Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярный механизм антимикробного действия микроцина С

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярный механизм антимикробного действия микроцина С"

\ I На правах рукописи

КАЗАКОВ Теймур Спартакович

Молекулярный механизм антимикробного действия микроцина С

03 00 26 - молекулярная генетика 03 00 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

003168933

Работа выпочнена в Институте белка РАН (Пущино) и в Институте им Ваксмана Университета Ратгерс (Waksman Institute, Rutgers University, USA)

Научные руководители

доктор биологических наук К В Северинов

доктор биологических наук В А Колб

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор А С Миронов

кандидат химических наук Т С Зацепин

Ведущая организация Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов им Г К Скрябина РАН

Зашита состоится «»¿СА&Ачф 2008 г в // на заседании диссертационного совета Диссертационном совете Д 002 03701 Института биологии гена РАН по адресу 119334, Москва, ул Вавилова, д 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института чотекулярнои биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, Москва ут Вавилова, д 32

Автореферат разостан « Zb

Ученый секретарь

Диссертационного совета, ур ____ /О

канд фарм наук ^¡Tfoc^zJp с Грабовская

Общая характеристика работы

Актуальность темы Для успешного выживания в условиях конкуренции с другими организмами бактерии выработали ряд приспособлений, одним из которых является продукция антимикробных веществ Антимикробные вещества, производимые бактериями, делятся на синтезируемые ферментативно и на кодируемые генами и синтезируемые на рибосомах Микроцины - антимикробные вещества, закодированные в геноме бактерий и синтезируемые путем трансляции на рибосомах Микроцины являются важным компонентом экологии микроорганизмов и многообещающим классом антибиотических веществ Среди разнообразия этих антибиотиков особое место занимают микроцины, имеющие цитогоизматические мишени в поражаемых клетках Такие микроцины имеют крайне необычные структуры и ингибируют рост чувствительных клеток, проникая в цитоплазму и действуя на внутриклеточные мишени, такие как ДНК-гираза, ДНК-зависимая РНК-полимераза и аспартил-тРНК-синтетаза

Микроцин С (МсС) - антибактериальный нуклеотид-гептапептид, продуцируемый некоторыми штаммами Е coli МсС действует на многие грам-отрицательные, а так же, в отличие от других микроцинов, на грам-положительные бактерии

Гены, необходимые для продукции микроцина С, расположены на плазмиде природного происхождения (плазмида pUHAB, использованная в работе, -производное такой плазмиды) Гены тсс А, тссВ, mccD и тссЕ участвуют в продукции МсС, а тссС и тссЕ - в экспорте микроцина из клетки и иммунности к нему Все вместе они образуют один оперон, первым в котором расположен ген тссЛ, 21 нуклеотидная пара которого кодирует пептидную часть МсС Таким образом, тссА является самым коротким из известных генов В процессе синтеза микроцина С гептапептид, продукт гена тссА, подвергается значительным изменениям, механизм осуществления которых до конца неясен С-концевой аспарагин МссА дезаминируется, превращаясь в аспарагиновую кислоту, к которой присоединяется остаток АМФ (через фосфоамидатную связь) Остаток АМФ также модифицирован путем присоединения ггропиламина к фосфатной группе Как реализует свои антибактериальные свойства эта химерная структура, оставалось неясным В настоящей работе мы показали, что микроцин С относится по своему

принципу действия к интереснейшей группе антибиотиков - троянских коней Принципиальное отличие таких антибиотиков состоит в том, что в интактном состоянии они не являются ингибиторами какого-либо клеточного процесса Клетка-мишень сама транспортирует их в цитоплазму, где подвергает модификации (процессингу), например, гидролизуя какие-то связи в молекуле антибиотика Этот ряд действий со стороны клетки-мишени высвобождает активную часть антибиотика, которая ингибирует свою внутриклеточную мишень Таким образом клетка-мишень сама делает веб, чтобы себя убить

Цель работы и задачи исследования Целью настоящей работы было изучение механизма действия микроцина С В задачи данного исследования входило

1 Идентифицировать внутриклеточную мишень микроцина С

2 Идентифицировать внутриклеточные ферменты, процессирующие антибиотик

3 Провести структурно-функциональный анализ пептидной части микроцина С Научная новизна п практическая ценность. Изучение микроцинов интересно само по себе, так как они отличаются необычными и непохожими между собой структурами, образующимися в результате посттрансляционных модификаций Кроме того, изучение механизмов действия микроцинов способствует получению сведений о работе и структуре их мишеней - ключевых ферментов в жизнедеятельности бактерий Троянский конь как модель действия антибиотика становится более актуальной по причине развития устойчивости у патогенных микроорганизмов к стандартным антибактериальным веществам С практической точки зрения микроцины и их более активные производные, полученные искусственным путем, могут найти применение как при лечении бактериальных инфекций (микроцины активны против ряда патогенных микроорганизмов), так и в роли консервантов в пишевой промышленности В случае микроцина С, появляется возможность изучать не только белки его транспорта, мишень (аспартил-тРНК-синтетазу), но и ферменты, которые осуществляют его процессинг В настоящей работе мы идентифицировали все ответственные за процессинг белки - пептидазы и деформилазу Возможность" внесения изменений в микроциновый ген,-кодирующий-пептидную часть антибиотика, позволяет изучать механизм деградации олигопептидов в клетке

Апробация данной работы Казаков ТС опубликовал результаты работы в 4

статьях Также результаты были представлены на 2 конференциях

Структура и объём работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы,

материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения,

выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на 100 страницах

машинописного текста и содержит 40 рисунков Библиография включает в себя 110

названий

Результаты работы

Диссертационная работа подразделяется на три различных по своей тематике, но логически связанных исследования Первая, и основная, часть работы -определение механизма действия и поиск внутриклеточной мишени нового антибиотика микроцина С Второе исследование посвящено поиску клеточных ферментов, ответственных за процессирование микроцина Третья часть работы сводится к структурно-функциональному анализу антибиотика

Микроцин С действует по принципу троянского коня

Ранее было показано (Guijairo et al, 1995), что микроцин С (рис 1) в концентрации 10 цМ подавляет на 50% бесклеточную сопряж4нную систему транскрипции-трансляции на основе экстракта из клеток Ecoh Однако нам не удалось получить такой же результат при воспроизведении этого эксперимента Использованный в работе метод измерения количества синтезированного белка по его ферментативной активности отличался более высокой чувствительностью антибиотик добавляли в систему транскрипции-трансляции гена светлячковой люциферазы Даже в течении 60-ти минутной работы бесклеточной системы значительного снижения ферментативной активности люциферазы по сравнению с контролем без антибиотика обнаружено не было Guijarro и соавторы наблюдали подавление белкового синтеза в течении 30 минут

время трансляции, минуты

Рисунок 2 Действие интактного микроцина С и гептапептидов на синтез белка в бесклеточной системе транскрипции-трансляции Система транскрипции-трансляции на основе ЭЗО экстракта из ЕсоИ содержала плазмиду рТ71ис, несущую ген светлячковой люциферазы и РНК-полимеразу фага Т7 Количество синтезированного белка в системе определяли непрерывно в реальном времени по свечению синтезируемой люциферазы (система трансляции содержала все субстраты люциферазы) В реакционные смеси были добавлены буферный раствор (контроль), микроцин С, гептапептид МКТСЫАО (пептид Э), гептапептид МЯТСЫЛЫ (пептид Ы) Ни одно из перечиненных веществ не подавляет синтез люциферазы

Более того, они выдвинучи гипотезу, в соответствии с которой~активной~частью микроцина является гептапептид MRTGNAD, а нуклеозид монофосфат играет в антибиотике транспортную роль При этом на специфическую активность микроцина in \ч!го не влияет наличие нуклеотидной части Мы проверили эту гипотезу,

синтезировав два очигопептада - MRTGNAD (пептид D),соответствующий интактному микроцину С, и MRTGNAN (пептид N), продукт микроцинового гена тссА Результат проверки их действия на систему транскрипции-трансляции можно видеть на рис 2 как интактный микроцин, так и оба типа гептапептидов не оказали действия на синтез люциферазы in vitro

время трансляции, минуты

Рисунок 3 Действие процессированного микроцина на синтез белка в бесклеточной системе транскрипции-трансляции В бесклеточную систему (см подпись к рис 2) добавляли буферный раствор (контроль), интактный или процесированный микроцин Видно, что процессированный антибиотик полностью подавляет синтез люциферазы в бесклеточной системе Смесь, в которой проводили процессинг микроцина, не оказывает действия на систему синтеза белка, процессированный микроцин не оказывает действия на ферментативную активность люциферазы (данные этих контролей не приведены)

Мы предположили, что отсутствие действия микроцина С на систему беткового синтеза ш vitro говорит о наличии стадии процессинга антибиотика, необходимой для высвобождения его активной формы Для проверки этой гипотезы микроцин С инкубировали с грубым нефракционированным клеточным экстрактом из клеток Ecoh в течении нескольких часов В результате такой инкубации антибиотик потерял способность действовать на клетки, но стал сильным ингибитором бесклеточной системы синтеза белка (рис 3) Такой микроцин мы назвали «процессированный микроцин С»

Далее было показано, что именно стадия трансляции мРНК в ходе синтеза белка подавляется процессированным МсС (рис 4а) Оставалось непонятным, почему в бесклеточной системе транскрипции-трансляции не происходит процессирования микроцина, поскольку система содержит экстракт тех же клеток, что и в опытах по превращению интактного микроцина в активную форму Причиной может служить низкая концентрация необходимых ферментов концентрация экстракта для процессирования превышала в несколько раз концентрацию такого же экстракта в системе синтеза белка

Для ответа на вопрос, что же является мишенью микроцина С, было проверено действие процессированного МсС на трансляцию полиуридиловой кислоты, поли(У) Результатом такой трансляции явтяется синтез полимеров фенилаланина При этом количество синтезированного продукта не зависит от присутствия антибиотика в системе трансляции (рис 46) Это прямо указывает на отсутствие ингибирования микроцином факторов элонгации трансляции, таких функций рибосомы, как кодон-зависимое связывание тРНКРЬе, транспептидация и транслокация, а также аминоацилироваяие xPHKpht Из этого следует, что предполагаемой мишенью антибиотика могут быть факторы инициации или терминации трансляции, либо тРНК-синтетазы (ARS), отличные от PheRS Последнее предположение было проверено, поскольку в его пользу свидетельствовала химическая структура микроцина С, напоминающая модифицированный аминоациладенилаг, а именно аспартиладенилат (см рис 1) Действительно, оказалось, что реакция аминоацилирования тРНК аспартатом подавляется, в то время как реакции с участием других аминокислот - нет Рис 5 иллюстрирует этот результат При этом в присутствии не подвергшегося процессированию МсС, как и в контроле без антибиотика (данные не показаны, результат совпадает с интактным МсС), реакция присоединения аспартата к тРНК не подавляется Требовалось найти доказательства того, что аспартил-тРНК-синтетаза (AspRS) является единственной мишенью процессированного микроцина С Убедительным доказательством стало бы восстановтение работы ингибированной системы трансляции после внесения недостающего субстрата, продукция~которого~ была прекращена микроцином, а именно аспартил-тРНК

время, минуты

контроль МсС проиессированный

МсС

Рисунок 4. Действие процессированного микроиина С на бесклеточную систему трансляции мРНК люииферазы и полиуридиловой кислоты. (А) Проиессированный микроцин добавлен в систему бесклеточной трансляции мРНК люциферазы. Трансляция полностью подавлена. (Б) Трансляция поли(У) в бесклеточной системе. Синтез полифенилаланина измеряли по включению радиоактивно меченного фенилаланина во фракцию осадка, нерастворимого в горячей ТХУ на 30 минуте реакции. Ни интактный, ни прицессированный микроцины не подавляют трансляцию поли(У).

1ц -Iй -ir -fr- 60 rb & rb

с, 1« > 1С OMcC

5 { rf- Нг к *4 6>ipoq

1 У 5- .y

® t } * t - f -С- 20

г - С' № IQ • Hh

Phe Ast Thf Aja Leu Дзр

Рисунок 5 Линноаинлировашге тРНК в присутствии микроцнма. Аминоацилирование проводили в присутствии 1% экстракта S30 из Ecoli, суммарной гтрокариотической тРНК и индивидуальных радиоактивно меченных аминокислот Количество образовавшейся аминоацил-тРНК измеряли по включению радиоактивной метки во фракцию, осаждаемую холодной ТХУ

Аспартил-тРНК была синтезирована, препарат очишен от примесей и внесён в систему трансляции, подавленную процессированным антибиотиком В качестве контроля использовали внесение фенилаланил-тРНК, полученную в таких же условиях Для большей убедительности эксперимента вносили аминоацилированную тРНК в каждую из реакций дважды При добавлении аспартил-тРНК в ингибированную микроцином систему трансляции мРНК люциферазы наблюдается восстановление накопления активной люциферазы После истощения внесенного запаса аспартил-тРНК накопление светящейся люциферазы прекращается Повторное внесение дополнительного количества аспартил-тРНК приводит к восстановлению синтеза люциферазы, опять до момента истощения внесенного запаса Внесение фенилаланил-тРНК не вызвало восстановления синтеза бетка в подавленной процессированным микроцином С системе трансляции (рис 6)

время, минуты

Рисунок 6 Восстановление смнтеза лкшиферазы в бесклеточной системе трансляции, ингибированной процессированным микроцином С Синтез белка проводили в трех независимых пробах бесклеточной системы трансляции люциферазной мРНК в присутствии процессированного микроцина, добавленного в ингибирующей концентрации В процессе инкубации в пробы дважды (отмечено стрелками) вносили аспаргил-тРНК, или фенилаланил-тРНК, или ничего не вносили Наблюдали за восстановлением синтеза белка по нарастанию количества синтезируемой люциферазы, измеренного по ее активности

концентрация протрассированного МсС пМ

Рисунок 7 Ингибирование аминоацилирования процсссиро ванным МсС в реакционной смеси из изолированных и очищенных компонентов Реакцию проводили, используя очищенную рекомбинантную АзрЯБ из Р ш/агеми в присутствии процессированного МсС, добавленного в указанной концентрации Измеряли включение радиоактивного аспартата в осадок, нерастворимый в холодной ТХУ

Для того, чтобы прямо показать взаимодействие процессированного антибиотика с тРНК-синтетазой, использовали изолированную и очищенную рекомбинантную АхрЯЭ из Р Ыагеши, гомологичную ферменту из ЕсоЬ на 58% Правомерность этого опыта следует из чувствительности к интактному микроцину С представителей как грам-положительных, так и грам-отрицательных бактерий Кроме того, тРНК-синтетазы имеют очень консервативный активный центр, что предполагает связывание антибиотика практически с любой лрокариотической АврЯБ Так или иначе, предположение было подтверждено экспериментальными данными Видно, что в диапазоне концентраций процессированного микроцина от 20 до 100 нМ активность синтетазы из Р ш1агепт изменяется от почти не пониженной при 20 нМ антибиотике до полностью подавленной при 100 нМ (см рис 7) Концешрация~аспартил-тРНК-синтетазы. в -этом _эксперименте_составляла 40 нМ Следовательно, можно с уверенностью утверждать, что весь фермент связался с антибиотиком при 100 нМ концентрации микроцина

ереия, кинуты

Рисунок 8 Реакция обмена фосфата между РР, и ЛТР Для реакции обмена использовали рекомбинантную AspRS из F lularensts в концентрации 30 пМ, радиоактивно меченный пирофосфат, немеченый АТР, интактный микроцин (200 пМ), процессированный микроцин (100 и 300 пМ) За ходом реакции следили по появлению радиоактивного АТР

Следующий эксперимент был поставлен для того, чтобы выяснить, какую именно стадию рабочего цикла аминоацил-тРНК-синтетазы ингибирует процессированный микроцин Для этого проверили, происходит ли реакция обмена радиоактивно меченного фосфата между неорганическим пирофосфатом и АТР в присутствии антибиотика Результат на рис 8 показывает, что такой обмен эффективно подавляется микрошшом Таким образом, получено прямое указание на то, что микроцин подавляет первую стадию в работе фермента, называемую активацией аминокислоты

Суммировав все приведённые выше результаты, можно сделать вывод, что процессированный микроцин С подавляет в бесклеточной системе трансляции аспартиловую тРНК-синтетазу, а именно стадию активации аминокистоты в работе фермента Следовало также проверить, является ли мишень микроцина, идентифицированная в опытах ш vitro, мишенью антибиотика в живой клетке Для

ответа на этот вопрос клетки трансформировали экспрессионным вектором, несущим гены либо аспартиловой, либо пролиповой тРНК-синтетазы (в контроле - вектор без вставки) и наблюдали за появлением полной или частичной устойчивости к интактному микроцину. Мы предположили, что увеличение количества Аэр!^ в клетке увеличит устойчивость клетки к антибиотику, подавляющему работу АэрКБ, в то время как наличие избытка другой тРНК-синтетазы (в данном случае - РгоЯ5) не повлияет на устойчивость клетки к микроцину.

мес + 4" +

Рисунок 9. Подавление роста клеток интактным микроцином С при сверхэкспрессии генов аминоацил-тРНК-синтетаз. На слой мягкого агара, содержащего клетки, несущие векторы рЕТ. pET_ProRS, pET_AspRS, наносили капли раствора с МсС в грех концентрациях. После впитывания капель в агар чашки Петри инкубировали 5-8 часов при 37 °С для образования газона клеток. На месте нанесения микроцина образовывались прозрачные зоны подавления - в этих зонах клетки не вырастали.

На рис. 9 представлены результаты этого эксперимента. Нетрудно видеть, что сверхэкспрессия гена аспартиловой тРНК-синтетазы даёт возможность клеткам расти в присутствии микроцина С, в то время как рост контрольных клеток (вектор без вставки) и клеток, экспрессирующих ген пролиновой тРНК-синтетазы, был полностью подавлен.

В зрелом микроцине С седьмой остаток (аспартиловый) соединён с AMP посредством нехарактерной для клетки N-ацилфосфорамидной связи. Если убрать первые шесть аминокислот гептапептвда, то получится аспартат, соединённый с AMP негидролизуемой (ферментами клетки) связью. Такая структура очень похожа на аминоациладенилат - продукт первой стадии рабочего цикла аспартил-тРНК-

сннтетазы (см рис 10), который, в свою очередь, является субстратом второй реакции - переноса аминокислоты на тРНК

о

Рисунок 10 Сравнение структур аслартил-АМР, природного субстрата для реакции ачиноацилирования, и процессированного микроцина

Мы предположили, что процессированный чикроцин подав пяет работу аспартил-тРНК-синтетазы именно благодаря такой «молекулярной мимикрии» Очевидно, что для образования антибиотика, обтадающего нерасщепляемой синтетазой связью между аспартатом и AMP, необходимо удалить шесть N-концевых аминокислотных остатков Для проверки этой гипотезы наблюдали за изменениями молекулярной массы микроцина и его активности в процессе инк)бации с экстрактом из клеток Ecoli Рассчитанная молекулярная масса интактного микроцина С составляет 1178 Да, это же значение определяется с помощью масс-спектрометрии Посте выдерживания антибиотика с клеточным экстрактом пик 1178 Да в масс-спектре исчезает, но появляется пик вещества массой 519 Да Очищенный «исходный» микроцин обладает антибактериальным действием, но не способен подавлять бесклеточную систему аминоацилирования Очищенное

процессированный МсС

NH

аспартил-АМР

вещество с массой в 519 Да не действует на бактерии, но подавляет бесклеточную систему аминоацилирования, то есть обладает активностью гипотетического процессированного микроцина С Вещество с молекулярной массой 519 Да было проанализировано методом ЯМР, который подтвердил наше предположение - это микроцин С, лишенный шести N-концевых аминокислотных остатков Более того, измеренная молекулярная масса в 519 Да совпадает с рассчитанной массой негидролизуемого аналога аспартил-аденилата Важное следствие из этого открытия - наличие обязательной стадии процессинга, осуществляемой клеточными ферментами (ферментом)

Активированная аминокислота - аминоациладенилат - является субстратом реакции присоединения аминокислоты к тРНК и у прокариот, и у эукариот Это позвотяет предположить, что процессированный микроцин С оказывает такое же ингибируюшее действие на аспартил-тРНК-синтетазу ядерных организмов Мы провели реакцию аминоацилирования в бесклеточном экстракте из зародышей пшеницы, добавляя в экстракт процессированный либо интактный микроцин На рис 11 представлен результат этого опыта аминоацилирующую активность эукариотического экстракта подавлял не только процессированный антибиотик, но и интактный Видимо, пептцдазная активность в пшеничном экстракте настолько высока, что процессинг успевает пройти до или во время начала реакции аминоацилирования Альтернативным объяснением высокой ингибиторной активности интактного микроцина С в эукариотической системе трансляции может служить предполагаемое различие пространственных структур бактериальной и растительной AspRS не исключено, что растительный фермент способен связывать непроцессированный антибиотик Для контроля специфичности действия микроцина мы проверили его влияние на аминоацилирование тРНК другими аминокислотами (в данном случае - Leu) Видно, что МсС не оказывает влияния на аминоацилирование лейцином (рис U)

Насколько прочно связывание активного антибиотика с мишенью9 Для ответа на этот вопрос был проведен следующий опыт с аспартил-тРНК синтетазой из F Tularensis, имеющей б ТйстидиновьгсГ остатков на С-конце, что позволяло выделять, фермент из реакционных смесей

□ Ьеи

□ Аэр

контроль

МсС

процессированный МсС

Рисунок 11 Аминоацилирование тРНК в экстракте зародышей пшеницы в присутствии микроцина С и его лроцсссированной формы. За ходом реакции следили по включению радиоактивно меченной аминокислоты (аспартата или лейцина) во фракцию осадка, нерастворимого в холодной ТХУ

С таким ферментом провели реакцию аминоацилирования в присутствии и в отсутствие процессированного микроцина В присутствии антибиотика фермент терял аминоацилирующую активность, в то время как контрольный фермент (без антибиотика) остался активным Эти два образца были нанесены на ^-содержащую колонку и подвергнуты промывке буфером После злюции фермента с колонки была проведена повторная реакция аминоацилирования, которая показала, что синтетаза с подавленной активностью осталась неактивна, в то время как контрольный фермент имел активность, сравнимую с таковой до процедуры отмывки (рис 12) Этот опыт указывает на чрезвычайно прочное связывание микроцина с его мишенью Можно предположить, что взаимодействие антибиотика с синтетазой идет по пути конкуренции микроцина с субстратами фермента Такое предположение подразумевает, что в присутствии субстратов и ингибитора фермента должно возникать равновесие между ферментами, связанными с субстратами, и ферментами,

связанными с ингибиторами Увеличивая концентрацию субстратов, можно вытеснить весь антибиотик из активного центра и сместить равновесие в сторону активных ферментов Для проверки этого предположения был проведен эксперимент, описанный выше, с той разницей, что аспартиловую тРНК-синтетазу промывали на колонке буфером, содержащим АТР и аспарагиновую кислоту Результат такого эксперимента совпал с предыдущим (рис 12) Это может быть еще одним доказательством того, что тРНК-синтетаза работает как клешня - «закрывается», держа субстрат (ати антибиотик) в активном центре до полного завершения реакции Так как в случае с антибиотиком следующая стадия реакции аминоацилирования идти не может, то фермент оказывается «закрытым» навсегда

8000 7000

£ 6000

О.

О

d 5000

<:

о

4000

о

S

<D 3000

2

5

ш 2000

1000 0

□ контроль

О процессированный МсС

до отмывки

после отмывки

Рисунок 12 Реакция аминоацилирования до и после отмывки иммобилизованной на котоике аспартил-тРНК-синтетазы буфером Описание эксперимента см в тексте

Экспериментальные данные позволяют заключить, что механизм действия микроцина С описывается моделью «троянского коня» антибиотик неактивен в "среде,-клетка-мишень- активно - транспортирует - его - внутрь - цитотазчы, — где -антибиотик продолжает оставаться безвредным для клетки, пока не подвергнется процессингу клеточными пептидазами

Процесснпг микроцнна С в цитоплазме клетки-мишени

Новиковой и копегами бьпо показано, что транспорт микроцнна С в клетку-мишень осуществляется белками-транспортерами, закодированными в yej-локусе, относящимися к ABC-транспортерам Но оставалось неизвестным, какие ферменты бактериатьной клетки-мишени осуществпяют процессинг микроцина, превращая его из неактивной о1игопептид-|гуклеотидной химерной структуры в ситьный ингибитор аспартил-тРНК-синтетазы, имитирующий активированную аминокислоту Метод введения статистических нарушений генов с помощью транспозона не позвотил найти клетки, имеющие внутриклеточную устойчивость к мнкроцшгу Таким методом Новиковой и копегами были найдены гены, ответственные за транспорт микроцина в клетку через цитоптазматическую мембрану Выключение любого из генов транспорта токуса yej приводит к нарушению транспорта Отсутствие мутантов, устойчивость которых обусловлена изменением внутриктеточной мишени, тегко объяснимо тРНК-синтетаза - критичный фермент дтя клетки, и изменение его активного центра несовместимо с жизнеспособностью клетки Однако отсутствие мутаций по ферментам процессинга микроцина навело нас на мысль, что процессинг мо,кет осуществляться несколькими взаимозаменяемыми белками Наши наблюдения позволяют сделать вывод, что гидролиз шести аминокислот осуществтяют пептидазы, общие дтя большинства прокариотических клеток, так как цитоплазма тюбых проверенных нами клеток способна процессировать микроцин С (мы проверили экстракты из большого числа штаммов на процессирующую активность и чувствительность к микроцину, данные не приведены) Кроме того, интактный микроцин дочжен быть процессирован либо с N-конца, либо внутри последовательности гептапептида, но никак не с С-конца, закрытого для терминального гидролиза присоединенным AMP На основании этих предположений и предпосылок, мы стали искать предпопагаемые ферменты среди аминопептидаз Так, были проверены делеционные мутанты по наиболее универсальным (с широкой специфичностью) ачинопептидазач А, В, N, D, Т и олигопептидазе Клетки с такими одиночными мутациями были чувствительны к интактному микроцину, а экстракт из этих клеток быт способен процессировать микроцин in vitro Тогда мы стали проверять двойные и тройные мутанты Устойчивыми к микроцину оказались только клетки с тройной мутацией ДрерААрерВйрерЫ На рис 13 видно, что рост клеток

двойных мутантов полностью подавлен микроцином, в то время как тройной мутант устойчив и рост его клеток совпадает с контрольным ростом На рисунке не приведены данные, показывающие, что все полученные нами мутантные клетки росли при 37 °С на богатой жидкой и твёрдой средах без видимых отличий от контрольного штамма, имеющего все пептидазы

время роста клеток минуты

Рисунок 13 Рост клеток в жидкой среде в присутствии МсС. За процессом роста ¡слеток следили по увеличению оптической плотности среды при 600 нм Дикий тип -исходный штамм, на основе которого были получены делеционные мутанты по пептидазам А, В, N

Таким образом было установлено, что ни одна из проверенных пептидаз не является единственной ответственной за процессинг микроцина Напротив, любая из трёх пептидаз, А, В или N. способна сделать клетку чувствительной к интактному микроцину Чтобы доказать, что процессинг не происходит в цитоплазме тройного мутанта, но способен происходить в присутствии любой из этих трёх аминопептидаз, инкубировали йнтактный "микроцин-в— экстрактах—из-мутантных- клеток,_с. последующим проведением реакции аминоацилирования в этих экстрактах В качестве положительного контроля вносили в экстракты процессированный МсС

тип

Рисунок 14. Реакция аминоацилирования в экстрактах клеток, мутантных по генам пептилаз. S30 экстракты клеток инкубировали с интактным или лроцессированным микроцином С 1 час при 37 °С, после чего экстракты использовали в реакции аминоацилирования. За холом реакции следили по включению радиоактивно меченого аспартата во фракцию осадка, нерастворимого в холодной ТХУ.

Все мутанты, кроме тройного по пептидазам А, В и N, способны процессировать интактный микроцин С в своей цитоплазме (рис. !4). Мы с уверенностью можем утверждать, что любая из аминопептидаз А, В или N способна процессировать МсС. Этот вывод хорошо согласуется с представлениями о том, что перечисленные пептидазы обладают широкой субстратной специфичностью и могут отщеплять аминокислотные остатки, из которых состоит олигопептидная часть микроцина. Однако, аминопеггтидазы А, В и N отщепляют только N-концевые аминокислоты, в то время как зрелый (интактный) МсС содержит формилированный метионин. В самом деле, пептидная часть микроцина синтезируется рибосомой, поэтому несёт формильную группу на первом метионине, как и все синтезированные de novo белки. Ни одна из трёх пептидаз не способна удалять формил-метионин. Формильную группу белка может удалить только специальный клеточный фермент -пептидная деформилаза (PDF). И уже после этого шага первый метионин может быть удалён метионин аминопептидазой (MAP). Активность метиониновой

аминопептидазы зависит от контекста, так называемого правила N-конца В случае микроцина четиоиин может быть удален любой из аминопептидаз с широкой специфичностью

Далее мы проверили, как сказывается отсутствие таких важных пептидаз в клетке на продукцию микроцина Для этого клетки, несущие тройную мутацию в генах пептидаз, трансформировали микроцииовой плазмидой pUHAB, содержащей все гены для синтеза антибиотика Трансформанты производили антибактериальное вещество с молекулярной массой в 1150 Да, в отличие от 1178 Да интактного микроцина, производимого клетками дикого типа При более подробном рассмотрении масс-спектров микроцина, синтезируемого диким типом клеток, также был обнаружен минорный пик в 1150 Да помимо пика интактного микроцина в 1178 Да Разница в массе ветчиной в 28 Да соответствует массе формильной группы первого метионина Анализ продукта массой в 1150 Да с помощью ЯМР подтвердил наше предположение эта структура представляет собой иктактныи микроцин С, лишенный формильной группы Таким образом, отсутствие в клетках пептидаз А, В и N приводит к синтезу только деформилированного микроцина Можно предположить, что это обусловлено наличием обратной связи между аминопептидазами и дефорчшшой Так или иначе, у нас появилась возможность сравнить процессинг интактного и деформилированного (def-McC) микроцинов в клеточном экстракте из чувствительных клеток В реакционные смеси для аминоацилирования добавляли одинаковое количество интактного или деформилированного микроцина и определяли скорость процессинга микроцинов по подавлению включения меченного аспартата во фракцию тРНК Как следует из результатов (рис 15), деформллированный микроцин процессируется примерно на 10 минут быстрее (почти в 2 раза) Так как эти два типа МсС отличаются только формильной группой, то можно заключить, что процессинг микроцина С происходит с самого N-конца и половину времени процессинга занимает стадия отщепления формильной группы первого метионина

25000

0 5 10 15 20 25 30

время процессинга, минуты

Рисунок 15 Скорость процессинга иктактного (МсС) и деформилированного (def-McC) микроцинов S30 экстракт клеток £ coli дикого типа инкубировали в присутствии МсС или def-McC, через каждые 5 минут отбирая аликвоты смеси и проводя в них реакцию аминоацилирования За ходом реакции следили по включению радиоактивно меченого аспартата во фракцию осадка, нерастворимого в холодной ТХУ

Для ответа на вопрос, участвует ли метиониновая аминопептидаза в процессинге микроцина, провели следующий эксперимент Интактный и деформилированный микроцины инкубировали в экстрактах из клеток дикого типа и мутанта йрсрААрерВйрер.Ы После инкубации измеряли молекулярную массу микроцинов с помощью масс-спектрометрии Как и следовало ожидать, в экстрактах из клеток дикого типа микроцины оказались полностью процессироваными В экстрактах, лишенных трёх пептвдаз, def-McC сохранил массу 1150 Да, то есть не подвергся процессингу Интактный МсС массой в 1178 Да превратился в деформилированный с массой 1150 Да Следовательно, в отсутствие пептидаз А, В и N может происходить только отщепление формильной группы, но даже шаг удаления первого метионина с помощью MAP не происходит Это объясняется наличием остатка аргинина во втором потожении пептидной части микроцина активность MAP намного слабее в таком контексте

Имеет ли деформилированный микроцин более высокую антибактериальную активность благодаря более быстрому процессингу в клетке7 Для ответа на этот

вопрос сравнили действие интактного МсС и def-McC in vivo при разных концентрациях микроцинов Неожиданностью оказался тот факт, что активность def-МсС была в несколько раз ниже таковой интактного микроцина (данные не приведены) Мы пришли к заключению, что формильная группа на N-конце пептидной части микроцина играет важную роль в процессе транспорта антибиотика в клетку-мишень

Выводы из этой части работы таковы процессинг МсС в клетке-мишени осуществляется только четырьмя ферментами - деформилазой и тремя пептидазами, которые одинаковы в своей способности гидролизовать олигопептидную часть микроцина Кроме того, наличие формильной группы у интактного МсС важно для транспорта микроцина внутрь клетки

Структурно-функциональный анализ микроцина С

Благодаря тому, что пептидная часть микроцина закодирована геном, МсС поддается структурному анализу активности, который можно провести стандартными генно-инженерными методами В то время как инициирующий кодон тссА нельзя мутировать без влияния на трансляцию мРНК МссА, мутации в остальных шести кодонах могут быть использованы для изучения эффектов замещения аминокислоты при созревании МсС, при транспорте в клетку-мишень, при процессинге внутри цитоплазмы и при ингибировании фермента-мишени Нами был создан и проанализирован набор из 114 точечных мутантов, полученных из гена тссА (6 тсс А кодонов X 19 вариантов аминокислот недикого типа)

Тгр .

Аэр Агд СЬ Абп

Н)5 Т11Г '

ТЬг Бег

пт бег Ме£

Тгр МЙ Уа) Сув

Туг „ Уа1 Не МЙ?;

5ег Су5 1 Не 1£Ц ап

А1а 1еи А1а' А!а Зет

Ме£ Агд ТЬг' 61у АЗП А!а А5П

1 2 3 4 5 6 7

1.еи А1а 1_еи Тгр 1_еи А1а

Не Не СУ5 Не 1еи

Уа1 Уа1 Рго Суэ Уа1 Не

Мй Ме1 Туг Рго ТЬг Уа1

ТЪг 5ег РЬе Тгр Мй

61у Тгр аи Туг &у 5ег

Суз № Рго ТЪг

Рго Рго Йп Туг Тгр

РЬе РЪе 1_уз Нй <31у

Азп Туг Агд А5П Суз

Йп Не Авр № Рго

иуэ АБП б1и Агд * РЬе

А«Р С1п А5р Туг

Йи Ьуэ Ои Нш

Агд б!п

Абр

Агд

Агр Ои

Рисунок 16 Результаты функционального анализа мутантов микроцина С Положение аминокислотных остатков в гептапептиде указано цифрами по горизонтали (нумерация с конца) Над цифрами приведены активные варианты замены в микроцине (дикий тип - сразу над цифрами, мутанты - выше), под цифрами - варианты замен, приводящие к нарушению синтеза микроцина. Например, любая замена в седьмом положении приводит к прекращению синтеза микроцина Голубым цветом отмечены такие замены, при которых нарушается транспорт микроцина в клетку-мишень, розовым - мутант с нарушением процессинга.

Мутации тссЛ были получены путем стандартного сайт-направленного мутагенеза ранее упомянутой плазмвды риНАВ, содержащей кластер генов тсс Правильность введения каждой мутации была проверена секвенированием плазмиды Каждой гишзмидой с точечной мутацией тссА был и трансформированы клетки Е сок На минимальную твердую среду с добавлением 0,2% экстракта дрожжей было нанесено равное количество клеток трансформантов В качестве контроля

использовали клетки DH5a, из которых был получен дикий тип МсС, а также клетки, которые несут в себе векторную плазмиду без генов тсс Спустя 12 часов инкубации при температуре 37 "С колонии клеток, содержащих плазмиды с индивидуальными мутациями тссА, были покрыты мягким агаром М63 с содержанием клеток Е coli, чувствительных к микроцину Было отмечено, что после 5 часовой инкубации при температуре 37 °С вокруг колоний клеток, несущих гены тсс, появились зоны ингибирования Прозрачные зоны ингибирования, в которых не было клеточного роста, были легко заметны на мутном фоне слоя чувствительных клеток Результаты этого исследования схематично изображены на рисунке 16

Вокруг колоний, несущих плазмиды с 28 вариантами точечных мутаций в гене тссА, можно было увидеть чёткие зоны ингибирования Размеры зон ингибирования соответствовали или превосходили размеры зон ингибирования, созданных клетками, содержащими дикий тип плазмиды pUHAB Во всех 28 случаях масс-спектральный анализ культуральной среды показал наличие ожидаемой ионной массы, соответствующей мугантным микроцинам Для мутантов, которые не образовывали зон подавления чувствительных клеток, мы так же провели поиск теоретически рассчитанных масс, однако их удалось обнаружить только в четырех случаях (голубой и розовый цвет на рис 16) R2Y, R2H, А6М, A6F Так как эти мутантные формы микроцина С секретировались в среду, но не оказывали действия на чувствительные клетки (также и в последующих опытах), мы предположили, что либо путь их процессинга в клетке-мишени нарушен, либо их концентрация в среде мала Для мутантов, присутствия которых не удалось обнаружить в среде, мы предположили нарушение синтеза или транспорта зрелого микроцина наружу клетки-продуцента Например, может быть нарушен механизм созревания микроцина, так как для белков, отвечающих за созревание, скорее всего важна аминокислотная последовательность гептапептида С другой стороны, отсутствие экспрессии генов, мутантных по седьмому положению, может быть объяснено отсутствием устойчивости к ним у клетки-продуцента такие антибиотики, вероятно, поражают другие, соответствующие замене, аминоацил-тРНК-синтетазы, а устойчивости у клетки-продуцента к ним быть не может ---------- -----.

Четыре мутанта, которые продуцировались в среду, но не имели антибактериальной активности, были изучены подробно Эти мутантные формы

были выделены и очищены, их способность давать зоны подавления роста чувствительных клеток при более высоких концентрациях проверена (рис 17)

концентрация микроцина, jjM

Рисунок 17 Измерение антибактериальной активности мутактных форм микроцина С

На газон с чувствительными клетками Есок наносили образцы с разной концентрацией микроцина. По прошествии нескольких часов роста клеток измеряли диаметр зон ингибирования, образованных антибиотиками

Можно видеть, что зоны, образуемые мутантами R2Y, R2H и А6М как минимум в два раза уступают по размерам зонам от микроцина дикого типа Мутант А6М вообще не образовывал зон подавления на слое агара с чувствительными клетками При увеличении концентрации до 200 рМ появлялись едва заметные мутные зоны (данные не приведены) Низкая эффективность действия этих мутантов т vivo может иметь два объяснения стабое поглощение клетками-мишенями и слабый процессинг мутантов внутри клетки Возможность того, что мутанты имеют другое сродство к

внутриклеточной мишени, следует исключить, так как активная часть (процессированиый МсС) этих мутантов идентична активной части микроцина дикого типа Для проверки предположений, приведенных выше, мы провели эксперименты с этими мутантами ш vitro, сравнив их способность процессироваться и подавлять реакцию аминоацилирования с микроцином дикого типа Результаты приведены на рис 18 Видно, что мутанты R2Y и А6М обладают активностью, сравнимой с диким типом Значит, их слабая антибактериальная активность объясняется нарушением транспорта микроцинов в клетку

концентрация микроцина, рМ

Рисунок 18 Подавление аминоацилирования мутантными микроцинами Дикий тип и _ мутанты микроцина инкубировали 1 час при 37 °С в экстрактах S30 из чувствительных клеток Е coli, далее эти экстракты использовали в реакции аминоацилирования" ~

Для одинакового ингибирования аминоацилирования требуется примерно четырёхкратный избыток мутанта A6F по сравнению с диким типом, что говорит о

нарушении его процеесинга Однако, учитывая неспособность этого микроцина подавлять рост клеток in vivo, можно с уверенностью заключить, что транспорт этого мутанта нарушен в большей степени, чем у мутантов R2Y и А6М Неожиданностью оказался тот факт, что для появления in vitro активности мутанта R2H погребовалась концентрация этого микроцина в 80 раз превосходящая концентрацию антибиотика дикого типа Мы заключили, что именно нарушение процессинга мутанта R2H явтяется причиной его слабого антибактериального действия, так как активная часть, как указывалось выше, в мутантах и диком типе микроцина идентичны Для проверки этого предположения микроцины мутантного и дикого типов подвергли инкубации разной длительности в экстракте клеток Е coli (рис 19)

время процессинга, минуты

Рисунок 19 Скорость процессинга микроиинов мутантного и дикого типов S30

экстракт клеток £ coli инкубировали при 37 °С в присутствии одинаковой концентрации микроцина дикого типа ичи мутанта R2H, взятых в одинаковой концентрации В процессе инкубации из смесей отбирали аликвоты и в них проводили реакцию аминоацилирования Контроль - экстракт, инкубированный в таких же условиях, но без микроцина.

Как следует из результатов этого эксперимента, микроцин С дикого типа подавляет реакцию аминоацилирования уже через 30 минут инкубации с клеточным экстрактом Напротив, для подавления аминоацилирования мутантом Я2Н требуется 140-минутная инкубация антибиотика с клеточным экстрактом Таким образом, замена аргинина на гистидин во втором положении гептапептида микроцина снижает скорость процессинга в 4 раза

Анализ распределения активных и частично активных мутантов микроцина указывает на несколько важных свойств антибиотика Во-первых, это возможность внесения мутаций во все положения, за исключения седьмого, без нарушения антибиотической активности микроцина Более того, положения 4 и 5 в олигопептиде наименее требовательны к аминокислотному составу Это может указывать на отсутствие в этих положениях участка узнавания белками созревания микроцина, а также транспортерами, которые выкачивают зрелый микроцин наружу клетки-продуцента и закачивают в клетку-мишень Во-вторых, для транспорта микроцина внутрь клетки оказались важными аминокислоты в крайних положениях Замена положительно заряженного аргинина на тирозин с жесткой нейтральной боковой цепью приводит к сильному ухудшению распознавания или транспорта микроцина белками клетки-мишени К такому же эффекту приводит замена аланина в шестом положении на более массивные аминокислотные остатки метионина и фенилаланина При этом если замена на метионин существенно ухудшает транспорт МсС в клетку, то замена на жбсткую структуру фенилаланина вовсе исключает такую возможность В-третьих, влияние гистидина во втором положении на скорость процессинга микроцина подтверждает, что гидролиз гептапептида идет «шаг за шагом» с Ы-конца антибиотика Опираясь на полученные данные, можно предположить, что замена положительно заряженного аргинина на положительно заряженный гистидин не сказывается на транспорте микроцина в клетку, но «проблемный» для пептидаз гистидин сильно замедляет процессинг антибиотика Таким образом, использование микроцина С в качестве зонда может оказаться перспективным для изучения специфичности транспортных белков и пептидаз

Выводы

1 Механизм действия микроцина С соответствует модели «троянского коня» -антибиотик активно поглощается клеткой-мишенью, после чего претерпевает процессинг, осуществляемый ферментами клетки, в результате которого приобретает свойства ингибитора

2 Внутриклеточной мишенью микроцина С является аспартил-тРНК-синтетаза, причем антибиотик способен т vitro подавлять как прокариотический, так и эукариотический фермент Активная часть микроцина представляет собой нерасшепляемый аналог природного субстрата реакции аминоацилирования, аминоациладенилата

3 Связывание активной части микроцина (процессированного МсС) с внутриклеточной мишенью, по-видимому, необратимо

4 Пептидная часть зрелого антибиотика играет роль сигнальной последовательности для транспорта микроцина внутрь клетки N-концевые и С-концевые аминокислотные остатки пептидной части МсС наиболее важны как для созревания антибиотика в клетке-продуценте, так и для транспорта микроцина в клетку-мишень

5 Процессинг интактного микроцина осуществляет любая из аминопептидаз А, В, N и клеточная деформилаза Процессинг идет от N-конца к С-концу Ключевой фермент деградации белков, MAP, не принимает участия в этом процессе, вместо него первый метионин отщепляет любая из аминопептидаз А, В или N Наличие тяжело отщепляемого аминокислотного остатка в пептидной части может значительно замедлить скорость процессинга

Публикации по теме диссертации

Metlitskaya*, А , Kazakov*, Т, Кошшег, А , Pavlova, О , Praetonus-Ibba, М, Ibba, М, Kiashennmikov, I, Kolb, V, Khmel', 1, and Sevennov, К (2006) Aspartyl-tRNA synthetase is the target of peptidenucleotide antibiotic Microcin С J. Biol. Chem, 281, 18033-18042

(* - авторы внесли одинаковый вклад в работу)

Kazakov, Т., Metlitskaya, А, and Sevennov, К (2007) Structure-activity analysis of translation inhibitor microcin С J Bacterial, 189,2114-2118

Sevennov, K., Semenova, E, Kazakov, A , Kazakov, Т., and Gelfand, M S (2007) The post-translationally modified microcms MoL Microbiol, 65,1380-1394

Kazakov, T, Vondenhoff, G H , Datsenko, К A, Novikova, M, Metlytskaya, A, Wanner, В L, Sevennov, K. (2008) E coli Peptidases A, B, or N Can Process Translation Inhibitor Microcin С J. Bacterid, 190,2607-2610

Представление результатов работы на конференциях

Molecular Genetics of Bacteria & Phages August 7-12,2007

University of Wisconsin-Madison, Wl, USA

Poster presentation, "Molecular Mechanism of Action of Microcin C5I" (Authors T S Kazakov, A Z Metlitskaya, К Sevennov)

NIAID Region II Center of Biodefense and Emerging Infectious Disease Research October 7-9,2007

Northeast Biodefense Center, NY, USA

Poster presentation, "Molecular Mechanism of Action of Microcin CSI" (Authors T S Kazakov, A Z Metlitskaya, M Novikova, К Datsenko, K. Sevennov)

Сдано в печать 22 апреля 2008года Объем печати 2 п л Заказ№1127/8 Тираж 40 экз Отпечатано в типографии ООО НВП «ИНЭК» г Москва, Ленинградское шоссе, д 18

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Казаков, Теймур Спартакович

Список сокращений.

Введение.

Аминоацил тРНК синтетазы.

Альбомицин.

Агроцин 84.

Микроцин В17.

Микроцин С.

Микроцин J25.

Пептидазы.Е. coli.

Аминопептидаза А.

Аминопептидаза В.

Аминопептидаза N.

Метиониновая аминопептидаза.

Олигопептидаза А.

Дипептидаза D.

Пептидаза Т.

Материалы и методы.

Бактериальные штаммы.

Питательные среды.

Отбор бактериальных колоний и их проверка на устойчивость к антибиотикам.

Электрофорез в агарозном геле.

Процессинг микроцина С.

Метод ПЦР.

Извлечение фрагментов ДНК из агарозы.

Биоинформатический анализ белков.

Очистка микроцина С.

Получение S30.

Получение S-100.

Выделение плазмид.

Очистка ДНК от белковых примесей.

Транскрипция in vitro.

Трансформация клеток E.coli.

Переосаждение ДНК.

Реакция аминоацилирования.

ТХУ осаждение белков.

Синтез люциферазы in vitro.

Результаты и обсуждение.

Процессинг микроцина С делает его активным in vitro.

Внутриклеточная мишень процессированного МсС.

Процессированный микроцин подавляет первую стадию реакции аминоацилирования.

Устойчивость клеток к МсС повышается при суперпродукции Asp-RS.

Структура процессированного МсС.

Процессированный МсС подавляет работу эукариотической тРНК синтетазы.

Связывание процессированного МсС и мишени очень прочно.

Процессинг микроцина С в цитоплазме клетки-мишени.

Любая из аминопептидаз А, В или N способна процессировать МсС.

Клетки, лишённые пептидаз, производят деформилированный микроцин.

Стадия деформилирования занимает половину времени процессинга интактного микроцина.

Формильная группа МсС требуется для эффективного транспорта внутрь клеткимишени.

Структурно-функциональный анализ микроцина С.

Изменение аминокислотного состава лидерного пептида может привести к изменению активности МсС.

Выводы.

Публикации автора по теме диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Казаков, Теймур Спартакович

выводы

1. Механизм действия микроцина С соответствует модели «троянского коня» — антибиотик активно поглощается клеткой-мишенью, после чего претерпевает процессинг, осуществляемый ферментами клетки, в результате которого приобретает свойства ингибитора.

2. Внутриклеточной мишенью микроцина С является аспартил-тРНК-синтетаза, причём антибиотик способен in vitro подавлять как прокариотический, так и эукариотический фермент. Активная часть микроцина представляет собой нерасщепляемый аналог природного субстрата реакции аминоацилирования, аминоациладенилата.

3. Связывание активной части микроцина (процессированного МсС) с внутриклеточной мишенью, по-видимому, необратимо.

4. Пептидная часть зрелого антибиотика играет роль сигнальной последовательности для транспорта микроцина внутрь клетки. N-концевые и С-концевые аминокислотные остатки пептидной части МсС наиболее важны как для созревания антибиотика в клетке-продуценте, так и для транспорта микроцина в клетку-мишень.

5. Процессинг интактного микроцина осуществляет любая из аминопептидаз А, В, N и клеточная деформилаза. Процессинг идёт от N-конца к С-концу. Ключевой фермент деградации белков, MAP, не принимает участия в этом процессе, вместо него первый метионин отщепляет любая из аминопептидаз: А, В или N. Наличие тяжело отщепляемого аминокислотного остатка в пептидной части может значительно замедлить скорость процессинга.

Публикации автора по теме диссертации

Metlitskaya*, A., Kazakov*, Т., Кошшег, A., Pavlova, О., Praetorius-Ibba, М., Ibba, М., Krashenninikov, I., Kolb, V., Khmel', I., and Severinov, K. (2006) Aspartyl-tRNA synthetase is the target of peptidenucleotide antibiotic Microcin C. J. Biol. Chem., 281,18033-18042. - авторы внесли одинаковый вклад в работу)

Kazakov, Т., Metlitskaya, A., and Severinov, К. (2007) Structure-activity analysis of translation inhibitor microcin C. J. Bacteriol., 189,2114-2118.

Severinov, K., Semenova, E., Kazakov, A., Kazakov, Т., and Gelfand, M. S. (2007) The post-translationally modified microcins. Mol. Microbiol., 65, 1380-1394.

Kazakov, Т., Vondenhoff, G.H., Datsenko, K.A., Novikova, M., Metlytskaya, A., Wanner, B.L., Severinov, K. (2008) E. coli Peptidases A, B, or N Can Process Translation Inhibitor Microcin C. Bacteriol., 190, 2607-2610.

Представление результатов работы на конференциях

Molecular Genetics of Bacteria & Phages August 7-12, 2007

University of Wisconsin-Madison, WI, USA

Poster presentation,"Molecular Mechanism of Action of Microcin С5Г' (Authors: T.S. Kazakov, A.Z. Metlitskaya, K. Severinov)

NIAID Region II Center of Biodefense and Emerging Infectious Disease Research October 7-9,2007

Northeast Biodefense Center, NY, USA

Poster presentation, "Molecular Mechanism of Action of Microcin C51" (Authors: T.S. Kazakov, A.Z. Metlitskaya, M. Novikova, K. Datsenko, K. Severinov)

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Казаков, Теймур Спартакович, Москва

1. Schimmel, Р. (1987) Aminoacyl-tRNA synthetases: general scheme of structure-function relationships in the polypeptides and recognition of transfer RNAs. Annu. Rev. Biochem. 56, 125-158

2. Lapointe, J., and Giege, R. (1991) Transfer RNAs and aminoacyl-tRNA synthetases. Translation in Enkaryotes (Trachsel, H., ed) pp. 35-69, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida

3. Schulman, L. H. (1991) Recognition oftRNAs by aminoacyl-tRNA synthetasesJVog. Nueleic Acid Res. Mol. Biol. 41,23-87

4. Schimmel, P., and Soil, D. (1979) Aminoacyl-tRNA Synthetases: general features and recognition of transfer RNAs. Annu. Rev. Biochem. 48, 601-648

5. Hountondji, C., Dessen, P., and Blanquet, S. (1986) Sequence similarities among the family of aminoacyl-tRNA synthetases. Biochimie 68,1071-1078

6. Mirande, M.' (1991) Aminoacyl-tRNA synthetase family from prokaryotes and eukaryotes: structural domains and their implications. Prog. Nucleic Acid Ret. Mol. Biol 40, 95-142

7. Martinis, S. A., Plateau, P., Cavarelli, J., and Florentz, G. (1999) Aminoacyl-tRNA synthetases: A family of expanding functions, EMBOJ. 18,4591-4596:

8. Ibba, M., and Soil, D. (2000) Aminoacyl-tRNA synthesis, Annu. Rev. Biochem. 69, 617-650.

9. Francklyn, C., Perona, J. J., Puetz, J., and Hou, Y. M. (2002) Aminoacyl-tRNA synthetases: versatile players in the changing theater of translation, RNA 8, 1363-1372'.

10. Arnez, J. G., and Moras, D. (1997) Structural and functional considerations of the aminoacylation reaction, Trends Biochem. Sci. 22, 211-216.

11. Kern, D., and Lapointe, J. (1980) The catalytic mechanism of glutamyl-tRNA synthetase of Escherichia coli. Evidence for a two-step aminoacylation pathway, and study of the reactivity of the intermediate complex. Eur. j Biochem. 106, 137-150

12. Dibbelt, L., Pachmann, U., and Zachau, H. G. (1980) Serine activation is the rate-limiting step of tRNASer aminoacylation by yeast seryl tRNA synthetase, Nucleic Acids Res. 8, 40214039.

13. Dibbelt, L., and Zachau, H. G. (1981) On the rate-limiting step of yeast tRNAPhe aminoacylation, FEBS Lett. 129, 173-176.

14. Eldred, E. W., and Schimmel, P. R. (1972) Investigation of the transfer of amino acid from a transfer ribonucleic acid synthetaseaminoacyl adenylate complex to transfer ribonucleic acid, Biochemistry 11, 17-23.

15. Killmann, II., Braun, M., Herrmann, G., and'Braun, V. (2001) FhuA Barrel-Cork Hybrids Are Active Transporters and Receptors. J. Bacteriol. 183: 3476-3487.

16. System of Streptococcus ¡pneumoniae R.6. J. Bacteriol; 188:,3878-3886:23; Ellis, JI G. & Murphy, P. J. (1981) Mol. Gem Genet. 181; 36-43;24; Gelvin; S: B. (2000) Ann. Rev. Plant Physiol; Plant Mol. Biol; 51, 223-256.

17. Hayman, G. T. & Farrand, S. K. (1988) J. Bacteriol; 170,1759-1767.

18. Kim, H; & Farrand, S. K. (1997) J. Bacteriol. 179, 7559-7572.27. von Bodman, S. B:, Hayman; G.T. & Farrand; S; K. (1992) i>roc. Natl: Acad; Sei. USA 89, 643-647.28: P. J. Murphy, M/ E. Tate, fi¿. Kérr, Eur. J: Biochem: 115, 539 (1981).

19. Ellis; J. G., Kerr, A., Van Montagu, Mi &• Schell; R(^979)Pf^siol; PlantPatholiï5,3n319.30: Slota; J: E. & Farrand; S: K.,(1982) Plasmid>&-, 175-186;

20. Reader, J.S., Ordoukhanian, P.T., Kim, J.-G., de Cre'cy-Lagard, V., Ingyu Hwang, I.H., Farrand, S., Schimmel, P. (2005) Major Biocontrol of Plant tumors Targets tRNA Synthetase. Science 309:1533.

21. Bäquero F., Bouanchaud D:, Martinez-Perez M.C., Fernandez C.(1978) Microcin plasmids: a group of extrachromosomal elements coding for- low-molecular-weight antibiotics in Escherichia coli // J. Bacteriol. V. 135. P. 342-347.

22. Davagnino J., Herrero M., Furlong D., Moreno F., Kolter R. (1986) The DNA replication inhibitor microcin B17 is a forty-three-amino-acid protein containing sixty percent glycine // Proteins. V. 1. P. 230-238.

23. Connell N., Han Z., Moreno F., Kolter R. (1987) An E. coli promoter induced by the cessation of growth// Mol. Microbiol. V. l.P. 195-201.

24. Genilloud O., Moreno F., Kolter R. (1989) DNA sequence, products, and transcriptional pattern of the genes involved in production of the DNA replication inhibitor microcin B17. J. Bacteriol. V. 171. P. 1126-1135.

25. Yorgey P., Davagnino J., Kolter R. (1993) The maturation pathway of microcin B17, a peptide inhibitor of DNA gyrase. Mol. Microbiol. V. 9. P." 897-905.

26. Yorgey P., Lee J., Kordel J., Vivas E., Warner P., Jebaratnam D., Kolter R. (1994) Posttranslational modifications in microcin B17 define an additional class of DNA gyrase inhibitor. Proc. Natl. Acad. Sei. U S A. V. 91. P. 4519-4523.

27. Kelleher N.L., Hendrickson C.L., Walsh C.T. (1999) Posttranslational heterocyclization ofcysteine and serine residues in the antibiotic Microcin B17: distributivity and directionality.

28. Biochemistry. V. 38. P. 15623-15630.

29. Gilson L., Mahanty H»K., Kolter R. (1990) Genetic analysis of an MDR-like export system: the secretion of colicin V. EMBO. J. V. 9. P. 3875-3884.

30. Garrido M.C., Herrero M., Kolter R., Moreno F. (1988) The export of the DNA replication inhibitor Microcin B17 provides immunity for the host cell // EMBO. J. V. 7. P. 1853-1862.

31. Madison L.L., Vivas E.I., Li Y.M., Walsh C.T., Kolter R. (1997) The leader peptide is essential for the post-translational modification of the DNA-gyrase inhibitor microcin B17. Mol. Microbiol. V. 23. P. 161-168.

32. Breil B.T., Ludden P.W., Triplett E.W. (1993) DNA sequence and mutational analysis of genes involved in the production and resistance of the antibiotic peptide trifolitoxin // J. Bacteriol. V. 175. P. 3693-3702.

33. Liu J. (1994) Microcin B17: posttranslational» modifications and their biological implications. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. V. 91. P. 4618-4620.

34. Lavina M., Pugsley A.P., Moreno F. (1986) Identification, mapping, cloning and characterization of a gene (sbmA) required for microcin B17 action on Escherichia coli Kl 2 // J. Gen. Microbiol. V. 132. P. 1685-1693.

35. Khmel' I.A. (1999) Microcins—peptide antibiotics of enterobacteria: genetic control of the synthesis, structure, and mechanism of action // Genetika. V. 35. P. 5-16.

36. Pierrat O.A., and Maxwell A. (2003) The action of the bacterial toxin microcin B17. Insight into the cleavage-religation reaction of DNA gyrase II J. Biol. Chem. V. 278. P. 35016-35023.

37. Pierrat O.A., Maxwell A. (2005) Evidence for the role of DNA strand'passage in the mechanism of action of microcin B17 on DNA gyrase // Biochemistry. V. 44. P. 4204-4215.

38. Vizan J.L., Hernandez-Chico C., del C., I, Moreno F. (1991) The peptide antibiotic microcin B17 induces double-strand cleavage of DNA mediated by E. coli DNA gyrase // EMBO. J. V. 10. P. 467-476.

39. KimiO.K., Ohemeng K., Barrett J.F. (2001) Advances in DNA gyrase inhibitors II Expert. Opin. Investig. Drugs. V. 10. P. 199-212.

40. Metlitskaya, A.Z., Katrukha, G.S., Shashkov, A.S., Zaitsev, D.A., Egorov, Ts.A., and Khmel, I.A. (1995) Structure of microcin C51, a new antibiotic with a broad spectrum of activity. FEBSLett. 357:235-8.

41. Kurepina, N.E., Basyuk, E.I., Metlitskaya, A.Z., Zaitsev, D.A., Khmel, I.A. (1993) Cloning and mapping of the genetic determinants for microcin C51 production and immunity. Mol. Gen. Genet. 241:700-6.

42. Khmel1 I.A., Bondarenko V.M., Manokhina I.M., Basyuk E.L, Metlitskaya A.Z., Lipasova V.A., Romanova Y.M. (1993) Isolation and characterization of Escherichia coli strains producing microcins of B and C types // FEMS. Microbiol. Lett. Ill :269-274.

43. Fomenko, D.E., Metlitskaya, A.Z., Peduzzi, J., Goulard, C., Katrukha, G.S., Gening, L.V., Rebuffat, S., Khmel, I.A. (2003) Microcin C51 plasmid genes: possible source of horizontal gene transfer. Antimicrob. Agents Chemother. 47:2868-74.

44. Novikova, M., A. Metlitskaya, A., K. Datsenko, T. Kazakov, A. Kazakov, B. Wanner, and K. Severinov. (2007) The E. coli Yej ABC transporter is required for the uptake of translation inhibitor microcin C. J. Bacteriol. 189:8361-8365.

45. Guijarro J.T., Gonzalez-PastorJ.E., Baleux F., San Millan J.L., Castilla M.A., Rico M. et al. (1995) Chemical structure and-translation inhibition-studies of the antibiotic microcin,C7 // J. Biol. Chem. V. 270. P. 23520-23532.

46. Blond A., Peduzzi J., Goulard C., Chiuchiolo M.J., Barthelemy M., Prigent Y. et al. (1999) The cyclic structure of microcin J25, a 21-residue peptide antibiotic from Escherichia coli // Eur. J. Biochemi V. 259. P.1747-755.

47. Salomon R.A., Farias R.N. (1992) Microcin 25, a novel antimicrobial peptide produced by Escherichia coli II J. Bacteriol V. 174. P. 7428-7435.

48. Wilson K.A., Kalkum M., Ottesen J., Yuzenkova J., Chait B.T., Landick R. et al. (2003) Structure of microcin J25, a peptide inhibitor of bacterial RNA polymerase, is a lassoed tail // J. Am. Chem. Soc. V. 125. P: 12475-12483.

49. Rosengren K.J., Clark R.J., Daly N.L., Goransson U., Jones A., Craik D.J. (2003) Microcin J25 has a threaded sidechain-to-backbone ring structure and not a head-to-tail cyclized backbone II J. Am. Chem. Soc. V. 125. P. 12464-12474.

50. Bayro M.J., Mukhopadhyay J., Swapna G.V., Huang J.Y., Ma L.C., Sineva E. et al. (2003) Structure of antibacterial peptide microcin-J25: a 21-residue lariat protoknot // J. Am. Chem. Soc. V. 125. P. 12382-12383.

51. Rosengren K.J., Blond A., Afonso C., Tabet J.C., Rebuffat S., Craik D.J. (2004) Structure of thermolysin cleaved microcin J25: extreme stability of a two-chain antimicrobial peptide devoid of covalent1 links II Biochemistry. V. 43. P. 4696-4702.

52. Solbiati J.O., Ciaccio M., Farias R.N., Salomon R.A. (1996) Genetic analysis of plasmid determinants for microcin J25 production and immunity // J. BacterioI. V. 178. P. 3661-3663.

53. Solbiati J.O., Ciaccio M., Farias R.N., Gonzalez-Pastor J.E., Moreno F., and.Salomon R.A. (1999) Sequence analysis of the four plasmid^ genes required to produce the circular peptide antibiotic microcin J25 II J. Bacteriol. V. 181. P. 2659-2662.

54. Delgado M.A., Vincent P.A., Farias R.N., Salomon R.A. (2005) Yojl of Escherichia coli functions as a microcin J25 efflux pump // J. Bacteriol. V. 187. P. 3465-3470.

55. Salomon R.A., Farias R.N. (1993) The FhuA protein is involved in microcin 25 uptake // J. Bacteriol. V. 175. P. 7741-7742.

56. Braun V., Patzer S.I., Hantke K. (2002) Ton-dependent colicins and microcins: modular design and evolution // Biochimie. V. 84. P. 365-380.

57. Darst S.A. (2004) New inhibitors targeting bacterial RNA polymerase // Trends. Biochem. Sei. V. 29. P. 159-160.

58. Mukhopadhyay J., Sineva E., Knight J., Levy R; M., Ebright R: H. (2004) Antibacterial peptide microcin J25 inhibits transcription by binding within and obstructing the RNA polymerase secondary channel // Mol. Cell V. 14. P. 739-751.

59. Adelman K., Yuzenkova J., La Porta A., Zenkin N., Lee J., Lis J. T., Borukhov S., Wang M. D., Severinov K. (2004) Molecular mechanism of transcription inhibition by peptide antibiotic Microcin J25 //. Mol Cell V. 16. P. 753-762.

60. Vincent P.A., Bellomio A., de Arcuri B.F., Farias R.N., Morero R.D. (2005) MccJ25 C-terminal is involved in RNA-polymerase inhibition but not in respiration inhibition-// Biochem. Biophys. Res. Commun. V. 331. P. 549-551.

61. Rintoul M.R., de Arcuri B.F., Salomon R.A., Farias R.N., Morero R.D. (2001) The antibacterial action of microcin J25: evidence for disruption of cytoplasmic membrane energization in Salmonella newport // FEMS. Microbiol. Lett. V. 204. P. 265-270.

62. Chandu D., Kumar A., and Nandi D. (2003) PepN, the Major Suc-LLVY-AMC-hydrolyzing Enzyme in Escherichia coli, Displays Functional Similarity with Downstream Processing Enzymes in Archaea and Eukarya. J. Biol. Chem. 278: 5548-5556.

63. Gonzales T.&Robert-Baudouy J. (1996) Bacterial aminopeptidases: Properties and functions. FEMS Microbiology Reviews 18: 319-344.

64. Miller C.G., Strauch K.L., Kukral A.M., Miller J.L., Wingfield P.T., Mazzei G.J., Werfen R.C., Graber P., and Mowa N.R. (1987) N-terminal methionine-specific peptidase in Salmonella typhimurium. PNAS 84: 2718-2722.

65. Sträter N., Sherratt DJ., and Colloms S.D. (1999) X-ray structure of aminopeptidase A from Escherichia coli and a model for the nucleoprotein complex in Xer site-specific recombination. EMBOJ. 18:4513-4522.

66. Barrett A.J., Rawlings N.D., and.Woessner J.F. (1998) Handbook of proteolytic enzymes. Academic Press, San Diego, Calif.

67. Vogt V.M. (1970) Purification and properties of an aminopeptidase from Escherichia coli. J.Biol.Chem. 245: 4760-4769.

68. Mathew Z., Knox T.M., and Miller C.G. (2000) Salmonella enterica serovar typhimurium peptidase B is a leucyl aminopeptidase with specificity for acidic amino acids. J. Bacterioh 182: 3383-3393.

69. Suzuki H., Kamatani S., and Kumagai H. (2001) Purification^ and Characterization of aminopeptidase B from Escherichia coli K-12. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65: 1549-1558.

70. Addlagatta A., Gay L., and Matthews B.W. (2006) Structure of aminopeptidase N from' Escherichia coli suggests a compartmentalized, gated active site. PNAS 103: 13339-13344.

71. Chandu D. & Nandi D. (2003) PepN is the major aminopeptidase in Escherichia coli: insights on substrate spl,149: 3437-3447.

72. Kumar A. & Nandi D. (2007) Characterization and role of peptidase N from Salmonella enterica serovar typhimurium. Biochemical and Biophysical Research Communications 353: 706-712.

73. Gharbi S., Belaich A., Murgier M., and Lazdunski A. (1985) Multiple Controls Exerted on In Vivo Expression of the pepN in Escherichia coli: Studies with'pepN-lacZ Operon and Protein Fusion Strains. J.Bacteriol. 163: 1191-1195.

74. Lowther W.T., Orville A.M., Madden D.T., Lim S., Rich D.H., and Matthews B.W. (1999) Escherichia coli Methionine Aminopeptidases: Implications of Crystallographic Analyses of the

75. Native, Mutant, and Inhibited Enzymes for the Mechanism of Catalysis. Biochemistry 38: 76787688

76. Ye Q.-Z., Xie S.-X., Ma Z.-Q., Huang M., and Hanzlik R.P. (2006) Structural basis of catalysis by monometalated methionine aminopeptidase. PNAS103: 9470-9475.

77. Solbiati J., Chapman-Smith A., Miller J:L., Miller C.G., and Cronan J.E. (1999) Processing of the N Termini of Nascent Poly peptide Chains Requires Deformilation Prior to Methionine Removal. Communication. J. Mol. Biol. 290: 607-614.f

78. Frottin F., Martinez A., Peynot P., Mitra S., Holz R.C., Giglione C., and Meinnel T. (2006) The Proteomics ofN-terminal Methionine Cleavage. Mol. CellProteomics 5:2336-49.

79. Chang S.-Y.P., McGary E.C., and Chang S. (1989) Methionine Aminopeptidase Gene of Escherichia coli Is Essential for Cell Growth. J.Bacteriol. 171: 4071-4072.

80. Conlin C.A.&Miller C.G. (2000) opdA, a Salmonella enterica Serovar Typhimurium Gene Encoding a Protease, Is Part of an Operon Regulated by Heat Shock. J.Bacteriol. 182: 518-521.

81. Schroeder U., Henrich., Fink J., and R.Plapp. (1994) Peptidase D of Escherichia coli K-12 a metallopeptidase of low substrate specificity. FEMS Microbiol. Lett. 123: 153-160.1

82. Kirsh M., Dembinski D.R., Hartman P.E., and Miller C.G. (1978) Salmonella typhimurium' Peptidase Active on Carnosine. J.Bacteriol. 134: 361-374.

83. Hakansson K.& Miller C.G. (2002) Structure of peptidase T from Salmonella typhimurium. Eur.J. Biochem. 269:443-450.

84. Strauch K.L.&Miller C.G. (1983) Isolation and'Characterization Salmonella typhimurium • Mutants Lacking a Tripeptidase (Peptidase T). J.Bacteriol. 154: 763-771.

85. Strauch K.L., Carter T.H., and Miller C.G. (1983) Overproduction of Salmonella typhimurium Peptidase T. J.Bacteriol. 156: 743-751.

86. Strauch K.L., Lenk J.B., Gamble B.L., and Miller C.G. (1985) Oxygen Regulation in Salmonella typhimurium. J.Bacteriol. 161: 673-680.

87. Lombardo > M.-J., Lee A.A., Knox T.M., and Miller C.G. (1997) Regulation of the Salmonella typhimurium pepT gene by cyclic AMP receptor protein (CRP) and FNR acting at a hybrid CRP-FNR site. J. Bacteriol. 179: 1909-1917.