Молекулярно-генетический анализ экспрессии импринтированных генов Igf2 и H19 у партеногенетических эмбрионов мышей

Ростам Задех Джалал

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетический анализ экспрессии импринтированных генов Igf2 и H19 у партеногенетических эмбрионов мышей
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ экспрессии импринтированных генов Igf2 и H19 у партеногенетических эмбрионов мышей"

На правах рукописи

РОСТАМ ЗАДЕХ ДЖАЛАЛ

Молекулярно-генетический анализ экспрессия импринтированных генов и Н19 у партеногенетических эмбрионов мышей

Специальность 03.00.15 -генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2005

ОБГГЗАТГ.ЛЬНЫИ

БЕСПЛл~НЫИ ЭКЗЕМПЛЯР

Работа выполнена в лабораториях сравнительной генетики животных и генетики развития Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ

доктор биологических наук, профессор Сулимовя Галина Ефимовна доктор биологических наук Платонов Евгений Семёнович ОФИЦАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Ванюшин Борис Федорович доктор биологических наук, профессор Янковский Николай Казимирович ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук

Защита состоится « »_2005 г. в_часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.214.01 в Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, ул. Губкина, 3. Факс: (095) 132 8962.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН.

Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Полухина Галина Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В конце XX столетия в рамках программы "Геном человека" была расшифрована нуклеотидная последовательность генома. Программа «Геном человека» ответила на важные вопросы о количестве генов, их структуре и устройстве генома человека, но не позволила ответить на главный вопрос - как работают отдельные гены и их ансамбли в различных клетках и тканях организма. Именно поэтому генетические исследования XXI века сместились в область функциональной геномики, главная задача которой заключается в выяснении механизмов реализации наследственной информации и установлении биологических функций генных продуктов. Так или иначе, эти исследования тесно связаны с проблемой индивидуального развития организма - ключевой проблемой современной биологии, которая и должна ответить на вопрос о том, каким образом из одной зиготы развивается организм с разнообразными клетками. За таким разнообразием стоит дифференциальная экспрессия генов в разных клетках развивающегося организма, имеющих одинаковый геном. Очевидно, установка и стабильное поддержание этих различий обусловлено, кроме всего прочего и эпигенетическим контролем генной экспрессии.

Эпигенетика представляет собой относительно новое направление в генетических исследованиях, проводимых на животных и растениях. Геномный импринтинг по своей природе относится к проблемам эпигенеттси, которая изучает наследственные изменения в экспрессии генов, не связанные с изменением последовательности нуклеотидов ДНК.

Под геномным импринтннгом понимают эпигенетический процесс, обуславливающий

репрессию одного из двух аллельных генов, локализованного на материнской или отцовской

хромосоме. Обычно у высших организмов имеется биаллельная экспрессия аутосомных

генов и только у млекопитающих в участках генома, подверженных импринтингу,

экспрессируется один материнский или отцовский аллель, то есть наблюдается

моноаллельная экспрессия импринтированных генных локусов. Считается, что эти гены

импринтированы в геноме их родителей и поэтому данный феномен называют родительским

импринтингом, геномным импринтингом или гаметическим импринтингом. В последнее

время для описания данного явления чаще используют термин - геномный импринтинг.

Ранее считалось, что число импринтированных генов относительно невелико и составляет не

более 0,1% (Barlow, 1997). Но в недавней публикации с помощью статистической модели,

основанной на структурных характеристиках ДНК, Луди с соавт. (Luedi et al., 2005)

предсказывают, что число таких генов существенно выше и потенциально

импршггированными могут быть до 2.5 % аннотированных

БИБЛИОТЕКА С. Петер J

анализированных аутосомных генов мыши их модель выделяет 600 генов). Из этого числа для 64 % генов предсказывается экспрессия с материнского аллеля. В геноме мыши к настоящему времени идентифицировано около 70 импринтированных генов (Murphy, 2003).

Возможность искусственной активации ооцитов млекопитающих к партеногенетическому развитию положила начало многочисленным исследованиям с использованием экспериментально получаемых партеногенетических эмбрионов в качестве модельной системы для изучения эффектов геномного импринтинга в развитии млекопитающих. В настоящее время наиболее распространенным объектом в этих исследованиях являются различные лабораторные линии домовой мыши (Mus musculus) и их гибриды.

Гибель диплоидных партеногенетических или андрогенетических эмбрионов млекопитающих обусловлена отсутствием экспрессии генов импринтированных локусов отцовского или материнского геномов, что приводит к возникновению дисбаланса генной активности и нарушению развития тканей и органов (Конюхов, Платонов, 2001).

Полученные в последнее время экспериментальные данные Коно с соавторами (Копо et al., 2004) показывают, что изменение функционирования даже одной пары импринтированных генов (локуса Igf2/H19) может приводить к рождению партеногенетических мышей, хотя эффективность получения таких партеногенетических мышей крайне низка: из 457 реконструированных яйцеклеток родились две жизнеспособные мыши. Результаты этих авторов показывают принципиальную возможность получения партеногенетических млекопитающих путём изменения эффектов геномного импринтинга в эмбриогенезе.

Показано, что воздействие на пре- или постимплантацинных стадиях ростовыми факторами FGF2, FGF4, TGFa и IGF2 по отдельности или в комплексе друг с другом приводит к пролонгированию развития партеногенетических эмбрионов мышей (Ленков, Платонов, 1997, 1999; Penkov et al., 1996, 2001; Платонов и др., 2001, 2002). Авторы указывают, что ростовые факторы при введении извне способны влиять на эффекты геномного импринтинга в развивающихся партеногенетических эмбрионах. Поэтому в нашей работе в качестве модельной системы исследования механизмов геномного импринтинга (особенно в локусе Igf2/H19) было выбрано партеногенетическое развитие эмбрионов мышей.

Целью данной работы является изучение молекулярно-генетических механизмов экспрессии импринтированных генов Igß и Н19 у партеногенетических эмбрионов мышей под воздействием трансформирующего ростового фактора альфа (TGFa)

Были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать способность TGFa участвовать в реактивации гена инсулиноподобного ростового фактора 2 {Igft) в локусе Igf2/H19 у партеногенетических эмбрионов мышей на 9,5-й день беременности.

2. Исследовать экспрессию Tgfa у 9,5-дневных партеногенетических и нормальных эмбрионов мышей.

3. Исследовать эффект in vitro обработки TGFa на локус Igf2/H19 в партеногенетических

бластоцистах мышей.

4. Исследовать экспрессию Igft с разных промоторов (PI, Р2 и РЗ) у 9,5-дневных партеногенетических эмбрионов мышей после обработки TGFa.

5. Исследовать характер метилирования дифференционально метилируемых регионов (DMRs) у генов Igft и Н19 у обработанных и необработанных TGFa партеногенетических эмбрионов мьппей на 9,5-й день беременности.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Впервые на молекулярном уровне изучено влияние TGFa на экспрессию импринтированных генов у партеногенетических эмбрионов мышей. Показано, что под воздействием экзогенного TGFa в 9,5-дневных партеногенетических эмбрионах и тканях развивающейся плаценты мышей происходит реактивация экспрессии импринтироваппого гена Igft, в норме экспрессирующегося только с отцовского аллеля. Выявленная экспрессия импринтированного гена Igft была ниже, чем в нормальных эмбрионах мьппей. Впервые показано, что в обработанных TGFa партеногенетических эмбрионах мышей Igft я HI 9 экспрессируются одновременно, при этом экспрессия гена Н19 на 9,5-й день беременности в обработанных TGFa партеногенетических эмбрионах ниже, чем в нормальных и необработанных партеногенетических эмбрионах мышей. Впервые показано, что экспрессия самого гена Tgfa снижена у 9,5-дневных партеногенетических зародышей. Полученные результаты позволяют предположить, что повышение концентрации TGFa в клетках в результате инкубации эмбрионов (на стадии морулы) in vitro с TGFa способствует реактивации Igft и частичному подавлению экспрессии Н19, который в партеногенетических эмбрионах мышей экспресируется биаллельно. Впервые продемонстрировано также, что обработка TGFa увеличивает процент выхода партеногенетических бластоцист, в которых экспрессируется Igft.

Показано, что под воздействием TGFa промоторы Р1-РЗ гена lgf2 реактивируются в партеногенетических эмбрионах мьппей, но не в их плацентах. Наиболее сильная экспрессия Igft в обработанных TGFa партеногенетических эмбрионах, как и в норме, наблюдалась с промотора Р2, что впервые позволило продемонстрировать избирательность действия TGFa

на реактивацию промоторов Igf2 в партеногенетических эмбрионах и развивающихся плацентах мышей.

Впервые показано, что дифференциально метилируемые регионы (DMR) А и В гена Н19 гипометилированы у партеногенетических 9,5-дневных зародышей, обработанных TGFa, и их паттерны метилирования сходны с паттернами метилирования материнского аллеля. При этом три сайта связывания CTCF фактора транскрипции (Rl, R3 и R4), расположенные в этих регионах А и В неметилированы.

Сравнение профилей метилирования DMR1 и DMR2 гена Igf2 в группах обработанных и необработанных TGFa 9,5-дневных партеногенетических эмбрионов мышей позволило продемонстрировать сходный характер метилирования по семи CpG-сайтам для /g/2-DMRl в обеих группах и выявить различия в профилях метилирования /g/2-DMR2, в особенности в CpG-динуклеотидах, расположенных в 5-ом экзоне (CpG 1-6). CpG динуклеотиды, находящиеся в коровом регионе б-oro экзона (CpG 16-25) гипометилированы в обеих группах. Полученные данные позволили впервые выявить влияние характера метилирования DMR2 на экспрессию гена Igf2 Высказано предположение, что метилирование DMR2 играет важную роль в реактивации Igf2 в партеногенетических эмбрионах под воздействием TGFa, поскольку необходимо для образования комплекса между 7g/2-DMR2 и tf/9-DMR.

Выполненная работа носит фундаментальный характер, но может в будущем иметь и практическое приложение, поскольку изучение молекулярных механизмов геномного импринтинга и действия различных факторов, модулирующих эти эффекты, важно как для развития реконструктивных технологий в животноводстве, так и для разработки новых подходов к профилактике и лечению наследственных болезней, связанных с нарушением геномного импринтинга.

Апробация работы. Основные результаты диссертации представлены на 12 Международных и Всероссийских конференциях, в том числе на следующих профильных конференциях: Международной конференции «Genomic Imprinting Workshop 2004: Twenty years of mammalian genomic imprinting» (Монпелье, Франция, 2004), Международной конференции « Harwell imprinting conference 2005: Genomic imprinting, Development and diseases» (Оксфорд, Англия, 2005), Международной научной конференции по современному состоянию проблем достижений в области генетики и селекции (Алматы, Казахстан, 2003), Ш Международной конференции Вавиловского общества генетиков и селекционеров "Генетика в XXI веке" (Москва, Россия, 2004), Международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнологии»» (Минск, 2004), Международных конференциях Иранских исследователей в Европе (Манчестер, Англия,

2004; Лидз, Англия 2005), Международных конференциях по новым информационным технологиям в медицине, биологии, фармакологии и экологии (Крым, Украина, 2003; 2005), конференциях «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2003; 2005) и Съезд физиологов СНГ, (Сочи, Россия, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 202 наименования, и приложений. Работа содержит 10 таблиц и 34 рисунка.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Получение партеногенетических и нормальных бластоиист и эмбрионов мышей

Общая схема работы представлена на рис.1. Партеногенетические зародыши мышей были получены в лаборатории генетики развитии с использованием гибридных самок мышей (C57BL/6 х CBA)F1 в возрасте 6-8 недель в качестве источника яйцеклеток. После активирования яйцеклеток и обработки их цитохалазином Б, отобранные диплоидные яйцеклетки культивировали до стадии бластоцисты (96 ч). На стадии ранней морулы в культуральную среду добавляли TGFa до конечной концентрации 10 нг/мл. Обработанные и не обработанные TGFa морулы выращивали in vitro до стадии поздней бластоцисты. Бластоцисты собирали для анализа или трансплантировали в матку реципиентных самок. На 9.5-й день беременности мышей забивали и определяли стадии развития эмбрионов. В наших исследованиях были использованы только живые эмбрионы, стадии развития которых указаны в табл.1.

Ранее методом гибридизации in situ было показано, что у партеногенетических зародышей после обработки TGFa происходит активация экспрессии импринтированного гена Igfi, в норме экспрессирующегося только с отцовского аллеля (Платонов и др., 2001). Однако, механизм действия TGFa оставался неизученным. Можно было предположить, что экспрессия гена Tgfa у партеногенетических зародышей снижена и инкубация in vitro с TGFa приводит к повышению его концентрации в клетках и реактивации Igft. В связи с этим нами был проанализирован уровень экспрессии гена Tgfa у нормальных и партеногенетических зародышей мышей.

