Молекулярно-генетический анализ и оценка состояния генофондов популяций Populus tremula L. в Пермском крае

Светлакова, Татьяна Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетический анализ и оценка состояния генофондов популяций Populus tremula L. в Пермском крае
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ и оценка состояния генофондов популяций Populus tremula L. в Пермском крае"

005053664

На правах рукописи

СВЕТЛАКОВА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ГЕНОФОНДОВ ПОПУЛЯЦИЙ POPULUS TREMULA L. В ПЕРМСКОМ КРАЕ

03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 ОКТ 2012

УФА-2012

005053664

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет» (ПГНИУ)

Ведущее учреждение:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН

Защита диссертации состоится 8 ноября 2012 г. в /^:С0часов на заседании Объединенного Диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, просп. Октября, 71, ИБГ УНЦ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, просп. Октября, 71. e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан 5 октября 2012 г.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент Боронникова Светлана Витальевна

Официальные оппоненты: Путенихин Валерии Петрович

доктор биологических наук, старший научный сотрудник,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ботанический сад-институт Уфимского научного центра Российской академии наук, заведующий лабораторией дендрологии и лесной селекции

доктор биологических наук, доцент, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт леса Карельского научного центра Российской академии наук, руководитель группы биотехнологии воспроизводства древесных растений

Ветчинникова Лидия Васильевна

Ученый секретарь диссертационного совета

Бикбулатова С.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследования, выполняемые в целях оптимизации природопользования и охраны биоразнообразия на популяционном уровне, относятся к наиболее приоритетным направлениям развития науки (Комплексная программа развития биотехнологий..., 2012). Эффективные мероприятия по охране биоразнообразия невозможны без внимания к его генетической компоненте. Вследствие рубок, болезней, загрязнения окружающей среды, осуществления индивидуального отбора в селекции, наблюдается снижение генетического разнообразия лесов (Путенихин, 1993; Ирошников и др., 1989; Видякин, 2004). Для разработки стратегии сохранения и рационального природопользования лесных ресурсов, обеспечивающей удовлетворение экономических потребностей общества и охрану биоразнообразия природных сообществ, необходимы глубокие знания о состоянии генофондов основных лесообразующих пород деревьев (Динамика популяционных..., 2004). Популяционный подход при изучении главнейших видов-лесообразователей важен для понимания закономерностей формирования лесных насаждений и открывает перспективу эффективного исследования эволюционного процесса у древесных растений (Путенихин, 2000). Только глубокое знание тонкой популяционно-генетической структуры древесных растений позволит проводить мониторинг ее изменений и прогнозировать нарушение ее стабильного воспроизводства во времени (Политов, 2007). Род Populas L. (тополь) является модельным для генетических исследований древесных растений благодаря относительно небольшому размеру генома и огромным адаптивным возможностям (Brunner et al., 2004). Североамериканский вид тополя Popiilus trichocarpa Torr, и A.Gray (западный бальзамический тополь, или калифорнийский тополь) был первым древесным видом растений, геном которого был полностью секвенирован (Tuskan et al. 2006). Populus trémula L. (тополь дрожащий или осина) - один из важнейших лесообразующих и практически значимых древесных видов растений, что подтверждается использованием данного вида в различных отраслях народного хозяйства развитых стран, таких как США, Канада, Финляндия, Япония, Китай (Gordon et al, 1996; Geburek, Turok, 2005). В настоящее время развитие ДНК-технологий, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР), открыло новые методические возможности для изучения генетических факторов, обуславливающих особенности динамики

популяционно-генетической структуры тех или иных видов древесных растений (Ветчинникова и др., 2012).

Цель исследований - изучение генетической компоненты биологического разнообразия и оценка состояния генофондов популяций Р. trémula в Пермском крае.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) провести молекулярно-генетический анализ популяций Р. trémula с использованием ISSR-маркеров;

2) изучить генетическую структуру популяций Р. trémula, определить генетические расстояния между популяциями Р. trémula;

3) определить нуклеотидные последовательности генов Р. trémula, которые используются для сравнительной геномики видов рода Populus и выявить в них SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms);

4) проанализировать частоту и расположение SNPs в изученных генах и провести их сравнительный анализ с SNPs других видов рода Populus-,

5) провести молекулярно-генетическую идентификацию популяций Р. trémula в Пермском крае с использованием ISSR-PCR маркеров и SNPs;

6) дать оценку состояния генофондов популяций Р. trémula в Пермском крае.

Научная новизна работы. Впервые в Пермском крае проведено комплексное изучение генофондов популяций Р. trémula. Генетическое разнообразие оценено с использованием межмикросателлитного, или ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats)-Merofla анализа полиморфизма ДНК. Изучена генетическая дифференциация популяций Р. trémula, установлены генетические расстояния, определены коэффициенты генетической оригинальности популяций (КГО). Секвенированы последовательности пяти генов Р. trémula. Впервые проведены исследования по детекции SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) в геноме пермских популяций Р. trémula. Проведен сравнительный анализ частот SNP Р. trémula с частотами SNPs двух других видов рода Populus. Впервые на основании данных молекулярно-генетического анализа разработан подход и дана оценка состояния семи популяций Р. trémula в Пермском крае. Разработана модельная система генетической идентификации древесных видов растений на основе ДНК маркеров (ISSR-PCR маркеров) с учетом SNP.

Практическая значимость диссертационной работы заключается в разработке подхода к определению состояния генофондов популяций лиственных древесных видов растений на примере Р. trémula и модельной системы генетической идентификации древесных видов растений на основе

полиморфизма ISSR-PCR маркеров и SNP. Результаты работы, научные выводы и рекомендации могут быть использованы при разработке программ сохранения и развития генетических ресурсов Р. trémula. Результаты работы внедрены в учебный процесс Пермского государственного национального исследовательского университета и Башкирского государственного университета, что подтверждено актами внедрения. Результаты исследований и практические рекомендации диссертации предлагаются для использования Министерством природных ресурсов, научными учреждениями, высшими учебными заведениями, для разработки программ сохранения и рационального использования генофонда вида на популяционной основе, для генетической идентификации древесных видов растений, включая определения места происхождения древесины. Результаты исследований могут быть использованы для оптимизации методов и мер сохранения генетической компоненты биологического разнообразия популяционных систем лиственных древесных видов растений и в других регионах страны.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена при частичной финансовой поддержке инновационного образовательного проекта «Образование», гранта РФФИ р_урал_а № 07-0496032 «Динамика генетического разнообразия и структуры популяционных систем ресурсных растений Пермского края при антропогенных воздействиях» (2007-2009 гг.), Аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (2009-2010 гг.), НИР «Оценка состояния генофондов и популяционных систем ресурсных видов растений при естественных колебаниях и антропогенной трансформации среды с использованием новых геномных и биоинформационных технологий» (20122014 гг.) государственного задания на оказание услуг Министерства образования и науки РФ, программы развития ПГНИУ «Рациональное природопользование: технологии прогнозирования и управления природными и социально-экономическими системами» (2010-2019 гг.), Международного договора о сотрудничестве ПГНИУ и Университета Эври Вал де Эссон (Франция).

Личное участие автора. Автором лично проведены полевые и лабораторные исследования, выполнена обработка и интерпретация полученных результатов, сопоставление их с литературными данными, написание и оформление диссертационной работы. Подготовка публикаций выполнена лично или при активном участии автора, результаты работы опубликованы в 20 печатных работах.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 12 научных и научно-практических конференциях, в их числе 9 Международных конференций: «Нанотехнологии в сельском хозяйстве» (Москва, 2008); «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010); «ЕС - Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи» (Уфа, 2010); «Антропогенная трансформация природной среды» (Пермь, 2010); «Третье международное совещание по сохранению лесных генетических ресурсов Сибири» (Красноярск, 2011); «Актуальные проблемы ботаники и экологии» (Киев, 2011); «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (Ростов-на-Дону, 2011); «Синтез знаний в естественных науках. Рудник будущего: проекты, технологии, оборудование» (Пермь, 2011) и 3 Всероссийских с международным участием: «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010); «Симбиоз-Россия 2011» (Воронеж, 2011); «Биологические системы: устойчивость, принципы и механизмы функционирования» (Нижний Тагил, 2012); «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ, в их числе 4 статьи в журналах из перечня ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы и приложений. Общий объем диссертационной работы составляет 145 машинописных страниц, работа содержит 21 таблицу, 22 рисунка. Список литературы содержит 180 источников, из них 112 на иностранном языке.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность за руководство диссертационной работы научному руководителю д.б.н., профессору, заведующему кафедрой ботаники и генетики растений «Пермского государственного национального исследовательского университета» С. В. Боронниковой, за консультации д.б.н., профессору кафедры лесоводства и ландшафтного дизайна ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет» Ю.А. Янбаеву, за освоение современных методов молекулярно-генетического анализа руководителю группы по изучению генетики тополей Института сравнительной геномики растений Университета Эври Вал де Эссон (Франция) П. Файвре Рампан, за консультации при проведении биоинформационного анализа доценту лаборатории растительной геномики Института биотехнологии университета Хельсинки (Финляндия) Р.Н. Календарю, за консультации заведующему лабораторией экологии леса Естественнонаучного института ПГНИУ М. В. Рогозину, за помощь в

статистической обработке материала с использованием компьютерных программ коллегам по лаборатории и соавторам по публикациям.

РЕГИОН, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проведены в Пермском крае, входящем в состав Приволжского федерального округа. Пермский край расположен на восточной окраине Русской равнины и западном склоне Уральских гор, в бассейне верхней и средней Камы. В качестве объектов исследований избраны популяции вида тополь дрожащий или осина (Populus trémula L.). С 2007 по 2012 годы были проведены комплексные исследования 7-ми природных популяций Р. trémula, которые располагаются в разных участковых лесничествах: в Пермском (Ptl), Полазненском (Pt2), Кунгурском (Pt3), Суксунском (Pt4), Частинском (Pt5), Ильинском (Pt6) и Губахинском (Pt7) муниципальных районах Пермского края. Выделение ДНК из листьев растений проводили по методике Д. Роджерса (Rogers, 1985) с небольшими модификациями. Концентрацию и спектральную характеристику ДНК определяли на приборе Spectrofotometr™ NanoDrop 2000 («Thermo scientific», USA). Молекулярно-генетический анализ проведен в молекулярно-генетической лаборатории кафедры ботаники и генетики растений биологического факультета ПГНИУ с использованием 1SSR- (Inter Simple Sequence Repeats, Zietkiewicz et al., 1994). Амплификацию ДНК проводили в термоциклере Gene Amp PCR System 9700 («Applied Biosystems», США) по стандартной для ISSR-метода программе (Молекулярная генетика..., 2007). Всего было протестирвоано 20 ISSR-праймеров, из которых было избрано для дальнейшего анализа 5: Ml (AC)8CG, М27 (GA)8C, Х9 (ACC)6G, Х10 (AGC)6C, XI1 (AGC)6G. Температура отжига в зависимости от G/C состава праймеров варьировала от 46°С до 56°С. В качестве отрицательного контроля (К-) в реакционную смесь для проверки чистоты реактивов добавляли вместо ДНК 5 мкл денонсированной воды. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1,7% агарозном геле в lx TBE буфере (Tris-Borate-EDTA), окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе гель-документации Gel Doc XR («Bio-Rad», США).

Для определения длин фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 bp +1.5 + 3 Kb DNA Ladder, ООО «СибЭнзим-М», Москва) и программу Quantity One («Bio-Rad», USA). Для проверки

достоверности полученных результатов опыты (или ПЦР) повторяли не менее трех раз. Эффективность выявления полиморфизма ДНК 20 ISSR-PCR праймеров рассчитана в соответствии со шкалой 1-5 (Боронникова, Календарь, 2007). Проведен компьютерный анализ молекулярно-генетического полиморфизма ДНК с помощью компьютерных программ POPGENE 1.31 (Yeh et al., 1999) и специализированного макроса GenAlExô (Peakall, Smouse, 2006) для MS-Excel с определением доли полиморфных локусов (Williams et al., 1990) при Р95, абсолютного числа аллелей (п„), эффективного числа аллелей (nj (Kimura et al., 1964), ожидаемой гетерозиготности (Ht) (Nei, 1987). Для описания генетической структуры подразделенной популяции были использованы следующие параметры: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (Нт) во всей популяции, как мера общего генного разнообразия; ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляции ( tf v ), как мера ее внутрипопуляционного разнообразия; доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций (GiT) (Nei, 1975). Генетическое расстояние между популяциями ( D) определяли по формулам М. Нея (Nei, 1978; Nei et al., 1979). На основе матриц бинарных признаков были рассчитаны матрицы генетических различий (Nei, 1972), на основании полученной матрицы невзвешенным парно-групповым методом (UPGMA - unweighed pair-grup method using arithmetic average) были построены дендрограммы, отражающие степень родства исследуемых популяций по ISSR- и IRAP-спектрам при помощи компьютерных программ Treecon 1.3Ь и POPGENE 1.31.

Для детекции SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) амплификацию проводили в термоциклере Gene Amp PCR System 9700 («Applied Biosystems», USA), по программе: 2 мин - 94°C, следующие 35 циклов (94°С0 - 20секунд, 60°С - 20 сек (-1° каждый цикл), 72°С - 40 сек.) 68°С - 10 мин. Дизайн праймеров проведен в программе Primer 3 на основе генома P. trichocarpa в Институте растительной геномики (Франция). Предварительную детекцию продуктов амплификации проводили электрофорезом в 2% агарозном геле в 1х TBE буфере (Tris-Borate-EDTA), окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе гель-документации Gel Doc XR («Bio-Rad», USA). Для реакции секвенирования был использован Big Dye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems», USA), в качестве праймера была использована реверсная последовательность из пары праймеров, с которой была поставлена ПЦР.

Очистку продуктов реакции секвенирования от невступивших в реакцию меченых нуклеотидов осуществляли с помощью набора BigDye® XTerminator™ Purification Kit («Applied Biosystems», USA). Секвенирование синтезированных последовательностей проводили в ПЦР-лаборатории кафедры ботаники и генетики растений ПГНИУ (Россия) в 24-капиллярном генетическом анализаторе Genetic Analyzer 3500xL («Applied Biosystems», USA).

Секвенированные последовательности были сравнены с имеющимися последовательностями в генетической базе данных NCB1 посредством системы автоматического on-line выравнивания BLASTN 2.2.26+ на сайте NCBI http://www.ncbi.com. Множественное выравнивание последовательностей проводилось в MULTAL1N. При анализе популяционных генофондов Р. trémula использованы общепринятые подходы и методики (Lewontin, 1972; Nevo, 1987; Алтухов, 1995, 2003; Динамика...., 2004). Оценка состояния генофондов популяций проведена в соответствии с методикой C.B. Боронниковой (2009). Молекулярно-генетическая идентификация популяций изучаемого вида проведена на основании технологии, предложенной C.B. Боронниковой (2008) с учетом нуклеотидного полиморфизма. Статистическая обработка полученых данных проведена с использованием стандартных для популяционно-генетических исследований методов (Животовский, 1983, 1990; Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ POPULUS TREMULA L. С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ISSR-PCR МАРКЕРОВ

Проведен молекулярно-генетический анализ с использованием ISSR-PCR маркеров, амплифицированных пятью праймерами, в семи популяциях Р. trémula в Пермском крае (рис. 1). Среднее число фрагментов ДНК, выявляемых праймером, равнялось 23,8, максимальное - 27 (праймер Ml), а минимальное - 19 (праймер XII). Доля полиморфных локусов (Р,5), выявленных в результате ПЦР со всеми ISSR-праймерами в изученных популяциях, составила 0,731. Низкая доля полиморфных локусов установлена в популяциях Ptl и Pt5 (0,530 и 0,565 соответственно). При этом доля полиморфных локусов в популяциях, выявляемых отдельными праймерами,

варьировала от 0,200 (праймер Х9, Р15) до 0,933 (праймер М1, Р13, Р(6). Праймер М27 выявил низкие показатели полиморфизма ДНК в популяциях (Р95 =0,575), а праймер М1 - наиболее высокие (Р95 =0,815).

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 to 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Рис. 1. ISSR-спектр второй популяции Р. trémula (Pt2) с праймером Х10; Цифрами сверху обозначены номера проб, М - молекулярный маркер, цифрами слева обозначены длины фрагментов ДНК. Стрелками указаны некоторые полиморфные фрагменты ДНК

Наибольшее абсолютное число аллелей выявлено в популяциях Pt2 (л„ = 1,465) и Pt4 (и,=1,449). Эффективное число аллелей оказалось наибольшим в популяции Pt2 (и„ = 1,275). Наименьшие показатели абсолютного и эффективного числа аллелей отмечены в двух популяциях Pt6 («,=1,186; и„ =1,354) и Pt7 (я,=1Д41; п„=1,315). Ожидаемая гетерозиготность (Я£) на общую выборку составила 0,129. Самое высокое значение этого показателя выявлено в популяции Pt2 (Я4 =0,160), самое низкое, ниже практически в два раза, - в популяции Pt7 (Я^=0,088). В литературе встречаются показатели ожидаемой гетерозиготности для этого вида от 0,026 до 0,834 (Lexer et al., 2005).

Изучение генетической структуры популяций показало, что гетерозиготных генотипов в общей популяции (нт) Р. trémula составила 0,281, а ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляции (Яу) — 0,127 (табл. 1). Наименьшие показатели генетического разнообразия получены при анализе с праймером Х9 {иг =0,249, ЯЛ.=0,080), а наибольшее - с праймером М27 (#/ =0,308) и Ml (Я =0,162). Коэффициент подразделенности популяций (G.V, ) показывает, что на межпопуляционную компоненту приходится 55% генетического разнообразия (Ся =0,550). Это говорит о том, что на внутрипопуляционную составляющую разнообразия приходится меньшая доля общего разнообразия, что является закономерным для вида Р. trémula. При

сравнении уровень генетической дифференциации изученных популяций Р. trémula был значительно выше, чем у других видов тополя, исследованных с помощью AFLP (Chen et al., 2010) и SSR-маркеров (Wang, 2011; Li et al., 2006).

Таблица 1.

Генетическая структура семи популяций Р. trémula

lSSR-праймер Нт G.n

Ml 0,285 (0,023) 0,162 (0,012) 0,432

М27 0,308 (0,025) 0,147 (0,006) 0,521

Х9 0,249 (0,036) 0,080 (0,005) 0,681

Х10 0,296 (0,030) 0,130 (0,006) 0,559

XII 0,265 (0,035) 0,117(0,006) 0,557

На общую выборку 0,281 (0,030) 0,127 (0,007) 0,550

Примечание: Нт - ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в общей популяции; Hs - ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляции; GST - доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии; в скобках даны стандартные отклонения

Наименьшее генетическое расстояние отмечено между популяциями Pt6 и Pt7 (£>=0,089), а наибольшее - между популяциями Ptl и Pt6 (D =0,429). Кластерный анализ был проведен невзвешенным парно-групповым методом (UPGMA) и построена дендрограмма, отражающая степень родства исследуемых популяций (рис. 2).

На дендрограмме растения Р. trémula сформировали 7 кластеров, соответствующих исследованным семи популяциям.

0.6 0.5 0.-4 0.3 0.2 O.I

_781 Т.------------------------------------Р1_4

íooL

-----------------J ----------------------------------- Р[ ¡

L 100.

_____________ — ............ — ---------- Р|_3

Рис. 2. UPGMA-дендрограмма генетического сходства 7-ми популяций Р. trémula, построенная на основании полиморфизма ISSR-маркеров. Шкала сверху - генетические дистанции. На дендрограмме указаны значения бутстрепа (в %)

Узлы ветвления имеют высокий индекс бутстрепа (>78%), что говорит о достоверности межпопуляционных различий.

2. АНАЛИЗ ОДНОНУКЛЕОТИДНЫХ ЗАМЕН В СЕКВЕНИРОВАННЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯХ ДНК POPULUS TREMULA L.

В Институте Растительной геномики (Франция) разработана стратегия для изучения нуклеотидного разнообразия видов рода Populus (Paolucci, 2008), отобраны 27 генов-кандидатов, к которым разработаны 36 пар праймеров. С каждой из 36 пар праймеров была проведена ПЦР в качестве матрицы с геномной ДНК Р. trémula. Информативными для Р.trémula оказались 16 пар праймеров к 14 генам. Последовательности этих праймеров фланкируют гены или их элементы, вовлеченные в процессы, которые можно разделить на 4 группы: формирование клеточный стенки и клеточная дифференциация (PopLTPl, PopFLA, PtrCOBL4, РорСНТ), устойчивость к водному стрессу и дегидротации (Erecta, PopDhnl), биосинтез лигнина (Ptr4CLl, САМ1, F5H1, С4Н1, GH3-5) устойчивость к патогенам (PIN-T, TR-INH2, PatRelProt, OX-RED, RIB-PROT). Для анализа частот и расположения SNPs нами выбраны локусы, вовлеченные в процессы биосинтеза лигнина. У 5 локусов из генов группы биосинтеза лигнина (Ptr4CLl, САМ1, F5H1, С4Н1, GH3-5) были секвенированы последовательности и выявлены частоты SNPs в 7 популяциях Р. trémula (табл. 2).

Таблица 2.

SNPs в последовательностях 5 генов Р. trémula

Локус Последовательности праймеров (5'-3') Всего SNPs Кол-во замен синонимов Кол-во замен не синонимов

С4Н1 F-AATCTCTTTCAGTACTCCTTTGG R-GCAGCCTTCTCTCTTTAACC 1 1 0

PtrfCLl F- ААСТСАССАТСТСТСССТСТ R- CCTCCAGATTTTATCATCCTC 6 5 1

САМ1 F- GTGGATGCTGACAAGGACAA R- TCCACTTACAGAAATTTAAGAGAGG 4 3 1

F5H1 F- AACATCCATAGGCACCAAC R- CAGGGAATGAAATCAGACA 10 10 0

GH3-5 F- АСССАТСАТСАТТАССТСАА R- TTGAATGCCCAAGTTCTG 8 6 2

Всего: 29 25 4

Всего в секвенированных последовательностях 5 локусов Р. trémula выявлено 29 SNPs. Суммарная длина анализированной последовательности по всем пяти локусам у каждого растения составила 2955 пн. Самым консервативным в изученных генах Р. trémula является локус С4Н1. При множественном выравнивании обнаружено, что и у других видов этого рода

(Р. tremuloides Р. tríchocarpa и Р. tomentosa) локус С4Н1 достаточно консервативен. Проведен анализ нуклеотидного полиморфизма на предмет замены кодируемой аминокислоты. Всего 13,8% замен из обнаруженных приводили к замене кодируемой аминокислоты (рис.3).

2680 I

2690 I

AATGCAGCAGAGGAGAAT AATGCAGCAGAGGAGAAT AATGCAGCAGAGGAGAA1 AATGCAGCAGAGGAGAAT ААТ GCAGC AGAGGAGAAT AATGCAGCAGAGGAGAAT AAIGCAGCAGAGGAGAAT &ATGCAGCAGAGGAGAAC GTGkGAkGc|ATAAGA

2700 I

GTAkGAkGllATAAGA GTA ¡VGA MST ATAAGA GTA ÜGA ÜGT ATAAGA GTA \GÄ ATAAGA GTC &GA ÜAC ATAAGA GTT ÜGAiGC ATAAGA GTGUGAUIC ATAAGA

AATGCAGCAGAGGAGAAT AATGCAGCAGAGGAGAAT

GTC iGA&AC ATAAGA GTG ÜGA ЛАС WAAGA

_ В с

Обозначения: А —

2320 2330 2340

I I I

1 CTTTCAAACTTTAATAACCAATGAAGTA

2 TTTTCAAACTCTAA---CCAGT GAAGC A

3 CTTCCAACACTCAC---CCAGT GAAGCA

4 CTTCCAACACTCAC---CCAATGAAGCA

5 TAAT С С AC ААТ CAA---ACTGT GAAGTA

6 TAATCCACAATCAA---ACTGTGAAGCA

7 TAATCAACAGTCTA---ACAATGAATCA

8 TATCAATGCTGGAG---ATGAGACCCCA

9 TAATCCACAATCAA---ACTGT GAAGTA

10 TAATCAACAGTCTA---ACAATGAATCA

Рис. 3. Результаты множественного выравнивания, вставка триплета, кодирующего стоп-кодон; В - синонимичная замена нуклеотида, кодоны GTA, GTC, GTT кодируют одну и ту же аминокислоту валин (Val); С - несинонимичные замены: триплеты AGT и AGC кодируют сератонин (Ser), триплет ААС кодирует аспергин (Asn); 1 - Populus trémula, 2 - Medicago tmncatula, 3 - Glycine max, 4 - Glycine max, 5 - Populus trichocarpa, 6 - Populus trichocarpa, 7 - Vitts vinifera, 8 - Populus trichocarpa, 9 - Vitis vinifera, 10 - Arabidopsis lyrata.

Популяции Pt6 и Pt7 в большинстве случаев имели одинаковые частоты SNPs. В популяции Pt4 в двух случаях были обнаружены замены, которых не наблюдается в других популяциях, это замена A/G в 272 положении гена GH3-5 с частотой 0,500 и замена С/Т в 85 положении гена GH5-3 с частотой 0,375.

При сравнении нуклеотидного полиморфизма с аналогичными показателями двух других видов рода Populus у осины на территории Пермского края выявлен более высокий уровень нуклеотидной изменчивости, 1 SNP на каждые 92 нуклеотида (табл. 3).

Таблица 3.

Сравнение частот SNPs у трех видов рода Populus

Вид тополя Частота SNP

Общая UTR регион Экзон Интрон

P. nigra 1/112 1/78 1/201 1/46

P. trichocarpa 1/104 1/75 1/143 1/68

Р. trémula 1/92 1/77 - 1/51

В секвенированных последовательностях 5 генов в пермских популяциях Р. trémula наиболее часты замены в интронах, как и у других видов. Для кодирующих участков нами не выявлены полиморфные позиции в исследуемых пяти генах, вовлеченных в процесс биосинтеза лигнина.

3. АНАЛИЗ СОСТОЯНИЯ ГЕНОФОНДОВ ПОПУЛЯЦИЙ Р. TREMULA

Установленные нами при молекулярно-генетическом анализе параметры генетического разнообразия разделены на четыре группы. К первой группе относятся «Основные показатели генетического разнообразия», это доля полиморфных локусов (Р95) и ожидаемая гетерозиготность (IIЕ ). Вторую группу параметров генетического разнообразия составляют показатели выравненное™ частот локусов (К). Этот показатель рассчитан отдельно для частот локусов, выявленных ISSR-PCR маркерами, и частот однонуклеотидных полиморфных позиций. Показатели выравненное™ частот локусов, выявленные по этим двум типам маркеров, демонстрируют высокий коэффициент корреляции (0,96). Генетическую структуру и дифференциацию популяций предлагаем характеризовать показателем внутрипогтуляционного разнообразия (ц) и долей редких фрагментов ДНК (h). Четвертую группу показателей генофондов предлагается оценивать по таким показателям как число редких аллелей (R ) и коэффициент генетической оригинальности (КГО).

С использованием ISSR-метода анализа полиморфизма ДНК в Ptl, Pt4, Pt6, Pt7 популяциях Р. trémula выявлено по одному уникальному фрагменту ДНК, а в Pt2, Pt3, Pt5 - по 5 уникальных фрагментов ДНК. Нами предложено дополнение в технологию молекулярно-генетической идентификации древесных видов растений, которое заключается в том, что в молекулярно-генетическую формулу помимо идентификационных фрагментов ДНК, амплифицированных в результате ПЦР, вносятся и другие структурные изменения геномов, такие как делеции, дупликации, однонуклеотидные замены, выявленные при сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей после секвенирования геномной ДНК. Например, популяция Pt4 идентифицируется с помощью обнаружения однонуклеотидной замены С на А в 126 положении гена Erecta, при этом в записи молекулярно-генетической формулы указывается: Pt4_Erecta_SNP126"C/A". Популяция Pt5

идентифицируется наличием делеции пяти нуклеотидов AAEGA в интроне гена Erecta с 259 по 263 позицию. При этом в записи молекулярно-генетической формулы указывается: Pt5_Erecta_Del259-263"AATGA".

Для комплексной оценки состояния популяционных генофондов все избранные показатели генетического разнообразия переведены в разработанную нами пятибалльную шкалу оценки. Наибольшую сумму баллов по результатам пятибалльного оценивания восьми избранных показателей генетического разнообразия популяций - 34 балла из 40 - набрала популяция Pt4 (рис. 4).

Р95

Рис. 4. Оценка состояния генофонда популяции Pt4 Р. trémula.

Обозначения: Рп - доля полиморфных локусов; HF - ожидаемая гетерозиготность; К/ssr - коэффициент выравненное™ частот аллелей по результатам ISSR-PCR-маркирования; К$м> - коэффициент выравненное™ частот аллелей по результатам SNP-маркирования; р. - среднее число морф; h - доля редких морф; R - число уникальных фрагментов; КГО - коэффициент генетической оригинальности.

На втором месте популяция Pt3, которая набрала 30 баллов. Популяции Ptl, Pt2, Pt6 и Pt7 набрали 28, 26, 25 и 23 балла соответственно. Наименьшая сумма баллов по предложенной шкале оценивания наблюдается в популяции Pt5 - 19 баллов из 40 возможных. Популяции Pt5, Pt6 и Pt7 характеризуются также не выравненными оценками по предложенной пятибалльной шкале. На основе восьми показателей популяционного генетического разнообразия, переведенных в предложенную нами пятибалльную шкалу оценивания, мы предлагаем следующую шкалу оценки состояния генофондов древесных видов растений. Таким образом, установлено, что в удовлетворительном состоянии находятся генофонды 6 из изученных в Пермском крае популяций Р. tremida, а

в одной популяции (Pt5) отмечены процессы обеднения популяционного генофонда.

На основании результатов исследований даны следующие рекомендации:

1. Из изученных семи популяций Р. trémula в Пермском крае три популяции (Ptl, Pt3 и Pt4) рекомендуются нами в качестве модельных для генетических исследований лиственных древесных видов растений. Эти популяции характеризуются высоким уровнем генетического разнообразия, а также наиболее выровненными его показателями.

2. Разработанный метод генетической идентификации древесных видов растений, в котором в молекулярно-генетическую формулу помимо традиционных идентификационных фрагментов ДНК (ISSR-PCR), вносятся позиции и частотные характеристики SNP-маркеров, рекомендуется для определения места происхождения древесины.

3. Данные молекулярно-генетического анализа рекомендуется использовать для идентификации видов рода Populus и гибридных форм тополей.

4. При оценке состояния генофондов популяций лиственных древесных видов растений рекомендуется учитывать их специфические особенности, установленные как с использованием ISSR метода, так и с учетом SNPs и их частот.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что изученные в Пермском крае популяции Р. trémula характеризуются высоким уровнем генетического разнообразия (Pw=0,731; Не=0,129; л.=1,217), при этом наибольшие значения изученных параметров отмечены в Pt4 (/>«=0,790; Яе=0,138; «,=1,225), а наименьшие - в Pt5 (Р,ъ-=0,565; tfe=0,120; п = 1,204).

2. Анализ генетической структуры популяций Р. trémula показал, что на межпопуляционную компоненту приходится 55% генетического разнообразии (G,T =0,550).

3. Генетические расстояния (D) между популяциями варьируют от 0,089 (между Pt6 и Pt7) до 0,429 (между Ptl и Pt6). Изученные растения Р. trémula сформировали на дендрограмме семь кластеров в строгом соответствии с исследованными семью популяциями.

4. Подтверждена информативность 16 из 36 пар праймеров, используемых в исследованиях по сравнительной геномике тополей, для амплификации 14 генов Р. trémula. Степень гомологии секвенированных последовательностей с аналогичными в базах данных 95-99%. В 5-ти генах Р. trémula выявлено 29 SNPs, из которых только 4 (13,8%) приводят к замене кодируемой аминокислоты.

5. В среднем частота SNPs в геноме представителей Р. trémula в Пермском крае по пяти изученным генам составила 1 SNPs на 92 нуклеотида, что на 13,0% выше чем в геноме P. trichocarpa и на 21,7% больше, чем в геноме P. nigra. Наибольшая частота SNPs в геноме Р. trémula была выявлена в интронах (1 SNPs на 51 нуклеотид), в экзонах изученных пяти генов SNP не обнаружено.

6. С использованием предложенного нами подхода дана оценка состояния 7-ми изученных популяций и установлено, что в удовлетворительном состоянии находятся генофонды 6 из изученных в Пермском крае популяций Р. trémula, а в одной популяции (Pt5) отмечены процессы обеднения популяционного генофонда.

7. На примере Р. trémula разработана и предложена система молекулярно-генетической идентификации популяций древесных видов растений, в которой в молекулярно-генетическую формулу помимо традиционных идентификационных фрагментов ДНК (ISSR-PCR), вносятся позиции и частотные характеристики SNP-маркеров.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Боронникова C.B., Светлакова Т.Н.. Бобошина И.В. Изучение генетического полиморфизма Populus trémula L. с использованием ISSR- и IRAP- маркеров // Аграрная Россия.-2009.-№2.-С.20-22.

2- Светлакова Т.Н.. Бобошина И.В., Нечаева Ю.С., Боронникова C.B. Генетическая дифференциация популяций Populus trémula L. в Пермском крае на основании полиморфизма ISSR-маркеров // Аграрный вестник Урала.-2012,-Вып. 3(95) март.-С.11-13.

3- Светлакова Т.Н.. Боронникова C.B. Бобошина И.В. Детекция однонуклеотидных замен (SNP) в геноме Populus trémula L. в Пермском крае //

"Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова".-2012.-Т.8.-№2.-С.42-46.

4. Светлакова Т.Н., Бобошина И.В., Боронникова C.B., Нечаева Ю.С. Эколого-генетический анализ популяционной структуры Populus trémula L. в Пермском крае// Экологическая генетика.-2012.-Вып.З.-С.37-40.

Публикации в других изданиях

1. Боронникова C.B., Тихомирова H.H., Светлакова Т.Н., и др. Использование микросателлитов для анализа геномов редких видов растений // Нанотехнологии в сельском хозяйстве: Доклады Международной научно-практической конференции.-Москва, 2008.-С. 107-108.

2. Светлакова Т.Н., Бобошина И.В., Королева Ю.А. Боронникова C.B. Использование ДНК-технологий для оценки состояния популяций ресурсных видов растений // Нанотехнологии в сельском хозяйстве: Доклады Международной научно-практической конференции.-Москва, 2008.-С.109-110.

3. Светлакова Т.Н., Бобошина И.В., Боронникова C.B. ISSR-маркирование генома Populus trémula L. // Биотехнология начала III тысячелетия: Сборник тезисов Междунар. науч. конф.—Саранск, 2010.-С.86.

4. Светлакова Т.Н. Сохранение генетического разнообразия Populus trémula L. посредством молекулярно-генетического анализа // Сборник тезисов III Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010».-Нижний Новгород, 2010-С.110-111.

5. Бобошина И.В., Боронникова C.B., Светлакова Т.Н. и др. Молекулярно-генетическая идентификация, штрихкодирование и паспортизация растений // Международная конференция с элементами научной школы для молодежи «ЕС - Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи» в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России».-Уфа, 2010.-С.65-67.

6. Светлакова Т.Н., Боронникова C.B., Бельтюкова H.H., Бобошина И.В. Анализ генетического разнообразия популяций Populus trémula L. в Пермском крае // Международная конференция с элементами научной школы для молодежи «ЕС - Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи» в рамках Федеральной

целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России».-Уфа, 2010.-С.272-273.

7. Бельтюкова H.H., Боронникова C.B., Светлакова Т.Н., Бобоишна И.В. Технология оценки популяционных систем и генетических ресурсов редких и практически значимых видов растений // Антропогенная трансформация природной среды: материалы междунар. конференции.-Пермь, 2010.-Т.З-С.276-282.

8. Боронникова C.B., Мандрица С.А., Кокаева З.Г., Суслонов A.B., Михеева О.В., Тихомирова (Бельюкова) H.H., Дрибноходова О.П., Светлакова Т.Н., Казьминых Т. В. Динамика генетического разнообразия и структуры популяционных систем ресурсных растений Пермского края при антропогенных воздействиях // Региональный конкурс РФФИ-Урал: Результаты научных исследований, полученные за 2007-2009 гг. Сборник статей Ч.2.-Пермь, Екатеринбург, 2010.-С.63-66.

9. Светлакова Т.Н., Бобошина И.В., Боронникова C.B. Молекулярно-генетический анализ Populus tremida L. в Пермском крае // Симбиоз Россия 2011: материалы IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов, Всероссийская биологическая ассоциация «Симбиоз Россия».-Воронеж, 2011.-С.212-215.

10. Светлакова Т.Н.. Боронникова C.B., Бобоишна И.В. Генетическая структура популяций Populus trémula L. в Пермском крае // Материалы Третьего, международного совещания по сохранению лесных генетических ресурсов Сибири.-Красноярск, 2011.-С. 126.

11 .Светлакова Т.Н.. Бобошина И.В., Бельтюкова H.H., Горохова Т.В., Боронникова C.B. Применение ISSR-маркирования в современных ботанических исследованиях // Материалы международной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы ботаники и экологии».-Киев, 2011.-С.201-202.

12. Боронникова C.B., Бельтюкова H.H., Светлакова Т.Н., Бобошина И.В. Анализ полиморфизма ДНК на основе тандемных повторов геномов растений // Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины: Мат-лы IV Междунар. науч.-практ. конф.-Ростов-на-Дону, 2011.-С.44-45.

13. Боронникова C.B., Бельтюкова H.H., Светлакова Т.Н.. Бобоишна И.В., Нечаева Ю. С., Кольцов С.А. Анализ полиморфизма ДНК геномных маркеров растений с целью изучения биоразнообразия // Материалы международной научной конференции «Синтез знаний в естественных науках. Рудник будущего: проекты, технологии, оборудование».-Пермь, 2011.-С.288-292.

14. Гринчук H.В., Светланова Т.Н., Рогозин М.В.. Боронникова C.B. Оценка состояния осинников Пермского края // Вестник молодых ученых ПГНИУ: сб. науч. тр.: в 2 т. / отв. ред. E.H. Батурин.-Пермь, 2011.-Т.1.-С.206-213.

Л Светланова Т.Н.. Боронникова C.B., Бобошина КВ., Рогозин М.В. Изучение генетического разнообразия популяций тополя дрожащего в Пермском крае // Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биологические системы: устойчивость, принципы и механизмы функционирования».-Нижний Тагил, 2012.—С.161-163.

Светланова Т.Н., Боронникова C.B., Бобошина ИВ. Детекция однонуклеотидных замен (SNP) в генах биосинтеза лигнина Populus tremida L. как модельная система молекулярной идентификации и отбора перспективных для плантационного выращивания древесных растений // Материалы международной конференции "Биология - наука XXI века".-Москва, 2012,-С.118-122.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

BLAST - Basic Local Alignment Search Tool

C4H - trans-cinnamate 4-monooxygenase

CAM - cell adhesion molecules

F5H - flavonoid 3'-hydroxylase

GH3-5 - GH3 family protein

ISSR - Inter-Simple Sequence Repeats

NCB1 -National Center for Biotechnology Information

Ptr4CL - P. trichocarpa 4-Coumarate:CoA ligase,

SNPs - Single Nucleotide Polymorphisms

UPGMA - unweighed pair-grup method using arithmetic average

Подписано в печать 03.10.2012 г. Формат 60x84Xs. Усл. печ. л. 1,16.

Тираж 150 экз. Заказ №278. 614990, г. Пермь, ул. Букирева ,15 Типография ПГНИУ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Светлакова, Татьяна Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВИДОВ РОДА POPULUSL.

1.1. Изучение генетической компоненты биологического разнообразия.

1.2. Биологические и экологические особенности видов рода Populus L.

1.3. Популяционно-генетические исследования Р. trémula в Российской Федерации.

1.4. Применение и перспективы использования Р. trémula.

1.5. Populus L. - модельный род для генетики древесных растений.

1.6. Исследований тополей с применением молекулярно-генетических маркеров.

1.7. Изучение генов Р. trémula, вовлеченных в процессы биосинтеза лигнина.

ГЛАВА 2. РЕГИОН, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Регион исследований.

2.2. Объекты исследований.

2.3. Методы исследований.

2.3.1. Выделение ДНК.

2.3.2. ISSR-анализ полиморфизма ДНК.

2.3.3. Компьютерный анализ данных.

2.3.4. Определение нуклеотидной последовательности генов Р. trémula.

2.3.5. Детекция SNP.

2.3.6. Определение и оценка состояния генофондов популяций.

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ POPULUS TREMULA L. С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ISSR-PCR МАРКЕРОВ.

3.1. Анализ полиморфизма ISSR-PCR маркеров в популяциях Р. trémula

3.2. Оценка генетического разнообразия популяций Р. trémula.

3.3. Генетическая структура и межпопуляционная дифференциация

Р. trémula в Пермском крае.

ГЛАВА 4. АНАЛИЗ ОДНОНУКЛЕОТИДНЫХ ЗАМЕН В СЕКВЕНИРОВАННЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯХ ДНК POPULUS TREMULA L.

4.1. Анализ эффективности праймеров.

4.2. Идентификация секвенированных последовательностей

ДНК Р. trémula.

4.3. Анализ SNP в изученных генах Р. trémula.

ГЛАВА 5. АНАЛИЗ СОСТОЯНИЯ ГЕНОФОНДОВ ПОПУЛЯЦИЙ POPULUS TREMULA L.

5.1. Характеристика генофондов популяций Р. trémula на основании полиморфизма ISSR-PCR маркеров и однонуклеотидных замен.

5.2. Молекулярно-генетическая идентификация популяций Р. trémulas Пермском крае.

5.3. Оценка состояния генофондов популяций Р. trémula в Пермском крае.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетический анализ и оценка состояния генофондов популяций Populus tremula L. в Пермском крае"

Актуальность проблемы. Исследования, выполняемые в целях оптимизации природопользования и охраны биоразнообразия на популяционном уровне, относятся к наиболее приоритетным направлениям развития науки (Комплексная программа развития биотехнологий., 2012). Эффективные мероприятия по охране биоразнообразия невозможны без внимания к его генетической компоненте. Вследствие рубок, болезней, загрязнения окружающей среды, осуществления индивидуального отбора в селекции, наблюдается снижение генетического разнообразия лесов (Ирошников и др., 1973; Путенихин, 1993; Видякин, 2004). Для разработки стратегии сохранения и рационального природопользования лесных ресурсов, обеспечивающей удовлетворение экономических потребностей общества и охрану биоразнообразия природных сообществ, необходимы глубокие знания о состоянии генофондов основных лесообразующих пород деревьев (Динамика популяционных., 2004). Популяционный подход при изучении главнейших видов-лесообразователей важен для понимания закономерностей формирования лесных насаждений и открывает перспективу эффективного исследования эволюционного процесса у древесных растений (Путенихин, 2000). Только глубокое знание тонкой популяционно-генетической структуры древесных растений позволит проводить мониторинг ее изменений и прогнозировать нарушение ее стабильного воспроизводства во времени (Политов, 2007). Род Populus L. (тополь) является модельным для генетических исследований древесных растений благодаря относительно небольшому размеру генома и огромным адаптивным возможностям (Brunner et al., 2004). Североамериканский вид тополя Populus trichocarpa Torr, и A.Gray (западный бальзамический тополь, или калифорнийский тополь) был первым древесным видом растений, геном которого был полностью секвенирован (Tuskan et al., 2006). Populus trémula L. (тополь дрожащий или осина) - один из важнейших лесообразующих и практически значимых древесных видов растений, что подтверждается использованием данного вида в различных отраслях народного хозяйства развитых стран, таких как США, Канада, Финляндия, Япония, Китай (Gordon et al., 1996; Geburek, Turok, 2005;). В настоящее время развитие ДНК-технологий, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР), открыло новые методические возможности для изучения генетических факторов, обуславливающих особенности динамики популяционно-генетической структуры тех или иных видов древесных растений (Ветчинникова и др., 2012).

Цель исследований - изучение генетической компоненты биологического разнообразия и оценка состояния генофондов популяций P. tremula в Пермском крае.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) провести молекулярно-генетический анализ популяций P. tremula с использованием ISSR-маркеров;

2) изучить генетическую структуру популяций P. tremula, определить генетические расстояния между популяциями P. tremula;

3) определить нуклеотидные последовательности генов P. tremula, которые используются для сравнительной геномики видов рода Populus и выявить в них SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms);

4) проанализировать частоту и расположение SNPs в изученных генах и провести их сравнительный анализ с SNPs других видов рода Populus;

5) провести молекулярно-генетическую идентификацию популяций P. tremula в Пермском крае с использованием ISSR-PCR маркеров и SNPs;

6) дать оценку состояния генофондов популяций P. tremula в Пермском крае.

Научная новизна исследований. Впервые в Пермском крае проведено комплексное изучение генофондов популяций P. tremula. Генетическое разнообразие оценено с использованием межмикросателлитного, или ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats)-MeTOfla анализа полиморфизма ДНК. Изучена генетическая дифференциация популяций P. tremula, установлены генетические расстояния, определены коэффициенты генетической оригинальности популяций (КГО). Секвенированы последовательности пяти генов P. tremula. Впервые проведены исследования по детекции SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) в геноме пермских популяций P. tremula. Проведен сравнительный анализ частот SNP P. tremula с частотами SNPs двух других видов рода Populus. Впервые на основании данных молекулярно-генетического анализа разработан подход и дана оценка состояния семи популяций P. tremula в Пермском крае. Разработана модельная система молекулярно-генетической идентификации древесных видов растений на основе ДНК маркеров (ISSR-PCR маркеров) с учетом SNP.

Практическая значимость полученных результатов диссертационной работы заключается в разработке подхода к определению состояния генофондов популяций лиственных древесных видов растений на примере P. tremula и модельной системы генетической идентификации древесных видов растений на основе полиморфизма ISSR-PCR маркеров и SNP. Результаты исследований, научные выводы и рекомендации могут быть использованы при разработке программ сохранения и развития генетических ресурсов P. tremula. Результаты работы внедрены в учебный процесс ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» (ПГНИУ) и ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет», что подтверждено актами внедрения. Полученные результаты и практические рекомендации диссертации предлагаются для использования Министерством природных ресурсов, научными учреждениями, высшими учебными заведениями, для разработки программ сохранения и рационального использования генофонда вида на популяционной основе, для генетической идентификации древесных видов растений, включая определения места происхождения древесины. Результаты исследований могут быть использованы для оптимизации методов и мер сохранения генетической компоненты биологического разнообразия популяционных систем лиственных древесных видов растений и в других регионах страны.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена при частичной финансовой поддержке приоритетного национального проекта «Образование», гранта РФФИ рурала № 07-0496032 «Динамика генетического разнообразия и структуры популяционных систем ресурсных растений Пермского края при антропогенных воздействиях» (2007-2009 гг.), Аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (2009-2010 гг.), НИР «Оценка состояния генофондов и популяционных систем ресурсных видов растений при естественных колебаниях и антропогенной трансформации среды с использованием новых геномных и биоинформационных технологий» (2012-2014 гг.) государственного задания на оказание услуг Министерства образования и науки РФ, программы развития ПГНИУ «Рациональное природопользование: технологии прогнозирования и управления природными и социально-экономическими системами» (2010-2019 гг.), Международного договора о сотрудничестве ПГНИУ и Университета Эври (Франция).

Личное участие автора. Автором лично проведены полевые и лабораторные исследования, выполнена обработка и интерпретация полученных результатов, сопоставление их с литературными данными, написание и оформление диссертационной работы. Подготовка публикаций выполнена лично или при активном участии автора, результаты опубликованы в 20 печатных работах.

Благодарности. Выражаю глубокую благодарность научному руководителю д.б.н., заведующему кафедрой ботаники и генетики растений ПГНИУ С. В. Боронниковой, за консультации д.б.н., профессору кафедры лесоводства и ландшафтного дизайна ФГБОУ ВПО «БашГАУ» Ю.А. Янбаеву, за освоение современных методов молекулярно-генетического анализа руководителю группы по изучению генетики тополей Института сравнительной геномики растений Университета Эври (Франция) П. Файвре Рампан, за консультации доценту университета Хельсинки (Финляндия) Р.Н. Календарю, заведующему лабораторией экологии леса ЕНИ ПГНИУ М. В. Рогозину, за помощь в статистической обработке материала с использованием компьютерных программ коллегам по лаборатории и соавторам по публикациям. Особая благодарность родным и близким.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Светлакова, Татьяна Николаевна

выводы

1. Установлено, что изученные в Пермском крае популяции Р. trémula характеризуются высоким уровнем генетического разнообразия (/^5=0,731; Не=0,129; ие=1,217), при этом наибольшие значения изученных параметров отмечены в Pt4 (/95=0,790; Не=0,138; «е=1,225), а наименьшие - в Pt5 (Р95=0,565;Яе=0,120; п = 1,204).

2. Анализ генетической структуры популяций Р. trémula показал, что на межпопуляционную компоненту приходится 55% генетического разнообразии (Gsr=0,550).

Пермском крае популяций P. tremula, а в одной популяции (Pt5) отмечены процессы обеднения популяционного генофонда.

7. На примере P. tremula разработана и предложена система молекулярно-генетической идентификации популяций древесных видов растений, в которой в молекулярно-генетическую формулу помимо традиционных идентификационных фрагментов ДНК (ISSR-PCR), вносятся позиции и частотные характеристики SNP-маркеров.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

BLAST - Basic Local Alignment Search Tool

C4H - trans-cinnamate 4-monooxygenase

CAM - cell adhesion molecules

F5H - flavonoid З'-hydroxylase

GH3-5 - GH3 family protein

ISSR - Inter-Simple Sequence Repeats

NCBI-National Center for Biotechnology Information

Ptr4CL - P. trichocarpa 4-Coumarate:CoA ligase,

SNPs - Single Nucleotide Polymorphisms

UPGMA - unweighed pair-grup method using arithmetic average

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Светлакова, Татьяна Николаевна, Пермь

1. Алтухов, Ю.П. Генетика популяций и сохранение биоразнообразия / Ю.П. Алтухов // Соросовский образоват. журн. 1995. - №1. - С.32-43.

2. Алтухов, Ю.П. Генетические процессы в популяциях: учеб. пособие. 3-е изд., перераб. и доп. / Отв. ред. JI.A. Животовский. М.: ИКЦ «Академкнига». - 2003. - 431 с.

3. Альбенский, А. В. Гибридизация деревьев : автореф. дис. . докт. биол. наук. М., 1948.-316 с.

4. Богданов, П.Л. Тополя и их культура / П.Л. Богданов. М.: Лесная промышленность. -1965. - 104 с.

5. Бородина, Т.И. Методы детекции SNP Электронный ресурс. // Практическая Молекулярная Биология. URL: http://molbiol.edu.ru/review/0403b.html (дата обращения: 22.05.2011).

6. Боронникова, C.B. Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация редких и находящихся под угрозой уничтожения видов растений / C.B. Боронникова. Пермь: Перм. ун-т. - 2008. - 120 с.

7. Боронникова, C.B. Молекулярно-генетический анализ генофондов редких и исчезающих видов растений Пермского края: автореф. дис. док. биол. наук. Уфа, 2009. - 44 с.

8. Ветчинникова, Л.В. Оценка генетического разнообразия популяций карельской березы в Карелии с помощью микросателлитных маркеров /

9. Л.В. Ветчинникова, А.Ф. Титов, Л.В. Топчиева, НЛ. Рендаков // Экологическая генетика. 2012. - Вып. 1. - С. 34-37.

10. Видякин, А.И. Популяционная структура сосны обыкновенной на востоке Европейской части России : автореф. дис. . докт. биол. наук. -Екатеринбург, 2004. 48 с.

11. Газизуллин, А.Х. Результаты выращивания различных генотипов осины в ГБУ «Сабинский учебно-опытный лесхоз» Республики Татарстан / А.Х. Газизуллин, Н.Р. Гарипов, В.И. Чернов и др. // Аграрная Россия. 2009а. - Специальный выпуск. - С. 17-18.

12. Газизуллин, А.Х. Формы осины в лесах Республики Татарстан / А.Х. Газизуллин, В.И. Чернов, Н.Р. Гарипов и др. // Аграрная Россия. -20096. Специальный выпуск. - С. 19-20.

13. Гарипов, Н.Р. Перспективы применения биотехнологических разработок в целях повышения продуктивности осинников Республики Татарстан / Н.Р. Гарипов, В.И. Чернов, Р.И. Исмагилов // Аграрная Россия. 2009. - Специальный выпуск. - С. 135-136.

14. География Пермского края. 4.1. Природная (физическая) география / H.H. Назаров.- Пермь 2006.- 139 с.

15. География Пермского края. Ч. II. Социально-экономическая география: учеб. пособие / Пермь: Перм.ун-т. 2008. - 206 с.

16. Глазко, Т.Т. Молекулярно-генетические подходы в селекции зерновых / Т.Т. Глазко, В.И. Глазко//Изв. ТСХА. 2006. - №4.- С. 100-107.

17. Гостимский, С.А. Изучение организации и изменчивости генома растений с помощью молекулярных маркеров / С.А. Гостимский, З.Г. Кокаева, Ф.А. Коновалов // Генетика. 2005. - Т. 41. - № 4. - С. 480490.

18. Гречкин, В.П. Вредители и болезни тополей и меры борьбы с ними / В.П. Гречкин, А.И. Воронцов. М: Гослесбумиздат, 1962. - 150 с.

19. Девяткова, И. Лесное хозяйство Пермского края / И. Девяткова // Экология Прикамья // «Промышленная безопасность и экология». -2008.-с. 1

20. Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях / под ред. Ю.П. Алтухова. М.: Наука. - 2004. - 619 с.

21. Елисеев, С.Г. Влияние морфологических форм дерева на технологические и эксплуатационные свойства древесины / С.Г. Елисеев, В.Н. Ермолин // Хвойные бореальной зоны. 2009. - №2.-С.284-288

22. Животовский, Л.А. Показатель внутрипопуляционного разнообразия / Л.А. Животовский // Журн. общ. биологии. 1980. - Т. 41 - № 6- С. 828-836.

23. Животовский, Л.А. Популяционная биометрия / Л.А. Животовский -М.: Наука.-1991.-271 с.

24. Иванников, С.П. Разведение и выращивание тополей и осины в лесостепи / С.П. Иванников. М.: ЦБНТИлесхоз. - 1966. - 49с.

25. Иванников, С.П. Тополь / С.П. Иванников. М.: Лесная промышленность. - 1980. - 85 с.

26. Иллюстрированный определитель растений Пермского края / С.А Овеснов, Е.Г. Ефимик, Т.В. Козьминых и др./ под ред. д.б.н. С.А. Овеснова. Пермь: Книжный мир. - 2007. - 743с.

27. Ирошников, А.И. Методика изучения внутривидовой изменчивости древесных пород / А.И. Ирошников, С.А. Мамаев, Л.Ф. Правдин , М.А. Щербакова // М.: ЦНИИЛГиС. 1973. - 32 с.

28. Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделееева. 2007. -4.2. - С.121.

29. Карпачевский, M.JI. Законодательные инструменты для сохранения биологического разнообразия при рубках леса / M.JI. Карпачевский // Устойчивое лесопользование. 2007. - № 1(13). - С. 8-13.

30. Колесникова, М.А. Использование молекулярных маркеров для картирования генов устойчивости (QTL) к ложной мучнистой росе у жемчужного проса: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Москва, 2001. -20 с.

31. Комплексная программа развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года. Москва, 2012. - 120 с.

32. Конвенция о биологическом разнообразии Электронный ресурс. Рио-де-Жанейро, 1992. URL: http://www.isu.ru/inst/botcad/cbd/cbd rus.htm (дата обращения: 10.09.2012)

33. Консенсусный документ по биологии тополя Populus L. Париж. 2000. -25с.

34. Коротаев, Н.Я. Почвы Пермской области / Пермь: Перм.кн.изд-во., 1962.-280 с.

35. Лакин, Г.Ф. Биометрия: учеб. пособие для биол. спец. вузов 4-е изд., перераб. и доп. - М.: Высш. шк. - 1990. - 352 с.

36. Лебедев, В.Г. Продовольственная безопасность и трансгенные продукты // Россия в окружающем мире: 2004 (Аналитический ежегодник). Отв. ред. Н. Н. Марфенин/Под общ. ред.: Н. Н. Марфенина, С. А. Степанова.— М.: МодусК — Этерна, 2005.—С. 128150

37. Машкина, О.С. Микроклональное размножение хозяйственно ценных генотипов осины / О.С. Машкина, Ю.Н. Исаков // Сохранение, изучение и воспроизводство генетических ресурсов лесных древесных растений: сб. науч. тр. Воронеж. - 2007. - С. 47-58.

38. Михайлов, JI.E. Осинники. M.: Лесная промышленность - 1972. - 119 с

39. Молекулярная генетика: учеб.-метод, пособие / под ред C.B. Боронниковой. Пермь: Перм. ун-т. - 2007. - 150 с.

40. Овеснов, С.А. Конспект флоры Пермской области / С.А. Овеснов. -Пермь: Изд-во Перм. Ун-та. 1997. - С. 82.

41. Падутов, В.Е. Методы молекулярно-генетического анализа / В.Е. Падутов, О. Ю. Баранов, Е. В. Воропаев. Минск. - 2007. - 176 с.

42. Политов, Д.В. Генетика популяций и эволюционные взаимоотношения видов сосновых (сем. Pinaceae) северной Евразии : автореф. докт. дис. -Москва, 2007. 49 с.

43. Политов, Д.В. Применение молекулярных маркеров в лесном хозяйстве для идентификации, инвентаризации и оценки генетического разнообразия лесных ресурсов / Д.В. Политов // Лесохозяйственная информация. 2008. - Т. 3-4. - С. 24-27.

44. Путенихин, В.П. Лиственница Сукачева на Южном Урале (изменчивость, популяционная структура и сохранение генофонда) / В.П. Путенихин. Уфа: УНЦ РАН, 1993. - 195 с.

45. Путенихин, В.П. Популяционная структура и сохранение генофонда хвойных видов на Урале: Автореф. дисс. . докт. биол. наук. / В.П. Путенихин. Красноярск, 2000. - 48 с.

46. Путенихин, В.П. Лиственница Сукачева на Урале: изменчивость и популяционно-генетическая структура / В.П. Путенихин, Г.Г. Фарукшина, З.Х. Шигапов. М.: Наука, 2004. - 276 с.

47. Путенихин, В.П. Ель сибирская на Южном Урале и в Башкирском Предуралье (популяционно-генетическая структура) / В.П. Путенихин, З.Х. Шигапов, Г.Г. Фарукшина. M.: Наука, 2005. - 180 с.

48. Рогозин, М.В. К обоснованию необходимого количества лесных генетических резерватов для Пермского края / М.В. Рогозин, А.Ю. Запоров, A.B. Жекин // Вестник Пермского университета. Биология. -2007.-Выпуск 5 (10).-С. 161-171.

49. Рукавцова, Е.Б. Получение и характеристика трансгенных растений, синтезирующих новые биологически активные соединения: Автореф. дис. . докт. биол. наук. -Пущино, 2009. 48с.

50. Русин, Н.С. Повышение продуктивности лесов путем создания плантационных культур быстрорастущих пород / Н.С. Русин // Лесохозяйственная информация. 2008. - № 3-4. - С. 27-28.

51. Светлакова, Т.Н. (а) Генетическая дифференциация популяций Populus trémula L. в Пермском крае на основании полиморфизма ISSR-маркеров / Т.Н. Светлакова, И.В. Бобошина, Ю.С. Нечаева, и др. // Аграрный вестник Урала. Вып. 3(95) март - 2012. - Стр. 11-13.

52. Семериков, Л.Ф. Популяционная структура древесных растений (на примере видов дуба европейской части СССР и Кавказа) / Л.Ф. Семериков. М.: Наука, 1986. - 140 с.

53. Сиволапов, А.И. Интерогрессивная гибридизация тополей породы LEUCE DUBY и ее значение в селекции // Биотехнология в ФЦП «Интеграция»: тез. докл. заочной науч.-практич. конф. Санкт-Петербург. - 1999. - С. 16-17.

54. Скворцов, A.K. Полиморфизм бальзамических тополей (Populus L. Секция Tacamahaca) по данным ISSR маркирования / А.К. Скворцов, С.С. Беэр, И.А. Шанцер // Молекулярная систематика и биосистематика. 2009. - С. 76-77.

55. Соболев, В.В. Использование ISSR-маркеров для молекулярно-генетической идентификации и паспортизации сортов малины /В.В. Соболев, Г.И. Карлов, А.Г. Соболева и др. // Сельскохоз. биология. -2006.-№5.-С. 48-52.

56. Старова, Н.В. Селекция ивовых / Н. В. Старова. — М.: Лесн. пром-ть, 1980. —205 с.

57. Тахтаджян, А.Л. Система магнолиофитов. Л.: Наука. Ленингр. отд-ие. - 1987.-438 с.

58. Топчиева, Л.В. Молекулярно-генетический анализ популяций карельской березы на основе использования ISSR-ПЦР маркеров / Л.В. Топчиева, Н.Л. Рендаков, Л.В. Ветчинникова // Аграрная Россия. -2009. Специальный выпуск. - С. 144-145.

59. У штекер, Р. Сообщества и экосистемы / Р. Уиттекер. М.: Прогресс, 1980.-326 с.

60. Флора СССР / под ред. В.Л. Комарова. М-Л.: Изд-во АН СССР, 1936. -Т.5.-С. 226-227.

61. Хедрик, Ф. Мир биологии: генетика популяций / пер. с англ. A.A. Лушниковой, Н.В. Петровой. М.: Техносфера, 2003. - 592 с.

62. Чесноков, Ю.В. ДНК фингерпринтинг и анализ генетического разнообразия у растений / Ю.В. Чесноков // Сельскохозяйственная биология. - 2005. - № 1. - С.20-40.

63. Шабунин, Д.А. Получение посадочного материала быстрорастущих форм осины с использованием метода in vitro и закладки плантаций / Д.А. Шабунин, В.А. Подольская, H.A. Бовичева // Лесохозяйственная информация. 2008. - № 3-4. - С.51-53.

64. Юмагужина, Н.С. Популяционно-ботаническая характеристика осинников Южного Урала: автореф. дис. . канд. биол. наук. -Оренбург, 2005.- 119с.

65. Яблоков, А.С. Воспитание и разведение здоровой осины / А.С. Яблоков. М.: Гослесбумиздат, 1963. - 440 с.

66. Abzhanov, A. Are we there yet? Tracking the development of new model systems / A. Abzhanov, C.G. Extavour, A. Groover et al. // Trends Genet. — 2008.-№24.-P. 353-360.

67. Barnes, B.V. The clonal growth habit of American aspens / B.V. Barnes // Ecology. 1966. - №47. - P. 439-447.

68. Barnes, B.V. Natural variation and delineation of clones of Populus tremuloides and P. grandidentata in northern Lower Michigan / B.V. Barnes // Silvae Genet. 1969. - V.18. - P. 130-142.

69. Berrang, P. Natural selection for ozone tolerance in Populus tremuloides: an evaluation of nationwide trends / P. Berrang, D.F. Karnosky, J.P. Bennett // Can. J. For. Res.- 1991.-№21.-P. 1091-1097.

70. Bevan, M. The Arabidopsis genome: A foundation for plant research / M. Bevan, W.Sean//Genome Res.-2005.-№15.-P. 1632-1642

71. Blackburn, K.B. A preliminary account of the chromosomes and chromosome behaviour in the Salicaceae / K.B. Blackburn, J.W.H. Harrison // Ann. Bot. 1924. - 38. - P. 361-378.

72. Boerjan, W. Lignin biosynthesis / W. Boerjan, J. Ralph, M. Baucher // Annu Rev Plant Biol 2003. - № 54. - P. 519-549.

73. Boerjan, W. Biotechnology and the domestication of forest trees / W. Boerjan // Curr. Opin. Biotechnol. 2005. - №16. - P. 159-66.

74. Brissette, J.C. Comparisons of phenology and growth of Michigan and western North American sources of Populus tremuloides / J.C. Brissette, B.V. Barnes, // Can. J. For. Res. V.14. - 1984. - 789-793.

75. Brookes, A.J. The essence of SNP / A.J. Brookes // Gene. 1999. - № 234. -P. 177-186.

76. Brunner, A.M. Poplar genome sequence: functional genomics in an ecologically dominant plant species / A.M. Brunner, V.B. Busov, S.H. Strauss // Trends in Plant Science. 2004. - Vol. 9. - № 1. - P. 49-56.

77. Butcher, P. A. Genetic mapping in acacias / P. A. Butcher, In S. Kumar, M. Fladung // Molecular genetics and breeding of forest trees. New York, USA.-2004.- P. 411-427.

78. Cervera, M.T. Genome mapping in Populus / M.T. Cervera, M.M. Sewell, P.F. Rampant et al. // Molecular genetics and breeding of forest trees. New York, USA. - 2004. - P. 387-410.

79. Cheliak, W.M. Genie diversity of natural populations of a clone-forming tree Populus tremuloides / W.M. Cheliak, B.P. Dancik // Genet. Cytol. -1982-V.24.-P. 611-616.

80. Chen, K. AFLP analysis of genetic diversity in Populus Cathayana Rehd originating from southeastern Qinghai-tibetan plateau of China / K. Chen, Peng Youhong, J. Рак 11 Can. J. Bot. 2010. - №42(1). - P. 117-127.

81. Corpet, F. Multiple sequence alignment with hierarchical clustering / F. Corpet // Nucl. Acids Res. 1988.-№16 (22).-P. 10881-10890.

82. Crow, J.F. Spontaneous mutation as a risk factor / J.F. Crow // Exp. Clin. Immunogenet. 1995.-№12.-P. 121-128.

83. Darlington, C.D. Chromosome atlas of flowering plants / C.D. Darlington, A.P. Wylie // MacMillan Co. London. - 1956. - P.3.

84. Davis, J. The Populus Genome Science Plan 2004-2009: Genetic Resources / J. Davis, J. Bohlmann, S. Jansson, L. Pearson et al. // 2004 http://www.ornl.gov/sci/ipgc/thejpopulusgenomescienceplan.pdf (дата обращения 10.09.2012).

85. Dunlap, J.M. Intraspecific variation in photosynthetic traits of Populus trichocarpa / J.M. Dunlap, J.H. Braatne, T.M. Hinckley et al. // Can. J. Bot. 1993.-№71.-P. 1304-1311.

86. Eckenwalder, J.E. Systematics and evolution of Populus. In Biology of Populus and its Imprications for Management and Conservation / J.E. Eckenwalder // NRC Research Press. 1996. - P. 7-32.

87. Einspahr, D.W. Natural variation and heritability in triploid aspen / D.W. Einspahr, J.P van Buijtenen, J.R. Peckham // Silvae Genet. 1963. -№12.-P. 51-58.

88. Einspahr, D.W. Genetics of quaking aspen / D.W. Einspahr, L.L. Winton // Res. Pap. WO-25. USDA For. Serv. - 1976. - P. 23.

89. Farmer, R.E. Latitudinal variation in height and phenology of balsam poplar / R.E. Farmer // Silvae Genet. 1993. - № 42.- P. 148-153.

90. Farmer, R.E. Genetic variation in dormancy relations of balsam poplar along a latitudinal transect in northwestern Ontario / R.E. Farmer, R.W. Reinholt // Silvae Genet. 1986. - №35.- P. 38-42.

91. Farmer R.E. Isozyme variation in balsam poplar along a latitudinal transect in northwestern Ontario / R.E. Farmer, W.M. Cheliak, P. Knowles, J. Barrett // Can. J. For. Res. 1988. - №18.-P. 1078-1081.

92. Farmer, R.E. Genetic variance and 'C' effects in balsam poplar rooting / R.E. Farmer, M. Freitag, K. Garlick // Silvae Genet. 1989. - №38. - P. 62-65.

93. Farmer, R.E. In Biology of Populus and its implications for management and conservation / R.E. Farmer, R.F. Stettler, H.D. Bradshaw, P.E. Heilman // Genecology of Populus. National Research Council Canada. - 1996. - P. 33-55.

94. Farrar, J.L. Trees in Canada / J.L. Farrar // Canadian Forest Service, Markham and Ottawa. 1995. - 132 p.

95. Filatti, J.J Efficient transfer of a glyphosate tolerance gene into tomato using Agrobacterium tumefaciens vector / J.J Filatti, J. Kiser, R. Rose // Bio/Technology. 1987. - № 5. - P. 726-730.

96. French, J.R. Variation in resistance of trembling aspen to Hypoxylon mammatum identified by inoculating naturally occurring clones / J.R. French, J.H. Hart // Phytopathology. 1978. - №68. - P. 485-489.

97. Gao, J. Application of ISSR markers to fingerprinting of elite cultivars (varietirs/ clones) from different sections of the genus Populus L. / J. Gao, S. Zhang, L. Qi // Silvae Genetica. 2006. - № 55(1). - P. 1-6.

98. Geburek, T. Conservation and Management of Forest Genetic Resources in Europe / T. Geburek, J. Turok // Arbora Publishers. 2005. - 694p.

99. Genetics and Genomics of Populus: (Plant Genetics and Genomics: Crops and Models) / Jansson, Stefan; Bhalerao, Rishikesh; Groover, Andrew (Eds.) // Hardcover 2010. - Vol. 8. - 368 p.

100. Ghosh, A. SSR Markers Linked to Mite (Polyphagotarsonemus latus Banks) Resistance in Jute {Corchorus olitorius L.) / A. Ghosh, S. Sharmin, S. Islam // Genet. Plant Breed. 2010. - № 46. - P. 64-74.

101. Gilchrist, E.J. Use of Ecotilling as an efficient SNP discovery tool to survey genetic variation in wild populations of Populus trichocarpa / E.J. Gilchrist, G.W. Haughn, C.C. Ying, S.P. Otto et al. // Mol. Ecol.- 2006. №15. - P. 78

102. Gordon, M.P. Phytoremediation of Trichloroethylene with Hybrid Poplars / M.P. Gordon, N. Choe, J. Duffy, G. Ekuan // ACS Symposium

103. Phytoremediation of Soil and Water Contaminants. Orlando, FL. - 1996. -Series 664. - №6. - P. 64-66.

104. Groover, A.T. The Populus homeodomox gene ARBORKNOX1 reveals overlapping mechanisms regulating the shoot apical meristem and the vascular cambium / A.T. Groover, S.D. Mansfield, S.P. DiFazio, G. Dupper et al. // Plant Mol. Biol. 2006. - P. 32

105. Han, H.K. High Frequency transformation of cottonwood (genus Populus) by Agrobacterium rhizogenes / H.K. Han, M.P. Gordon, S. Strauss // Canadian Journal of Forest Research. 1996. - 27. - P. 464.

106. Harakava R. Genes encoding enzymes of the lignin biosynthesis pathway in Eucalyptus / R. Harakava // Genetics and Molecular Biology. 2005. -№28.-P. 601-607.

107. Heilman, P.E. Genetic variation and productivity of Populus trichocarpa and its hybrids / P.E. Heilman, R.F. Stettler // II. Biomass production in a 4-year plantation. -1985. Can. J. For. Res. 15. - P. 384-388.

108. Heimburger, C. Poplar breeding in Canada. In Growth and utilization of poplars in Canada / C. Heimburger // Can. For. Bra. 1968. - № 1205. - P. 88-100.

109. Heinze, B. Genetic traces of cultivated hybrid poplars in the offspring of native Populus nigra in Austria / B. Heinze // Preslia. 2008. - V. 80. - P. 365-374.

110. Hu, W.-J. Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth / W.-J. Hu, S.A. Harding, J. Lung // Nature Biotech.-1999.-№ 17.-P. 808-812.

111. Hyun, J.O. Genetic variation in trembling aspen in Ontario based on isozyme studies / J.O. Hyun, O.P. Rajora, L. Zsuffa // Can. J. For. Res. -1987.-№17.-P. 1134-1138.

112. Ingvarsson, P.K. Nucleotide polymorphism and linkage disequilibrium within and among natural populations of European aspen (Populus tremula L., Salicaceae) / P.K. Ingvarsson // Genetics. 2005. - 169 - P. 53

113. Isebrands, J.G. Enviromental befits of poplar culture / J.G. Isebrands, D. Karnovsky // Poplar culture in North America. NRC Research Press, Ottawa, 2001.-P. 207-218.

114. Kalendar, R. IRAP and REMAP: Two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques / R. Kalendar, T. Grob, M. Regina // Theor. and Applied Genetics. 1999. - V. 98. - P. 704-711.

115. Karron, J.D. A comparison of levels of genetic polymorphism and self-compatibility in geographically restricted and widespread plant congeners. / J.D. Karron // EvolEcol.- 1987. -№1.-P. 47-58.

116. Khasa, D. P. Application of SSR markers for parentage analysis of Populus clones / D. P. Khasa, S. Nadeem, B. Thomas et al. // Forest Genetics. -2003. -№ 10 (4). P. 273-281.

117. Kimura, M. The number of alleles that can be maintained in a finite population / M. Kimura, J.F. Crow // Genetics (US). 1964. - V. 49. - P. 725-738.

118. Kort, J. Biomass production and carbon fixation by prairie shelterbelts / J.Kort, B. Turnock. // PFRA Shelterbelt Centre. Indian Head, Supplementary Report. 1996. - №96-5.

119. Latva-Karjanmaa, T. Sexual reproduction of European aspen (Populus trémula L.) at prescribed burned site: the effects of moisture conditions / T. Latva-Karjanmaa, L. Syvanto, K. Leinonen et al. // New Forests Springer. -2006. -P.545-558

120. Lewontin, R.C. The apportioment of human diversity / R.C. Lewontin // EV. Biol. 1972. - №6. - P. 381-398.

121. Li, S. Analysis of Genetic Diversity of Populus deltoides gemplasm by SSRs / S. Li, Z. Chen yin, P. Huang minren // International poplar symposium. -Nanjing, China. 2006. - P. 9.

122. Li, W.H. Rates of nucleotide substitution in primates and rodents and the generation-time effect hypothesis / W.H Li, D.L. Ellsworth, J. Krushkal et al. // Mol. Phylogenet. Evol. 1996. - №5. - P. 182-187.

123. Loo, M. Clonality and spatial genetic structure in Populus x canescens and its sympatric backcross parent P. alba in a Central European hybrid zone / M. Loo, J. Joseph, B. Heinze // New Phytologist. 2007. - P. 506-516.

124. Lund, S.T. Isozyme variation in quaking aspen in Minnesota / S.T. Lund, G.R. Furnier, C.A. Mohn // Can. J. For. Res. 1992. - №22. - P. 521-524.

125. MacKay, J. Functional genomic investigations of wood formation and defense response in trees, and beyond / J. MacKay, J. Bousquet, J. Cooke et al. // In Plant & Animal Genomes XII Conference. San Diego, CA, USA, 2005.-P. 58-62.

126. McCown, B.H. Recalcitrance of woody and herbaceous perennial plants: Dealing with genetic predeterminism / B.H. McCown // In vitro Cell. Dev. Biol. Plant 36.-2000.-P.149-154.

127. McDonough, W.T. Quaking aspen seed germination and early seedling growth / W.T. McDonough // Res. Pap. INT-234, USDA For. Serv., Ogden, UT. - 1979 - P. 13.

128. McLetchie, D.N. Gender determination in Populus / D.N. McLetchie, G.A. Tuskan, J. Dietrichson // Norweigan J. Agric. Sci. 1994. - №18. - P. 5766.

129. Nei, M. Genetic distance between populations / M. Nei // Amer. Naturalist. 1972.-V. 106.- P. 283-292.

130. Nei, M. Molecular population genetics and evolution / M. Nei // Amsterdam, 1975. 278 p.

131. Nei, M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals / M. Nei // Genetics. 1978. - V. 89. - P. 583590.

132. Nei, M. Molecular evolutionary genetics / M. Nei // N.Y.: Columbia Univ. press.- 1987.-512p.

133. Nei, M. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases / M. Nei, W.-H. Li // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1979.-V. 76.-P. 5269-5273.

134. Nelson, C.D. Genetic variation in juvenile characters of Populus deltoides Bartr. from the southern Great Plains / C.D. Nelson, C.G. Tauer // Silvae Genet.- 1987.-№36. -P. 216-221.

135. Nevo, E. Genetic variation in natural populations: patterns and theory / E. Nevo//Theor. Pop. Biol.- 1987.-V. 13. №1.-P. 121-177.

136. Orlovic, S. Evaluation of interspecific DNA variability in poplars using AFLP and SSR markers / S. Orlovic, V. Galovic, M. Zoric et al. // African Jornal of Biotechnology. 2009. - Vol. 8 - № 20. - P. 5241-5247.

137. Paolucci, I. SNP detection in Populus species / I. Paolucci, P. Faivre Rampant, A. Bresson et al. // Plant and Animal Genome XVI Conference. -2008.

138. Peakall, R. GenAlEx6: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research / R. Peakall, P.E. Smouse // Mol. Ecol. Not. 2006. - V. 6. - P. 288-295.

139. Peto, F.H. Cytology of poplar species and natural hybrids / F.H. Peto // Can. J. Res. (Sec.) 1938. -№16. - P. 445-455.

140. Pilate, G. Field and pulping performances of transgenic trees with altered lignification / G. Pilate, E. Guiney, K. Holt, M. Petit-Conil et al. // Nat. Biotechnol. 2002. - V. 20. - P. 607-612.

141. Rahman, M.H. Microsatellite DNA markers in Populus tremuloides / M.H. Rahman, S. Dayanandan, O.P. Rajora // Genome. 2000. - № 43. - P. 293297.

142. Rajora, O.P. Allozyme and leaf morphological variation of eastern cottonwood at the northern limits of its range in Ontario / O.P. Rajora, L. Zsuffa, B.P. Dancik // For. Sci. 1991. - № 37. - P. 688-702.

143. Rampant, P.F. Analysis of BAC end sequences in oak, a keystone forest tree species, providing insight into the composition of its genome / P.F. Rampant, I. Lesur, C. Boussardon et al. // BMC Genomics. 2011. - № 12. - P.292.

144. Reighard, G.W. Progeny testing of native aspens and their hybrids for biomass production in Michigan / G.W. Reighard, W. Hanover // In Proceedings 29th Northeastern Forest Tree Improvement Conference, Morgantown, WV. 1985. - P. 5-22.

145. Rogers, D.L. Genetic variation and productivity of Populus trichocarpa and its hybrids / D.L. Rogers, R.F. Stettler, P.E. Heilmann // III. Structure and pattern of variation in a 3-year field test. Can. J. For. Res. 1989. - № 19. -P. 372-377.

146. Rogers, S. O. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues / S. O. Rogers, A. J. Bendich // Plant Molecular Biology. 1985. - V. 5. - P. 69 -76.

147. Saiki, R.K. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase / R. K. Saiki, D.H. Gelfand, S. Stoffels et al. // Science. 1988. -№ 2 (39). - P. 487-491.

148. Schier, G.A. Origin and development of aspen root suckers / G.A. Schier // Can. J. For. Res.- 1973. -№3. P. 45-53.

149. Schmidt, • M. Label-free in situ imaging of ligniWcation in the cell wall of low lignin transgenic Populus trichocarpa / M. Schmidt, A. M. Schwartzberg, • P. N. Perera • // Planta. 2009. - P. 589-597.

150. Schnekenburger, F. Genetic variance in growth of balsam poplar under 16-and 8-hour photosynthetic periods / F. Schnekenburger, R.E. Farmer // For. Sei. 35.- 1989.-P. 903-919.

151. Schreiner, E.J. Populus L. Poplar. In Seeds of woody plants in the United States. Edited by C.S. Schopmeyer / E.J. Schreiner // Agricultural Hanbook Forest Service, USDA, Washington, DC. - 1974. - №450. - P. 645-655.

152. Smit, B.A. Selection of flood-resistant and susceptible seedlings of Populus trichocarpa Torr. & Gray / B.A. Smit// Biological Aspects of Hybrid Poplar Cultivation on Floodplains in . Can. J. For. Res. 18. 1988. - P. 271-275.

153. Smith, E.C. A study of the cytology and speciation in the genus Populus. J. / E.C. Smith // Arnold Arboretum. 1943. - № 24. - P. 275-304.

154. Smulders, M. J. Trinucleotide repeat microsatellite markers for black poplar {Populus nigra L.) / M. J. Smulders, M. Van Der Schoot, P. Arens et al. // Molecular Ecology Notes. 2001. - № 1. - P. 188-190.

155. Thumma, B.R. Polymorphisms in cinnamoyl CoA reductase (CCR) are associated with variation in microfibril angle in Eucalyptus spp. / B.R. Thumma, M.F. Nolan, R. Evans et al. // Genetics. 2005. - № 171. - P. 1257-1265.

156. Tuskan, G.A. Characterization of microsatellites revealed by genomic sequencing of Populus trichocarpha / G.A. Tuskan., L.E. Gunter, Z.K. Yang et al. II Can. J. For. Res. 2004. - №34. - P. 85-93.i i i v „ i t

157. Tuskan, G.A. The genome of black cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. and Gray) / G.A. Tuskan, S. DiFazio, S. Jansson et al. // Science. 2006. -№313.-P. 1596-1604.

158. Van Buijtenen, J.P. Note on the presence of sex chromosomes in Populus tremuloides / J.P. Van Buijtenen, D.W. Einspahr // Bot. Gaz. 1959. -№121.-P. 60-61.

159. Wang, J. Genetic Differentiation and Delimitation between Ecologically Diverged Populus euphratica and P. pruinosa / J. Wang, Y. Wu, G. Ren, Q. Guo et al. // PLoS Hubs: Biodiversity. 2011. - №6(10).

160. Weber, J.C. Genetic variation and productivity of Populus trichocarpa and its hybrids / J.C. Weber, R.F. Stettler, P.E. Heilman // I. Morphology, and phenology of 50 native clones. Can. J. For. Res. 15. 1985. - P. 376-383.

161. Williams, J.G.K. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers / J.G.K. Williams, A.R. Kubelik, K.J. Livak et al. // Nucl. Acids Res. -1990. -V. 18. P. 6531-6535.

162. Wright, S. Evolution in mendelian populations / S. Wright // Genetics. -1931.-V. 16. -P.97-159.

163. Xu, Z. Comparative genome analysis of lignin biosynthesis gene families across the plant kingdom / Z. Xu, D. Zhang, J. Ни, X. et al.: // BMC Bioinform. 2009. - P.30-32.

164. Yeh, F.C. RAPD variation within and among natural populations of trembling aspen (Populus tremuloides Michx.) from Alberta / F.C. Yeh, D.K.X. Chong, R.C. Yang// 1995. -№ 86. - P. 454-460.

165. Yin, T. Molecular linkage maps of the Populus genome / T. Yin, X. Zhang, M. Huang et al. // Genome. 2002. - № 45. - P. 541-555.

166. Yin, T.M. Large scale heterospecific segregation distortion in Populus revealed by a dense genetic linkage map / T.M. Yin, S.P. DiFazio, L.E. Gunter // Theor. Appl. Genet. 2004. - № 109. - P. 451-463.

167. Ying, C.C. Genetic variation in eastern cottonwood in an eastern Nebraska provenance study / C.C. Ying, W.T. Bagley // Silvae Genet. 1976. -№25.-P. 67-73.

168. Ying, C.C. Variation in rooting capacity of Populus deltoids / C.C. Ying, W.T. Bagley // Silvae Genet. 1977. - № 26. - P. 204-207.

169. Yu, J.H. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. indies) / J.H. Yu, J. Wang, G.K-S. Wong et al. // Science. 2002. - № 296. - P. 7992.

170. Zietkiewicz, E. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification / E. Zietkiewicz, A. Rafalski, D. Labuda // Genomics. 1994. - V. 20. - P. 176-183.

Информация о работе

Светлакова, Татьяна Николаевна
кандидата биологических наук
Пермь, 2012
ВАК 03.02.07

Диссертация

Молекулярно-генетический анализ и оценка состояния генофондов популяций Populus tremula L. в Пермском крае - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы