Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярный анализ эмбрионального развития Hydra путем вычитательной гибридизации

ВАК РФ 03.00.00, Биологические науки

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Генихович, Григорий, Киль

05-31Я S3

Молекулярный анализ эмбрионального развития Hydra путем вычитательной

гибридизации

Диссертация на соискание степени кандидата наук факультета Математики и естественных наук Университета им. Христиана Альбрехта города Киля

представленная Григорием Гениховичем

Киль 2004

Оппонент:..............................................................Проф. д-р., д-р. Л.с. Т.К.Г. Бош

Второй оппонет:...............................................................Проф. д-р. Р. Ментляйн

Дата устного экзамена:..........................................................................06.12.2004

Дата публикации: Киль...........................................................................................

Части данной работы опубликованы или готовятся к печати:

Frobius, А. С., Genikhovich. G.. Кйгп, U., Anton-Erxleben, F. and Bosch, Т. С. G. (2003) Expression of developmental genes during early embryogenesis of Hydra. Dev. Genes Evol. 213, 445^455.

Genikhovich. G.. KQrn, U., Hemmrich, G. and Bosch, Т. C. G. (2004) Discovery of genes involved in Hydra embryogenesis (в печати)

Содержание

Сокращения 8

1. Введение 11

1.1. Характерные особенности оогенеза и эмбрионального развития 11

1.2. Hydra - модель для изучения постоянного формирования

паттерна и морфогенезов во взрослом состоянии 12

1.2.1. Филогенетическое положение, анатомия и гистология

гидры 14

1.2.2. Гаметогенез у Hydra 15

1.2.3. Эмбриональное развитие гидры 19

1.2.4. Формирование паттерна у взрослых животных: система позиционной информации 21

1.2.5. Формирование паттерна у взрослых животных: региональная спецификация судьбы клеток 23

1.2.6. Что известно об эмбрионе гидры на молекулярном уровне

и что остается узнать? 28

1.3. Цели данного исследования 30

2. Результаты 31

2.1. Конструирование кДНК-библиотеки из ранних эмбрионов путем вычитательной гибридизации и ее анализ 31

2.1.1. Конструирование кДНК-библиотеки из ранних эмбрионов

путем вычитательной гибридизации 31

2.1.2. Анализ полученных последовательностей 32

2.1.3. Проверка качества вычитательной кДНК-библиотеки путем

RT ПЦР 37

2.1.4. Примеры генов с известными гомологами 39

2.2. HyEED-1 - консервативный регуляторный ген, участвующий в эмбриогенезе 43

2.2.1. Клонирование HyEED-1 43

2.2.2. Анализ экспрессии HyEED 49

2.3 НуЕМВ-1 - ген без известных гомологов, задействованный в

эмбриогенезе 54

2.3.1. Клонирование и анализ НуЕМВ-1 54

2.3.2. Анализ экспрессии НуЕМВ-1 методом гибридизации in situ 58

3. Обсуждение 63

3.1. Эмбриональное развитие: что происходит на молекулярном уровне? 63

3.2. Преимущества и недостатки подавляющей вычитательной гибридизации 66

3.3. Проверка качества библиотеки: необходимо ли это? 68

3.4. Анализ последовательностей кластеров и синглетов

библиотеки Kiel 3 70

3.4.1. Общая информация 70

3.4.2. Не имеющие гомологов гены в библиотеке Kiel 3 71

3.5. НуЕМВ-1 - не имеющий гомологов, неизвестный ранее ген 73

3.6. Ген Hydra Embryonic Ectoderm Development эпигенетика и происхождение интерстициальных клеток 75

3.6.1. Функции белков группы Polycomb 75

3.6.2. Hydra EED - самый ранний генетический маркер интерстициальных клеток 77

3.7. Заключительные соображения 80

4. Резюме 83

5. Материалы 85

5.1. Используемые животные 85

5.2. Среды 85

5.3. Растворы 86

5.3.1. Растворы общего назначения 86

5.3.2. Растворы для гибридизации in situ и окрашивания антителами и методом TUNEL 88

5.4. Наборы реагентов 90

5.5. Ферменты (не из наборов реагентов) 90

5.6. Химические реагенты 91

5.7. Радиоактивные нуклеотиды 93

5.8. Векторы 93

5.9. Антитела 93

5.10. Праймеры и олигонуклеотиды 94

5.11. Приборы 97

5.12. Прочие материалы 99

5.13. Компьютерные программы 99

6. Методы 102

6.1. Животные и условия культивирования 102

6.2. Выделение геномной ДНК 103

6.3. Выделение тотальной и матричной РНК 104

6.4. Синтез кДНК путем обратной транскрипции 104

6.5. Лигирование сплинкеретт 105

6.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 106

6.6.1. Амплификация фрагментов ДНК 107

6.6.2. RT ПЦР 107

6.6.3. 3" RACE ПЦР 108

6.6.4. 5' RACE ПЦР 109

6.6.5. ПЦР с вырожденным праймером 110

6.7. Гибридизация по Саузерну 110

6.8. Гибридизация по Нозерну 112

6.9. Клонирование и секвенирование 113

6.9.1. АТ-лигирование продуктов ПЦР 113

6.9.2. Компетентные клетки 114

6.9.3. Электропорация и проверка на наличие вставки 115

6.9.4. Выделение плазмид 115

6.9.5. Секвенирование с использованием системы Li-COR 115

6.9.6. Секвенирование с использованием системы MEGABACE 500 116

6.10. Подавляющая вычитательная гибридизация 117

6.11. Выращивание библиотеки в бактериях и приготовление макроэррэев 119

6.11.1. Выращивание библиотеки в бактериях, репликация и 119

хранение клонов

6.11.2. Упорядоченное нанесение клонов библиотеки на

нейлоновую мембрану и обработка фильтров 120

6.11.3. Гибридизация макроэррэев 121

6.12. Гибридизация in situ 121

6.12.1. Приготовление меченных дигоксигенином проб 121

6.12.2. Гибридизация in situ на целых зародышах 122

6.12.3. Гибридизация in situ на целых полипах 123

6.12.4. Гибридизация in situ на замороженных срезах эмбрионов 124

6.13. Окрашивание антителами 125

6.13.1. Окрашивание антителами взрослых полипов 125

6.13.2. Окрашивание антителами замороженных срезов 126

6.14. Окраска по методу TUNEL 126

7. Литература 128

8. Благодарности 141

9. Официальное заявление 142

Сокращения

1 Минута

а Секунда

а.к. Аминокислота

БСА Бычий сывороточный альбумин

В Вольт

ВКМ Внеклеточный матрикс

г Грамм

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

ДНКаза Дезоксирибонуклеаза

ДЭПК Диэтилпирокарбонат

Ед Единица (активности фермента)

кДНК Комплементарная ДНК

л Литр

кВ Киловольт

мг Миллиграмм

мкг Микрограмм

мкФ Микрофарада

мл Миллилитр

мкл Микролитр

мм Миллиметр

м/о Весовые проценты

мРНК Матричная РНК

нг Нанограм

нм Нанометр

о/о Объемные проценты

пмоль Пикомоль

Рис. Рисунок

РНК Рибонуклеиновая кислота

РНКаза Рибонуклеаза

см Сантиметр

тРНК Транспортная РНК

УФ Ультрафиолет

ЭДТА Этилен диамин тетраацетат, натриевая соль

ВАС Искусственая бактериальная хромосома

BCIP 5-бромо-4-хлоро-3-индолилфосфат

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

bp Пара нуклетодидов

Cpm Импульс в минуту

DABCO Триэтилендиамин

DAPI 4,6-диамидино-2-фенилиндол

dATP Дезоксирибоаденозин трифосфат

dCTP Дезоксирибоцитидин трифосфат

ddH20 Бидистиллированная вода

dGTP Дезоксирибогуанидин трифосфат

dH20 Дистиллированная вода

Dig Дигоксигенин

dNTP Дезоксирибонуклеотид трифосфат

dTTP Дезоксириботимидин трифосфат

dUTP Дезоксирибоуридин трифосфат

EST Expressed sequence tag

et al. И другие

FITC Флуоресцеин изотиоцианат

GAPDH Глицеральдегид-З-фосфат дегидрогеназа

HS Гибридизационный раствор

1-клетка Интерстициальная клетка

IPTG Изопропил-1-тио-р-0-галактозид

kb Тысяча пар нуклеотидов

LB Luria broth

M Молярный

MAB Maleic acid buffer

mM Милимолярный

NBT Тетразол нитросиний

NCBI Национальный центр биотехнологической информации

QD600 Оптическая плотность при длине волны 600 нм

ORF Открытая рамка считывания

PBS Phosphate-buffered saline

PCR Полимеразная цепная реакция

PEG Полиэтиленгликоль

PRC Репрессорный комплекс белков группы поликомб

RACE Rapid amplification of cDNA ends

rpm Обороты в минуту

RT Обратная транскрипция

SDS Додецилсульфат натрия

SSC Sodium salino-cytrate

Та Температура отжига праймера

TdT Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза

TEMED N, N, N', N'- тетраэтил метилдиамин

Тт Температура плавления праймера

TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine-digoxigenin triphosphate nick-end labeling

UTP Рибоуридин трифосфат

UTR Нетранслируемый участок

X-Gal 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-р-Р-галактозид

1. Введение

1.1 Характерные особенности оогенеза и эмбрионального развития

Программа развития многоклеточного животного включает в себя формирование самой сложной клетки организма, яйцеклетки, ее оплодотворение и быстрое, но при этом безошибочное, развитие исключительно сложно устроенного тела животного. Самое очевидное и, в то же время, важнейшее свойство оогенеза и эмбрионального развития заключается в том, что эти процессы происходят с каждым живым существом только один раз за всю их жизнь. В ходе оогенеза или раннего развития происходит детерминация осей тела, затем специфицируются обширные области зародыша, клетки пролиферируют и дифференцируются, образуя, в конечном счете, части тела. Общепринятым считается то, что закладка осей, формирование паттерна, морфогенетические движения, зависимая от положения в зародыше спецификация судьбы клетки, активные и всеохватывающие процессы пролиферации и дифференциации клеток являются характерными особенностями оогенеза и эмбрионального развития. Все эти процессы требуют жесткого контроля за экспрессией генов, что возможно только в строго организованной среде из структурных белков, желтка, мембранных компонентов и специфически распределенных в пространстве материнских мРНК. После того как формирование паттерна завершается, а части тела и органы уже сформированы, задачей организма становится, в первую очередь, поддержание гомеостаза, обновление клеточных популяций, борьба с патогенами и, наконец, репродукция. Эта смена задачи отражается в наличии значительного числа структурных и регуляторных генов (и материнских, и зиготических), которые необходимы для построения организма животного, но не для его поддержания. Эти гены экспрессируются кратковременно в ходе оогенеза (если это гены материнского эффекта) и эмбриогенеза. Например, материнская мРНК bicoid запасается на переднем полюсе яйца Drosophila, белок, транслированный с этой мРНК, образует градиент, и, после того как передне-задняя ось плодовой мушки специфицирована, bicoid больше не экспрессируется до тех пор, пока не приходит время сформировать новое яйцо (Bereleth et al., 1988; FlyBase http://flybase.bio.indiana.edu/). Hunchback экспрессируется в яичниках Drosophila; его РНК имеется во всех частях эмбриона, но в передней части, где белок bicoid связывается с энхансерами hunchback в зиготических ядрах, дополнительно транскрибируется еще некоторое количество hunchback. Hunchback

работает вместе с bicoid, регулируя формирование передней части зародыша, и также не экспрессируется во взрослой дрозофиле до тех пор, пока не начинается оогенез (FlyBase http://flybase.bio.indiana.edu/). Зиготический ген serendipity-a кодирует компонент цитоскелета, необходимый для целлюляризации. Этот ген начинает экспрессироваться во время двенадцатого клеточного цикла, достигает максимальной интенсивности экспрессии в начале четырнадцатого цикла, а к концу его полностью исчезает (см. обзор Mazumdar and Mazumdar, 2002). Эти данные свидетельствуют о том, что существуют процессы, специфичные для эмбрионального развития, и они требуют определенного генетического контекста.

В то же время существуют животные, у которых формирование паттерна, пролиферация и дифференциация клеток происходят постоянно или случаются периодически и во взрослом состоянии. За их необычную природу эти процессы даже получили название «соматических эмбриогенезов» (Tokin, 1969). Соматические эмбриогенезы типичны для животных, стоящих по обе стороны эволюционной границы Eumetazoa: для губок и книдарий.

1.2. Hydra - модель для изучения постоянного формирования

паттерна и морфогенезов во взрослом состоянии

Пресноводная гидра - типичное, хоть и просто устроенное, многоклеточное животное с истинными тканями, примитивной нервной системой и стабильными клеточными типами. С середины XVIII-oro века гидра привлекала внимание исследователей, благодаря своей уникальной способности к регенерации (Trembley, 1744). Она способна восстанавливать себя из маленького кусочка и даже из полученных путем центрифугирования агрегатов диссоциированных клеток (Gierer et al., 1972; Gierer, 1974; Bosch, 2003). Пролиферация и дифференциация клеток, зависящая от положения в теле полипа спецификация судьбы клеток, морфогенетические движения постоянно происходят во взрослых полипах в ходе того, как клетки делятся в гастральном отделе тела гидры и смещаются в голову и ногу животного, а также в периодически образующиеся почки (Bode et al., 1986). Таким образом, процессы, типичные для эмбрионального развития более эволюционно продвинутых многоклеточных животных, могут изучаться на почкующейся и регенерирующей гидре. Все это, вкупе с простотой организации полипа, особенно с

наличием у него единственной оси тела, и эволюционным положением гидры в типе Сшс1апа - древней сестринской группе (Рис. 1.1) для всех билатеральносимметричных многоклеточных животных - обусловило выбор гидры в качестве модельного организма эволюционной биологии развития. Интерес к этому организму так велик, что в последние годы ведется крупномасштабный ЕБТ-проект, а сейчас также запускается геномный проект по пресноводной гидре.

Bilatería

также в соответствии с таксономической базой данных ITIS (http://www.itis.usda.gov/)

С точки зрения эволюции каскадов развития, гидра предоставляет информацию о том, какой базовый набор регуляторных генов необходим для того, чтобы многоклеточное животное было многоклеточным животным. По мере того, как у книдарий обнаруживаются гены консервативных транскрипционных факторов, выясняются их предполагаемые анцестральные функции. Зачастую функция этих генов у Bilatería сильно отличается от функции у Hydra. Например, у гидры имеется два гомолога гена brachyury (Technau and Bode, 1999), который у всех трехслойных животных является специфичным для мезодермы. А у гидры нет мезодермы. У гидры и других книдарий были обнаружены гомологи нескольких Нох- и РагаНох-генов, например гомологи labial, Abdominal-B, Gsx и caudal (Gauchat et al., 2000; Ferrier and Holland, 2001). У билатеральносимметричных животных эти гены управляют спецификацией клеток в зависимости от их позиции относительно передне-задней оси, а у книдарий нет явной передне-задней оси, поскольку апикально-базальная ось не может быть однозначно названа ее гомологом.

1.2.1. Филогенетическое положение, анатомия и гистология гидры

Гидра принадлежит к типу Cnidaria, включающему в себя радиальиосимметричных двуслойных животных, возраст древних окаменелых остатков которых датирован более чем 500 миллионами лет (Xiao et al., 2000). Книдарии были названы так благодаря наличию в стенке тела у них стрекательных клеток, называемых книдоцитами или нематоцитами. Класс Hydrozoa включает в себя семь отрядов, и представлен, в подавляющем большинстве, морскими колониальными животными, для которых характерно закономерное чередование бесполого, представленного полипом, и полового, представленного медузой, поколений. Гидра, в отличие от морских родственников, полностью лишена медузоидного поколения. Просто устроенные гонады формируются прямо на стенках тела мужских и женских полипов. В благоприятных условиях гидра размножается почкованием, но осенью или в неблагоприятных условиях она переключается на половой процесс, который будет описан ниже. Анатомия полипа проста. Он представляет собой двуслойную трубку, у которой на апикальном конце, называемом головой, находится окруженный венчиком

Рис. 1.2 Анатомия Hydra и схема стенки ее тела (по Ruppert and Barnes, 1994)

щупальцев гипостом со ртом, а на базальном конце, именуемом ногой, - стебелек и подошва (Рис. 1.2). Почка закладывается на границе нижних двух третей тела.

Книдоциль

Стрекательная капсула

Рецепторная ресничка

Эпителиально-мышечная

«летка

Интерстициальная клетка Чувствительная клетка

Эктодерма -

Мезоглея

Энтодерма

Нейрон

Продольные миофибриллы Вазальная мембрана (2) Кольцевые миофибриллы Ядро

Железистая клетка Гранулярный материал

Ресничка

Эпителиально-мышечная кпетк_

Пищеварительная вакуоль

Стенка тела состоит из двух слоев - эктодермы и энтодермы. Существуют три стабильных клеточных линии: эпителиально-мышечные клетки эктодермы, эпителиально-мышечные клетки энтодермы и система стволовых интерстициальных клеток (David and Campbell, 1972; Campbell and David, 1974). Эпителиально-мышечные клетки являются основным клеточным типом, отвечающим за поддержание формы тела животного и за формирование паттерна в нормальной и экспериментальных ситуациях. Обычно эти клетки именуются просто эпителиальными.

Соматические Половые

Рис. 1.3 Пути дифференциации стволовых интерстициальных клеток

Интерстициальные стволовые клетки (I-клетки) располагаются в пространствах между базальными частями эктодермальных эпителиально-мышечных клеток. Как показано на Рис. 1.3, интерстициальные клетки могут пролиферировать (примерно 60%) и дифференцироваться (примерно 40%) в соматические производные, такие как нервные клетки, железистые клетки и стрекательные клетки, а также в гаметы (Bosch and David, 1987; Bosch et al., 1991).

1.2.2. Гаметогенез у Hydra

Считается, что, в отличие от многих других групп животных, книдарии не имеют стабильной линии клеток зародышевого пути (см. обзор Extavour and Akam, 2003). И сперматогонии, и оогонии образуются из субпопуляции стволовых интерстициальных клеток, которая становится детерминирована дать начало половым клеткам. В то же время, интерстициальные клетки и бесполых полипов, и полипов, претерпевающих гаметогенез, постоянно экспрессируют маркерные гены клеток зародышевого пути, такие как гомологи vasa, названные Cnvasl и Cnvas2 (Mochizuki et

А

т

Рис. 1.4 Анатомия и гистология семенника гидры А) Мужской полип. В) Поперечный срез полипа через семенник Ect - эктодерма, End — эндодерма, М -мезоглея. С) гистология семенника D) схема среза, показанного на (С). Sg - сперматогонии, Sc -сперматоциты, Sd - сперматиды, Sz - сперматозоиды, сперматозоиды Ер - эпителиально-мышечная клетка. Видно характерное расположение клеток на разных стадия сперматогенеза и изменения в размере их ядер. (Из Kuznetsov