Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные колонии

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные колонии"

На правах рукописи

ЧЕТВЕРИМА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОЛОНИИ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2007

Работа выполнена а лаборатории биохимии вирусных РНК Института Белка! РАН

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОПТЮНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор, академик РАИ

Гвозде» Владимир Алексеевич

доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН

Кочетков Сергеи Николаевич

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН

Лукьянов Сергей Анатольевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Йнститут химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Защита состоится 24 мая 2007 года о 10 часов на заседании диссертационного совета Д.501.001.76 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им.А.Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологически к наук

НО. Калинина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Принцип метода молекулярных колоний (ММК) заключается в том, что нуклеиновые кислоты экспоненциально размножают при помощи полимераз не в жидкой среде, как обычно, а в иммобилизованной среде, например, в геле. В результате иммобилизации среды потомство каждой исходной молекулы не распространяется по всему реакционному объему, а концентрируется в ограниченной зоне вокруг родительской молекулы, то есть образует колонию Таким образом, отдельную молекулу можно размножить до детектируемого числа идентичных молекул, что дает возможность обнаруживать, идентифицировать и подсчитывать единичные молекулы Удобнее анализировать молекулярные колонии, расположенные в виде двумерного рисунка, для чего размножение осуществляют в тонком слое геля Впервые мы опубликовали метод молекулярных колоний в 1991 году, применив его для обнаружения в воздухе единичных молекул реплицирующихся матриц, выращивая колонии РНК в агарозе, содержащей Qß-репликазу (РНК-зависимую РНК-полимеразу фага Qß) и рибонуклеозидтрифосфаты [2] Тогда же мы предложили использовать аналогичный подход для выращивания колоний ДНК, а также использовать молекулярные колонии для таких направлений, как изучение реакций между одиночными молекулами РНК, точная молекулярная диагностика, клонирование и экспрессия генов in vitro. Все это содержится в патентах на метод молекулярных колоний, полученных нами в России и США [20-25] Реализация сформулированных идей позволила бы дать мощный инструмент для молекулярной биологии и биотехнологии Именно этому посвящена данная работа, что и определяет ее актуальность После серии наших публикаций, продемонстрировавших уникальные возможности метода молекулярных колоний [4, 5], его потенциал был осознан на Западе, где он стал известен под названием «метод полоний» (то есть «полимеразных колоний»'), данным ему Чёрчем и сотрудниками (Гарвардский университет, США) [Mitra R D , Church G М 1999 In situ localized amplification and contact replication of many individual DNA molecules Nucleic Acids Res 27, e34 ] С тех пор метод молекулярных колоний с успехом применяется в ряде зарубежных лабораторий для решения разнообразных фундаментальных и прикладных задач

Данная работа выполнена в рамках тем «Разработка бесклеточной системы репликации РНК» (государственный регистрационный номер 01.8 70 03 1902), «Конструирование и исследование РНК-векторов» (01.960 005897) и «Развитие метода молекулярных колоний. Исследование механизма рекомбинации РНК, молекулярная диагностика и клонирование генов in vitro» (0120 0 404412)

Целью работы явилось развитие метода молекулярных колоний и изучение его возможностей для обнаружения, клонирования и анализа молекул нуклеиновых кислот В качестве основных направлений работы были выбраны исследование явления рекомбинации РНК

in vitro (как демонстрация научного потенциала метода), разработка методов молекулярной диагностики (как демонстрация практического применения метода), а также синтез и экспрессия генов в молекулярных колониях (что может иметь как научное, так и практическое значение)

Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие задачи исследования

1 Создание чистой бесклеточной системы для изучения рекомбинации РНК. 2. Изучение механизма образования рекомбинантных РНК, в частности, выяснение возможности рекомбинации РНК без участия ДНК-интермедиатов. 3 Разработка способа выращивания колоний ДНК посредством осуществления полимераз-

ной цепной реакции в геле. 4. Разработка методов детекции молекулярных колоний с использованием флуоресцентных зондов

5 Разработка способов диагностики инфекционных и онкологических заболеваний.

6 Разработка метода клонирования генетического материала in vitro, включающего выращивание колоний ДНК, их экспрессию (транскрипцию и трансляцию) и скрининг т situ

Научная новизна и практическая значимость. В работе показано, что, по сравнению с размножением нуклеиновых кислот в жидкости, метод молекулярных колоний обладает рядом преимуществ' позволяет прямо подсчитывать число исходных молекул и прямо клонировать молекулы, без использования традиционных методов генной инженерии Метод исключает взаимную конкуренцию разных молекул (поскольку их синтез пространственно разделен), что позволяет преодолеть помехи со стороны неспецифического (фонового) синтеза нуклеиновых кислот и размножать сложные смеси матриц без риска потерять редкие и неэффективно размножаемые виды На примере исследования рекомбинаций - очень редких реакций между молекулами РНК, а также на примере детекции вирусных нуклеиновых кислот и РНК-маркеров онкологических заболеваний в образцах крови и костного мозга продемонстрирована уникальная способность метода обнаруживать одиночные молекулы РНК или ДНК определенного вида среди огромной массы посторонних нуклеиновых кислот

Полученные результаты существенно расширили представления о рекомбинации РНК Доказано существование рекомбинации на уровне РНК, обнаружено многообразие механизмов рекомбинации РНК, осуществляемой разными РНК-зависимыми РНК-полимеразами, открыто явление спонтанной рекомбинации РНК

Создана ПЦР-версия метода молекулярных колоний, использующая полимеразную цепную реакцию для выращивания колоний ДНК В отличие от QP-репликазной версии, позволяющей выращивать колонии РНК только определенного вида, данный метод позволяет размножать в виде молекулярных колоний любую нуклеотидную последовательность На

основе ПЦР-версии метода молекулярных колоний созданы способы диагностики инфекционных и онкологических заболеваний, для чего разработана полная диагностическая процедура, включающая в себя новый способ консервации биологического материала и новый универсальный метод выделения нуклеиновых кислот из клинических образцов Разработаны способы обнаружения колоний с помощью флуоресцентных зондов, в том числе, способы обнаружения растущих колоний в реальном времени с использованием гомогенных флуоресцентных систем детекции

Разработан метод клонирования генетического материала т vitro, включающий получение колоний ДНК, а также их экспрессию (транскрипцию и трансляцию) Продемонстрирована возможность скрининга клонов tn situ по функции кодируемого белка

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на открытом семинаре Лаборатории механизмов биосинтеза белка Института белка РАН (2006), на ежегодных конференциях Института белка РАН (Пущино, 1995-2006), на международных конференциях. Энгельгардтовские конференции по молекулярной биологии (2000, 2004, 2006), конференции "Frontiers in Bioprocessing И" (Colorado, USA, 1991), "First German-Russian Summerschool on in vitro Systems" (Берлин, Германия, 1994), конференции Медицинского института Говарда Хьюза (Прага, Чехия, 1996, Варшава, Польша, 1997; Будапешт, Венгрия, 1998, Чеви Чейз, Мэрилэнд, США, 2000, Ванкувер, Канада, 2001; Паям Коув, Австралия, 2002, Мерида, Мексика, 2005), конференции RNA society (Висконсин, США, 1996, Эдинбург, Великобритания, 1999), US - Russian Workshop "Ecology of Infectious Diseases" (Новосибирск, Россия, 2002), II Московский международный конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2003), конференция "Basic Science for Biotechnology and Medicine" (Новосибирск, Россия, 2006), конференция «Генетика в России и мире» (Москва, Россия 2006), - а также на конференциях и школах молодых ученых (Рига, Латвия, 2000, Ижевск, Россия, 2004, Москва, Россия, 2004, 2005, Пущино, Россия, 2005, 2006)

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российской академии наук (программа «Молекулярная и клеточная биология»), Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 93-04-6550, 96-04-48329, 96-04-48331, 99-0448672, 02-04-48320, 05-04-48897), Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы (госконтракты 43.035 1 1 1527/ИБ и 02.434 11 3024), Медицинского института Говарда Хьюза (гранты 75195-544701 и INTNL55000302), Европейского агентства ИНТАС (гранты 95-1365, 97-1034, 01-2012), Международного научного фонда (гранты МТОООО и МТО 300)

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований Основные результаты работы получены лично автором или под его непосредственным руководством Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях

Публикации. Результаты исследования опубликованы в 58 работах, в том числе в 18 статьях, 6 патентах (3 патента РФ и 3 патента США), 5 заявках на патент (3 заявки на патент РФ и 2 международные заявки) и 29 сообщениях (тезисы конференций)

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, где формулируются цели и задачи исследования, шести глав, выводов, приложения (с описанием материалов и методов) и списка цитируемой литературы из 476 наименований Работа изложена на 328 страницах и включает 98 рисунков и 9 таблиц

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА I. ПРИНЦИП МЕТОДА МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЙ (ММК)

Глава посвящена анализу литературных данных. В ней излагается история изобретения ММК, описываются первые варианты и характеристики метода, рассматриваются различные системы амплификации нуклеиновых кислот, пригодные для использования в методе молекулярных колоний, а также рассказывается о первом применении метода Так, с помощью ММК было продемонстрировано, что так называемый «спонтанный» синтез РНК, осуществляемый (2р-репликазой, вызывается молекулами реплицирующихся матриц, попадающих в реакционную смесь из воздуха

ГЛАВА II. ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЙ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАЦИИ РНК

Следующим приложением ММК стало изучение рекомбинаций РНК - крайне редких событий, приводящих к возникновению новых молекул, состоящих из фрагментов родительских РНК

После того, как была открыта генетическая рекомбинация на уровне ДНК, стали появляться указания на то, что аналогичный процесс может происходить и на уровне РНК Впервые об этом было заявлено в начале 1960-х Г Херстом и Н Лединко, которые изучали обмен генетическими маркерами между родственными штаммами РНК-содержащего вируса полиомиелита В 1980 г в лаборатории В И Агола было показано, что рекомбинация у полио-вируса приводит к образованию химерного полипротеина, то есть действительно связана с перестройкой первичной структуры геномной РНК вируса, а в 1982 г. в лаборатории А Кинга образование рекомбинантной вирусной РНК было установлено прямым секвенированием Считалось, что рекомбинация РНК - прерогатива вирусов высших организмов, животных и

растений, - пока в нашей лаборатории не были выделены из бактериальных лизатов два вида

4

g, 3 -фрагмент -у?—,оследоватепьности

рекомбинация JT,

З'-фрагмент

=13'

реплицирующаяся РНК

Чужеродная вставка

5"-фрагмеНТ Pstl Salí Xbal BamHI 5' . . . UCCCUli

3'

CUGCAGgUCGAcUCUAGAGGAUC

Pstl Xhol Xbal BamHI

ggcgCUGCAGcUCGAgUCUAGAGGAUC

gUAC. ■ .3'" З'-фрагмент

Рис. 1 Стратегия исследования рекомбинации РНК в бесклеточной системе.

(А) Схема рекомбинации между нереплицируемыми фрагментами К<3135(~) РЖ. Результатом рекомбинации является образование РНК, реплицируе-мой С?Р-репликазой (Б) Последовательность чужеродных довесков (белые буквы на черном фоне) 51- и З'-фрагментов Я(2135(-) РНК Довески представляют собой поли-линкерные последовательности и отличаются несколькими нуклеотида-ми (строчные буквы), служащими маркерами фрагментов

реплицируемых QP-репликазой рекомбинантных РНК - RQ120 и RQ135 [1, 3] Обозначение RQ происходит от «Replicable by QP replicase», а число отражает длину нуклеотидной последовательности РНК

Однако, поскольку все исследованные рекомбинантные РНК возникли в живых клетках или в грубых клеточных лизатах, ни в одном случае не была исключена возможность обратной транскрипции и, следовательно, всегда существовала вероятность, что рекомбинация происходит не между молекулами РНК, но между их ДНК-копиями, а рекомбинантные РНК возникают в результате транскрипции рекомбинантных кДНК.

Рекомбинация в присутствии QP-репликазы

Бесклеточная система для изучения рекомбинации РНК

ММК позволил исследовать реакции между молекулами РНК в чистой системе, где отсутствуют ДНК, dNTP (2'-дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфаты), обратные транскриптазы, ДНК-зависимые РНК-полимеразы и ферменты, ответственные за рекомбинацию ДНК, и, следовательно, исключена возможность образования рекомбинантных РНК через ДНК-интермедиаты В качестве субстратов рекомбинации мы использовали взаимодополняющие 5'- и З'-фрагменты минус-цепи реплицирующейся RQ135 РНК [RQ135(-) РНК], снабженные чужеродными довесками (рис 1) Поскольку господствовало убеждение, что рекомбинант-ная РНК всегда образуется в результате смены матриц, чужеродные довески были сделаны

гомологичными для облегчения такого события Сами по себе такие фрагменты не способны к репликации, но образование между ними коваленг-ной связи с восстановлением правильной взаимной ориентации должно приводить к формированию РЖ, способной размножаться Qp-репликазой Тем самым обеспечивалась позитивная селекция рекомбинантных молекул

Рекомбинантные молекулы детектировали, используя вариант ММК, разработанный нами ранее [4] смесь фрагментов высевали на слой агарозы, содержащий QP-репликазу, который затем накрывали нейлоновой мембраной, смоченной раствором rNTP (рибонуклеозид-5-трифосфаты), инкубировали при 22°С в течение 60 мин и затем мембрану гибридизовали с 32Р-меченным зондом (рис 2) В качестве зондов использовали целый 5'-фрагмент RQ135(-) РНК или дезоксиолигонуклеотид, гомологичный его чужеродному довеску Каждый из этих зондов способен гибридизоваться с (+)-цепью ожидаемого продукта рекомбинации, которая при экспоненциальном размножении синтезируется наряду с (-)-цепью О возникновении рекомбинантов судили по образованию гибридизующихся с зондом колоний РНК, число которых отражало частоту рекомбинаций

Демонстрация рекомбинации РНК in vitro

Фрагменты смешивали, инкубировали, и рекомбинантные молекулы детектировали с помощью ММК Оказалось, что колонии РНК действительно образуются, причем тогда и только тогда, когда на агарозу высевали смесь 5'- и З'-фрагментов, но не каждый из них в отдельности (рис 3) Это стало первым доказательством того, что прямая рекомбинация между молекулами РНК возможна Оказалось также, что частота рекомбинации резко возрастает, если перед посевом фрагменты не просто проинкубировать, а отжечь, при этом фрагменты ассоциируют - вероятно, за счет Уотсон-Криковских взаимодействий между соответствующими участками RQ135 РНК [5]

Экстрагированные из колоний рекомбинантные РНК клонировали в виде кДНК в составе плазмидного вектора и секвенировали (рис 4А) Все рекомбинанты содержали целый

5'-фрагмент, а также целый или укороченный с 5'-конца З'-фрагмент Вопреки ожиданиям,

6

Смешивание РНК-фрагментов

5'-фрагмент ]1 З'-фрагмент Инкубация

QB-репликазой Выращивание колоний РНК

Ч.

Гибридизация мембраны с меченым зондом

посеян посеяны

один из фрагментов оба фрагмента

Рис 2. Схема экспериментов по рекомбинации РНК в бесклеточной системе.

Рис. 3. Рекомбинация между удлиненными фрагментами RQ13fi(-) РНК. Колонии РНК, выросшие в результате посева смеси, содержащей указанное число Молекул 5'- и 3'-фрагментов, на агарозу с Qp-рспликазой. Смесь фрагментов перед посевом инкубировали в течение 45 мин в буфере, не содержащем М& , Число реплицируем ых ре-комбипаптпых молекул уценивали как число колоний PI Si, ги бридту кмцихся с радиоактивно меченным 5'-фрагментом.

оказалось, что во всех случаях перекрест субстратов рекомбинации произошел по не гомологичным участкам. Такие рекомбинйнты и такую рс комби нацию называют мсгомолоивпыми.

На тог период существовала единстве иная гипотеза рекомбинации РНК - гипотеза смсны матриц, в соответствии с которой на исходной матрице (в нашем случае - на З1-фрагменте) синтезируется ее комплементарная копий (или ее часть), которая затем служит праймером для копирования второй матрицы (5'-фрагмента), Существование такого механизма ранее было доказано для РНК-зависимых Д1 ПС-пол имераз ретро виру с о в. Действительно, в результате инкубации смеси тех же РНК-фрагментов и присутствии обратной транс-криптазы вируса миелобластоза птиц (AMV) и се субстратов (dNTP), образуется гомологичный рехомбинэнт (рис. 4Б). Следовательно, фрагменты, и спольздва; ты с в нашик жепер»-Йентах, могут служить субстратами для гомологичной рекомбинации, однако Qlí-репликзза эту возможность не использует, Более того, столь же эффективную рекомбинацию в присутствии Qp-репликазы мы наблюдали, если довески 5'- и З'-фрагментов были не гомологичны^ ми, н при этом все рекомбииамты имели такую же структуру, что и рекомбинанты, произошедшие из фрагментов с гомологичными довесками, то есть содержали 5'-фрагмент целиком и часть З'-фрагмента (рис. 9А).

Условия, при которых наблюдается рекомбинация (р! I, температура, концентрации солей и Mg!+), полностью соответствуют внутриклеточным. Как и следует ожидать от бимолекулярной реакции, выход рекомбииаи гон пропорционален произведению концентраций 5'- и З'-фрагментов. Экстраполяция к внутриклеточной концентрации РНК позволяет предположить, что в клетке аналогичный процесс должен происходить с частотой 10"4 - 10" ' на иук-леотнд за инфекционный цикл. Это согласуется с наблюдаемой частотой нсгомоло-ичпон рекомбинации РНК у РНК--содержащих бактериофагов in vivo и является косвенным свидетельством того, что и в клетках рекомбинапгпые молекулы образуются путем реакций между молекулами РНК, без привлечения Д1 lK-иитермодиатон [19].

7

5 -фрагмент 3 -фрагмент 2x1010 2x1010

S'-фрагмент + З'-фрагмент 3x10' 9x103 2.7х109 В.1х109

* ч* ^ ..Ж

ggcgCUGCAGcUCGAg

A1___UCUAGAGGAUCcUACGAGGGA. . .

,. .иссси1В1^НШШН!Н!ЕИЕадН!Н1ШШД!НгиАсаАбсаА.,. (5)

. . . UCCCUUCUGCAGgUCGAcUCUAGAGGAUC

ggcgCUGCAGcUCGAg A2 UCUAGAGGAUCcUACGAGGGA..,

. . .UCCClUfWm^mTrilHn^iW^ir-T^iiirTtT.T^tr^UACGAGGGA. . . (1)

,..UCCCUUCUGCAGgUCGAcUCUAGAGGAUC

ggcgCUGCAGcUCGAg A3 _UCUAGAGGAUCcUACGAGGGA . . .

...UCCCUUCUGCAGgUCGAcUCUAGAGGAUC

ggcgCUGCAGcUCGA A4 __яUCUAGAGGAUCcUACGAGGGA. . .

.,. цсссисшмшиашшгишдЩ'шшажшдзиАсоАббеА...

.,.UCCCUUCUGCAGgUCGAcUCUAGAGGAUC

A5 _ _ _

... исссшЁмаЕшвшашжыздв

. , .UCCCUUCUGCAGgUCGAcUCUAGAGGAUC

(1)

A5__ggcgCUGCAGcUCGAgUCUAGAGGAUCcUAC . . .

Б

ggcg

СUGCAGсUCGAgUCUAGAGGAUCcUACGAGGGA. . . . . . ТСССТТТи ¿tWH* И rfj ft < Л ti rf: Г А С G AGGG A. . ,

.,.UCCCUUCUGCAG

gUCGAcUCUAGAGGAUC

Рис. 4. Иуклсотшшые последовательности продуктов [»«комбинации фрагментов RQ135(-) 1*11 lv н присутствии QJi-реплнказы (Л) и обратной тра искри лтазы ([>). Последовательности 5'- и З'-фрагментов приведены соответственно ниже и выше последовательности ре комбинашкой РНК. Показана только часть последовательности ре ком б и пакта, остальная часть полностью совпадает с последовательностями фрагментов. Чужеродные довески фрагментов изображены жирными буквами, отличающиеся нуклеотиды до-вс сков изображены строчными буквами. Чужеродные вставки в р с комбинаты изображены белыми буквами па черном фоке. Числа к скобках обозначают число клопои с укачанной последовательностью.

(А) Последовательности рекомбипаптпых I1![К, выросши* на Йгарозе с Qp-репликазой после инкубации смеси, содержащей ПО Ю'1' молекул 5'- И ^¿фрагментов, в течение 40 мин в отсутствие Mg2'.

(Б) Последовательности клонов, полученных при проведении обратной транскрипции с такой же смесыо фрагментов.

Роль 3'-конца 5'-фрагмента 0рекомбинации РНК

Учитывая, что З'-фрэгмепт входит в ре комбинат целиком, мы предположили, что ре комбинат ы образуются в результате реакции траксэстерификании: свободный I идрокеил 3' конца З'-фрагмепта атакует внутренний фосфагг 3'-фрагмента.

НСгЛ о

р

р

р

он он

Рис. 5. Модификации З'-конца РНК-субстратов рекомбинации.

Дальнейшие исследования показали, что наблюдаемая рекомбинация действительно требует наличия свободных гидроксильных групп на З'-конце 5'-фрагмента: она полностью подавлялась, если 5'-фрагмент окислен перйодатом, что приводит к окислению 2',3'-цис-гликольной группировки на З'-конце РНК с разрывом рибозного кольца и образованием ди-апьдегида (рис. 5), или если его концевой З'-гидроксил блокирован фосфатной группой (6А, верхний ряд) [5]. Удаление этой фосфатной группы с помощью фосфатазы (рис. 5) восстанавливает рекомбинацию до исходного уровня (рис. 6, А и Б). Аналогичная модификация З'-конца З'-фрагмента не оказывает существенного влияния на эффективность рекомбинации (рис. 6А, нижний ряд). Некоторое уменьшение колоний в варианте « . .N011», где для рекомбинации использовали З'-фрагмент, укороченный на один нуклеотид, объясняется тем, что укороченный на один нуклеотид рекомбинант хуже размножается (Зр-рспликазой (рис. 6В).

Разделение стадий рекомбинации и размножения рекомбинантов

Используя окисление 5'-фрагмента для подавления рекомбинации в присутствии (ЗР-репликазы, удалось отделить собственно рекомбинацию (образование рекомбинантов) от размножения продуктов рекомбинации в виде молекулярных колоний. С этой целью смесь фрагментов РНК сначала инкубировали в выбранных условиях, а перед посевом на агарозу окисляли перйодатом и расплавляли, предварительно убрав все свободные ионы К^2' посредством добавления ЭДТА. Благодаря разрушению нековалентных комплексов между фрагментами, расплавление помогало понизить уровень остаточной рекомбинации, обусловленной неполным окислением РНК. Такая обработка практически полностью предотвращала дальнейшую рекомбинацию (рис. 7Б, 7В) и в то же время не мешала росту колоний, если в образце присутствовал готовый рекомбинант (рис. 7Г и 7Д). Таким образом, если перед посевом мы проводили окисление и расплавление, колонии РНК могли возникнуть лишь при условии, что рекомбинация произошла до стадии окисления (рис. 7А).

Такой подход, то есть запрещение рекомбинации во время роста колоний, дает возможность выяснить, может ли рекомбинация происходить в отсутствие С?Р-репликазы, а также позволяет исследовать роль других ферментов в рекомбинации РНК.

...NpNohl ...NpNMI ...NP ...N0H

модифицирован 5'-фрагмент

модифицирован 3'-фрагмент

ф

* ф т > i Л

-CIP +CIP

0.5 niM Mg!t 10 mM Mgi+

a

в

Y * X

$ ^ -A

ли*

■Ib

Рис. 6. Зависимость эффективности рбк/шбинации от модификации З'-конца субстратов рекомбинации.

(А) Колонии РНК, выросшие после инкубации смеси, содержащей по 6■>' 10'' молекул каждого 5'- и 3'-фрагментов, один из которых 6i.ni немодифицирован, а другой либо нсмоди-фициронан (NpNoh)í либо окислен перйодатом мафия (NpNox¡). либо после окисления обработан анилином (Np), либо дефосфорилиронан с помощью щелочной фосфатазы после окисления и обработки анилином (N^h). Смссь перед посевом инкубировали в течение I ч при 20С'С н отсутствие Mg 1.

(Ь) Колонии РНК, выросшие после инкубации см се и, содержащей но 6Х10® молекул нс-модифинирова иного 3'-фрагмента и 5'-фрагмента, несущего фосфат на З'-Квнце, в течение I ч при 37°С в присутствии указанной концентрации Mg'' и в отсутствие или в присутствии 0.01 сд. щелочной фосфатазы (С1Р). Перед посевом ао все образцы добавляли EDTA и количестве, необходимом для компенсации свободного Mg2', и все образцы прогревали при 96"С а течение 2 мим для инактивации фосфатазы. Мембраны гибридизовали с '3Р-меченным олш опуклеотидом, гаиОлОгичным чужеродному довсску.

(IÍ) Электрофорез в недснатурирующсм полиакриламидном геле продуктов синтеза QJÍ-рспликазой в течение 10 мин при использовании в качестве матрицы 2 иг рекомбинантпой РНК (тип А5, рис. 4), которая была либо нсмодифицирована (N¡.N0h), либо окислена периодатом натрия (NpNox,), либо после окисления обработана анилином (N¡>), либо дсфос-форилиронана после окисления и обработки анилином (Non). После электрофореза гель окрашен серебром.

Резюме

!. ¡Та основе метода молекулярных колоний впервые создана чистая бесклеточная система рекомбинации РНК.

2. Показано, что рекомбипантные РНК образуются в отсутствие ДНК и каких-либо ферментов, кроме (^-рспликазы. Этот факт окончательно доказывает возможность рекомбинации на уровне РНК.

Рис. 7. П редотвра щей не рекомбинации ь ароиееес роста колоний РНК,

(A) Колонии РНК, выросши^ после отжига смеси, содержащей но 101' молекул 5'- и 3'-фрагмептов КОШ(-) РНК

(Б) Отожженная смесь фрагментов расплавлено.

(B) Отожженная смесь фрагментов расплавлена и окислена перйодатом натрия.

(Г) Кинетика роста колоний при посеве 104 молекул рекомбинантной РНК типа А1 (рис. 4), которая была добавлена к смеси отожженных фрагментов перед расплавлением и окислением

(Д) Колонии РНК, выросшие в течение 60 мин при посеве 10"1 молекул рекомбинантной РНК типа А1, не подвергавшейся каким-либо обработкам.

3. Обнаружено, что

1) для рекомбинации фрагментов РНК п присутствии рр-репликазы необходим свободный З'-гидроксил на 5'-фрагменте,

2) выход рекомййнантов стимулируется предынкубацией или отжигом смеси фрагментов, то есть лимитирующей стадией реакции «шляется ассоциация фрагментов РНК,

3) последовательность 5'-фрагмента входит в рекомбинант целиком,

4) все образующиеся ре комбинаты негомологичны,

5) рекомбинация происходит с частотой =10~5 па I нуклеотид в час.

4 Найден способ, позволяющий разделить стадии образования рекомбинанТа и его размножения.

Спонтанная рекомбинация РНК

Оказалось, что фрагменты РНК могут ре комби пировать и и отсутствие рр-рспликачы и гМТР, образуя реплицирующиеся молекулы (рис 8). Единственным, но обязательным условием является наличие двухвалентных катионов - М§2+. Однако частота такой «спонтанной» рекомбинации на несколько порядков меньше, чем в присутствии репликазы. Отличается и Механизм спонтанной рекомбинации: она не требует наличия свободных гидроксильных групп, так как одинаково эффективна при любой модификации З'-копца 5'-фрагмента (рис. 8). Появление рекомбипаптов при использовании 5'-фрагмента, лишенного свободного 3'-пщроксила, нельзя объяснить тем, что долгая инкубации в (16-64 часа при 37°С) приводит к снятию модификации или к образованию каких-либо реактивных групп, которые могут затем сшиваться решшказой. Так, если смесь фрагментов, содержащую окисленный З'-

фрагмент, после длительной инкубации в Ме:' дополнительно окислить перйодатом натрии,

II

А Б В

ш

г

30 мин 45 мин 60 мин

А

Б

+ Mg2-

- Mg2+

Рис; Я. Спонтанные реакции молекул РНК. Колонии РНК, выросшие после отасйга и инкубации смеси, содержащей по Ю10 молекул ^модифицированного 5'-фрагмента RQ135(-) РНК и 5'-фрагмента, снабженного довеском, гомологичным (А) или негомолошчным (В) довеску 3'-фрагмента. Щ-фрагмент был либо немодифнциро ван (NpNohJ, либо окислен пе-рйодатом натрия (NpNoxi), либо после окисления обработан анилином (Кр). Смесь перед гюссвом инкубировали в течение 64 ч при 37°С в отсутствие или в присутствии 9 мМ Mg2', а перед посевом расплавляли. 15 варианте, где использовали немоднфициронаииый 5'-фрагмсит, смесь перед посевом, помимо расплавления, окисляли перйодатом натрия,

число колоний не уменьшается (рис. ЮЛ). Для рекомбинации нужна именно совместная инкубация фрагментов: колоний нет, если фрагменты инкубировали в Mg2' по отдельности, а смешивали непосредственно перед посевом (рис. 10Б). Это является дополнительным указанием на то, что рекомбинация происходит до контак та фрагментов с репликазой, то есть в отсутствие каких-либо белков.

Секвенированпе РНК, экстрагированных из колоний, показало, что рекомбинация происходит по внутренним участкам фрагментов, с частичной потерей последовательности как 3'-, гак и 5-фрагмента. Отсюда понятно, Почему эффективность спонтанной рекомбинации не зависит от окисления или иной концевой модификации РНК. Для рекомбинации не нужна гомология последовательностей: эффективность рекомбинации фрагментов с гомологичными и негомологичными доиссками одинакова и все ре ко мои панты негомологичны (рис. Ж) Наконец, места рекомбинаций более или менее случайным образом распределены по нуклео-тидной последовательности 5'- и 3'-фрагментов в пределах ± 10*20 нуклеотидйв от мест стыка последовательностей RQI35 РНК и чужеродных довсскон, (По-видимому, отсутствие рекомбинации за пределами этих участков является следствием отбора: QjS-репликаза плохо размножает как рекомбипапты, у которых сильно повреждена исходная структура RQI35 РНК, так и рекомбинапты, несущие слишком длинные вставки.) Отсюда следует, что за наблюдаемую рекомбинацию не отвечают не только белки, но и какие-либо рийозимоподобпые структуры. Иными словами, способность к рекомбинациям является неотъемлемым свойством полирибоиуклеотидов.

•ч f ч— if-

...NpN0

...ЫрМ„

* & V i?' L

•

...NpHr

Модификации 5'-фрагмента

А

Фрагменты с гомологичными довесками

5'-фрагмент

З'-фрагмент

Фрагменты с негомологичными довесками

5'-фрагмент

исссисссииссссиАссоАйсиссмии

ОССОСизСАССиССАаисиАСАСбАиССиАССАССОАиииаАСА

З'-фрагмент

Б

Фрагменты с гомологичными довесками

5'-фрагмент

З'-фрагмент

Фрагменты с негомологичными довесками

5'-фрагмент исССисССиисССбиАССйАССиСйААии

й й С й СI) й С А Э С и С в АС И СУ Ав Ай й Аи С С и А С Э Ай Бв АО И и (3 А С А

З'-фрагмент

Рис, 9, Рекомбинация фрагментов РНК с разными чужеродными довесками.

Показана только часть последовательности фрагментов. Чужеродные довески фрагментов изображены красными (гомологичные участки) или синими (негомология пью участки) Сукнами. Желтые линии соединяют нуклеотиды, оказавшиеся соседними врекомбинантных молекулах. (А) Рекомбинация и присутствии Ор-рсппиказы. (Б) Спонтанная рекомбинация.

L

В

✓ ' i ЛА *

0 16 64 Время инкубации, ч

• *» да

5 22 37 Температура, °С

Риф 10. Свойства спонтанной рекомбинации РНК. Если ис указано иное, смесь, содержащую окисленный 5'-фрагмент и не-модифицированный 3'-фрагмент RQI35(-) РНК отжигали, затем инкубировали в течение 64 ч ири 37"С в присутствии 9 мМ Mg2', расплавляли и высевали и количестве 101' молекул в расчете на каждый фрагмент. (Л) Смесь фрагментов была окислена и расплавлена после инкубации. (Б) Инкубированные но отдельности 5'- и З1-фрагменты были расплавлены и перед посевом смешаны.

(И) Зависимость образования рскомбннан-зов от времени инкубации (при 37"С). (Г) Зависимость образования рекомбинан-тов от температуры инкубации (в течение 64 ч).

Аналогичные эксперименты уже не с фрагментами, а с длинными производными Ир РНК (650 - 930 нуклеотидов), внутрь которых были встроены последовательности различных мРНК, показали, что спонтанная рекомбинация может происходить и виутримолекуляр-но [7]. Такие ку мРНК не способны размножаться ОР-рсиликазои, но в процессе инкубации н присутствии М^"'" происходят рекомбинации «/и ей», приводящие, как показало секвестрование, к делении вставок с образованием реплицирующихся молекул, выявляемых с помощью ММК.

Возможно, ч то Спонтанная рекомбинация происходит но механизму, включающему не-гидролиги чеекпй разрыв сахарофосфатного остова РНК с Образованием концов, несущих 2',3'-циклофосфат и 5-1 идрокеил, с последующим обращением реакции с участием концов разных молекул (кросс-лигнрованнем). Поскольку этот механизм требует наличия 2'-гидроксияов, спонтанная рекомбинация является, по всей видимости, свойством, присущим исключительно РНК, и не должна происходить между молекулами ДНК.

Были установлены следующие свойства спонтанной рекомбинации РНК;

1. Кинетика рекомбинации линейна (рис. !0В). В ряде независимых экспериментов было установлено, что количество ре комбинатов, образовавшихся к 64 часам инкубации, в 4.0 ± 1 .6раз бопыис, чем к К>часам (п = Ю)

2. Спонтанная рекомбинации РНК является реакцией псевдопсрвою порядка, то есть не зависит от концентрации рскомбинирующих фрагментов в исследованном диапазоне концентраций (5 - 500 нМ). ! [ричиной этого является то, что скорость ассоциации фрагментов РНК в условиях реакции существенно выше, чем скорость собственно химического процесса.

3 Скорость реакции увеличивается в =3 раза при повышении температуры на 10°С (рис ЮГ) Такое значение коэффициента Вант-Гоффа характерно для некатализируемых (не-энзиматических) химических реакций.

4 Константа скорости реакции составляет =10~9 ч""1 на 1 фосфодиэфирную связь при 37°С [7]

На первый взгляд, скорость спонтанной рекомбинации чрезвычайно мала Без помощи ММК продукты этой реакции практически невозможно зарегистрировать, особенно на фоне огромного избытка непрорекомбинировавших фрагментов. Тем не менее, спонтанные перестройки молекул РНК могут играть важную роль в эволюции как РНК-, так и ДНК-геномов Даже не будучи промотированной клеточными РНК-связывающими белками, спонтанная рекомбинация должна приводить к появлению новой рекомбинантной РНК в одной эукариоти-ческой клетке каждую минуту Это означает, что, например, в течение жизни в организме человека должно произойти до 10м таких событий Обратная транскрипция и интеграция даже очень небольшой доли образовавшихся рекомбинантных последовательностей привели бы к значительному изменению человеческого генома, поэтому саморекомбинацию РНК следует рассматривать как важный фактор, влияющий на изменчивость генома и вероятность онко-генной трансформации Кроме того, как отмечал А. С Спирин, спонтанная рекомбинация РНК могла играть важную роль в формировании и развитии мира РНК. Добавим также, что способность к саморекомбинации является дополнительным аргументом в пользу первичности РНК по отношению к ДНК

Резюме

1 Открыто явление саморекомбинации РЖ Обнаружено, что в присутствии ионов Mg2+ молекулы РНК способны спонтанно перестраивать свои нуклеотидные последовательности без участия белков.

2. Места рекомбинаций распределены вдоль нуклеотидных последовательностей случайным образом, откуда следует, что способность к рекомбинациям является неотъемлемым свойством полирибонуклеотидов

3 Спонтанные рекомбинации происходят как между молекулами (т trans), так и внутри одной молекулы (т cis) и могут приводить как к увеличению, так и к уменьшению размера молекул РНК

4 Реакции саморекомбинации осуществляются с биологически значимой скоростью (10"9 событий на 1 фосфодиэфирную связь в час) Такие реакции могут играть важную роль в эволюции современных вирусных и клеточных геномов, а также могли служить механизмом возникновения длинных полирибонуклеотидов и генерации их вариантов в мире РНК

Механизмы реплнкативной рекомбинации

Экспериментальный подход, с помощью которого были продемонстрированы спонтанные рекомбинации, был использован и для изучения влияния на рекомбинацию вирусных РНК-завиеиМЫХ РНК-полимерач [12]. В этом случае перед посевом на агарозу инкубационную смесь не только окисляли, но и подвергали фенолы юн экстракции для удаления белков.

Рекомбинация, осуществляемая Qji-репаинтои, является репликшштой

Эксперименты по инкубации смеси 5'- и З'-фрагмснтов с добавлением компонентов ре-плпкациоппой смеси в разных сочетаниях показали, что рекомбинанты образуются только в присутствии полного набора компонентов, который включает в себя Qp-рспликачу, магний и все четыре ркбонуклеози дтрифосфата (АТР, СТР, GTP и UTP). Это позволило предположить, что для рекомбинации необходим синтез PI [К.

Это предположение подтверждается результатом эксперимента с использованием кор-дицепинтрйфосфата (З'-дезокси-АТР), являющегося терминатором синтеза РНК. Даже там, где синтез РНК не был полностью запрещен (рис 1 i слева, З'-дезокси-АТР добавлен одновременно с другими нуклеотидами), рекомбинация существенно подавлена. При использованном соотношении концентраций З'-дезокси-АТР и АТР (20 : 1) герминатор включается Qp-ренликаэОЙ в растущую непочку с вероятностью 20%, то сечь вместо каждой пятой молекулы АТР,

Следовательно, для рекомбинации необходим не просто синтез РНК, а синтез довольно протяженных участков. Таким образом, рекомбинация, осуществляемая Qp-репликазой, является репликативной.

Время инкубации в отсутствие З'-дезокси-АТР, мин

Рис, I !. Подавление З'-аезокси-АТР (кордн ципннтрифосфа-тим) рекомбинации, осуществляемой Ор-рсчмиказои.

Смесь, содержащую по 1:0* молекул 5'- и 3'-фрагментов, отжигали, затем инкубировали в течение I ч при 22°С в присутствии 10 м ¡VI Tri s-Cl, pH 7.8, 100 мМ NaCI, 9 мМ Mg2\ 35 мкг/мл QJÏ-репликазы, 0.2 мМ АТР и I мМ GTP, СТР, UTP. 13 указанное от начала инкубации время добавлен З'-дезокси-АТР до концентрации 4 мМ (вместе с эквимолярпым количеством Mg~+ для компенсации повышенной концентрации нуклеотидов). После инкубации, перед посевом на агарочу, в смесь добавляли 1 сл. щелочной фосфатазы и инкубировали в течение 20 мин, затем экстрагировали фе1 юл/хлороформом, окисляли перйодатом натрия, обессоливали и расплавляли.

Сравнение механизмов рекомбинации, осуществляемой разными РНК-зависимыми РНК-полимеразами

Классическим объектом исследования рекомбинации РНК т то является полиовирус (вирус полиомиелита) Для объяснения гомологичной рекомбинации именно у этого вируса в 1974 г. был впервые постулирован механизм смены матриц вирусной репликазой (РНК-зависимой РНК-полимеразой). С тех пор гипотеза смены матриц стала общепризнанной и применялась для объяснения всех случаев рекомбинации РНК, хотя, в отличие от смены матриц при обратной транскрипции, ни разу не была подтверждена экспериментально Более того, понятия «смена матриц» и «репликативная рекомбинация» использовались как синонимы Составной частью механизма смены матриц является механизм «гибридизации и удлинения праймера» По этому механизму истинными субстратами рекомбинации являются РНК разной полярности, например, 5'-фрагмент и комплементарная копия З'-фрагмента Эти фрагменты гибридизуются комплементарными участками, и далее один из фрагментов или они оба служат праймерами' удлиняются полимеразой, использующей другой фрагмент в качестве матрицы Естественно, при этом получается гомологичный рекомбинант. Частота такой рекомбинации должна зависеть от стабильности гибрида, а, следовательно, от длины комплементарных участков праймера и матрицы.

Поскольку наши исследования показали, что рекомбинация РНК, осуществляемая 00-репликазой, не является гомологичной и не происходит по механизму смены матриц, хотя является репликативной, важно было прямо сравнить в одинаковых условиях влияние <ЗР-репликазы и полиовирусной РНК-полимеразы (белка ЗОро!) на рекомбинацию РНК Обеим РНК-зависимым РНК-полимеразам были предложены одни и те же субстраты рекомбинации и оптимальные реакционные условия (эти условия оказались похожими). Использовали также одну и ту же систему детекции рекомбинантов - (2р-репликазную версию ММК

Для того, чтобы прямо проверить возможность образования рекомбинантов по механизму «гибридизации и удлинения праймера», в качестве субстратов рекомбинации использовали пары фрагментов 11(3135 РНК разной полярности (рис 12), включающие 5'-фрагмент и комплемент З'-фрагмента (З'С) с довесками разной длины Внутри каждой пары довески комплементарны (в соответствующих парах фрагментов одного знака они гомологичны), но так как довески имеют разную длину, то и длины комплементарных участков различаются.

Оказалось, что рекомбинация между фрагментами разной полярности, осуществляемая полиовирусной РНК-полимеразой, очень эффективна и полностью согласуется с механизмом «гибридизации и удлинения праймера»: пары фрагментов с более длинными комплементарными участками рекомбинируют с большей частотой (рис. 13В) и все рекомбинанты гомологичны (рис 14Д)

5'(ВатН1)

ЦИМ^ШСиОСДПВИСВАСиСиАЙАПДАИСпн-»

-е-ноебАсаиссАесисАОАисиссиАйШ^ГЩ 5'(ВагоН!) З'С(ЭрЫ)

ЕЕЗЗШ=и8САеаиС8АСисиАСАССАиСон->

•е-ноССАесиОАОАисиССиАйШЗЗЗ!

5'($а11) 3'С(Рз!1)

ЕПЗИШс ио С АС8 иС6А он->

но ссАосиолеАисиссилоЩШИ 5'(Рз11) 3'С'р51"

тед;|уич!1Сон-» _

ноС С А5С 11С!АО А и СIIС СIIАС^

З'С(РзМ)

АивСиС..

Рис. 12. Пары фрагментов №0135 РНК разной полярности, используемые дл| изучения рекомбинации. Последовательность ГчС)135 РНК изображена частично (белые буквы на черном фоне). Щужеродные; довески обозначены черными буквами (комплементарные участки довесков - на сером фоне). В названия фрагментов включены сайты рестрикции, ограничивающие длину траиекрипта; З'С - комплемент 3 '-фрагмента.

В то же время, рекомбинация между теми же фрагментами, осуществляемая ()[!-репликазой, на 3-4 порядка менее эффективна, нет корреляции между Эффективностью рекомбинации и протяженностью комплементарных участков (рис. 13А) и все рекомбинанты не гомологичны (рис. 14, А-Г). Рекомбинация, осуществляемая (ЗД-репликазой между фрагментами разной полярности, на 2-3 порядка менее эффективна, чем между фрагментами одного знака (рис 1 ЗГ>), Также, для ее подавления недостаточно окисления 3'-конца 5'-фрагмента, а необходимо окисление обоих фрагментов [12].

13 отличие от <ЗР-репликазы, полиовирусная РНК-полимераза пе образует детектируемых количеств рекомбинаптов при реакции между фрагментами одного знака (рие. 131").

Таким образом, установлено, что разные РНК-зависимые РНК-полимеразы используют разные механизмы для осуществления рекомбинации РНК: полиовирусная РНК-полимераза использует механизм «гибридизации и удлинения праймера», в го время как Ор-регшиказа сто отвергает.

На рие. 15 приводятся схемы возможных механизмов рекомбинации РНК, осуществляемой (Зр-реиликшой. Первый механизм требует наличия концевых гидроксилоп как 5'-, гак и З'С-фрагмента и поэтому пс согласуется с наблюдением, что рекомбинация продолжает принеходить, если окислен только одни из фрагментов. Второй и третий механизмы похожи друг па друга: оба механизма предполагают удлинение З'С-фрагмента и частичное его копирование с образованием шпильки. Разница состоит в том, что по второму механизму 3'-гидроксил удлиненного З'С-фрагмента атакует 5'-фосфзт на копии 5'-фрагмента (реакция Трансэстерифйкации), в то время как но третьему механизму З'С-фрагмеиг удлиняется дальше, Используя 5-фрагмент в качестве матрицы. Иными словами, третий механизм предусматривает удлинение праймера, не гибридизовашюго с матрицей.

по 10 молекул фрагментов разной полярности

Й'(ВатН)) 5'(БатН1) 5'{3а1!)* 5'(Р5(1)* »3'С(5рШ) хУС(Р«1) 3'С(Ра(1) 3'С(Р5'1)

В

по 105 молекул фрагментов разной полярности

5'(ВатН1) 5*(ВатН1) 5'(3а11)" 5'|Р5Н)х *3'С(5рЬ1| *3'С(Р5(1} ЗС(РзН) З'С(РзМ)

И А; *

• • ¿Г »V

•д ч

«р *

по 10й молекул фрагментов одинаковой полярности

по 108 молекул фрагментов одинаковой полярности

5'*3'

Рис. 13, СравЕ1Смне эффект» В1гостей рекомбинаций, осуществляемых Ор-рсплнклзои л пол нови русн ой поли ч ера мЩ В названия фрагментов КС3135 РНК включены сайты рестрикции, ограничивающие длину гранскрипта; З'С - комплемент З'-фрагмента. (Л, В) Рекомбинация в присутствии Ор-репликазы. Смссь, Содержащую по 10 молекул фрагментов разной полярности (А) или по 10'' молекул фрагментов одинаковой полярности (Б), отжигали и без инкубации и дополнительных обработок наносили па гель, содержащий Ор-репликазу.

(15,1') Рекомбинация в присутствии полиовируспой полимеразы.

Смесь, содержащую но 1(г молекул фрагментов разной полярности (В) или по 10* молекул фрагментов одинаковой полярности (Г), отжигали, затем инкубировали » течение 30 мин в Оптимальных условиях для ЗО-ро! (при 30°С в присутствии 50 мМ Нерез-КОН, рП 7.0, 100 мМ КаС1, 0.8 мМ 5 мМ дптиотрейтола, 0.1 мМ гЫТР и 30 мкг/мл 30-ро1. После инкубации, перед посевом на гель, содержащий 0 р-реп л и кат у, смесь экстрагировали фенол/хлороформом, окисляли перйодатом натрия, обессоливали и расплавляли.

Второй механизм выглядит предпочтительнее: 1. В механизме трансэстерификации (механизм 2) 5'-фрагмент и его комплементарная копня образуют дуплекс, что защищает межнуклеотидные фосфаты от атаки это объясняет, почему З'-фрагмепт почти всегда входит в рекомбинант целиком (рис 14, А-Г). Напротив, в механизме удлинения праймера (механизм 3) ¿'-фрагмент участвует в одпоце-почечной форме, поэтому непонятно, почему отсутствует внутреннее Праймирование (в этом случае в рскомбипапте оказалась бы только часть 5'-фрагмента без З'^концевого участка).

A 5'(BamHI)oii

и 3 3 AG.G и CG AC U С U AG AU С 1

Комплемент 3'C(Sphl

CCUQC AGaiJCGAC«CIJ AGAGGAUi ¡C UG CAG GU CGACU CUAGAGGAU С -GACCUGCAGGCAUGCCUGCAGGUCGACUCUAGAGGAU'

■cugcagguggagucuagaggaugagaccugcac.....с с и g с ag g uc G acuc и ag agg aui

¡C UG CAG GU С GACU CUAGAGGAU CAGACCUGCA......С CUGCAGSLICCA CUC U AGA GGA U

CUGCAGGUCGACUCUAGAGGAUC-UCCCUGC.......С С U G С AGG UC SACUC U AGAGGAU ci

jCUGCAGGUCGACUCUAGAGGAUC- - ■ UCUGC.......СCUGCAGGUC{5 ACUCUAGAGGAU

■CUGCAGGUCGACUCUAGAGGAUC - - - CC JSC.......СCUGCAGGUCGACUCUAGAGGAU

CUGCAGGUCGACUCUAGAGGAUC- - -CCUG........CC UG CAGG UCG AC UC UAGAGGAU C|

¡CUGCAGGUCGACUCUAGAGGAUC-M............С CU GC AGG UC G AGUC U AG AGG AU-

.CUGCAGGUCGACUCUAGAGGA.........CA......CCUGCAGGUC5AGUCUAGAGGAU

Б S'(BnmHI)

ЕПЕЗЦС UGCAGGUCGACUCUAGAGGAUC

Комплемент 3'C(Sphl}oxi

[ CC U GCAG GUCGACU GUAGAGG AC cUjWtfЛ Д

TCUGCAGGUCG AC UC UAGAG GAUC UCCUGCA----С CU GCAGGUC GACUO U AGAG G AU

CUGCAGGUCGACUCUAGAGGAUC----- - - GAAG...................GGAUC;

¡CUGCAGGUCGACUCUAGAGGAUC...........С CUG СAGG UC GAC UC U AGAG GAUC

.CUGCAGGUCGACUCUAGAGGAUC.............U G С AGG UCGAC UC U AG AG G AUC.

В 5'(BamHI)oxi

1 MiHi Ш [CUGC AGGU CGACUCUAGAGGAUC ]

Комплемент 3'C(Pstl)

GGUCGACUC UAGAGGAU с[ГЩеЩ1

UGCAGGUCGACUCUAGAGGAUC - - - GA С С C UC G G G G U CGAC UC UAGAGGAU СД UGСAGGUCGACUCUAGAGGAUС- -CGAGCCAC- -GGJCGACUCUAGAGGAUCff UG С AG GU GGACU CUAGAGGAU CGAGA U С CC.......С G AC U С U AG AgGAUffi

ugcaggucgacucuagaggaug--caacccga--с gu с gacu с uagacgaucB ugcaggucgacucuagaggauc- - -GAcccGG--ggucgacucиagaggaucS .'JGCAGG'JCGAC^ouaqaciQAUC - -CGACCQG- - -ашсеАСОШлаагдAucft ugcaggucgacucuagaggauc- --gaccgg- --ggucgacucuagaggaucI

UGCAGGUCGACUCUAGAGGAUC---GACCC----GGUCGACUCUAGAGGAUCI

UGCAGGUCGACUCUAGAGGAUC---GACCCC---$GUCGACUCUAGAQGAUCS

Г 5'{BamHI)

■•ilWIr'H)* UGCAGGUCGACUCUAGAGGAUC

Комплемент 3'G(P5tl)wti

[GGUCGACUCUAGAGGAU

CUGCAGGUCGACUCUAGAGGAU CUUCGGGUCGACUCUAGAGGAUС CUGCAGGUCGACUCUAGAGGAUC-UCGGGUCGACUCUAGAGGAUС UG GAGG UCGACUCUAGAGGAU CGUC-GGUCGACUCUAGAGGAUС UGCAGGUCGACUCUAGAGGAUCС — GGUCGACUC UAGAGGAU С

ЩЯI M4>.II.J CUGCAGG UCGACU СУ AGAGGA11 C.imtTJt;* {IS) Ц^ЖК'. С CUG CAG G UCG AC UG IIAGA GG At ¡O.'f.WtfTti (6)

Рис. !4. Гкрг.лчмаи структура рекомбиВйнтов, образовавшихся в присутствии Qp-реп.шказм и полновмруспой полимера ты и; фраЩентов разной полярности. Последовательность RQ135 РНК изображена частично (белые буквы на черном фоне). Чужеродные довески фрагментов обозначены черными буквами на сером фоне, вставки - черными буквами на белом фоне. Подчеркнуты комплементарные участки вставки и неокисленного фрагмента. Числа в скобках обозначают число клонов с указанной последовательностью (Л-Г) Рекомбинация в присутствии Qp-репликазы. (Д) Рекомбинация в присутствии иолиоиируспой полимеразы.

2. Этот Вывод находит подтверждение при рассмотрении последовательности рекомбинан-тов, образованных из фрагментов одной полярности (рис. 4А и 9А): З'-фрагмент и се г да входит в рекомбинант целиком, а ^'-фрагмент укорочен с 5'-ко ¡та на разную глубину

А

комплемент 3'С($рЫ} '

.,д ссийСАааисцАсцсиАаАаадие.,>ж^С0Н_>

Механизм 1 ..............................

А ^ С йАСЬ ЦС СА КСИВАОАЦСцесиАЬ^Гё!?ГД -5 ЭЗДЗрМ)

5' ■ ЩНПИМШС1НЗ САйОиойАСи СиАОАйВАИСа <

_5'(ВашН1)______}

Б'(ВатН1) Д. комплемент З'С (5

г'-ЕЕЕЕс оа САоеисбАС исиАаАбалисйАСсиесАсесАиассиесАааисйАсиси АйАВйАисЗЗЗЗЭ - У

5'(Ва тН!) ''

я1-с иАвалашсисАОсиааАсаисДИ^ШЯ Мр„и„,и , ри^иссиси АйАбисйА.сс з-

механизм г ^ комплемент ;'(ВатН1}

и СССиаСАйЕЦОа<

а с веде ви ссассц вдадисис сиаШЕШ Я 51 з'С[врш)

ог

{' 5'(ВатН1) _

з--сиАоаАаАисисАесивоАсе исЗЕЗЕЕ! Механизм 3 исссуссАдсисок-»-

а с а адсеис сассислсАисиссцав!Ж'-;ч■ -5- з'с(зры)

коч ппе мен г 5" (В а т N!} £1 З'С(ЙрЫ)

Э'. ЕТ7£2Еь\С'ЗиссАасиеАйАисисс идпс ийодсс ис соцасссасс и сслаа л^йАнсиссида11 ИД . 5'

5'|ВатН1] XI компл«м«нг 3'С(8рМ)

5'- ЕВЭЗЭШсив сАСйисодс исиА.слсг.АнекАС с иа с ас а слиосс иа сайс ^вася сиАаАеоАиоКЕЕЗ-з1

б-овсвсивсАвсисвАО. з--фрагмент

, Р иоиАСАбаАисЯ25!$1 -з1

II ^ МММ*

£ сдади сисдв сиоадсаи с ТУ>М1 [д - 5--фрагмент

Рис. 15 Возможные механизмы рекомбинации, осуществляемой Ор-репликазой.

Обозначения - как на рис. 14 Тонкие стрелки указывают направление удлинения фрагмента, толстые черные стрелки указывают направление атаки фосфата 3'-гидроксилом,

(А) Рекомбинация фрагментов разной полярности. (Б) Рекомбинация фрагментов одной полярности

Это опять-таки свидетельствует в пользу механизма транса стер ж|> икании, при котором З'-фрагмент участвует в одноцепочечной форме (рис. 15Г>), и против праймср-завпеимого механизма, при котором З'-фрагмент может образовать дуплекс со своей комплементарной копией.

3. Наконец, такой же вывод следует из сравнения частот рекомбинации в присутствии 0(5-реиликазы между фрагментами одного знака и между фрагментами разных знаков (при допущении, что в обоих случаях работает один и тот же механизм) 11епосрсдствсппыми субстратами рекомбинации при праймср-зависимом механизме являются фрагменты разной полярности, а при механизме трапсэстсрификацип - фрагменты одинаковой поляр-

ности Поэтому для любого типа праймер-зависимого механизма частота рекомбинации между фрагментами разных знаков должна быть выше, чем между фрагментами одного знака, однако в действительности она на несколько порядков ниже (рис 13А), что согласуется с механизмом трансэстерификации

Резюме

С использованием одной и той же чистой бесклеточной системы рекомбинации выявлено, что разные полимеразы осуществляют рекомбинацию РНК по разным механизмам Показано, что

1. Частота рекомбинации между фрагментами разных знаков в присутствии С?р-репликазы на несколько порядков ниже, чем в присутствии полиовирусной РНК-полимеразы

2 Напротив, рекомбинация между фрагментами одного знака происходит с относительно высокой частотой в присутствии (ЗР-репликазы и не обнаруживается в присутствии полиовирусной РНК-полимеразы

3 В то время как полиовирусная РНК-полимераза образует только гомологичные рекомби-нанты, (Зр-репликаза - только негомологичные

4 Полиовирусная РНК-полимераза использует механизм «гибридизации и удлинения прай-мера», а (ЗР-репликаза такой механизм не использует

ГЛАВА III. РАЗВИТИЕ МЕТОДА МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЙ

Попытки использования (2Р-репликазы для диагностики и клонирования мРНК

Обнаружение реплицирующихся РНК в воздухе, которое послужило самым веским аргументом в доказательстве матричной природы «спонтанного» синтеза, осуществляемого <ЗР-репликазой [2], стало, фактически, первым применением ММК для диагностики Эти эксперименты продемонстрировали способность ММК обнаруживать «инфекционные» молекулы и определять их число. Поэтому было предложено использовать (ЗР-репликазную версию ММК для диагностики, а также для клонирования чужеродного генетического материала, например, мРНК, внедряя его внутрь природной реплицирующейся молекулы [20-25] Однако (Зр-репликазная версия ММК, использованная в тех экспериментах, оказалась малопригодной для этих целей из-за жестких структурных требований, которые (ЗР-репликаза предъявляет к своим матрицам, а также из-за способности молекул РНК к рекомбинациям, особенно в присутствии (Зр-репликазы (см выше), что приводит к образованию многочисленных колоний РНК независимо от наличия в образце анализируемой мишени

Размножение ДНК и полна (фила ми дном геле с цел о льзовяйием пол име разной цепной реакции

Более перспективной для диагностики оказалась полимеразная цепная реакция {ПЦР) [20-25]. Мы разработали ПЦР-версию ММ К. с использованием которой можно получать колонии ДНК [20-25, 8,

14 мм

14 мм

0.4 мм

Предметное стекло с лунками Реакционная лунка

Рис. 16. Предметам стекло для Н1П' в геле,

9]. Это дает возможность определять как ДНК-, гак и РНК-мишени; в последнем Случае, РНК должна быть сначала переведена н форму к ДНК с

помощью РНК-зависимых ДНК-пОли мераз (обратных транскрипта?). Так как ПЦР требует периодического нагревания среды до -100°С, реакцию осуществляли не в агарозс, которая при этом плавится, а в термоустойчивой среде - в полиакридам идиом геле. Гель приготавливали в подходящем контейнере, например, в лунке, сделанной в предметном стекле для микроскопии (рис. 16). Были Отработаны условия пришивки тонкого геля к стеклу, подобраны

концентрации полиакриламвда и метиленбие-акриламида, найдены реагенты, препятствующие сорбции мишени и пол и мера:! и на стекле, оптимизированы условия герметизации и температурного цик-лироваиия, разработаны способы детекции колонии

Первоначально гель полимерию вали в присутствии компонентов ПЦР; включая ДНК-пол и мер азу [20-25], н ттот способ был воспроизведен в лаборатории Чёрча (Гарвардский университет. США). Однако оказалось, что лучшие результаты дает другой подход: сначала гель полнмеризугот, затем вымачивают в воде для удаления всех растворимых веществ, авто-клавируют и сушаз', а непосредственно перед экспериментом пропитывают реакционной смесыо, включающей с!МТР, олигонуклеотщщые праймеры, термо-сзабильную ДНК-зависимую ДНК-полимеразу и исследуемый образец (рис. 17). В этом случае полностью сохраняется активность ДН К-по л и меразы и уничтожаются молекулы ДНК, которые могли но-23

Пропитывание высушенного геля реакционной смесью для ПЦР

Проведение ПЦР (35-45 циклов)

Перенос ДНК на нейлоновую мембрану (блоттинг)

4

цив

1ым .

I ■ ■ ■,

ГиЕридизацив мембраны с меченым зондом

Рис. 17. Схема выращивания колоний ДНК-

пасть в гей в процессе его приготовления. При впитываний реакционной среды гель полностью восстанавливает исходный объем и механические свойства. Объем геля, приготовленного в лунке диаметром 14 мм и глубиной Ü.4 мм, составляет 65 мкл (то есть расход реактивов почти такой же, как в стандартной ПЦР объемом 50 мкл).

Для осуществления ПЦР, гель герметизировали и помещали в ДНК-амплификатор с плоским нагревательным элементом (какой используют для ПЦР т situ). Далее проводили примерно такие же температурные циклы, как при стандартной ПЦР в пробирках, несколько (на 10-20 с) увеличивая продолжительность стадии отжига. После ПЦР ДНК переносили па нейлоновую Мембрану при помощи блотинга и г и бр намокали со специфическим меченым ЗОНДОМ (РНК или дело кс иол и го ну клеотидом), комплементарным размножаемой последовательности.

Чувствительность детекции нуклеиновых кислот

Чтобы иметь возможность детектировать молекулы пак Д1 ОС, гак и I'! 11Í, в первых экспериментах мы использовали универсальную реакционную смесь с ДНК-полимеразой Tharmus ¡hermophiíús (Tili Д1 IK-полимсраза) [8]. В присутствии Мп2' эта полнмераза способна в качестве матрицы использовать не только ДНК, но и РНК, синтезируя кДНК. Перед ПЦР гель инкубировали в течение 30 мин при температуре, обеспечивающей обратную транскрипцию. В такой системе чувствительность обнаружения молекул мишени составила 98% (± 21%) для HBV ДНК. 13% (± 3%) для HIV РНК и !5% (± 3%) для Qß РНК (рис. 18). Таким образом, ПЦР-версйя М М К выявляет 100% молекул ДНК, а более низкая чувствительность определения РНК отражает выход стадии обратной транскрипции. В дальнейших экспериментах выход обратной транскрипции мы повысили до 50%, используя обратную

Рис. 18. Чувствительность детекции вирусных нуклеиновых кислот. Колонии ДНК, выросшие в результате проведения ПНР (температурного цитирования) к палиакриламидном геле, содержащем 40 мМ бицип-КОН. pl I ÍS.3: 92 мМ ацетат калия, pH 8 3; 6.4% глицерин, 2.5 мМ MnC'h, по 0.28 мМ dCTP, dü IP, dTTP и 0 56 мМ dATP, по 0.45 мкМ праймеров, 1 мкг/мкл BS А. 5.8 нг/мкл Tth ДНК-полимеразы, ! .2 нг/мкл Tac ДНК-полимеразы и указанное число молекул HBV ДНК или 1IIV-I РНК, или Q]) РНК, Колонии выявляли посредством гибридизации на мембране с радиоактивно меченым РНК-зондом.

HBV ДНК

• V

■v■ t; *

25

.Г"-''

S.1

50 100

HIV-1 РНК

Qß РНК

100

100

-

г

300

ф

1000

- trtráSk

«У&ЧЙК

300

1000

транскриптазу вируса мышиной и крысиной лейкемии (M-MLV), лишенную активности РНКазыН [11]

Применение флуоресцентных зондов для детекции молекулярных колоний

Выросшие в геле колонии ДНК можно обнаружить разными способами Например, по окончании ПЦР гель можно окрасить интеркалирующими красителями, такими как бромистый этидий [2, 4, 20-25] или SYBR Green I [15] Однако при этом окрашиваются как специфические колонии (продукты размножения анализируемой мишени), так и неспецифические, образованные «димерами» праймеров (продуктами удлинения праймеров в результате гибридизации между собой) или продуктами размножения посторонней ДНК, происходящего по причине ошибочной гибридизации праймеров с чужими матрицами.

Специфические колонии можно выявить путем гибридизации с зондом, комплементарным внутренней области размноженной мишени, на мембранном фильтре после переноса путем промокания (блотинга) геля В первых экспериментах для гибридизации с молекулярными колониями мы использовали радиоактивно меченные зонды Недостатками таких зондов являются необходимость использования вредных для здоровья радиоактивных материалов (32Р, 33Р или 35S), которые к тому же имеют короткий период полураспада, и длительность процедуры получения радиоавтографа, часто более суток.

Гибридизация с флуоресцентными зондами на мембране

Чтобы ликвидировать указанные недостатки, мы разработали гибридизацию молекулярных колоний на мембране с флуоресцентными зондами, общая продолжительность которой (от фиксации колоний до получения результата сканирования) занимает менее 1 часа [18, 27]

Процедуру гибридизации отрабатывали на колониях кДНК AML1-ETO, являющейся маркером часто встречающегося лейкоза (см ниже) Результаты демонстрируют, что метод позволяет быстро обнаруживать одиночные молекулы и определять титр ДНК- и РНК-мишеней (рис 19А, 19Б) Судя по тому, что число колоний совпадает, в пределах статистического разброса, с числом молекул ДНК, введенных в гель до начала ПЦР (рис 19А), можно заключить, что выявляются все колонии ДНК Молекулы РНК выявляются с эффективностью около 50% (рис. 19Б), что совпадает с результатом, полученным при использовании вирусных мишеней и радиоактивно меченных зондов [11]. Такую же процедуру гибридизации можно использовать для обнаружения колоний РНК, выращенных с помощью Qß-репликазы (рис 19В)

Рис. 19 (А, Б) также демонстрирует, что мембрану можно гибридизовать со смесью флуоресцентных зондов и получать информацию отдельно о гибридизации каждого из зон-

Рис 19 Обнаружение молекулярных колоний посредством гибридизации на мембране с флуоресцентными зондами.

(А-Б) Колонии получены путем размножения ДНК в полиакриламидном геле при помощи ПЦР В качестве матрицы в полиакриламидный гель вносили 50 молекул плазмиды, несущей фрагмент кДНК АМЫ-ЕТО (А), либо продукт обратной транскрипции 100 молекул РНК АМЫ-ЕТО (Б). Нуклеиновые кислоты переносили с помощью блотинга на мембраны НуЬоп<1 которые гибридизовали со смесью оли-годезоксинуклеотидов Су5-АМЬ и СуЗ-ЕТО и регистрировали флуоресценцию Су5 и СуЗ, соответственно

(В) Колонии получены путем размножения рекомби-нантных РНК в агарозном геле при помощи 0(5-репликазы В качестве матрицы на агарозный гель наносили отожженную смесь, содержащую по 105 молекул 5'- и З'-фрагментов И)135(-) РНК Колонии РНК обнаруживали путем гибридизации с Су5-меченным олигодезоксинуклеотидным зондом

дов при условии, что спектральные характеристики меток различаются достаточно, чтобы обеспечить избирательную регистрацию флуоресценции каждого из них, как это наблюдается для флуорофоров СуЗ и Су5. В данном же случае смесь флуоресцентных зондов использована для обнаружения разных частей химерной молекулы кДНК АМЫ-ЕТО. Су5-меченный зонд специфичен к АМЬ-части, а СуЗ-меченный зонд специфичен к ЕТО-части последовательности АМЫ-ЕТО Гибридизация обоих зондов с одной и той же колонией свидетельствует о том, что данная колония образована химерными молекулами Это дает возможность повысить специфичность диагностики путем отсечения колоний, образованных нехимерными молекулами, содержащимися в нормальных лейкоцитах

Гибридизацию одновременно с несколькими флуоресцентными зондами, различающимися как нукпеотидными последовательностями, так и флуорофорами, можно использовать и в других целях, например, для раздельного определения сразу нескольких мишеней либо для определения вариантов последовательности одной мишени, в частности, для определения так называемого однонуклеотидного полиморфизма (БОТ)

Обнаружение молекулярных колоний в режиме «реального времени»

Мы показали, что растущие колонии ДНК можно наблюдать в реальном времени [15, 28, 29], применяя так называемые «гомогенные» системы детекции, использующие интерка-лирующие красители, гибридизационные зонды или комбинации таковых, которые вводят в реакционную смесь до начала ПЦР и флуоресценция которых возрастает в результате взаимодействия с размноженной ДНК Для наблюдения растущих колоний ПЦР проводили как

Су5 СуЗ

О 30 35 36 37 ЗВ 39 40

Г т.тгч.^^

J L jl X ^L^L1^

О 30 34 38 42

Рис. 20. Обнаружение молекулярных колоний В режиме «реального времени».

Числа обозначают номер цикла ПЦР, после которого осуществляли сканирование. (А) Реакционные лунки для наблюдения растущих колоний ДНК: (а) реакционная лупка с высушенным полиакрнламидпым гелем, (б) набухший гель пол покровным стеклом, (в) набухший гель под покровным стеклом, заклеенным липкой фольгой. (Е-Д) Изображения молекулярных колоний, полученных с помощью асимметричной ПЦР, осуществленной в геле с использованием гомогенных флуоресцентных систем детекции. В качестве матрицы в ПНР использовали 50 молекул (Б) и 20 молекул (В-Д) плазмиды, несущей ген GFP Длина размножаемого ПЦР-продукта - 229 п о. (Б, Г, Д) или 608 п.о, (В).

(Б, В) ПЦР в присутствии гибридизующихся рядом 0.1 мкМ FRET-зоидов (РАМ/Су5), сканирование с использованием синего лазера (488 им) и эмиссионного фильтра 670 им (Г-'АМ - флуорофор карбокспфлуоресксин, Су5 - флуорофор цианин 5), (I1) I]ЦР в присутствии 0.03 мкМ олигонуклеотидпого зонда-« бйкена» (FAM/BI1Q-1), сканирование с использованием синего лазера (488 им) и эмиссионного фильтра 508 им (BHQ-I - гаситель флуоресценции);

(Д) ПЦР в присутствии неспснифического красителя SYBIi Green I (1:10000 разведение исходного раствора) п 0. i мкМ олигонуклеотидпого зонда, несущего акцепторную флуо-реслекую группу Су5, сканирование с ¡использованием синего лазера (4RR им} и эмиссионного фильтра 670 им для рег истрации флуоресценции С'у5 (верхний ряд) или эмиссионного Фильтпа 522 им для регистрации флуоресценции SYBR Green I (нижний ряд).

обычно: в таком же пол иакри лам идиом ¡еле, приготовленном в лупках предметного стекла и накрытом покровным стеклом Однако, чтобы обеспечить регистрацию флуоресценции геля,

покровное стекло заклеивали липкой фольгой с отверстием, вырезанным по размеру лунки (рис 20А) Использование гомогенных систем позволяет обнаруживать молекулярные колонии без открывания геля, переноса колоний на мембрану и осуществления стадии гибридизации по завершении ПЦР.

Одним из примеров подходящих гомогенных систем детекции является пара рядом гибридизующихся зондов, на сближенных концах которых находятся флуорофоры, между которыми возможен резонансный перенос энергии (рис 20Б, 20В) Другой пример - «молекулярный бакен»' олигонуклеотидный зонд, имеющий структуру шпильки и несущий на тесно сближенных концах флуорофор и группу, которая гасит флуоресценцию флуорофора, когда зонд свободен, но перестает гасить, когда зонд вытягивается в результате гибридизации с мишенью (рис. 20Г) Колонии также можно выявить, используя комбинацию неспецифического флуоресцентного красителя и специфического зонда, несущего флуоресцентную группу, максимум возбуждения которой совпадает с максимумом эмиссии красителя (рис 20Д) В каждом случае после 30-го цикла ПЦР в геле появляются флуоресцентные пятна, число которых приблизительно равно числу молекул ДНК в образце (рис. 20А-Д). Увеличение длины размножаемого фрагмента приводит к более позднему появлению колоний, но они становятся мельче (рис. 20Б), что позволяет увеличить разрешение ММК.

Хотя детектируемые колонии образуются и при обычной (симметричной) ПЦР, чувствительность детекции можно увеличить, используя режим асимметричной ПЦР, для осуществления которой концентрации праймеров подбирают так, чтобы синтезировалось больше тех цепей, которые комплементарны флуоресцентным зондам При асимметричной ПЦР колонии флуоресцируют значительно ярче благодаря тому, что часть цепей мишени остается в однотяжной форме и, следовательно, является более доступной для гибридизации с зондами [15]

Временная зависимость флуоресценции, производимой одной колонией, похожа на график, получаемый при жидкостной ПЦР в реальном времени, инициированной <10 молекулами мишени [15, 19], с той разницей, что в случае молекулярных колоний шум меньше, отношение сигнала к фону больше, и, следовательно, надежность измерений выше В определенном смысле, выращивание колоний в геле эквивалентно параллельному осуществлению в реальном времени множества реакций, каждая из которых стартует с единственной молекулы мишени

Резюме

1 Разработана ПЦР-версия ММК, позволяющая размножать в виде колоний ДНК любые нуклеотидные последовательности

2 Новый метод позволяет прямо подсчитывать число молекул нуклеиновых кислот (определять их титр в образце), выявляя до 100% молекул ДНК-мишеней и до 50% РНК-мишеней

3 Разработан экспресс-метод детекции молекулярных колоний путем гибридизации с флуоресцентными зондами на нейлоновых мембранах, позволяющий отказаться от использования радиоактивно меченных зондов и существенно сократить продолжительность процедуры гибридизации

4 Осуществлена детекция молекулярных колоний с помощью гомогенных флуоресцентных систем детекции Помимо дальнейшего ускорения и упрощения анализа, это многократно снижает риск взаимного загрязнения образцов

ГЛАВА IV ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ Разработка диагностической процедуры

Разработка диагностики вирусных и онкологических заболеваний включала в себя дизайн олигонуклеотидных праймеров и зондов, создание плазмидных конструкций, несущих последовательности ДНК и кДНК модельных мишеней, а также разработку всех стадий диагностической процедуры, в том числе консервацию клинического материала, выделение нуклеиновых кислот, обратную транскрипцию и определение титра мишеней с использованием ПЦР-версии метода молекулярных колоний

Были созданы методы, обеспечивающие выделение нуклеиновых кислот с выходом около 100% из клинических образцов, в том числе, из нефракционированной цельной крови метод выделения ДНК [8] и универсальный метод, обеспечивающий одновременное выделение и РНК, и ДНК [11] Был также найден способ консервации клинических образцов показано, что при хранении образцов цельной крови в виде лизатов, содержащих 4 М тиоцианат гуанидина, высокомолекулярные РНК и ДНК сохраняются в течение 3 суток при комнатной температуре и, по крайней мере, в течение 2 недель при +4°С и больше года при -20°С [14, 26] Такой способ консервации обеспечивает хранение и транспортировку образцов при температуре окружающей среды и полностью совместим с процедурой последующего выделения нуклеиновых кислот.

В ходе оптимизации обратной транскрипции обнаружено, что нуклеиновые кислоты в больших концентрациях ингибируют обратно-транскриптазную активность "ТЧЬ ДНК-полимеразы и что при анализе образцов с низким титром РНК-мишеней предпочтительно использовать обратную транскриптазу вируса мышиной лейкемии (М-МЬУ), лишенную активности РНКазы Н, для синтеза кДНК и Taq ДНК полимеразу для ПЦР [11]

Диагностический потенциал молекулярных колоний

Отсутствие конкуренции между мишенями, одновременно размножаемыми в геле

В клинических исследованиях часто используют одновременное обнаружение сразу нескольких мишеней (то есть проводят «мультиплексную» ПЦР). Чтобы определить, в какой мере ММК позволяет избежать конкуренции между размножаемыми молекулами, был проведен эксперимент, и котором 300 молекул РНК вируса иммунодефицита человека, тип I, (Ы1V-1 РНК) размножали одновременно с ДНК вируса гепатита Б (НВУ ДНК), количество которой составляло от 0 до миллиарда молекул (рис. 21). После реакции мембрану сначала гцрридизовали е зондом, специфичным к размножаемому фрагменту генома I ]IV-1, затем этот зонд отмывали и зу же мембрану гибридизовали с зондом, специфичным к размножаемому фрагменту 11ВУ Д11К Видно, что число н размер колоний одной мишени не зависят от того, растет ли в том же геле в миллионы раз больше колоний другой мишени.

Н1У-1 РНК

О 102 103 104 105 10е Ю7 108 109

НВУ ДНК

Рис. 21. Отсутствие конкуренции между мишенями, размножаемыми в одном геле.

Показаны колонии ДНК, выросшие в результате проведения ПЦР в иол на к рилам и дном геле, содержащем компоненты ПЦР (как на рис 18), 300 молекул фрагмента Р11К вируса СПИДа (Н1\М), указанное число молекул фрагмента ДНК вируса гепатита Б (НВУ), а также Н1У-1- и [ПЗУ-специфичные ираймеры. По окончании ПЦР 9 мембран (в ряду) гибридизовали сначала с радиоактивно меченым ШV-1-специфичным зондом (верхний ряд), а затем - с НВУ-епепнфичным зондом (нижний ряд).

Отсутствие помех со стороны неспецифического аштезйДНК

Так как помимо обнаруживаемой мишени, клинический образец обычно содержит большое количество других нуклеиновых кислот, при осуществлении ГИДР в жидкое™ велика вероятность помех со стороны неснецифического (не зависящего от мишени) синтеза ДНК, Неспецифический синтез является следствием ограниченной специфичности гибридизации используемых для размножения мишени олнгонуклеотидов: с некоторой вероятностью

вместо мпшени одигонуклеотид гибридизуется с пс вполне комплементарной последовательностью - другим ол и го ну клеоти дом или посторонней ДНК. Хотя вероятность одиночного события такого рода мала, она почти всегда реализуется при анализе биологических образцов, так как концентрация олкгонуклеотидов и посторонних нуклеиновых кислот в анализируемом образце гораздо выше, чем мишени. Так, при размножении в жидкости 1000 молекул HBV ДНК количество специфического продукта уменьшается, а неспецифичсского возрастает в присутствии 0.4 мкг нуклеиновых кислот (выделенных из 15 мкл цельной крови), что соответствует 109-кратному избытку нуклеиновых кислот человека над мишенью размером 392 п.о. (рис. 22А). В то же время, ни яркость, ни число специфических колоний ДНК не изменяются при размножении а геле 50 молекул той же мишени в присутствии 5 мкг нуклеиновых кислот (выделенных в другом эксперименте из 100 мкл крови), ч то соответствует 2х! О1 '-кратному избытку нуклеиновых кислот человека над мишенью (рие. 22Б).

Нуклеиновые кислоты крови, мкг О 0.04 0.4

Специфический продукт

Димеры праймероа

'/-W

0 0.5 5

Нуклеиновые кислоты крови, мкг

Ряс. 22. Влияние нуклеин иных кислит крови на обнаружение ДНК вируса гепатита 1>.

11ЦР проводили в отсутствие и в Присутствии указанного количества нуклеиновых кислот. В качестве мишени использовали 1000 молекул (А) или 50 молекул (Б, верхний ряд) НВУ ДНК.

(А) 11ри проведении 1ЩР в жидкости добавление посторонних нуклеиновых кислот приводит к снижению выхода специфического продукта и накоплению мссмсцифмческмх продуктов (анализ с помощью электрофореза в полиакрил а м идиом геле и окрашивания бромистым чти днем).

(Ь) При проведении 11Ц1> в геле посторонние нуклеиновые кислоты не влияют ни на число, ни на яркость специфических колоний ДНК (колонии выявляли посредством гибридизации на мембране с радиоактивно моченным РНК-зопдом). Нижний ряд - в отсу тствие НВУ Д| 1К

Обнаружение вирусных нуклеиновых Кислом в цельной криви человека

Следующий эксперимент имитирует клиническую диагностику (рие, 23). В образцы донорской крови объемом 100 мкл добавили (одновременно с лизируюшим раствором) 50, 100 или 200 молекул ДНК вируса гепатита Б и из крови выделили нуклеиновые кислоты, ко-

Рис. 23. Обнаружение молекул ДНК вируса гепатита 1> (НВУ) в крови человека.

В образцы донорской кроки объемом 100 мкл добавили I! момент лизиса 0, 50, 100 или 200 молекул НВУ ДНК, затем выделили суммарные нуклеиновые кислоте»! и 60% полученного препарата использовали для ПЦР в геле. Колонии выявляли посредством гибридизация на мембране с радиоактивно меченым Р11К-зоидом.

торыс затем использовали для 11ЦР в геле. Оказалось, что число колоний, гибридизуюшихся с зоилом, комплементарным размножаемому фрагменту НВУ ДНК, соответствует (в пределах статистическою разброса) числу добавленных в кровь молекул мишени. Таким образом, ММК позволяет снизить предел детекции ДНК-содержащих вирусов в крови до абсолютного минимума ■- 1 молекулы, что в 500 раз лучше, чем современный уровень IЩР-диагностики [10]. Аналогичный результат получен при одновременном обнаружении Н1У-1 РНК и НВУ ДНК в цельной крови человека (рис. 24). В этом случае выявляется 100% ДНК-мишени и 50% РНК-мишени (меньшая чувствительность обнаружения РНК отражает выход стадии обратной транскрипции) [II].

Эти результаты также показывают, что разработанные нами и использованные здесь способы выделения обеспечивают близкий к 100% выход нуклеиновых кислот н полностью удаляют из образца примеси, ишибирующие обратную транскрипцию и I [ЦР.

1

нкм

НВУ

Рис. 24 Одновременное обнаружение HIV-1 РНК и HBV ДИК в цельной крови человека. Из образца донорской крови объемом !00 мкл, в который либо не добавляли мишень (1), либо добавили в момент лизиса 150 молекул HSV-! РНК и 50 молекул HHV ДНК (2-4), выделили суммарные нуклеиновые кислоты и нссь полученный препарат использовали для синтеза кДПК с помощью обратной транскриптазы M-MLV superscript™ II и последующей ПЦР в геле с помощью Taq ДНК-поли меразы. Колонии выявляли посредством гибридизации мембраны с радиоактивно меченным РНК-зондом, сначала H1V-I-специфичпым (верхний ряд), а затем - HliV-спсцифичным (нижний ряд). И серии из 7 Экспериментов в виде молекулярных колоний выявлено 78 ± 18 молекул I-IIV-1 РНК и 53 ± 11 молекул HBV ДНК.

Ожидаемое число молекул мишени

О 30 60 120 •'г; .'* •• '¿У

.*• ■ .'А •__■

■* • •• V О 40 68 105

Число обнаруженных колоний ДНК

2

Г

3 4

%* &

- *

vV

Определение маркерной РНК при онкологических заболеваниях

С использованием метода молекулярных колоний нами были разработаны системы детекции мРНК альфа-фетопротеина [48, 52], являющейся маркером гепатоклеточной карциномы и некоторых опухолей репродуктивной системы, и химерного транскрипта АМЫ-ЕТО [18], являющегося маркером лейкоза, ассоциированного с транслокацией 1(8,21)^22;я22). сконструированы плазмиды, несущие под Т7-промотором фрагменты кДНК маркерных РНК, и проведены модельные эксперименты по детекции этих РНК как в чистой системе, так и в цельной крови Для выделения нуклеиновых кислот из цельной крови использовали модифицированный метод Хомчинского, выделяющий преимущественно РНК Синтез кДНК осуществляли с использованием обратной транскриптазы М-МЬУ, лишенной активности РНКазы Н

Разработанная диагностическая процедура была испытана путем определения абсолютного титра мРНК АМЫ-ЕТО в клинических образцах [18], взятых у больных данным типом лейкоза на разных стадиях заболевания. Оказалось, что с помощью ММК появление онко-маркера в крови и костном мозге пациентов, находящихся на стадии ремиссии, удается обнаружить за несколько месяцев до всплеска его титра, что может быть использовано для своевременного проведения повторного цикла химиотерапии

Таблица 1. Выявление АМЫ-ЕТО РНК в клинических образцах с помощью обратной транскрипции и либо жидкостной ПЦР в реальном времени, либо ПЦР в геле (методом молекулярных колоний).

Шифр образца крови или костного мозга Титр мРНК АМЫ-ЕТО, молекул/мл

Жидкостная ПЦР в реальном времени ПЦР в геле (ММК)

С 1 36 640 328 000

С 2 11 060 23 400

С 4 0 0

С 5 0 0

С6 0 136

С 7 0 0

С 8 0 429

С 10 0 0

С 11 0 54

С 12 0 0

С 29 4 760 3 750

С 39 0 0

С 40 251 1 650

С 41 82 200 73 300

С 42 0 0

Результаты, полученные с использованием ММК, были сопоставлены с результатами стандартной (жидкостной) ПЦР в реальном времени (Таблица 1) ПЦР в реальном времени проводили в НИИ детской гематологии Минздрава РФ на тех же препаратах РНК, что и ПЦР в геле При высоком титре РНК-мишени в крови или костном мозге больных наблюдалось удовлетворительное совпадение результатов, полученных с помощью этих двух методов Такой высокий титр наблюдается до лечения или при рецидиве заболевания (Таблица 1, образцы Cl, С2, С29, С40, С41) Однако на стадии ремиссии, когда титр РНК-мишени низкий, чувствительности стандартной ПЦР не всегда хватает для обнаружения остаточной болезни (Таблица 1, образцы С6, С8, Cl 1).

Дополнительный резерв для увеличения специфичности заключается в способности ММК различать колонии ДНК, образованные химерными РНК и их нехимерными предшественниками, присутствующими в нормальных клетках' химерные колонии должны гибриди-зоваться с каждым из зондов, специфичных к генам, составляющих химеру (рис 25), тогда как нехимерные колонии могут гибридизоваться лишь с одним из них

Рис 26 иллюстрирует как проблему ложноположительного фона, обусловленного размножением нехимерных матриц, так и способы ее решения Верхний ряд показывает флуоресценцию мембран после гибридизации с зондом, специфичным к AML-части химерной молекулы и меченным красным флуорофором Су5, а второй ряд - результат гибридизации с зондом, специфичным к ЕТО-части и меченным желто-зеленым флуорофором СуЗ Стрелками отмечены колонии ДНК, которые гибридизуются с зондом Cy5-AML, но не гибридизуют-ся с зондом СуЗ-ЕТО Очевидно, эти колонии образованы нехимерными молекулами, содержащими последовательность гена AML1 и не содержащими последовательность гена ЕТО То, что ген AML1 образует ложноположительные колонии чаще, чем ген ЕТО, вполне ожидаемо, так как уровень его экспрессии в здоровых клетках значительно выше. Из приведенного эксперимента следует, что ложноположительные результаты могут быть исключены, если молекулярные колонии гибридизовать с двумя зондами, специфичными к обеим частям химерной молекулы

Аналогичного эффекта можно добиться, используя зонды, гибридизующиеся с составными частями химерной матрицы в месте их стыка и несущие флуорофоры, способные к резонансному переносу энергии (FRET) (рис 25Б) Так как FRET возможен лишь тогда, когда флуорофоры находятся в непосредственной близости друг от друга, свечение колоний доказывает, что они состоят из химерных последовательностей, способных к гибридизации с обоими зондами (нижний ряд на рис 26)

Ж

Зонд Cy5-AML Ч™<Г Зонд СуЗ-ЕТО

AATCACAGTGGATGGGCCCCGAGAA АС С G ТACTG AG AAG CACTCCACAAT

3'-TTTTAGTGTCACCTACCCGGGGCTCTTGGAGCI TGGCATGACTCTTCGTGAGGTGTTACGGTCTGA-5'

Ген AfÙÏL 1 Ген ETO

4:

FRET

Донор WÍ' Акцептор 51 -GATGGGCCCCGAGAACCTCGAA CGTACTGAGAAGCACTCCACAATGCCAp 3'-TTTTAGTGTCACCTACCCGGGGCTCTTGGAGCTTTGGCATGACTCTTCGTGAGGTGTTACGGTCTGA-S,

Ген AMI I Ген ETO

Гис. 25, Mecía гибридизации флуоресцентны* зондов с размножаемым фрагментом химерной кДНК А МЫ «КТО. Зонды комплементарны цепочке, синтезирующейся при обратной транскрипции. Зонд Cy5-AML и донор пары FRET-зондон гибридизуются с AMLS-частью кДНК, а зонд СуЗ-ЕТО и акцептор пары FR ВТ-зон до в гибридизуются с ос НТО-частью. Малое расстояние (2 нуклеотида) между флуорофорами донора (FAM) и акцептора (Су5) обеспечивает аффективный резонансный перенос энергии между ними, когда эти зонды гибридизоваиы с продуктом размножении химерной кДНК (А) Зонды, которые использовали для гибридизации па мембране. (Б) I lapa FRET-зондов.

Таким образом, продемонстрирован^ что разработанная процедура выявления РНК-маркера лейкоза (то есть обнаружения «минимальной остаточной болезни») на основе метола молекулярных колоний превосходит но чувствительности и надежности существующие способы, в том числе ПНР в реальном времени.

Клинические образцы (шифр) С6 С8 С11 С13

* s •Ni N. * N

% • • • •

* « * * •

Зонд Cy5-AML

Зонд СуЗ-ЕТО

FRET-зонды

l'iic. 26. Исключение лож-мшоложительн ы х колоний посредством гибридизации с зондами, специфичными к составным частям химерной кДНК AMLJ-ETO. Колонии ДНК выявляли посредством гибридизации на мембране с зондом CyS-AMl. и зондом СуЗ-ЕТО, а также посредством гибридизации в геле с парой зондов, способных к резонансному переносу энергии (FRET). Белыми стрелками указаны колонии, гибридизующиесй с зондом Су5-АМЕ, но не гибридизующисея с зондом СуЗ-ЕТО и с FRET-зондами,

Резюме

1. На основе ПЦР-версни метода молекулярных колоний созданы способы диагностики инфекционных и онкологических заболеваний.

2. Разработана полная диагностическая процедура, включающая в себя новый способ консервации биологических образцов, новый универсальный метод выделения нуклеиновых кислот и ПЦР-вариант метода молекулярных колоний для детекции и определения титра специфических мишеней в выделенном препарате.

3. Разработанный метод выявляет в биологических образцах 100% молекул ДНК-мишени и 50% молекул РНК-мишени

4. Разные мишени не мешают определению друг друга, даже если их титры различаются более чем в миллион раз.

5. Обнаружению мишени не мешает присутствие почти триллион-кратного избытка посторонних нуклеиновых кислот.

Таким образом, по ряду параметров ММК-диагностика превосходит методы, основанные на размножении нуклеиновых кислот в жидкости. Благодаря обнаружению молекул в виде счетных колоний, ММК делает анализ цифровым методом и позволяет производить прямой подсчет молекул. Благодаря пространственному разделению размножаемых молекул, ММК значительно снижает конкуренцию между мишенями при одновременном размножении нескольких мишеней, а также помехи со стороны неспецифического синтеза, вызванного ошибочной гибридизацией праймеров с посторонними нуклеиновыми кислотами. Метод молекулярных колоний позволяет преодолеть все проблемы жидкостной ПЦР и существенно повысить чувствительность, точность и надежность ПЦР-диагностики.

ГЛАВА V. ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЙ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ

Как отмечалось выше, каждая молекулярная колония представляет собой клон, то есть генетически однородное потомство единственной родительской молекулы. Недавно, с помощью ПЦР-всрсии ММК, нами была осуществлена идея клонирования генов (точнее, бе-лок-кодирующих последовательностей ДНК, окруженных всеми элементами, необходимыми для транскрипции и трансляции), их экспрессии в молекулярных колониях, а также т скрининга клонов по функции кодируемого белка [13, 16, 17]. Иными словами, удалось осуществить истинно молекулярное клонирование - в отличие от традиционного клонирования генов, которое, хотя его и называют «молекулярным клонированием», является, по существу, клонированием не молекул, а клеток или размножаемых в клетках вирусов.

Подобрав оптимальную плотность полиакриламидного геля, удалось получить молекулярные колонии, содержащие до 108 копий гена При этом число колоний совпадает, в пределах статистического разброса, с числом посеянных молекул ДНК Это дает возможность клонировать и тестировать до 100% элементов генетической библиотеки против 0,00010,01% при клонировании в клетках Столь малый выход при клонировании в клетках происходит из-за низкой эффективности процессов лигирования вставки в клонирующий вектор и трансформации клеток. Необходимость в этих процессах отпадает при использовании ПЦР-версии ММК

На примере РНК люциферазы Lucióla mingrelica была продемонстрирована способность метода клонировать из природного биологического материала кДНК длиной до 2 тысяч п о При этом клоны удается выделить, без предварительного размножения генетического материала, из порции суммарной РНК, соответствующей единственной клетке, что практически невозможно при использовании традиционных способов клонирования

Полученные клоны удалось экспрессировать in situ Для осуществления транскрипции ПЦР-гель просто высушивали и пропитывали раствором, содержащим транскрипционный буфер, ДНК-зависимую РНК-полимеразу и rNTP Инкубация геля в течение 2 ч при 37°С приводила к синтезу в колониях, по крайней мере, 10 копий РНК длиной до 1700 нт на каждую копию ДНК [13] Этот вариант метода позволяет осуществлять клонирование и прямую селекцию молекул РНК, таких как рибозимы и аптамеры.

Для осуществления синтеза белка в молекулярных колониях процедуру пришлось модифицировать, так как оказалось, что компоненты ПЦР, прежде всего буфер с относительно высоким значением рН, ингибируют трансляцию. Проблему удалось преодолеть вымачиванием геля в спиртово-солевом растворе (Промывка спиртово-солевым раствором была разработана нами ранее для удаления ингибиторов обратной транскрипции и ПЦР из препаратов нуклеиновых кислот, выделяемых из клинических образцов [8]) При такой обработке из геля вымывались все ингибиторы трансляции, но полностью сохранялись колонии ДНК После этого гель высушивали и пропитывали смесью, содержащей все компоненты, необходимые для совмещенной транскрипции-трансляции

На примере гена зеленого флуоресцирующего белка (GFP) продемонстрировано, что экспрессия в молекулярных колониях приводит к синтезу функционально активного (а, следовательно, правильно свернутого) полипептида (рис 27А) Флуоресценцию синтезируемого GFP можно наблюдать в реальном времени Колонии становятся детектируемыми через час, а их флуоресценция достигает максимума через два часа после начала реакции совмещенной транскрипции-трансляции Число флуоресцирующих пятен коррелирует с числом молекул гена GFP, введенных в гель перед ПЦР Кроме того, расположение флуоресцирующих пятен (рис 27А) практически совпадает с расположением GFP-специфических колоний ДНК, вы-

Рис. 27. Экспрессия mía GFP » виде молекулярных колоний» После проведения ПЦР в геле, содержащем смесь Taq и fwo ДНК-пол и мер аз и укачанное число молекул нлачмидм, несущей ген GFP, гель промывали спиртово-солевым раствором с целью удаления компонентов ПЦР, высушивали, пропитывали компонентами бесклеточной системы транскрипции-трансляции на основе Т7 РНК-полимеразы и экстракта зародышей пшеницы, п инкубировали при 25°С. В укачанные моменты времени регистрировали флуоресценцию геля с использованием синего лазера (488 им) и эмиссионного фильтра 508 пм. (Л) флуоресценция GFP, синтезированного в геле в виде молекулярных колоний.

р>) Колонии ДНК с геном GFP в пек же гелях. Показаны радиоавтографы мембран, гибридичованиых с меченым зондом.

являемых в этом же геле посредством гибридизаций с радиоактивно меченным зондом (рис. 27В).

В среднем в колонии синтезируется около № молекул белка, что достаточно для его Обнаружения ¡n silu. в Том Числе, ПО связыванию с антителами или лигам дамп, а также по ферментативной активности.

Клонирование генов в молекулярных колониях обладает рядом преимуществ по сравнению с клонированием >: vivo. Во-пер&ых, клонирование и экспрессия генов возможны в отсутствие Естественного отбора и в присутствии неириродиых иуклеотидев и аминокислот Во-вторых, возможен прямой скрининг генов по свойствам продуктов их экспрессии, так как нет клеточных стенок и мембран. В-третьих, условия анализа клопов могут отличаться от условий транскрипции-трансляции: состав реакционной среды может быть легко изменен путем пропитывания геля подходящим раствором. В-четвертых, молекулярная колония представляет собой генетически чистую Д! IIÍ, которая может быть прямо использована для генетических манипуляций, минуя стадию выделения. Наконец, поскольку каждый геи находится в той же колонии, что и продукт его экспрессии, метод может быть использован в качестве молекулярного дисплея. Отметим, что, в Отличие от фагового и иных форм генетического дисплея белков и пептидов, здесь для привязки белка к его гену не требуется модифицировать белок тэг-поелсдолателыюстью или «сливать» его с другим белком, которые могут влиять на структуру и функцию искомого белка. Иными словами, клонирование в молекулярных

Время транскрипции-трансляции, часы

□п

Число молекул матрицы в геле

колониях может делать все, что и традиционное клонирование в живых клетках, и много больше

Резюме

1. Осуществлено клонирование генов (белок-кодирующих последовательностей, окруженных элементами, необходимыми для их транскрипции и трансляции) в виде колоний ДНК.

2 Показано, что клоны индивидуальных кДНК можно получить из порции суммарной РНК, соответствующей ее содержанию в одной эукариотической клетке

3 Осуществлена транскрипция ДНК в молекулярных колониях

4 Осуществлена полная экспрессия (транскрипция и трансляция) генов в молекулярных колониях с образованием функционально активного белка

Таким образом, с помощью молекулярных колоний осуществлено полноценное клонирование генетического материала, включая экспрессию и скрининг клонов in situ по функции кодируемого белка

ГЛАВА VI. ДРУГИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЙ

Глава посвящена обзору литературных данных по применению молекулярных колоний в других лабораториях мира и обсуждению перспектив дальнейшего развития и использования ММК.

В течение 10 лет ММК развивался исключительно нашими усилиями Ситуация изменилась, когда метод стали использовать в лаборатории Дж Чёрча в Гарвардском университете. В 1999 году под названием «технология полоний» (то есть полимеразных колоний) Р. Митра и Дж Черч опубликовали ПЦР-версию ММК, почти буквально воспроизводящую наш метод, изложенный в патентах [20-25], заявки на которые были поданы еще в 1992 году Они ввели лишь одну несущественную модификацию - иммобилизовали на полиакриламид-ном матриксе с помощью акридитного метода один из праймеров Под именем полоний молекулярные колонии теперь используют в Гарварде и других университетах США с целью анализа экспрессии генов и однонуклеотидного полиморфизма (SNP), секвенирования клонированных ДНК in situ, исследования альтернативного сплайсинга, определения аллельных вариаций генов, картирования генов и определения числа их копий

К перспективам дальнейшего развития ММК относится его применение для определения уровня экспрессии генов в единичных клетках, количественного in situ анализа РНК одновременно в нескольких клетках, селекции генов по разнообразным свойствам кодируемых ими белков, селекции РНК, изучения функционального взаимодействия белков, детекции молекул ненуклеиновой природы.

выводы

1 На основе QP-репликазной версии метода молекулярных колоний исследовано явление рекомбинации РНК т vitro\

1) создана первая чистая бесклеточная система рекомбинации РНК;

2) впервые прямо продемонстрирована способность молекул РНК к рекомбинации без участия ДНК-интермедиатов;

3) обнаружено многообразие механизмов репликативной рекомбинации РНК, осуществляемой разными РНК-зависимыми РНК-полимеразами,

4) открыто явление саморекомбинации РНК

2 Создана ПЦР-версия метода молекулярных колоний, использующая полимеразную цепную реакцию для выращивания колоний ДНК в полиакриламидном геле Разработаны способы обнаружения колоний ДНК с помощью флуоресцентных зондов, в том числе способы обнаружения растущих колоний в реальном времени с использованием гомогенных флуоресцентных систем детекции.

3 На основе ПЦР-версии молекулярных колоний разработана полная процедура диагностики инфекционных и онкологических заболеваний Метод выявляет 100% молекул ДНК-мишени и 50% молекул РНК-мишени в биологических образцах и обладает высокой надежностью и специфичностью Продемонстрировано, что разные мишени не мешают определению друг друга, даже если их титры различаются более чем в миллион раз, и что обнаружению мишени не мешает присутствие триллион-кратного избытка посторонних нуклеиновых кислот

4 С помощью молекулярных колоний осуществлено полноценное клонирование генетического материала, включая экспрессию и скрининг клонов tn sttu по функции кодируемого белка

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах.

Статьи в научных журналах

1. Mumshkin, А. V., Voronin, L. A., Ugarov, V. I, Bondareva, L A, Chetvenna, Н V., and Chetvenn, А В (1991) Efficient templates for Qp replicase are formed by recombination ftom heterologous sequences. J. Mol Biol. 221, 463-472

2 Chetverin, А В , Chetverina, H V , and Munishkin, А V (1991) On the nature of spontaneous RNA synthesis by QP replicase J Mol Biol 222, 3-9

3 Chetvenn, А В , Voronin, L A , Munishkin, А V , Bondareva, L A , Chetverina, H V and Ugarov, V I. (1992) Recombination m replicatmg RNAs In Frontiers m Bioprocessing II (Todd, P , Sikdar, S К & Bier, M, eds ), American Chemical Society, Washington, DC, pp 44-49

4 Chetverina, H V and Chetvenn, А В (1993) Cloning of RNA molecules tn vitro Nucleic Acids Res 21,2349-2353

5 Chetvenn, А. В , Chetverina, H V , Demidenko, A. A , and Ugarov, V. I. (1997) Nonhomologous RNA recombination in a cell-free system evidence for a transestenfication mechanism guided by secondary structure Cell 88, 503-513

6 Ugarov, V. I, Samatov, T R, Chetverina, H. V., and Chetverin, А В (1999) Plasmid purification using hot Mg2+ treatment and no RNase BioTechmques 26, 194-198

7 Chetverina, H V., Demidenko, A A , Ugarov, V. I, and Chetvenn, А В (1999) Spontaneous rearrangements in RNA sequences FEBS Lett. 450, 89-94

8 Chetverina, H V , Samatov, T R , Ugarov, V. I, and Chetvenn, А В (2002) Molecular colony diagnostics Detection and quantitation of viral nucleic acids by in-gel PCR BioTechmques 33,150-156

9. Четверин А Б , Четверина E В (2002) Точная диагностика с помощью молекулярных колоний Молекуляр. биология 36, 320-327

10 Четверин А Б , Четверина Е В (2003) Преодоление проблем ПЦР-диагностики с помощью метода молекулярных колоний Молекуляр медицина 2, 30-40.

11 Chetverina, H V, Falaleeva, M. V., and Chetverin, А В (2004) Simultaneous assay of DNA and RNA targets in the whole blood using novel isolation procedure and molecular colony amplification Anal Biochem. 334, 376-381.

12 Chetvenn, А В, Kopein, D S, Chetverina, H. V., Demidenko, A A, and Ugarov, V. I. (2005) Viral RNA-directed RNA polymerases use diverse mechanisms to promote recombination between RNA molecules. J. Biol. Chem 280, 8748-8755

13 Samatov, T R, Chetverina, H V , and Chetvenn, А В (2005) Expressible molecular colonies Nucleic Acids Res 33, el45

14 Кравченко А В , Четверина E В , Четверин А Б (2006) Сохранность нуклеиновых кислот в гуанидинтиоцианатных лизатах цельной крови Биоорган химия 32,609-614

15. Samatov, T. R, Chetverina, H V , and Chetvenn, А В (2006) Real-time monitoring of DNA colonies growing m a polyacrylamide gel Anal Biochem 356, 300-302

16 Саматов T.P., Четверина E В , Четверин А Б (2006) Клонирование и экспрессия генов в молекулярных колониях Вестник биотехнол. 2, 45-49

17 Четверин А Б , Четверина Е В. (2007). Научные и практические приложения молекулярных колоний Молекуляр. биология 41,284-296

18. Фалалеева MB , Четверина Е В , Кравченко А В , Заболотнева Ю.А., Саматов Т Р., Боб-рынина В О, Масчан M А., Четверин А Б. (2006) Выявление минимальной остаточной болезни при лейкозах посредством детекции одиночных молекул химерных РНК-онкомаркеров. Научно-практическая конференция «Живые системы» в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники в 2002-2006 гг.», Сборник докладов 238-243.

Патенты

19. Четверин А Б , Четверина Е В (1995) Способ размножения нуклеиновых кислот, способ их экспрессии и среда для их осуществления Патент РФ № 2048522, 22 с Приоритет изобретения 14 09.92

20. Chetverin, А В and Chetverina, H V (1997) Method for amplification of nucleic acids in solid media U.S. Patent 5,616,478; 28 pp Filed Oct 26,1992

21. Четверин А. Б., Четверина E. В (1998) Способ клонирования нуклеиновых кислот. Патент РФ № 2114175, 26 с Приоритет изобретения' 14 09 92

22 Четверин А. Б., Четверина Е В. (1998) Способ диагностики нуклеиновых кислот Патент РФ № 2114915, 24 с. Приоритет изобретения 14 09 92.

41

23. Chetverin, А. В and Chetverina, H. V. (1999). Method for amplification of nucleic acids in solid media and its application for nucleic acid cloning and diagnostics U.S. Patent 5,958,698, 26 pp Original application filed Oct 26,1992

24 Chetverin, А В and Chetverma, H V (1999) Solid medium for amplification and expression of nucleic acids as colonies US Patent 6,001,568, 24 pp Original application filed Oct. 26, 1992

25 Chetverin, А В and Chetverina, H V (2004) Clinical assay for nucleic acids amplified in solid matrices to produce colonies of the progeny of individual target molecules. PCTpatent application EP1409744

26 Четверина E В , Четверин А Б , Кравченко А В (2005) Способ консервации биологических образцов, обеспечивающий сохранность нуклеиновых кислот Заявка на получение патента РФ № 2005138583

27. Четверина Е В , Четверин А Б , Кравченко А В (2006) Обнаружение молекулярных колоний посредством гибридизации на мембранах с флуоресцентными зондами Заявка на получение патента РФ № 2006108053.

28 Четверин А Б , Саматов Т Р , Четверина Е В (2006) Бесконтактные способы обнаружения молекулярных колоний, наборы реагентов и устройство для их осуществления Заявка на получение патента РФ № 2006109271

29 Chetverin, А. В., Samatov, Т. R. and Chetverina, Н V (2006) Non-invasive molecular colony methods, kits and apparatus PCT patent application PCT/US2006/038191.

Тезисы

30 Chetverin А В , Voronin, L A , Munishkin, A V., Bondareva, L. A., Chetverina, H V. and Ugarov, V I. (1990). Recombination in replicating RNAs Abstracts of Conference "Frontiers in Bioprocessmg II", University of Colorado, Boulder, p 38

31 Chetverina, E V and Chetverin, А В (1994). Cell-free cloning of RNA molecules Abstracts of the First German-Russian Summerschool on in vitro Systems, Technical University, Berlin, p 21

32 Chetverin, А В , Chetverina, H V , Demidenko, A A., and Ugarov, V I (1996). The molecular colony technique and its use for studying RNA recombination Abstracts of the 1996 Meeting of International Research Scholars from the Baltics, Central Europe, and the Former Soviet Union, Prague, Czech Republic, p 54

33 Chetverin, А В , Chetverina, H V , Demidenko, A. A., and Ugarov, V. I (1996) A splicing-like mechanism for RNA recombination suggested by experiments in a cell-free system Abstracts of the First Annual Meeting of the RNA society "RNA'96", University of Wisconsin-Madison, Wisconsin, USA, p 123

34 Chetverin, А В , Chetverina, H V , Demidenko, A A , and Ugarov, V I (1997). The mechanism of RNA recombination in a cell-free system Abstracts of the 1997 Meeting of International Research Scholars from Belarus, Czech Republic, Estonia, Hungary, Latvia, Lithuania, Poland, Russia, Slovak Republic, and Ukraine, Warsaw, Poland, p 47

35 Chetverin, А В , Chetverina, H V., Demidenko, A A , and Kolesnikov, I V. (1998). Use of the molecular colony technique for studying RNA recombination and ultrasensitive diagnostics Abstracts of the 1998 Meeting of International Research Scholars from Belarus, Czech Republic, Estonia, Hungary, Latvia, Lithuania, Poland, Russia, Slovak Republic, and Ukraine, Budapest, Hungary, p 79

36 Chetverin, A , Chetverina, H, Demidenko, A, and Ugarov, V. (1999) Nonreplicative modes of RNA recombination Abstracts of the Fourth Annual Meeting of the RNA society "RNA'99", University of Edinburgh, Scotland, UK, p 179

37 Chetverina, H., Demidenko, A , Ugarov, V., and Chetverin, A (1999) Self-recombination of RNA Abstracts of the Fourth Annual Meeting of the RNA society "RNA'99", University of Edinburgh, Scotland, UK, p 180

38 Chetverin, А В , Samatov, T. R, Chetverina, H V., and Ugarov, V. I (2000) DNA colonies prospects for cell-free gene cloning and diagnostics Abstracts of the 2000 Meeting of International Research Scholars from Argentina, Belarus, Brazil, Canada, Chile, Czech Republic, Estonia, Hungary, Latvia, Lithuania, Mexico, Poland, Russia, Slovak Republic, Ukraine, and Venezuela Chevy Chase, Maryland, USA, p 65

39 Samatov, T. R., Chetverina, H V , Ugarov, V. I., and Chetverin, А В (2000) PCR molecular colony technique the ultrasensitive quantitative diagnostics Proceedings of the Annual Student Meeting of the Medical Academy of Latvia, pp 28-29

40 Chetverina, H V., Samatov, T R, Ugarov, V I, and Chetverin, А В (2001) Virus assay with the molecular colony technique Abstracts of the 2001 Meeting of International Research Scholars in Vancouver, Canada, June 20-23, 2001. Howard Hughes Medical Institute, Chevy Chase, MD, p 48

41. Chetverina, H. V, and Chetverin, A B. (2002). Diagnostics and environmental monitoring with the molecular colony technique. Abstracts of the U.S - Russian Workshop "Ecology of Infectious Diseases", SRC VB "Vector", Novosibirsk, p 42

42 Demidenko, A A, Chetverina, H V , Ugarov, V I, and Chetverin, A. B. (2002) QP replicase-promoted RNA recombination Abstracts of the 2002 Meeting of International Research Scholars in Palm Cove, Australia, June 25-28, 2002. Howard Hughes Medical Institute, Chevy Chase, MD,p 88

43 Samatov, T R , Chetverina, H. V., Ugarov, V. I, and Chetverin, А В (2003) PCR Molecular Colony Technique The powerful tool for quantitative assays. Conference for Young Scientists, PhD Students and Students on Molecular Biology and Genetics, September 25-27, Kyiv, Ukraine, p 204

44. Четверин А. Б , Четверина E В (2003) Преодоление проблем ПЦР-диагностики с помощью метода молекулярных колоний Материалы II Московского международного конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития» Ч 1 С 35-36

45 Четверина Е В , Фалалеева М В , Четверин А Б (2003) Обнаружение одиночных молекул вирусных нуклеиновых кислот в цельной крови Материалы II Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» Ч 1. С 8182.

46 Фалалеева М В , Четверина Е В , Четверин А Б (2004) Обнаружение одиночных молекул вирусных нуклеиновых кислот в цельной крови Сборник тезисов III Конференции молодых ученых России с иностранным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» Москва, Научно-исследовательский центр ММА им ИМ Сеченова С 172-173.

47. Русинова А.В, Четверина Е.В., Четверин А Б (2004) Количественное определение мРНК альфа-фетопротеина человека и крысы с помощью метода молекулярных колоний VI Российская университетско-академическая научно-практическая конференция, Уд-мурдский государственный университет, http //v3 udsu ru/item-ipspub/meth-v/obj-09874 html

«¡h 10

к >i

48. Русинова А. В , Фалалеева М В , Четвер: агностики лейкемии t(8,21) с помощы; зимней молодежной научной школы биологии и биотехнологии», Москва, 749 Фалалеева М В , Четверина Е В , Четв( ния нуклеиновых кислот из цельной ций Тезисы XVII зимней молодежной н. зико-химической биологии и биотехнолоа

50 Фалалеева М В , Четверина Е В , Чет i ДНК полимераз при помощи метода м> дународной Пущинской школы-конфере, ка», Пущино, 18-22 апреля 2005 г С 58

51. Русинова АВ, Четверина ЕВ, Четвф: мРНК альфа-фетопротеина в крови с по тезисов 9-й Международной Пущинскс гия - наука XXI века», Пущино, 18-22 аг

52 Samatov, Т. R , Chetverina, Н V., and Chi: stracts of the 2005 Meeting of Internatior a, 25, 2005. Howard Hughes Medical Institut

53 Кравченко A.B , Четверина E В , Четве ) детекция лейкозной РНК при помощи зондам Сборник тезисов 10-й Между> дых ученых «Биология - наука XXI века>

54 Chetverina, Н V , Kopein, D S , Demid (2006). Comparison of the mechanisms of 3D polymerase. Program and abstracts of lecular Biology "RNA-Protein Interactu Sciences, Moscow, p 62

55. Chetverin, А В , and Chetverina, H V. (: technique Abstracts of the International Medicine", September 3-7, 2006 Sibenar vosibirsk, p 44

56 Chetverina, H V , Falaleeva, M V , and RNA molecules in the whole blood Absti for Biotechnology and Medicine", Septemh emy of Sciences, Novosibirsk, p 110

57 Samatov, T R , Chetverina, H V , and in molecular colonies Program and abstr on Molecular Biology "RNA-Protein Inter Sciences, Moscow, p. 76

58 Саматов T P , Четверина E В , Четверии кулярных колоний Материалы Между ре», 28 июня - 2 июля 2006 г Институт С 174

Юн

ина Е В , Четверин А Б (2005) Разработка ди-э метода молекулярных колоний Тезисы XVII 'ерспективные направления физико-химической

февраля 2005 г С 23 :рин А Б (2005) Универсальный метод выделе-ови для точной диагностики вирусных инфек-* тучной школы «Перспективные направления фи-•ии», Москва, 7-10 февраля 2005 г С 96 верин А Б (2005) Сравнение РНК-зависимых :< лекулярных колоний. Сборник тезисов 9 меж-¡ции молодых ученых «Биология - наука XXI ве-

ин А Б (2005) Количественное определение нощью метода молекулярных колоний. Сборник й школы-конференции молодых ученых «Биоло-реля 2005 г С 168

tvenn, А В (2005) Molecular colony display. Ab-7 Research Scholars in Merida, Mexico, June 22-Chevy Chase, MD, p 38 ин А.Б (2006) Метод молекулярных колоний гибридизации на мембране с флуоресцентными ародной Пущинской школы-конференции моло-Пущино, 17-21 апреля 2006 г. С. 24-25. ;nko, А А, Ugarov, V I, and Chetverin, А В RNA recombination by QP replicase and poliovirus the 8th International Engelhardt Conference on Moms", August 19-24, 2006 Russian Academy of

006) Digital diagnostics with the molecular colony Conference "Basic Science for Biotechnology and Branch of the Russian Academy of Sciences, No-

rhetverin, А В (2006) Detecting single DNA and acts of the International Conference "Basic Science •er 3-7, 2006. Siberian Branch of the Russian Acad-

etverm, А В (2006) Gene cloning and expression ids of the 8th International Engelhardt Conference actions", August 19-24, 2006. Russian Academy of

А Б (2006) Генетический дисплей в виде моле-/ародной конференции «Генетика в России и ми-общей генетики им Н И Вавилова РАН, Москва,

Заказ № 33/04/07 Подписано в печать 15.03.20Q7 Тираж 150 эк! Усл. пл. 2,75

^ ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; e-mail: infa@cfr.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Четверина, Елена Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна и практическая значимость.

Апробация работы.

Публикации.

Финансовая поддержка работы.

Благодарности.

ГЛАВА I. ПРИНЦИП МЕТОДА МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ).

1. ИЗОБРЕТЕНИЕ ММК.

2. СИСТЕМЫ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, ПРИГОДНЫЕ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В МЕТОДЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЙ.

2.1. Размножение РНК с использованием QP-репликазы.

2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.3. Альтернативные системы амплификации.

2.3.1. Самоподцерживаемая репликация (3SR).

2.3.2. Амплификация с вытеснением цепи (SDA).

2.3.3. Лигазная цепная реакция (LCR).

2.3.4. Размножение по принципу катящегося кольца (RCA).

2.4. Резюме.

3. РЕПЛИКАЦИЯ РНК, ОСУЩЕСТВЛЯЕМАЯ Qp-РЕПЛИКАЗОЙ.

3.1. Геном фага QP.

3.2. QP-репликаза.

3.3. Матричная специфичность QP-репликазы.

3.4. Репликация РНК.

3.5. Происхождение RQ РНК.

3.5. Вторичная структура RQ РНК.

4. ПЕРВОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ММК.

4.1. Необходимость выяснения источника «спонтанного» синтеза.

4.2. Доказательство матричной природы «спонтанного» синтеза.

4.3. Репликация RQ РНК в «сэндвиче».

4.4. Свойства ММК.

4.4.1. Число колоний соответствует числу добавленных молекул RQ РНК.

4.4.2. Разные колонии содержат разные виды RQ РНК.

ГЛАВА II. ПРИМЕНЕНИЕ ММК ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАЦИИ

1. РЕКОМБИНАЦИЯ РНК (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Полиовирусы.

1.2. История изучения рекомбинации РНК.

1.3. Рекомбинация у прокариот.

1.4. Гомологичная рекомбинация.

1.5. Не го мо логичная рекомбинация.

1.6. Возможные механизмы рекомбинации.

1.7. Необходимость создания чистой бесклеточной системы.

1.8. Резюме.

2. РЕКОМБИНАЦИЯ РНК IN VITRO (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ).

2.1. Рекомбинация в присутствии QP-репликазы.

2.1.1. Бесклсточная система для изучения рекомбинации РНК.

2.1.2. Демонстрация рекомбинации РНК in vitro.

2.1.3. Первичная структура рекомбинантов.

2.1.4. Вторичная структура рекомбинантов.

2.1.5. Роль 3'-конца 5'-фрагмента в рекомбинации РНК.

2.1.6. Разделение стадий рекомбинации и размножения рекомбинантов.

2.1.7. Резюме.

2.2. Спонтанная рекомбинация РНК.

2.2.1. Межмолекулярная рекомбинация.

2.2.2. Первичная структура рекомбинантов.

2.2.3. Внутримолекулярная рекомбинация.

2.2.4. Свойства спонтанной рекомбинации.

2.2.5. Роль вторичной структуры в саморекомбинации РНК.

2.2.6. Возможные механизмы саморскомбинации РНК.

2.2.7. Резюме.

2.3. Механизмы репликативной рекомбинации.

2.3.1. Рекомбинация, осуществляемая QP-репликазой, является репликативной.

2.3.2. Сравнение механизмов рекомбинации, осуществляемой разными РНК-зависимыми РНК-полимеразами.

2.3.2.1. Механизм «гибридизации и удлинения праймера».

2.3.2.2. Субстраты рекомбинации.

2.3.2.3. Свойства рекомбинаций, осуществляемых разными репликазами.

2.3.3. Возможные механизмы рекомбинации РНК, осуществляемой Qp-репликазой.

2.3.4. Резюме.

3. РАЗНООБРАЗИЕ МЕХАНИЗМОВ РЕКОМБИНАЦИИ РНК (ОБСУЖДЕНИЕ).

3.1. Результаты изучения рекомбинации в чистой бесклеточной системе.

3.1.1. Сравнение механизмов саморекомбинации и рекомбинации, осуществляемой QPрепликазой.

3.1.2. Разнообразие рспликативных механизмов рекомбинации РНК.

3.2. Нерепликативная рекомбинация in vivo.

3.3. Роль негомологичной и гомологичной рекомбинаций РНК.

3.4. Роль спонтанной рекомбинации РНК.

3.4.1. Возможная роль спонтанной рекомбинации в изменчивости геномов.

3.4.2. Возможная роль спонтанной рекомбинации РНК в происхождении жизни.

4. РЕЗЮМЕ.

ГЛАВА III. РАЗВИТИЕ МЕТОДА МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЙ.

1. ПОПЫТКИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ QP-РЕПЛИКАЗЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И КЛОНИРОВАНИЯ РНК.

2. ПРИМЕНЕНИЕ ПЦР ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

2.1. ПЦР-диагностика вирусных и онкологических заболеваний.

2.1.1. Диагностика вирусных заболеваний.

2.1.1.1. Вирус гепатита Б (HBV).

2.1.1.2. Вирус иммунодефицита человека (HIV).

2.1.1.3. ПЦР-диагностика HBV и HIV в стандартных жидкостных системах.

2.1.2 Диагностика онкологических заболеваний.

2.1.2.1. мРНК альфа-фстопротеина как маркер первичного рака печени.

2.1.2.2. Химерная РНК AML1-ETO как маркер лейкоза.

2.2. Проблемы жидкостной ПЦР.

2.2.1. Эффективность ПЦР.

2.2.2. Специфичность ПЦР.

2.2.3. Причины ошибочных ПЦР-тестов.

2.2.4. Проблемы количественной ПЦР.

2.2.5. Рекомбинация в процессе ПЦР.

2.3. Резюме.

3. РАЗМНОЖЕНИЕ ДНК В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЦР (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ).

3.1. Техническое воплощение ПЦР в геле.

3.2. Чувствительность детекции нуклеиновых кислот.

4. ПРИМЕНЕНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЙ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ).

4.1. Методы обнаружения молекулярных колоний.

4.2. Гибридизация с флуоресцентными зондами на мембране.

4.2.1. Обзор литературных данных.

4.2.2. Экспресс-гибридизация молекулярных колоний с флуоресцентными зондами на мембране.

4.3. Обнаружение молекулярных колоний в режиме «реального времени».

4.3.1. Характеристика гомогенных систем флуоресценции.

4.3.2. Детекция молекулярных колоний с использованием гомогенных систем флуоресценции.

5. РЕЗЮМЕ.

ГЛАВА IV. ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ.

1. РАЗРАБОТКА ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ПРОЦЕДУРЫ.

1.1. Консервация биологических образцов.

1.1.1. Методы консервации нуклеиновых кислот.

1.1.2. Сохранность нуклеиновых кислот в гуанидинтиоцианатных лизатах цельной крови

1.2. Выделение нуклеиновых кислот из клинических образцов.

1.2.1. Проблемы, связанные с выделением нуклеиновых кислот из цельной крови.

1.2.2. Удаление ингибиторов с помощью спиртово-солсвого раствора.

1.2.3. Универсальный метод выделения нуклеиновых кислот.

1.3. Резюме.

2. ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЙ.

2.1. Отсутствие конкуренции между мишенями, одновременно размножаемыми в геле.

2.2. Отсутствие помех со стороны неспецифического синтеза ДНК.

2.3. Обнаружение вирусных нуклеиновых кислот в цельной крови человека.

2.4. Определение маркерной РНК при онкологических заболеваниях.

3. ПРЕОДОЛЕНИЕ ПРОБЛЕМ ЖИДКОСТНОЙ ПЦР-ДИАГНОСТИКИ С ПОМОЩЬЮ ММК.

4. РЕЗЮМЕ.

ГЛАВА V. ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЙ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ И ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ.

1. МЕТОДЫ КЛОНИРОВАНИЯ И СЕЛЕКЦИИ ГЕНОВ (ВВЕДЕНИЕ).

1.1. Клонирование генов in vivo и in vitro.

1.2. Генетические дисплеи.

1.2.1. Генетические дисплеи, использующие клетки.

1.2.2. Бесклеточныс генетические дисплеи.

1.3. Гены для клонирования и экспрессии in vitro.

2. КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ В МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЯХ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ).

2.1. Размножение генов в виде молекулярных колоний.

2.2. Клонирование in vitro кДНК из биологического материала.

2.3. Экспрессия генов в молекулярных колониях.

3. ПРЕИМУЩЕСТВА КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНОВ В МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЯХ (ОБСУЖДЕНИЕ).

4. РАЗРЕШАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ ММК (ОБСУЖДЕНИЕ).

5. РЕЗЮМЕ.

ГЛАВА VI. ДРУГИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЙ

1. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ММК В ДРУГИХ ЛАБОРАТОРИЯХ МИРА.

1.1. Секвенирование в молекулярных колониях.

1.1.1. Секвенирование путем удлинения праймера.

1.1.2. Секвенирование путем гибридизации с олигонуклеотидами.

1.2. Однонуклсотидный полиморфизм.

1.2.1. Определение гаплотипа.

1.2.2. Определение лекарственной устойчивости вирусов.

1.3. Альтернативный сплайсинг.

1.4. Определение копийности аллелей и мРНК.

2. ДАЛЬНЕЙШЕЕ РАЗВИТИЕ ММК И ДРУГИЕ ВОЗМОЖНЫЕ ПРИМЕНЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЙ.

2.1. Синтез кДНКв геле.

2.2.Изучсние экспрессии генов в единичных клетках.

2.3. Селекция молекул РНК.

2.4. Селекция генов по функциям кодируемых белков.

2.5. Изучение функциональных взаимодействий белков.

2.6. Детекция молекул, ненуклеиновой природы.

3. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОЛОНИИ - ДОКЛЕТОЧНАЯ ФОРМА ЖИЗНИ?.

4. РЕЗЮМЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные колонии"

Актуальность проблемыПринцип метода молекулярных колоний (ММК) заключается в том, чтонуклеиновые кислоты экспоненциально размножают при помощи полимеразне в жидкой среде, как обычно, а в иммобилизованной среде, например, в геле. В результате иммобилизации среды потомство каждой исходной молекулыне распространяется по всему реакционному объему, а концентрируется в ограниченной зоне вокруг родительской молекулы, то есть образует колонию.Таким образом, отдельную молекулу можно размножить до детектируемогочисла идентичных молекул, что дает возможность обнаруживать, идентифицировать и подсчитывать единичные молекулы. Удобнее анализировать молекулярные колонии, расположенные в виде двумерного рисунка, для чего размножение осуществляют в тонком слое геля. Впервые мы опубликовали метод молекулярных колоний в 1991 году, применив его для обнаружения в воздухе единичных молекул реплицирующихся матриц, вьфащивая колонии РНКв агарозе, содержащей QP-репликазу (РНК-зависимую РНК-полимеразу фагаQP) и рибонуклеозидтрифосфаты (Chetverin et al. 1991). Тогда же мы предложили использовать аналогичный подход для выращивания колоний ДНК, атакже использовать молекулярные колонии для таких направлений, как изучение реакций между одиночными молекулами РНК, точная молекулярнаядиагностика, клонирование и экспрессия генов in vitro. Все это содержится впатентах на метод молекулярных колоний, полученных нами в России и США(Четверин и Четверина 1995, 1998а, 19986; Chetverin & Chetverina 1997, 1999а,1999b). Реализация сформулированных идей позволила бы дать мощный инструмент для молекулярной биологии и биотехнологии. Именно этому посвящена данная работа, что и определяет ее актуальность. После серии нашихпубликаций, продемонстрировавших уникальные возможности метода молекулярных колоний, его потенциал был осознан на Западе, где он стал известенпод названием «метод полоний» (то есть «полимеразных колоний»), даннымему Чёрчем и сотрудниками (Гарвардский университет, США) (Mitra &1999). С тех пор метод молекулярных колоний с успехом применяется12в ряде зарубежных лабораторий для решения разнообразных фундаментальных и прикладных задач.Данная работа выполнена в рамках тем «Разработка бесклеточной системы репликации РНК» (государственный регистрационный номер 01.8.70 031902), «Конструирование и исследование РНК-векторов» (01.960.005897) и«Развитие метода молекулярных колоний: Исследование механизма рекомбинации РНК, молекулярная диагностика и клонирование генов in vitro» (0120.0404412).Цель и задачи исследованияЦелью работы явилось развитие метода молекулярных колоний и изучение его возможностей для обнаружения, клонирования и анализа молекулнуклеиновых кислот. В качестве основных направлений работы бьши выбраны исследование явления рекомбинации РНК in vitro (как демонстрация научного потенциала метода), разработка методов молекулярной диагностики (какдемонстрация практического применения метода), а также срштез и экспрессия генов в молекулярных колониях (что может иметь как научное, так ипрактическое значение).Для достижения этой цели бьши поставлены и решены следуюш;ие задачи исследования.1. Создание чистой бесклеточной системы для изучения рекомбинации РНК.

2. Изучение механизма образования рекомбинантных РНК; в частности, выяснение возможности рекомбинации РНК без участия ДНКинтермедиатов.3. Разработка способа выраш,ивания колоний ДНК посредством осуществления полимеразной цепной реакции в геле.4. Разработка методов детекции молекулярных колоний с использованиемфлуоресцентных зондов.5. Разработка способов диагностики инфекционных и онкологических заболеваний.6. Разработка метода клонирования генетического материала in vitro, включающего выращивание колоний ДНК, их экспрессию (транскрипцию итрансляцию) и скрининг in situ.13Научная новизна и практическая значимостьВ работе показано, что, по сравнению с размножением нуклеиновых кислот в жидкости, метод молекулярных колоний обладает рядом преимуществ:позволяет прямо подсчитывать число исходных молекул и прямо клонироватьмолекулы, без использования традиционных методов генной инженерии. Метод исключает взаимную конкуренцию разных молекул (поскольку их синтезпространственно разделен), что позволяет преодолеть помехи со стороны неспецифического (фонового) синтеза нуклеиновых кислот и размножать сложные смеси матриц без риска потерять редкие и неэффективно размножаемыевиды. На примере исследования рекомбинаций - очень редких реакций междумолекулами РНК, а также на примере детекции вирусных нуклеиновых кислоти РНК-маркеров онкологических заболеваний в образцах крови и костногомозга продемонстрирована уникальная способность метода обнаруживатьодиночные молекулы РНК или ДНК определенного вида среди огромной массы посторонних нуклеиновых кислот.Полученные результаты существенно расширили представления о рекомбинации РНК. Доказано существование рекомбинации на уровне РНК, обнаружено многообразие механизмов рекомбинации РНК, осуществляемойразными РНК-зависимыми РНК-полимеразами, открыто явление спонтаннойрекомбинации РНК. Создана ПЦР-версия метода молекулярных колоний, использующая полимеразную цепную реакцию для выращивания колоний ДНК. В отличие отQp-репликазной версии, позволяющей выращивать колонии РНК только определенного вида, данный метод позволяет размножать в виде молекулярныхколоний любую нуклеотидную последовательность. На основе ПЦР-версииметода молекулярных колоний созданы способы диагностики инфекционныхи онкологических заболеваний, для чего разработана полная диагностическаяпроцедура, включающая в себя новый способ консервации биологическогоматериала и новый универсальный метод выделения нуклеиновых кислот изклинических образцов. Разработаны способы обнаружения колоний с помощью флуоресцентньпс зондов, в том числе, способы обнаружения растущих14колоний в реальном времени с использованием гомогенных флуоресцентныхсистем детекции.Разработан метод клонирования генетического материала in vitro, включающий получение колоний ДНК, а также их экспрессию (транскрипцию итрансляцию). Продемонстрирована возможность скрининга клонов in situ пофункции кодируемого белка.Апробация работыМатериалы диссертационной работы были представлены на открытомсеминаре Лаборатории механизмов биосинтеза белка Института белка РАН(2006), на ежегодных конференциях Института белка РАН (Пущино, 19952006), на международных конференциях: Энгельгардтовские конференции помолекулярной биологии (2000, 2004, 2006), конференции «Frontiers in Bioprocessing II» (Colorado, USA, 1991), «First German-Russian Smnmerschool on in vitro Systems» (Берлин, Германия, 1994), конференции Медицинского институтаГоварда Хьюза (Прага, Чехия, 1996; Варшава, Польша, 1997; Будапешт, Венгрия, 1998; Чеви Чейз, Мэрилэнд, США, 2000; Ванкувер, Канада, 2001; ПалмКоув, Австралия, 2002, Мерида, Мексика, 2005), конференции RNA society(Висконсин, США, 1996; Эдинбург, Великобритания, 1999), U.S. - RussianWorkshop «Ecology of Infectious Diseases» (Новосибирск, Россия, 2002), II Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективыразвития» (Москва, Россия, 2003), конференция «Basic Science for Biotechnology and Medicine» (Новосибрфск, Россия, 2006), конференция «Генетика вРоссии и мире» (Москва, Россия 2006), - а также на конференциях и школахмолодых ученых (Рига, Латвия, 2000, Ижевск, Россия, 2004, Москва, Россия,2004, 2005, Пущино, Россия, 2005, 2006).ПубликацииРезультаты исследования опубликованы в 58 работах, в том числе в 18статьях, 6 патентах (3 патента РФ и 3 патента США), 5 заявках на патент (3заявки на патент РФ и 2 международные заявки) и 29 сообщениях (тезисыконференций).15Финансовая поддержка работыРабота выполнена при финансовой поддержке Российской академии наук(программа «Молекулярная и клеточная биология»), Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 93-04-6550, 96-04-48329, 96-04-48331,99-04-48672, 02-04-48320, 05-04-48897), Федеральной целевой паучнотехнической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы (госконтракты43.035.1.1.1527/ИБ и 02.434.11.3024), Медицинского института Говарда Хьюза(гранты 75195-544701 и INTNL55000302), Европейского агентства ИНТАС(гранты 95-1365, 97-1034, 01-2012), Международного научного фонда (грантыМТО 000 и МТО 300).БлагодарностиДанная работа была выполнена в лаборатории биохимии вирусных РНКИнститута Белка РАН. Автор выражает руководителю лаборатории и своему постоянному соавтору А. Б. Четверину искреннюю признательность и сердечную благодарностьза постоянное внимание и поддержу, советы и рекомендации при постановкеэкспериментальных задач, стимулирующие и плодотворные обсуждения, засоздание творческой и благожелательной атмосферы в лаборатории.Автор благодарит своих коллег и соавторов - сотрудников ИнститутаБелка В. И. Угарова, Т. Р. Саматова, М. В. Фалалееву, А. А. Демиденко,Д. Копеина, А. В. Русинову (Кравченко), Ю. А. Заболотневу, а также сотрудников НИИ детской гематологии Минздрава РФ - В. О. Бобрынину иМ. А. Масчана.Автор приносит искреннюю благодарность и глубокую признательностьакадемрпсу РАН А. Спирину за постоянное внимание, интерес и поддержкуданной работы.Автор благодарен д.ф.-м.н. А. В. Финкельштейну за консультацию пооценке вероятностей выделения клонов.Автор благодарен В. И. Присяжному за предоставление реактивов дляхимических модификаций РНК и очистки белков.16Автор благодарит за предоставление плазмидных конструкций или материала для их создания: А. П. Алимова (Институт Белка РАН, Пущино),В. Н. Ксензенко (Институт Белка РАН, Пущино), ГНЦ ВБ «Вектор» (Кольцово. Новосибирская обл.), Е. Высоцкого (Институт биофизики, Красноярск),Е. В. Флейшман и И. Косорукову (Институт Канцерогенеза РОНЦ, Москва),Н. Н. Угарову (Московский Государственный Университет), Дабровски иЙ. Кур (Технический университет Гданьска, Польша), П. Кэсберг,А, Палменберг и П. Шекли (Университет штата Висконсин, США), Тайаги(Народный институт здоровья, Нью-Йорк, США), Шульц (Университет Колорадо, США).Автор благодарит за техническую помощь постоянных сотрудников лаборатории Н. И. Андросову, Л. В. Шутову, Т. М. Попкову, А. А. Андросову, атакже студентов, выполнявших курсовые и дипломные работы Е. А. Узлову,3. В. Валину, А. В. Симоненко, 3. К. Тнимова, Д. В. Лесняка. Автор благодарит всех сотрудников лаборатории за доброе отношение и помощь в работе, атакже всех сотрудников Института Белка, способствовавших выполнениюданной работы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Четверина, Елена Владимировна

1. На основе QP-ренликазной версии метода молекулярных колоний иссле довано явление рекомбинации РЬЖ in vitro:

1) создана нервая чистая бесклеточная система рекомбинации РНК;

2) внервые нрямо продемонстрирована снособность молекул Р1Ж к ре комбинации без участия ДНК-интермедиатов;

3) обнаружено многообразие механизмов ренликативной рекомбинации

РНК, осуществляемой разными РНК-зависимыми РНК-нолимеразами;

4) открыто явление саморекомбинации РНК.

2. Создана ПЦР-версия метода молекулярных колоний, иснользующая но лимеразную ценную реакцию для выращивания колоний ДНК в нолиак риламидном геле. Разработаны способы обнаружения колоний ДНК с по мощью флуоресцентных зондов, в том числе снособы обнаружения рас тущих колоний в реальном времени с использованием гомогенных флуо ресцентных систем детекции. 3. На основе НЦР-версии молекулярных колоний разработана полная проце дура диагностики инфекционных и онкологических заболеваний. Метод

выявляет 100% молекул ДНК-мишени и 50% молекул РНК-мишени в био логических образцах и обладает высокой надежностью и специфично стью. Нродемонстрировано, что разные мишени не мешают онределению

друг друга, даже если их титры различаются более чем в миллион раз, и

что обнаружению мишени не мешает присутствие триллион-кратного из быгка посторонних нуклеиновых кислот. 4. С номощью молекулярных колоний осуществлено нолноценное клониро вание генетического материала, включая экснрессию и скрининг клонов in

situ по функции кодируемого белка.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Четверина, Елена Владимировна, Пущино

1. Создание чистой бесклеточной системы для изучения рекомбинации РНК.

2. Изучение механизма образования рекомбинантных РНК; в частности, выяснение возможности рекомбинации РНК без участия ДНК-интермедиатов.

3. Разработка способа выращивания колоний ДНК посредством осуществления полимеразной цепной реакции в геле.

4. Разработка методов детекции молекулярных колоний с использованием флуоресцентных зондов.

5. Разработка способов диагностики инфекционных и онкологических заболеваний.