Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярный анализ копии мобильного элемента репейник (BURDOCK), расположенной в дистальной области локуса GUT DROSOPHILA MELANOGASTER

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярный анализ копии мобильного элемента репейник (BURDOCK), расположенной в дистальной области локуса GUT DROSOPHILA MELANOGASTER"

РГЗ од

1 1 НОВ 1335

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи УДК 577,2+575,116

Айрих Лариса Готлибовна

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ КОПИИ МОБИЛЬНОГО ЭЛЕМЕНТА РЕПЕЙНИК (BURDOCK), РАСПОЛОЖЕННОЙ В ДИСТАЛЬНОй ОБЛАСТИ ЛОКУСА CUT DR050PHILA MELAN0GASTER

(03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва,1996,

Работа выполнена в лаборатории организации генома Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН,

Научные руководители:

доктор биологических наук Н.А.Чуриков, кандидат биологических наук Н.А.Пономаренко. •

Офицалъные оппоненты:

доктор биологических наук A.B. Ипсес. кандидат биологических наук В.Е. Алаторцев. Ведущая организация:

Институт биологии гена РАН

Защита состоится isafir. в "^'часов на

заседании специализированного совета (Д 002.79.01! в Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул.Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан . ______1996г.

Актуальность темы. Изучение мобильных элементов является важным для понимания механизма функционирования генов и возникновения мутация. Одним из наиболее интересных классов мобильных элементов можно считать ретротранспозоны, сходные по структуре с интегрированными ретровирусами позвоночных (провирусами). Несмотря на то, что они давно изучаются до сих пор остаются открытыми многие вопросы, связанные с их транскрипцией и перемещением, имеющие ключевое значение для понимания роли ретротранспозонов в организации генома дрозофилы.

Рапсе при анализе нестабильной линии ct^ был обнаружен новый мобильный элемент дрозофилы репейник (burdock). В 11 независимо возникших ct деталях методом геномной гибридизации по Саузерну была локализована инсерция фрагмента величиной около 2,5 kb в районе -116 локуса cut. Было проведено молекулярное клонирование данного фрагмента из мутантной линии . Методом

гибридизации In situ на политенннх хромосомах дрозофилы и с помощью физического картирования было показано, что данная вставка является новым мобильным элементом.

Цель работы. Целью настоящей работы было

проведение молекулярного анализа копии мобильного элемента репейник и района его инсерции в локусе cut Brosophila

melanogaster, а также изучение его транскрипции на разных стадиях развития дрозофилы.

Задачи исследования.

1.Определение первичной структуры мобильного элемента репейник.

2.Определение нуклеотидной последовательности района инсерцим репейника в локусе cut Dr.ineianugaslyr,

3,Изучение транскрипции репейника на разных стадиях развития дрозофилы.

4.Локализация транскриптов методом нерадиоактивной in situ гибридизации на эмбриональной стадии развития.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенных исследований обнаружено, что репейник является необычно маленьким ретротранспозоном и содержит одну открытую рамку считывания, В--ней. нет областей, кодирующих протеаэу, РНКазу Н, обратную транскриптазу и интегразу, которые необходимы для транспозиции. Кодируемый ORF репейника полипептид имеет.два последовательных участка гомологии с белками, кодируемыми 0RF1 и 0RF2 gypsy, в N и С областях соответственно. Инсерция репейника в данный район локуса cut прерывает его ORF, причем направление транскрипции мобильного элемента противоположно направлению транскрипции в локусе. Это

по-видимому и является причиной возникновения летальной мутации.

Проведен анализ транскрипции нового ретротранспозона D.me]anogaster репейник. Обнаружена необычная гетерогенность транскриптов репейника. Показано, что данный мобильный элемент обладает стадие- и тканеспецифичностью транскрипции. Наиболее

транскрибируемыми являются стадии личинок и имаго, на стадии куколок транскрипция практически отсутствует. В процессе эмбриогенеза транскрипты репейника первоначально обнаруживаются в ядрах желточного тела (синтициальная бластодерма), позднее выявляются в базальной части эндодермальных клеток ( клеточная бластодерма) и в мезодерме (гаструляция), в зрелых эмбрионах транскрипты локализуются в мезодерме, кишечнике и клетках вентрального эпидермиса.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 13 (Крит, сентябрь-1993 ) и 14-ой (Венеция, сентябрь-1995! Енропейской Конференции по исследованиям на дрозофиле.

Объем диссертации. Материал диссертации изложен на 102 страницах машинописного текста и содержит 16 рисунков. Список цитированной литературы включает 105 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЩНИЕ.

Изучение первичной структуры мобильного элемента репейника.

Клон фага \ , содержащий копию мобильного элемента и окружающие его геномные последовательности, был изолирован

D Пй

езультате скрининга библиотеки, полученной из геномной МЯ1К1

ДНК линии ct. Ранее было обнаружено, что репейник внедряется в локусе в EcoRI Фрагмент величиной 1.57 kb и не содержит внутренних EcoEI сайтов (рис.1б!. Поэтому EcoRI фрагмент А клона, содержащий репейник и прилежащие области локуса и имеющий длину около 4.0 kb, был переклонирован в плазмиду pUC12 (р4.0). Аналогичным образом, из ДНК. линии дикого типа (Oregon RC) был изолирован EcoRI фрагмент локуса величиной 1.57 kb, не содержащий мобильного элемента (р1.57). На рис. 1в представлены физические карты клонсв и локализация репейника, полученные с помощью рестриктного анализа и перекрестной гибридизации. Субфрагменты плазмид р4,0 и р1.57 были секвенированы.

На рис. 2 представлены нуклеотидная и гипотетическая аминокислотная последовательности мобильного элемента репейник. Оказалось, что репейник является необычно маленьким ретротранспозоноы, его длина составляет 2 569 pb. Он содержит длинные концевые повторы (LTR) величиной 275

в р4.0

pi ,57

к-

H H -Л—

H В H S -i-UtbU

R

I; kb.

\

в

VL

H

ч

3

jll:

IT

Рис Л.а - Физическая карта локуса cut: 1- EcoRI карта клонированного сегмента ДНК из линии Oregon RC; обозначена локализация и природа "классических" ct-мутантов; приведена" шкала в Kb. 2 - области локализации известных ct мутаций: жизнеспособные (светлые прямоугольники) и летальные (серые прямоугольники) мутации г вызванные инсерцией gypsy, заштрихованный прямоугольник - ct-летали, не связанные с мобильными элементами, черный прямоугольник - точка внедрения репейника. 3 - стрелками обозначены районы локализации и направление известных транскриптов,

б - Физическая карта района внедрения репейника в локусе cut в линии ctMR1K1. в - Рестриктные карты клонов р4.0 и pi,5?, содержащих мобильны:! элемент репейник и район его инсерции в локус cut, LTR репейника обозначены прямоугольниками; стрелки соответствуют 0RF, показано направление транскрипции в локусе и в мобильном элементе, R - EcoRI, Н - НШШ, S - Sail, Б - ВаиН1,

LIR

ЛС'ГТДЛСЛСЛЛТСЛСЛАААСАСССОАААТАТ AG7CGTAAGCCTCAAGTGCTTTTCCCATC 60

tatagatcgagctttacctataaggaactgtaacttgttaagctttagagataagaactc 120

ttgci'atacttaagttagtggattttggaágattagaagcgtcggtcatcgccacgtact 180

tactattcgtctcattaagtgcagaccgcgcaagcctattgtaattaatáaacttacgct 240

LTE —.-,

А^ТАААТАТАТСШАААТСТАСТААААТСАТААТ1;1ЖШШ,Д.АССЙАТАТАААААССТ 3 О О

ACGATAACTGAATAATTATÁAATAAATAACAAAAGGAGGÁTCCGGAGACÁAAACCAGCGG 360

CTTTGGCTAÀTTAACTCTAÀCCTAAGAAATAAAAATTTCGrGATTACATÀAAATATAATÀ 420

TTAATTACTAAGACCATCTACGTTAAAATTGTTTGTTAAnJACTATTATTATATTGTAAG 480

TATAACGCTTATrGAACGAÀTTAAAAATATTA'rTATTATTATTATATTATAACCTATGCÀ 540

aagagtattgataataaaaátacatgagtgacagtgataáccttttagacaacctagtgt 600

M S I) S D N L L I> N L Y 12

CAAGCTTAAÀTAAATGGTCÀGCGCACCAGGCAAGTAGGCÂAAACAGrGCACAAAAAAATÀ 660

SSLNKWSA II Q A S В Q N S A F К N зг

ATAAGTCATCAGATAATTGGTGGTCAAAAÂCAMGACAACTACCCAAATCCAA'nïCAAG Г20

n к s s d m w w s к t к t t s e m e f e 5 2

CTCAGTTA.AÀAGCGATCGTÀGAGAGTGCrGTTGCCGGTGCGCTCGCAGTCCAAAAACAAT 760

A Q i К A I V E S A Y A G A I, A V О К Q 72

CAJTTGAAAÀGCAATTGCAGGAGATGAATGAGCGAA'TCGGGAAATTAACÀGTGAACACCC 840 S F H К Q L Q E M NERIGKLTYNT

CAGAGGTGGÂAACTTATGTÂGATGCTGAAÀTTAGACCAGGTGTTGTCTGTAGCGAGCCTC 900

PEYETYYDAEIRPGYYCSEP 112

TAGATATACTTAAATCTCTGGCQGATTTTGATGGCAAAAGTGAAACATATGTGTCGTGGÂ 960

ldilkslppfpgksetyysw iî2

GAAAAGCGGCTCATGTCGCTTTTAAAGTTTTCAAAGATTÁCGAGGGAAGTTCAACATTTT 1020

R К A A H Y A F К Y F К D Y E G S 5 T F 152

ACCAAGCTCTTGGTATTATGCGAAATAAAÁTAAAAGGTCCAGCGAATACÁGTATTGGCTT 1080

Y Q A L G I M. R N К I К G P A N T Y L A 172

CTTTTAAAAÁACAGCTAAGÁAGAGAAAATGTAACAAGACGAGACAGAACCTTTGAGGTGG 1140

s f к к Q LÁ.LÍ.J.J.JJ..L1I.L.LI..L 192

CACAAACCGTCATGGTAAAÂCAAAACAATCGCTTGGGAAÂTAAACTAACCCCACGGTATÂ 1200

Ç..-E..T.-V.J.J _K._Q. _N_N„ B—t- _G. Jî _ _K_ _ T- JEL-B_1- 212

gggaagaactaatcgaagcígacctcgggácaacgcttcctcataaaaggcíagggtcgttc 1260

Р. J-.L-L-J__H.A. D..L..S..J..T. -Y-.L. .L..K..G. ü. V...Y...

ataaagataàtctacgctaggtttagtatttcttttccttttgtgaccatcgccaagttâ 1320

gcaaaatacáaacgtgaaatctgaacactágtaaaagagtttgcaaacatttttcaattá 1380

aatatttgtcaaatccttcttatttaatctttaaacattttgtattatttccgcttcatc 1440

ctctttagaáaattttaaaggtatgtgatgaaatgctagácccgaatgatttgaaaactf 1500

aaagtccacixaaccacaaátatiiiictgáaáciáccátágaaáataaatc^attaccaá 1560

aacggcataátaacagtatágcgcactgactctaattagátttcaaattcccgattaaaá 1620

aaaaaataaáacactaatgragcaataccctgcctgattctgtcaactaáataggaaaat 1680

caagacttgcaatcaataagcggtttactácatactttaítatcaaaaatatctgaatgá 1740

actttattataaaattataágtgttatacttaattattgtcaaaactttàgtattaaaac 1800

tgtaactacctcttaagtagatgagaagagtagaagagggaattaagatctatcaacgtá 1860

gtatctgctáaagacgtaaágatgcggcaáctatttctgcgcctgggtactgaaacgacg 1920

aactgaataátatctgccatgagacgccaáccagagtgcóttcaacacatacgttttgat 1980

ggtcaactagttcaaccaacatcagcatcátcgtcgtcaácaagrcc-acggttacaataá 2040

agattttttccaagttcgctacgatcatctcgagaaccttgttgcgaacccatgacatgg 2100

agaatcagcágcatttacgáacttctgggátcatccagacacgcagagctgccttccctt 2160

cgatggtttáacgcagtaccaggttggcagtatgggaacftagtgcacaáccaatgttac 2200

ccgtaagatccgctttcaaátagatttgccaattgtaaaáagtctgtggácagccttcgt 2260

. Ljg ,

сттшшшю^сттаасасаатсасаааасасссаааататастсстаассстсаа 2320

GTGCTTTTCCCATCTATAGÁTCGAGCTTTÁCCTATAAGGÁACTGTAACTfGTTAAGCTTT 2400

AGAGAmcÁACTCTTGCTÁTACTTAAGTTAGTCGATTTfGGAAGAmÓAAGCCTCGGT 2460

CATCGCCACGTACTTACTATTCGTCTCATTAAGTGCAGACCGCGCAAGCCTATTGTAA1Ê 2520

,_, , LTE___

MTÄÄ^CTTACGC[TAATAA.A|TATATGG'AAAATCTACTAAAATGATAA.TT| 2569

Рис.2. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности репейника. LTR выделены и ограничены рамками: сайт связывания лизиновой тРНК подчеркнут двойной чертой: полипуриновый тракт обозначен пунктирной рамкой; сигналы полиаденилирования заключены в рамки. Нумерация нуклеотидов и аминокислотных остатков дана справа. Подчеркнуты участки аминокислотной гомологии с 0RF1 (сплошная линия! и 0RF2 (пунктир) gypsy.

pb, не имеющие гомологии с какими-либо из описанных ранее, LTR репейника ограничены короткими инвертированными повторами AgTTA-TAAtT и несут два предполагаемых сигнала полиаденклирования (в позиции 226 и 24!, рис.2!, В нуклеотидной последовательности LTR ррпрщииа не обнаружено участка, идентичного какой-либо из ранее описанных для мобильных элементов области начала транскрипции. Сразу за 5' -LTP. находится сайт связывания лизкпевой тРНК, а непосредственно перед o'-LTR расположен полипуриновыи тракт.

Анализ нуклеотидной последовательности I.TR репетша не выявил промоторши области идентичной какои-либо из ранее описанных для мобильных элементов. Кроме того, отсутствие в LTR тетрануклеотидэ АСАр или CGTG, характерного для позиции +25/50 промоторов всех ранее описанных мобильных элементов, возможно, указывает на наличие в регтнике отличной от уже известных точки инициации транскрипции,

Репейник имеет одну открытую рамку считывания (0RF1, кодирующую гипотетический полипептид величиной 238 аминокислотных остатков. При сравнительном анализе полученной последовательности, проведенном с помощью программы Genebee и банка данных SWISSPR0T, обнаружена,

хорошая гомология с белками, кодируемыми ретротранепозоном gypsy. Причем, 120 аминокислотных остатков (53-173) гомологичны соответствующей части полипептида, кодируемого 0RF1 gypsy, в то время как, последующие 65 гомологичны С-концу 0RF2 этого мобильного элемента (рис.3).

Молекулярный анализ данной копии ретротранспозона репейник выявил ряд интересных структурных особенностей нового мобильного элемента. Некоторые структурные черты, как то инвертированные AgTTA-TAAtT повторы, ограничивающие LTR, сайт связывания лиэиновой тРНК,, высокая степень гомологии между белковыми продуктами (до 76%), позволяют предположить наличие родственной связи we аду репейником и gypsy и, возможно, указывают на их общее происхождение. Однако, необходимо отметить и существенные различия. Так, вместо 0RF3, кодирующей компоненты необходимые для образования вирусных частиц, и, предположительно, определяющей свойства gypsy как ретровируса насекомых, репейник содержит некодирующую последовательность величиной около 1 кЪ.

Поскольку в белке, кодируемом ORF репейника, отсутствуют домены, характерные для РНКазы Н, обратной транскриптазы, протеазы и интегразы, вопрос о механизме транспозиции данной копии мобильного элемента остается

I

A

burdock gypsy

burdock gypsy

В

173 165

.burdock kRREI|VT3lR^TlrEVG 238

gypsy" IEmraPSHQ№V№VGERVmmKBLÖWaTPLCTEQWQABLGTSVXlKGRTOKDiILK 1035

Рис.3. Гомологии Мелкое, кодируемых ORF репейника (burdock), с полипептидами, кодируемыми ORFHA» и 0RF2fБ) ретротрансляэона gypsy. Показано штриховкой и чертой сверху согласно матрице Schwarte & Dayhoff

открытым.

С одной стороны, характер гомологии между белками, кодируемыми 0RF репейника и gypsy, позволяет предположить, что изучаемая последовательность возникла в результате делеции в области 1085-1095 фрагмента размером около 3,7 kb, кодирующего, подобно соответствующему району gypsy, необходимые для перемещения домены. Поэтому представляется вполне вероятным, что в геноме имеется полная копия репейника, содержащая все нужные для транспозиции последовательности, и способная обеспечить интеграцию делетированного варианта burO. Подобный механизм не противоречит известным фактам. Например, присутствие хэлпера, несущего определенные последовательности Р элемента, обеспечивает внедрение конструкции на основе этого элемента в геном дрозофилы.

С другой стороны, как уже отмечалось выше, структурные элементы, играющие важную роль в процессе транспозиции, у репейника и gypsy одинаковы. Все инсерции репейника в данный район локуса cut происходили в линии ctMR2, уже содержащей ретротранспозон gypsy на расстоянии., около 1,5 kb от "горячей точки" внедрения (рис.1б). Кроме

Q1 !Л

того, описанные ранее .жизнеспособные мутации ct и

Т —1 ft

ct являются результатом инсерции gypsy в тот же самый

0,35 lib Hlndlll-Sall Фрагмент локуса(рисЛб) и, возможно, точно в описываемую нами "горячую точку" внедрения репейника. Таким образом, альтернативное предположение о механизме транпозиции репейника может быть связано с тем, что данная копия для своего перемещения способна использовать белки, кодируемые близкородственным ретротранспозоном gypsy. Изучение других копий репейника, содержащихся в геноме дрозофилы, позволит ответить на этот вопрос.

Анализ нуклеотидной последовательности района инсерции репейника в локусе cut Dr.melanogaster.

На рис.4 представлены нуклеотидная и гипотетическая аминокислотная последовательности района инсерции репейника в локусе cut. Интеграция данного мобильного элемента приводит к дупликации тетрануклеотида TATA. При инсерции репейника в данный район локуса cut прерывается свободная рамка считывания, кодирующая гипотетический полипептид длиной 220 аминокислотных остатков. Поскольку данная последовательность не содержит в начале метионинового кодона, она не может являться отдельным транскриптом, и, по-видимому, входит в виде экзона в более длинную мРНК, Интересно отметить, что описанные ранее мутации ct81,/1 и ctf-1® , обусловленные инсерцией

gaattcttaccccgcacactccagtctccátacagagatggatcatgattgcaacaatgá 60

tgacgttgaâctgctctccgattcggaattagaatcagaàtcagaatcagaatcactacà 120

GTGCCAAAGGAATGACCACCGCTCAACCGÂTTGCCGTACCTCTCCGGGTGTrATATAATÀ 180

atcgtctgtätttccttgatcaattgtatgtcgtcgcttcttgctagattgcttctttct' 240

TAACACCTTÀCTGCGACCCÀTTTTCCGTATTTCCGTATGTGTCTTTTAACTGTTGATAGT 300

atattàatatctgaggttgtaattgtactgtcggaaattttaaaatggagtgaagtctgc 360

aacatcaaactgacaggtttctcaaaacaàaaaatctgtàccataatttgtatcttactg 420

tacattacatgtaccttatgttccataagcgttttcgtcâaaaatagggcctaccgaatà 480

ccccgaaatcgattagtgcgggccaacaagtcgataagatcatagaggagttataggtct 540

tgcatattagctggaagctcttctccgaagagatcgattgtgtgtggcttccattgaaaâ 600

ttggctaccgaccacaccatatggggcaaàactagatcatagtatccatttaatgcgtgt 660

agatcgaagggctaagatagccgacagttàgttggagaacctttcagttâgtgggttaag. 720

cttaaaggcgacaatctcgtgcacccgaaâcccgctacaâaaacgcggaàaaaacgtatt 780

aaatacaaantcctggtaâtaaaacagagagacaactctggccactggctgccaaaata 840

brett l- at g- с q N- 12

aagaaataaátcttaacgcccagagggtcága6aaagagágagagagagágagagagagá 900

keinlnaqryeerereeere 32

gagaaagacágcgaatcggáatcggagtgáctaacgtatcgccgctgcttccagcctttá 960

r e r q r i g i g v t n y s p l l p a f 52

ttgttacttttgtgtatatâttcttgtatcagcgtgtaaatctcgctcacacaccagatg 1020

iytfyyiflyqrynlahtpd 72

aaatacggagagtcggccgáaaaccgaactcaagtcgacägaatttttattggaaatctg 1080 eirrvgrkpnssrqnfywks 92

tacgcagaaâtagtcatcatcccattccaàccccgtccatccccatcgtcgtcataatgà 1140 yrrnshhpiptpsipivyim 112

tctttggattcggattcgtâttcggattcggattcagccgcatcttcatctgccgcctgâ 1200 ifgfgfyfgfgfsrifichl иг

17

1 Y

TCTTTTTCTTGTTTCTGATGCCTCAGATGCATATCGCAGTTCGCGCTGGCAATAAAAATA 12« IFFLFLMPQMHIAVRAGNLN ii

TATATGAGCTGTTGATGACTGCATATAAAAACAGGATGGAATGCTATTGTTGCTCGACTA 13 i I YELLMTAYKNRMECYCCST r

TCGAGTACCCGTTAGTCAGAGAAAATTTTTTTAAAAGTGTGGACGGGAGAGGCATGCTAA 131 IEYPLYREMFFKSYDGRGML i1

GTATCGAATCTGATCAAGAATATAATTATTTAATATGGTCAGAAAGGCTTAATTCCACAT 14' SIESDQEYNYLI WSERLNST 2

CTTACTTTGTTTTTCAGCCAATCTAGTATACCCTTTTACTTCACGTGCAACGGGTATAAT 151 S Y F Y F Q P I 2.'

TATACGAAACTGCCAGTGAACAAACCCTCGGATA'FACTGTGATATATGCGTGCCGATGCA 15< GTTGACTCCGGGACCAAAGTCAAGGAATTC 15!

Рис.4. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности райо внедрения репейника в локус cut. Выделена последовательное дуплицируюшаяся при инсерции мобильного элемента. Нумерац нуклеотидов и аминокислотных остатков дана справа.

ретротранспозона gypsy в тот же самый 0,35 ЪЪ Hlndlll-sall Фрагмент локуса cut, являются »«неспособными. При этом направление транскрипции мобильного элемента совпадает с направлением транскрипции в локусе.По данным геномного блот-анализа, во всех И ct-деталях, возникших в результате внедрения репейника из линии ct^, направление транскрипции в мобильном элементе противоположно направлению транскрипции в локусе cut, что, возможно, и является причиной возникновения летальной мутации. Таким образом, можно предполояпь, что возникновение летальной мутации в случае инсерции в данный район репейника связано с его внедрением в определенной ориентации,

При подробном анализе нуклеотидной последовательности данного района локуса cut обнаружено, что "горячая точка" внедрения репейника может быть сайтом узнавания для топоизомеразы II дрозофилы. Интересно, что эта область содержит два перекрывавшихся консенсуса,

т л

узнаваемых шшиаомеразой II; пентадекамер GTNiA-fATTNATNNp

iii VJ

и альтернирующий пурин-пиримидиновый тракт, причем непосредственный участок интеграции мобильного элемента входит в состав обоих консенсусов. Ранее аналогичные последовательности были обнаружены не в самом месте внедрения ретровируеа ВИЧ в геном человека , а в

непосредственной близости от него . Возможно, топоизомераза II участвует в процессе интеграции ретроэлементов в геном, меняя информацию хромосом в месте внедрения.

Изучение транскрипции на разных стадиях развития

ДРОЗОФИЛЫ.

Для дальнейшего изучения элемента был предпринят анализ его транскрипции на разных стадиях развития дрозофилы.

Внутренний Н1п<11ТТ-ЗаП фрагмент величиной 1.4 кЬ (рис 2 в) использовали в качестве зонда в МоШш-гибридиэациях с препаратами поли(А+)РНК, представляющими разные стадии развития дрозофилы. При этом оказалось, что каждая стадия характеризуется своим набором трапскриптов (рис.5). Наиболее активно репейник транскрибируется в личинках: четыре основных мРНК величиной 3.7, 2.7, 2.5, и 1.2 кЬ, и ряд минорных - величиной около 7, 3.4, 2.0, 1.8 и 1,4 КЬ. В имаго обнаруживаются только два основных транскрипта величиной 2.7 и 2.5 КЬ, мРНК длиной 3.7 И присутствует в виде минорной полосы, а транскрипт величиной 1,2 к!) практически не выявляется. Кроме того, на этой стадии присутствуют минорные мРНК величиной 7, Л.4 и 2.0 кЬ, На эмбриональной стадии репейник транскрибируется значительно слабее и представлен четырьмя

i 2 3V

Рис.5, Notliern слот анализ транскрипции репеинииа на разных стадиях развития дрозофила. Около 5 мкг поли1А+)РНК, соответствующей стадии развития, фракционировали в агарозяой геле, Флотировали и гиОридизовали с зондом, полученным -с помощью гибридизацмонного праимера на фаге М13, Указаны размеры в Мз. В качестве маркеров использовали РНК E.coli, ШгДОП, препарат ядерной РНК дрозофилы, 1 - эмбрионы, 2 - личинки, 3 - куколки, 4 -мухи.

мРНК величиной 7, 3.5, 3.4 и 2.7 kb. При метаморфозе в куколках транскрипция практически отсутствует.

Исследуемой копии burO, по-видимому, соответствует один из основных транскриптов величиной 2.5 или 2.7 kb. Можно предположить, что мРНК длиной около 7 kb, характерная для большинства ретротранспозонов, синтезируется с полной копии репейника. Возможно, что делетированные копии репешика транскрибируются более активно, и/или большая часть его копий имеет делеции.

Наличие нескольких коротких дополнительных транскриптов на различных стадиях развития дрозофилы характерно для большинства ретротранспозонов. Предполагается, что они являются результатом альтернативного сплайсинга РНК, однако доказано это только для ретротранспозонов copia и toa. Сравнительный анализ геномных копий и клоков кДНК репейника поможет выяснить происхождение коротких транскриптов.

Известно, что стадиеспецифичность транскрипции разных ретротранспозонов сильно варьирует, однако, некоторые из них обладают сходным спектром транскрипции в развитии, и могут быть объединены в одну группу. По характеру транскрипции репейник наиболее близок к мобильным элементам HMS Beagle и Springer. Эти элементы активно

транскрибируются в личинках и имаго, на эмбриональной стадии их транскрипция слабее, а в куколках - практически отсутствует. Однако, репейник отличается количеством и длиной дополнительных мРНК, Интересно отметить, что ретротранспозон gypsy, имеющий структурное сходство и белковую гомологию с репейником, а также одинаковую по длине дополнительную мРНК (1,4 kb>, напротив, наиболее активно транскрибируется в куколках.

Локализация транскриптов методом нерадиоактивной In situ гибридизации на эмбриональной стадии развития.

На рис.6 представлены результаты локализации транскриптов, соответствующих репейнику, в эмбрионах дрозофилы методом нерадиоактивной гибридизации in situ. Транскрипция репейника начинается на самых ранних стадиях эмбриогенеза. На стадии синцитиальной бластодермы транскрипты обнаруживаются в ядрах центрального желточного тела (рис.6а). Транскрипция усиливается на стадии клеточной бластодермы, а большая часть транскриптов в этот период выявляется в базальний части клеток, преимущественно в вентральной области (рис.бб.в). В период гаструляции транскрипты репейника определяются в основном в базальной части эктодермальных клеток, а также в мезодерме (рис.бг-е). На поздних эмбриональных стадиях транскрипты локализуются в

Рис,6. Анализ транскрипции репейника методом нерадиоактивной In situ гибридизации на целых эмбрткая B.nielanogzster шиии Oregon В, В качестве зонда использовали внутренний Hifldlll-Sall фрагмент репейника IburOi величиной 1.4 Jib. Ориентация эмбрионов: передняя часть слева для а-в, справа для г-з: а-х ~ вид сбоку; з, - вид с дорсальной стороны. Стрелками и кружками .отмечены отдельные места локализации транскриптов4. а - некоторые ядра желточного тела; д -12 сегментарных зон в мезодерме; ж - хишечнж; з - две

симметричных группы клеток в головном отделе,

24

кишечнике, мезодерме и вентральном эпидермисе (рис.6ж,э). Таким образом, в процессе эмбриогенеза репейник обнаруживает характерное распределение транскриптов, отличное от описанных ранее для других ретротранспоэонов,

К настоящему моменту обнаружено только два мобильных элемента, 412 и isdgl, обладающих одинаковой стадие- и тканеспецифичностью транскрипции. Предполагается, что это может быть обусловлено идентичностью участков, ответственных за инициацию транскрипции. Известно, что эти ретротранспозоны имеют сходную структуру: идентичные инвертированные повторы на концах LTE, наличие сайта связывания arg тРНК, а также содержат одну и ту же последовательность величиной 27 bp (включая И нуклеотидов полипуринового тракта), непосредственно перед LTR. Однако, ретротранспозоны репейник и gypsy, также сходные по структуре и обладающие белковой гомологией, сильно отличаются специфичностью транскрипции. Резко различен и характер транскрипции мобильных элементов 297 и 17,6 , тогда как, последовательности их LTR и 3'-концевых областей длиной 1,7 Kb обладают высокой степенью гомологии, причем 46 нуклеотидов, расположенных непосредственно перед LTR, абсолютно идентичны. Таким образом, однозначно определить район, ответственный за специфичность

транскрипции мобильных элементов пока невозможно, хотя, в настоящий момент, есть данные о наличии в 5' нетранслируемой области ретротранспоэона copia последовательностей, связывание которых с гомеодоменами регулирует его транскрипцию,

Поскольку регротранспозоны не кодируют собственных транскрипционных факторов, а используют для транскрипции белки хозяина, локализация сайтов связывания с этими белками позволит в дальнейшем идентифицировать и изучать ткане- и стадиеспецифические транскрипционные факторы эукариот.

выводы

. Мобильный элемент репейник относится к классу ретротранспозонов содержит одну открытую рамку считывания. В ней нет областей, одирущих протеазу, РНКазу Н, обратную транскриптазу и интегразу, оторые необходимы для транспозиции. Кодируемый ORF репейника олилептид имеет два последовательных участка гомологии с белками, одируемыми 0RF1 и 0RF2 gyps/- в N и С областях соответственно, . Сайтом инсерции репейника в локусе cut является TATA оследовательность. Инсерция репейника в данный район прерывает ORF окуса, направление транскрипции мобильного элемента ротивоположно направлению транскрипции в локусе, "Горячая точка" недрения данного элемента в локусе гомологична сайту узнавания опоизомеразой II дрозофилы.

. Методом Nothem-гибридизации обнаружено, что репейник обладает тадиесгтецифичностью транскрипции. Наиболее транскрибируемыми вляются стадии личинок и имаго. Каждая стадия развития дрозофилы арактерязуетея своим набором транскриптов,

. Выявлена локализация транскриптов методом нерадиоактивной In ltu гибридизации на эмбриональной стадии развития. Обнаружена канеспецифичная транскрипция репейника. В процессе эмбриогенеза ранскрипты первоначально обнаруживаются в ядрах желточного тела, озднее выявляются в базальной части эндодермальных клеток и в ¡езодерме, а в зрелых эмбрионах транскрипты локализуются в [езодерме, кишечнике и клетках вентрального эпидермиса.

Работы. опубликованные по тепе диссертации.

1.Пономаренко H.A., Айрих Л.Г.. Молекулярный анализ новоп мобильного элемента - репейник, (burdock) - и района его инсерции i локусе eut Drosophila ше lano gas ter. - Генетика, 33, I.e., 1997.

2.Пономаренко H.A., Айрих Л.Г., Мезохот К,, Чуриков H.A. Изучение транскрипции мобильного элемента репейник (burdock) н; разных стадиях развития дрозофилы. - Докл.РАН, -принято i печать, 1997.

3.Ponomarenko N.A., Airich L.G., Dyinovlch А,У,, Tchurlkov N.A. The Molecular analisis of burdock - a novel mobile element ii Drosophila genome - and mechanisms of its transposition - 14tl European Drosophila fiesearch Conference, Venezla sept.., 19-22, 1995.