.653-667.

182. Vernet G. Molecular diagnostics in virology//J Clin Virol. 2004. - №31. - P. 239247.

183. Vijgen L., Keyaerts E., Moes E. et al. Development of one-step, real-time, quantitative reverse transcriptase PCR assays for absolute quantitation of human coronaviruses OC43 and 229E. J Clin Microbiol. 2005, №43, p.5452-5456.

184. Ward C.W., Dopheice T.A.A. Primary structure of the Hong Kong H3 hemagglutinin. Brit. Med. Bull. 1979, v.35., N 1, p.51-56.

185. Watzinger F., Suda M., Preuner S. et al. Real-time quantitative PCR assays for detection and monitoring of pathogenic human viruses in immunosuppressed pediatric patients. J Clin Microbiol. 2004, №42, p.5189-5198.

186. Webster R.G., Campbell C.H., and Granoff A. The "in vivo" production of "New" influenza viruses (I). Virology, 1971, 44, p.317-328.

187. Webster R.G., Campbell C.H., and Granoff A. The "in vivo" production of "New" influenza viruses (III). Virology, 1973, 51, p.149-162.

188. Webster R.G., Bean W.J., Corman O.T., Chambers T.H., Kawaoka Y. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol. Rev. 1992, v.56, p.152-179.

189. Webster R., Guan Y., Peiris M., Chen H. H5N1 Influenza continues to circulate and change. Microbe., vol.1, №12, 2006, p.559-565.

190. Webster R.G., Kawaoka Y. Influenza -an emerging and re-emerging disease. Seminar in Virology. 1994, v.5, p.103-111.

191. WER, Recommendations for the composition of Influenza virus vaccines. 1998, 2000,2006, 2007.

192. WER. Influenza. 2002, v.78, N 46, p.381-384.

193. WER, Influenza. 2003, v.78, N 11, p.81-88.

194. WER, Influenza. 2007, v.82, N 6, p.41-48.

195. WER, Influenza. 2007, v.82, N 9, p.69-76.

196. WER, Influenza. 2007, v.82, N 40, p.345-356.

197. WER, Influenza. 2008, v.83, N 41, p.365-372.

198. WER, Influenza. 2009, v.82, N 9, p.65-76.

199. WHO recommendations on the use of rapid testing for influenza diagnosis. Geneva, 2005, document available athttp://www.who.int/csr/disease/avian influenza/guidelines/rapid testing/en/index.html

200. Wiley D.S., Wilson I.A., Skehel J.J. Structural identification of the antibody -binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and twir involvement in antigenic variation. Nature. 1981, v.289, p.373-378.

201. Wiley D.C., Skehel J.J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Revier of Biochemistry. 1987, v.56, p.365-394.

202. Wilson I.A., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure of haemagglutinin membrain glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. Nature, London. 1981, v.289, p.365-373.

203. Wilson, I. A. & Cox, N. J. Structural basis of immune recognition of influenza virus hemagglutinin. Annu Rev Immunol, 1990, №8, p.737-771.

204. Wittwer C. T., Herrmann M. G., Cameron N. et al. Real-Time Multiplex PCR. Methods. 2001, №25, p.430-442.

205. Wong S.S.Y., Yuen K. Avian Influenza virus infection in humans. Chest 2006; 129: 156-168.

206. Woo P. C., Chiu S. S., Seto W. H. et al. Cost-effectiveness of rapid diagnosis of viral respiratory tract infections in pediatric patients. J. Clin. Microbiol. 1997. - №35. -p.1579-1581.

207. Xu X., Guo Y., Rota P., Hemphill M., Kendal A., Cox N. Genetic reassortment of human influenza virus in nature. Options for the Control of Influenza II. 1993, p.203-207.

208. Ye Z., Pal R., Fox J.W., Wagner R.R. Functional and antigenic domains of the matrix (Ml) protein of influenza A virus. J.Virol., 1987, v.61, p.239-246.

209. Yuen K.Y., Chan P.K., Peiris M. et al. Clinical features and rapid viral diagnosis of human disease associated with avian influenza A/H5N1 virus. Lancet, 1998, v.351, p.467-471.

210. Zammatteo M., Hamels S., De Longueville F., et al. New chips for molecular biology and diagnostics. Biotechnol. Annu. Rev. 2002, v.8, p.85-101.

211. Zayats M., O.A. Raitman, V.I. Chegel, A.B. Kharitonov, I. Willner, Anal. Chem. 2002, 74, 4763-4773

Информация о работе

Трушакова, Светлана Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.02

Диссертация

Мониторинг циркуляции вирусов гриппа в регионах России в 2006-2010 гг. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы