Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетические предикторы репродуктивных потерь

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические предикторы репродуктивных потерь"

На правах рукописи

Машкина Елена Владимировна

Молекулярно-генетические предикторы репродуктивных потерь

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Белгород 2014

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего образования «Южный федеральный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации

Официальные оппоненты:

Абилсв Серикбай Каримович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, заместитель директора института

Асланян Марлен Мкртичович. доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова», профессор кафедры генетики

Куцев Сергей Иванович, доктор медицинских наук, профессор. Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский государственный медицинский университет им.Н.И.Пирогова», заведующий кафедрой молекулярной и клеточной генетики

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится $/СЛ- 20г. в Л?часов на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015. г. Белгород, ул. Победы, 85.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» и на сайте: www.bsu.ed" г"

И.о. ученого секретаря совета а .

по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, ^ / ^ на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13,

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Шкурат Татьяна Павловна

Автореферат разослан

доктор медицинских наук

Пахомов С. П.

I ~ российская

i ГОСУДАРСТВЕННАЯ

I Библиотека

2015_

----------Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Репродуктивные потери у человека составляют около 50% по отношению к общему числу зачатий. Частота невынашивания беременности остается высокой, несмотря на достигнутые успехи в профилактике и лечении нарушений репродукции человека. В настоящее время различные виды самопроизвольного прерывания беременности рассматривают в качестве мультифакторных заболеваний (Бочков Н.Г1., 1985; Rull К., 2012; Vaiman D., 2014), развитие которых может быть запущено комбинацией нескольких факторов. Индивидуальный вклад каждого фактора может быть незначительным, и только их сумма ведет к развитию заболевания.

Причины ранних эмбриональных потерь многочисленны и разнообразны. Аномалии кариотипа плода выявляются при остановке развития и при естественно наступившей беременности, и при вспомогательных репродуктивных технологиях (Кириллова Е.А. и др., 2006; Баранов B.C., Кузнецова Т.В., 2007; Курило Л.Ф., 2007; Чиряева О.Г. и др., 2012; Simon С. et al„ 1998; Liunger Е. et al., 2005; Morales С. et al., 2008). Однако причины хромосомных мугаций у плода пока не выяснены. Есть данные, что одной из причин могут быть полиморфные варианты генов Madl; Mad2; Buhl; ВиЬЗ, отвечающие за расхождение хромосом в мейозе (Vaiman D., 2014).

Нарушения эпигенетической составляющей программы развития на ранних стадиях могут изменять экспрессию генов, ответственных за поддержание стабильности генома, а также индуцировать увеличение числа мугаций при дроблении и дифференцировке бластомеров (Лебедев И.Н., Пузырев В.II., 2007; Reik W. et al., 2001; Ziller M. et al., 2013).

Существенный вклад в патогенез ранних эмбриональных потерь вносят иммунные и аутоиммунные факторы (Rai R. et al., 1995; Younis J. et al., 2000; Макацария А.Д., Бицадзе В О., 2001; Керчелаева С Б., 2003). К эндокринным причинам невынашиваиия беременности относят изменение уровня синтеза гонадотропинов, нарушение функционирования их рецепторов (1л N. et al., 2000; Bellver J. et al., 2008; Prakash A. et al., 2006; 2008).

Генетические исследования репродуктивной патологии имеют несколько составляющих: идентификация ДНК/РНК маркеров, имеющих прогностическую ценность для оценки риска невынашивания беременности; выявление профилей экспрессии генов, создание метаболических сетей патологии беременности; изучение эпигенетических модификаций генома в процессе эмбрионального развития человека; оценка роли микро-РНК в патогенезе репродуктивных потерь и поиск генов микро-РНК, влияющих на регуляцию экспрессии генов в процессе раннего эмбрионального развития для развития таргетпой терапии; применение исследований, основанных на гипотезах, для определения колирующих локусов и создания неинвазивных биомаркеров, применимых в клинических условиях для выявления ранних осложнений беременности.

Практически все из перечисленных этиологических факторов невынашивания беременности оказывают влияние на морфологические и функциональные свойства формирующейся плаценты, уровень пролиферации и апоптоза

клеток ((^ипшуеЬ М. е( а!., 2000). Обязательным компонентом процессов имплантации и формирования плаценты являются межклеточные взаимодействия с участием нескольких функциональных семейств генов.

Физиологическое течение беременности определяется активными процессами деления и дифференцировки клеток и тканей, согласованными в пространстве и во времени. Основными функциональными группами выступают молекулы межклеточной сигнализации, а также факторы, контролирующие пролиферацию клеток, целостность и стабильность ДНК. Однако роль генов системы контроля клеточного цикла и репарации ДНК в возникновении нарушений репродуктивного здоровья человека практически не изучена.

Базовые механизмы, лежащие в основе раннего эмбрионального развития, изучены недостаточно. Исследуемые в работе функциональные группы генов обеспечивают и контролируют ключевые для многоклеточного организма процессы - синтез и репарацию ДНК, деление клеток, межклеточные взаимодействия, формирование тканей, апоптоз клеток. Проведение комплексного корреляционного анализа полиморфных вариантов генов-кандидатов и уровня их экспрессии в тканях материнского и зародышевого происхождения позволяет получить новые данные о механизмах регуляции генов эукариог на ранних стадиях развития.

Цель работы: изучить механизмы межгенных взаимодействий при репродуктивных потерях для разработки новых диагностических биомаркеров.

Задачи исследования

1. Изучить генотипические особенности клеток материнского и зародышевого происхождения по полиморфным вариантам генов цитокинов при физиологически протекающей беременности и невынашивании беременности I триместра.

2. Проанализировать вклад полиморфных вариантов генов фолатного обмена и факторов свертывающей системы крови в клетках материнского и зародышевого происхождения в увеличение риска невынашивания беременности I триместра.

3. Определить паттерн метилирования гена синцитина 1 и гена синцитина 2 (ККУ1'К1)К1), а также уровень глобального метилирования ДНК, по метилированию Ор островков в тканях материнского и зародышевого происхождения при физиологически протекающей беременности и невынашивании беременности.

4. Изучить особенности генотипа клеток материнского и зародышевого происхождения но полиморфным вариантам генов контроля клеточного цикла и репарации ДНК при физиологически протекающей беременности и невынашивании беременности I триместра.

5. Провести анализ межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов цитокинов, фолатного обмена, факторов свертывающей сис темы крови, системы контроля клеточного цикла и репарации ДНК при физиологически протекающей беременности, спонтанном прерывании беременности и неразвивающейся беременности.

6. Оценить уровень экспрессии гена индуцируемого гипоксией фактора HIF-la в тканях материнского и зародышевого происхождения при физиологически протекающей беременности и невынашивании беременности.

7. Изучить уровень экспрессии генов провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в децидуальной и хорионической тканях при физиологически протекающей беременности и невынашивании беременности.

8. Проанализировать уровень экспрессии генов контроля клеточного цикла и репарации ДНК в децидуальной и хорионической тканях при физиологически протекающей беременности и невынашивании беременности.

9. Исследовать типы микро-РНК, локализованные в цис-регуляторных участках генов цитокинов, генов системы репарации, фолатного цикла и факторов свертывающей системы крови.

10. Разработать модель взаимодействий молекулярно-генетических предикторов репродуктивных потерь с учетом наличия полиморфных вариантов генов и уровня их экспрессии.

Научная новизна работы

Впервые на основе молекулярно-генетических, эпигенетических и биоин-формационпых методов исследования материнской и зародышевой ткани при различном характере течения беременности показаны механизмы межгенных взаимодействий, исследованы причины изменения уровня экспрессии генов в зависимости от уровня метилирования ДНК, наличия полиморфных локусов и локализации микро РНК.

Впервые показано, что частоты генотипов по полиморфному варианту -3\С-'Г гена IL-1/i среди женщин со спонтанным прерыванием беременности и неразвивающейся беременностью различны. Частота аллели -317' гена //.-1 р наибольшая среди женщин со спонтанным абортом в первом триместре. Установлено, что риск спонтанного прерывания беременности повышен для гегеро-зигот -592Г-7 по гену IL-10. Гомозиготы по аллели С-592 гена II-10 имеют сниженный относительный риск развития мультифакторной патологии. Впервые показано, что при гомозиготном по аллели -174G гепа IL-6 состоянии клеток хорионической ткани повышается риск неразвивающейся беременности.

Впервые установлены уровни метилирования промоторных и отдельных внугригенных регионов генов сиитицина 1 и синтицина 2 при невынашивании беременности и в норме. Установлено, что при физиологически протекающей беременности общий уровень метилирования ДНК в хорионической ткани ниже, чем децидуальной, что подтверждается уровнем метилирования LINH1 элементов, гена HKRVK.

Высокий риск невынашивания беременности первого триместра ассоциирован с налчием у женщин аллелей 66G гена MTRR и 2756G гена MTR.

Впервые показано, ч то среди женщин со спонтанным прерыванием беременности частота аллели 15\G!n гена ERCC1 статистически значимо выше по сравнению с группой контроля. Наличие аллели I IGOdelC гена CIIEK2 в клетках хорионической гкапи также ассоциировано с невынашиванием беременности.

Впервые установлено, что риск остановки в развитии эмбриона (неразвивающейся беременности) повышается при наличии в генотипе женщины полиморфных вариантов генов IL-lß и IL-10. При сочетании в генотипе полиморфных вариантов четырех генов цигокинов (IL-Iß, TNF, IL-6, IL-10) повышается риск спонтанного прерывания беременности. В целом, риск невынашивания беременности в первом триместре резко возрастает при наличии в генотипе полиморфных вариантов генов фолатного цикла (MTHFR, MTRR), провоспали-тельных цигокинов (IL-lß, IL-6) и SERPINEI. Установлено трехкомпонентное (APEX, XPD, TP 53) взаимодействие генов системы контроля клеточного цикла и репарации ДНК, ассоциированное с предрасположенностью к невынашиванию беременности.

Установлено снижение уровня экспрессии гена HlL'-la в хорионической ткани при невынашивании беременности первого триместра.

Впервые выявлено повышение уровня экспрессии гена IL-lß как в дециду-альной, так и хорионической тканях при невынашивании беременности. Показано, что уровень мРНК генов IL-6, IL-10 повышается в децидуальной ткани при неразвивающейся беременности по сравнению с физиологически протекающей беременностью.

Впервые показано, что при физиологически протекающей беременности в децидуальной ткани уровень экспрессии гена ТР53 выше по сравнению с хорионической. При невынашивании беременности различий в уровне экспрессии гена ТР53 между двумя типами тканей не выявлено.

Разработана модель взаимодействий молекулярно-генетических маркеров при репродуктивных потерях с учетом наличия полиморфных вариантов генов и уровня их экспрессии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Наибольший вклад в эмбриональную гибель плода со стороны матери вносят полиморфные локусы генов цигокинов, а со стороны огца гены репарации ДНК и контроля клеточного цикла. Уровень экспрессии генов цито-кинов, репарации /(ПК и контроля клеточного цикла зависит от наличия полиморфных локусов в промоторной области и, большого числа типов и копий микро-PIIK, локализованых в цис-регуляторной области транскрибирующихся генов.

2. Женщины, гетерозиготные но аллельному варианту -592CA гена ILIO и гомозиготные по аллели -3086' гена l'NFa имеют повышенный риск спонтанного прерывания беременности; аллель -317'гена IL-\ß ассоциирована с риском возникновения неразвивающейся беременности. Невынашивание беременности характеризуется генотипическими особенностями клеток хорионической ткани. Гомозиготность по аллели -I74G гена IL-6 ассоциирована с невынашиванием беременности.

3. При физиологически протекающей беременности ДНК зародышевого происхождения характеризуется i ипометилированием. Уровень метилирования CpG-сайто в 5 LTR регионах генов ERVWEI и ERVFRDEI в хорионической ткани снижен по сравнению с децидуальной.

4. Риск спонтанного прерывания беременности повышен для женщин, имеющих аллель 751(7/« гена £У?СС2. Наличие аллели 1100с)е1С гена СНЕК2 в клетках хорионической ткани ассоциировано с невынашиванием беременности.

5. Риск репродуктивных потерь в первом триместре беременности увеличивается при сочетании в генотипе женщины полиморфных вариантов генов фолатного цикла (МТНШ, МТЯЛ), факторов свертывающей системы крови (БЕЯРШЕI), провоспалительных цитокинов (¡¡.-I р, ¡1-6).

6. Снижение уровня экспрессии гена Н1Е-1а в хорионической ткани ассоциировано с невынашиванием беременности в первом триместре. Репродуктивные потери в I триместре ассоциированы с повышением уровня экспрессии гена 1Ь-1р как в децидуальной, гак и хорионической тканях, а также повышением уровня экспрессии генов 1Ь-6, ¡¿-10 в децидуальной ткани. При невынашивании беременности в децидуальной ткани снижается активность экспрессии гена ТР53.

7. В цис-регуляторных районах генов, вовлеченных в процессы формирования трофобласта, выявлены таргерные мишени для терапии - Ьах-гшг-5069, Ьав-гтЯ-тЗ, Ьая-гтЯ-Дбб, Нач-т1Я-1268, Ь^-гтиг-5703, Ьа5-1шг643.

8. Предложена модель взаимодействия молекулярно-генетических маркеров исследованных функциональных групп генов при невынашивании беременности.

Научно-практическое значение работы

Теоретическая значимость работы заключается в раскрытии механизмов межгенных взаимодействий генов-кандидатов нескольких функциональных групп при невынашивании беременности первого триместра. Получены данные, которые расширяют представления о взаимозависимой и сопряженной роли ферментов фолатного цикла, факторов свертывающей системы крови, а также цитокинов в нарушении репродуктивной функции человека. Получены новые данные о роли аллельных вариантов генов системы контроля клеточного цикла и репарации ДНК, а также уровня их экспрессии в тканях материнског о и зародышевого происхождения при невынашивании беременности первого триместра. Научная значимость работы состоит в получении новых данных об участии микро-РНК в регуляции уровня активности генов системы репарации, генов цитокинов. Теоретическая ценность полученных результатов состоит в создании модели, описывающей взаимоотношение молекулярно-генетических маркеров (наличие аллельных вариантов генов, уровень их экспрессии) в тканях материнского и зародышевого происхождения при репродуктивных потерях.

Практическая значимость работы основана на том, что полученные данные о повышении риска репродуктивных потерь в первом триместре беременности у женщин, имеющих в генотипе полиморфные варианты генов фолатного цикла (МТНЕЯ, МТШ), факторов свертывающей системы крови (БЕЮЧНЕ!), провоспалительных цитокинов (//,-//?, ¡1.-6}, могут быть использованы в медико-генетических консультациях в качестве неинвазивных биомаркеров для

оценки величины относительного риска возникновения осложнений ранних сроков беременности.

Созданный банк образцов ДНК может быть использован в дальнейших исследованиях для анализа причин нарушения репродуктивной функции человека.

Полученные в работе результаты внедрены в клинико-лабораторную и практическую деятельность клинико-диагностической лаборатории «Наука» (г. Ростов-на-Дону), медицинских центров «Диагноегиклаб», «Биоритм» (г.Ростов-па-Дону), «Салюсмед» (г.Белая Калитва), «Юнона» (г.Таганрог), «Центра репродукции человека и ЭКО» (г.Ростов-на-Дону), государственного бюджетного учреждения Ростовской области «Областной центр планирования семьи и репродукции человека». Новые научные данные, а также разработанные в ходе выполнения работы экспериментальные методики используются в учебном процессе на факультете биологических наук Академии биологии и биотехнологии Южного федерального университета, в частности при чтении лекций по курсам «Биолог ия индивидуального развития», «Генетика онтогенеза», «Генетика пола и репродукции», «Медико-генетическое консультирование», при проведении практических занятий по генетике.

Работа выполнена в рамках тематического плана научно-исследовательских работ Научно-исследовательского института биологии Академии биолог ии и биотехнологии Южного федерального университета «Исследование прогностических геномных и поетгеномных маркеров эмбрионального развития человека», проекта ФЦП "Разработка технологии мониторинга репродуктивной функции человека и развития плода с использованием новых геномных и постгеномных маркеров" (государственный контракт № 02.740.11.0501 2009-2011); научно-исследовательской работы «Молекулярно-гепетический анализ генов цигокиновой системы при нарушении репродуктивной функции человека» в рамках проекта ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России 2007-2013» (соглашение 14.А18.21.0199), проектной части государственного задания Министерства образования и пауки Российской Федерации по темам: «Поиск новых мишеней для предиктивной диагностики заболеваггий репродуктивной системы» (проект 6.703.2014/К) и «Анализ межгепных взаимодействий при нарушении ранних этапов эмбриогенеза человека» (проект 6.98.2014/К). Экспериментальные исследования выполнены па оборудовании ЦКП «Биотехнология, биомедицина и экологический мониторинг» и ЦКП «Высокие технологии» ЮФУ (грант RFMF'1159414X0002).

Апробация работы

Материалы диссертации доложены гга V и VI Съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Росгов-па-Дону, 2010), V World Congress of World Association оГ Reproductive Mcdicine (WARM) (Moscow, 2010), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010), III, IV и V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехноло-

гий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2010; 2011, 2013), European Human Genetics Conference (Amsterdam, The Netherlands, 2011); Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век ианотехнологий» (Санкт-Петербург, 2012), European Human Genetics Conference (Nürnberg, Germany,

2012); конференции ВОГиС «Проблемы генетики и селекции» (Новосибирск,

2013), 21 lh International Congress of Genetics (Singapore, 2013), European Human Genetics Conference (Paris, France, 2013), II конференции участников Российского биомаркерного консорциума (Москва, 2013), IV международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2014).

Личное участие автора. Построение концепции исследования, определение алгоритма исследования, выбор методов исследования выполнены лично автором. Все исследования выполнены в соответствии с целыо и задачами диссертации лично автором. Автор осуществлял аналитическую и статистическую обработку полученных результатов, интерпретацию данных исследования. Лично автором подготовлены публикации по выполненной работе, осуществлено написание и оформление рукописи.

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано 45 работ в том числе 17 из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени. Получен 1 патент па изобретение и зарегистрировано 3 свидетельства на Базы данных.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 205 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 32 отечественных и 321 зарубежных источника и приложения. Работа содержит 28 таблиц, иллюстрирована 48 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общее число обследованных в зависимости от диагноза и определяемых показателей приведено в таблице 1. Для анализа молскулярно-генетических предикторов репродуктивных потерь использованы образцы ДНК из лейкоцитов крови 285 женщин с невынашиванием беременности первого фимеслра. Контрольную группу составили 134 женщины с физиологически протекающей беременностью. Сбор анамнестических данных и формирование исследуемых групп женщин были проведены сотрудниками кафедры акушерства и гинекологии №3 ГБОУ BIIO «Ростовского государственного медицинского университета» МЗ РФ, а также врачами акушерами гинекологами юродской больницы № 8 и роддома №5 г. Ростова-на-Дону под руководством доктора медицинских иа-

ук, профессора, заведующего кафедрой А.Н. Рымашевского, В качестве материала для исследования были использованы и образцы децидуальной и хориб-нической тканей, полученные при проведении медицинского аборта у женщин с физиологическим течением беременности на сроке 5-10 недель, при спонтанном прерывании беременности и неразвивающейся беременности в первом фиместре беременности.

Таблица 1 - Количество исследованных человек в зависимости от диагноза и определяемых показателей __

Группа Кол-во Исследуемый биоматериал Методы исследований

Репрезентативная выборка жителей Ростовской области, популя-ционный контроль 800 Лейкоциты крови Определение 8ЫР методом аллель-специфичной ПЦР

Женщины с физиологически протекающей беременностью (контроль, медицинский аборт (МА)) 134 Лейкоциты крови Определение 8МР методом аллель-специфичной ПЦР

25 Децидуальная ткань Определение 8>ГР методом аллель-специфичной ПЦР, ПДРФ-анализ. Анализ экспрессии генов. Анализ уровня метилирования генов и иИЕ1 элементов

25 Хорионическая ткань

Женщины с неразвивающейся беременностью 77 Лейкоциты крови Определение 8ЫР методом аллель-специфичной ПЦР

19 Децидуальная ткань Определение ЯМР методом аллель-специфичной ПЦР, ПДРФ-анализ. Анализ экспрессии генов. Анализ уровня метилирования генов и ЫЫЕ1 элементов

19 Хорионическая ткань

Женщины с самопроизвольным прерыванием беременности 74 Лейкоциты крови Определение ЯЫР методом аллель-специфичной ПЦР

14 Децидуальная ткань Определение 8ЫР методом аллель-специфичной ПЦР, ПДРФ-анализ. Анализ экспрессии генов. Анализ уровня метилирования генов и 1ЛШ1 элементов

14 Хорионическая гкань

Для выделения ДНК из лейкоцитов периферической крови использовали термокоагуляционный метод и реагенты «ДНК-экспресс-кровь» (Литех, Россия). Метод фенол-хлороформной экстракции был использован для выделения тотальной ДНК из децидуальной и хорионической тканей (Grimberg .1. et al., 1989). Выделение РНК из образцов тканей проводили путем экстракции смесыо гуанидинтиоционат-фенол-хлороформ (Chomczynski P. et. al., 1987).

Полиморфные варианты генов фолатного цикла (С677Т (rs 1801133) MTHFR, A66G (rs 1801394) MTRR, A2756G (rsl805087) MIR), генов факторов системы гемостаза (Т1565С (rs5918) ITGB3, С807'Г(rsl 126643) ITGA2, -455G-A (rs 1800790) FGB, -675 5G/4G (rsl799889) SERPINF.I), генов цитокинов (-3IC-T (rsl 143627) IL-ip, -174G-C (rsl800795) IL-6, -592C-A, (rsl800872) -819C-T (rsl800871) IL-10, -308G-A (rsl800629) /№«), генов системы контроля клеточного цикла и репарации (AspI48G!u frsl 130409) APEX 1 (АРЕ 1), Lys75lG!n F.RCC 2 (XPD), 11 OOdelC CHER' 2) исследовали методом аллель-специфичной ПЦР с использованием реагентов «SNP-экспресс» (Литех, Россия). Анализ полиморфных вариантов гена 7Р53 (Pro72Arg) (rsl042522) проводили методом анализа полиморфизма длин ресфикционных фраг ментов.

Количественный анализ уровня метилирования ДНК в генах ERVWE1 и ERVFRDE1, последовательностей LTR HERVK и 5'UTR LINE] определяли SIRPH-методом. Оценку глобального метилирования ДНК в образцах хорионической и децидуальной ткани проводили методом бисульфитного пиросеквени-рования всех сайтов метилирования (Gp островков).

Уровень экспрессии гена IIIF-Ia анализировали методом полуколичественной ПЦР. Уровень экспрессии генов цитокинов (IL-lfi, IL-6, II.-IO, TNFa), a также генов систем контроля клеточного цикла и репарации ДНК (APEI, ТР53, СНЕК2, ERCC2) определяли с помощью real-time PCR.

Поиск мотивов микро-РНК проводили с помощью биоинформационных пакетов профамм МЕМЕ Suite, GLAM-2 и mscanner. Величину гомологии последовательности рассчитывали как процент схожести найденного в ттуклеотидной последовательности фрагмента с консенсусной последовательностью мотива микро-РНК. Результаты были отфильтрованы по гомологии, для дальнейшей обработки были отобраны последовательности со степенью сходства 85% и выше.

Соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга определяли с использованием Hardy-Weinberg equilibrium calculator в профамме www.oege.org/software/Hardy-Wcinberg (Rodriguez S. el al., 2009). Оценку различий в распределении аллельных вариантов генов в обследованных фуппах осуществляли по критерию \ при помощи профаммы BIOSTAT (Biostalistica, 1998). Для анализа межгенных взаимодействий генов-кандидатов использован биоинформатический подход - Mullifactor Dimensionality Reduction (профамма MDR, v. 1.1.0 www.epislasis.org/mdr.html).

Статистический анализ данных по экспрессии генов цитокинов и факторов системы контроля клеточного цикла и репарации ДНК в тканях проводили

методом 2 длс 1. ДАО и ЛСЧ раесчитывали согласно Елуак К. И 8сЬтШ§еп Т. (Ыуак К., ЯсЬт^еп Т., 2001).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ частот полиморфных вариантов генов цигокинов в клетках материнского и зародышевого происхождения при невынашивании беременности

В результате исследования установлено, что распределение частот генотипов по полиморфному варианту гена интерлейкина 1 среди женщин с неразвивающейся беременностью и спонтанным прерыванием беременности в первом триместре не отличается от контроля. Однако различия в характере распределения частот генотипов по полиморфному варианту -ЗК^-Ггена //,-//? между двумя группами женщин с патологией беременности в первом триместре статистически значимы. Частота аллели -31Т гена II -1 /? в группе НБ оказалась выше по сравнению с таковой в группе женщин со спонтанным прерыванием беременности (табл. 2).

Среди женщин со спонтанным прерыванием беременности выявлено повышение риска возможного развития спонтанного прерывания беременности для гетерозигот -592Г-7' гена /А-10 ((Ж = 2,44 95% С1 1,36 - 4,38). В то же время гомозиготы по аллели С-592 гена /¿-10 имеют сниженный относительный риск развития мультифакторной патологии (ОИ = 4,46 95% С1 0,26 - 0,82). Статистически значимые отличия обнаружены между двумя группами женщин с нарушением ранних сроков эмбрионального развития плода. Среди женщин из группы СА увеличена частота гетерозигот по данному полиморфному варианту гена по сравнению с группой женщин с неразвивающейся беременностью (табл. 2).

В группе женщин со спонтанным прерыванием беременности распределение частот генотипов по полиморфизму -819СТ гена /7,-10 статистически значимо отличалось от такового для контрольной группы. Частота аллели -8197" гена //.-10 среди женщин со спонтанным прерыванием беременности в нервом триместре статистически значимо выше по сравнению с контролем (0,228).

Характер распределения частот генотипов и аллелей но полиморфному варианту гена фактора некроза опухоли среди женщин с неразвивающейся беременностью соответствует контрольной фуппе (табл. 2). Среди женщин со спонтанным прерыванием беременности выявлено увеличение числа гомозигот по аллели -308(7 при одновременном еггижеггии доли гетерозигот -308С7Л по сравнению с контрольной группой. Частота аллели -308Л в данной группе наименьшая. Аллель (1-ЗОН гена УШ'а ассоциирована с повышением риска спонтанного прерывания беременности на ранних сроках (ОЯ = 2,03 95% О 1,12 -3,7).

Анализ частот регистрации полиморфных вариантов генов цитокинов в хориопичсской ткани не выявил отличий между группами в характере распре-

деления частот генотипов по полиморфным вариантам генов интерлейкина-10 и фактора некроза опухоли (табл. 3).

Таблица 2 - Частоты генотипов и аллелей по полиморфным вариантам генов цитокинов в лейкоцитах периферической крови женщин_

Ген, генотип, аллель Контроль (МА) Патология беременности

СА, абс. (%) х2.(Р) НЕ, абс. (%) Х21(Р)

¡¿-¡Р

¡¿-¡Р СС-31 49 (36,6) 39 (52,7) 5,09 (0,08) 24 (31,2) 1,22 (0,54)

И-1Р С-31 Т 66 (49,3) 27 (36,5) 44(57,1)

¡¿-¡Р -31 ТТ 19(14,2) 8(10,8) 9(11,7)

Аллель -31Т 0,388 0,291 0,403

*22(Р) 3,97 (0,05) 0,09 (0,77)

Л(Р) Генотипы:7,64 (0,02) Аллели: 4,18 (0,04)

11-6

11-6 СО-174 32 (23,9) 14(18,9) 2,21 (0,33) 19(24,7) 4,09 (0,13)

11-6 (7 -174 С 74 (55,2) 38(51,4) 33 (42,9)

11-6 - 174 СС 28 (20,9) 22 (29,7) 25 (32,5)

Аллель -174С 0,485 0,554 0,539

1,82 (0,18) 1,19(0,29)

¡¿-10

И-10 СС -592 80 (59,7) 30 (40,5) 9,18 (0,01) 44(57,1) 0,18 (0,91)

¡¿-10 С -592А 42 (31,3) 39 (52,7) 25 (32,5)

¡¿-1- -592АА 12 (9,0) 5 (6,8) 8(10,4)

Аллель -592А 0.246 0,331 0,266

Л(Р) 3,43 (0,06) 0,21 (0,65)

Л(Р) Генотипы:6,45 (0,04) Аллели: 1,52 (0,22)

11-10

¡¿-10 СС -819 82 (61,2) 32 (43,2) 6,21 (0,04) 48 (62,3) 0,57 (0,75)

¡¿-10 С -819 Т 43 (32,1) 35 (47,3) 22 (28,6)

¡¿-1- -819 ТТ 9(6,7) 7 (9,5) 7(9,1)

Аллель 0,228 0,331 0,234

Л(Р) 5,25 (0,02) 0,02 (0,89)

Х2з(Р) Генотипы:6,11 (0,05) Аллели: 3,53 (0,06)

ТЫРа

ТИР С,0 -308 85 (63,4) 59 (79,7) 5,97 (0.05) 45 (58,4) 0,94 (0,63)

Т№ а -308 А 45 (33,6) 14(18,9) 28 (36,4)

'ШР -308 ЛА 4 (3,0) 1 (1.4) 4 (5,2)

Аллель -308/4 0,198 0,108 0,234

Х22(Р) 5,54 (0,02) 0,76 (0,38)

Л(Р) Генотипы:8,29 (0,02) Аллели: 8,36 (0,004)

Примечание: МА - медицинский аборт; СА - спонтанное прерывание беременности; НБ - неразвивающаяся беременность; - сравнение с контролем частот генотипов; х'г ~ сравнение с контролем частот аллелей; х"э•- сравнение между группами СА и НБ.

Однако в группе женщин с неразвивающейся беременностью частота образцов, гомозиготных по аллели 0-174С гена 1Ь-б статистически значимо выше по сравнению с контрольной группой и группой СА. Высокий относительный риск неразвивающейся беременности выявлен для аллели С-174 гена 1Ь-6 (ОЯ = 8,1 95% С1 1,96-33,87).

Таблица 3

Частота генотипов и аллелей генов цитокинов в хорионической ткани женщин с

невынашиванием беременности

Ген, генотип, ал- Контроль Спонтанное прерыва- Неразвивающая-

лель (МА) ние беременности ся беременность

Абс. % Абс. % Абс. %

И-1Р

И-1Р СС-31 6 26,1 7 50,0 4 21,1

И-1Р С-31Т 16 69,6 5 35,7 13 68,4

И-1Р-31ТТ 1 4,3 2 14,3 2 10,5

4,23 (0,12) 0,67 (0,72)

Аллель -31 Г (Р) 0,39 0,32 (0,54) 0,45 (0,6)

И-6

1Ь-6 ОС -174 4 17,4 4 28,6 12 62,2

1Г-6С-174С 16 69,6 9 64,3 7 36,8

11-6 -174СС 3 13,0 1 7,1 0 0

г (Р) 0,82 (0,66) 10,2 (0,006)

Аллель-174Г (Р) 0,48 0,39 (0,47) 0,18(0,005)

тг

'¡Ш СЮ -308 15 65,2 8 57,1 9 47,4

1ШС-308А 7 30,4 6 42,9 10 52,6

Т№ -308 АА 1 4,3 0 0 0 0

Х*(Р) 1,08 (0,58) 2,67 (0,26)

Аллель -308Л (Р) 0,19 0,21 (0,85) 0,26 (0,46)

11-10

11-10 СС-592 8 34,8 4 28,6 12 63,2

11-10 С-592А 14 60,9 9 64,3 7 36,8

11-10- -592АА 1 4,3 1 7,1 0 0

х2(Р) 0,25 (0,88) 3,79 (0,15)

Аллель -592Л (Р) 0,35 0,39 (0,7) 0,18(0,09)

Примечание: \ (Р) - сравнение частот генотипов с контролем; Р - сравнение

частот аллелей с контролем.

Анализ частот полиморфных вариантов генов фолатного цикла и факторов свертывающей системы крови в тканях материнского и зародышевого происхождения

Распределение частот генотипов и аллелей по полиморфизму С677Т гена MTHFR одинаково в сравниваемых группах женщин. Ile обнаружено статистически значимых различий в частотах генотипов и для гена MTRR. Однако частота аллели 66G гена MTRR среди женщин с репродуктивными потерями статистически значимо выше контрольной группы (0,536 и 0,455 соответственно, р = 0,05).

В группе женщин с потерей беременности в первом триместре доля гете-розигот и гомозигот по аллели 2756G гена MTR выше по сравнению с группой контроля. Распределение частот генотипов в данной группе статистически значимо отличается от контрольных показателей, /(ля гомозигот гго аллели 2756G гена MTR относительный риск развития изучаемой мультифакторной патолог ии составил 4,1 (95% CI 1,15 — 14,76). Частота аллели 2756G гена MTR среди женщин с невынашиванием беременности составила 0,286, что статистически значимо выше гго сравнению с контролем.

Таким образом, для женщин выявлена ассоциация аллели 66G гена MTRR и аллели 2756G гена MTR с невынашиванием беременности первого триместра.

Анализ частот полиморфных вариантов генов факторов свертывающей системы крови в клетках материнского и зародышевого происхождения не выявил различий между сравниваемыми группами.

Анализ уровня метилирования геномной ДНК в тканях материнского и зародышевого происхождения

Анализ уровня метилирования CpG-сайтов, расположенных в 5'LTR регионе генов ERVWE1 и ERVFRDE1 статистически значимо ниже в хориониче-ской ткани по сравнению с децидуальной (р < 0.0001) вне зависимости от характера течения беременности (рис. 1).

Рисунок 1. Профиль метилирования региона 5T.TR гена ЕЯУ]УЕ1 при разном характере течения беременности (ХТ - хориопическая ткань; ДТ - де-цидуальная ткань; * - при Р < 0.0001, значения Р представлены для сравнений между двумя типами тканей).

Уровень метилирования CpG-сайгов, расположенных в 5'UTR нетранс-лируемой области LINE1 и длинном концевом повторе HERVK, также статистически значимо ниже в хорионической ткани по сравнению с децидуальной (Р< 0.0001).

Абсолютный уровень метилирования LINE1 элементов в хорионической ткани, измеренный методом глубокого бисульфитного секвенирования, равен 54 % (рис. 2).

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

Рисунок 2. Профиль метилирования генов ЕКУ1¥1\1, ЕЯУЬТНУЕЛ, НЕИУК и ЬШЕ1 в хорионической и децидуальной тканях беременных женщин с различным диагнозом; данные представлены в виде среднего уровня метилирования.

Результаты глубокого бисульфитного секвенирования согласуются с результатами, полученными путем ЯЖРН-метода. Средние уровни метилирования всех проанализированных регионов статистически значимо ниже в хорионической ткани, чем в децидуальной (р < 0.01) (рис. 3).

SLTR ERVWE1 5 LTR ERVFRDE1 LTR HERVK 5'UTR LINE1

ERVWE1 S'LTR ERVFRDE1 S'LTR HERVK LTR

AT XT ДТ XT ДТ

LINE15'UTR

XT

ft I ■ NflMTWIHpOtMNMl CpG-ыйг

i л 1 Я м*тмдиро(ммыЙ срОч<Ят

' г . 1 - I. СЭ о«укт»умшийСрО-сайт

т г.. ||| t. v

1 | 1

СУМА-ОМ (УМА з O.tl iyr.1A3D.J7 (УМА'О-в! (УМА'0.27 сУМА.0« N-1M N«M0 М> 1273 N*HJ Hiun N.tu

Рисунок 3. Профиль метилирования регионов 5'LTR ERVWE1, 5'LTR ERVFRDE1, LTR HERVK и 5'UTR LINE1 в хорионической и децидуальной тка-

ни. Горизонтальные линии соответствуют отдельным СрО-сайтам, вертикальные - ампликонам; синие полосы соответствуют не метилированным СрО-сайтам, красные - метилированным, белые - нераспознанным СрО-сайтам.

Таким образом, на основании результатов анализа уровня метилирования ДНК в хорионической и децидуальной тканях можно сделать вывод о тотальном гипометилировании ДНК клеток хорионической ткани.

Анализ частот полиморфных вариантов генов системы контроля клеточного цикла и репарации ДНК

Ни в одном из исследуемых образцов ДНК, полученных из лейкоцитов периферической крови беременных женщин, не выявлено делеции цитозина в 1100 положении гена СНЕК1 как в гетерозиготном, так и гомозиготном состоянии. Данные о частоте регистрации полиморфных вариантов А5р148С1и гена АРЕХ1, Ьу5751С1п гена ЕЯСС2 (ХРО) и ТР53 Рго72Аг% в образцах крови представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Частоты генотипов и аллелей по полиморфным вариантам генов системы контроля клеточного цикла и репарации ДНК в клетках крови женщин__

Ген, генотип, аллель Контроль (MA) Патология беременности

НБ, абс. (%) х2(Р) CA, абс. (%) х2(Р)

ТР53

TP53 ProPro72 11 (8,2) 7(9,1) 3,49 (0,17) 3(4,1) 2,72 (0,26)

ТР53 Pro72Arg 43 (32,1) 34 (44,2) 19(25,7)

ТР53 72ArgArg 80 (59,7) 36(46,8) 52 (70,3)

Аллель 12Arg 0,757 0,6881 2,39 (0,12) 0,831 3,05 (0,08)

APEX1

APEX1 AspAspl 48 28 (20,9) 16(20,8) 0,84 (0,66) 19(25,7) 0,8 (0,67)

APEX1 Aspl48Glti 71 (53,0) 45 (58,4) 35 (47,3)

APEX1 148GluGlu 35 (26,1) 16(20,8) 20 (27,0)

Аллель 148 Glu 0,526 0,50 0,27 (0,61) 0,507 0,14 (0,71)

ERCC2 (XPD)

XPD LysLys 751 42 (31,3) 20 (26,0) 1,0 (0,61) 16(21,6) 4,38 (0,11)

XPD Lys751Gln 73 (54,5) 43 (55,8) 40 (54,1)

XPD 751GlnGln 19(14,2) 14(18,2) 18(24,3)

Аллель 751 Gin 0.414 0,461 0,88 (0,35) 0,514 3,8 (0,05)

Примечание: МА - медицинский аборт; СА - спонтанное прерывание беременности; НБ - неразвивающаяся беременность; - сравнение с контролем.

Но полиморфным вариантам генов ТР53, АРЕХ\ различий в распределении частот генотипов и аллеей между группами женщин не выявлено. Но среди

17

женщин со спонтанным прерыванием беременности частота аллели 751 ап гена ЕЛСС2 статистически значимо выше по сравнению с группой контроля (0,514 и 0,414 соответственно) (ОЯ = 1,49 95% С1 1,0 - 2,24).

Результаты проведенного анализа частот аллельных вариантов генов системы контроля клеточного цикла и репарации ДНК в клетках хорионической ткани представлены в таблице 5. В образцах хорионической ткани, полученных в случаях невынашивания беременности первого триместра, выявлены гетеро-зиготы по исследуемому аллельному варианту гена СНЕК2. И при неразвивающейся беременности и при спонтанном ее прерывании частота аллели 1100с!е1С в образцах хорионической ткани статистически значимо выше по сравнению с контрольной группой образцов.

Таблица 5 - Частота генотипов и аллелей генов системы контроля клеточного цикла и репарации ДНК в хорионической ткани_

Ген, генотип, аллель Контроль (МА) Неразвивающаяся беременность Спонтанное прерывание беременности

Абс | % Абс. | % Абс. | %

СНЕК2

СНЕК2 СС1100 24 100 15 78,9 11 78,6

СНЕК2 СП00с1е1 0 0 4 21,1 3 21,4

СНЕК2 110Ме/Ш1 0 0 0 0 0 0

I2 (Р) 5,57 (0,06) 5,58 (0,06)

Аллель \ Ш(]е1С(?) 0 0,105 (0,02) 0,107(0,02)

ТР53

ТР53 РгоРго72 0 0 0 0 0 0

ТРРго72Аг% 3 12,5 3 15,8 4 28,6

ТР 72Аг%Аг% 21 87,5 16 84,2 10 71,4

х" (Р) 0,1 (0,95) 1,52 (0,47)

Аллель 72Аге (Р) 0,94 0,92 (0,77) 0,86 (0,24)

АРЕХ1

АРЕХ1 А.\рАьр148 4 16,7 2 10,5 2 14,3

АРЕХ1 А.чр14801и 16 66,7 12 63,2 10 71,4

АРЕХ1 14801и(Пи 4 16,7 5 26,3 2 14,3

х2 (Р) 0,78 (0,68) 0,09 (0,95)

Аллель 148в!и (Р) 0,5 0,58 (0,47) 0,5 (1,0)

ХРО

ХРО Ly.sLy.4751 7 29,2 4 21,1 1 7,1

ХРО Еу$75Ю1п 15 62,5 13 68,4 9 64,3

ХРО 751С,1пС1п 2 8,3 2 10,5 4 28,6

х2(Р) 0,38 (0,82) 4,34 (0,11)

Аллель 75101п (Р) 0,39 0,45 (0,63) 0,61 (0,08)

Примечание: % (Р) - сравнение частот г енотипов с контролем; Р - сравнение частот аллелей с контролем.

Анализ межгенных взаимодействий генов-кандидатов ассоциированных с репродуктивными потерями

Сочетанный анализ генов фолатного цикла показал, что риск невынашивания беременности первого триместра значимо повышен для женщин, имеющих в своем генотипе полиморфные варианты всех трех генов — MTHFR, MTRR, MTR (табл. 6). Еще более высокий риск невынашивания беременности формируется при сочетании аллельных вариантов генов MTHFR, MTRR и SER-PINE1. Риск остановки в развитии эмбриона (неразвивающейся беременности) повышается при наличии в генотипе женщины полиморфных вариантов генов IL-ip и 1L-I0. При сочетании в генотипе полиморфных вариантов четырех генов цитокинов повышается риск спонтанного прерывания беременности. Таблица 6 - Анализ межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов при невынашивании беременности

Комбинации генов в Тестируемое Воспроиз- Р OR

модели (группа взаимодействие водимость (95% CI)

женщин) генов

MTHFR, MTRR, MTR 0,62 10/10 0,001 2,6

(НВБ) (1,58-4,3)

MTHFR, MTRR, SER- 0,74 10/10 < 7,79

PINE1 (НВБ) 0,0001 (4,5-13,4)

IL-ip, IL-10 (SNP в - 0,68 10/10 < 5,9

819 положении) (НБ) 0,0001 (2,7- 12,8)

IL-ip, TNF, IL-6, IL-10 0,69 10/10 < 4,8

(CA) 0,0001 (2,5- 9,4)

MTHFR, MTRR, SER- 0,75 10/10 < 8,8

PINE1 (НВБ) 0,0001 (4,9- 15,9)

MTHFR, MTRR, 0,84 10/10 < 32,9

IL-ip, IL-6 (НВБ) 0,0001 (15,7-9,2)

APEX, XPD, TP53 0,64 10/10 0,0076 2,3

(НВБ) (1,9-4,2)

Сочетанный анализ полиморфных вариантов генов фолатного цикла, факторов свертывающей системы крови, а также цитокинов показал, что риск невынашивания беременности в первом триместре возрастает при наличии в генотипе полиморфных вариантов генов фолатного цикла, провоспалительных цитокинов и БЕЯ.РМЕ1 (табл. 6).

Анализ уровня экспрессии гена индуцируемого гипоксией факгора Н1Р-1а в клетках материнского и зародышевого происхождения

Анализ уровня экспрессии гена Н1Е-1а в хорионической и децидуальной тканях показал, что при нормально развивающейся беременности уровень экспрессии гена ШЕ-1а в хорионической ткани статистически значимо ньАне по

19

сравнению с децидуальной тканью (Р = 0,016) (рис. 4). При невынашивании беременности первого триместра уровень экспрессии гена в обоих типах тканей одинаков. При этом, если в децидуальной ткани уровень экспрессии не отличается от контрольного, то в хорионической ткани экспрессия гена Н1Р-1а при невынашивании беременности в 1,5 раза ниже по сравнению с контролем (Р = 0,057).

1.2

1.0

& 0.8 с э

$ 0.6

0.2 0,0

Рисунок 4. Уровень экспрессии гена Н1Г-1а в хорионической и децидуальной тканях при физиологической беременности

Анализ уровня экспрессии генов цитокинов в клетках материнского и зародышевого происхождения

Анализ уровня экспрессии гена провоспалительного цитокина 11.-1(1 при физиологически протекающей беременности показал, что уровень мРНК данного гена в децидуальной ткани статистически значимо выше по сравнению с хорионической тканью (Р = 0,001) (рис. 5).

При нарушении ранних этапов эмбрионального развития интенсивность экспрессии гена Я.-//? в тканях материнского и зародышевого происхождения одинакова (Р = 0,105) за счет усиления экспрессии данного гена в хорионической ткани.

-12

-16

Децидуальная Хорионичвская Децидуальная Хорионическая

А Б

Рисунок 5. Уровень экспрессии гена И-1р в клетках хорионической и децидуальной тканей относительно экспрессии гена ОАРИН при физиологически протекающей беременности (А) и невынашивании беременности (Б)

Таким образом, выявлено статистически значимое повышение уровня экспрессии гена интерлейкина-1 как в децидуальной (Р = 0,024), так и хорио-

нической (Р = 0,016) тканях при невынашивании беременности по сравнению с контролем.

Уровень экспрессии гена 1Ь-6 при физиологически протекающей беременности в децидуальной и хорионической тканях одинаков (Р = 0,168). При невынашивании беременности различий между тканями материнского и зародышевого происхождения также не выявлено (Р = 0,06). Однако, если в хорионической ткани экспрессия гена ингерлейкина-6 практически не изменяется (Р = 0,31) (рис. 6А), то в децидуальной ткани при неразвивающейся беременности уровень мРНК гена Я,-6 статистически значимо выше по сравнению с физиологически протекающей беременностью (Р = 0,015) (рис. 6Б).

-6 -8 -10 -12 -14 -16 -18

-6 -8 -10 -12 -14 -16

Контроль

НБ

Контроль

НБ

Рисунок 6. Уровень экспрессии гена И-6 в клетках хорионической (А) и децидуальной (Б) тканей относительно экспрессии гена ОАРОН при физиологически протекающей беременности и невынашивании беременности

Статистически значимых различий в содержании мРНК гена фактора некроза опухоли между клетками материнского и зародышего происхождения как в контроле, так и при неразвивающейся беременности не выявлено (Р = 0,18 и 0,17 соответственно).

Анализ уровня экспрессии гена противовоспалительного цитокииа IL-10 показал, что при физиологически протекающей беременности содержание мРНК данного гена одинаково в децидуальной и хорионической тканях (Р = 0,35) (рис. 7А). При неразвивающейся беременности уровень экспрессии гена IL-10 в децидуальной ткани статистически значимо выше по сравнению с хорионической тканью (Р = 0,036) (рис. 7Ь). Содержание мРНК гена IL-10 в децидуальной ткани при неразвивающейся беременности статистически значимо превышает данный показатель для физиологически протекающей беременности (Р = 0,019).

Корреляционный анализ показал, что при физиологически развивающейся беременности в децидуальной ткани уровень экспрессии гена IL-lß коррелирует с активностью синтеза мРНК гена 1L-10 (г = 0,62; Р = 0,039), а активность экспрессии гена IL-6 коррелирует с экспрессией TNF (г = 0,72; Р = 0,008) (рис. 8А). Активность синтеза противовоспалительного цитокина интерлейкипа-10 коррелируется с уровнем экспрессии фактора некроза опухоли (г = 0,72; Р = 0,008) (рис. 8Б)

-2 -4 -6 -8 -10 -12 -14 -16 -18

-2 -4 -6 -8 -10 -12 -14

Децидуальная' Хорионическая

Децидуальная Хорионическая

Рисунок 7. Уровень экспрессии гена И-10 в клетках хорионической и децидуальной тканей относительно экспрессии гена йАРБН при физиологически протекающей беременности (А) и невынашивании беременности (Б)

Таким образом, в децидуальной ткани при физиологически протекающей беременности активность синтеза провоспалительных и противовоспалительных цитокинов согласована.

J

Рисунок 8. Соотношение уровня экспрессии (ACt) генов IL6 и TNF (А) и TNF и IL-10 (Б) в клетках децидуальной ткани относительно экспрессии гена GAPDH при физиологически протекающей беременности

При нарушении ранних этапов эмбриогенеза в клетках децидуальной ткани нарушается сопряженность синтеза мРНК генов IL-6 и фактора некроза опухоли, а также TNF и IL-10. Если при физиологически протекающей беременности экспрессия противовоспалительного цитокина соотносится с уровнями мРНК всех трех исследуемых провоспалительных цитокинов, то при неразвивающейся беременности корреляционный анализ выявил сопряженность синтеза мРНК гена IL-10 только с геном IL-lß (г = 0,84; Р = 0,018). Это указывает на возможный дисбаланс в концентрации про- и противовоспалительных цитокинов в децидуальной ткани при невынашивании беременности.

В хорионической ткани при нормальной беременности уровень экспрессии гена IL-6 коррелирует с уровнем экспрессии IL—Iß (г = 0,9; Р = 0,0001). При неразвивающейся беременности в хорионической ткани уровни мРНК генов цитокинов практически не зависят друг от друга (например, г = 0,29 для генов IL-lß и IL-6; г = 0,36 для генов IL-6 и TNF). В то же время выявлена корре-

ляция между уровнем экспрессии генов TNF и IL-10 (г = 0,91; Р = 0,0038) (рис.

9). __

14

12 10 « ■ Ж ♦ ■ ■ • ■

8 - 1 ♦ ■ ♦ «11-10

6 - ■ "NF

4 ♦

0 ■

0 1 г 6 8

Рисунок 9. Соотношение уровней экспрессии (ACl) генов TNF и IL-I0 в клетках хорионической ткани относительно экспрессии гена GAPDH при невынашивании беременности

Обобщая полученные данные, можно сделать вывод, что при невынашивании беременности уровень экспрессии генов цитокинов изменяется как в клетках децидуальной, так и хорионической тканях. Общий характер изменений направлен на увеличение концентрации провоспалительных медиаторов.

Анализ уровня экспрессии генов системы контроля клеточного цикла и репарации ДНК в клетках материнского и зародышевого происхождения

В клетках материнского происхождения (децидуальная ткань) при физиологически протекающей беременности уровень экспрессии гена апуриновой эк-зонуклеазы статистически значимо превышает данный показатель для клеток хорионической гкани (Р = 0.019) (рис. 10А). При невынашивании беременности уровень транскрипции гена APEXI в клетках хорионической ткани не отличается от активности синтеза мРНК данного гена в децидуальной ткани (Р = 0,1) (рис. 10Б).

-0.5

•2.0 •2 S -3.0 -3.5 -4.0 -4.5 -5.0

мчмуатма

Рисунок 10. Уровень экспрессии гена APEXI в клетках хорионической и децидуальной тканей по отношению к уровню экспрессии гена GAPDH при фи-

зиологически протекающей беременности (а) и невынашивании беременности (б)

Уровень экспрессии генов ХРО, СНЕК2 в децидуальной гкани также выше по сравнению с хорионической тканью как при физиологической беременности (Р < 0,0001), так и при неразвивающейся беременности (Р = 0,003; 0,024 соответственно).

При физиологическом течении беременности уровень активности гена ТР53 в децидуальной ткани выше по сравнению с клетками хорионической ткани (Р = 0,0001) (рис. 11а). Различия в уровне экспрессии данного гена между тканями материнского и зародышевого происхождения нивелируются при невынашивании беременности (Р = 0,15) (рис. 116).

-4.0 -4.5 -5.0 -5.5 У -в о

-в .5 -7.0 -7.5 -8.0

-4.5 -5.0 -5.5 •6.0 -6.5 -7.0 ■73 -8.0

дсцмдушма* жориомнчмаая

а б

Рисунок 11. Уровень экспрессии гена ТР53 в клетках хорионической и децидуальной тканей по отношению к уровню экспрессии гена САРБН при физиологически протекающей беременности (а) и невынашивании беременности (б)

Поиск мотивов, гомологичных микро-РНК, как таргетных мишеней

Анализ мотивов, гомологичных микро-РНК в окружении исследуемых генов-кандидатов (табл. 7) показал, что степень гомологии последовательностей с известными микро РНК варьировала от 0,86 до 1. Большинство последовательностей было представлено в единичной копии. Наиболее часто встречались последовательности семейства гшг-1273.

Проведен анализ нескольких генов семейства фактора некроза опухолей ТЫРБР. Как зрелые (шпильки), так и пре-микро РНК равномерно распределены по всему межгенному пространству перед, после гена ТЫРБ/'10, а также в его интронах. Наблюдается кластеризация участков.

Анализ последовательностей вокруг гена Я,-//? выявил наличие последовательностей пре-микроРНК - на прямой цепи Ьав-ппЯ^З и Ьаз-гшЮ268, на обратной цепи найден мотив гомологичный пре-микро-РНК тт1-гтпг-7174 (72 пн). Последовательности для гшг482с; 1са-гшг-6012 расположены на обратной цепи, поэтому на прямой должны быть локализованы их транскрипционные сайты связывания.

Таблица 7 - Распределение мотивов, гомологичных микро-РНК (степень гомологии более 85%), в окружении исследуемых генов

Ген Длина Кол-во обна- Преобладающий мо- Плотность

межген- руженных зре- тив распределения

ного уча- лых ми-РНК ми-РНК по

стка участку генома

BRCA1 12254 34 hsa-miR-1273, miR-466 0.0028

BRCA2 4577 11 hsa-miR-5096; 0.0024

NF1 25057 45 hsa-rruR -1273 0.0016

NF2 43709 91 hsa-miR-1273; 0.0021

ТР53 28283 83 hsa-miR-1273 0.0029

IL-lß 16547 32 hsa-miR-5096;hsa-mi R-619 0.0019

IL-6 61612 68 hsa-miR-1273; hsa- mir-1268 0.0011

IL-10 26374 43 hsa-miR-5096; hsa-mir-566 0.0016

TNF-a 1241 6 hsa-miR-1273; miR-6984 0.0048

MTHFR 3857 12 hsa-mir-3929 0.0031

MTRR 65 0 0 0

MTR 30648 34 hsa-miR-5096;hsa-miR-619. 0.0011

ITGB 9389 4 hsa-mir-566 0.0004

FGB 6981 14 hsa-miR-5096 0.0020

SERPINE1 36459 25 hsa-miR-5096; mir-566 0.0006

Был проведен анализ области гена 1L-10, в которой локализованы исследуемые нами полиморфизмы. На рисунке 12 вертикальной желтой полосой выделен полиморфный сайт -592 и место расположения обнаруженной микро РНК. Первая желтая полоса - место локализации has mir 643. Эта микро-РНК расположена за 110 нуклеотидов до исследуемого нами полиморфного сайта.

Рисунок 12. Снимок жрана геномного браузера А^о, отображающий результаты поиска мотива микро-РНК для гена /¿-70 найденного с помощью программы тэсаппег. Правая желтая полоса отражает локализацию сайта -592.

Модель взаимодейст вии молекулярно-генетических предикторов при невынашивании беременности

На основании проведенного исследования можно утверждать, что ал-лельные варианты, уровень экспрессии, а также сочетанный эффект полиморфных вариантов одних генов с уровнем экспрессии друг их генов-кандидатов четырех функциональных групп ассоциированы с невынашиванием беременности в первом триместре.

На основании анализа полученных данных предложена схема взаимодействия изученных молекуляргго-геггетических маркеров. При физиологически протекающей беременности адекватная экспрессия индуцируемого гипоксией фактора (ЮТ-1а) запускает каскадные сигнальные пути, которые обеспечивают нормальное деление клеток эмбриогга, процессы имплантации, формирования и роста новьгх кровеносных сосудов. Поскольку данные процессы требуют активного синтеза и ДНК, и РНК, и белков функционирование фолатного цикла (в частности, как донора метальных групп) является обязательным условием (рис. 13).

Мы применили метод МОЯ для анализа возможного взаимодействия между наличием полиморфных вариантов и уровнем экспрессии исследуемых генов. Анализ для децидуальной ткани показал, что существует тесная взаимосвязь между наличием полиморфных вариантов генов интерлейкина-10, интер-лейкина-6 и уровнем экспрессии генов //.-///, 11,-10 (табл. 8).

Для клеток хорионической ткани выявлена сопряженность наличия полиморфного варианта гена //.-//? с особенностями экспрессии генов 11.-1/1, II-10, Т№а (габл. 9).

Окислительный стресс

Тромбообразование и нарушение ангиогенеза

т

Нарушение имплантации

т

Нарушение деления клеток

НЕВЫНАШИВАНИЕ БЕРЕМЕННОСТИ

Рисунок 13. Роль исследуемых молекулярно-генетических маркеров функциональных групп генов в невынашивании беременности

Таблица 8 - Анализ межгенных взаимодействий с учетом индивидуальных генотипов клеток децидуальной ткани по полиморфным вариантам генов цитоки-нов и уровня их экспрессии

Комбинации генов в Тестируемое Воспроизводимость р

модели взаимодействие генов модели

И-1р (экспрессия), И-10 0,92 10/10 0,0007

(наличие И-10 (экспрессия)

На рисунке 14 приведена схема, отражающая взаимное влияние исследуемых маркеров - предикторов репродуктивных потерь. Исследуемый полиморфный вариант гена 1Ь-1р обуславливает повышение уровня экспрессии гена, что влечет за собой активацию синтеза цитокинов семейства интерлейкина-6, активацию синтеза интегринов, в частности субъединицы рЗ. В то же время синтез самого провоспалительного цигокина интерлейкина-1 зависит от концентрации гомоциетеина, а также активности белков, контролирующих деление клеток и апоптоз.

Таблица 9 - Анализ межгенных взаимодействий с учетом индивидуальных генотипов клеток хорионической ткани по полиморфным вариантам генов цито-кинов и уровня их экспрессии

Комбинации генов в Тестируемое Воспроизводимость р

модели взаимодействие генов модели

IL-lß /экспрессия), IL-lß 1,0 9/10 <0,0001

(SNP), IL-10 (экспрессия), TNF (экспрессия)

Активность синтеза цитокинов семейства интерлейкина-6, находясь под контролем других цитокинов, например, фактора некроза опухоли, а также ряда факторов роста, активирует синтез интегринов, регулирует экспрессию генов контроля клеточного цикла.

Поскольку исследуемые молекулярно-генетические маркеры относятся к медиаторам межклеточных взаимодействий, а также факторам контроля стабильности ДНК и клеточного цикла изменение характера функционирования данных групп генов влечет за собой нарушения в работе целого ряда метаболических путей и развитию мультифакторных патологий.

Экспрессия

Цитокины и факторы роста

Ферменты контроля клеточного цикла и репара-

Факторы свертывающей системы крови

обмен

Снижение активности ферментов, гипергомоцистеинемия

t

MTHFR. MTRR. MTR

I

Нарушение обмена м см ильных групп

АРЕХ1

SERPINL1

Интегрины

TN Fa

Наличие полиморфных вариантов генов

Изменение уровня экспрессии

СНЕК2

ТР53

Рисунок 14. Схема, отражающая взаимное влияние исследуемых маркеров - предикторов репродуктивных потерь (красными стрелками указаны активирующие эффекты, синими стрелками указаны ингибирующие эффекты)

выводы

1. Молекулярно-генетические причины репродуктивных потерь включают в себя комплекс факторов, среди которых наличие полиморфных локусов генов цитокинов, фолатного цикла, факторов свертывающей системы, системы репарации ДНК и контроля клеточного цикла. При этом наибольший вклад в эмбриональную гибель плода со стороны матери вносят полиморфные локусы генов цитокинов, а со стороны отца генов репарации ДНК и контроля клеточного цикла. Уровень экспрессии ряда генов сопряжен с наличием полиморфных локусов. Наличие полиморфизмов в промоторной области генов цитокинов изменяют уровень транскрипции генов за счет нарушения связывания их с микро-РНК, которые в большом числе копий локализованы в цис-регуляторной области исследуемых генов.

2. Группы женщин с неразвивающейся беременностью и спонтанным прерыванием беременности отличаются друг от друга особенностями генотипа по генам цитокинов. Среди женщин с неразвивающейся беременностью увеличена частота аллели -31Г гена IL-\p. Гетерозиготность -592С-Гпо гену //.-10 ассоциирована с повышением риска спонтанного прерывания беременности (OR = 2,44 95% CI 1,36 - 4,38). Аллель (¡-ЗОН гена TNFa ассоциирована с повышением риска спонтанного прерывания беременности на ранних сроках (OR = 2,03 95% CI 1,12 - 3,7). При неразвивающейся беременности в клетках хориониче-ской ткани снижена частота регистрации аллели -174С гена IL-6.

3. Репродуктивные потери в I триместре ассоциированы с наличием у женщины аллели 66G гена MTRR и аллели 2756G гена MTR. Высокий риск невынашивания беременности характерен для женщин, имеющих в генотипе полиморфные варианты всех трех генов фолатного цикла - MTHFR, MTRR, MTR. Риск невынашивания беременности возрастает для женщин, имеющих в своем генотипе полиморфные варианты генов фолатного цикла (MTHFR, MTRR), факторов свертывающей системы крови (SERPINE1) и провоспалительных цитокинов (//.-/, IL-6).

4. Исследование статуса полного метилирования методом бисульфит-ного секвенирования UNE1 элементов и HERVK показало, что уровень метилирования геномной ДНК в хорионической ткани ниже, чем дсцидуальной, независимо от исхода беременности. Для 5 LTR генов ERVWE1 и ERVFRDEJ, LTR HERVK и 5'UTR UNE! показано тканеспсцифическое метилирование в децидуальной и хорионической гканях. Различий в уровне метилирования генов ERVWEI и ERVFRDEJ в тканях материнского и зародышевого происхождения при физиологически протекающей беременности и невынашивании беременности не выявлено. Отмечено г лобальное гиггометилирование геномной ДНК в хорионической ткани плаценты.

5. Среди женщин со спонтанным прерыванием беременности частота аллели 75107л? гена ERCC2 повышена (OR = 1,49 95% CI 1,0 - 2,24). Наличие аллели UOOdelC гена СНЕК2 в клетках хорионической ткани ассоциировано с Iгевы!гашиваггием беременности.

6. При физиологическом течении беременности уровень экспресссии гена HIF-la в хорионической ткани статистически значимо выше по сравнению с децидуальной тканью (р = 0,016). При невынашивании беременности уровень экспрессии гена HIF-la снижается в хорионической ткани в 1,5 раза по сравнению с контролем.

7. Невынашивание беременности первого триместра ассоциировано с увеличением уровня экспрессии гена lL-ip как в децидуальной, так и хорионической тканях. В клетках децидуальной ткани нарушается сопряженность синтеза мРНК генов IL-6 и фактора некроза опухоли, а также TNF и IL-10.

8. При физиологически развивающейся беременности уровень экспрессии генов XPD, СНЕК2, ТР53 в децидуальной ткани превосходит таковой для хорионической ткани. При невынашивании беременности различия в уровне экспрессии гена ТР53 между двумя типами тканей отсутствуют.

9. Цис-регуляторные районы генов, вовлеченных в процессы развития трофобласта, содержат таргетные мишени генов микро РНК has-mir-5069, has-miR-1273, has-miR-466, has-miR-1268, has-mir-5703. Полиморфные локусы гена IL-10 -592 С-А и -819 С-Т расположенные рядом с микро-РНК has-mir 643.

10. Наличие полиморфных вариантов исследованных генов коррелирует с характером экспрессии генов кандидатов. Для децидуальной ткани при патологии ранних сроков беременности выявлена тесная взаимосвязь между наличием полиморфных вариантов г енов IL-10, IL-6 и уровнем экспрессии генов IL-ip, IL-10. Для клеток хорионической ткани характерна сопряженность наличия полиморфного варианта гена IL-ip с особенностями экспрессии генов 1L-ip, IL-10.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Сохранение репродуктивного здоровья населения и повышение рождаемости имеет приоритетное значение в стратегии национальной безопасности пашей страны. Целесообразно на этапе планирования беременности супружеским парам рекомендовать проводить молекулярно-генетическое обследование на носительство полиморфных аллелей генов с целью определения риска репродуктивных потерь в данной семье, с последующим проведением профилактических мероприятий, а при необходимости и превентивной терапии для сохранения беременности.

2. Рекомендуемая панель определения полиморфных локусов в супружеских парах : аллели -31Т гена IL-1 p. G-308 гена TNFa ; 66G гена MTRR; 2756G гена MTR. 151 (Пп гена ERCC2, IlOOdelC гена C1IKK2. Женщинам с угрозой прерывания беременности, имеющим случаи невынашивания беременности в анамнезе, рекомендуется проводить комплексную ДНК-диагностику по выявлению полиморфных вариантов генов цитокинов, генов фолатного цикла, факторов свертывающей системы, а для их супругов рекомендуется выявление полиморфизмов системы репарации ДНК и контроля клеточного цикла с целью определения относительного риска эмбриональной гибели плода.

3. Выявленные в цис-регуляторных элементах генов-кандидатов последовательности микро-РНК могут быть использованы как таргетные мишени для разработки новых терапевтических подходов в лечении осложнений беременности.

4. Наибольшее практическое значение имеет возможность составления индивидуального прогноза риска эмбриональных потерь, что обеспечивает персонифицированный подход в медицине.

Перечень использованных сокращений

ИМ - индекс метилирования ДНК МА - медицинский аборт НБ - неразвивающаяся беременность НВБ — невынашивание беременности ОТ - обратная транскрипция

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

CA - спонтанное прерывание беременности

АРЕ 1 — апуриновая-апиримидиновая эндонуклеаза

CDK - циклин-эависимые киназы

СНЕК2 - чекпоинт-киназа 2

ERVFRDE1 - ген еинцитина 2

ERVWE1 - ген еинцитина 1

FGB -фибриногена ß-цепь

GAPDH - глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа

HIF-la- индуцируемый гипокисей фактор

IL - интерлейкин

ITGA2 - интегрин альфа-2

ITGB3 - тромбоцитарный рецептор фибриногена

LIF - фактор ингибирования лейкемии

M-MLV RT - обратная транскригггаза вируса лейкемии мышей Молони

Ml UFR -5,10-метилентетрагидрофолатрсдуктаэа

М I RR - метионинсинтаза редуктаз

MTR - метионинсинтаза

NK — естественные киллеры - лимфоциты

SERPINE1 - ингибитор активатора плазминогена

SNuPE - метод однонуклеотидной элонгании праймера

TNF - фактор некроза опухоли

XPD - белок эксцизионной репарации ДНК ERCC-2

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Полиморфизм генов системы фолатного цикла и бесплодие / Онуф-риенко Е.А., Машкина Е В. // Мат. V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (часть I). Москва, 2009. С. 472.

2. Исследование эффективности пренатального скрининга в первом триместре беременное™ / Гутникова JI.В., Александрова A.A., Ломтева С В.,

Данько Е. А., Машкина Е.В., Шкурат Т.П. // Валеология, 2009 № 3. С. 28-34.

3. Генодиагностика папилломавирусной инфекции у жителей Ростовской области / Машкина Е.В., Коваленко К.А., Сараев К.Н., Лысенко О.В., Шкурат Т.П. // Валеология, 2009, № 3. С . 21-28.

4. Исследование частог полиморфных аллелей генов ангиотензиноге-на и интефинов ß-З в трех возрастных фуппах жителей Ростова-на-Дону / Коваленко К.А., Сеина С.О., Чанг Нгуен Тхи и др. // Валеология. - 2010. - №3. - С. 49-54.

5. Полиморфизм генов интефинов и невынашивание беременности / Гутникова Л.В., Коваленко К.А., Покудина И.О. и др. // Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков: тезисы докл. - Ростов-на-Дону, 2010. - С. 50.

6. Исследование частот полиморфных аллелей генов системы репарации ДНК и контроля клеточного цикла у женщин с невынашиванием беременности / Лотник B.C., Лаура Н.Б., Машкина Е.В. // Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010. С. 104.

7. Полиморфизм генов фолатного цикла и предрасположенность к тромбофилиям у школьников Ростова-на-Дону / Миктадова A.B., Машкина Е.В.. Шкурат Т.П. // Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010. С. 114.

8. Coagulation genes and pregnancy / Kovalenko К.A., Gutnikova E.V., Mashkina E.V. et al. // Abstracts of the 5'1' Congress of the World Association of Reproductive Medicine. - Moscow, 2010. - P. 11-12.

9. Показатели окислительного статуса беременных, родивших детей с низкой массой тела / Александрова A.A., Гутникова Л.В., Амелина С.С., Машкина Е.В., Шкурат Т.П. // В мат. I межд. научно-практической конф. "Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине", г.Москва, 2010. -С. 121.

10. Исследование частот полиморфных аллелей генов системы деток -сикации ксенобиотиков при эмбриональных потерях / Гутникова Л.В., Коваленко К.А., Покудина И.О., Машкина Е.В., Шкурат Т.П. // Сборник трудов VII Всероссийской научно-пракгической конференции с международным участием, 2010. Т. 3. С. 47-49.

11. Полиморфизм генов фолатного цикла у женщин с невынашиванием беременности / Деревянчук Е.Г., Коваленко К.А., Машкина Е.В. и др. // Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010»: тезисы докл. — Москва, 2010.—С. 49-50.

12. Региональные нормы уровня сывороточных маркеров крови беременных Ростовской области / Гутникова Л.В., Амелина С.С., Грудева Е.В., Се-шота О.И., Александрова A.A., Машкина Е.В., Шкурат Т.П. // Ученые залиски СПбГУ им. Акад. И.П. Павлова. 2011 Т. XVIII № 1. С. 86-90.

13. Исследование полиморфизма генов фолатного цикла и коагуляци-

онных факторов крови у супружеских пар с бесплодием / Мирина Е.А., Коваленко К.А., Машкина Е.В., Шкурат Т.П. // Валеология, 2011. № 2. С. 91-95.

14. Биохимические и генетические критерии фолатного метаболизма и нарушения эмбриогенеза человека / Деревянчук Е.Г., Машкина Е.В., Коваленко К.А. и др. // Современные проблемы науки и образования. 2011. № 4. URL: www.science-education.ru/98-4738

15. Полиморфизм гена ангиотензиногена у лиц с нарушением репродуктивной функции / Мирина Е.А., Машкина Е.В., Шкурат Т.П. // Валеология. 2011. №4. С. 113-115.

16. The frequency of DNA-repair and cell cycle control polymorphisms and pregnancy / Lotnik V., Mashkina E., Shkurat Г. // Eur J Human genetics, 201 I.V. 19 Suppl 2. P. 167

17. Polymorphism of genes and pregnancy loss / Mashkina E., Kovalenko K., Fomina N., Rimashevsky A., Shkurat T. // Eur J Human genetics, 2011. V. 19 Suppl 2. P. 173.

18. Спонтанный и индуцированный цитокиновый craiyc в культуре клеток / Александрова A.A., Машкина Е.В. // Сборник материалов II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакторной патологии», Курск, 17-19 мая, 2011, С. 133-134.

19 Цитокины и беременность / Фомина Н.В., Коваленко К.А., Машкина Е.В. // Материалы IV Межд. Научно-практ. конф. «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», Ростов-на-Дону, 2011, С. 75.

20. Урогенитальные инфекции и патология беременности / Коваленко К.А., Машкина Е.В., Рымашевский АН. и др. // Журнал фундаментальной медицины и биологии. — 2012. — №1. — С. 66-70.

21. Полиморфные варианты генов системы детоксикации ксенобиотиков при патологии беременности / Сараев К Н., Машкина Е.В., Шкурат Т.П. // Валеология. 2012. № 2. С. 52-57.

22. Анализ частот алпельных вариантов генов среди жителей Ростова-на-Дону / Микгадова A.B., Коваленко К.А., Машкина Е.В. и др.. // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - № 5; URL: htlp://www.scicnce-education.ru/105-6999 (дата обращения: 14.09.2012).

23. Исследование частоты полиморфных вариантов генов цитокинов в бесплодных супружеских нарах / Е.В. Машкина, Г А. Лаптина, К.А. Коваленко // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - №6; URL.: www.science-education.ru/106-7587.

24. Роль цитокинов в невынашивании беременности / Фомина Н.В., Коваленко К.А., Машкина Е.В. // V Всероссийская конференция с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий»: тезисы докл. - Новосибирск, 2012. — С. 114.

25. Polymorphism of folate cycle and integrins genes and pregnancy loss / Mashkina E„ Kovalenko K„ Fomina N., Shkurat T. // Eur J Human genetics, 2012.

V. 20 Suppl I. P. 138-139.

26. Cytokine gene expression in women with embryo loss / Kovalenko K., Mashkina E„ Pokudina N., Shkurat T. // Eur J Human genetics, 2012. V. 20 Suppl I. P. 140.

27. Polymorphism of cytokine genes and pregnancy loss / Mashkina E„ Fomina N., Kovalenko K. // Genetics and Genomics of global health and sustainabili-ty. 21 Intern Congress of Genetics. 13-18 Apr. 2013. Singapore. Abstract book. P. 161-162.

28. The interactive map of NF-kappaB-dependent inflammatory / Zolotukhin P., Mashkina E., Kovalenko K. // Eur J Human genetics, 2013. V. 21 Suppl 2. P. 551.

29. Repair and cell cycle control systems' genes analysis for miscarriage / Kutsyn K„ Kovalenko K., Mashkina E„ Shkurat T. // Eur J Human genetics, 2013. V. 21 Suppl 2. P. 601.

30. Молекулярно-генетичсский анализ генов цитокиновой системы при невынашивании беременности / Машкина Е.В., Коваленко К.А., Фомина Н.В. // Тезисы докладов конференции ВОГиС «Проблемы генетики и селекции», Новосибирск, 1-7 июля 2013. С. 30.

31. Интерактомно - ориентированное профилирование транскриптома плацент при тяжелом гсстозс / Золотухин П.В., Александрова А.А., Машкина Е.В., Покудина И.О., Родионов А.А., Самсонов А.Е., Шкурат Т.П. // Материалы I Международного Форума «Молекулярная медицина - новая модель здравоохранения XXI века: технологии, экономика, образование». - 2013. - С. 74-75.

32. Прсдиктивныс биомаркеры для оценки риска развития гестоза и формирования феномена крупного плода во время беременности / Машкина Е.В., Александрова А.А., Шестопалов А.В., Рымашевский А.Н., Шкурат Т.П. //Мат. II Конференции участников Российского биомаркерного консорциума "Биомаркеры 2013", Москва, 19 февраля 2013,, С. 15-16.

33. Уровни метилирования генов DKK1. HANDI и MLHI а плацентарных тканях при неблагоприятном течении беременности / Дерсвянчук Е.Г., Александрова А.А., Машкина Е.В., Шкурат Т.П. // Мат. II Конференции участников Российского биомаркерного консорциума "Биомаркеры 2013", Москва, 19 февраля 2013,, С. 25.

34. Ассоциация аллельных вариантов гена PPARGC1B с нарушением формирования репродуктивной функции / Баронян Е.С., Гаркушснко B.C., Машкина Е.В. // Материалы V Мсжд. Научно-практ. конф. «Актуальные про' блемы биологии, нанотехнологий и медицины», Ростов-на-Дону, 2013, С. 220221.

35. Молекулярно-генетичсский анализ полиморфизмов генов системы репарации и контроля клеточного цикла у женщин с невынашиванием беременности / Куцын К.А., Коваленко К.А., Машкина Е.В., Шкурат Т.П. // Современные проблемы науки и образования. - 2013. -№ I; URL: http://www.science-education. ru/107-8357.

36. Полиморфизм генов цитокинов в тканях плаценты при невынашивании беременности / Машкина Е.В., Коваленко К.А., Фомина Н.В., Покудина

И.О. I! Фундаментальные исследования. 2013. №

10-584.

URL: http://rae.ru/fs/?section=content&op=show_article&article_id= 10000204

37. Ассоциация полиморфных вариантов генов фолатпого цикла и ип-тегрипов с невынашиванием беременности Машкина Е.В., Коваленко К.А., Гутпикова Л.В., Дерсвяпчук Е.Г.. Шкурат Т.П. // Медицинская генетика. 2013. № I.C. 40-45.

38. Анализ экспрессии гена IL-10 в децидуальной и хорионической тканях при невынашивании беременности / Машкина Е.В., Коваленко К.А., Миктадова А.В., Волосовцова Г.П., Сараев К.Н. // Современные проблемы пауки и образования. - 2013. - № 5: URL: http://www.science-education.ru/l 11-10208

39. Экспрессия генов системы репарации (APEXI. XPD) и контроля клеточного цикла (СНЕК2, Р53) при патологии беременности / Куцын К.А., Коваленко К.А., Машкина Е.В., Шкурат Т.П. // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - № 6; URL: http://www.science-education.rU/l 13-11592

40. Полиморфизм генов фолатпого цикла и мужское бесплодие / Миктадова А.В., Машкина Е.В.. Волосовцова Г.И., Койгсрова Е.С., Сараев К.Н., Шкурат Т.П. // Валеология. - 2014. - № I. С. 38-44.

41. Ранние эмбриональные потери и полиморфизм генов фолатпого цикла, иптегрипов и цитокипов / Машкина Е.В., Коваленко К.А.. Шкурат Т.П. // Тезисы докладов VI Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Ростов-па-Допу, 15-20 июня 2014 г. С. 98-99.

42. Expression of HIF and VEGF genes and pregnancy loss / Mashkina E.V.. Kovalenko K.A. // Eur. J. Human Genet. 2014. V. 22. Suppl. 1. P. 379.

43. Анализ межгеппых взаимодействий при невынашивании беременности / Коваленко К.А.. Фомина Н.В.. Машкина Е.В. // Сборник трудов IV Мсжд. паучпо-практичсской копф. «Постгспомпыс методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Казань, 19.10 - 1.11 2014. С. 224.

44. Исследование ассоциации полиморфных вариантов генов цитокипов с ранними эмбриональными потерями / Машкина Е.В.. Коваленко К.А.. Фомина Н.В., Шкурат Т.П. // Экологическая генетика. 2014. Т. XII. № 1. С. 1927.

45. Hypoxia-inducible factor IA expression in chorionic tissue and deciduas of women with spontaneous abortion at the first trimester of pregnancy / Mashkina E.V., Kovalenko K.A., Butenko E.V. // Am. J. Biochem. Biotechnol. 2014. 10 (4). 18-23.

2014250602

Подписано n iic'i.iTi. I'M)I ¿01'' i\ Формат 60*84 '/«■ Пет. лип 2,04 Уч.-иэд. лист. I.'»7. Тираж 100 1К). Ялкап N» 420«.

Отпечатано II отделе полиграфической, корпоративной 11 lyill'HIipHOil продукции

Иэд.||сл|,1к0-П0л0|ра,|.....ее кого комплекса КИЬИ МКДИЛ ЦКНТРа 10ФУ

М40Ч0, I I'm-гни-на-Доиу. ор. Стачки. 200/1,тсл. |Н63| ¿47-H0-5I.

2014250602