шртмм«

Бжмпспь щииьипи м и шиикш

ПК

(щмашДВК

Йм^льфим

птфалмш нр0н»«|ии 1хР (Р1,Р2аРЗ)

Лил» жцют ■ решат аремеи* (к*1 Йтс КТ-РСВ)

Рис. 1 Общая схема работы.

№ ПЭ(+ТвРа) ПЭ (-ТСЕв)

Развитие до следующих сомитных стадий

1 25 20

2 25 25

3 25 21

4 25 12

Таблица 1. Стадии развития (в сомитах) использованных в работе партеиогенетических эмбрионов мышей (ПЭ), обработанных и необработанных ТвРо.

2. Анализ экспрессии гена ТеТа и имппинтнрованных генов /г/2 и Н19 2.1. Анализ экспрессии гена Т$а

Ген Т%£а расположен на шестой хромосоме мыши. Экспрессия Т^а начинается после оплодотворения. Мы сравнили экспрессию Т^а в нормальных (оплодотворенных) и необработанных ТвРа партеиогенетических 9.5-дневных эмбрионах мышей методом полуколичественной ОТ-ПЦР (рис. 2). Для синтеза кДНК во всех экспериментах было использовано равное количество тотальной РНК. В качестве внутреннего контроля использовали ген глидеральдегид-З -фосфатдегидрогеназы (СгарсШ). Следует отметить, что во

всех последующих экспериментах были использованы праймеры, которые были локализованы внутри экзонов, поэтому продукты амплификации РНК и ДНК имели разные размеры и на геле легко могли быть дифференцированы друг от друга.

Рис. 2 Экспрессия Tgfa в нормальных (НЭ1, 2, 3) и партеногенетических (ПЭ1, 2, 3) 9,5-дневных эмбрионах мышей. Для

синтеза кДНК использовалось равное количество тотальной РНК (50 нг). В качестве внутреннего контроля использовали ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (Gapdh).

В постимплантационном периоде у нормальных мышей наиболее высокий уровень TGFa-мРНК наблюдается на 9-е сутки эмбриогенеза, хотя экспрессия гена Tgfa в развивающихся нормальных и партеногенетических эмбрионах устанавливается па ранних доимплантационных стадиях, начиная со стадии 4-х бластомеров (Harada et al., 1997). Ранее при изучении методом гибридизации in situ отдельных эмбриональных тканей мышей было показано, что TGFa синтезируется в клетках плаценты и различных тканей зародыша (Wilcox, Derynck, 1988).

Результаты наших исследований показали, что экспрессия Tgfa в партеногенетических эмбрионах ниже, чем в нормальных эмбрионах мышей. Это может происходить из-за слабого развития плаценты и различных тканей эмбриона по сравнению с нормой. Если мы обратимся к автокринному и паракринному эффектам этого фактора, то можно объяснить различия в экспрессии у нормальных и партеногенетических эмбрионов, поскольку чем больше масса клеток, тем больше авто- и паракринный эффект и тем выше экспрессия.

Таким образом, полученные нами данные о более низком уровне экспрессии гена Tgfa в партеногенетических зародышах по сравнению с нормальными зародышами мышей позволяют считать гипотезу о влиянии TGFa на экспрессию гена Igf2 правомочной. Инкубация партеногенетических зародышей in vitro с TGFa, по-видимому, повышает концентрацию TGFa в клетках и способствует реактивации Igf2 и дальнейшему развитию партеногенетических зародышей.

2.2. Анализ экспрессия генов Igf2 и HI 9

Изучение экспрессии генов Igf2 и Н19 в 9,5-дневных партеногенетических эмбрионах мышей, обработанных TGFa , и их плацентах показало, что обработка TGFa реактивирует

НЭ1 НЭ2 НЭЗ

ЛЭ1 ПЭ2 ПЭЗ

1дй

400

экспрессию Т^/2 как в самих зародышах, так и их плацентах (рис.3). Во всех экспериментах анализировалась эмбриональная часть развивающейся плаценты, которая для удобства

обозначается здесь и далее термином «плацента».

А)

ИР яи* <m>ltfl

Рис.3. Анализ экспрессии генов /^/2 и И19 в 9,5-дневных нормальных (НЭ) и обработанных ТвРв партеногенетических эмбрионах (ПЭ) и их плацентах с использованием ОТ-ПЦР. Разделение продуктов амплификации проводили в 6%-ном полиакриламидном (А) и агарозном (Б) гелях. А - продукты амплификации /й/2 и Н19 в плаценте и Н19 - дорожки 1 и 2 соответственно) и ПЭ, обработанных ТСРа и Н19 - дорожки 3 и 4 соответственно); маркер М50 (дорожка 5); отрицательный контроль, Н2О (дорожка 6); продукты амплификации 1^2 и Н19 у нормального эмбриона (дорожки 7 и 8 соответственно). Б -продукта амплификации генов 1^2 и Н19 в НЭ (дорожка 1) и ПЭ, обработанных ТОРа (дорожки 2-5).

Полученные нами результаты согласуются с работами ряда исследователей, установивших, что TGFa способен модулировать экспрессию некоторых генов (Babalola, Schultz, 1995). Харрис с соавторами (Harris et al., 1998) сообщили о дерепрессии импринтированного материнского аллеля Igf2 в клетках печени мышей в результате эндогенной индукции трансгена TGFa, что приводило к канцерогенезу печени. Инсулиноподобный ростовой фактор 2 (IGF2) является мощным стимулятором пролиферации клеток в эмбриогенезе млекопитающих. Обработка IGF2 партеногенетических эмбрионов мышей сомитаых стадий развития in vitro приводит к значительному продлению их развития по сравнению с контролем (Penkov et al. 2001). Можно предположить, что пролонгирование развития партеногенетических эмбрионов мышей, обработанных в преимплантационном периоде TGFa в дозе 10 нг/мл, обусловлено, главным образом, дерепрессией импринтированного аллеля Igfi.

В качестве маркерного гена первоначально использовали ген Gapdh (рис.ЗА), однако, в последующих экспериментах в качестве внутреннего контроля рассматривали экспрессию гена HI 9, поскольку он экспрессируется как в нормальных, так и в партеногенетических эмбрионах мышей.

Сравнительный анализ экспрессии /£/2 и Н19 у обработанных и необработанных партеногенетических и нормальных 9,5-дневных эмбрионов мышей показал, что 1^2 экспрессируется в обработанных ТОРа эмбрионах, но уровень его экспрессии ниже, чем в нормальных эмбрионах (рис. 4).

300 250

Рис. 4 Экспрессия Igf2 и Н19 в необработанных и обработанных TGFa партеногенетических и нормальных 9,5-дневных эмбрионах мышей. Экспрессия Igf2 я HI 9 у нормального эмбриона (дорожка 1), у обработанного (дорожка 2) и у необработанного TGFa (дорожка 4) партеногенетического эмбриона; маркёр, М50 (дорожка 3). Для синтеза кДНК использовалось равное количество тотальной РНК (35 иг).

Интересно отметить, что экспрессия HI9 в обработанных TGFa партеногенетических эмбрионах ниже, в необработанных партеногенетических и нормальных эмбрионах (рис.4). Эти результаты позволяют предположить, что в обработанных партеногенетических эмбрионах дерепрессия Igf2 сопровождается подавлением HI 9, который в партеногенетических эмбрионах мышей экспресируется биаллельно. Неизвестно, происходит ли более низкая экспрессия Н19 из-за репрессии одного аллеля Н19 в обработанных партеногенетических эмбрионах или оба аллеля работают слабее, чем в необработанных TGFa эмбрионах. Для определения, сколько аллелей работают в обработанных TGFa эмбрионах, необходимо наличие полиморфизма для выявления отцовского и материнского аллелей. Отсутствие такого полиморфизма не позволило выяснить этот вопрос.

Таким образом, с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР подтверждены ранее полученные методом гибридизации in situ данные (Платонов и др., 2001), что обработка in vitro TGFa партеногенетических эмбрионов мышей перед их трансплантацией в матку ложнобеременным самкам приводит к реактивации экспрессии импринтированного гена Igfl. Тем не менее оставалось неясным, насколько специфична реактивация гена lgf2: происходит ли под влиянием TGFa в партеногенетических эмбрионах неизбирательная активация промоторов Igf2 или активируются те же промоторы, которые активны и у нормальных эмбрионов. В связи с этим нами был исследован уровень экспрессии lgf2 с разных промоторов у обработанных TGFa партеногенетических эмбрионов.

2.3. Дифференциальный анализ экспрессии 1ц/2 с разных промоторов у партеногеиетических зародышей мышей, обработанных ТвРа

Ген 1^7 у мьппи имеет 3 промотора (Р1, Р2 и РЗ), которые активны в эмбрионе, и

промотор Р0, который активен в плаценте (рис.5). Для анализа экспрессии гена /¿/2 с разных

промоторов была использована мультиплексная ОТ-ПЦР с помощью прямых праймеров И,

12 и 13 и обратного праймера 17 (рис.5). Продукты амплификации различались по длине в

зависимости от того, какой промотор был активен в исследуемом эмбрионе (рис.5).

Р0 Р1 Р2 РЗ Рис. 5. Структура гена 1ц/2 у мыши и

локализация использованных праймеров.

Мультиплексная ОТ-ПЦР была выполнена с 01 т В1 В2 ЕЗ Е4 Еб помощью прямых праймеров 1Р1, П>2 и 1РЗ,

■+" расположенных в экзонах Е1, Е2 и ЕЗ

и т то 1Р7 соответственно, и обратного праймера 1Р7,

расположенного в экзоне 6.

Сравнительный анализ продуктов амплификации, полученных с помощью различных прямых праймеров, позволял определить, какой из промоторов используется в исследованных эмбрионах и оценить уровень их активности (рис.6).

промоторов Р1, Р2 и РЗ у нормального (дорожки 1-3 соответственно) и партеногенетического эмбрионов

(дорожки 7-9 соответственно); мультиплексная ОТ-ПЦР у нормального (дорожка 4) и партеногенетического (дорожка 6) эмбрионов. Маркер - дорожка 5. Для синтеза кДНК использовалось одинаковое количество тотальной РНК (35 иг).

Дифференциальный анализ экспрессии с разных промоторов показал, что у партеногеиетических эмбрионов под воздействием ТвРа реактивируются все эмбриональные промоторы, но они работают слабее, чем промоторы у нормальных эмбрионов. Наиболее сильный промотор - Р2, как и у нормальных зародышей. Уровень экспрессии с промоторов РЗ и, в особенности, Р1 существенно ниже. У паргеногенетических контрольных эмбрионов (необработанных ТвРа) экспрессия гена 1^2 не наблюдалась ни с одного из промоторов. В экспериментах было исследовано 4 обработанных и 4 необработанных ТвРа 9,5-дневных партеногеиетических эмбриона мышей.

/иг , 1ит

Ц^ ШХ9 >"-1 ш »Я

^ Н1 м „, ■>» м* 1МТ

«в шМче

Рис.6 Дифференциальная экспрессия 1%]7 с разных промоторов в партеногенетическом и нормальном эмбрионах мыши на 9.5-й день беремености. Экспрессия 1^2 с

В плацентах партеногенетических зародышей промоторы Р1, Р2 и РЗ под воздействием ТвРа не активируются и экспрессии 1^2 с этих промоторов не наблюдается (рис.7).

Рис.7. Электрофоретнческий анализ продуктов амплификации мультиплексной ОТ-ПЦР у нормальных I 2 з 4 5 эмбрионов (Э1, 2) и тканей плацент

§(ПЛ1, 2, 3), обработанных ТвРа, 9,5-дневных партеногенетических

эмбрионов. Мультиплексная ОТ-ПЦР дм* щ выполнена с вышеупомянутыми

^^ ^^ ^ ш ^ 0тм» праймерами (см. рис.5). В качестве

"" ^^ внутреннего контроля использовалась

амплификация гена Н19. Экспрессия гена 1^2 с промоторов Р1, Р2 и РЗ в нормальных зародышах (дорожки 1 и 2) и в плацентах обработанных ТОБа партеногенетических эмбрионов (дорожки 3-5).

У взрослой мыши экспрессия 1^2 останавливается в большинстве тканей, за исключением центральной нервной системы (1(НС), в клетках которой экспрессируются оба аллеля (Ни е1 а1., 1995). Экспрессия 1^2 от каждого из родительских аллелей отличается в различных регионах ЦНС В оболочках мозга /я/2 экспрессируется с промоторов Р1-РЗ, главным образом, с отцовского аллеля, в то время как в некоторых других областях ЦНС экспрессия осуществляется прежде всего с материнского аллеля (Ни е1 а]., 1995). В наших исследованиях мы анализировали эмбрионы целиком, поэтому не можем судить о различиях в экспрессии между отдельными тканями эмбриона, чего, однако, нельзя исключать.

Таким образом, реактивация экспрессии гена у партеногенетических эмбрионов под воздействием ТвРа происходит специфично, причем наиболее сильная экспрессия наблюдалась с промотора Р2, в норме также наиболее сильного.

2.4. Анализ экспрессия /¿/2 в нормальных и партеногенетических бластоцистах обработанных и необработанных ТСГо

Экспрессию 1^2 анализировали с помощью двухэтапной ОТ-ПЦР. Прямые праймеры первого этапа были локализованы в промоторах Р2 или РЗ, а обратный праймер в 6-ом экзонс. Второй этап был выполнен с использованием 2 мкл продукта первого этапа с праймерами, одинаковыми для ампликонов с обоих промоторов и локализованными внутри

амплифицируемой на первом этапе области (в 5 и 6-ом экзонах). При анализе групп необработанных и обработанных TGFa партеиогенетических бластоцист с праймерамн, специфичными для Р2, было показано, что Igf2 экспрессируется в обеих группах. В обработанных TGFa партеиогенетических бластоцистах анализ экспрессии Igf2 проводили с праймерамн для двух промоторов: Р2 и РЗ. Полученные результаты показали, что Igf2 экспрессируется с обоих промоторов - Р2 и РЗ.

В обработанных TGFa партеиогенетических бластоцистах практически 100% бластоцист, экспрессирующих HI9 (Н19+), экспрессируют и Igf2(Igf2+), а у необработанных - только 53.85% (G =7,089, df=2, р=0,03).

Для проверки, не влияет ли на экспрессию исследуемых генов сам факт культивирования бластоцист in vitro, был проведен анализ экспрессии генов с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Стандартные кривые были получены с помощью ОТ-ПЦР с теми же праймерамн, но с РНК, полученной из нормального эмбриона. Показано, что экспрессия Igf2 в некультивированных нормальных бластоцистах выше, чем в культивированных (рис. 8), т.е. культивирование бластоцист в культуральной среде снижает уровень экспрессии гена Igf2 (таб.2).

Cyd.

Рис. 8. Сравнительный анализ экспрессии Igf2 в нормальных бластоцистах (А), некультивированных (1) и культивированных (2) в питательной среде in vitro, и кривые стандартной ПЦР (В). Стандартные кривые обозначены (ск).

Ст между: Р

ПБ+ и ПЕ- 0.2467

НЕН- и НБ- 0.0037

ПБ- и НБ+ 0.1479

ПБ- и НБ- 0.0002

ПБ+ иНБ+ 0.7404

ПБ+ иНБ- 0.0020

ПБ+/-ИНБ+ 0.3509

ПБ+/-иНБ- 0.0005

Таб. 3 Результаты анализа

пороговых циклов. Ст: пороговый цикл (цикл, в котором начинается логарифмическая кривая); ПБ+: обработанная партеногенетическая

бластоциста; ПБ-: необработанная партеногенетическая бластоциста; НВ+: культивированная нормальная бластоциста; НБ-: некультивированная нормальная бластоциста

Анализ экспрессии в необработанных и обработанных ТОБа

партеногенетических бластоцистах не выявил различий между ними по уровню экспрессии (рис. 9). Сравнительный анализ результатов показал, что в группе партеногенетических бластоцист существуют некоторые различия в уровне экспрессии и их кривые

амплификации расположены в диапазоне между культивированными и не культивированными нормальными бластоцистами.

Рис. 9. Экспрессия /£/2 в необработанных (1) и обработанных ТвРа (2) партеногенетических бластоцистах (А) и кривые стандартной ПЦР (В). Стандартные кривые обозначены (ск).

Сравнительный анализ Ст (пороговый цикл, в котором начинается логарифмическая фаза ПЦР) показал, что между культивированными нормальными бластоцистами и партеногенетическими бластоцистами, обработанными и необработанными TGFa, различия в Ст не достоверны (Р>0.05), а между перечисленными группами и некультивированными бластоцистами достоверны (Р< 0.01). Эти результаты указывает на влияние среды на развитие эмбриона. В наших экспериментах эффект влияния среды на культивированные необработанные и обработанные TGFa бластоцисты одинаков, поэтому сравнение между ними возможно.

Латэм с соавторами сообщили (Latham et al. 1994), что экспрессия Igß в бластоцистах выше, чем в 2- и 8- клеточных эмбрионах, причем в 2-клеточном эмбрионе выше, чем в 8-клеточном. Эта картина хорошо совпадает с картиной деметилирования и последующего реметилирования после образования зиготы, когда уровень метилирования до стадии морулы уменьшается, а затем увеличивается (Lopes et al., 2003). После имплантации происходит репрессия гена Igß в партеногенетическом эмбрионе. По-видимому, TGFa блокирует этот процесс и Igß продолжает экспрессироваться одновременно с HI 9.

Таким образом, выполненные исследования позволили установить, что в модельных условиях существует возможность модулировать эффекты геномного импринтинга с помощью определенных экзогенных пептидпых ростовых факторов, в частности TGFa. Полученные данные позволяют надеяться, что в дальнейших экспериментах будет отработана рецептура смеси нескольких соединений для их совместного аддитивного действия с целью инициирования процесса нормального развития (Пепков, 2005). С генетической точки зрения такой подход может быть назван «нормокопированием», т.е. нормализацией фенотипа при патологическом генотипе (Бочков, 2001).

3. Анализ метилирования генов Н19 и 1е(2

В пределах импринтированого кластера на дистальной хромосоме 7 у мыши расположены два субдомена, которые регулируются раздельно (Reik, Walter, 2001). Один из этих субдоменов содержит Igß, который экспрессируется с отцовского аллеля, и ген HI9, который экспрессируется с материнского аллеля. В пределах этого субдомена существует четыре региона диференциального метилирования (DMRs, рис. 10).

В данной работе исследован характер метилирования ДНК в дифференциально метилируемых регионах импринтированного локуса Igß-H19 у партеногенетических эмбрионов мышей, обработанных in vitro TGFa, и у контрольных партеногенетических эмбрионов мышей (необработанных TGFa) на 9.5-й день беременности.

Рис. 10. Дифференциально метилируемые регионы генов Н19 и Ig/2. /g/2-DMRl, /g/2-DMR2 и Я/P-DMR метилируются в отцовском аллеле, Igf2-DMR0 - в материнском аллеле.

Я/P-DMR у отцовского аллеля метилируется и содержит инсулятор и сайленсер. Я/P-DMR находится перед Н19 и ограничивает, когда неметилирован, доступ к энхансерам Igf2, расположенным после гена Н19 (Lopes et al., 2003). DMR1 находится перед эмбриональными промоторами lgf2, содержит метил-чувствительный сайленсер и в отцовском аллеле гиперметилируется (Edén et al., 2001; Constancia et al., 2000). DMR2 расположен в пределах 5-ого и 6-ого экзонов Igf2 и содержит метил-чувствительный активатор (Murrell et al., 2001; Feil, 1994). Функция DMR0, который расположен в промоторе Р0 у Igf2, в настоящее время неизвестна (Moore et al., 1997).

Секвенирование геномной ДНК, модифицированной бисульфитом, - наиболее мощный метод для определения характера метилирования ДНК. Следует отметить, что образцы ДНК, которые были получены нами после выделения РНК, были первоначально использованы для анализа экспрессии HI9 и Igf2. В связи с этим количество материала, доступного для анализа, было очень мало, что делало необходимым выполнение экспериментов на высоком уровне чувствительности и воспроизводимости. Нами была использована улучшенная модификация бисульфитного метода (Olek, 1996). Стратегия метода состояла в том, что бисульфитная обработка и последующие шаги ПЦР проводились на материале (ДНК), упакованном в агарозные шарики. Это предотвращало потерю ДНК в ходе экспериментальной процедуры и гарантировало оптимальную активность бисульфита, поддерживая ДНК в одноцепочечной форме. Сохранение ДНК в одноцепотечной форме является важным шагом. Агароза блокирует ренатурацию ДНК, поэтому цитозины в последовательности ДНК полностью превращаются в урацил, а 5-метилцитозины сохраняются без изменения. Таким образом, данная модификация бисульфитного метода облегчает проведение исследований, обеспечивает хорошую воспризводимость и позволяет достичь высокого уровня чувствительности.

Обработанная бисульфитом ДНК, выделенная из двух необработанных и двух обработанных TGFa партеногенетических 9,5-дневных эмбрионов, была амплифицирована с помощью двухэтапной ПЦР. Для каждого индивидуального эмбриона после бисульфитной

Í. .Гц

а»

в a

ПК

обработки их ДНК получали несколько ПЦР-продуктов, клонировали и затем секвенировали 2-3 клона, полученных от каждого эмбриона (один из каждого ПЦР-продукта).

3.1. Карта метилирования гена И19

Первичная структура исследуемых нами фрагментов двух регионов (А и В) в пределах Н19-Т)МЛ, включающих 35 СрСт-сайта, представлена на рис. 11.

и* 141?

* >* _

ДА

одсташикмсмастяслгкэнэдр^

_ _._*_

*сии>ттг1».гмл1Ш,1>1,1|]дил1. ,1*1 ц иьищщщ шиа*

I* ^

сггосслм! ггхцоиама^ттсшхгслдсАМ^

ототоииыьготатосйсстстоам^

+ * _ _# ,

ИИРПИ1МТ1 ПЛ1

наявияоаяяммосшмгдимам» и • -мш теисмяцдитугжцмигстецавта^г»^^

И* II*

шшшядвштмммесис

алтпсхамюпставтплппапгшг» I «щчиицаиА.тц.'ИОж: 1 тщхст

* * * * __ *

_* хьг _+

иаиааанеиидсяиамтичщ« итацдплнцицмищщця.

Рис. 11. Нуклеотндная последовательность исследуемых ОМК-регионов, локализованных в области, прилегающей к 5'-концу гена Н19, а локализация в них Ср<3-сайтов. Координаты и последовательность амплифицируемых фрагментов регионов Л и В приведены относительно начала транскрипции Н19 в соответствии с последовательностью Ш9619, приведенной в базе данных ОепВапк ^агпеске е1 а1., 1998а). Срв динуклеотиды подчеркнуты и даны их обозначения.

Регион А расположен в пределах 1417-1158 п.н. до начала транскрипции гена Н19 (1Л9619, ОепВапк). В этом регионе находятся 11 Срв, которые после обработки бисульфитом инвертируются в ирв, если неметилированы, остальные 56 цитозинов, присутствующие в данном фрагменте, также инвертируются в урацил. Метилированный цитозин остается без изменения. В использованных нами условиях после обработки бисульфитом имеющийся цитозин практически полностью (98-100%) превращается в урацил, который в процессе амплификации заменяется тимином.

Согласно нашим данным нуклеотидные последовательности клонов амплифицированных фрагментов региона А Н19-Т)МЯ, полученных из двух 9.5-дневных партеногенетических эмбрионов мышей, обработанных ТОРа, неметилированы, кроме Срв в участках 1А-4А 5'-концевой последовательности исследуемого фрагмента. Срв участки

1А-4А являются потенциальными мишенями для ДНК-метилтрансферазы (Wamecke et al., 1998b).

Регион В находится в пределах 2621-3165 п.н. до начала транскрипции гена Н19 (U19619, GenBank) и включает 24 CpG-учаспса.

Карты метилирования регионов А и В у партеногенетических зародышей мышей, обработанных TGFa, приведены на рис. 12. Наши данные показали, что эти регионы гипометилированы у партеногенетических зародышей, обработанных TGFa. Их паттерны метилирования похожи на паттерны метилирования материнского аллеля (Lopes et al, 2003; Warnecke et al., 1998a).

Регион А

1 23 4 5 6789 1011

-•----©-©----©----©—©©-©© — ©© -la

-Ф----------ф-----©--© ©-© ©-© © -16

------©-© — © — © — © ©-© © —© © -2a

----------©----© — ©©-©©-©© -26

Регион В

-©-©©© — © — О-//--© ©-©-©-©----©-//-© — © © ©-©— © © Q — ©-© •-© -la

R2 R3

Б)

Rl: gttgTCGCGTGGTGGCAGCAAAATCgatt (в регионе А) R3: gataCCGCGCGGTGGCAGCATACTCctat (в регионе В) R4: gatgCCGCGTGGTGGCAGTACAATActac (в регионе В)

Рнс. 12 А) Карты метилирования регионов А и В Я/9-DMR отдельных клонов у партеногенетических 9,5-дневных эмбрионов мышей, обработанных TGFa. Образцы ДНК деметилировали бисульфитом натрия, амплифицировали, клонировали и секвенировали. © - неметнлированные CpG; • • метилированные CpG; сайты связывания CTCF подчеркнуты. Цифрами и буквами справа обозначены эмбрионы и клоны соответственно.

Б) Последовательность повторов в сайтах связывания CTCF.

Я/9-DMR считается иисулятором и чувствителен к метилированию (Hark et al., 2000; Bell, Felsenfeld, 2000). Этот инсулятор имеет сайты связывания СТС-связывающего фактора транскрипции (CTCF). Инсулятор в материнском аллеле у нормального зародыша неметилирован, поэтому CTCF может связываться, и блокирует энхансеры, в результате чего HI9 включен, a Igf2 выключен. В отцовском аллеле, наоборот, инсулятор метилирован. Это блокирует связывание CTCF, поэтому энхансеры имеют доступ к Igf2, в результате чего Н19 выключен, a Igf2 включен. В регионах А и В расположены 3 сайта связывания CTCF (Rl, R3 и R4, рис.12 Б) (Engle et al., 2004), которые по нашим данным неметилированы в 9,5-дневных партеногенетических зародышах мышей, обработанных TGFa (рис. 12). Это означает, что либо происходит реактивация Igf2 независимо от инсулятора и CTCF, либо работают другие механизмы регуляции.

Мутации в CTCF могут изменить способность CTCF узнавать эпигенетические маркеры и стать причиной некоторых форм опухолей, поскольку эпигенетические нарушения обычны при возникновении опухолевых заболеваний человека (Feinberg, 2001). Например, дерепрессия материнского аллеля IGF2 связана с неправильным метилированием CTCF-специфичных сайтов в пределах H19-DMR в широком диапазоне типов рака (Allshire, Bickmore, 2000; Tycko, 1999; Reik et al., 2000). Это может привести к невозможности для CTCF установления функции инсулятора на материнском аллеле (Holmgren et al., 2001). Переход эпигенотипа от материнского к отцовскому может происходить из-за нарушений в защите метилирования в процессе развития соматических клеток или клеток зародышевого пути у самок, приводя, таким образом, к утрате функции инсулятора.

Филиппова и другие (цит. по Ohlsson et al., 2001) идентифицировали несколько конкретных мутаций в опухолях и анализировали их влияние на эффективность связывания CTCF с его сайтами в инсуляторе. Показано, что продуцируемые опухолевые мутации блокируют связывание CTCF с Igf2/Hl S-DMR-сайтами, устраняя или снижая CTCF взаимодействие с промоторами этих генов. Мутации в CTCF изменяют материнский тип метилирования в Я/9-DMR и других CTCF-специфичных сайтах, что приводит к их неправильному метилированию. Наши результаты, соответствуют промежуточному положению между стадиями, которые показаны на рис.13, а именно, Я/9-DMR неметилированы, но Igf2 экспрессируется. По-видимому, TGFa непосредственно блокирует связывание CTCF с иисулятором или необходимые этапы посттрансляционной модификации, например, такие как поли-АДФ-рибозилирование. Последние исследования показали, что поли-АДФ-рибозилирование CTCF регулирует его деятельность как инсулятора без изменения его ДНК-связывающих свойств (Yu et al., 2004; рис.13).

поли-АДФ-рвбоаы

CTCF —- HZ \

пмспипфюяпшн

III

метилированный DM1

Рис. 13 Поли-АДФ-рибозилирование CTCF-фактора. А) В результате поли-АДФ рибозилирования CTCF-фактора в материнском аллеле экспрессируется только Н19. В) Мутации в гене поли-АДФ-рибозополимеразы (PARPs). С) CTCF-фактор связывается с инсулятором, но оба гена Н19 и Igß экспрессируются. При обработке TGFa нами обнаружена сходная ситуация, при которой оба гена Н19 и Igß экспресируются, но Н19-DMR неметилированы. D) В конце процесса экспрессируется только Igß и W79-DMR метилированы (Jeong, 2004).

3.2. Карта метилирования областей DMR1 и DMR2 гена Igß.

Нами исследованы паттерны метилирования /g/2-DMRl и -DMR2 у 9.5-дневных партеногенетических зародышей мышей, обработанных TGFa, и у необработанных партеногенетических зародышей того же возраста.

/g/2-DMRl находится перед эмбриональным промотором PI (фрагмент протяженностью 12814-13334 п.н., U71085, GenBank) и содержит 7 CpG-сайтов. Igf2-VMR2 находится в пределах 5-ого и 6-ого экзонов (фрагмент протяженностью 23974-24572 п.н., U71085, GenBank) и содержит 31 CpG-сайт.

Карты метилирования DMR1- и DMR2-областей гена Igß у партеногенетических эмбрионов мышей, обработанных и необработанных TGFa, приведены на рис.14.

После оплодотворения происходит деметилирование DMR1 и DMR2. Минимальный уровень метилирования отмечен на стадии морулы (Lopes et а]., 2003). Поэтому в наших

экспериментах время обработки TGFa партеног енетических эмбрионов на стадии морулы приурочено к минимальному уровню метилирования.

А)

/£2-DMRl(+TCFa)

о-в-«-•-•-«—о -1»

о—0-о-•-©-о—о -и

о—-•-в-о—О -2*

О—-•-в-©—в -26

•—-в-О-О—в -2в

ДО-DMRl (-TGFa)

О—-•-О-О—• 1»

О—-О-•-• — О 16

о-в-*-•-©-©—© 1в

©-•-•-•-©-©—« 2л

?—•-©-в-©-О—© 26

в—-О-•-• — О 2»

Б)

/¿2-DMR2(+TGFa)

1-5-10-15-20-25-30—

9-90-9-9- - -90--0S9-0-0- --9----О- - -те-©--ОООО- -ООOO-ee-0-OO-Ola

—оо- -©о©-©-©—о----о—вэ-в- -soso- -oaso-sö-o-Qo-oie

О-вО-О-О---00--00©-©-©---О----0---ОО-О- -0000- -•©•О-ОО-О-вЭ-02»

•-••-•-О---00- -000-0-0---О----О---00-©- -OQQO- -00э*-00-0-00-026

Ехоп5 Intron5 Ехопб

/¿/2-DMR2 (- TGFa)

©-ОО-в-О---во- -ООО-О-в---•----О- - -00-0- -«ООО- -OOOO-GO-O-OO-Ola

а-оо-о-в—во- -©оо-©-©—о----о—оо-о- -оооо- -oeoo-eo-o-oe-aie

O-QO-O-9---•©--•••-0-*---©----©---00-0- -ООО©--ОО0О-©©-О-©0-©2а

о-оа-в-9—90--еее-о-о—©----©—о©-о- -еве©--оов©-о©-о-оф-о2б

О-Ов-О-О- - -00- -©ЭО-О-О---©----О---оо-о- -0000- -OOOO-OO-0-OO-O2B

ЕхопЗ Intron} Ехопб

Рис. 14 А) Карты метилирования DMR1(A) и DMR2 (Б) локуса Igß отдельных клонов у партеногенетических 9,5-дневных эмбрионов мышей, обработанных и необработанных TGFa. Образцы ДНК деметилировали бисульфитом натрия, амплифицировали, клонировали и секвенировали. © - неметилированные CpG; • - метилированные CpG. Цифрами и буквами справа обозначены эмбрионы и клоны соответственно.

Сравнение профилей метилирования области ig/2-DMRl по семи CpG-сайтам показало сходный характер метилирования в обеих группах 9,5-дневных партеногенетических эмбрионов мышей (обработанных и необработанных TGFa).

Сравнение ОМК2-последовательностей в двух группах 9,5-дневных партеногенетических эмбрионов мышей (обработанных и необработанных TGFa) выявило различия в профилях метилирования, особенно в CpG-динуклеотидах, расположенных в 5-ом экзоие (CpG 1-6). CpG динуклеотиды, находящиеся в коровом регионе 6-ого экзона (CpG 1625) гипометилированы. Мурелл с соавторами (Murell, 2001) предполагают, что

метилирование корового региона (CpG 16-25) играет важную роль в инициации экспрессии lgf2 с отцовского аллеля. В нашем случае, после обработки TGFa , CpG-динуклеотиды, находящиеся в 5-ом экзоне (CpG 1-5) приобретают метилирование, что, возможно, и является причиной реактивации Igf2.

Родительски-определенные взаимодействия между DMRs обеспечивают эпигенетическое выключение Igf2. В материнском аллеле неметилированные Я/9-DMR (с которыми связывается CTCF и, возможно, другие белки) и /g/2-DMRl взаимодействуют, пространственно сближая две области хроматина: Н19ъ активной области с энхансерами и Ig/2 в неактивной области, недоступной для энхансеров. В отцовском аллеле метилированный Я/9-DMR взаимодействует с метилированным 7g/2-DMR2 через предполагаемые белковые факторы, перемещая Igf2 в активную область хроматина. Местоположение DMR2 в конце Igf2 располагает промоторы гена рядом с энхансерами, находящимися после HI 9. Хотя HI 9 находится в активной области хроматина, он остается молчащим из-за метилирования ДНК (Murrell, et al. 2004). В соответствии с нашими результатами между обработанными и необработанными эмбрионами различия в уровнях метилирования в области DMR2 выше, чем в DMR1. Это позволяет предполагать, что приобретение метилирования DMR2 после обработки TGFa in vitro играет важную роль в реактивации Igf2 в партеногенетических эмбрионах. По-видимому, метилирование DMR2 необходимо для образования комплекса между DMR2 и Я/9-DMR.

Итак, Ig/2 экспрессируется в преимплантационных партеногенетических эмбрионах мыши. Импрннтинг гена lgf2 после имплантации эмбрионов в стенку матки приводит к его умолканию. Обработка партеногенетических эмбрионов мышей TGFa на стадии морулы приводит к увеличению числа преимплантационных эмбрионов, в которых экспрессируется ген Igf2, а после трансплантации в матку ложнобеременных самок к реактивации этого гена. Реактивация сопровождается метилированием /g/2-DMR2, что указывает на ключевую роль в реактивации гена Igf2 метилирования /g/2-DMR2 в 5-ом экзоне.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что экспрессия гена трансформирующего ростового фактора альфа (Tgfa) в партеногенетических эмбрионах значительно ниже, чем в нормальных эмбрионах мышей на 9.5-й день беременности.

2. Под воздействием экзогенного TGFa в партеногенетических эмбрионах и тканях развивающейся плаценты мышей ген инсулиноподобного ростового фактора (Igf2) реактивируется на 9,5-й день беременности, но его экспрессия ниже, чем в нормальных эмбрионах мышей.

3. Впервые показано, что в обработанных TGFa 9,5-дневных партеногенетических эмбрионах мышей гены Igß vi Hl 9 экспрессируются одновременно. Экспрессия гена HI 9 в обработанных TGFa партеногенетических эмбрионах ниже, чем в нормальных и необработанных партеногенетических эмбрионах мышей.

4. Обработка TGFa увеличивает процент выхода партеногенетических бластоцист, в которых экспрессируется Igß. Культивирование зародышей in vitro до стадии бластоцисты снижает уровень экспрессии гена Igß, по сравнению с развитием нормальных эмбрионов in utero.

5. Впервые продемонстрирована избирательность действия TGFa на реактивацию промоторов Igß у 9,5-дневных партеногенетических эмбрионов и в тканях плаценты мышей: под воздействием TGFa промоторы Р1-РЗ гена Igß реактивируются в партеногенетических эмбрионах, но не в их плацентах; наиболее выраженная экспрессия Igß происходит, как и в нормальных эмбрионах, с промотора Р2.

6. Дифференциально метилируемые регионы (DMR) А и В гена Hl 9 гипометилированы у 9,5-дневных партеногенетических зародышей, обработанных TGFa, и их паттерны метилирования сходны с таковыми у материнского аллеля нормальных зародышей. Три сайта связывания CTCF фактора транскрипции (Rl, R3 и R4) в регионах А и В у партеногенетических зародышей не метилированы на 9,5-й день беременности.

7. Сравнение профилей метилирования DMR1 и DMR2 гена Igß в группах обработанных TGFa и необработанных 9,5-дневных партеногенетических эмбрионов мышей позволило впервые установить роль метилирования CpG-островков 7g/2-DMR2 (CpG 1-6), расположенных в 5-ом экзоне гена, в регуляции экспрессии Igß.

Публикации по материалам диссертации

1. Rostamzadeb J., Penkov L.E., Klimov E.A., Platonov E.S., Sulimova G.E. Molecular-genetical effects of TGFa on the embryonic development of parthenogenetic mice// Proceedings of the XI International Conference "New Information Technology in Mcdicine, Biology and Ecology (IT + ME'2003)". Ukraine, Gurzuf, 2003, pp 43-44.

2. Rostamzadeh J., Penkov L.E., Klimov E.A., Platonov E.S., Sulimova G.E. Reactivation of the imprinted Igf2 gene in the parthenogenetic mice embryos treated with TGFa// Современное состояние проблем и достижений в области генетики и селекции, Казахстан. Алматы. 2003. с.181.

3. Ростамзадех Д., Пенков Л.И., Климов Е.А., Платонов Е.С., Сулимова Г.Е. реактивация гена Igp у партеногенетических мышей под воздействием трансформирующего ростового фактора (TGFa)» // 7-ая Путинская школа-конференция молодых ученых "БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА" Пущино. 2003. с.370.

4. Платонов Е.С., Пенков Л.И., Ростамзадех Д., Миронова О.В., Сулимова Г.Е. Моделирование эффектов геномного импринтинга и депрессия импринтированого гена Igf2 у партеногенетических эмбрионов мышей под влиянием трансформирующего ростового фактора альфа (TGFa) / Материалы III съезда ВОГИС «Генетика в XXI веке- современное состояние и перспективы развития». Москва, 6-12 июня 2004. Т.1. С. 389.

5. Rostamzadeh J., Penkov L.E., Platonov E.S., Sulimova G.E. Expression Igf2 imprinted gene in TGF-alpha treated parthenogenetic mouse embryos // Genomic imprinting Workshop 2004: twenty years of mammalian genomic imprinting. Montpellier. France, p.64.

6. Rostamzadeh, J., Penkov, L.I.,Platonov, E.S. and Sulimova, G.E. analysis of H19-Igft imprinted genes in TGFa treated parthenogenetic mouse embryos and placentas// The 12й1 Iranian Researchers Conference in Europe, UMIST, Manchester, United Kingdom. 2004. p. 250.

7. Rostamzadeh J., Penkov L.E., Platonov E.S., Sulimova G.E. Analysis of Igf2 and H19 differentially metylated regions (DMRs) of partenogenetic mice embryos treated with TGFa// International scientific conference on «Molecular genetics, genomics and biotechnology». Minsk. 2004. P. 20.

8. Rostamzadeh J., Penkov L.E., Platonov E.S., Sulimova G.E. TGFa as a modulator of imprinted mouse Igf2/H19 locus// Harwell imprinting conference 2005: Genomic imprinting, development and disease. Oxford, UK. 2005. P. 70.

9. Rostamzadeh, J., Penkov, L.I.,Platonov, E.S. and Sulimova, G.E. Modulation of imprinted mouse Igf2/H19 locus in the parthenogenetic mouse blastocysts treated with TGFa // The 13th Iranian Researchers Conference in Europe. Leeds, Uk. 2005. http://www.itce.OTg/va html ai=615

10. Ростамзадех Д., Исаев Д.А., Володина О.Ю., Климов Е.А., Платонов Е.С., Сулимова Г.Е. Анализ экспрессии импринтированного гена Igf2 в бластоцистах мышей методом Real-Time PCR// Съезд физиологов СНГ, Сочи. 2005.

11.Ростамзадех Д., Климов Е.А., Пенков JI.E., Рузина М.Н., Платонов Е.С., Сулимова Г.Е. Партеногенетические эмбрионы мышей как модель изучения эффектов геномного импринтинга // Сборник тезисов 9ой Путинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино, 2005. С.29.

12. Rostamzadeh J., Penkov L.E., Klimov E.A., Platonov E.S., Sulimova G.E. TGFa treatment effects of on the Igf2/H19 locus of parthenogenetic mouse embryo(PP), placenta(PP) and blastocyte (PB)// Proceedings of the ХП1 International Conference "New Information Technology in Medicine, Biology and Ecology (IT + ME'2005)". Ukraine, Guizuf, 2005, pp 39-40.

13. Rostamzadeb J., Penkov L.E., Klimov E.A., Platonov E.S., Sulimova G.E. TGFa reactivates imprinted Igf2 in the parthenogenetic mice embryos and placenta. // Genetika. 2005. V. 41. № 10. pp. 1387-1391.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД!1! 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 27.09.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 576. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Р1981Э

РИБ Русский фонд

2006^4 Т6353

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ростам Задех Джалал

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Эпигенетика и ее значение для биологии, сельского хозяйства и медицины

2.2. Практическое значение эпигенетики

2.2.1. Проблемы малигнизации тканей (Рак)

2.2.2. Наследственные болезни

2.2.3. Эпигенетические защитные механизмы

2.2.4. Сельское хозяйство

2.2.5. Клонирование

2.3. Геномный импринтинг

2.4. Генетические и эпигенетические особенности импринтированных генов

2.5. Цикл развития импринтов ^

2.5.1. Стирание импринтов

2.5.2. Установление импринтинга

2.5.3. Сохранение метилирования импринтов

2.6. Структура хроматина и экспрессия генов

2.7. Функция и эволюция геномного импринтинга

2.8. Геномный импринтинг и проблема партеногенеза у млекопитающих

2.8.1 Способность к партеногенезу в различных группах животных

2.8.2 Типы партеногенетических зародышей и особенности партеногенетического развития яйцеклеток млекопитающих

2.8.3 Получение индуцированных (искусственных) партеногенов млекопитающих

2.9. Развитие и причины гибели партеногенетических зародышей млекопитающих

2.10. Партеногенез и модуляция эффектов геномного импринтинга

2.10.1. Деметилирование ДНК

2.10.2. Влияние генетической среды на эффекты геномного импринтинга

2.10.3. Модуляция экспрессии генов полипептидными ростовыми факторами

2.10.4. Импринтинг и трансформирующие ростовые факторы

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Реактивы и оборудование, использованные в работе

3.2. Получение партеногенетических эмбрионов

3.3. Выделение РНК

3.4. Выделение ДНК после выделения РНК набором Trizol RNA Prep

3.5. Проведение обратной транскрипции и последующей полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)

3.6. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)

3.7. Дифференциальный анализ экспрессии импринтированого гена Ig/

3.8. Анализ экспрессии Ig/2 в бластоцистах (претрансплантированных эмбрионах)

3.8.1 Анализ с помощью двухэтапной ОТ- ПЦР

3.8.2 Анализ в режиме реального времени

3.9. Элюция ДНК из агарозных гелей

3.10. Бисульфитная обработка изолированной ДНК

3.11. Клонирование и секвенирование продуктов амплификации после бисульфитной обработки

3.12. Детекция продуктов амплификации в 6%-ном (9%-ом) полиакриламидном геле

3.13. Детекция продуктов амплификации в 2%-ном агарозном геле

3.14. Использованные в работе компьютерные программы

3.15. Компьютерные базы данных, использованные в работе

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1. Получение партеногенетических и нормальных бластоцист и эмбрионов мышей

4.2. Анализ экспрессии гена Tgfa и импринтированных генов Ig/2 и HI

4.2.1. Анализ экспрессии гена Tgfa

4.2.2. Анализ экспрессии генов Ig/2 и HI

4.2.3. Дифференциальный анализ экспрессии разных промоторов Ig/2 партеногенетических зародышей мышей под воздействием TGFa

4.2.4. Анализ экспрессии Ig/2 в нормальных и партеногенетических бластоцистах обработанных и необработанных TGFa

4.3. Анализ метилирования генов HI 9 и Igf

4.3.1. Карта метилирования гена HI

4.3.2. Карта метилирования областей DMR1 и DMR2 гена Ig/

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1. Экспрессия генов

5.2. Анализ метилирования локуса Igf2/H

6. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетический анализ экспрессии импринтированных генов Igf2 и H19 у партеногенетических эмбрионов мышей"

В конце XX столетия в рамках программы "Геном человека" была расшифрована нуклеотидная последовательность генома. Программа «Геном человека» ответила на важные вопросы о количестве генов, их структуре и устройстве генома человека, но не позволила ответить на главный вопрос - как работают отдельные гены и их ансамбли в различных клетках и тканях организма. Именно поэтому генетические исследования XXI века сместились в область функциональной геномики, главная задача которой заключается в выяснении механизмов реализации наследственной информации и установлении биологических функций генных продуктов. Так или иначе, эти исследования тесно связаны с проблемой индивидуального развития организма -ключевой проблемой современной биологии, которая и должна ответить на вопрос о том, каким образом из одной зиготы развивается организм с разнообразными клетками. За таким разнообразием стоит дифференциальная экспрессия генов в разных клетках развивающегося организма, имеющих одинаковый геном. Очевидно, установка и стабильное поддержание этих различий обусловлено, кроме всего прочего и эпигенетическим контролем генной экспрессии.

Эпигенетика представляет собой относительно новое направление в генетических исследованиях, проводимых на животных и растениях. Геномный импринтинг по своей природе относится к проблемам эпигенетики, которая изучает наследственные изменения в экспрессии генов, не связанные с изменением последовательности нуклеотидов ДНК.

Под геномным импринтингом понимают эпигенетический процесс, обуславливающий репрессию одного из двух аллельных генов, локализованного на материнской или отцовской хромосоме. Обычно у высших организмов имеется биаллельная экспрессия аутосомных генов и только у млекопитающих в участках генома, подверженных импринтингу, экспрессируется один материнский или отцовский аллель, то есть наблюдается моноаллельная экспрессия импринтированных генных локусов. Считается, что эти гены импринтированы в геноме их родителей и поэтому данный феномен называют родительским импринтингом, геномным импринтингом или гаметическим импринтингом. В последнее время для описания данного явления чаще используют термин - геномный импринтинг. Ранее считалось, что число импринтированных генов относительно невелико и составляет не более 0,1% (Barlow,

1997). Но в недавней публикации с помощью статистической модели, основанной на структурных характеристиках ДНК, Луди с соавт. (Luedi et al., 2005) предсказывают, что число таких генов существенно выше и потенциально импринтированными могут быть до 2.5 % аутосомных генов (из 23788 аннотированных анализированных аутосомных генов мыши их модель выделяет 600 генов). Из этого числа для 64 % генов предсказывается экспрессия с материнского аллеля. В геноме мыши к настоящему времени идентифицировано около 70 импринтированных генов (Murphy, 2003).

Результаты, полученные на мышах, могут быть использованы для идентификации подверженных импринтингу генов у человека, так как существует синтения между хромосомами или хромосомными районами человека и мыши (Мглинец и др. 1996). Установлена локализация некоторых импринтированных локусов у мыши, гомологичных импринтированным генам человека (De-Groot, Hochberg, 1993; Morison, Reeve, 1998; Tilghman, 1999). Многие аномалии развития и синдромы у человека обусловлены нарушением геномного импринтинга (Мглинец и др., 1996). Потеря импринтов, сопровождающаяся возникновением биаллельной экспрессии некоторых импринтированных локусов, может приводить к появлению раковых опухолей.

Полученные в последнее время экспериментальные данные Коно с соавторами (Kono et al., 2004) показывают, что изменение функционирования даже одной пары импринтированных генов (локуса Igf2/H19) может приводить к рождению партеногенетических мышей, хотя эффективность получения таких партеногенетических мышей крайне низка: из 457 реконструированных яйцеклеток родились две жизнеспособные мыши. Результаты этих авторов показывают принципиальную возможность получения партеногенетических млекопитающих путём изменения эффектов геномного импринтинга в эмбриогенезе.

Показано, что воздействие на пре- или постимплантацинных стадиях ростовыми факторами FGF2, FGF4, TGFa и IGF2 по отдельности или в комплексе друг с другом приводит к пролонгированию развития партеногенетических эмбрионов мышей (Пенков, Платонов, 1997, 1999; Penkov et al., 1996, 2001; Платонов и др., 2001, 2002). Авторы указывают, что ростовые факторы при введении извне способны влиять на эффекты геномного импринтинга в развивающихся партеногенетических эмбрионах. Поэтому в нашей работе в качестве модельной системы исследования механизмов геномного импринтинга (особенно в локусе Igf2/H19) было выбрано партеногенетическое развитие эмбрионов мышей.

Следует отметить, что, несмотря на пристальное внимание исследователей к изучению геномного импринтинга его эффекты в эмбриогенезе млекопитающих к настоящему времени изучены недостаточно. Единичные работы посвящены изучению обратимого характера импринтинга, возможности модулирования его эффектов в эмбриогенезе. Поэтому получение новых знаний в этой области несомненно важно как для развития реконструктивных технологий в животноводстве, так и для разработки новых подходов к профилактике и лечению наследственных болезней.

Целью данной работы является изучение молекулярно-генетических механизмов экспрессии импринтированных генов Ig/2 и Н19 у партеногенетических эмбрионов мышей под воздействием трансформирующего ростового фактора альфа (TGFa)

Были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать способность TGFa участвовать в реактивации гена инсулиноподобного ростового фактора 2 (Ig/2) в локусе Igf2/H19 у партеногенетических эмбрионов мышей на 9,5-й день беременности.

2. Исследовать экспрессию Tgfa у 9,5-дневных партеногенетических и нормальных эмбрионов мышей.

3. Исследовать эффект in vitro обработки TGFa на локус Igf2/H19 в партеногенетических бластоцистах мышей.

4. Исследовать экспрессию Igf2 с разных промоторов (PI, Р2 и РЗ) у 9,5-дневных партеногенетических эмбрионов мышей после обработки TGFa.

5. Исследовать характер метилирования дифференционально метилируемых регионов (DMRs) у генов Igf2 и HI 9 у обработанных и необработанных TGFa партеногенетических эмбрионов мышей на 9,5-й день беременности.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Ростам Задех Джалал

6. выводы

3. Впервые показано, что в обработанных TGFa 9,5-дневных партеногенетических эмбрионах мышей гены Igf2 и HI 9 экспрессируются одновременно. Экспрессия гена Н19 в обработанных TGFa партеногенетических эмбрионах ниже, чем в нормальных и необработанных партеногенетических эмбрионах мышей.

4. Обработка TGFa увеличивает процент выхода партеногенетических бластоцист, в которых экспрессируется Igf2. Культивирование зародышей in vitro до стадии бластоцисты снижает уровень экспрессии гена Ig/2, по сравнению с развитием нормальных эмбрионов in utero.

5. Впервые продемонстрирована избирательность действия TGFa на реактивацию промоторов Igf2 у 9,5-дневных партеногенетических эмбрионов и в тканях плаценты мышей: под воздействием TGFa промоторы Р1-РЗ гена Igf2 реактивируются в партеногенетических эмбрионах, но не в их плацентах; наиболее выраженная экспрессия Igf2 происходит, как и в нормальных эмбрионах, с промотора Р2.

6. Дифференциально метилируемые регионы (DMR) А и В гена HI 9 гипометилированы у 9,5-дневных партеногенетических зародышей, обработанных TGFa, и их паттерны метилирования сходны с таковыми у материнского аллеля нормальных зародышей. Три сайта связывания CTCF фактора транскрипции (Rl, R3 и R4) в регионах А и В у партеногенетических зародышей не метилированы на 9,5-й день беременности.

7. Сравнение профилей метилирования DMR1 и DMR2 гена Igf2 в группах обработанных TGFa и необработанных 9,5-дневных партеногенетических эмбрионов мышей позволило впервые установить роль метилирования CpG-островков 7g/2-DMR2 (CpG 1-6), расположенных в 5-ом экзоне гена, в регуляции экспрессии Igf2.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ростам Задех Джалал, Москва

1. Алтухов Ю.П., Клименко В.В. Положительная корреляция между уровнем индивидуальной гетерозиготноети и способностью к полному термическому партеногенезу у тутового шелкопряда // Доклады АН СССР. 1978. Т. 230. № 2. Р. 460462.

2. Астауров Б.Л. Искусственный партеногенез у тутового шелкопряда. М.-Л.: Изд-во АН СССР. 1940. с. 240.

3. Астауров А.П., Демин Ю.С. Партеногенез у птиц // Онтогенез. 1972. Т. 3. №2. С. 123- 143.

4. Астауров Б.Л. Отбор по способности к термическому партеногенезу и получение улучшенных по этому признаку партеноклонов шелковичного червя // Генетика . 1973. Т. 9. №9. С. 93-106.

5. Бараускене В.К. Исследование генетической структуры бисексуальных и партеногенетических поколений Daphnia magna II Канд. диссертация. Вильнюс. 1984. 141р.

6. Бочков Н.П. Вклад генетики в медицину// Актовая речь. Москва. Изд. "русский врач". 2001. с. 1-43

7. Дыбан А.П., Нониашвили Е.М. Партеногенез млекопитающих// Онтогенез. 1986. Т. 17. №4. С. 368-388.

8. Дыбан А.П., Хожай Л.И. Партеногенетическое развитие овулировавших мышиных яйцеклеток под влиянием этилового спирта // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1980. Т.139. С. 487-489.

9. Конюхов Б.В., Платонов Е.С. Геномный импринтинг у млекопитающих// Генетика. 2001. Т. 37. №1. С. 5-17.

10. Ляшенко А. А., Уваров В.Ю. К вопросу о систематизации цитокинов// Успехи современной биологии. 2001. Т.121. № 6. С.589-603.

11. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Дж. Молекулярное клонирование // М. Мир. 1984. 480С.

12. Мглинец В.А., Левина Л.Я., Константинова Л.М. Геномный импринтинг и синдромы Прадера-Вилли и Энджельмена // Генетика. 1996. Т.32. № 12. С. 1605-1615.

13. Назаренко С.А. Эпигенеические модификации генома и болезни человека// Медицинская генетика. 2004. Т. 3. № 2. С. 70-77

14. Пенков Л.И., Платонов Е.С. Изучение развития диплоидных партеногенетических зародышей мышей инбредных линий C57BL/6 И СВА // Онтогенез. 1992. Т. 23, № 4, С. 364-369.

15. Пенков Л.И., Платонов Е.С. Влияние факторов роста фибробластов (ФРФ-2, ФРФ-4) на развитие партеногенетических эмбрионов мышей// Онтогенез. 1999. Т.ЗО № 6. С. 448-452.

16. Платонов Е.С., Пенков Л.И., Конюхов Б.В. Трансформирующий ростовой фактор a (TGFa) модулирует эффекты геномного импринтинга и пролонгирует развитие партеногенетических эмбрионов мышей// Генетика. 2001. Т. 37. № 10. с. 1358-1363.

17. Платонов Е.С., Пенков Л.И., Нью Д.А.Т. действие двух ростовых факторов FGF2 и IGF2 на развитие партеногенетических эмбрионов мышей in utero и in vitroll Онтогенез. 2002. Т. 33. № 1. С. 60-67.

18. Платонов Е.С. Модуляция эффектов геномного импринтинга у млекопитающих: исследования на модельной системе — партеногенетических эмбрионах мышей// диссертация. 2003. с. 181.

19. Платонов Е.С., Пенков Л.И., Димитров Б.Д., Миронова О.В., Конюхов Б.В. Влияние ростовых факторов FGF4, TGFa и TGFp 1 НА развитие партеногенетических эмбрионов мышей C57BL/6 // Онтогенез. 2005. Т. 36. №2. с.144-149.

20. Терская Е.Р., Струнников В.А. Искусственный мейотический партеногенез у тутового шелкопряда // Генетика. 1975. Т.П. № З.С. 54-67.

21. Хадорн Э., Венер Р. Общая зоология. Пер. с нем. М.: Мир. 1989. с. 528.

22. Adamson, E.D. Growth factors and their receptors in development // Dev. Genet. 1993. V.14. P. 159-164.

23. Austin C.R., Braden A.W.H. Induction and inhibition of the second polar division in the rat eggs and subsequent fertilisation // Aust. J. Biol. Sci. 1954. V. 7. P. 195 210.

24. Babalola G.O., Schultz R.M. Modulation of gene expression in the preimplantation mouse embryo by TGF-alpha and TGF-beta // Mol. Reprod. Dev. 1995. V. 41. № 2. P. 133139.

25. Babinet C. Transgenic mice as models for human diseases// Rev Prat. 1990. V. 40(20). P. 1859-62.

26. Baker H., Liu J-P., Robertson E.J. et al. Role of IGFs in embryonic and postnatal growth // Cell. 1993. V. 75. P. 73-82.

27. Barker D.J.P. Mothers, Babies, and Disease in Later Life// London: BMJ Publishing Group. 1994.

28. Baylin, S.B. and Herman J.G. DNA hypermethylation in tumorigenesis//Trends Genet.2000. V. 16. P. 168-174.

29. Barlow D.P. Competition a common motif for the imprinting // EMBO J. 1997. V. 16. P. 6899 -6905.

30. Barlow D.P., Stoger R., Herrmann B.G. et al. The mouse insulin-like growth factor type-2 receptor is imprinted and closely linked to the Tme locus // Nature. 1991. V. 349. P. 84-87.

31. Bartolomei M.S., Tilghman S.M. Genomic imprinting in mammals // Ann. Rev. Genet. 1997. V.31.P. 493 -525.

32. Barton S.C., Ferguson-Smith A.C., Fundele R., Surani M. A. Influence of paternaly imprinted genes on development // Development. 1991 . V. 113. P. 679 688.

33. Barton S.C. Surani M.A.H., Norris M.L. Role of paternal and maternal genomes in mouse development//Nature. 1984. V.311. P. 374-376.

34. Beatty R.A. Parthenogenesis and polyploidy in mammalian development// London: Cambridge Univ. Press. 1957. 210 p.

35. Beechey C.V., Cattanach B.M. Genetic imprinting map // Mouse Genome. 1996. V. 94. P. 96-99.

36. Bell, A.C. and Felsenfeld, G. Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene// Nature 2000. 405. P. 482-485.

37. Bestor Т.Н. The DNA methyltransferases of mammals // Hum. Mol. Genet. 2000. V. 9. No. 16. P. 2395-2402.

38. Bestor Т.Н., Tycko B. Creation of genomic methylation patterns // Nat. Genet. 1996. Vol. 12.P. 363-367.

39. Boue G.J., Boue A. Chromosomal anomalies in early spontaneous abortions // Curr. Top. Pathol. 1976. V. 62. P. 193 208.

40. Bourc'his D. et al. abnormal methylation does not prevent x inactivation in ICF patients// Cytogenet. Cell genet. 1999. V. 84. P. 245-252.

41. Braden A. W. H., Austin C. R. Reactions on unfertilized mouse eggs to some experimental stimuli // Exp. Cell. Res. 1954. V. 7. P. 277 280.

42. Brandeis M., Kafri Т., Ariel M. et al. The ontogeny of allele-specific methylation associated with imprinted genes in the mouse // EMBO J. 1993. V. 12. P. 3669- 3677.

43. Cattanach B.M. Non-disjunction tests with Robertsonian translocations// Mouse Newsl., 1982. No. 66. P. 62-63.

44. Cattanach B.M., Kirk M. Differential activity of maternally and paternally derived chromosome regions in mice // Nature. 1985. V. 315. P. 496 -498.

45. Cattanach B.M. Parental origin effects in mice// J. Embryol. Exp. Morph. Suppl.1986. V. 97. P. 137 -150.

46. Cattanach B.M., Beechey C.V., Evans E.P. et al. Further localization of the distal chromosome 2 imprinting region // Mouse Genome. 1991. V. 89. P. 255.

47. Chaillet J.R., Vogt T.F., Beier D.R., Leder P. Parental-specific methylation of an imprinted transgene is established during gametogenesis and progressively changes during embryogenesis // Cell. 1991. V. 66(1). P. 77-83.

48. Coffey R.J., Goustin A.S., et al. Transforming growth factor alpha and beta expression in human colon cancer lines: implications for an autocrine model// Cancer Res. 1987. V. 47(17). P.4590-4.

49. Constancia, M. et al Deletion of a silencer element in Igf2 results in loss of imprinting independent of H19//Nat. Genet. 2000. V. 26. P. 203-206.

50. Coulier F., Pontarotti P., Roubin R. et al. Of worms and men: an evolutionary perspective on the fibroblast growth factor (FGF) and FGF receptor families// J. Mol. Evol. 1997. V. 44. P. 43-56.

51. Crouse H.V. The controlling element in sex chromosome behaviour in Sciarall Genetics. 1960. V. 45. P. 1425-1433.

52. Cuthbertson K.C.R. Parthenogenetic activation of mouse oocytes in vitro with ethanol and benzyl alcohol // J. Exp. Zool. 1983. V. 226. P. 311-314.

53. Czyz J., Wobus M.A. Embryonic stem cell differentiation: The role of extracellular factors // Differentiation. 2001. V. 68. P. 167-174.

54. De Chiara, T.M., Efstratiadis, A. And Robertson, E.J. A growth deficiency phenotype in heterozygous mice carrying an insulin-like growth factor II gene disrupted by targeting// Nature 1990. 345: 78-80.

55. DeChiara T.M., Robertson E.J., Efstratiadis A. Parental imprinting of the mouse insulinlike growth factor II gene // Cell. 1991. V. 64. P. 849 -859.

56. De-Groot N., Hochberg A. Gene imprinting during placental and embryonic development // Mol. Reprod. Develop. 1993. V. 36. P. 390-406.

57. Dennis K., Fan T. et al. Lsh, amember of the SNF2 family, is required for genom-wide methylation// Genes Dev. 2001. V. 15. P. 2940-2944.

58. Dorer, D.R. & Henikoff, S. Expression of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in drosophila// Cell 1994. V. 77. P. 993-1002.

59. Eden, S. et al. An upstream repressor element plays a role in Igf2 imprinting// EMBO J. 2001. V. 20. P. 3518-3525.

60. Efstratiadis A. Genetics of mouse growth // Int. J. Dev. Biol. 1998. V. 42. P. 955-976.

61. Eggenschwiler, J., Ludwig, Т., Fisher, P., et al. Mouse mutant embryos overexpressing IGF-II exhibit phenotypic features of the Beckwith-Wiedemann and Simpson-Golabi-Behmel syndromes. Genes. Dev. 1997. 11: 3128-3142.

62. Ekstrom T.J., Cui H., Li X., Ohlsson R. Promoter-specific IGF2 imprinting status and its plasticity during human liver development // Development. 1995. V. 121. P. 309 -316.

63. Ehrlich M. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues or cells//Nucleic Acid Res.1982. V. 10. P. 2709-2721.

64. Engel N., West AG, Fersenfeld G and Bartolomei Antagonism between DNA hypermethylation and enhancer-blocking activity at the HI9 DMD is uncoverd by CpG mutations// Nature genetics. 2004. V. 36(8). P. 883-888.

65. Engstrom W., Shokrai A., Otte K. et al. Transcriptional regulation and biological significance of the insulin like growth factor II gene // Cell Prolif. 1998. V. 31. P.173-189.

66. Eppig J.J. Development potential of LT/Sv parthenotes derived from oocytes matured in vivo and in vitro // Develop. Biol. 1978. V. 65. P. 244 249.

67. Feil R., Walter J., Allen N.D., Reik W. Developmental control of allelic methylation in the imprinted mouse Igf2 and HI9 genes// Development. 1994. V. 120(10).P. 2933-43.

68. Feil, R. Developmental control of allelic methylation in the imprinted mouse Igf2 and H19 genes// Development 1994. V. 120. P. 2933-2943.

69. Feinberg, A. Cancer epigenetics takes center stage// Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. V. 98. P. 392-394.

70. Forejt J., Gregorova S. Genetic analysis of genomic imprinting: an Imprintor-1 gene controls inactivation of the paternal copy of the mouse Tme locus// Cell. 1992. V. 70(3). P. 443-50.

71. Gardner R.L., Squire S., Zaina S., Hills S. And Graham C.F. Insulin-like growth factor-2 regulation of conceptus composition: effects of the rophectoderm and inner cell mass genotypes in the mouse//Biol. Reprod. 1999. V. 60. P. 190-195.

72. Granau C., et al. Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters//Nucleic Acid Research. 2001. V. 29(13). e65.

73. Guillemot F., Caspary Т., Tilghman S.M. et al. Genomic imprinting of Mash-2, a mouse gene required for trophoblast development // Nat. Genet. 1995. V. 9. P. 235 -241.

74. Harada Т., Fujikawa Т., Yoshida S. et al. Expression of transforming growth factor alpha (TGF-alpha) gene in mouse embryonic development // J. Assist. Reprod. Genet. 1997. V. 14(5). P. 262-269.

75. Hark A.T. et al. CTCF mediates methylation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19/Igf2 locus// Nature. 2000. V. 405. P. 486-489.

76. Harris T.M., Rogler L.E., Rogler C.E. Reactivation of the maternally imprinted IGF2 allele in TGFa induced hepatocellular carcinomas in mice// Oncogene. 1998. V. 16. P. 203209.

77. Hayashizaki Y, et al. Identification of an imprinted U2af binding protein related sequence on mouse chromosome 11 using the RLGS method// Nat. Genet. 1994. V. 6(1). P. 33-40

78. Howell C.Y., Bestor Т.Н. et al. Genomic imprinting disrupted by a maternal-effect mutation in the Dnmtl gene// Cell. 2001. V. 104. P. 829-838.

79. Howlett S.K. & reik W. methylation levels of maternal and paternal genomes during preimplantation development//Development. 1991. V. 113. P. 119-127

80. Holliday R. A new theoiy of carcinogenesis// Br. J. Cancer 1979. V. 40. P. 513-522.

81. Holmgren C. et al. CpG methylation regulates the Igf2/H19 insulator// Curr. Biol. 2001. V. 11. P. 1-3.

82. Jablonka E., Lamb M.J. Epigenetic inheritance in evolution// J. Evol. Biol. 1998. V. 11.P. 159-183.

83. Jablonka E. and Lamb M. J. The Changing Concept of Epigenetics// 2002. Ann. N.Y. Acad. Sci. V. 981. P. 82-96.

84. Jackson-Grusby L. et al. Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation// Nature Genet. 2001. V. 27. P. 31-39.

85. Jaenisch R., Bird A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals// Nat Genet. 2003 V. 33. Suppl: 245-54.

86. Jeong S., Pfeifer K. Shifting insulator boundaries // Nat Genet. 2004. V. 36(10). P. 1036-7.

87. Jiang S., Hemann M.A., Lee M.P. et al. Strain-dependent developmental relaxation of imprinting of an endogenous mouse gene KvIgtl// Genomics. 1998. V. 53(3). P. 395 399.

88. Jonakait G.M., Luskin M.B., Ni L. Transforming growth factor-alpha expands progenitor cells of the basal forebrain, but does not promote cholinergic differentiation// J. Neurobiol. 1998. V. 15(37). P. 405-412.

89. Jones P.A. The DNA methylation paradox// Trends Genet. 1999. V. 15. P. 34-37.

90. Kalscheuer V.M., Mariman E.C., Schepens M.T. et al. The insulin-like growth factor type-2 receptor gene is imprinted in the mouse but not in humans //Nat. Genet. 1993. Vol. 5. P. 74-78.

91. Kaneko-Ishino Т., Kohda Т., and Ishino F. The Regulation and Biological Significance of Genomic Imprinting // J. Biochem. 2003. V. 133. P. 699-711.

92. Kato Y., Rideout W.M., Hilton K., Barton S.C., Tsunoda Y., and Surani M.A. Developmental potential of mouse primordial germ cells// Development. 1999. V. 126. P.1823-1832.

93. Kaufman M. H. Early mammalian development: parthenogenetic studies. Cambridge Univ. Press, Cambridge London. 1983. P. 1 - 259.

94. Kaufman M. H. Parthenogenesis: a system facilitating understanding of factor that influence early mammalian development // Progress in Anatomy. Eds. Harrison R.J., Holmes R.L. Cambridge Univ. Press. 1981. V. 1. P. 1 34.

95. Kaufman M. H. The chromosome complement of single-pronuclear haploid mouse embryos following activation by ethanol treatment// J. Embryol. Exp. Morphol. 1982. V. 71. P. 139- 154.

96. Kaufman M.H., Evans M.J., Robertson E.J., Bradly A. Influence of injected pluripotential (EK) cells on haploidand diploid parthenogenetic development// J. Embryol. Exp. Morphol. 1984. V. 80. P. 75 86.

97. Kaufman M.H., Barton S.C., Surani M.A.H. Normal postimplantation development of mouse parthenogenetic embryos to the forelimb bud stage. // Nature. 1977. V. 265. P. 53-55.

98. Kaye P.L. Preimplantation growth factor physiology// Reviews of Reproduction. 1997. V. 2. P. 121-127.

99. Keresztes M., Boonstra J. Import(ance) of growth factors in (to) the nucleus// J. Cell Biol. 1999. V. 145. P. 421-424.

100. Kitsberg D., Selig S., Brandeis M., Smon I., Keshet I., et al. Allele-specific replication timing of imprinted gene regions// Nature 1993. V. 364. P. 459-463.

101. Knoll J.H.M., Chem S-D. & Lalande M. Allele specificity of DNA replication timing in the Angelman/Prader-Willi syndrome imprinted chromosomal region// Nature Genet. 1994 V. 6. P. 41-46.

102. Kono Т., Obata Y., Yoshimzu T. et al. Epigenetic modifications during oocyte growth correlates with extended parthenogenetic development in the mouse// Nat. Genet. 1996. V. 13. P. 91-94.

103. Kono Т., Sotomaru Y., Katsuzawa Y. et al. Mouse parthenogenetic embryos with monoallelic H19 expression can develop to day 17.5 of gestation// Developmental Biology. 2002. V. 243. P. 294-300.

104. Kono T. Obato Т., Wu O. et al. Birth of parthenogenetic mice that can develop to adulthood//Nature. 2004. V. 248. P. 860-864.

105. Lamb M.J. Epigenetic inheritance and aging// Rev. Clin. Gerontol. 1994. V. 4. P. 97105.

106. Latham K.E. Strain-specific differences in mouse oocytes and their contributions to epigenetic inheritance // Development. 1994. V 120. P.3419-3426.

107. Latham K.E., Kutyna K., Wang Q. Genetic variation in trophectoderm function in parthenogenetic mouse embryos //Develop. Genetics. 1999. V. 24. No. 3-4. P. 329-335.

108. Latham K.E., Solter D. Effect of egg composition on the developmental capacity of androgenetic mouse embryos // Development. 1991. V. 113. P. 561-568.

109. Lee J.E., Pintar J. And Efstratiadis A. Pattern of the insulin-like growth factor II gene expression during early mouse embryogenesis// Development 1990. 110: 151-159.

110. Leighton P.A., Ingram R.S., Eggenschwiler J. et al. Disruption of imprinting caused by deletion of the HI9 gene region in mice // Nature. 1995. V. 375. P. 34-39.

111. Lerchner W., Barlow D.P. Paternal repression of the imprinted mouse Igf2r locus occurs during implantation and is stable in all tissues of the postimplantation mouse embryo// Mech. Dev. 1997. V. 61. P. 141 -149.

112. Li E., Bestor Т.Н., Jaenisch R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in emberyonic lethality// cell. 1992. V. 69. P. 915-926.

113. Li E., Beard C., Jaenisch R. Role for DNA methylation in genomic imprinting// Nature. 1993. V. 366(6453). P. 362-5.

114. Liang G., Salem C.E., Yu M.C., Nguyen H.D., Gonzales F.A., Nguyen T.T., Nichols P.W. and Jones P.A. DNA methylation differences associated with tumor tissues identified by genome scanning analysis// Genomics 1998. V. 53. P. 260-268.

115. Lopes S. et al. Epigenetic modifications in an imprinting cluster are controlled by a hierarchy of DMRs suggesting long-range chromatin interactions// Human Molecular Genetics 2003. V. 12(3). P. 295-305.

116. Luedi P.P., Hartemink A.J. and Jirtle R.L. Genome-wide prediction of imprinted murine genes// Genome Research 2005. V. 15. P. 875-884.

117. Lyko F., Brenton J.D., Surani M.A. and Paro R. An imprinting element from the mouse HI9 locus functions as a silencer in Drosophila // Nat. Genet. 1997. V. 16(2) P. 171-3.

118. Lysiak J.J., Han V.K., Lala P.K. Localization of transforming growth factor alpha in the human placenta and decidua: role in trophoblast growth // Biol. Reprod. 1993. V. 49. N. 5. P. 885-894.

119. Mann J.R., Lovell-Badge R.H. Two maternally derived X chromosomes contribute to parthenogenetic inviability// Development. 1988. V.103. P. 129-136.

120. Mayer W. Niveleau A., Walter J. Fundele R. and Haaf T. Demethylation of the zygotic paternal genome// Nature 2000. V. 403. P. 501-502.

121. McGrath J., Solter D. Nuclear transplantation in mouse embryos// J. Exp. Zool. 1983. V. 228. P. 355- 362.

122. McGrath J., Solter D. Completion of mouse embryogenesis requires both the maternal and paternal genomes// Cell. 1984. V. 37. P. 179 -183.

123. Mertineit C., Yoder J.A., Taketo T. et al. Sex-specific exons control DNA methyltransferase in mammalian germ cells // Development. 1998. V. 125(5). P. 889-897.

124. Miyoshi N., Kuroiwa Y., Kohda Т., et al. Identification of the Megl/GrblO imprinted gene on mouse proximal chromosome 11, a candidate for the Silver-Russell syndrome gene// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. 95: 1102-1107.

125. Monk M. Development in mammals// Amsterdam: North-Holland Publ. Co. 1978. p. 189.

126. Monk M. Variation in epigenetic inheritance //Trends Genet. 1990. V. 6(4). P. 110-4.

127. Moore T. and Haig D. Genomic imprinting in mammalian development: a parental tug-of-war // Trends Genet. 1991. Vol. 7. P, 45-49

128. Morgan H.D. et al. Epigenetic inheritance at the agouti locus in the mouse// Nature Genet. 1999. V. 23. P. 314-318.

129. Morison I.M., Reeve A.E. A catalogue of imprinted genes and parent-of-origin effects in humans and animals//Human Mol. Genet. 1998. V.7. P. 1599 1609.

130. Murphy S.K. and Jirtle R.L. Imprinted genes as potential genetic and epigenetic toxicological targets// Envir. Health Perspect. 2000. V. 108(Suppl.l). P. 5-11.

131. Murphy S.K., Jirtle R.L. Imprinting evolution and the price of silence// BioEssays2003. V. 25. P. 577-588.

132. Murrell, A. et al. An intragenic methylated region in the imprinted Igf2 gene augments transcription// EMBO Rep. 2001. V. 2. P. 1101-1106.

133. Murrell A., Heeson S., Reik W. Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and HI9 into parent-specific chromatin loops//Nat. Genet.2004. V. 36(8). P. 889-93.

134. Neumann B. Kubicka P. and Barlow D. Characteristics of imprinted genes// Nature genet. 1995. V. 9. P. 1829-1841.

135. Nielsen J. Christiansen J. Lykke-Andersen J., et al. A family of insulin-like growth factor II mRNA binding proteins represses translation in late development// Mol. Cell Biol.1999. V.19. P. 1262-1270.

136. Nomura T. Parental exposure to X rays and chemicals induces heritable tumours and anomalies in mice// Nature 1982.V. 296. P. 575-577.

137. Obata, Y., T. Kaneko-Ishino, T. Koide, Y. Takai, T. Ueda et al., Disruption of primary imprinting during oocyte growth leads to the modified expression of imprinted genes during embryogenesis//Development. 1998. V. 125. P. 1553- 1560.

138. Ohlsson R., Renkawitz R. and Lobanenkov V. CTCF is a uniquely versatile transcription regulator linked to epigenetics and disease// Trends in Genetics 2001.V. 17(9). P. 520-27.

139. Okano M., Bell D.W., Haber D.A. and Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development// Cell. 1999. V. 99(3). P. 247-57.

140. Olek A., Oswald J. and Walter J. A modified and improved method for bisulphate based cytosine methylation analysis// Nucleic Acids Research. 1996. V. 24(24). P. 5064—5066.

141. Olek A. and Walter J. The pre-implantation ontogeny of the HI 9 methylation imprint// Nat. Genet. 1997. V. 17. P. 275-276.

142. Oswald J., Engemann S., Lane N., Mayer W., Olek A., Fundele R., Dean W., Reik W. and Walter J. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote// Curr. Biol.2000. V. 10. P. 475-478.

143. Paldi A., Gyapay G., Jami J. Imprinted chromosomal regions of the human genome display sex-specific meiotic recombination frequencies// Curr Biol. 1995. V. 5(9). P. 1030-5.

144. Pedone P.V., Cosma M.P., Ungaro P., Colantuoni V., Bruni C.B., Zarrilli R., Riccio A. Parental imprinting of rat insulin-like growth factor II gene promoters is coordinately regulated// J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 23970-23975.

145. Penkov L.I., Platonov E.S., Mironova O.V., Konyukhov B.V. Effects of 5-azacytidine on the development of parthenogenetic mouse embryos// Develop. Growth Differ. 1996. V. 38. P. 236-270.

146. Penkov L.I., Platonov E.S., New D.A.T. Effects of fibroblast growth factor 2 and insulin-like growth factor 2 on the development of parthenogenetic moues embryos in vitro// In Vitro Cell Devel. Biol. Animal. 2001. V. 37. pp. 440-444.

147. Pincus G., Enzman E.V. The comparative behavior of mammalian eggs in vitro and in vivo. 2. The activation of the tubal eggs of the rabbit // J. Exp. Zool. 1936. V. 73. P. 195- 208.

148. Ripoche M.A., Kress C., Poirier F., Dandolo L. Deletion of the H19 transcription unit reveals the existence of a putative imprinting control element// Genes Dev. 1997. V. 11(12). P. 1596-604.

149. Rappolee D.A., Sturm K.S., Behrendtsen O. et al. Insulin-like growth factor II acts through an endogenous growth pathway regulated by imprinting in early mouse embryos // Genes Devel. 1992. V. 6. P. 939-952.

150. Rappolee D.A., Brenner C.A., Schultz R. et al. Developmental expression of PDGF, TGF-a, and TGF-b genes in preimplantation mouse embryos // Science. 1988. V. 241. P. 1823-1825.

151. Reik W., Romer I., Barton S.C., Surani M.A., Howlett S.K., Klose J. Adult phenotype in the mouse can be affected by epigenetic events in the early embryo// Development. 1993. V. 119(3). P. 933-42.

152. Reik W.f Constancia M., Dean W. et al. Igf2 imprinting in development and disease// Int. J. Dev. Biol. 2000. V. 44. P. 145-150.

153. Reik W. and Walter J. Genomic imprinting: parental influence on the genome// Nature Reviews Genetics. 2001. V. 2. P. 21-32.

154. Reik, W. and Walter, J. Evolution of imprinting mechanisms: the battle of the sexes begins in the zygote// Nat. Genet. 2001. V. 27. P. 255-256.

155. Robertson E.J. Insulin-like growth factors, imprinting and embryonic growth control // Semin. Develop. Biol. 1995. V. 6. P. 293-299.

156. Robertson K.D. et al. The human DNA methyltransferases (DNMTs) 1, 3a and 3b: coordinate mRNA expression in normal tissues and over expression in tumors// Nucleic Acids Res. 1999. V. 27 P. 2291-2298

157. Robinson W.P. and Lalande M. Sex-specific meiotic recombination in the prader-willi/angelman syndrome imprinted region// Hum. Mol. Genet. 1995. V. 4. P. 801806.

158. Rougier N. et al. Chromosome methylation patterns during mammalian pre implantation development// Genes Dev. 1998. V.12. P. 2108-2113.

159. Sasaki H., Ferguson-Smith A.C. et al. Temporal and spatial regulation of H19 imprinting in early embryogenesis // Development. 1995. V.121. P. 4195-4202.

160. Savory Т.Н. The mule // Sci. Am., 1970. V. 223. N 6. P. 102-109.

161. Searle A.G., Beechey C.V. Complementation studies with mouse translocations// Cytogenet. Cell Genet. 1978. V. 20. P. 282-303.

162. Sleutels F., Barlow D.P. and Lyle R. The uniqueness of theimprinting mechanism// Curr. Opin. Genet. Dev. 2000. V. 10. P. 229-233.

163. Solter D. Mammalian cloning: advances and limitations// Nature Rev. Genet. 2000. V. l.P. 199-207.

164. Sotomaru Y., Katsuzawa Y., Hatada I., Obata Y., Sasaki H., Kono T. Unregulated expression of the imprinted genes HI9 and Igf2r in mouse uniparental fetuses// J. Biol. Chem. 2002 V. 277(14). P. 12474-8.

165. Stevens L.C., Varnum D.S. The development of teratomas from partenogeneticaly activated ovarian mouse eggs// Develop. Biol. 1974. V. 37. P. 369 380.

166. Stoger R., Kubicka P., Liu C.G. et al. Maternal-specific methylation of the imprinted mouse Igf2r locus identifies the expressed locus as carrying the imprinting signal// Cell. 1993. V. 73. P. 61-71.

167. Sun F.L., Dean W.L., Kelsey G., et al. Transactivation of Igf2 in a mouse model of Beckwith-Wiedemann syndrome// Nature 1997. V. 389. P. 809-815.

168. Surani M.A.H., Allen N.D., Barton S.C. et al. Developmental consequenses of imprinting of parental chromosomes by DNA methylation// Royal Society Meeting on DNA Methylation and Gene Regulation. 1989. P. 1- 46.

169. Surani M.A.H., Barton S.C. and Norris M.L. Nuclear transplantation in the mouse: heritable differences between parental genomes after activation of the embryonic genome// Cell. 1986. V. 45 P. 127-136.

170. Szabo P.E., Mann J.R. Allele-specific expression and total expression levels of imprinted genes during early mouse development: implications for imprinting mechanisms// Genes Dev. 1995. V. 9. P. 3097-3108.

171. Takagi H., Tajima S. and Asano A. Overexpression of DNA methyltransferase in myoblast cells accelerates myotube formation// Eur. J. Biochem. 1995. V. 231. P. 282-291.

172. Tarkowski A. K. Recent studies on parthenogenesis in the mouse// J. Reprod. Fert. Suppl. 1971. V. 14. P. 31 -39.

173. Tarkowski A. K., Wroblewska A., Nowicka J. Experimental parthenogesis in the mouse// Nature. 1970. V. 226. P. 162 165.

174. Thorvaldsen J.L., Bartolomei M.S. Molecular biology. Mother setting boundaries// Science. 2000. V. 288. No. 5474. P. 2145-2146.

175. Tichomiroff A. and Die kunstliche A. Parthenogenese bei Insekten// Arch. Anat. Physiol. Abt. Suppl. 1886. Bd. 35-36.

176. Tilghman S.M. The sins of the fathers and mothers: genomic imprinting in mammalian development// Cell. 1999. V. 96. P. 185- 193.

177. Tremblay R.D., Saam J.R., Ingram R.S. et al. A paternal-specific methylation imprint marks the alleles of the mouse H19 gene // Nature Genet. 1995. V. 9. P. 407-413.

178. Tremblay K.D., Duran K.L. and Bartolomei M.S. A 5' 2-kilobase-pair region of the imprinted mouse H19 gene exhibits exclusive paternal methylation throughout development// Mol. Cell. Biol. 1997. V. 17. P. 4322-4329

179. Tycko B. Genomic imprinting and cancer// In Genomic Imprinting: An Interdisciplinary Approach (Ohlsson, R., Ed.) Springer-Verlag 1999. P. 133-170.

180. Vu Т.Н., Hoffman A.R. Promoter-specific imprinting of the human insulin-like growth factor-II gene//Nature. 1994. V. 371. P. 714 -717.

181. Waddington C.H. The epigenotype// Endeavour. 1942. V. 1. P. 18-20.

182. Warnecke P.M., Mann J.R., Frommer M. and Clark S.J. Bisulfite Sequencing in reimplantation Embryos: DNA Methylation Profile of the Upstream Region of the Mouse Imprinted HI9 Gene// Genomics 1998a. V. 51. P. 182-190

183. Warnecke P.M., Biniszkiewicz D., Jaenisch R., Frommer M., and Clark S.J. Methylation patterns of HI9 imprinting region in DNA methyltransferase null mutant and rescued ES cells// Dev. Genet. 1998b. V. 22. P. 111-121.

184. Weiss A., Keshet I., Rasin A. et al. DNA demethylation in vitro: Involvement of RNA// Cell. 1996. V. 86. P. 708-718.

185. Wevrick R., Francke U. An imprinted mouse transcript homologous to the human imprinted in Prader-Willi syndrome (IPW) gene// Hum. Mol. Genet. 1997. V. 6. P. 325 -332.

186. White M.J.D. Animal cytology and evolution. // 3rd ed. Cambridge: Cambridge Univ. Press. 1973. 961 p.

187. Wilcox J.M., Derynck R. Developmental expression of transforming growth factors alpha and beta in mouse fetus// Mol. Cell Biol. 1988. V. 8. P. 3415-3422.

188. Wilkins J.F. and Haig D. What good is genomic imprinting: the function of parent-specific gene expression// Nat Rev Genet 2003. V. 4. P. 359-68.

189. Wolffe A.P. and Matzke M.A. Epigenetics: regulation through repression// Science. 1999. V. 286. P. 481-486.

190. Wu C.T. and Morris J.R. Genes, genetics, and epigenetics: a correspondence// Science. 2001. V. 293(5532). P. 1103-5.

191. Young L.E., Fernandes K., McEvoy T.G., et al. Epigenetic change in IGF2R is associated with fetal overgrowth after sheep embryo culture// Nat. Genet. 2001. V.27 (2). P. 153-4.

192. Yu W., Ginjala V., Pant V., et al. Poly (ADP-ribosyl)ation regulates CTCF-dependent chromatin insulation//Nat Genet. 2004. V. 36(10). P. 1105-10.

Информация о работе

Ростам Задех Джалал
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.15

Диссертация

Молекулярно-генетический анализ экспрессии импринтированных генов Igf2 и H19 у партеногенетических эмбрионов мышей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы