Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ гена Broad Complex у Drosophila virilis

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ гена Broad Complex у Drosophila virilis"

# %

V

На правах рукописи УДК 577.21 : 595.773.4

ДОРОНКИН Сергей Геннадьевич

МОЛ ЕКУЛЯ РНО-ГЕП ЕГИЧЕСКМ11 АНАЛИЗ ГЕНА BROAD COMPLEX У DROSOPHILA VIRILIS

Специальность 03.00.26 — молекулярная генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1908

Работа выполнена в лаборатории пейрогенетикн и генс.т'ипГ

развития Института биологии гена РАН.

Научный- руководитель:

член-корреспондент РАН, доктор'- медицинских паук, профессор Л. И. Корочкин..

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук П. Г. Георгиев"; кандидат1'биологических наук А. М., Кул и :сов..

Ведущая организация':

Институт- общей генетики им. Н. Й. Вавилова РАН.

Защита диссертации состоится' « .-^."г» . ... . 1998 го-

да в «.-/?. » часов на заседании Диссертационного совета Д.200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова, 34/5.

С Диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энг-ельг-ардта РАН по* адресу 117984, Москва, ул; Вавилова,. 32.

Автореферат разослан« 'С» . . . 1998 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета'

кайд. фарм. наук Грабовская Л. С.

к ^^^Г^КгРс-Л)

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность задачи

Стероидные гормоны - экдистероиды играют большую роль в метаморфозе насекомых. Drosophíla в период метаморфоза является хорошей моделью для детального изучения механизмов тканеспецифичной регуляции транскрипции генов под влиянием стероидного гормона экдистерона, а также для изучения таких фундаментальных процессов как рост и дифференцировка тканей и запрограммированная гибель клеток. В период метаморфоза под действием гормона предетерминированные зачатки взрослых тканей (имагинальные диски) дифференцируются и растут, превращаясь во взрослые органы, а личиночные ткани полностью разрушаются (Berendes Н., Ashburner М., 1967).

В основе этих тканеспецифичных изменений лежит каскад транскрипционных событий, индуцируемый экдистероном (Ashburner М. et al., 1974; Ashburner М., Richards G., 1976). В начале под действием гормона активируется набор факторов транскрипции ("ранние гены"), которые, в свою очередь, активируют большое число тканеспецифичных "поздних" генов. Считается, что дифференциальная активность "поздних" генов отвечает за метаморфоз органов. Молекулярный механизм, который позволяет одному и тому же гормональному сигналу

вызывать тканеспецифичный ответ, пока не полностью понят.

Направленный поиск мутаций в области раннего экдистерон-индуцируемого пуфа 2ВЗ-5 Х-хромосомы Drosophila melanogaster привел к открытию в 1980 году локуса ее s (ecdysterone sensitivity), позднее переименованного в Broad Complex, который является типичным ранним геном и играет ключевую роль в каскаде экдистероновой регуляции развития (Belyaeva E.S. et al., 1980) .

Поскольку ген Broad Complex является ключевым в контроле метаморфоза, несомненный интерес представляет сравнительное исследование его организации у ряда близких видов, в частности, у Drosophila virilis.

Цель и задачи исследования.

Основная цель настоящей работы заключалась в молекулярно-генетическом анализе гена Broad Complex у Drosophila virilis.

В ходе исследования предполагалось решение следующих экспериментальных задач:

1. Клонирование гена Broad Complex Drosophila virilis.

2. Локализация гена Broad Complex на политенных хромосомах Drosophila virilis.

3. Изучение экспрессии гена Broad Complex на различных стадиях развития дрозофилы.

4. Выявление районов гена, активных в транскрипции,

5. Определение количества и размеров транскриптов гена Broad Complex у Drosophila virilis.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В работе впервые проведено молекулярное клонирование гена Broad Complex у Drosophila virilis. С помощью гибридизации in situ на политенных хромосомах определена локализация клонированного гена в 44В районе цитологической карты Drosophila virilis, предложенной И.Губенко и М.Евгеньевым (Gubenko I., Evgen'ev М., 1982). Показано, что гену Broad Complex соответствуют, по меньшей мере, шесть поли(А+)РНК различных размеров. Определены транскрипционно-активные районы гена Broad Complex. Показано, что ген Broad Complex имеет разный уровень экспрессии на разных стадиях развития Drosophila virilis. Наибольшая транскрипционная активность наблюдается на второй и третьей личиночных стадиях, а также на стадии куколки третьего возраста. В эти периоды наблюдается как экспрессия максимального числа транскриптов, часть из которых отсутствует на других стадиях, так и

увеличение экспрессии транскриптов, присутствующих на остальных стадиях.

Изучение таких генов, как Broad Complex, которые вовлечены в гормональную регуляцию дифференцировки и функционирования половой системы дрозофилы, поможет найти аналогичные гены у человека и решить практические проблемы, связанные с лечением его гормональных болезней.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены: на 38-й Ежегодной конференциии по исследованию на дрозофиле (Чикаго, США, 1997), Третьей франко-американской летней школе по нейрогенетике и генетике поведения (Орлеан, Франция, 1997), Первой ежегодной конференции европейского общества нейрогенетики и генетики поведения (Орлеан, Франция, 1997), 39-й Ежегодной конференции по исследованию на дрозофиле (Вашингтон, США, 1998).

Публикации.

Результаты диссертации опубликованы в трех печатных работах.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на .... страницах машинописного текста, содержит .... рисунков и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Библиография включает .... источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Ген Broad Complex непосредственно индуцируется экдистероном и выполняет регуляторную функцию (Belyaeva E.S., et al 1981; Crowley Т.Е., et al 1984; Dubrovsky E.B., et al 1988). Локус Broad' Complex у Drosophlla melanogaster был клонирован (Chao А.Т., Guild G.M., 1986; Protopopov И.О. et al., 1991).

1. Клонирование гена Broad Complex. Drosophlla virilis.

Для решения задачи клонирования локуса, занимаемого геном Broad Complex Drosophlla virilis и построения его рестриктной карты нами была приготовлена геномная библиотека из имаго Drosophila virilis дикого типа. Геномную библиотеку готовили,

применяя частичное расщепление высокомолекулярной геномной ДНК рестриктазой Sau3A. Фрагменты длиной около 20 т.п.н. затем использовали для лигирования с плечами лямбда-вектора EMBL-4 и упаковки. Также в работе была использована геномная библиотека из мух Drosophila virilis дикого типа в векторе лямбда DASH, любезно предоставленная М.Б.Евгеньевым. Для поиска гомологичных последовательностей в качестве мест начала "прогулки по хромосоме" были использованы клонированные участки из локуса Broad Complex Drosophila melanogaster с координатами 123-124, 173175, 206-209, находящиеся в центральном и фланкирующих районах этого локуса (Protopopov М.О. et al., 1991). Для удобства они были переклонированы в плазмиду pBluescriptSK (+). Клоны гена Broad Complex Drosophila melanogaster были получены из лаборатории И.Ф.Жимулева, где они были выделены с использованием метода микродиссекции хромосом. Гибридизацию

проводили в стандартных условиях. В результате последовательных скринингов геномных библиотек Drosophila virilis дикого типа было получено значительное количество клонов, девять из которых перекрывали регион размером около 100 т.п.н. геномной ДНК. Этот участок был картирован с использованием рестриктаз EcoRl, Hindlll, BamHJ (Рис.1).

R H

1 I

RH

=LL

A В

HR

sP">

R H H RB R R

A j 1 1 11 'J

H R H H BR

JL3L

Рио.1

Рестриктная карта гена Broad Complex у Drosophila virilis. A - Рестриктная карта. Заглавными буквами обозначены сайты рестрикции: В - BamHI, R - EcoRI, Н - HindiII. Тонкой линией нал физической картой помечены участки, содержащие повторяющиеся последовательности;В - Номера клонов геномной ДНК. Короткие отрезки с номерами 205, 215 и 1471 обозначают участки, содержащие последовательности, гомологичные геномным клонам гена BR-C Drosophila melanogasteг.

Известно, что геном Drosophila содержит большое число многократно повторяющихся последовательностей. В связи с этим изолированные клоны были исследованы на предмет присутствия в них районов, имеющих в своем составе множественные повторы. Для этого BcoRI-рестрицированные фрагменты клонированных участков ДНК были использованы в качестве зондов для Southern-блот гибридизации с фильтрами, содержащими EcoRI-рестрицированную геномную ДНК Drosophila virilis. С помощью^ <того эксперимента было выявлено два района, в составе которых содержатся повторяющиеся

последовательности (Рис.1).

2.Локализация гена Broad Complex на политенных хромосомах Drosophila virilis.

Фрагменты клонированного гена Broad Complex Drosophila virilis были также использованы как зонды в цитогенетических экспериментах с целью изучения локализации этого участка на хромосомах Drosophila virilis. Для этого проводили экперименты по их гибридизации in situ на политенных хромосомах слюнных желез, приготовленных из личинок третьего возраста Drosophila virilis дикого типа. Все манипуляции проводили по общепринятой методике (Gall J., et al.,

1971), добавляя в гибридизационную смесь декстран сульфат до 10%. Зонды приготавливали путем элюирования клонированных фрагментов геномной ДНК из агарозного геля и включения в них радиоактивных изотопов [а-3Н]-dATP, [а-3Н] -dCTP и [a-3H]-dGTP. Гибридизация

in situ показала локализацию гена Broad Complex в 4 4 В районе цитологической карты Drosophila virilis, предложенной И.Губенко и М.Евгеньевым (Gubenko I., Evgen'ev М., 1982). Это пуф в четвертой хромосоме (рис.2). Считается общепринятым, что пуфы представляют собой деконденсированные участки политенных хромосом с высокой интенсивностью транскрипции. Для ряда пуфов установлено, что в них синтезируется матричная РНК, которая поступает в цитоплазму и связывается с полисомами. Продемонстрирована связь между

функционированием пуфа и синтезом определенного белка (Spradling А. et al., 1975; McKenzie S. et al., 1975; Korge G. et al., 1977; Lubsen N. et al., 1977; Жимулев И.Ф. 1992, 1993, 1994). Учитывая это, мы можем с большой долей уверенности предположить

транскрипционную активность гена Broad Complex на стадии личинки третьего возраста. Более того, гибридизация на пуфирующем участке соответствует теоретическим ожиданиям, поскольку является

л

i ■ a

V

Mi Ia^V^

/Til Г v.**

/ 7/

« ,

»

Рис.2

Гибридизация in situ политенных хромосом Drosophila virilis с фрагментом с координатами 70-78. Стрелкой указан район гибридизации.

индикатором экспрессии экдистерон-стимулируемого гена Broad Complex в период, когда велико содержание экдистерона.

Диффузное рассеянное мечение всех хромосом, полученное нами в этих экспериментах, может быть объяснено гибридизацией простых гомополимерных последовательностей типа поли(dC-dA/dG-dT). Эти последовательности очень широко распространены в геноме у дрозофилы, особенно у Drosophila virilis, и обычно расположены блоками по 20-120 п.н. Поли-(dC-dA)/(dG-dT) , поли-(dC-dT)i (dG-dA) , поли-dC/dG повторы при in situ гибридизации найдены во многих местах эухроматиновых плеч хромосом дрозофилы (Pardue М., 1990). Так как температура плавления таких гомополимерных последовательностей весьма низкая, можно предположить, что в нежестких условиях гибридизации, использованных в настоящей работе, такие последовательности легко могут выявляться в виде рассеянного мечения хромосом.

Наши эксперименты показали, что ген Broad Complex сходно организован у Drosophila melanogaster и Drosophila virilis. Он занимает у этих видов близкие по размеру участки, содержит в своем составе повторяющиеся фрагменты. Однако, его расположение на хромосомах различно. Видимо, это связано с тем, что

данные виды относятся к различным таксономическим группам.

3. Дифференциальная экспрессия клонированного гена.

С целью выяснения на рестриктной карте гена Broad Complex расположения транскрибируемых участков, а также исследования их дифференциальной экспрессии в метаморфозе был использован метод Northern-блот гибридизации. В качестве зондов для гибридизации использовали фрагменты ДНК полученных нами ранее геномных клонов, перекрывающих район локализации данного гена Drosophila vlrilis. Для этого клонированные участки ДНК обрабатывали рестриктазой £coRI и разделяли электрофорезом в агарозном геле. Для гибридизации полученные фрагменты элюировали из геля, метили [а-згР] -dATP/dCTP и использовали для гибридизации по стандартной методике.

Выделение РНК проводили на восьми основных стадиях развития насекомого - из эмбрионов, личинок первого, второго, третьего возрастов, ранней куколки, средней куколки, поздней куколки и взрослого насекомого. Тотальную РНК выделяли горячим кислым фенольным методом. Для определения концентраций препаратов и

степени их чистоты использовался

спектрофотометрический анализ. Однако, эксперименты по Northern-блот гибридизации с тотальной РНК, выделенной из особей на разных стадиях развития, не дали четкого ответа на поставленные выше вопросы. По-видимому, это связано со сравнительно невысоким общим уровнем экспрессии гена Broad Complex.

В связи с этим, для каждой из перечисленных стадий были выделены препараты матричных РНК.

Полиаденилированную РНК отделяли от

неполиаденилированной стандартным способом адсорбции и элюции на oligo (dT)-целлюлозе. Затем poly(А)+ - РНК разделяли электрофорезом в агарозном геле, содержащем формальдегид.

С помощью Northern-блот гибридизации выявлено несколько транскрипционно-активных районов на карте гена Broad Complex Drosophila virHis (Рис. 3) . Примечательно, что этим районам, активным в транскрипции, соответствуют последовательности

матричной РНК различной длины. Геномным фрагментам с координатами 41-49 и 78-87 (Рис. 4а, 4d) соответствовало по одному транскрипту размером около 4,5 т. н. Участок с координатами 5 6-62 гибридизовался с пятью транскриптами размерами - 5,5 т. н., 4,5 т.н., 3,8 т.н., 3,3 т.н., 2,7 т.н. (Рис. 4Ь) . Участок с

»> t H it H

R н m

н н

I I -

R H H KB RR HH BHRH H BR RBBHB

J_! I " M I_I T I_II III Г if I '

11)0

Рис.3

Рестриктная карта гена Broad Complex Drosophila

virilis с транскрипционно-активными участками (обозначены утолщенными линиями). Двойной линией

обозначены участки, содержащие повторяющиеся последовательности. В - BaoHI, R - EcoRX, Н -Hindlll.

координатами 62-70 обнаруживал картину, аналогичную предыдущему, кроме того, были видны более слабые сигналы на уровне 10 т.н. (Рис. 4с), появляющиеся на второй и, в большей степени, третьей личиночной стадии. Однако, этот район геномной карты имеет участок с множественными повторами, поэтому этот большой транскрипт, вполне возможно, не является уникальным.

С остальными участками геномной ДНК при гибридизации с poly(А)+ - РНК не было выявлено гомологии, что говорит либо об их более слабой транскрибируемое™ (или ее отсутствии), либо недостаточной разрешающей способности примененного метода.

Принимая во внимание, что транскрипт размером около 4,5 т.н. выявляется при гибридизации со всеми перечисленными участками ДНК, можно предположить, что этот транскрипт может являться общим для них. В этом случае, ген Broad Complex Drosophila virilis кодирует, как минимум, шесть различных транскриптов РНК.

В этой серии экспериментов было также показано, что наибольшая транскрипционная активность гена Broad Complex Drosophila virilis проявляется на второй и третьей личиночной стадиях, а также на стадии поздней куколки (Рис. 4). Очевидно, что это связано с теми

1 2 3 4 5 6 7 8 Ь

- 5,5

- 4,5

- 3,6

- 3,3

- 2,7

1 2 3 4 5 6 7 8

- 10

1 2 3 4 5 6 7 8

«И - 4,5

, - 3,8

' - 3,3

I - 2,7

4,

•р # т т - ^

Рис4.

МотЬегп-блот гибридизация матричной РНК, выделенной на различных стадиях развития,-а-с участком с координатами 41-49, Ь- с участком с координатами 56-62, о- с участком с координатами 62-70, (1- с участком с координатами 78-87. 1-эмбриональная стадия, 2-личинки первого возраста, 3-личинки второго возраста, 4-личинки третьего возраста, 5-ранняя куколка, 6-средняя куколка, 7-поздняя куколка, 8-имаго. гав2 - меченый зонд был использован в качестве контроля (нижнее фото).

серьезными изменениями в развитии, которые происходят в эти периоды, и которые во многом инициируются с возрастанием титра гормона экдистерона. Полученные результаты хорошо согласуются с теоретически ожидаемыми, поскольку ген Broad Complex является чувствительным к экдистерону. Таким образом, наиболее активные периоды в картине синтеза матричных РНК гена Broad Complex приурочены к критическим периодам развития - формированию пупариума и куколочной линьке.

Выводы.

1.Клонирован и картирован участок ДНК, содержащий ген Broad Complex Drosophila virilis. Он занимает участок размером около 100 т.п.н., содержит районы с повторяющимися последовательностями.

2.Установлено, что ген Broad Complex локализован в 44В районе цитологической карты Drosophila virilis, предложенной И.Губенко и М.Евгеньевым (Gubenko I., Evgen'ev М., 1982).

3.Показано, что ген Broad Complex имеет разный уровень экспрессии на разных стадиях развития дрозофилы. Максимальная экспрессия наблюдается на

второй и третьей личиночных стадиях, а также на стадии куколки третьего возраста.

4.Определены районы гена Broad Complex, содержащие транскрипционно-активные участки.

5.Показано, что гену Broad Complex Drosophila virilis соответствует, по меньшей мере, шесть транскриптов разных размеров.

Автор выражает благодарность чл.-корр. РАН, д.б.н., проф. И.Ф.Жимулеву за предоставленные клоны гена Broad Complex Drosophila melanogaster, консультации и обсуждение полученных результатов, а также д.б.н., проф. М.Б.Евгеньеву за помощь в определении района гибридизации in situ.

Список работ, опубликованных по <геме диссертации.

1. S.G.Doronkin, L.I.Korochkin. Cloning of the ecs gene of Drosophila virilis. // 38th Annual Drosophila Research Conference, Chicago, USA, 1997, P. 80B.

2. С.Г.Доронкин, Л.И.Корочкин. Клонирование гена BR-C у Drosophila virilis. II Генетика, 1998, Т. 34, № 4, стр. 569-570.

3. С.Г.Доронкин, JI.И.Корочкин. Исследование транскрипционной активности локуса BR-C у Drosophila virilis. // Генетика, 1998, Т. 34, № 4, стр. 571-573.