Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическое исследование экспрессии гена Est-S Drosophila virilis в трансгенных линиях Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фридман, Марина Владиславовна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6 Особенности reHaEst-S у D.virilis, а также некоторых орто- и паралогичных генов у других видов дрозофилид 7 Особенности и предпологаемые функции белка est-S

D. virilis и белка est-6 D. melanogaster

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Использованные виды и линии Drosophila

Оборудование

Методы исследования

РЕЗУЛЬТАТЫ

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическое исследование экспрессии гена Est-S Drosophila virilis в трансгенных линиях Drosophila melanogaster"

Целью настоящей работы было изучение особенностей экспрессии гена Еэ^ Б ИМпИз, с помощью трансформации конструкциями, содержащими его 5'-регуляторные участки, другого вида дрозофилид - хорошо изученной и удобной для генетического анализа О. melanogaster.

Еэ^ у О. специфически экспрессируется в половой системе (всемявыносящих луковицах) взрослого самца. При копуляции соответствующий белок переносится во влагалище самки. Продукт этого гена связан с р-эстеразной активностью в семявыносящих луковицах и влагалище, а по первичной структуре ген близок к другим р-эстеразным генам дрозофилид.

С нашим участием были исследованы трансгенные D.melanogaster, в геном которых был введён фрагмент гена Ез1-8. Фрагмент содержал около 400 п.о. дистальной регуляторной области и часть кодирующей последовательности в 900 п.н. Оказалось, что его вполне достаточно, чтобы обеспечить экспрессию соответствующего белкового продукта в семявыносящих луковицах (у D.melanogaster Р-эстераза ЕБ^б, специфичная для половой системы взрослого самца, экспрессируется в семявыносящих протоках). Более того, иммунохимически было показано, что продукты трансляции фрагмента этого гена тоже переносились во влагалище самки при копуляции. Транскрипционная активность тоже обнаруживалась, как и у самой строго всемявыносящих луковицах на 3 день после вылупления. Но роль отдельных регуляторных районов гена Еэ^ в обеспечении тканеспецифичности экспрессии подлежала дополнительному исследованию.

Как уже упоминалось, к числу особенностей гена Еб^Б относится крайняя специфичность экспрессии только в семявыносящих луковицах взрослых самцов и более нигде. Перед структурным геном находятся два промотора (-411 п.н. и -64 п.н.), из которых высокой активностью именно в семявыносящих луковицах взрослых самцов обладает проксимальный. Дистальный же активен в третьем личиночном возрасте в генитальном имагинальном диске и мальпигиевых сосудах, и у имаго на первый день вылупления и после 10-го дня (тоже всемявыносящих луковицах самца, но уровень активности на два порядка меньше).

На 5'-конце РНК, считанной со второго промотора, присутствуют несколько коротких открытых рамок считывания, наличие которых, видимо, мешает трансляции структурного гена эстеразы. Непонятно, затрудняет такая упреждающая транскрипция с дистального промотора последующую транскрипцию с проксимального промотора или, наоборот, способствует ей (например, за счёт изменения структуры хроматина), но интересно, что время появления первых транскриптов с дистального промотора совпадает со временем детерминации к синтезу est-S. Поэтому представляло интерес исследовать влияние различных 5'-регуляторных областей гена на его экспрессию с помощью трансформации D.melanogaster вектором pCaSpeR-AUG-ß-gal, содержащим фрагменты гена Est-S.

Трансгенные линии D.melanogaster получали по методике Р-элемент-опосредованной трансформации (Rubin G.M., Spradling A.C., 1982,1983). Были использованы конструкции, содержащие в качестве маркера ген mini-white (Pirrotta V., et al, 1985). Важной вспомогательной задачей была разработка простых и эффективных методов генетического анализа трансформантов и выведения линий, содержащих конструкцию в известной хромосоме. Использование линий с различной хромосомной локализацией позволяло нам исключить эффект положения. Также было существенно добиться того, чтобы линии содержали одну инсерцию на гаплоидный геном, чтобы исключить дополнительные регуляторные взаимодействия.

Таким образом, задачи нашей работы состояли в следующем:1. Создать генетическую схему анализа трансформантов и последующего выведения линий, который позволил бы просто, быстро и достоверно локализовать инсерции на хромосомах и воспользоваться этой методикой для выведения линий трансгенных мух с различной локализацией инсерции.

2. Исследовать трансгенные линии D.melanogaster на предмет особенностей экспрессии в них неполноразмерного гена Est-S D.virilis.

3. Выяснить, какое влияние на регуляцию транскрипции оказывают 5'-регуляторные области гена Еб^Б, прежде всего области проксимального и дистального промотора.

Научная новизна результатов работыБыло показано, что наличие дистального промотора необходимо для экспрессии гена Еб^ в семявыносящих луковицах, а наличие вышележащих последовательностей - для подавления его экспрессии в других органах и тканях. Подобная негативная регуляция для этого гена ранее описана не была.

Практическая значимость работыРазработанная схема генетического анализа трансформантов и выведения линий трансгенных мух пригодна для системы трансформации, использующей вектор рСаБреИ. и хелперную плазмиду с дефектным Р-элементом. Она может быть использована в практических целях - для получения максимального числа линий трансгенных мух с различной и известной хромосомной локализацией инсерции.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Фридман, Марина Владиславовна

ВЫВОДЫ

1. Созданная нами методика генетического анализа трансформантов и выведения трансгенных линий пригодна для широкого круга работ, использующих опосредованную Casper-вектором трансформацию D.melanogaster.

2. Фрагмент гена Est-S, содержащий 400 п.н. регуляторной и 900 п.н. кодирующей области, обеспечивает специфичность экспресии соответствующего белкового продукта по полу и органу, адекватную таковой у самой D.virilis.

3. Полученные данные подтверждают важную роль области дистального промотора Р1 гена Est-S для его ^кспрессии в семявыносящих луковицах.

4. Обнаружено, что участки, находящиеся дистальнее Р1, принимают участие в подавлении нетканеспецифической экспрессии гена Est S.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор хотел бы поблагодарить своих коллег по совместной работе Дзитоеву С.Г., Копанцеву М.Р. и Полякову Е.В., а также своих научных руководителей -Башкирова В.Н., который осуществлял постоянную поддержку при организации работ и обсуждении их результатов и Корочкина Л.И., определявшего общее направление наших работ.

Я очень признательна также Шостак Н.Г. за руководство при освоении методики микроинъекций, Копанцевой М. Р. за помощь в освоении методики иммуноблотинга и предоставление антител, Мавлетшиной Д. за предоставление эффективных модификации методики для оценки количества белка в образцах и высокочувствительной окраски серебрением.

Всем, кому я уже упомянула, я глубоко признательна также за интересное и содержательное обсуждение полученных результатов. Хотела бы выразить благодарность и всем сотрудникам лаборатории нейрогенетики и генетики развития ИБГ РАН и молекулярной биологии развития ИБР РАН за создание благоприятной атмосферы для работы, моральную и техническую поддержу. Я благодарна также Н.Садовской за помощь в оформлении работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фридман, Марина Владиславовна, Москва

1. Аронштам A.A. Исследование выражения гена Est-б у Drosophila. Автореферат дис. на соискание степени к.б.н. Л., Ин-т цитогенетики и генетики СО АН СССР, 1974.

2. Аронштам A.A., Кузин Б.А. Формирование полового диморфизма в соответствии с экспрессией Est-б гена у гибридов между D.melanogaster и D.simulans. ЖОБ, 1974, п.9, с. 926-934.

3. Аслануков А.Р. Молекулярно-генетический анализ природы нестабильной мутации white-starka и её производных. Автореферат дис. на соискание степени К.6.Н. М., Ин-т биологии гена РАН, 1996 г.

4. Асонова С.Н., Виноградова М.С, Корочкин Л.И. Ультраструктурный и иммуногистохимический анализ клеток в период изменений в синтезе изоферментов в онтогенезе Drosophila. Онтогенез, 1978, т.9, п.З, сю397-401.

5. Башкиров В.Н., Дзитоева С.Г., Панин В.М., Фридман М.В., Сергеев П.В., Корочкин Л.И. Молекулярно-генетические механизмы регуляции активности гена est S у трансгенных дрозофил. ДАН, 1997, т.352, п.5, с.695-698.

6. Дзитоева С.Р. Исследование регуляции тканеспецифической экспрессии гена est S у дрозофилы. Автореферат дис. на соискание степени к.б.н. М., ИБР РАН, 1996.

7. Ениколопов Г.Н., Кузин Б. А, Евгеньев М.Б., Корочкин Л.И., Георгиев Г.П. Клонирование гена эстеразы S из геномаD.virilis. ДАН, 1982, т.267, п.6, стр.14751477.

8. Ениколопов Г.Н., Георгиев Г.П. Альтернативный промотор гена эстеразы S Drosophila virilis приводит к появлению необычной м-РНК в клетках имагинальных дисков. Докл. АН СССР, 1989, т.306, п.З, стр.727-730.

9. Ениколопов Г.Н., Малеванчук O.A., Пеунова Н.И, Сергеев П.В., Георгиев Г.П. Локус est Drosophila virilis содержит два родственных гена. Докл. АН СССР, 1989, т.306, п.5, стр. 1247-1249.

10. Ениколопов Г.Н., Хечумян Р.К., Кузин Б.А., Корочкин Л.И., Георгиев Г.П. Молекулярная организация семейства генов эстераз Drosophila virilis. Тканеспецифичная экспрессия гена эстеразы S Drosophila virilis. Генетика, 1989, т.25, п.З, стр. 406-416.

11. Ениколопов Г.Н., Малеванчук O.A., Пеунова Н.И., Сергеев П.В., Георгиев Г.П. Локус Est Drosophila virilis содержит два родственных гена. Доклады Академии наук, 1989, т.306, п.5, стр. 1247-1249.

12. Ергучёв Д.М., Сергеев П.В., Копанцева М.Р., Людвиг М.З., Тамарина H.A., Мартине К.П., Корочкин Л.И. Идентификация продуктов тканеспецифических генов у дрозофилы. Доклады Академии наук, 1996, т.347, п.1, с.136-140.

13. Иващенко Н.И., Корочкин Л.И.Утрата тканевой специфичности одним из изоферментов эстеразы у Drosophila hydei. Онтогенез, 1985, т.16, стр.175-177.

14. Копанцева М.Р., Людвиг М.З., Успенский И.И., Тамарина Н.А, Цатрян В.А, Корочкин Л.И. Белки семявыносящих луковиц различных видов ЯгаторМа.ЖОБ, 1990, т.51, п.1, стр. 125-140.

15. Копанцева М.Р. Сравнительная генетико-биохимическая характеристика продуктов двух гомологичных эстеразоподобных генов. Автореферат диссертации на соискание степени к.б.н. Москва, 1995, ИМБ РАН.

16. Коротков Д.В., Кайданов Л.З., Корочкин Л.И. Активность эстеразы-6 в линиях Drosophila melanogaster с разной половой активностью самцов. Генетика, 1993, т. 29, п.9, с. 1429-1439.

17. Корочкин Л.И., Евгеньев М.Б. Цитогенетическая локализация гена, кодирующего органоспецифическую эсгеразу у дрозофилы. Доклады Академии Наук, 1982, т.263, п.2, стр. 471-474.

18. Корочкин Л.И. Тезисы докладов и сообщений, представленных на советско-финляндском симозиуме по биологии развития. Тканеспецифическая экспрессия генов эстеразы у дрозофилид. Онтогенез, 1984, т. 15, п.4, стр.430.

19. Корочкин Л.И. Клонирование, экспрессия, регуляция тканеспецифических генов у дрозофилы. Генетика, 1995, т. 31, п.8, стр. 1029-1042.

20. Корочкин Л. И. Молекулярно-генетические механизмы регуляции тканеспецифической экспрессии гена est S у дрозофилы. Молекулярная биология, 2000, т.34, п.5, с.736-742.

21. Кузин Б.А, Аронштам АА., Корочкин Л.И. Исследование детерминации гена Est 6 к экспрессии в гениталиях самцов Drosophila melanogaster. Онтогенез, 1975, т.6, п.З, с.323-340.

22. Людвиг М.З., Филинова М.Р., Корочкин Л.И. Генетико-биохимические свойства белка ЕВ - 1 у Drosopila virilis. Доклады Академии наук, 1984, т.279, п.1, стр. 220-222.

23. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, 1984, М., "Мир".

24. Матвеева Н.М. Генетический контроль экспрессии изоферментов эстераз у видов Drosophila группы virilis. Автореферат диссертации на соискание учёной степени к.б.н. Москва, 1981 г., ИБР АН.

25. Сергеев П.В, Кастильо Х.Э., Пеунова Н.И., Ениколопов Г.Н. Первичная структура гена эстеразы S Drosophila virilis. Биоорганическая химия, 1989, т. 15, п.6, с.839-843.

26. Тамарина H.A. Экспрессия гена Est-S у Drosophila virilis и других видов рода Drosophila. Диссертация на соискание степени к.б.н., М., ИБР АН СССР, 1990.

27. Arnason E., Chambers G. Macromolecular interaction and the electrophoretic mobility of esterase-5 from Drosophila pseudoobscura. Biochem Gen., 1987, v.25, n.3/4, pp.287-308.

28. Arnason E. Esterase-5 in Drosophila pseudoobscura is transferred from males to females during copulation. Drosophila information service, 1988, v.67, p.3.

29. Balakirev E.S., Ayala F.J. Is esterase-P encoded by cryptic pseudogene in Drosophila melanogasterl Genetics, 1996, v.144, n.4, pp.1511-1518.

30. Brady J.P., Richmond R.C., Oakeshott J.G. Cloning of the esterase-5 locus from Drosophila pseudoobscura and comparison with its homologue in D.melanogaster. Molecular biololgy and evolution, 1990, v.7, n.6, pp.525-546.

31. Brady J.P., Richmond R.C. Journal of molecular evolution, 1992,v.34, iss.6, p.506-521.

32. Collet C., Nielsen KM., Russel R.J., Karl M., Oakeshott J.G., Richmond R.C. Molecular analysis of duplicated esterase genes in Drosophila melanogaster. Mol. Biol, and Evol.,1990,v.7, n.l, pp.9-28.

33. Fang B., Hanovr J.A., Miller M.W. An evaluation of sialation of the nucleoporin 62. Arch. Biochem Biophys, 1998, sep. 1, v. 357 (1), pp. 95-100.

34. Game A.Y., Oakeshott J.G. Associations between restriction site polymorphism and enzyme activity variation for esterase 6 in Drosophila melanogaster. Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 1990, v. 126, n.4.

35. Gilbert D.G. Ejaculate esterase 6 and initial sperm use by female Drosophila melanogaster. J. Insect phisiol.,1981, v.27, n.9, pp.641-650.

36. Gilbert D.G., Richmond R.C. Esterase 6 in Drosophila melanogaster: reproductive function of active and null males at low temperature. Proc.Nat.Acad.Sci. USA, v.79, n.9, pp.2962-2966.

37. Hasson E., Eaner W.F. Contrasting histories of three gene regions associated with In (3L) Payne of Drosophila melanogaster. Genetics, 1996, v. 144, n. 4, pp. 1565-1575.

38. Healy M.J., Dumancic M.M., Cao A., Oakeshott J.G. Localization of sequences regulating ancestral and acquired sites of esterase 6 activity in Drosophila melanogaster. Mol. biol. and evol.,1996, v.13, iss.6, pp.784-797.

39. Karotam J., Oakeshott J.G. Regulatory aspects of esterase 6 activity variation in sibling Drosophila species. Heredity, 1993, v. 71, part. 1, pp. 41-50.

40. Korochkin L., Belyaeva E, Matveeva N., Kuzin B., Serov O. Genetics of esterases in Drosophila. IV. Slow-migrating S-esterase in Drosophila of the virilis group. Biochem. Genet., 1976,14, n. 1/2, p. 161-182.

41. Korochkin L. Genetic regulation of isozyme patterns in Drosophila during development. Isozymes: current topics in biological and medical research. N.Y.: Alan R. Liss, 1980, v.4, p. 159-202

42. Korochkin L., Bashkirov V., Panin V., Sergeev P., Dzitoeva S., Gabitova L., Golubeva M. Esterase gene family in Drosophila development. 15th European Drosophila research conference, 1997, Varna, p. 25.

43. Drosophila melanogaster adult. Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1993, v.90 (13), pp.62336237.

44. Mane S.D., Tompkins L., Richmond R.C., Male esterase 6 catalyzes syntesis of a sex pheromone in Drosophila melanogaster females. Science, 1983, v. 222, n. 4622, p. 419-421.

45. Meikle D.B., Seehan K.B., Phillis D.M., Rihmond R.C. J. Loocalization and longevity of seminal-fluid esterase 6 in mated female Drosophila melanogaster. Insect Physiol., 1990, v. 36, n. 2, pp. 93-101.

46. Myers M.A, Healy M.J., Oakeshott J.G. Effects of the residue adjacent to the reactive serine on the substrate interactions of Drosophila esterase. Biochem. Genet.,1993, v.31, iss.7-8, pp.259-278.

47. Oakeshott J., Collet C., Phillis R., Nielsen K., Russel R., Chambers G., Ross V., Richmond R. Molecular cloning and characterization of esterase 6, a serine hydrolase of Drosophila. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1987, v.84, n.10 pp.3359-3363.

48. Oakeshtt J.G., van Papenrecht E.A., Boyce T.M., Healy M.J., Russell R.J. Evolutionary genetics of Drosophila esterases. Genetica, 1993, v. 90, pp. 239-268.

49. Oakeshott J.G., Saad M., Game A.Y., Healy M.J. Causes and cosequences of esterase 6 enzyme activity variation in pre-adult Drosophila melanogaster., Heredity,1994, v.73, n.2, pp.160-169.

50. Oakley B.R., Kirsch D.R., Morris N.R. A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in polyacrylamide gels. Analytical biochemistry, 1980, v. 105, pp. 361363.

51. Pirotta V., Steller H., Bozzetti M.P. Multiple upstream regulatore elements control the expression of the Drosophila melanogaster white gene. EMBO J., 1985, v. 4, n. 13A, pp. 3501-3508.

52. Procunier W.S., Smith J.J, Ricmond R.C. Physical mapping of the esterase-6 locus of Drosophila melanogaster., Genetica, 1991, y. 84, n. 3, pp. 203-208.

53. Richmond R.C., Gilbert D.G., SheehanK.B. Gromko M., Butterworth F. Esterase 6 is involved in reproduction of Drosophila melanogaster. Science, 1980, v. 207, n. 11, pp. 1483-1485.

54. Richmond R.C., Senior A. Esterase 6 of Drosophila melanogaster: kinetics of transfer to females, decay in females and male recovery., J. Insect.Phisiol.,1981, v.27, n.12, pp. 849-853.

55. Rubin G.M., Spradling A.C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science, 1982, v. 218, pp. 348-353.

56. Rubin G.M., Spradling A.C. Vectors for P-element gene transfer in Drosophila. Nucl. Acids Res., 1983, v. 11, pp. 6341-6351.

57. Scott D. Inhibition of female Drosophila melanogaster remating by a seminal fluidprotein (esterase 6). Evolution, 1986, v. 40, n. 5, pp. 1084-1091.

58. Scott D., Jackson L.L. The basisi for control of post-mating sexual attractiveness by Drosophila melanogaster females. Anim. Behav., 1990, v. 40 (5), pp. 891-900.

59. Sentry J.W., Kaiser K. Progress in Drosohila genome maniulation. Transgenic Research, 1995, v. 4, pp. 155-162.

60. Sergeev P.V., Yenikolopov G.N., Peunova N.I., Kuzin B.A., Khechumian R.A., Korochkin L.I., Georgiev G.P. Regulation of tissue-specific expression of the esterase S gene in Drosophila virilis. Nucl. Ac.Res., 1993, v.21, n.15, pp.3545-3551.

61. Sergeev P.V., Panin V.M., Pavlova G.V., Kopantseva M.R., Shostak N.G., Bashkirov Y.N., Georgiev G.P., Korochkin L.I. The exression of esterase S gene of Drosophila virilis in Drosophila melanogaster. FEBS Letters, 1995, v.360, pp. 194196.

62. Tamarina N.A., Ludwig M.Z., Richmond R.C., Divergent and conserved features in the spatial expression of the Drosophila pseudoobscura esterase-5B gene and theesterase-6 gene of Drosophila melanogaster. PNAS USA, 1997, Jul. 22, v.94, (15), pp. 7735-7741.

63. Yenicolopov G.N., Kuzin B.A., Evgen ev M.B., Ludvig M.Z., Korochkin L.I., Georgiev G.P. The cloning and expression of the gene encoding organ-specific est S from the genome of D.virilis. EMBO J., 1983, v.2, all, p. 1-7.

64. Zouros E., van Delden W., Odense R., van Dijk H. An esterase duplication in Drosophila: differences in expression of duplicate loci within and among related species. Biochemical Genetics, 1982, v. 20, n. 9/10, pp. 929-942.

65. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

66. Башкиров В.Н., Дзитоева С.Г., Панин В.М., Фридман М.В., Сергеев П.В., Корочкин Л.И. Молекулярно-генетические механизмы регуляции активности гена est S у трансгенных дрозофил. ДАН, 1997, т.352, п.5, с.695-698.

67. Korochkin L., Bashkirov V., Panin V., Sergeev P., Dzitoeva S., Gabitova L., Golubeva M. Esterase gene family in Drosophila development. 15th European Drosophila research conference, 1997, Varna, p. 25.

68. Korochkin L., Bashkirov V., Panin V., Sergeev P., Dzitoeva S., Gabitova L., Golubeva M. Molecular-genetic aspects of tissue specific genes expression in Drosophila. 15th European Drosophila research conference, 1997, Varna, p. 20.тегса&гит

69. Рис.1. Эволюционное древо рода ОгохоркИа. Упомянутые в обзоре группы подчёркнуты.5'РestS regulatory regionestS coding region1. EcoRI1. Рис.2

70. Схематическая карта конструкции с геном estS D. viriLis.pCaSpeR-AUG-bgal 16,844 kbwhitelacZestS regulatory region - 4000bp/■/\