Молекулярно-генетические механизмы повышенной устойчивости бактерий к потенциально-летальным повреждениям ДНК

Вербенко, Валерий Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические механизмы повышенной устойчивости бактерий к потенциально-летальным повреждениям ДНК
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические механизмы повышенной устойчивости бактерий к потенциально-летальным повреждениям ДНК"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ПОВЫШЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ БАКТЕРИЙ К ПОТЕНЦИАЛЬНО-ЛЕТАЛЬНЫМ ПОВРЕЖДЕНИЯМ ДНК

Специальность: 03.00.15 - генетика

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

На правах рукописи

ВЕРБЕНКО Валерий Николаевич

АВТОРЕФЕРАТ

Санкт-Петербург 2009

□ □34814 <

003481472

Работа выполнена в Отделении молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Михельсон Виктор Михайлович,

доктор биологических наук, профессор Газиев Ажуб Ибрагимович,

доктор биологических наук, профессор Квитко Константин Васильевич,

Ведущее учреждение: ФГУП Государственный научный центр РФ

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов "ГосНииГенетика"

Защита состоится " 2009 г. в часов на заседании

совета Д212.232.12 по заи1ите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9, Санкт-Петербургский государственный университет, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан "_"_ ' 2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д212.232.12 кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Молекулярно-генетические механизмы устойчивости бактериальных клеток к повреждениям ДНК представляют собой несомненный интерес как эволюционно консервативные системы защиты клеток прокариотов и эукариотов. Нерепарированные однонитевые повреждения ДНК вызывают ингибирование и дезинтеграцию репликативных вилок, приводящую к появлению потенциально-летальных двунитевых разрывов (ДР) ДНК. В Escherichia coli дезинтегрированные двунитевые вилки собираются заново благодаря RecBCD-пути рекомбинационной репарации через направляемую гомологией инвазию однонитевой ДНК в интактный сестринский дуплекс. Репарация как прямо индуцированных, так и возникших при дезинтеграции репликативных вилок ДР ДНК в Е. coli возможна прежде всего в реплицированной части хромосомы.

Уровень радиорезистентности бактерий определяется эффективностью репарации ДР ДНК. Репарация двунитевых разрывов у Е. coli идет по механизму гомологичной RecBCD-зависимой рекомбинации. RecBCD-путь репарации двунитевых разрывов за пределами репликативной вилки может рассматриваться как комбинация двух независимых событий репарации, вовлекающих гомологичную хромосому. RecBCD-путь рекомбинационной репарации двунитевых разрывов сопровождается значительной деградацией ДНК и ассоциирован с рестартом репликации. В клетках дикого типа возможна репарация двунитевых разрывов без участия RecBCD-пути. RecF-пути рекомбинационной репарации приписывается роль в заделке брешей, хотя и признается его способность репарировать двунитевые разрывы при выключении RecBCD-пути.

У высокорадиоустойчивой бактерии Deinococcus radiodurans нет экзонуклеазы RecBCD, и репарация двунитевых разрывов идет по RecF-пути рекомбинационной репарации либо по гипотетическому механизму зависимого от протяженного синтеза отжига нитей. Взаимоотношения несомненно главного RecBCD-зависимого пути рекомбинационной репарации ДР ДНК с альтернативными RecF- и RecE-путями репарации в Е. coli еще не выяснены. Механизмы повышенной радиорезистентности снова в центре внимания:

1) высказана гипотеза о зависимом от протяженного синтеза отжига нитей (ESDSA) как способа репарации двунитевых разрывов у высокорадиоустойчивой бактерии D. radiodurans,

2) обнаружено, что белок RecA из D. radiodurans обладает особенными свойствами,

3) показано, что индукция стрессовой системы теплового шока приводит к эффекту термоиндуцированной радиорезистентности в диком типе,

4) продемонстрировано, что в условиях холодового шока повышается дифференциальная скорость синтеза белков RecA и GyrA (субъединица А ДНК-гиразы).

5) изучаются взаимодействия стрессовых систем клетки с системами репарации повреждений ДНК. Белки холодового шока (БХШ) рассматриваются как активаторы транскрипции и РНК-шапероны.

В решении актуальных вопросов могут оказаться полезными исследования мутантов кишечной палочки с повышенной радиационной устойчивостью, в которых может быть усилена функция RecF-пути при сохранении роли RecBCD-пути рекомбинационной репарации.

Моделью для молекулярно-генетического анализа факторов радиорезистентности стал радиоустойчивый мутант Е. coli Gamr444. Радиорезистентность мутанта Gamr444 зависит от гесА+-1ехА+- функций (Бреслер и др., 1984). Штаммы бактерий Gam1 имеют пониженный уровень пострадиационной деградации ДНК (Бреслер и др., 1982). Мутация recF в большей степени снижает радиоустойчивость мутанта Gamr444, чем клеток дикого типа (Бреслер и др., 1984). Повышенный уровень белков теплового шока (БТШ) приводит к эффекту термоиндуцированной радиорезистентности у клеток дикого типа и гроН-гесА-зависимому росту радиоустойчивости у мутанта Gamr444 (Вербенко и др., 1986), при этом гены-регуляторы репарационной системы и белков теплового шока - гесА и гроН, соответственно, в мутантах Gam1 не изменились (Бреслер и др., 1984; Вербенко и др., 1986).

Анализ штаммов Gamr позволил предположить, что усиление радиоустойчивости у мутанта Gamr444 обусловлено мутациями по меньшей мере 3 типов. Одна из них предотвращает избыточную пострадиационную деградацию ДНК, вторая повышает эффективность работы рекомбинационных систем репарации (особенно RecF), и третья повышает уровень белков теплового шока, играющих вспомогательную роль в репарации. Для того, чтобы наиболее полно изучить механизмы высокой устойчивости бактерий к ДНК-повреждающим факторам, необходимо исследовать свойства мутантных локусов, дающих фенотип Gamr.

Процесс деградации поврежденной нити ДНК играет важную роль в рекомбинационной репарации. Защиту от избыточной деградации ДНК, по-видимому, могут осуществлять клеточные белки, аналогичные белкам gam и gp2 фагов X и Т4. Плазмида pGam26, вероятно, несет клонированный мутантный ген, кодирующий клеточный ингибитор деградации ДНК, не совпадающий с белком RecA. Свойства этого продукта кажутся интересными для исследования.

Одним из факторов, лимитирующих репаративный потенциал бактериальных клеток, является сложный, разветвленный процесс рекомбинационной репарации. Существование различных путей рекомбинации (Clark, 1973) может приводить как к кооперативным, так и к конкурентным взаимоотношениям генетических продуктов, использующих один и тот же субстрат. Полученные ранее данные указывают на то, что важной причиной повышения устойчивости клеток Е. coli к летальному действию у-излучения является увеличение эффективности работы SOS-системы и RecF-пути рекомбинационной репарации (Бреслер и др., 1984). Вместе с тем взаимоотношения различных путей рекомбинации при репарации повреждений ДНК остаются невыясненными и требуют дальнейших исследований.

Вклад стрессовых систем клетки в радиорезистентность не вызывает сомнения, однако механизмы усиления экспрессии остаются невыясненными.

Белок RecA оказывает плейотропный эффект и занимает центральное место в индуцибельной репарации. Этот белок, будучи хорошо изученным у Е. coli, продолжает оставаться объектом сравнительного исследования у разных микроорганизмов. С точки зрения эффективной репарации ДНК несомненный интерес представляет RecA-подобный белок у высокорадиоустойчивой бактерии D. radiodurans (Battista et al., 1999, Kim et al., 2002, Narumi et al., 1999). Возможным способом повышения радиоустойчивости выглядит перенос и экспрессия гена гесА из грамположительной бактерии D. radiodurans в клетках Е. coli.

Целью работы являлось исследование молекулярно-генетических механизмов повышенной устойчивости бактериальных клеток к потенциально-летальным повреждениям ДНК - двунитевым разрывам, на примере радиоустойчивых мутантов Е. coli.

В задачи исследования входило: изучение роли различных путей рекомбинационной репарации, и прежде всего генов RecF-пути в повышении радиоустойчивости клеток, клонирование и изучение мутантаых локусов gam, повышающих эффективность репарации; изучение вклада основных белков системы теплового шока в радиоустойчивость, исследование возможности активации RecA-зависимых функций в репарации, изучение роли мажорных белков холодового шока в феномене радиоустойчивости.

Научная новизна исследования состоит в том, что экспериментально установлена ассоциация репарации радиационно-индуцированных повреждений ДНК (включая двунитевые разрывы как основные летальные повреждения) с активностями RecBCD- и RecF-nyxefi рекомбинационной репарации не только в клетках дикого типа, но и в радиоустойчивых мутантах. Есть несколько особенностей репарационных систем в мутантах Gamr: 1) при низких дозах облучения (на уровне D37) штаммы бактерий, имеющие пониженный уровень пострадиационной деградации ДНК, для исправления летальных повреждений не нуждаются в белке PriA и обширном ресинтезе, сопровождающем RecBCD-путь репарации; 2) при более высоких дозах (> 500 Гр) RecBCD-путь репарации становится существенным и у радиорезистентных мутантов; 3) относительный вклад SOS-функций значительно выше в мутантах Gamr по сравнению с диким типом, и объем репарации ДНК и/или ее эффективность значительно выросли; 4) вероятно, эти SOS-функции, крайне важные для репарации у-повреждений, идентичны ферментам RecF-пути рекомбинационной репарации ДНК, о чем говорит перераспределение ролей RecBCD- и RecF-путей в пользу последнего, по крайней мере в диапазоне доз до 1 кГр; 5) мутации recO, recR, recQ, helD и uvrD, затрагивающие альтернативный RecF-путь репарации, гораздо сильнее сенсибилизируют мутант Gamr444, чем штамм дикого типа.

• Понижение уровня экзонуклеазной деградации ДНК в необлученных клетках штамма Gamr444, обнаруженное прямым измерением экзонуклеазной активности фермента RecBCD и косвенным методом оценки выживаемости фагового мутанта Т4 2", согласуется с предположением о

"конститутивном", т. е. присутствующим уже в необлученных клетках, ингибиторе пострадиационной деградации ДНК, который не контролируется репрессором SOS-системы LexA и не совпадает с белком RecA. Свойства плазмиды pGam26, несущей один из клонированных мутантных генов штамма Gamr444, свидетельствуют о том, что этот аллель способен ограничивать экзонуклеазную активность RecBCD в необлученных клетках дикого типа.

• Мутантный локус радиорезистентности gaml8 из штамма Gamr444 Е. coli, клонированный на плазмиде pGaml8, компенсирует мутации в гене uvrD, кодирующем ДНК-геликазу II и относящемся к RecF-пути.

• Белок RecA из высокорадиоустойчивой грамположительной бактерии D. radiodurans не способен компенсировать дефект гена гесА грамотрицательной бактерии Е. coli К-12. Однако после серии последовательных облучений возрастающими дозами гамма-радиации клеток Е. coli, несущих плазмиды с клонированными аллелями гена rech D. radiodurans, получены мутантные аллели гесА-300 и гесЗО-212, комплементирующие делецию гена гесА Е. coli и, по-видимому, кодирующие мутантные белки RecAoa, способные эффективно взаимодействовать с компонентами рекомбинационной репарации Е. coli.

• Доказано существование у радиоустойчивых мутантов Е. coli Gamr смешанного RecBCD-RecFOR-пути рекомбинационной репарации двунитевых разрывов в гомологичных хромосомах, на котором происходит перераспределение ролей RecBCD- и RecF-путей в пользу последнего: ограничение активности экзонуклеазы V на RecBCD-пути сопровождается активацией геликазы на RecF-пути. Гиперпродукция белков теплового шока DnaK, DnaJ, CbpA, GrpE, ClpB и Lon создает благоприятные условия для репарации: ренатурации или гидролиза поврежденных протеинов. Белки холодового шока субсемейства CspA: CspA' и CspG' регулируют экспрессию генов, кодирующих БТШ, и генов SOS-регулона.

Положения, выносимые на защиту:

1. Предполагается существование у радиоустойчивых мутантов Е. coli Gamr смешанного RecBCD- и RecF-зависимого пути рекомбинационной репарации, на котором происходит перераспределение ролей RecBCD- и RecF-путей в пользу последнего: ограничение активности экзонуклеазы V на RecBCD-пути сопровождается активацией геликазы на RecF-пути.

2. Гиперпродукция белков теплового шока DnaK, DnaJ, CbpA, GrpE, ClpB и Lon создает благоприятные условия для репарации: ренатурации или гидролиза поврежденных протеинов. Модифицированные белки CspA' и CspG' системы холодового шока могут повышать устойчивость клеток Е. coli как дикого типа, так и радиоустойчивого мутанта Gamr444 к летальному действию ионизирующей радиации и УФ-света, регулируя экспрессию генов и синтез белков холодового шока, теплового шока и RecA-зависимых функций, в частности белков RecF-пути репарации.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные демонстрируют существование эволюционно-консервативного механизма защиты клеток от опасных повреждений ДНК, включающего координированное действие различных репарационных и стрессовых систем бактериальной клетки. Работа вносит существенный вклад в разработку методов создания рекомбинантных плазмид, повышающих устойчивость клеток к генотоксичным факторам среды. В связи с задачей биологической очистки радиоактивных отходов штаммы микроорганизмов, способные селективно накапливать тяжелые металлы, в том числе и радионуклиды, должны обладать устойчивостью к повышенному радиационному фону. Клонированные мутантные локусы, повышающие эффективность репарации ДНК, дают возможность создания радиоустойчивых форм микроорганизмов для решения задач биоремедиации.

Результаты работы использованы при составлении программы курса "Регуляция транскрипции" и лабораторного практикума по молекулярной биологии для студентов кафедры биофизики Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конференциях: 25th Annual Meeting European Society Radiation Biology, Stockholm, 1993; "Molecular Genetics of Bacteria and Phages" в Колд-Спринг-Харборе (Cold Spring Harbor Laboratory) в 1995 г.; "Molecular Genetics of Bacteria and Phages" в Колд-Спринг-Харборе (Cold Spring Harbor Laboratory) в 1996 г.; на 2 съезде ВОГиС в Санкт-Петербурге в 2000 г., на международной конференции, посвященной 100-летнему юбилею Н.В. Тимофеева-Ресовского "Современные проблемы радиобиологии, радиоэкологии и эволюции" в Дубне в 2000 г., на международной конференции "Проблемы радиационной генетики на рубеже веков" в Москве в 2000 г. и на школе-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология" в Москве - Пущино в 2008 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 38 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключения, выводов и списка цитированной литературы, насчитывающего 501 источник. Работа изложена на 310 страницах, иллюстрированных 81 рисунком и 19 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

Обзор литературы посвящен результатам изучения механизмов генетического контроля процессов репарации опасных повреждений ДНК. Наиболее подробно рассмотрены пути рекомбинационной репарации двунитевых разрывов ДНК. Особое внимание уделено вкладу стрессовых систем в радиорезистентность. Проведен сравнительный анализ свойств высокорадиоустойчивой бактерии D. radiodurans и радиорезистентных мутантов Е. coli Gamr. В выводах по главе 1 сформулированы задачи работы.

Глава 2. Материалы и методы

Штаммы. В работе использованы следующие штаммы бактерий и фагов: I) родительский штамм ABl 157 дикого типа Е. coli К-12 (F" ara¡4 galK2 his-4 proA2 argEÍ thil tsx33 thrl leuó lacYl mtll xyl5 rpsL31 supE37)\ 2) происходящие из ABl 157 радиорезистентные мутанты Gamr 444 и Gamr 445 (Бреслер и др., 1980); 3) штаммы, из коллекции лаборатории; 4) производные штаммы Е. coli, сконструированные в данной работе методами конъюгации и трансдукции фагом PI,

Ппазмиды. Плазмиды, несущие мутантные локусы радиоустойчивости gam, а также компенсирующие температурочувствительность мутантов AdnaK52::cat, dnaJ259, grpE280, groES617 и groEL44, получены методом клонирования in vivo с использованием мини-Ми-вектора MudII4042 (Groisman et al., 1984). Плазмида pGroESL (Тсг) получена от А.И. Грагерова (Москва), pKS5 (Арг гесА+0: ) и pKSrec30 (Арг recA670Dr) от проф. I. Narumi (Япония), pUC19-recAl.l (Apr гес/ГЕс) от проф. В.А. Ланцова(Гатчина).

Для выращивания клеток Е. coli и Salmonella derby применяли АП-бульон - аминопептид. Клетки выращивали при 32° С с аэрацией до концентрации 2-108 клеток в 1 мл, осаждали центрифугированием и ресуспендировали в среде М9. Для выращивания клеток D. radiodurans применяли среду TGY. Твердая среда готовилась добавлением 1,5% агара Difco к среде TGY. Титрование клеток производили на максимальном агаре, содержащем 1,5% агара и 25% аминопептида.

Бактериальные культуры выращивали с антибиотиками в соответствии с генотипом штаммов Е. coli. Антибиотики добавляли в следующих концентрациях (мкг/мл): ампицилин (Ар) - 50, канамицин (Km) - 40, тетрациклин - 30, хлорамфеникол (Сш) - 25.

Методы. В работе были использованы традиционные методы генетики бактерий и ряд молекулярно-биологических методик.

Трансдукция и конъюгация. Перенос мутаций из донорных штаммов в реципиенты ABl 157 и Gamr производили с помощью трансдукции фагом PI vir и методом конъюгации по модификации известных методик (Маниатис и др., 1984; Миллер, 1976).

Клонирование локусов Garn. Метод клонирования in vivo основан на транслокации ДНК из хромосомы на плазмидный вектор с помощью транспозонного фага Mu (Groisman et al., 1984) в виде его варианта мини-MudII4042, содержащегося на многокопийной плазмиде рВС4042 с репликоном гер15А, Случайные библиотеки генов штамма Gam'444 на плазмидном векторе обогащались рекомбинантными клонами, несущими клонированные мутантные аллели Gamr двумя способами: выделением радиорезистентных клонов клеток с помощью повторяющихся циклов у-облучения-подращивания (Бреслер и др., 1980; Erdman et al., 1961) и разработанным методом для селекции рекомбинантных "доминантных" плазмид.

Изучение зависимости выживаемости клеток от дозы у- и УФ-излучения. Облучение клеток в экспоненциальной фазе роста производили в среде М9 при 4° в ледяной бане на установке "Исследователь" у-лучами 60Со при мощности дозы 13-70 Гр/мин или при комнатной температуре в тонком

слое в чашке Петри УФ-светом на установке "Хромотоскоп" при мощности дозы 670 мДж/м Je в диапазоне 200-315 нм. Облученные клетки после разбавления в среде М9 рассевали на АП-агар и подсчитывали число колоний через 24^18 часов.

Определение экзонуклеазной активности. Из неочищенного лизата клеток выделяли фракцию, содержащую фермент RecBCD, с помощью гель-фильтрации на колонке из сефакрила S-200 ("Pharmacia"). Инкубацию 3Н-дНТФ с различными клеточными фракциями проводили в 50 мМ трис-буфере, pH 7,0, содержащем 5 мМ MgCl2, 5 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мМ АТФ, и измеряли переход метки 3Н в кислоторастворимую фракцию (Belyakova et al., 1993).

Определение относительной эффективности посева мутантного фага Т4 2~ проводили согласно (Rinken et al., 1992).

Определение частоты замещения хромосомного аплеля аллелем из плазмиды при участии транедуцирующих фагов X из библиотеки Кох ары (Kohara et ai, 1987) проводили по методу (Kulakauskas et ai, 1991).

Молекулярно-биологические методы. В ходе выполнения работы были использованы стандартные методы - трансформация бактерий, выделение плазмидной ДНК (Маниатис и др., 1984), электрофоретическое разделение плазмидной ДНК и белков (Маниатис и др., 1984; Laemmli and Favre, 1973), введение радиоактивной метки в белки и клеточную ДНК (Вербенко и др., 1986; Бреслер и др., 1982), полимеразная цепная реакция с праймерами производства "Синтол" (Москва) на ДНК-амплификаторе "Eppendorf MasterCycler Personal", гибридизация ДНК рекомбинантной плазмиды с хромосомной библиотекой Е. coli на мембране Escherichia coli Gene Mapping Membrane производства "Takara Shuzo Co" (Япония), секвенирование ДНК на секвенаторе ABI Prizm 370 в фирме "Хеликс" (Санкт-Петербург). Анализ секвенированных последовательностей проводили с помощью программы BLASTN Национального центра биотехнологической информации (США). Поиск потенциальных сайтов связывания белка-регулятора холодового шока CspA в геноме Е. coli проводили с помощью программы Search, написанной Н.В. Клоповым в ПИЯФ РАН.

Математическая обработка результатов опытов. Все дозовые кривые о зависимости выживаемости клеток (S) от дозы уизлУчения (D) воспроизводили в трех - четырех независимых опытах и строили дозовые кривые выживаемости lgS = А + BD методом наименьших квадратов, рассчитывая параметры А и В.

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Конститутивные н индуцибельные пути репарации и радиоустойчивость

Роль RecBCD-nymu рекомбииационной репарации, сопряженной с репликацией, е радиоустойчивости мутантов Gam' Е. coli. Согласно предложенной Когомой модели рекомбинации ДНК, зависящей от репликации, белок PriA участвует в сопряженном с обширной деградацией ДНК RecBCD-пути репарации двунитевых разрывов ДНК на стадии сборки праймосом в

D-петлях (промежуточных продуктах обмена нитей на концах двунитевого разрыва) для последующего переключения к индуцированному ресинтезу ДНК.

Фактор изменения дозы (ФИД) для исходных вариантов priA+ мутантов Gamr по сравнению с штаммом ABl 157 дикого типа, рассчитанный как отношение параметров В (углов наклона линейных участков дозовых кривых), равен 2,15±0,2 для Gamr445 и 3,2±0,4 для Gamr444. Дозовые кривые выживаемости подтверждают вывод о радиосенсибилизирующем действии мутации priA2::kan на все 3 родительских штамма (рис. 1). Это означает, что в радиорезистентных мутантах Gamr путь репарации летальных повреждений, в котором участвует белок PriA, играет не менее существенную роль в выживаемости, чем у клеток дикого типа. Это согласуется с сильным влиянием мутации recB21 на радиоустойчивость мутантов Gamr, указывающим на значительный вклад RecBCD-пути в репарацию ДР у этих мутантов (Бреслер и др., 1984). Однако если сравнивать параметры В для штаммов ABl 157 и Gamr на генетическом фоне рпА', то ФИД мутантов Gamr444 и Gamr445 по отношению к ABl 157 по-прежнему остается достаточно высоким: он равен 2,4+0,2 для первого и 2,5±0,4 для второго из радиорезистентных мутантов. Это указывает на существование у мутантов Gamr альтернативной системы репарации, не зависящей от белка PriA и, по-видимому, работающей без обширного ресинтеза ДНК. Этой альтернативной системой может являться RecF-путь рекомбинационной репарации.

Рис. 1. Влияние мутации priA2v.kan на радиорезистентность клеток Е. coli.

1 - (о) АВ1157рпЛ+,

2 - (•) AB 1157 priA2::kan,

3 - (□) Gamr444 priA+,

4 - (■) Gamr444 priA2\\kan,

5 - (Д) Gamr445 priA\

6 -(A) Gamr445 priAv.kan.

o.o

0 5

1.0

1.5

2.0

По оси абцисс - доза (кГр), по оси ординат - выживаемость (IgS)

Роль генов RecF-nymu в радиационной устойчивости Е. coli. В данном исследовании была экспериментально изучена роль ряда генов, потенциально важных для RecF-пути рекомбинационной репарации в мутантах Gamr: гесА, recR, recO, recQ, uvrD, helD и recJ (табл. 1). Наиболее драматический эффект вызывает мутация гесА/З в гене, кодирующем ключевой белок SOS-системы репарации и всех ветвей гомологичной рекомбинации: проявление фенотипа Gamr практически исчезает. Изучаемые гены могут быть разделены на два класса: 1) recR и recQ вносят более важный вклад в выживаемость после у-облучения на фоне Gamr444, а не на фоне клеток дикого типа в интервале умеренных доз (при D37); recO и helD существенны для радиоустойчивого мутанта на экспоненциальном участке кривых выживаемости, а uvrD (SOS-регулон и RecF-путь) важен для репарации у-индуцированных повреждений в клетках Gam'444 во всем интервале доз. RecBCD-путь репарации одинаково важен и почти абсолютно необходим как для дикого типа, так и для мутанта Gamr444, так как выключение экзонуклеазы RecJ, замещающей RecBCD в мутантах recBC sbcB с активированным RecF-путвм, не сильно влияет на штамм Gamr444.

Таблица 1

Влияние мутаций в генах RecF-зависимой рекомбинационной репарации на

радиочувствительность клеток Е. coli

Штамм А В(кГр-') ХЛМГр) Оо(Гр) ФИД37 ФИДо

АВН57 0,121 -2,954 180±10 119±7

Gam'444 0,788 -0,745 1500±100 490±37 0,151 *

ABl 157 recA13 0,311 -25,601 25±1 18±1 0,139

Gam'444 recAI3 0 -19,797 25±1 I5±l 0,017 0,031

AB 1157 recR252: :Tn 10 0,16 -8,875 67±10 44 ±3 0,372 0,370

Gam'444 recR252::TnlO -0,684 -2,489 170±15 159±14 0,113 0,324

ABl 157 rec01541::7nS -0,331 -2,333 92±11 155±20* 0,511 1,303

Gam'444 recOl54/::Tn5 0,412 -1,633 590±5 253±14 0,393 0,516

ABl 157 recQ-.-.Tnl 0,501 -7,285 240±10 39±7 1,333 0,327

Gam'444 recQwTn3 -0,131 -1,342 480±30 200±12 0,320 0,408

ABl 157 uvrD254::Tn5 -0,330 -2,570 110±6 155±8* 0,611 1,303

Gam'444 uvrD254::Tn5 0,412 -1,633 260±8 300±10 0,173 0,612

ABl 157 heID1021:Jn\0-9 -0,115 -2,635 103±4 146±5* 0,572 1,227

Gam'444 helDl 021::Ш0-9 0,202 -1,353 605±40 243±17 0,403 0,496

ABl 157 recJ284::Tn5 -0,017 -5,809 120±6 90±7 0,667 0,756

Gam'444 recJ284::7n5 0,139 -0,923 890±27 370±11 0,593 0,755

* кривая выживаемости IgS = f(D) L-образная.

3.2. Мутантные аллели радиорезистентности из штамма Е. coli Gamr444: клонирование и характеристика

Свойства клонированной рецессивной мутации gaml2. Плазмида pGaml2 несет рецессивную мутацию Gamr {garni2) штамма Gamr444. Один из радиоустойчивых клонов (штамм Gaml2-20y) по уровню радиорезистентности вдвое превосходит штамм ABl 157. Мутация gam 12 влияет на экспрессию белков теплового шока, что доказано экспрессией гена ß-галактозидазы lacZ под контролем промотора гена теплового шока htpG.

Свойства клонированных доминантных аллелей gant. В четырех независимых сериях опытов были выделены 4 плазмиды (pGaml8, pGam26, pGam43 и pGam55), которые стабильно передают промежуточный уровень радиорезистентности первичным трансформантам Сшг реципиента AB 1157 (Mu). Эффект "доминантных" плазмид pGamr является г ее А- и гроН-зависимым: плазмиды pGaml8 и pGam55 несколько сенсибилизируют штамм гесА13, в то же время плазмиды pGam26 и pGam55 сохраняют некоторый радиопротекторный эффект (с ФИД = 1,5 - 2,0) и способны предотвращать пострадиационную деградацию ДНК крайне радиочувствительного мутанта АВ2463 (гесА'). Следовательно, как и в случае родительского штамма Gamr444, эффект клонированных доминантных мутаций gam зависит от функционирования регулонов SOS и БТШ.

3.3. Конститутивное ингибирование деградации ДНК, вызванной ферментом RecBCD, в мутанте Gamr444 Е. coli

Чтобы доказать существование конститутивного (синтезирующегося независимо от облучения клеток) ингибитора экзонуклеазной деградации ДНК в клетках Gam'444 и проверить гипотезу, согласно которой этот ингибитор кодируется клонированным мутантным аллелем gam26, мы сравнили АТФ-зависимую экзонуклеазную активность в необлученных клетках Gamr444 и родительского штамма AB 1157 и деградацию экзогенной линейной ДНК фага Т4 в этих штаммах и в клетках дикого типа, несущих некоторые плазмиды с клонированными мутантными аллелями штамма Gamr444.

АТФ-зависимая деградация ДНК в клеточной фракции штамма Gam'444, содержащей экзонуклеазу V. После выделения методом гель-фильтрации на колонке из сефакрила S-200 фракции, содержащей белок RecBCD, АТФ-зависимая экзонуклеазная активность по отношению к двунитевой ДНК у мутанта Gamr444 понижена по сравнению с диким типом столь же сильно, как и у мутанта гесБС, дефектного по ферменту RecBCD (рис. 2). Объяснение этих данных может состоять в том, что штамм Gamr444 имеет мутацию в локусе recBCD, понижающую экзонуклеазную активность RecBCD. В качестве контроля была использована транедукция реципиента Gamr444 фагом PI, размноженным на клетках дикого типа с транспозонной вставкой argA::TnlO в соседнем с recD гене (Schulz et al., 1983). Из 30 транедуктантов Тсг штамма Gamr444, наследовавших вставку argAv.TnlO, ни один не отличался от Gamr444 в спот-тесте на радиорезистентность. Таким образом, штамм Gamr444 не имеет мутаций в локусе recBCD, повышающих радиоустойчивость и влияющих непосредственно на белок RecBCD.

Эти данные позволяют предположить, что у мутанта Сашг444 даже в отсутствие облучения клеток имеется фактор, понижающий экзонуклеазную активность фермента ЯесВСО, и что этот ингибитор прочно ассоциирован с комплексом ЯесВСО и не отделяется от экзонуклеазы V при гель-фильтрации.

Рис. 2. АТФ-зависимая экзонуклеазная активность в активной фракции по отношению к двунитевой рН]ДНК. 1 - АВ1157, 2 - SK508 гесВС, 3 - Gamr444.

По оси абсцисс - объем активной фракции в реакционной смеси, мкл; по оси ординат -экзонуклеазная активность,

распад/минхЮ3

Оценка экзонуклеазной активности RecBCD с помощью фага Т4 -27 Альтернативный, более простой метод изучения экзонуклеазной активности фермента RecBCD состоит в измерении эффективности посева фагов мутанта Т4 2' с амбер-мутацией в гене белка 2, связывающегося с концами линейной двунитевой ДНК фага Т4 и защищающего ее от деградации (Silverstein and Goldberg, 1916). Результаты определения относительной эффективности посева мутантного фага Т4 2" на разных штаммах Е. coli представлены в табл. 2. На газоне необлученных клеток мутанта Gamr444 эффективность посева Т4 2" в 400 раз выше, чем на газоне родительского штамма ABl 157 дикого типа, и лишь в 2 раза ниже, чем на газоне мутанта гесВ21, дефектного по экзонуклеазе V. Наиболее интересны данные, полученные с плазмидой pGam26, несущей клонированный аллель радиорезистентности gam26 мутанта Gamr444. Эта плазмида в клетках ABl 157 дикого типа обеспечивает такую же высокую эффективность посева Т4 2', как и в бесплазмидном мутанте гесВ21, т. е. вызывает не зависящее от облучения клеток выключение экзонуклеазной активности RecBCD. Это согласуется с предположением, что клонированный мутантный аллель gam26 кодирует конститутивный ингибитор деградации ДНК. В качестве контроля использовали плазмиды pGaml2 и pGaml8. Первая из них, несущая мутацию, приводящую к конститутивной экспрессии белков теплового шока, не влияет на эффективность посева фага Т4 27 Вторая плазмида, несущая клонированный мутантный аллель повышенной

радиоустойчивости мутанта Gamr444 gaml8, вызывает небольшое, но достоверное уменьшение эффективности посева Т4 2~ по сравнению с бесплазмидным штаммом ABl 157, которое устраняется мутацией-вставкой мини-TnlO-Kan, инактивирующей аллель garni8. Можно предположить, что некоторое снижение эффективности посева на хозяине Gamr444 по сравнению с ABl 157/pGam26 обусловлено мутантным аллелем gaml8, вероятно,влияющим на геликазную активность.

Таблица 2

Эффективность посева фага Т4 2" на штаммах Е. coli_

Штамм Генотип Относительная эффективность посева

WA235 recA56 recB21 sup+ 1

WA237 recB* sup* 0,000065

ABl 157 recB* supE37 0,0011

Gamr444 gaml2 gaml8 gam26 0,489

ABH57(Mucir)/pGaml2 recB* gam 12 0,00152

AB1157(Mu cü)/pGaml8 recB* gaml8 0,00041

ABl 157(Mu cü)/pGaml8::Kan recB* gaml8\:kan 0,00670

AB 1157(Mu cü)/pGam26 recB+ gam26 0,910

3.4. Свойства мутантного аллеля gaml8

Эффект плазмиды pGaml8 на фоне дикого типа целиком устраняется мутацией в гене гесВ одной из субъединиц фермента RecBCD, играющего ключевую роль в RecBCD-пути гомологической рекомбинации, и не проявляется на RecE-пути рекомбинационной репарации в мутанте recBC sbcA. Однако значительный радиозащитный эффект плазмиды, примерно такой же как в случае клеток дикого типа, наблюдается на генетическом фоне recBC sbcB~, т. е. в условиях работы RecF-пути рекомбинационной репарации, и полностью устраняется на этом фоне мутацией recF. Более того, плазмида pGaml8 вызывает достоверное повышение радиочувствительности мутанта recBC sbcB recF. Этот радиосенсибилизирующий эффект плазмиды выражен еще более сильно в случае дефектного по RecF-пути мутанта recBC sbcB recJ. Плазмида pGaml8 не оказывает защитного действия на одиночные мутанты recF, гесО и recR, а также recN и recQ, у которых также может быть затронут RecF-путь рекомбинации-репарации при сохранении альтернативного пути RecBC. Она не повышает выживаемость у-облученных клеток мутанта recBC sbcB ruvB, дефектного по миграции ветвей холидеевских стыков.

Компенсация дефекта гена uvrD, кодирующего ДНК-геликазу II, мутантным аллелем gaml8. Среди всех испытанных мутантов Е. coli, у которых выведен из строя RecF-путь, убедительный защитный эффект плазмиды pGaml8 наблюдался только на трех аллельных мутантах по гену uvrD, кодирующему ДНК-геликазу II (Riebet et al., 1983) (рис. 3). Он проявляется как на фоне гесВ+, так и на фоне recBC sbcBT, где достигает максимального значения. Таким образом, продукт мутантного аллеля gaml8

работает на RecF-пути рекомбинационной репарации и эффективно компенсирует дефекты мутантов uvrD по ДНК-геликазе II.

Рис. 3. Летальное действие у-лучей на лизогенные по Ми штаммы Е. coli К-12. 1, 2 - uvrD210, 3, 4 - uvrD152, 5, 6 -recB21C22 sbcB uvrD502, где 1, 3, 5 -бесплазмидные штаммы, 2, 4, 6 - штаммы, несущие плазмиду pGaml8.

По оси абсцисс - доза (кГр), по оси ординат - выживаемость (igS)

Чтобы проверить, не несет ли плазмида pGaml8 ген какой-либо из известных ДНК-геликаз, мы применили метод замещения хромосомного аллеля аллелем, клонированным на плазмиде (Kulakauskas et al, 1991), с помощью фагов X библиотеки Кохары (Kohara et al., 1987), используя в качестве донора при трансдукции штамм с плазмидой pGaml8::Kan, у которой локус gaml8 помечен вставкой транспозона мини-TnlO-Kan. На этом штамме были размножены те клоны фагов X из библиотеки Кохары, которые содержат гены известных ДНК-геликаз. Наибольшая частота переноса аллеля gaml8:\kan из плазмиды pGaml8::Kan в хромосому наблюдалась с фагом X, несущим ген uvrD, и в меньшей степени с фагами, несущими гены rep илиpriA.

3.5. Природная плазмида pSD89 (Cmr) из Salmonella derby К89, повышающая радиоустойчивость штаммов Е. coli К-12

Штамм Е. coli ZS05 (r'm+) был использован как промежуточный хозяин плазмиды pSD89 (Сшг) из 5. derby К89, чтобы избежать ее рестрикционной деградации при трансформации клеток Е. coli. Этот штамм после трансформации к хлорамфениколустойчивости проверялся на приобретение неселектируемого маркера радиоустойчивости и оказался более устойчивым к у-лучам (ФИД = 2,5 при S = 10'3) по сравнению с реципиентом.

Указание на повышение ДНК-полимеразной активности в S. derby К89 по сравнению с S. derby К82 (Саркисян и др., 1985) определило выбор мутанта Е. coli по ДНК-полимеразе I как объекта для трансформации плазмидой

pSD89 (Cmr). Трансформированные ею клетки polA6 приобретают более высокую устойчивость к летальному действию ультрафиолетового света, но компенсация дефекта по репарации является неполной. Более высокая защитная эффективность плазмиды в области малых доз проявляется в сигмоидальном характере кривых выживаемости. Плазмида pSD89 (Cmr) подобным же образом компенсирует дефект, вызванный мутацией гесА13. Плазмида не оказывает влияния на чувствительность к ультрафиолетовому свету мутанта uvrA и, что особенно показательно, мутанта итиС. Изучение летального действия у-лучей подтверждает, что плазмида pSD89 (Cmr) в значительной мере компенсирует дефекты по репарации, вызванные мутациями в генах polA и г ее А, хотя плечо на кривых выживаемости выражено в меньшей степени, чем при облучении УФ-светом. В то же время на радиочувствительность клеток дикого типа эта плазмида оказывает лишь небольшое влияние.

Компенсация дефекта в гене polA плазмидой pSD89 (Cmr) была проверена по восстановлению способности плазмиды pBR322, имеющей polA-зависимый репликон, размножаться при непермиссивной температуре в клетках температурочувствительного по ДНК-полимеразе I штамма polA12 (ts), трансформированного плазмидой pSD89 (Cmr). Эффективность посева на агар с тетрациклином при 43°С •клеток polA12 (ts)/pBR322 (Тсг Apr)/pSD89 (Сшг) составила « 100% по сравнению с 32°С, тогда как эффективность посева ро1А12 (ts)/pBR322 при 43°С равнялась нулю. Этот результат позволяет предположить, что природная плазмида pSD89 (Cmr) несет гомолог гена polA.

3.6. Влияние мутаций в структурных генах, кодирующих белки теплового шока, на радиорезистентность штаммов Е. coli

Систематические исследования влияния мутаций в структурных генах, кодирующих главные БТШ на радиочувствительность Е. coli, до сих пор не проводились. Мы изучили влияние мутаций в генах, кодирующих семь главных БТШ: dnaK, dnaJ, cbpA, grpE, groES, groEL и clpB на чувствительность клеток E. coli с нормальным репаративным генотипом и радиорезистентных мутантов Gamr с целью установить роль индивидуальных БТШ в природной и термоиндуцированной радиорезистентности и повышенной радиоустойчивости штаммов Gamr.

Как и в случае клеток с нормальным репаративным генотипом, наиболее сильное влияние на радиорезистентность мутантов Garn' оказывает мутация ДdnaK52. При введении ее в геном наиболее резистентного мутанта Gamr444 повышенная радиоустойчивость полностью устраняется (рис. 4)

Мутация dnaJ259, вызывающая заметный радиозащитный эффект на генетическом фоне дикого типа, приводит к почти полному исчезновению повышенной радиоустойчивости штамма Gamr444. Мутация в гене-гомологе cbpA вызывала радиосенсибилизацию штамма Gam'444, но не дикого типа. В гораздо меньшей степени выражена радиосенсибилизация штамма Gamr444, вызванная дополнительными мутациями groES617, groEL44 и grpE280: соответствующие варианты в 1,5-2 раза более у-чувствительны по сравнению с Gamr444. Дополнительная мутация в субъединице АТФ-зависимой протеазы clpB радиосенсибилизировала штамм Gamr444, но не дикий тип.

Рис. 4. Летальное действие у-лучей на штаммы Е. coli Gamr444 с дополнительными мутациями в генах, кодирующих БТШ.

1 - Gamr444, 2 - Gamr444 grpE280, 3 -Gam'444 dnaJ259, 4 - Gam'444 5 - Gamr444 clpB, 6 - Gamr444 AdnaK52::Cm\ 7- контроль ABl 157.

По оси абсцисс - доза у-лучей (кГр), по оси ординат - логарифм выживаемости (IgS)

3.7. Рост радиоустойчивостн бактериофагов как результат усиления экспрессии стрессовых систем клетки-хозяина

Для анализа конкретных молекулярных механизмов, приводящих к повышению радиоустойчивости мутантов Gam', были использованы в качестве "зондов" бактериофаги, инактивированные у-лучами и УФ-светом. Известно, что реактивация клеткой-хозяином УФ-облученного фага X сильно зависит от uvr-системы эксцизионной репарации, в меньшей степени от ДНК-полимеразы I и почти не зависит от Ree-функций клетки. В случае фага X, инактивированного у-лучами, в реактивации принимают участие продукты генов polA и lig. Вирулентный фаг Т4 почти не чувствителен к реактивации клеткой-хозяином, хотя в его реактивации принимает участие клеточная ДНК-полимераза I. Установлено, что продукты генов теплового шока groES и groEL необходимы для мутагенной umuDC-зависимой ветви репарации УФ-повреждений. Мутации в этом опероне блокируют W-реактивацию УФ-облученного фага S13. Потребность в этих белках приписывается их участию в поддержании стабильности белка UmuC. Считается, однако, что другие БТШ, за исключением Lon, не влияют на УФ-резистентность клеток Е. coli. Можно ожидать, что при повышении активности стрессовых систем клетки увеличивается эффективность репарации УФ- или у-облученных фагов.

Денситометрия радиоавтографов электрофореграмм показала усиление экспрессии стрессовых систем в мутантах Gam'. Наиболее существенным отличием экспоненциально растущих при 32°С клеток мутантов Gamr от клеток дикого типа является наличие заметных пиков белков с кажущимися молекулярными массами 94, 84, 70, 69, 60 кД. Они были идентифицированы как белки теплового шока Lon, ClpB, HtpG, DnaK, LysU, так как синтез именно этой группы белков усиливается при переносе клеток ABl 157 на 43°С и блокируется мутацией в гене-регуляторе гроН. Другое отличие мутантов Gamr от дикого типа заключается в быстрой кинетике синтеза и элиминации белка с

массой 40 кД после у-облучения клеток. Этот пик не индуцируется в мутанте гесА~ и идентифицируется как белок RecA, играющий ключевую роль в дерепрессии SOS-регулона. В присутствии 358-метионина сразу после облучения наблюдается усиление по сравнению с необлученным контролем полосы с мол. массой 40 кД только у радиоустойчивых мутантов. После 30 мин пострадиационной инкубации импульсное мечение показывает усиление синтеза этого белка у дикого типа, продолжение синтеза у наименее радиоустойчивого штамма Gamr445 и исчезновение этой полосы у гиперрезистентного мутанта Gam'444. Таким образом, усиление синтеза белка RecA и его элиминация отражают степень радиоустойчивости штаммов Е. coli.

Мы проверили, как повышенная эффективность индукции белка RecA влияет на W-реактивацию фагов, инактивированных во внеклеточном состоянии при у-облучении клеток Gamr. Зависимость коэффициента W-реактивации (к) от дозы лучей, которой были облучены клетки 3-х штаммов Е. coli, представлена на рисунке 5. Следует отметить следующие обстоятельства: максимальное значение к для штамма ABl 157 приходится на дозу 400 Гр и достигает 2, а у мутантов Gamr максимум достигает 2,7 для фага 080 vir и 3 для фага X cl и находится в области больших доз (900-1200 Гр). Обращает на себя внимание то, что у мутантов Gamr более сильная, чем в диком типе, W-реактивация регистрируется в широком интервале доз от 300 до 2000 Гр. Таким образом, можно сделать вывод, что радиоустойчивые мутанты обладают более эффективной системой SOS-репарации у-облученных фагов по сравнению с родительским штаммом.

Рис. 5. Зависимость коэффициента W-реактивации у-облученных фагов от дозы у-лучей, которой были облучены, клетки.

Фаг X: 1 - АВ1157, 2 - Gamr445; фаг 080: 3 - АВ1157, 4 - Gamr444, 5 -Gamr445.

По оси абсцисс - коэффициент W-реактивации (к), по оси ординат -доза у-лучей (кГр)

3.8. Радноустойчивость штаммов Е. coli г ее А' с клонированными мутантными аллелями гена recA Е. coli и D. radiodurans

Для клонирования мутации в гене recA, дающей фенотип recAHcr (High capacity of reactivation), мы использовали метод обогащения радиоустойчивыми клонами популяции клеток Е. coli ЛгесА, трансформированных плазмидой pUC19-recA+, несущей ген гесА+. После 12 циклов у-облучения, подращивания,

выделения плазмиды и трансформации был выделен вариант плазмиды pUC19-recAHcr с большим радиопротекторным эффектом по сравнению с исходной плазмидой pUC19-recA+.

Сравнение наклонов (-В) кривых выживаемости IgS = f(D) для штаммов Z905 ArecA/pUCl9-recAHa и Z905 ArecA/pUC19-recA+ позволило определить фактор изменения дозы, характеризующий эффективность радиозащитного действия плазмиды pUC19-recAHcr (табл. 3). На генетическом фоне штамма Z905 ДгесА эта плазмида не только полностью компенсирует делению гена /■есА, но и дает дополнительный радиозащитный эффект, будучи в 1,8 раза более эффективной, чем исходная плазмида pUC19-recA+.

Плазмида pUC19-recAHcr передана также в мутант Е. coli ABl 157 lex A3 recAA21, дефектный по индукции SOS-системы репарации. Все трансформанты Арг в спот-тесте мало отличались по радиоустойчивости от бесплазмидного 1ехАЗ гесАА21. Это подтвердилось и при количественном анализе дозовых кривых выживаемости. В штамме АВ1157 1ехАЗ гесАЬ21 плазмида pUC19-recAHcr вызывала радиозащитный эффект с фактором изменения дозы ~ 1,9 по отношению к бесплазмидному реципиенту при выживаемости 37%, в то время как на фоне ДгесА этот эффект был равен ~ 15,7.

Плазмида pUCI9-recAHcr по сравнению с pUC19-recA+ эффективнее восстанавливала устойчивость к УФ-свету мутанта Z905 ДгесА. Однако мутация 1ехАЗ практически нивелировала различие в действии плазмид. Фактор изменения дозы при выживаемости 37% составлял s 1,4, что в 10 раз меньше, чем при у-облучении трансформанта Z905 Arec/1/pUC 19-гесАНсг.

Таблица 3

Сравнение радиозащитных свойств плазмид, повышающих _радиорезистентность Е. coli ______

Штамм -В ФИД

у-излучение (кГр'1)

ABl 157 2,730±0,106

Z905 ДгесА 27,820+2,075 0,098

Z905 ЛгесА/pUC 19-гесА+ 3,205±0,093 0,851

Z905 ArecA/pUC 19-гесАн" 1,767+0,056 1,545

/ехАЗ гесАА21 18,147±0,109 0,150

lex A3 recAA2H pUC19-recA+ 15,687+0,377 0,174

кхАЗ гесАA2//pUC19-recAHcr 14,920+1,780 0,183

УФ-свет (с'1)

ABl 157 0,006+0,001

Z905 ДгесА 0,072+0,007 0,085

Z905 Arec/4/pUC19-recA+ 0,009±0,001 0,675

Z905 ДтгЛ/pUC 19-гесАНсг 0,005±0,001 1,158

1ехАЗ гесАА21 0,084+0,004 0,073

¡ехАЗ rec/f Д2//р1ГС19-гесА+ 0,056+0,003 0,110

кхАЗ гесАÄ2//pUC19-recAHcr 0,059+0,003 0,104

Штж •

Электрофоретическое исследование лизатов клеток штамма ¿905 АгесЛ, несущего плазмиды риС19-гесАНсг и риС19-гесА+, показало увеличение содержания белка ЯесА+ в штамме, несущем плазмиду риС19-гесАНсг (рис. 6).

Рис. 6. Электрофоретическое распределение в ПААГ белков из лизатов штаммов Z905 Д recA (1), Z905

Д/-еЫ/риС19-гесА белок RecA (4)

(2), Z905 Area4)/pUC 19-recA (3),

Секвенирование плазмид pUC19-recAHcr и pUC19-recA+c универсальными праймерами к вектору pUC19 установило идентичность структурной части гена recA и полное соответствие последовательности, представленной в Национальном центре биотехнологической информации США. Вместе с тем была обнаружена трансверсия А:Т -> Т:А в 20-м положении SOS-блока гена recA^ Е. coli (рис. 7). Такая мутация нарушает комплементарность палиндрома, образующего SOS-блок. По этой причине мутант гесАНсг был переименован как оператор-конститутивный мутант гесАо0, а мутация соответственно обозначена как гесАоЮ.

ргесАЯог tagccatttt tactcctgtc atgccgggta ataccggata gtcaatatgt precA+ tagccatttt tactcctgtc atgccgggta ataccggata gtcaatatgt recA+ TAGCCATTTT TACTCCTGTC ATGCCGGGTA ATACCGGATA GTCAATATGT

+1 -10 -35

_SOS box_J

precAHcr tctgttgaag caattaAact gtatgctcat acagtatcaa gtgttttgta precA+ tctgttgaag caattatact gtatgctcat acagtatcaa gtgttttgta reaA* TCTGTTGAAG CAATTATACT GTATGCTCAT ACAGTATCAA GTGTTTTGTA

Рис. 7. Нуклеотидная последовательность регуляторного района гена recA. Последовательности получены при использовании универсальных секвенирующих праймеров для pUC19 и плазмид pUC19-recA сг и pUC19-гесА+. Приведена также последовательность гена гесА+ по данным НЦБИ, Подчеркнут стартовый кодон. Прописным шрифтом выделена трансверсия А:Т -» Т:А в конце SOS-блока.

Исследование свойств гена recA D. radiodurans в клетках Е. coli. При введении плазмиды pKS5 с клонированным геном recA+ D. radiodurans и pKSrec30 с мутантным геном гесА670 в клетки Е. coli АгесА с полной делецией собственного гена гесА все полученные трансформанты Арг не отличались в спот-тесте по радиорезистентности друг от друга и от штамма-реципиента. Радиозащитный эффект плазмид с геном recA D. radiodurans не превышал 1,25 как при экспрессии с собственного промотора, так и с промотора ластозного оперона pUV5 после индукции IPTG в клетках точечного мутанта гесА56 и отсутствовал в мутанте ssb-I (табл. 4). В качестве контроля была использована плазмида pUC19-recl.l с геном recA+ Е. coli. На генетическом фоне штамма Z905 А гесА эта плазмида вызывает достоверный радиозащитный эффект, равный 8,17, практически восстанавливая радиоустойчивость до уровня штамма дикого типа ABl 157 гесА*.

Обработка трансформантов Z905 Areo4/pKS5 и Z905 Arec/l/pKSrec30 с помощью индуктора лактозного оперона IPTG значительно усиливала экспрессию белка RecA по сравнению с базальным уровнем.

Таблица 4

Сравнение радиозащитных свойств плазмид с различными аллелями гена гесА в клетках Е. coli

Штамм -B (кГр"') ФИД

AB 1157 3,058+0,087

Z905 АгесА 27,820±1,797 0,110

Z905 ArecA/pKSrecJO 24,771±0,512 0,123

Z905 ДгесЛ/рКЭгесЗО + IPTG 28,351+0,749 0,109

Z905 ArecAIpKSS 23,714±1,120 0,129

Z905 АгесА/pKS5 + IPTG 22,310±0,964 0,137

Z905 ДгесЛ/pUC 19-recA 1.1 3,401+0,051 0,899

recA56 39,514+1,210 0,077

rec/iJd/pKSrec30 30,286+0,659 0,010

recA J6/pKSrec30 + IPTG 31,371+0,732 0,097

rec^56/pKS5 30,929±1,402 0,099

recA Jö/pKS5 + IPTG 26,700+1,389 0,115

ssb-l 4,912+0,183 0,623

1 ssb-l/pKSrec30 6,001 ±0,183 0,510

ssb-//pK.Srec30 + IPTG 5,334+0,024 0,573

ssb-llpKS5 4,702+0,039 0,650

ssb-l/pKS5 + IPTG 4,330±0,099 0,706

Белок RecA из высокорадиоустойчивой грамположительной бактерии D. radiodurans не способен компенсировать делеционную мутацию в гене гесА грамотрицательной бактерии Е. coli К-12. Однако после серии облучений возрастающими дозами у-радиации клеток Е. coli АгесА, несущих плазмиды с гесАш и recA670dr, получены мутантные аллели гесА-300 и гесЗО-212, дающие радиозащитный эффект при у- и УФ-облучении.

Сравнение белков RecA Е. coli и D. radiodurans показывает значительную степень подобия этих белков 57%). Наибольшие отличия заключаются в N-концевом фрагменте из 16 аминокислот и С-концевой части белка.

3.9. Вклад белков холодового шока в радиоустойчнвость Влияние инсерционной мутации в гене cspA, кодирующем главный белок холодового шока, на радиорезистентность клеток Е. coli. Мы установили, что мутация, затрагивающая ген cspA Е. coli, способна в гетерозиготном (на плазмиде) и в гомозиготном (в клеточной хромосоме) состоянии значительно повысить устойчивость к радиации клеток Е. coli с нормальными системами репарации и синтеза белков теплового шока.

При введении плазмиды pCspA::Kan в штамм Е. coli ABl 157 дикого типа все полученные трансформанты Кшг обнаружили в спот-тесте повышение радиорезистентности. Сравнение наклонов В кривых IgS = f(D) для штаммов ABl 157 и ABl 157/pCspA::Kan позволило определить ФИД, характеризующий эффективность радиозащитного действия плазмиды pCspA::Kan (табл. 5). В качестве контроля была использована плазмида pCspA+ - исходная родительская плазмида для pCspA::Kan, в которой ген cspA+ не разрушен вставкой кассеты Кгпг. На.генетическом фоне штамма ABl 157 эта плазмида вызывает радиозащитный эффект, но он является гораздо более слабым, чем для pCspA::Kan.

Таблица 5

Параметры дозовых кривых выживаемости для штаммов Е. coli

Штамм -В ФИД

у-излучение, (кГр"1)

AB 1157 3,167+0,088

AB 1157/pCspA::Kan 1,384+0,047 2,288

ABU57/pCspA+ 2,756+0,072 1,149

AB И 57 cspAvKan 1,083±0,061 2,924

JC7623 recB2IC22 sbcB15 4,471±0,195

JC7623 recB21C22 sbcB15 cspAwkan 1,942+0,035 2,302

Gam'444 0,750+0,036

Gamr444/pCspA::Kan 0,912±0,052 0,882

Gam'445 1,406±0,038

Gam'445/pCspA::Kan 1,076+0,021 1,307

KS0160 Gamr 1,388±0,071

KS0160 Gamr/pCspA::Kan 1,033±0,039 1,344

AB2463 recA13 20,40±2,05

AB2463 «c^/3/pCspA::Kan 19,66±0,60 1,038

AB И 57 rpoH15 3,355±0,058

| AB 1157 rpoHl 5/pCspA"Kan ' 2,835±0,093 1,183

1 УФ-свет (мин"')

AB1157 0,477+0,015

AB И 57 cspAwkan 0,341+0,003 1,399

Плазмида pCspA::Kan была передана также в два мутанта Е. coli: 1) гесА13, дефектный по гомологической рекомбинации и путям рекомбинационной и SOS-репарации; 2) гроН15, дефектный по индукции системы белков теплового шока. В обоих случаях все трансформанты Кшг в спот-тесте не отличались по радиоустойчивости от бесплазмидных родителей. Это подтвердилось и при количественном анализе дозовых кривых выживаемости. В штамме АВ2463 гесА13 плазмида pCspA::Kan не вызывала никакого радиозащитного эффекта. В мутанте гроН, выращенном при 32°, плазмида pCspA::Kan вызывала достоверный небольшой радиозащитный эффект, который был наиболее заметным при больших дозах. Однако этот эффект оказался гораздо более низким, чем на генетическом фоне дикого типа.

Трансдуктанты ABl 157 cspAwkan проявляли заметное повышение радиорезистентности: фактор изменения дозы оказался близким к 3, т. е. в 1,3 раза больше, чем у гетерозиготного по мутации cspAv.kan штамма ABl 157/pCspA::Kan. В гомозиготном состоянии мутация cspAv.kan проявляет радиозащитный эффект как на RecF-, так и на RecBCD-пути рекомбинации-репарации. Штамм ABl 157 cspAr.kan оказался достоверно более УФ-резистентным по сравнению с штаммом ABl 157. Однако фактор изменения дозы R составлял s 1,4, т. е. был заметно ниже, чем для у-излучения.

Роль мутации в кластере генов cspH-cspG в регуляции белков теплового шока. Рецессивная мутация gamI2, клонированная на плазмиде рВС4042, в гетерозиготном состоянии вызывает незначительное увеличение радиоустойчивости клеток дикого типа Е. coli ABl 157 с плазмидой pBC4042-gaml2, и радиозащитный эффект становится заметным только в области больших доз. После пяти последовательных у-облучений наблюдается значительный рост радиоустойчивости с фактором изменения дозы, равным ~ 3.37. По-видимому, радиация вызывает гомогенотизацию и переход от меродиплоида к gaml2!gaml2, так как известно, что облучение клеток Е. coli гесА* с высокой частотой вызывает перенос аллелей из плазмид на хромосому (Mudgett and Taylor, 1986).

Мы картировали мутацию gaml2. Гибридизация ДНК плазмиды pBC4042-gaml2, меченной 2Р, с набором фагов А. Кохары (Kohara et al., 1987), несущих упорядоченные фрагменты хромосомы, неожиданно показала несколько положительных сигналов (рис. 8). Их позиции были приписаны номерам "мини-набора"; 102, 103, 129, 130, 131, 225, 226, 404 и 615, что соответствует клонам Кохары 6НЗ, 22В12, 5А5, ЗС7, 21С10, 4Н11, 2F1, 9С2 и 10F5. Клоны 5А5 и ЗС7 представляют собой фрагменты хромосомы, перекрывающиеся по локусу оперона lacZYA. Плазмида рВС4042 содержит оперон lacZ'YA, лишенный промотора (Groisman et ai, 1984). Не исключено, что гибридизация с этими клонами может определяться последовательностью ДНК вектора. Однако общей особенностью клонов 6НЗ, 22В12, 21С10, 4HII, 2F1, 9С2 и 10F5 является присутствие инвертированной последовательности IS1, затем гена, кодирующего белок InsB транспозона, и экстрагенного палиндромного элемента. Такие вставки встречаются в 6 местах хромосомы Е. coli: IS1 A, IS1B, IS1C, IS1D, IS1G и IS1E. Следует отметить, что клоны 5А5 и

ЗС7 несут кроме локуса lacZYA также транспозон IS1B. Таким образом, клонированная мутация gaml2, по-видимому, соседствует с одним из IS1-элементов в геноме Е. coli. Анализ районов, прилегающих к этим IS 1 -элементам, позволил нам выбрать клоны 4Н11 и 2F1 со вставкой IS1D, локализованной на 22,68 мин хромосомы с 5'-стороны от 'кластера генов cspH-cspG, кодирующих белки семейства холодового шока с негативным регулятором CspA. Мы предположили, что мутация gaml2 расположена в этом районе, так как ранее установлено, что мутация-вставка сspAv.kan в ключевом гене холодового шока вызывает большой радиозащитный эффект даже в присутствии хромосомного гена cspA+ дикого типа, и этот эффект зависит от генов re с А и гроН.

101 310

Рис. 8. Картирование клонированного локуса

хромосомы. Гибридизация набора фагов А, Кохары с ДНК плазмиды рВС4042, меченной 32Р и несущей аллель gam!2. Вверху указано положение клонов на мембране

Полимеразная цепная реакция с праймерами mugC-F3 и musI-R3 к ДНК на флангах вектора, содержащих последовательности фага Ми, позволила оценить размер клонированного на плазмиде pBC4042-gaml2 фрагмента, как равный ~ 2500 п.н. (рис. 9). Это больше, чем район insB-cspH-cspG, который равен 1650 п.н. Использование встречно ориентированных праймеров cspG-F4 и cspG-R4 к гену cspG дало фрагмент размером ~ 570 п.н., что соответствует ожидаемой длине. Эти результаты позволили предположить, что клонированный фрагмент с локусом gam!2 содержит последовательность, включающую повтор IS1D, гены insB, cspH и cspG.

Мы секвенировали локус gaml2 с праймерами cspH-F5 и cspG-R5 к гену cspG. Полученная последовательность идентична на ~ 98% последовательности гена cspG. Выравнивание нуклеотидных последовательностей аллеля gaml2 и гена cspG показало четыре нуклеотидные вставки во второй половине гена. Эти вставки приводят к появлению в последовательности преждевременного стоп-кодона TGA. Концептуальная трансляция такой последовательности дает N-концевой фрагмент белка CspG', состоящего из 41 аминокислоты вместо 70 (рис. 10), практически совпадающий с укороченным белком CspA', полученным после трансляции гена cspA со вставкой транспозона Тп903.

1 2 3 4 5

Рис. 9. Электрофоретическое распределение ПЦР-продуктов в 0,6% агарозном геле. Маркеры мол. весов ДНК ШтсНИ (1), РВС4042-ёаш12 (2, 4), рВС4042-£аш12 после 5 у-облучений (3, 5). 2, 3 -праймеры ти§С-РЗ и т^-ЯЗ, 4, 5 - праймеры сзрО-Р4 и сэрО-ИА Верхняя стрелка - 2500 п.н., нижняя стрелка -570 п.н.

CspG 1 MSNKMTGLVKWFNADKGFGFJTPDDGSKDVFVHFTAIQSNE 41

Garni2 (CspG) MSNKMTGLVKWFNADKGFGFITPDDGSKDVFVHFIRHPï^Q*41 CspA' 1 MSGmTGIVKWFNADiCGFGFITPDDGSKDVFVHFSAIQNGS 40

CspA 1 MSGKMT GIVKWFNADKGFGFIT PDD G S KD VFVHFS AI QND G 41

CspG 42 EFRTLNENQKVEFSIEQGQRGPAAANWTL* 70

Garni 2 (CspG') ------------------------------

CspA' 42 GCNPGSATEHSSV*

CspA 42 YKSLDEGQKVSFTIESGAKGPAAGNVTSL* 70

Рис. 10. Выравнивание аминокислотных последовательностей, полученных трансляцией локусов cspG, gaml2, cspA со вставкой кассеты Тп903 и cspA. Курсивом показаны остатки, образующие мотивы связывания с РНК и ДНК (Schindelin, 1994). Аминокислоты, отличающие CspA от CspG, подчеркнуты; аминокислоты, появившиеся из-за сдвига рамки считывания, подчеркнуты волнистой линией

Мутация garni2 не затрагивает мотивов белка KGFGFI и VFVHF, ! которым приписывается роль в связывании ДНК и РНК (Schindelin et al., 1994). Белки субсемейства CspA на 43% идентичны "домену холодового шока" эукариотических белков семейства "Y-блока" (Y-box). Все эти белки обладают способностью связываться с нуклеиновыми кислотами, влияя на транскрипцию, репликацию и репарацию или на эффективность трансляции мРНК.

Не исключая разные механизмы действия БХШ на экспрессию генов и синтез белка, мы проанализировали распределение в геноме Е. coli нуклеотидного мотива ССААТ и комплементарного ATTGG с помощью программы Search. Список существенных генов, содержащих этот мотив в 5'-регуляторной области (меньше, чем 100 п.н. от блока -35), в промоторе (между блоками -10 и -35), в 5'-нетранслируемом районе РНК и структурной части гена представлен в таблице 6. Эти гены можно разделить на семейство генов собственно холодового шока: cspA, cspB, cspC, cspD, cspE, cspF, cspG, cspH, cspl, csdA, и rbfA; теплового шока: rpoH, dnaKJ, grpE, groES, htpG, Ion, clpB, clpP, ddg, dksA, hslV, hslJ, htrA, htrC, ibpA, ibpB\ гены репликации и клеточного деления: dnaA, dnaN, dnaX и ftsQ\ регуляторные гены: oxyR, rpoS, ompR, osmC, hns, stpA (гомолог hns), asr, arcB, hipA, hupA, gcpE, greB и rob\ гены систем репарации и рекомбинации: recA, alkA, dinG, gyrA, polB, recC, recF, recO, recR через dnaX, recN, ruvA, ssb, uvrA, uvrB, uvrD и sulA.

Вне нашего рассмотрения остаются гены метаболизма и транспорта, также содержащие мотивы ССААТ.

Таблица 6

Классификация генов Е. coli с областями, содержащими последовательность __Y-бокс для связывания CspA-подобных белков_

Функция Гены/положение

5'-UAS Промотор 5'-UTR Структурная часть

Белки холодового шока cspF* cspA *, cspC* cspB*, cspD*, cspE* csdA, cspA*, cspB*, cspC*, cspD*, cspE*, cspF*, cspG*, cspH*, cspl*, rbfA

Белки теплового 1 шока dnaKJ, grpE dnaKJ, htpG*, clpB*, clpP, ddg*, dksA, dnaK, groES*, grpE, hslV, hslJ, htpG*, htrA, htrC, ibpA, ibpB, ion, rpoH

Системы репарации, рекомбинации, репликации и клеточного деления alkA, gyrA*, dnaA, recO, ssb, uvrA, ruvA recO, polB, ssb, ftsQ recC*, recF, recR через dnaX, uvrD, dinG', ssb, ftsQ, dnaN, dnaX dinG*, gyrA*, polB, recA*, recF, recN, ruvA, ssb, ung, uvrA, uvrB, uvrD, intA, intB, ftsJ, ftsQ, dnaA, dnaN, dnaX, sulA

Регуляторные белки hns*, stpA, hipA, gcpE, ompR* arcB hns *, oxyR, rob, gcpE, greB asr, hns*, hupA, oxyR, ompR*, osmC, rob, rpoS, stpA

* изменение экспрессии при холодовом шоке подтверждено протеомным анализом (Phadtare and Inouye, 2004).

Таким образом, нами идентифицирована рецессивная мутация gaml2 из высокорадиоустойчивого штамма Е. coli Gamr444. Эта мутация находится на 22,68 мин хромосомы в кластере генов cspH-cspG и по меньшей мере затрагивает ген cspG, вызывая сдвиг открытой рамки считывания с образованием стоп-кодона. Не исключено, что мутантный белок холодового шока CspG' принимает участие в регуляции экспрессии стрессовых систем клетки при низкой температуре аналогично укороченному белку CspA'.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. Устойчивость бактерий к наиболее опасному типу повреждений ДНК - двунитевым разрывам, определяется эффективностью рекомбинационной репарации. Современная модель рекомбинационной репарации двунитевых разрывов у Е. coli основывается на RecBCD-зависимом пути репарации, сопряженном с реинициацией репликации, а RecF-пути отводит роль в репарации брешей или альтернативного механизма в отсутствие экзонуклеаз V и I. В данной работе представлены доказательства того, что, по крайней мере, у радиоустойчивых мутантов Е. coli Gamr возможно одновременное функционирование обоих путей репарации и только смешанный RecBCD-RecFOR-путь репарации способен исправлять множественные двунитевые разрывы в геноме этих бактерий.

Полученные данные говорят об эволюционном консерватизме унифицированного механизма рекомбинационной репарации повреждений ДНК у бактерий с повышенной устойчивостью к ДНК-тропным агентам. Предполагается, что высокая резистентность к ДНК-повреждающим агентам у радиоустойчивых мутантов кишечной палочки достигается формированием смешанного RecBCDFOR-пути рекомбинационной репарации, на котором происходит перераспределение ролей RecBCD- и RecF-путей в пользу последнего: активация геликазы на RecF-пути сопровождается ограничением активности экзонуклеазы V на RecBCD-пути. Дополнительно белки стрессовых систем теплового и холодового шока выполняют вспомогательную роль в ренатурации ключевых белков репарационных систем, деградации аберрантных белков и в регуляции экспрессии как SOS-регулона, так и аддитивных стрессовых систем.

Можно предложить следующий механизм реакции радиоустойчивых мутантов на действие ионизирующей радиации. Гамма-облучение вызывает повреждение ДНК и других компонентов клеток радиоустойчивого штамма, что является сигналом для частично конститутивных Сатг-функций (рис. 11). Активация этих функций приводит к изменению экспрессии генов SOS-системы репарации и RecF-пути рекомбинационной репарации, нарушению репликации и клеточного деления, изменению метаболизма, появлению устойчивости к окислительным агентам, усилению синтеза ренатурирующих белков, АТФ-зависимых протеаз и РНК-шаперонов и, возможно, других гипотетических систем. В итоге эти события приводят к повышению эффективности репарации потенциально-летальных повреждений ДНК и росту выживаемости клеток.

Транскрипция

Трансляция^^^

Репликация и клеточное деление

Повреждение ;ДНК и других I компонентов

Garn1-, функции^

Репарация

: ... днк

Метаболизм

Окислительный стресс

Стрессовый ответ БТШ и БХШ

Гипотетические функции

Клеточная выживаемость

Рис. 11. Реакция клеток радиоустойчивой бактерии на воздействие ионизирующей радиации

ВЫВОДЫ

1. Штаммы бактерий, имеющие пониженный уровень пострадиационной деградации ДНК, для исправления летальных повреждений при низких дозах не нуждаются в белке РпА и обширном ресинтезе, сопровождающем RecBCD-путь репарации двунитевых разрывов. Однако при более высоких дозах (> 500 Гр) этот путь репарации становится существенным и у радиорезистентных мутантов.

2. Радиоустойчивость мутанта Е. coli Gam'444 зависит от индуцибельной системы SOS-репарации и конститутивного RecBCD-зависимого пути репарации разрывов ДНК. Вместе с тем установлено, что мутации гесО, recR, recQ, helD и uvrD, затрагивающие альтернативный RecF-путь репарации, гораздо сильнее сенсибилизируют мутант Gamr444, чем штамм дикого типа.

3. Обнаружено понижение уровня экзонуклеазной деградации ДНК в необлученных клетках штамма Gamr444 как прямым измерением экзонуклеазной активности фермента RecBCD, так и косвенным методом оценки выживаемости фагового мутанта Т4 2'.

4. Свойства плазмиды pGam26, несущей клонированный мутантный аллель gam26 штамма Gamr444, свидетельствуют о том, что его продукт способен ограничивать экзонуклеазную активность RecBCD в необлученных клетках дикого типа. Картирование показало, что он не совпадает с геном гесА, который кодирует белок RecA, ингибирующий пострадиационную экзонуклеазную деградацию ДНК.

5. Мутантный аллель gaml8 радиорезистентного мутанта Gamr444, клонированный на плазмиде pGam!8, повышает выживаемость у-облученных клеток recBC sbcB', т.е. активен на RecF-пути рекомбинационной репарации.

6. Частичная компенсация плазмидой pGaml8 радиосенсибилизирующего эффекта мутаций в гене uvrD, кодирующем ДНК-геликазу II и также относящемся к RecF-пути, позволяет предположить, что мутантный аллель gam!8 повышает ДНК-геликазную активность на предсинаптической стадии RecF-пути репарации у-индуцированных двунитевых разрывов ДНК.

7. Природная плазмида pSD89, выделенная из штамма S. derby, повышает радиоустойчивость клеток Е. coli дикого типа, значительно компенсирует дефект по репарации в мутантах гесА и polA, но не uvrA и итиС и несет гомолог гена polA.

8. Повышенный базальный уровень основных белков теплового шока, а именно: DnaJ, CbpA, GrpE, CIpB, Lon, и в особенности DnaK, вызывает рост радиоустойчивости мутантов Gamr.

9. Мутация в SOS-блоке оператора гена гесА, снижающая связывание репрессора LexA, приводит к накоплению белка RecA в клетках и к росту устойчивости к летальному действию ионизирующей радиации и ультрафиолетового света.

10. Экспрессия гена гесА высокорадиоустойчивой грамположительной бактерии D. radiodurans не компенсирует делецию гена гесА грамотрицательной бактерии Е. coli К-12.

11. Модифицированные белки CspA' и CspG' системы холодового шока повышают устойчивость клеток Е. coli дикого типа, a CspG' также и радиоустойчивого мутанта Gamr444 к летальному действию ионизирующей радиации и УФ-света, активируя синтез белков холодового шока, теплового шока и ReeA-зависимых функций, в частности белков RecF-пути репарации.

12. Доказано существование у радиоустойчивых мутантов кишечной палочки смешанного RecBCDFOR-пути рекомбинационной репарации двунитевых разрывов ДНК, на котором происходит перераспределение ролей RecBCD- и RecF-путей в пользу последнего: ограничение активности экзонуклеазы V на RecBCD-пути создает условия для RecF-пути, который дополнительно стимулируется активацией геликазы. При этом белки стрессовых систем теплового и холодового шока выполняют вспомогательную и регуляторные роли в ренатурации или протеолизе поврежденных белков и избирательном усилении экспрессии генов.

Список публикаций по материалам диссертации.

Журналы, рекомендованные ВАК:

1. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Бикинеева В.Г., Калинин В.Л. Влияние мутаций в структурных генах белков теплового шока на радиорезистентность Escherichia coli. - Генетика, 1992, т. 28, № 2, с. 99110.

2. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Калинин В.Л. Мутантные аллели радиорезистентности штамма Gamr444 Escherichia coli: клонирование и предварительная характеристика. - Генетика, 1994, т. 30, № б, с. 756-762.

3. Вербенко В.Н., Калинин В.Л. Рост радиоустойчивости бактериофагов как результат усиления экспрессии стрессовых систем клетки-хозяина. ■ -. Генетика, 1995, т. 31, № 12, с. 1630-1636.

4. Вербенко В.Н., Исаханова К.Г., Калинин В.Л. Природная плазмида pSD89(Cmr) из Salmonella derby К89, повышающая радиоустойчивость штаммов Escherichia coli К-12. - Генетика, 1999, т. 35, № 3, с. 303-308.

5. Вербенко В.Н., Крупьян Е.П., Шевелев И.В., Калинин В.Л. Конститутивное ингибирование деградации ДНК, вызванной ферментом RecBCD, у радиоустойчивого мутанта Gam'444 Escherichia coli К-12. -Генетика, 1999, т. 35, № 4, с. 438-443.

6. Вербенко В.Н., Крупьян Е.П., Кузнецова Л.В., Калинин В.Л. Мутантный аллель gam!8, участвующий в RecF-пути репарации у Escherichia coli К-12. - Генетика, 1999, т. 35, № 3, с. 309-313.

7. Вербенко В.Н., Смольникова А.В., Калинин В.Л. Влияние нулевой мутации в гене priA на радиорезистентность Escherichia coli. - Генетика, 2000, т. 36, № 3, с. 318-321.

8. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Смольникова А.В., Калинин В.Л. Влияние инсерционной мутации в гене cspA главного белка холодового шока на радиорезистентность клеток Escherichia coli. - Генетика, 2003, т. 39, № 6, с. 748-757.

9. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Крупьян Е.П., Суслов А.В. Оператор-конститутивная мутация в гене гесА повышает радиоустойчивость Escherichia coli. - Генетика, 2009, т. 45, № 8, с. 1048-1054.

10. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Лучкина Л.А., Клопов Н.В. Мутация в кластере генов cspH-cspG повышает экспрессию белков теплового шока и SOS-системы репарации Escherichia coli. - Генетика, 2009, т. 45, № 9, с. 1194-1202.

И. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Крупьян Е.П., Шалгуев В.И. Экспрессия гена re с A Deinococcus radiodurans в клетках Escherichia coli. - Генетика, 2009, т. 45, № 10, с. 1324-1331.

Тезисы конференций, сборники и др.:

12. Verbenko V.N., Kalinin V.L., Kuznetsova L.V. Mutant radiation resistant alleles from Escherichia coli Gamr444: cloning and preliminary characterization. - LNPI Research Report, 1990-91, LNPI, Gatchina, 1992. -256 p., p. 174-176.

13. Вербенко B.H. Роль стрессовых систем бактериальных клеток в детерминировании устойчивости к неблагоприятным факторам среды. — Тезисы VI съезда ВОГиС, Минск, 1992.

14. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Kuznetsova L.V. Radiation resistant alleles from Escherichia coli Gamr444 mutant: cloning and preliminary characterization. -Abstr. 25th Ann. Meet. Eur. Soc. Radiat. Biol., Stockholm, 1993, p. 04:18.

15. Вербенко B.H., Бикинеева Е.Г., Калинин B.JI. Рост радиоустойчивости бактериофагов как результат координированного усиления экспрессии стрессовых систем. - Тезисы II Радиобиологического съезда, Киев, 1993, ч. 1, с. 178-179.

16. Verbenko V.N., Kalinin V.L. Interplay of stress systems of Escherichia coli Gamr444 mutant in repair of y-induced damage. - J. Cell Biochem., 1995, Suppl. 21A, p. 345.

17. Verbenko V.N., Krupjan H.P., Kalinin V.L. Additive regulation of Escherichia coli stress systems in Gam'444 mutant. - Abstr. Meet. "Molecular Genetics of Bacteria and Phages", Cold Spring Harbor Lab., 1995.-307 p., p. 268.

18. Kalinin V.L., Kuznetsova L.V., Verbenko V.N. Is main cold stress CspA protein negative regulator of heat-shock proteins in E. соШ - Abstr. Meet. "Molecular Genetics of Bacteria and Phages", Cold Spring Harbor Lab.,

1995.-307 p., p. 128.

19. Калинин В.Л., Вербенко B.H., Кузнецова Л.В., Ахмедов А.Т., Крупьян Е.П. Радиорезистентные мутанты бактерий и клеточные стрессовые системы. - ГШЯФ-XXV, Основные направления научной деятельности, ОМРБ, ПИЯФ, Гатчина, 1995. - 264 е., с. 158-165. ISBN 5-86763-091-9.

20. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Krupjan E.P. Properties of cloned dominant Gaml8 allele. - PNPI Research Report, 1994-95, PNPI, Gatchina, 1996. - 344 p., p. 206-207. ISBN 5-86763-087-0.

21. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Krupjan E.P., Shevelev I.V. Properties of cloned dominant Gam43 allele. - PNPI Research Report, 1994-95, PNPI, Gatchina,

1996. - 344 p., p. 208. ISBN 5-86763-087-0.

22. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Isakhanova K.G. Natural plasmid pSD89 (Cmr) from Salmonella derby K89 protects Escherichia coli K-12 against radiation. -PNPI Research Report, 1994-95, PNPI, Gatchina, 1996. - 344 p., p. 209-210. ISBN 5-86763-087-0.

23. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Kuznetsova L.V. Overproduction of a subset of heat-shock proteins is sufficient for enhancement of radiation resistance in

Escherichia coli. - Abstr. 44th Annual Meet. Radiat. Res. Soc., Chicago, 1996, p. 185.

24. Verbenko V.N., Kalinin V.L., Krupjan H.P., Kuznetsova L.V. Recombinant plasmid pGaml8 which carries a mutant allele involved in RecF pathway protects Escherichia coli wild-type cells from lethal effects of ionizing radiation. - Abstr. 44th Annual Meet. Radiat. Res. Soc., Chicago, 1996. -196 p., p. 185.

25. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Krupjan E.R Rec functions in enhanced radiation resistance of E. coli Gamr444 mutant. - Abstr. Meet. "Molecular Genetics of Bacteria and Phages", Cold Spring Harbor Lab., 1996.-178 p., p. 61.

26. Verbenko V.N., Krupjan E.P., Shevelev I.V., Kalinin V.L. Mapping of the dominant mutation gam26 enhancing E. coli radioresistance. - Abstr. Meet. "Molecular Genetics of Bacteria and Phages", Cold Spring Harbor Lab., 1996. - 178 p, p. 114.

27. Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Krupjan E.P., Kalinin V.L. The mutation enhancing heat-shock proteins synthesis in Escherichia coli K-12 at normal temperature is located within cspG gene. - Abstr. Meet. "Molecular Genetics of Bacteria and Phages", Wisconsin-Madisson, 1997.

28. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Krup'yan E.P. Rec functions in enhanced radiation resistance of Escherichia coli K-12 Gamr mutants. -PNPI Research Report, 1996-97, PNPI, Gatchina, 1998. - 432 p., p. 296-297. ISBN 5-86763-087-0.

29. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Krup'yan E.P. Preliminary mapping of Escherichia coli K-12 mutation enhancing heat-shock protein synthesis at normal temperature. - PNPI Research Report, 1996-97, PNPI, Gatchina, 1998. - 432 p., p. 298. ISBN 5-86763-087-0.

30. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Smol'nikova A.V. Influence of a null mutation in the priA gene on radiation resistance of Escherichia coli. — PNPI Research Report, 1996-97, PNPI, Gatchina, 1998. - 432 p., p. 299-301. ISBN 5-86763087-0.

31. Крупьян Е.П., Вербенко B.H. Повышение эффективности RecF-пути рекомбинационной репарации ДНК у радиоустойчивого мутанта Escherichia coli Gamr444. - Тезисы 2 съезда ВОГиС, Санкт-Петербург, 1-5 февраля, 2000.

32. Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Kalinin V.L. Radiation resistance of Escherichia coli depends on the cspA gene encoding the main cold shock protein. - Тезисы конференции, посвященной 100-летнему юбилею Н.В.Тимофеева-Ресовского "Современные проблемы радиобиологии, радиоэкологии и эволюции", ОИЯИ, Дубна, 6-9 сентября 2000 г.

"Проблемы радиационной генетики на рубеже веков", Москва, 20-24 ноября 2000 г.

34. Kalinin V.L., Smol'nikova A.V., Verbenko V.N. Influence of mutations in the cspA gene encoding the main cold shock protein on radiation resistance of Escherichia coli. - PNPI Research Report, 1998-99, PNPI, Gatchina, 2000. -244 p., p. 231. ISBN 5-86763-033-1.

35. Калинин В.Л., Вербенко B.H. Гиперрадиорезистентность у бактерий. -Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня. В сб. "Бреслеровские чтения"; ПИЯФ РАН, Гатчина, 2002. - 322 е., с. 43-49. ISBN 5-86763-197-4.

36. Вербенко В.Н., Крупьян Е.П., Кузнецова Л.В., Калинин В.Л. Исследование ключевого гена рекомбинационной репарации гесА высокорадиоустойчивой бактерии Deinococcus radiodurans в клетках Escherichia coli. - Основные результаты научных исследований 20002004, ПИЯФ РАН, Гатчина, 2005. - 258 е., с. 203-204. ISBN 5-86763-172-9.

37. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Крупьян Е.П., Калинин В.Л. Роль стрессовых систем клетки в развитии радиоустойчивости у бактерий. -Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня. В сб. "Бреслеровские чтения И". ПИЯФ РАН, Гатчина, 2007. - 443 е., с. 396404. ISBN 5-86763-057-9.

38. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Крупьян Е.П., Суслов А.В., Шалгуев В.И. Селекция мутаций в гене гесА, повышающих радиоустойчивость Escherichia coli. - Тезисы школы-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология", 20-24 октября 2008 г. Москва -Пущино, 2008. - 188 е., с. 27.

Отпечатано в типографии ГЖЯФ РАН

188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 328, тир. 100, уч.-изд. л. 2; 30.09.2009 г.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Вербенко, Валерий Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.б

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. РЕАКЦИЯ БАКТЕРИЙ НА ПОВРЕЖДЕНИЕ ДНК, SOS-OTBET,

РЕКОМБИНАЦИОННАЯ РЕПАРАЦИЯ И СВЯЗЬ С РЕПЛИКАЦИЕЙ ДНК.

1.1.1. Основные категории генов, участвующих в защите генома.

1.1.2. Однонитевые повреждения ДНК и их репарация.

1.1.3. Алкилирование ДНК и адаптивный ответ.

1.1.4. Реакция на окислительный стресс.

1.1.5. Механизмы эксцизионной репарации.

1.1.6. Коррекция ошибочно спаренных оснований

1.1.7. SOS-ответ coli на повреждение ДНК.

1.1.8. Происхождение двунитевых повреждений ДНК и их репарация.

1.1.9. Ранние модели репарации двунитевых повреждений ДНК.

1.1.10. Пути рекомбинационной репарации у Е. coli.

1.1.11. Репарация двунитевых концов ДНК в отсутствие RecBCD.

1.1.12. RecE-путь рекомбинационной репарации.

1.1.13. Репарация ДНК по RecF-пути рекомбинации.

1.1.14. Репарация двунитевых разрывов ДНК при участии фермента RecBCD.

1.1.15. Рекомбинационная репарация, зависящая от репликации, и белок РпА.

1.1.16. Модель репарации, сопряженной с репликацией ДНК.

1.1.17. Подготовка двунитевых концов ДНК нуклеазой RecBCD.

1.1.18. Гены, кодирующие экзонуклеазу V.

1.1.19. Деградация ДНК после облучения ионизирующей радиацией и УФ-светом.

1.1.20. Деградация ДНК как способ контроля хромосомной репликации.

1.1.21. Роль белка RecA в рекомбинационной репарации.

1.1.22. Клеточные процессы, зависящие от RecA.

1.1.23. Контроль активности RecA.

1.1.24. Значение рекомбинационной репарации.

1.1.25. Клеточные процессы, сопровождающиеся рекомбинационную репарацию.

1.1.26. Унифицированный механизм репарации двунитевых разрывов.

1.2. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ СТРЕССОВЫЕ СИСТЕМЫ КЛЕТКИ И РАДИОУСТОЙЧИВОСТЬ.

1.2.1. Реакция бактериальной клетки на тепловой шок во время облучения.

1.2.2. Система постэкспоненциальных белков.

1.2.3. Стрессовый ответ холодового шока.

1.3. ГИПЕРРАДИОРЕЗИСТЕНТНАЯ БАКТЕРИЯ Deinococcus radiodurans И РОЛЬ RecA-ПОДОБНОГО БЕЛКА.

1.3.1. Характеристика радиочувствительности D. radiodurans.

1.3.2. Роль рекомбинанационной репарации и белка RecA в радиоустойчивости D. radiodurans.

1.3.3. Ингибироваиие радиационно-индуцированной деградации у D. radiodurans.

1.3.4. Дополнительные факторы радиоустойчивости D. radiodurans.

1.4. СВОЙСТВА МУТАНТОВ Escherichia coli К-12 GAMr.

1.4.1. Радиобиологическая характеристика мутантов Gamr.

1.4.2. Предварительная характеристика мутантных аллелей Gamr.

1.4.3. Сравнение мутантов Е. coli Gamr и D. radiodurans.

1.5. ПРИРОДНЫЕ ПЛАЗМИДЫ, ПОВЫШАЮЩИЕ РАДИОУСТОЙЧИВОСТЬ БАКТЕРИЙ.

1.6. ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 1.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы Escherichia coli, Salmonella derby, Deinococcus radiodurans, фаги и плазмиды

2.2. Получение рекомбинантных плазмид.

2.3. Среды.

2.4. Трансдукция.

2.5. Спот-тест для качественной оценки уровня радиочувствительности

2.6. Изучение зависимости выживаемости клеток от дозы у-излучения

2.7. Клонирование локусов Gamr.

2.8. Определение экзонуклеазной активности.

2.9. Введение радиоактивной метки в белки.

2.10. Введение радиоактивной метки в клеточную ДНК.

2.11. Определение относительной эффективности посева мутантного фага.

2.12. Определение частоты замещения хромосомного аллеля.

2.13. Выделение плазмидной ДНК.

2.14. Электрофоретическое разделение плазмидной ДНК и белков.

2.15. Полимеразная цепная реакция, гибридизация и секвенирование ДНК.

2.16. Математическая обработка результатов опытов.

Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. КОНСТИТУТИВНЫЕ И ИНДУЦИБЕЛЬНЫЕ ПУТИ РЕПАРАЦИИ И РАДИОУСТОЙЧИВОСТЬ.

3.1.1. Роль RecBCD-пути рекомбинационной репарации, сопряженной с репликацией, в радиоустойчивости мутантов Gamr Escherichia coli. Ill

3.1.2. Роль индивидуальных генов RecF- и RecBC-путей рекомбинационной репарации в радиационной устойчивости Е. coli.

3.2. МУТАНТНЫЕ АЛЛЕЛИ РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ ИЗ ШТАММА ESCHERICHIA COLI GAMR444: КЛОНИРОВАНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА.

3.2.1. Клонирование и селекция рекомбинантных плазмид.

3.2.2. Свойства клонированной рецессивной мутации gam.

3.2.3. Свойства клонированных доминантных аллелей gam.

3.2.4. Аддитивность радиозащитного действия двух классов аллелей Gamr.

3.3. КОНСТИТУТИВНОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ ДЕГРАДАЦИИ ДНК, ВЫЗВАННОЙ ФЕРМЕНТОМ RECBCD, В МУТАНТЕ GAMR 444 Е. COLI.

3.3.1. АТФ-зависимая деградация ДНК в клеточной фракции, содержащей экзонуклеазу V.

3.3.2. Оценка экзонуклеазной активности RecBCD с помощью мутанта фага Т4 2".

3.3.3. Предварительное картирование мутантного аллеля gam26 из радиоустойчивого штамма Gamr444.

3.4. СВОЙСТВА МУТАНТНОГО АЛЛЕЛЯ GAM18.

3.4.1. Тестирование радиозащитного эффекта плазмиды pGaml8 на RecE- и

RecF-путях рекомбинационной репарации.

3.4.2. Компенсация дефекта гена uvrD, кодирующего ДНК-геликазу П, мутантным аллелем gaml8.

3.5. ПРИРОДНАЯ ПЛАЗМИДА pSD89 (Cm1) ИЗ Salmonella derby К89, ПОВЫШАЮЩАЯ РАДИОУСТОЙЧИВОСТЬ ШТАММОВ Escherichia coli К-12.

3.5.1. Радиочувствительность штаммов Salmonella derby.

3.5.2. Электрофоретическое разделение плазмидных ДНК из S. derby К89.

3.5.3. Изменение радиочувствительности штаммов Е. coli, трансформированных плазмидой pSD89 (Cm1).

3.5.4. Способность плазмиды pSD89 (Cm1) поддерживать размножение ро/Л-зависимых репликонов.

3.6. РОЛЬ СТРЕССОВОЙ СИСТЕМЫ БТШ В РАДИОУСТОЙЧИВОСТИ БАКТЕРИЙ И БАКТЕРИОФАГОВ.

3.6.1. Влияние мутаций в структурных генах белков теплового шока на радиорезистентность штамма дикого типа Escherichia coli.

3.6.2. Зависимость повышенной радиорезистентности мутантов Gamr от состояния структурных генов белков теплового шока.

3.6.3. Влияние белков теплового шока на пострадиационную деградацию ДНК.

3.6.4. Рост радиоустойчивости бактериофагов как результат усиления экспрессии стрессовых систем клетки-хозяина.

3.6.4.1. Определение экспрессии стрессовых систем у радиоустойчивых мутантов.

3.6.4.2. Реактивация и W-реактивация у-облученных фагов.

3.6.4.3. Радиочувствительность фагов, облученных в комплексе с клетками.

3.6.4.4. Пострадиационная деградация фаговой ДНК.

3.7. ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ГЕНА RECA D. RADIODURANS В Е. COLI.

3.7.1. Роль гена recA+ D. radiodurans в радиоустойчивости Е. coli.

3.7.2. Радиоустойчивость штаммов Е. coli гесА' с клонированными мутантными аллелями гена гесА Е. coli и D. radiodurans.

3.8. ВКЛАД БЕЛКОВ ХОЛОДОВОГО ШОКА В РАДИОУСТОЙЧИВОСТЬ.

3.8.1. Влияние пнсерционной мутации в гене cspA главного белка холодового шока на радиорезистентность клеток Е. coli.

3.8.2. Роль мутации в кластере генов cspH-cspG в радиоустойчивости.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетические механизмы повышенной устойчивости бактерий к потенциально-летальным повреждениям ДНК"

Устойчивость бактерий к генотоксичным факторам среды во многом определяется их способностью к репарации повреждений ДНК. Одним из факторов, лимитирующих репаративный потенциал бактериальных клеток, является сложный, разветвленный процесс рекомбинационной репарации. Существование различных путей рекомбинации (Clark, 1973) может приводить как к кооперативным, так и к конкурентным взаимоотношениям генетических продуктов, использующих один и тот же субстрат.

Полученные ранее данные указывают на то, что важной причиной повышения устойчивости клеток Е. coli к летальному действию у-излучения является увеличение эффективности работы SOS-системы и RecF-пути рекомбинационной репарации (Бреслер и др., 1984). Вместе с тем взаимоотношения различных путей рекомбинации при репарации повреждений ДНК остаются невыясненными и требуют дальнейших исследований.

Важную роль в рекомбинационной репарации играет процесс расчистки поврежденной нити ДНК. Защиту от избыточной деградации ДНК, по-видимому, кроме белка RecA могут осуществлять клеточные белки, аналогичные белкам gam и gp2 фагов X и Т4, соответственно. Тем не менее, клеточные аналоги таких фаговых белков до сих пор не описаны.

Для того чтобы наиболее полно изучить механизмы высокой устойчивости бактерий к ДНК-повреждающим факторам, необходимо исследовать свойства мутантных локусов, дающих фенотип Gamr. Возможным способом повышения радиоустойчивости выглядит перенос гена гесА и экспрессия белка RecA из грамположительной бактерии D. radiodurans в клетки Е. coli.

Актуальность темы.

Молекулярно-генетические механизмы устойчивости бактериальных клеток к повреждениям ДНК представляют собой несомненный интерес как эволюционно консервативные системы защиты клеток прокариотов и эукариотов.

Нерепарированные повреждения ДНК вызывают ингибирование и дезинтеграцию репликативных вилок, приводящую к появлению потенциально-летальных двунитевых разрывов ДНК. В Е. coli дезинтегрированные двунитевые вилки собираются заново благодаря RecBCD-пути рекомбинационной репарации через направляемую гомологией инвазию одноиитевой ДНК в интактный сестринский дуплекс. Репарация как прямо индуцированных, так и возникших при дезинтеграции репликативных вилок двунитевых разрывов ДНК в Е. coli возможна прежде всего в реплицированной части хромосомы.

Уровень радиорезистентности бактерий определяется эффективностью репарации двунитевых разрывов ДНК. Репарация ДР идет по механизму гомологичной RecB CD-зависимой рекомбинации. RecBCD-путь репарации двунитевых разрывов за пределами репликативной вилки может рассматриваться как комбинация двух независимых событий репарации, вовлекающих гомологичную хромосому. RecBCD-путь рекомбинационной репарации двунитевых разрывов сопровождается значительной деградацией ДНК и ассоциирован с рестартом репликации. В клетках дикого типа возможна репарация ДР без участия RecBCD-пути (у фагов).

RecF-пути рекомбинационной репарации приписывается роль в репарации однонитевых брешей, хотя и признается его способность репарировать ДР при выключении RecBC-пути. У высокорадиоустойчивой бактерии D. radiodurans нет экзонуклеазы RecBC и репарация ДР идет по RecF-пути рекомбинационной репарации, либо по гипотетическому механизму зависимого от протяженного синтеза отжига нитей. Взаимоотношения, несомненно, главного RecBCD-зависимого пути рекомбинационной репарации двунитевых разрывов ДНК с альтернативными RecF- и RecE-путями репарации в Е. coli еще не выяснены.

Потребность в генах рекомбинационной репарации хромосомной ДНК по RecBCD-и RecF-путям во многом перекрывается, что вызывает попытки создания унифицированного механизма рекомбинационной репарации.

Белок RecA играет ключевую роль в SOS-ответе и всех путях рекомбинационной репарации. RecA из высокорадиоустойчивой бактерии D. radiodurans обладает особенными свойствами. Механизмы повышенной радиорезистентности снова оказываются в центре внимания благодаря успехам в исследовании D. radiodurans. В литературе обсуждается зависимый от протяженного синтеза отжиг нитей (ESDSA) как причина высокой радиоустойчивости. Вместе с тем известно, что индукция стрессовой системы теплового шока приводит к эффекту термоиндуцированной радиорезистентности у клеток дикого типа. А в условиях холодового шока (при переносе с 37° на 10°) повышается дифференциальная скорость синтеза белков RecA и GyrA (субъединица А ДНК-гиразы). Белки холодового шока рассматриваются как активаторы транскрипции и РНК-шапероны.

Несмотря на очевидную важность взаимодействия стрессовых систем клетки с системами репарации повреждений ДНК не изучены.

В решении актуальных вопросов могут оказаться полезными исследования мутантов кишечной палочки с повышенной радиационной устойчивостью, в которых может быть усилена функция RecF-пути при сохранении роли RecBC-пути рекомбинационной репарации и аддитивном эффекте стрессовых систем.

Эта работа была выполнена в группе индуцибельных систем клетки Отделения молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики РАН, в которой были выделены мутанты Escherichia coli К-12 Gamr, имеющие гораздо более высокую устойчивость к летальному действию у-излучения, чем стандартные штаммы дикого типа (например, штамм АВ1157, из которого эти мутанты были получены). Работа проводилась в рамках программы изучения механизмов повышенной устойчивости бактерий к летальному действию ионизирующей радиации в соответствии с планом НИР "Исследование генетической рекомбинации, механизмов мутагенеза, устойчивости к факторам внешней среды", N гос. регистрации 01.9.60- 002792 и поддержана грантами 98-04-48696 и 00-04-48887 Российского фонда фундаментальных исследований. Работа частично финансировалась грантом Министерства Энергетики США (DOE), грантом Санкт-Петербургской администрации для студентов, аспирантов и молодых ученых и грантом Государственного Комитета по Науке и Технике "Перспективные направления генетики".

Целью данного исследования является изучение молекулярно-генетических механизмов повышенной устойчивости бактериальных клеток к потенциально-летальным повреждениям ДНК - двунитевым разрывам, на примере радиоустойчивых мутантов Escherichia coli.

Основные задачи исследования.

Для изучения роли некоторых участников рекомбинационной репарации в повышении радиоустойчивости клеток Escherichia coli нами выбран штамм дикого типа АВ1157 и изогенные радиорезистентные мутанты Gamr (Бреслер и др., 1980); а также их производные, несущие мутации в генах, существенных для рекомбинационной репарации. Компенсация этих мутаций исследовалась с применением мутантных локусов gam, клонированных на плазмидах. Ранее было показано, что важной причиной повышения устойчивости штамма Е. coli Gamr444 к летальному действию у-излучения является увеличение эффективности работы RecF-пути рекомбинационной репарации (Бреслер и др., 1984). С этой точки зрения представляет интерес мутантный аллель gam 18, клонированный из штамма Gamr444 на плазмиде pGaml8. Перенос вставки транспозона мини-TnlO-Kan в этом аллеле в хромосому приводит к значительной радиосенсибилизации клеток на генетическом фоне recBC sbcB~. Такое повышение чувствительности к летальным повреждениям ДНК обычно указывает на участие инактированного гена в RecF-пути рекомбинационной репарации. Чтобы подтвердить предположение о том, что мутация gaml8 затрагивает RecF-путь репарации-рекомбинации, необходимо изучить способность плазмиды pGaml8 компенсировать дефекты в генах, принадлежащих RecE- и RecF-путям рекомбинации.

Процесс деградации поврежденной нити ДНК играет важную роль в рекомбинационной репарации. Защиту от избыточной деградации ДНК, по-видимому могут осуществлять клеточные белки аналогичные белкам gam и gp2 фагов X и Т4. Плазмида pGam26, вероятно, несет клонированный мутантный ген, кодирующий клеточный ингибитор деградации ДНК, не совпадающий с белком RecA. Свойства этого продукта также кажутся интересными для исследования.

Сам же белок RecA продолжает оставаться в центре внимания в филогенетических исследованиях. RecA-подобный белок из высокорадиоустойчивой бактерии D. radiodurans обладает особенными свойствами (Battista et al., 1999, Kim et al., 2002, Narumi et al., 1999). Выключение гена recA полностью лишает D. radiodurans уникальной радиоустойчивости (Narumi et al., 1999). Это обстоятельство ставит вопрос о возможности его использования для усиления репарации ДНК в клетках Е. coli.

Основные задачи исследования можно сформулировать следующим образом:

1) изучение роли различных путей рекомбинационной репарации в повышении радиоустойчивости клеток,

2) клонирование и изучение мутантных локусов gam, повышающих эффективность репарации,

3) изучение вклада основных белков системы теплового шока в радиоустойчивость,

4) исследование возможности активации RecA-зависимых функций в репарации,

5) изучение роли мажорных белков холодового шока в феномене радиоустойчивости.

Научная новизна.

Анализ генетической детерминированности повышенной радиоустойчивости мутантов Escherichia coli Gamr, выделенных в ОМРБ ПИЯФ, и изучение свойств плазмид, несущих клонированные мутантные аллели у-гиперрезистентности, обнаружил строгую зависимость усиленной репарации летальных повреждений ДНК от двух клеточных стрессовых систем: 1) классической репаративной SOS-системы, включающей ряд генов RecF-пути рекомбинационной репарации; 2) генов, кодирующих основные белки системы белков теплового шока, которая должна экспрессироваться конститутивно для обеспечения максимальной усиленной радиоустойчивости. Также были получены данные, показавшие, что определенные мутации-вставки в гены cspA и cspG мажорных белков еще одной стрессовой системы — системы белков холодового шока, тоже могут приводить к повышению радиорезистентности.

Наши данные показывают, что репарация радиационно-индуцированных повреждений ДНК (вероятно, включая двунитевые разрывы как основные летальные повреждения) ассоциирована с активностями RecBCD- и RecF-путей рекомбинационной репарации не только в клетках дикого типа, но и в радиоустойчивых мутантах. Очевидно, адаптация Е. coli к ДНК-повреждающим! агентам, включая у-излучение, не связана с i появлением новых репарационных систем. Однако есть несколько особенностей традиционных репарационных систем в мутантах Gamr: 1) при низких дозах облучения (на уровне D37) штаммы бактерий, имеющие пониженный уровень пострадиационной » деградации ДНК, для исправления летальных повреждений не нуждаются в белке PriA и обширном ресинтезе, сопровождающем RecBCD-путь репарации двунитевых разрывов; 2) 1 при более высоких дозах (> 500 Гр) RecBCD-путь репарации становится существенным и у радиорезистентных мутантов; 3) относительный вклад SOS-функций значительно выше в мутантах Gamr по сравнению с диким типом и объем репарации ДНК и/или её I эффективность значительно выросли; 4) вероятно, эти SOS-функции, крайне важные для репарации у-повреждений, идентичны ферментам RecF-пути рекомбинационной репарации ДНК, о чем говорит перераспределение ролей RecBCD- и RecF-путей в пользу последнего, по крайней мере, в диапазоне доз до 1 кГр; 5) мутации recO, recR, recQ; helD и uvrD, затрагивающие альтернативный. RecF-путь репарации, гораздо сильнее сенсибилизируют мутант Gamr444, чем штамм дикого типа. '

Мутантный локус радиорезистентности gam!8 из штамма Gamr444 Escherichia coli, клонированный на плазмиде pGaml8, повышает с фактором изменения дозы ФИД = 2 устойчивость клеток дикого типа и мутанта recBC sbcB, но не мутанта recBC sbcA, к летальному действию у-излучения. Это указывает на участие продукта локуса gamlS в RecF-пути рекомбинационной репарации. Мутации большинства генов RecF-пути (recF recJ, recR, recO, recQ, recN и ruvB) полностью устраняют радиозащитный эффект плазмиды pGaml8. Однако 3 мутации в гене uvrD, кодирующем ДНК-геликазу II и также относящемся к RecF-пути, частично компл ем вотируются плазмидой pGaml8. Эти данные позволяют предположить, что мутантный аллель gaml8 влияет на ДНК-геликазную активность на предсинаптической стадии RecF-пути репарации у-индуцированных двунитевых разрывов ДНК.

Ранее было высказано предположение, что у мутанта Gamr444 имеется "конститутивный", т.е. присутствующий уже в необлученных клетках, ингибитор пострадиационной деградации ДНК, который не контролируется репрессором SOS-системы LexA и не совпадает с белком RecA (Бреслер и др., 1984). Понижение уровня экзонуклеазной деградации ДНК в необлученных клетках штамма Gamr444, обнаруженное прямым измерением экзонуклеазной активности фермента RecBCD и косвенным методом оценки выживаемости фагового мутанта Т4 2", согласуется с этим предположением. Свойства плазмиды pGam26, несущей один из клонированных мутантных генов штамма Gamr444, свидетельствуют о том, что этот аллель способен ограничивать экзонуклеазную активность RecBCD в необлученных клетках дикого типа. Предварительное картирование показало, что он не совпадает ни с одним из известных генов и, в частности, с геном гесЛ.

Белок RecA из высокорадиоустойчивой грамположительной бактерии Deinococcus radiodurans не способен компенсировать дефект гена гесЛ грамотрицательной бактерии Escherichia coli К-12. Однако после серии последовательных облучений возрастающими дозами гамма-радиации клеток Е. coli, несущих плазмиды с клонированными аллелями гена recA Deinococcus radiodurans, получены мутантные аллели гесА-300 и гесАЗО-212, комплементирующие делецию гена recA Е. coli и, по-видимому, кодирующие мутантные белки RecAoR, способные эффективно взаимодействовать с компонентами рекомбинационной репарации Е. coli.

Предполагается существование у радиоустойчивых мутантов Е. coli Gamr смешанного RecBCD-RecFOR-пути рекомбинационной репарации ДР в гомологичных хромосомах, на котором происходит перераспределение ролей1 RecBCD- и RecF-путей в пользу последнего: ограничение активности экзонуклеазы V на RecBCD-пути сопровождается активацией геликазы на RecF-пути. Гиперпродукция белков теплового шока DnaK, DnaJ, CbpA, GrpE, ClpB и Lon создает благоприятные условия для репарации: рефолдинга или гидролиза поврежденных протеинов. Белки холодового шока субсемейства CspA: CspA' и CspG', регулируют экспрессию БТШ и SOS-регулона.

Практическая ценность.

В связи с задачей биологической очистки радиоактивных отходов штаммы микроорганизмов, способные селективно накапливать тяжелые металлы, в том числе и радионуклиды, должны обладать устойчивостью к повышенному радиационному фону. Клонированные мутантные локусы, также как природная плазмида из S. derby, повышающие эффективность репарации ДНК, дают возможность создания радиоустойчивых форм микроорганизмов для решения задач биоремедиации.

Апробация работы.

Материалы данного исследования представлялись на конференциях: 25th Annual Meeting European Society Radiation Biology, Stockholm, 1993, Molecular Genetics of Bacteria and Phages" в Колд-Спринг-Харборе (Cold Spring Harbor Laboratory) в 1995 г., Molecular Genetics of Bacteria and Phages" в Колд-Спринг-Харборе (Cold Spring Harbor Laboratory) в 1996 г., на 2 съезде ВОГиС в Санкт-Петербурге в 2000 г., на международной конференции, посвященной 100-летнему юбилею Н.В. Тимофеева-Ресовского "Современные проблемы радиобиологии, радиоэкологии и эволюции" в Дубне в 2000 г. и на международной конференции "Проблемы радиационной генетики на рубеже веков" в Москве в 2000 г., на Российской школе-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология" в Москве и Пущино в 2008 г.

Объем работы.

Объем работы - 310 страниц. Содержится 81 рисунок, 19 таблиц и 501 ссылка.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Вербенко, Валерий Николаевич

ВЫВОДЫ

1. Штаммы бактерий, имеющие пониженный уровень пострадиационной деградации ДНК, для исправления летальных повреждений при низких дозах не нуждаются в белке PriA и обширном ресинтезе, сопровождающем RecBCD-путь репарации двунитевых разрывов. Однако при более высоких дозах (> 500 Гр) этот путь репарации становится существенным и у радиорезистентных мутантов.

2. Радиоустойчивость мутанта Е. coli Gamr444 зависит от индуцибельной системы SOS-репарации и конститутивного RecBCD-зависимого пути репарации разрывов ДНК. Вместе с тем, установлено, что мутации recO, recR, recQ, helD и uvrD, затрагивающие альтернативный RecF-путь репарации, гораздо сильнее сенсибилизируют мутант Gamr444, чем штамм дикого типа.

4. Свойства плазмиды pGam26, несущей клонированный мутантный аллель gam26 штамма Gamr444, свидетельствуют о том, что его продукт способен ограничивать экзонуклеазную активность RecBCD в необлученных клетках дикого типа. Картирование показало, что он не совпадает с геном recA, который кодирует белок RecA, ингибирующий пострадиационную экзонуклеазную деградацию ДНК.

5. Мутантный аллель gamlS радиорезистентного мутанта Gamr444, клонированный на плазмиде pGaml8, повышает выживаемость у-облученных клеток recBC sbcB', т.е. активен на RecF-пути рекомбинационной репарации.

6. Частичная компенсация плазмидой pGaml8 радиосенсибилизирующего эффекта мутаций в гене uvrD, кодирующем ДНК-геликазу II и также относящемся к RecF-пути, позволяет предположить, что мутантный аллель gaml8 повышает ДНК-геликазную активность на предсинаптической стадии RecF-пути репарации* у-индуцированных двунитевых разрывов ДНК.

7. Природная плазмида pSD89, выделенная из штамма S. derby, повышает радиоустойчивость клеток Е. coli дикого типа, значительно компенсирует дефект по репарации в мутантах recA и polA, но не uvrA и итиС и несет гомолог генаpolA.

8. Повышенный базальный уровень основных белков теплового шока, а именно: DnaJ, CbpA, GrpE, ClpB, Lon, и в особенности DnaK, вызывает рост радиоустойчивости мутантов Gamr.

9. Мутация в SOS-блоке оператора гена recA, снижающая связывание репрессора LexA, приводит к накоплению белка RecA в клетках и к росту устойчивости к летальному действию ионизирующей радиации и ультрафиолетового света.

10. Экспрессия гена recA высокорадиоустойчивой грамположительной бактерии Deinococcus radiodurans не компенсирует делецию гена recA грамотрицательной бактерии Escherichia coli К-12.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор крайне признателен организатору этой работы |В.Л. Калинину), сотрудникам ОМРБ ПИЯФ, принимавшим непосредственное участие в работе; Л.В. Кузнецовой, Е.П. Крупьян, И.В. Шевелеву, А.Т. Ахмедову, Н.В. Клопову, также благодарен за техническую помощь O.K. Кабоеву, Л.А. Лучкиной, В.И. Шалгуеву и участие в дискуссиях А.В. Суслову и Л.В. Коневеге. Особая благодарность В.Г. Королеву за чтение рукописи, обсуждение и полезные замечания.

В обсуждении работы принимали участие и оказывали помощь также: Takashi Yura, Institute for Heat Shock Proteins, Kyoto (Япония); Kenneth Rudd, National Center for Biotechnology Information, Bethesda (США); David Ewing, Allegheny Universities of the Health Sciences, Philadelphia (США); Richard D'Ari, Centre national de la recherche scientifique, Paris (Франция).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Журналы, рекомендованные ВАК

1. Вербенко В.Н., Кузнецова JI.B., Бикннеева Е.Г., Калинин B.JI. Влияние мутаций в структурных генах белков теплового шока на радиорезистентность Escherichia coli. - Генетика, 1992, т. 28, № 2, с. 99-110.

2. Вербенко В.Н., Кузнецова JI.B., Калинин B.JI. Мутантные аллели радиорезистентности штамма Gamr444 Escherichia coli-. клонирование и предварительная характеристика. - Генетика, 1994, т. 30, № б, с. 756-762. Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., and Kalinin V.L. Mutant radiation-resistance alleles from the Escherichia coli Gamr444 mutant: cloning and preliminary characterization. - Russian J. Genet., 1994, v. 30, № 6.

3. Вербенко B.H., Калинин B.JI. Рост радиоустойчивости бактериофагов как результат усиления экспрессии стрессовых систем клетки-хозяина. — Генетика, 1995, т. 31, № 12, с. 1630-1636.

Verbenko V.N., and Kalinin V.L. Increase in bacteriophage radiation resistance as a result of enhanced expression of stress systems in host cells. - Russian J. Genet., 1995; v. , 31, № 12, p. 1386-1392.

4. Вербенко B.H., Исаханова К.Г., Калинин B.JI. Природная плазмида pSD89(Cmr) из Salmonella derby K89, повышающая радиоустойчивость штаммов Escherichia coli К-12. - Генетика, 1999, т. 35, № 3, с. 303-308.

Verbenko V.N., Isakhanova KG., and Kalinin V.L. Natural plasmid pSD89(Cmr) from Salmonella derby K89 enhancing radiation resistance of Escherichia coli K-12 strains. — Russian J. Genet., 1999, v. 35, № 3, p. 238-243.

5. Вербенко B.H., Крупьян Е.П., Шевелев И.В., Калинин B.JI. Конститутивное ингибирование деградации ДНК, вызванной ферментом RecBCD, у радиоустойчивого мутанта Gamr444 Escherichia coli K-12. — Генетика, 1999, т. 35, № 4, с. 438-443.

Verbenko V.N., Krupyan Е.Р., Shevelev I.V., and Kalinin V.L. Constitutive inhibition of RecBCD-mediated DNA degradation in the Escherichia coli K-12 radiation-resistant mutant Gamr444. - Russian J. Genet., 1999, v. 35, № 4, p. 358-363.

6. Вербенко B.H., Крупьян Е.П., Кузнецова JI.B., Калинин B.JI. Мутантный аллель gaml8, участвующий в RecF-пути репарации у Escherichia coli K-12. — Генетика, 1999, т. 35, № 3, с. 309-313.

Verbenko V.N., Krupyan E.P., Kuznetsova L.V., and Kalinin V.L. Mutant allele gaml8 involved in the RecF repair pathway of Escherichia coli K-12. - Russian J. Genet., 1999, v. 35, № 3, p. 244-248.

7. Вербенко B.H., Смольникова A.B., Калинин B.JI. Влияние нулевой мутации в гене priA на радиорезистентность Escherichia coli. - Генетика, 2000, т. 36, № 3, с. 318321.

Verbenko V.N., Smol'nikova A.V., and Kalinin V.L. Effect of a null mutation in the priA gene on the radiation resistance of Escherichia coli. - Russian J. Genet., 2000, v. 36, №. 3, p. 245-248.

8. Вербенко B.H., Кузнецова JI.B., Смольникова A.B., Калинин В.Л. Влияние инсерционной мутации в гене cspA главного белка холодового шока на радиорезистентность клеток Escherichia coli. - Генетика, 2003, т. 39, № 6, с. 748757.

Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Smol'nikova A.V., and Kalinin V.L. Effect of an insertional mutation in the cspA gene encoding the major cold-shock protein on radiation resistance of Escherichia coli. - Russian J. Genet., 2003, v. 39, №. 6, p. 618-626.

9. Вербенко B.H., Кузнецова JI.B., Крупьян Е.П., Суслов А.В. Оператор-конститутивная мутация в гене гесА повышает радиоустойчивость Escherichia coli. - Генетика, 2009, т. 45, № 8, с. 1048-1054.

Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Krup'yan Е.Р., Suslov A.V. Operator constitutive mutation in the recA gene enhances radiation resistance of Escherichia coli. - Russian J. Genet., 2009, v. 45, №. 8, p. 917-923.

10. Вербенко B.H., Кузнецова JI.B., Лучкина Л.А., Клопов H.B. Мутация в кластере генов cspH-cspG повышает экспрессию белков теплового шока и SOS-системы репарации Escherichia coli. - Генетика, 2009, т. 45, № 9, с. 1194-1202.

Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Luchkina L.A., Klopov N.V. Mutation in the cspH-cspG claster enhances expression of heat shock proteins and SOS repair system of Escherichia coli. - Russian J. Genet., 2009, v. 45, №. 9, p. 1047-1054.

11. Вербенко B.H., Кузнецова Л.В., Крупьян Е.П. Шалгуев В.И. Экспрессия гена г ее А Deinococcus radiodurans в клетках Escherichia coli. — Генетика, 2009, т. 45, № 10, с. 1324-1331.

Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Krup'yan Е.Р., Shalguev A.I. Expression of the Deinococcus radiodurans recA gene in Escherichia coli cells. — Russian J. Genet., 2009, v. 45, №. 10, p. 1192-1199.

Тезисы конференций, сборники и др.

12. Verbenko V.N., Kalinin V.L., Kuznetsova L.V. Mutant radiation resistant alleles from Escherichia coli Gamr444: cloning and preliminary characterization. - PNPI Research Report, 1990-91, PNPI, Gatchina, 1992. - 256 p., p. 174-176.

13. Вербенко B.H. Роль стрессовых систем бактериальных клеток в детерминировании устойчивости к неблагоприятным факторам среды. — Тезисы VI съезда ВОГИС, Минск, 1992.

14. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Kuznetsova L.V. Radiation resistant alleles from Escherichia coli Gamr444 mutant: cloning and preliminary characterization. — Abstr. 25th Ann. Meet. Eur. Soc. Radiat. Biol., Stockholm, 1993, p. 04:18.

16. Verbenko V.N., Kalinin V.L. Interplay of stress systems of Escherichia coli Gamr444 mutant in repair of y-induced damage. - J. Cell Biochem., 1995, Suppl. 21A, p. 345.

17. Verbenko V.N., Krupjan H.P., Kalinin V.L. Additive regulation of Escherichia coli stress systems in Gamr444 mutant. — Abstr. Meet. "Molecular Genetics of Bacteria and Phages", Cold Spring Harbor Lab., 1995. - 307 p., p. 268.

18. Kalinin V.L., Kuznetsova L.V., Verbenko V.N. Is main cold stress CspA protein negative regulator of heat-shock proteins in E. colil — Abstr. Meet. "Molecular Genetics of Bacteria and Phages", Cold Spring Harbor Lab., 1995. - 307 p., p. 128.

19. Калинин B.JI., Вербенко B.H., Кузнецова JI.В., Ахмедов А.Т., Крупьян Е.П. Радиорезистентные мутанты бактерий и клеточные стрессовые системы. - ПИЯФ-XXV. Основные направления научной деятельности, ОМРБ, ПИЯФ, Гатчина, 1995. -264 е., с. 158-165. ISBN 5-86763-091-9.

21. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Krupjan E.P., Shevelev I.V. Properties of cloned dominant Gam43 allele. - PNPI Research Report, 1994-95, PNPI, Gatchina, 1996. - 344 p., p. 208. ISBN 5-86763-087-0.

22. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Isakhanova K.G. Natural plasmid pSD89 (Cm1) from Salmonella derby K89 protects Escherichia coli K-12 against radiation. - PNPI Research Report, 1994-95, PNPI, Gatchina, 1996. - 344 p., p. 209-210. ISBN 5-86763-087-0.

23. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Kuznetsova L.V. Overproduction of a subset of heat-shock proteins is sufficient for enhancement of radiation resistance in Escherichia coli. - Abstr. 44th Annual Meet. Radiat. Res. Soc., Chicago, 1996, p. 185.

25. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Krupjan E.P. Rec functions in enhanced radiation resistance of E. coli Gamr444 mutant. - Abstr. Meet. "Molecular Genetics of Bacteria and Phages", Cold Spring Harbor Lab., 1996. - 178 p., p. 61.

27. Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Krupjan E.P, Kalinin V.L. The mutation enhancing heat-shock proteins synthesis in Escherichia coli K-12 at normal temperature is located within cspG gene. — Abstr. Meet. "Molecular Genetics of Bacteria and Phages", Wisconsin-Madisson, 1997.

28. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Krup'yan E.P. Rec functions in enhanced radiation resistance of Escherichia coli K-12 Gamr mutants. - PNPI Research Report, 1996-97, PNPI, Gatchina, 1998. - 432 p., p. 296-297. ISBN 5-86763-087-0.

31. Крупьян Е.П., Вербенко B.H. Повышение эффективности RecF-пути рекомбинационной репарации ДНК у радиоустойчивого мутанта Escherichia coli Gamr444, - Тезисы 2 съезда ВОГиС, Санкт-Петербург, 1-5 февраля, 2000.

33. Verbenko V.N., Krup'yan Е.Р., Kuznetsova L.V., Kalinin V.L. Repeated "growth-irradiation" cycles induced a Gamr mutation at the cspG-cspH gene cluster of Escherichia coli. — Тезисы Международной конференции "Проблемы радиационной генетики на рубеже веков", Москва, 20 - 24 ноября 2000 г.

35. Калинин B.JI., Вербенко B.H. Гиперрадиорезистентность у бактерий. -Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня. В сб. Бреслеровские чтения, ПИЯФ РАН, Гатчина, 2002. - 322 е., с. 43-49. ISBN 5-86763-197-4.

36. Вербенко В.Н., Крупьян Е.П., Кузнецова Л.В. Калинин В.Л. Исследование ключевого гена рекомбинационной репарации гесА высокорадиоустойчивой бактерии Deinococcus radiodurans в клетках Escherichia coli. — Основные результаты научных исследований 2000-2004, ПИЯФ РАН, Гатчина, 2005. - 258 е., с. 203-204. ISBN 5-86763-172-9.

37. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Крупьян Е.П., Калинин В.Л. Роль стрессовых систем клетки в развитии радиоустойчивости у бактерий. - Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня. В сб. Бреслеровские чтения П. ПИЯФ РАН, Гатчина, 2007. - 443 е., с. 396-404. ISBN 5-86763-057-9.

38. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Крупьян Е.П., Суслов А.В., Шалгуев В.И. Селекция мутаций в гене г ее А, повышающих радиоустойчивость Escherichia coli. — Тезисы школы-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология", 20 - 24 октября 2008 г. Москва - Пущино, 2008. - 188 е., с. 27.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Вербенко, Валерий Николаевич, Гатчина

1. Бреслер С.Е., Бекетова А.Г., Носкин JI.A., Розенберг О.А., Степанова И.М. и Суслов А.В. Термоиндуцированная радиорезистентность клеток Escherichia coli. — Радиобиология, 1984а, т. 24, №5, с. 579-583.

2. Бреслер С.Е., Бекетова А.Г., Носкин Л.А., Степанова И.М. Генетическая детерминированность и механизм реализации термоиндуцированной радиорезистентности. — Радиобиология, 19846, т. 24, № 5, с. 584-589.

3. Бреслер С.Е., Вербенко В.Н., Калинин В.Л. Мутанты Escherichia coli К-12 с повышенной устойчивостью к ионизирующей радиации. Сообщение I. Выделение и изучение перекрестной резистентности к различным агентам. — Генетика, 1980, т. 16, № 11, с. 17531763.

4. Бреслер С.Е., Вербенко В.Н., Калинин В.Л. Мутанты Escherichia coli К-12 с повышеной устойчивостью к ионизирующей радиации. П. Изучение повреждения и репарации ДНК в гамма-облученных клетках. Генетика, 1982, т. 18, № 8, с. 1245-1254.

5. Бреслер С.Е., Вербенко В.Н., Калинин В.Л. Мутанты Escherichia coli К-12 с повышенной устойчивостью к ионизирующей радиации. III. Влияние мутаций гес и lexA на радиорезистентность. Генетика, 1984в, т. 20, № 5, с. 746-755.

6. Бреслер С.Е., Калинин В.Л., Ланеева Н.И. Мутанты Escherichia coli К-12 с повышенной устойчивостью к ионизирующей радиации. IV. Особенности рекомбинации у мутантов Gamr. Генетика, 1984г, т. 20. № 5, стр. 756-759.

7. Бреслер С.Е., Вербенко В.Н., Калинин В.Л. Мутанты Escherichia coli К-12 с повышенной устойчивостью к ионизирующей радиации. Сообщение V. Влияние мутаций на спонтанный и индуцированный мутагенез. Генетика, 1985, т. 21, № 3, с. 384-390.

8. Вербенко В.Н., Ахмедов А.Т., Калинин В.А. Термоиндуцированная радиорезистентность клеток Escherichia coli и белки теплового шока. Радиобиология, 1986а, т. 26, № 4, с. 453459.

9. Вербенко В.Н., Ахмедов А.Т., Калинин В.Л. Мутанты Escherichia coli К-12 с повышенной устойчивостью к ионизирующей радиации. VI. Повышенная радиорезистентность и белки теплового шока. Генетика, 19866, т. 22, № И, с. 2658-2663.

10. Вербенко В.Ы., Калинин В.Л. Радиорезистентные мутанты Escherichia coli: влияние модификаторов на радиорезистентность. — Проблемы природной и модифицированной радиочувствительности. М.: Наука, 1983. -279 е., с. 95-102.

11. Вербенко В.Н., Крупьян Е.П., Кузнецова Л.В., Калинин В.Л. Мутантный аллель gaml8, участвующий в RecF-пути репарации у Escherichia coli К-12. — Генетика, 1999а, т. 35, № 3, с. 309-313.

12. Вербенко В.Н., Крупьян Е.П., Шевелев И.В. и Калинин B.JI. Конститутивное ингибирование деградации ДНК, вызванной ферментом RecBCD, у радиоустойчивого мутанта Gamr444 Escherichia coli К-12. Генетика, 19996, т. 35, № 4, с. 438-443.

13. Вербенко В.Н., Кузнецова JI.B., Калинин В.Л. Мутантные аллели радиоустойчивости из штамма Escherichia coli К-12 Gamr444: клонирование и предварительная характеристика. Генетика, 1994, т. 30. № 6, с. 756-762.

14. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Бикинеева Е.Г., Калинин В.Л. Влияние мутаций в структурных генах белков теплового шока на радиорезистентность Escherichia coli. — Генетика, 1992, т. 28, № 2, с. 99-110.

15. Вербенко В.Н., Смольникова А.В., Калинин В.Л. Влияние нулевой мутации в гене priA на радиорезистентность Escherichia coli. — Генетика, 2000, т. 36, № 3, с. 318-321.

16. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Смольникова А.В., Калинин В.Л. Влияние инсерционной мутации в гене cspA главного белка холодового шока на радиорезистентность клеток Escherichia coli. Генетика, 2003, т. 39, № 6, с. 748-757.

17. Виноградская Г.Р., Горышин И.Ю., Ланцов В.А. Роль гена ssb в индуцибельных и конститутивных путях рекомбинации в Escherichia coli К-12. — Докл. Акад. Наук. 1986, т. 290, № 1, с. 228-231.

18. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В., Калинин В.Л., Ахмад Ш.И. Гиперрекомбинация плазмид характерна для гиперрезистентных штаммов Escherichia coli. — Генетика, 1997, т. 33, №6, с. 757-761.

19. Калинин В.Л., 1986 неопубликованные данные.

20. Кцоян Ж.А., Таисова А.А., Саркисян Н.Н. Изменение механизмов устойчивости S. derby к Str. Антибиотики и химиотерапия. 1976, т. 33, № 10, с. 760.

21. Маниатис Т., Фрич Э., Самбрук Дж. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. - 479 е., с. 232-250.

22. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976. 436 е., с. 186-189.

23. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981. 288 е., с. 57.

24. Петров С.И., Газиев А.И. Связь между образованием двунитевых разрывов ДНК в гамма-облученных бактериях и функциональными процессами быстрой репарации однонитевых разрывов ДНК. Докл. Акад. Наук СССР, 1980, т. 253, № 6, с. 1500-1503.

25. Саркисян Н.Н., Антонян Р.Г., Светлова М.Г., Кцоян Ж.А., Томилин Н.В. R фактор из природного штамма S. derby, несущего ген ДНК-полимеразы. Биохимия, 1985, т. 50, № 4, с. 673-679.

26. Суслов А.В., Суслова И.Н. Количественный анализ индуцибельных систем Escherichia coli и Bacillus subtilis радиоиммунологическими методами. — Радиационная биология. Радиоэкология, 1998, т. 38, № 4, с. 495-501.

27. Adams D.E., West S.C. Relaxing and unwinding on Holliday: DNA helicase-mediated branch migration. Mutat. Res., 1995, v. 337, № 3, p. 149-159.

28. Alexseyev A.A., Bakhlanova I.V., Zaitsev E.N., Lanzov V.A. Genetic characteristics of new recA mutants of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol., 1996, v. 178, № 7, p. 2018-2024.

29. Alfano C., McMacken R. Ordered assembly of nucleoprotein structures at bacteriophage X replication origin during initiation of DNA replication. J. Biol. Chem., 1989, v. 284. № 18, p. 10699-10708.

30. Amundsen S.K., Smith G.R. Interchangeable parts of the Escherichia coli recombination machinery. Cell, 2003, v. 112, № 6, p. 741-744.

31. Amundsen S.K., Taylor A.F., Chaudhury A.M., and Smith G.R. recD\ the gene for an essential third subunit of exonuclease V. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1986, v. 83, № 15, p. 5558-5562.

32. Ananthaswamy H.N., and Eisenstark. A. Repair of hydrogen peroxide-induced single-strand breaks in Escherichia coli deoxyribonucleic acid. J. Bacteriol., 1977, v. 130, № 1, p. 187-191.

33. Arthur H.M., and Lloyd R.G. Hyper-recombination in uvrD mutants of Escherichia coli K-12. -Mol. Gen. Genet., 1980, v. 180, № 1, p. 185-191.

34. Arthur H.M., Bramhill D., Eastlake P.E., Emmerson P.T. Cloning of the uvrD gene of E. coli and identification of the product. Gene, 1982, v. 19, № 3, p. 285-295.

35. Asai Т., Bates D.B., Kogoma T. DNA replication triggered by double-stranded breaks in E. coli: dependence on homologous recombination functions. Cell, 1994, v. 78, № 6, p. 1051-1061.

36. Bae W., Jones P.G., Inouye M. CspA, the major cold shock protein of Escherichia coli, negatively regulates its own gene expression. J. Bacteriol., 1997, v. 179, № 22, p. 7081-7088.

37. Battista J.R. Against all odds: the survival strategies of Deinococcus radiodurans. Annu. Rev. Microbiol., 1997, v. 51, p. 203-224.

38. Battista J.R., Earl A.M. and Park M.J. Why is Deinococcus radiodurans so resistant to ionizing radiation? Trends Microbiol., 1999, v. 7, № 9, p. 362-365.

39. Battista J.R., Park M.J., McLemore A.E. Inactivation of two homologues of proteins presumed to be involved in the desiccation tolerance of plants sensitizes Deinococcus radiodurans R1 to desiccation. Cryobiology, 2001, v. 43, № 2, p. 133-139:

40. Bauer C.E., Elsen S., Bird Т.Н. Mechanisms for redox control of gene expression. Annu. Rev. Microbiol., 1999, v.53, p. 495-523.

41. Bell C.E. Structure and mechanism of Escherichia coli RecA ATPase. Mol. Microbiol., 2005, v. 58, № 2, p. 358-366.

42. Belyakova N.V., Kleiner N.E., Kravetskaya T.P. et al. Proofreading 3' 5' exonucleases isolated from rat liver nuclei. Eur. J. Biochem., 1993, v. 217, № 2, p. K493.

43. Berdal K.G., Johansen R.F., Seeberg E. Release of normal bases from intact DNA by a native DNA repair enzyme.-EMBO J., 1998, v. 17, №2, p. 363-367.

44. Bhattacharya R., Beck D.J. Survival and SOS induction in cisplatin-treated Escherichia coli deficient in Pol II, RecBCD and RecFOR functions. DNA Repair (Amst), 2002, v. 1, № 11, p. 955-966.

45. Bi E., Lutkenhaus J. Cell division inhibitors SulA and MinCD prevent formation of the FtsZ ring.-J. Bacteriol., 1993, v. 175, №4, p. 1118-1125.

46. Bierne H., Seigneur M., Ehrlich S.D., Michel B. uvrD mutations enhance tandem repeat deletion in the Escherichia coli chromosome via SOS induction of the RecF recombination pathway. -Mol. Microbiol., 1997, v. 26, № 3, p. 557-567.

47. Biswas I., Maguin E., Ehrlich S.D., Gruss A. A 7-base-pair sequence protects DNA from exonucleolytic degradation in Lactococcus lactis. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1995, v. 92, № 6, p. 2244-2248.

48. Bjelland S., Birkeland N.K., Benneche Т., Volden G., Seeberg E. DNA glycosylase activities for thymine residues oxidized in the methyl group are functions of the AlkA enzyme in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1994, v. 269, №48, p. 30489-95.

49. Blasius M., Shevelev I., Jolivet E., Sommer S., Hubscher U. DNA polymerase X from Deinococcus radiodurans possesses a structure-modulated 3'—>5'-exonuclease activity involved in radioresistance. Mol. Microbiol., 2006, v. 60, № 1, p. 165-176.

50. Bonner C.A., Stukenberg P.T., Rajagopalan M., Eritja R., O'Donnel M., McEntee K., Echols H., Goodman M.F. Processive DNA synthesis by DNA polymerase II mediated by DNA polymerase Ш accessory proteins. J. Biol. Chem., 1992, v. 267, № 16, p. 11431-11438.

51. Bonura Т., Smith K.C. Enzymatic production of deoxyribonucleic acid double-strand breaks after ultraviolet irradiation of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol., 1975, v. 121, № 2, p. 511517.

52. Bonura Т., Smith K.C., and Kaplan H.S. Enzymatic induction of DNA double-strand breaks in y-irradiated Escherichia coli K-12. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1975, v. 72, № 11, p. 4265-4269.

53. Bork J.M., Сох M.M., Inman R.B. The RecOR proteins modulate RecA protein function at 5' ends of single-stranded DNA. EMBO J., 2001, v. 20, № 24, p. 7313-7322.

54. Brandi A., Spurio R., Gualerzi C.O., Pon C.L. Massive presence of the Escherichia coli "major cold-shock protein" CspA under non-stress conditions EMBO Journal, 1999, v. 18, № 9, p. 1653-1659.

55. Brcic-Kostic K., Stojiljkovic I., Salaj-Smic E., Trgovcevic Z.Overproduction of the RecD polypeptide sensitizes Escherichia coli cells to gamma-radiation. — Mutat. Res., 1992, v. 281, № 2, p. 123-127.

56. Bresler S.E., Kalinin V.L., and Shelegedin V.N. Inactivation of transfecting DNA by physical and chemical agents influence of genotype of phage lambda on host cells. Mutat. Res. 1974, v. 25, № 3, p. 235-248.

57. Bresler S.E., Kalinin V.L., and Shelegedin V.N. W-reactivation and W mutagenesis of gamma-irradiated phage lambda. Mutat. Res., 1978, v. 49, № 3, p. 341-355.

58. Bresler S.E., Noskin L.A., Suslov A.V. Induction by gamma irradiation of double-strand breaks of Escherichia coli chromosomes and their role in cell lethality. Biophys. J., 1984, v. 45, № 4, p. 749-754.

59. Bukau В., Donnelly C.E., Walker G.C. DnaK and GroE proteins play roles in E. coli metabolism at low and intermediate temperatures as well as at high temperatures. UCLA Symp. Mol. Biol., 1989, v. 96, p. 27.

60. Bukau В., Walker G.C. Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate role for heat shock proteins in normal metabolism. J. Bacteriol., 1989, v. 171, № 5, p. 2337.

61. Burland V., Plunkett G., Daniels D.L., Blattner F.R DNA sequence and analysis of 136 kilobases of Escherichia coli genome: organizational symmetry around origin of replication — Genomics, 1993, v. 16, № 3, p. 551-561.

62. Burrell A.D., Feldschreiber P. and Dean C.J. DNA-membrane assotiation and the repair of double breaks in X-irradiated Micrococcus radiodurans. — Biochim. Biophys. Acta, 1971, v. 247, № 1, p. 38-53.

63. Calsou P. and Salles B. Heat inducible reactivation of UV damaged bacteriophage X. Mol. Gen. Genet., 1991, v. 226, № 1-2, p: 113-119:

64. Campbell A. Comparative molecular biology of lambdoid phages. Annu: Rev. Microbiol., 1994, v. 48, p. 193-222.

65. Campbell A. Comparative molecular biology of lamboid phages. Annu. Rev. Microbiol., 1994, v. 48, p. 193-222.

66. Campbell M.J., and Davis R.W. On the in vivo function of the RecA ATPase. J. Mol. Biol., 1999, v. 286, № 2, p. 437-445.

67. Campbell M.J., and Davis R.W. Toxic mutations in the recA gene of E. coli prevent proper chromosome segregation. J. Mol. Biol., 1999, v. 286, № 2, p. 417-435.

68. Cao Y., and Kogoma T. The mechanism of recA polA lethality: suppression by RecA-independent recombination repair activated by the /exzl(Def) mutation in Escherichia coli. — Genetics, 1995, v. 139, № 4, p. 1483-1494.

69. Capaldo F.N., Ramsey G., and Barbour S.D. Analysis of the growth of recombination-deficient strains of Escherichia coli K-12. J. Bacterid., 1974, v. 118, № 1, p. 242-249.

70. Capaldo-Kimball F., and Barbour S.D. Involvement of recombination genes in growth and viability of Escherichia coli K-12. J. Bacterid., 1971, v. 106, № 1, p. 204-212.

71. Carlsson J., and Carpenter V.S. The recAX gene product is more important than catalase and superoxide dismutase in protecting Escherichia coli against hydrogen peroxide toxicity. — J. Bacterid., 1980, v. 142, №l,p. 319-321.

72. Chattoraj D.K., Cordes K., Berman M.L. Mutagenesis and mutation transfer induced by ultraviolet light in plasmid-cloned DNA Gene, 1984, v. 27. № 2, p. 213-222.

73. Chaudhury A.M., and Smith G.R. A new class of Escherichia coli recBC mutants: implications for the role of RecBC enzyme in homologous recombination. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1984, v. 81, №24, p. 7850-7854.

74. Chedin F., Noirot P., Biaudet V., and Ehrlich S.D. A five-nucleotide sequence protects DNA from exonucleolytic degradation by AddAB, the RecBCD analogue of Bacillus subtilis. — Mol. Microbiol., 1998, v. 29, № 6, p. 1369-1377.

75. Chen В., Zhong D., and Monteiro A. Comparative genomics and evolution of the HSP90 family of genes across all kingdoms of organisms. BMC Genomics, 2006, v. 7, № 156, p. 1-19.

76. Cimino G.D., Gamper H.B., Isaacs S.T., and Hearst J.E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. -Annu. Rev. Biochem., 1985, v. 54, p. 1151-1193.

77. Clark A.J. Recombination deficient mutants of E. coli and other bacteria. Annu. Rev. Genet., 1973, v. 7, p. 67-86.

78. Clark A J. Toward a metabolic interpretation of genetic recombination of E. coli and its phages. -Annu. Rev. Microbiol., 1971, v. 25, p. 437-464.

79. Clark A .J., and Low K.B. Pathways and systems of homologous recombination in Escherichia coli. -The recombination of genetic material (Low K.B. ed.). San Diego, Calif.: Academic Press, Inc., 1988, p. 155-215.

80. Clark A.J., and Sandler S.J. Homologous recombination: the pieces begin to fall into place. — Crit. Rev. Microbiol., 1994, v. 20, № 2, p. 125-142.

81. Clark A.J., Sharma V., Brenowitz S., Chu C.C., Sandler S., Satin L., Templin A., Berger I., and Cohen A. Genetic and molecular analyses of the C-terminal region of the recE gene from the

82. Rac prophage of Escherichia coli K-12 reveal the recT gene. J. Bacterid., 1993, v. 175, № 23, p. 7673-7682.

83. Clark A.J., Volkert M.R., Margossian L.J., and Nagaishi H. Effects of a recA operator mutation on mutant phenotypes conferred by lexA and recF mutations. Mutat. Res., 1982, v. 106, № 1, p. 11-26.

84. Colbert Т., Taylor A., and Smith G.R. Genomics, Chi sites and codons: "islands of preferred DNA pairing" are oceans of ORFs. Trends Genet., 1998, v. 14, № 12, p. 485-488.

85. Connelly J.C., de Leau E.S., Okely E.A., and Leach D.R.F. Overexpression, purification, and characterization of the SbcCD protein from Escherichia coli. — J. Biol. Chem., 1997, v. 272, № 32, p. 19819-19826.

86. Courcelle J., Carswell-Crumpton C., and Hanawalt P.C. recF and recR are required for the resumption of replication at DNA replication forks in Escherichia coli. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, № 8, p. 3714-3719.

87. Courcelle J., Khodursky A., Peter В., Brown P.O., and Hanawalt P.C. Comparative gene expression profiles following UV exposure in wild-type and SOS-deficient Escherichia coli. -Genetics, 2001, v. 158, № 1, p. 41-64.

88. Cox J.M., Tsodikov O.V., Cox M.M. Organized unidirectional waves of ATP hydrolysis within a RecA filament. PLoS Biol., 2005, v. 3, № 2, e52.

89. Cox M.M. Recombinational DNA repair in bacteria and the RecA protein. Progr. Nucleic Acids Res. Mol. Biol., 1999, v. 63, p. 311-366.

90. Cox M.M. The bacterial RecA protein as a motor protein. Annu. Rev. Microbiol., 2003, v. 57, p. 551-577.

91. Cox M.M. The bacterial RecA protein: structure, function, and regulation. — Topics in Current Genetics, Ed.: S. Hohmann, N.-Y.: Springer, 2007, 524 p., p. 53-94.

92. Dahan-Grobgeld E., Livneh Z., Maretzek A.F., Polak-Charcon S., Eichenbaum Z., Degani H. Reversible induction of ATP synthesis by DNA damage and repair in Escherichia coli. In vivo NMR studies. J. Biol. Chem., 1998, v. 273, № 46, p. 30232-30238.

93. Daly M.J., and Minton K.W. An alternative pathway of recombination of chromosomal fragments precedes recA-dependent recombination in the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans. J. Bacterid., 1996, v. 178, № 15, p. 4461-4471.

94. Dean C.J., Feldschreiber P., and Lett J.T. Repair of X-ray damage of the deoxyribonucleic acid in Micrococcus radiodurans. Nature, 1966, v. 209, № 5018, p. 49-52.

95. Dean C.J., Little J.G., and Serianni R.W. The control of post irradiation DNA breakdown in Micrococcus radiodurans. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1970, v. 39, № 1, p. 126-134.

96. Delaney J.M. A grpE mutant of Escherichia coli is more resistant to heat than the wild type J. Gen. Microbiol., 1990, v. 136, № 5, p. 797-801.

97. Delaney J.M. Requirement of the Escherichia coli dnaK gene for thermotolerance and protection against H202 J. Gen. Microbiol., 1990, v. 136, № 10, p. 2113-2118.

98. Demple В., Amabile-Cuevas C.F. Redox redux: the control of oxidative stress responses. — Cell, 1991, v. 67, №5, p. 837-839.

99. Demple В., Halbrook J., Linn S. Escherichia coli xth mutants are hypersensitive to hydrogen peroxide. J Bacterid., 1983, v. 153, № 2, p. 1079-1082.

100. Dianov G., Price A., and Lindahl T. Generation of single-nucleotide repair patches following excision of uracil residues from DNA. -Mol. Cell. Biol., 1992, v. 12, № 4, p. 1605-1612.

101. Dillingham M.S., Spies M., and Kowalczykowski S.C. RecBCD enzyme is a bipolar helicase. -Nature, 2003, v. 423, № 6942, p. 893-897.

102. Dobson P.P. and Walker G.C. Plasmid (pKMIOl)-mediated Weigle reactivation in Escherichia coli K12 and Salmonella typhimurium LT2: genetic dependence, kinetics of induction, and effect of chloramphenicol. -Mutat. Res., 1980, v. 71, № 1, p. 25-41.

103. Dodson L.A., and Hadden C.T. Capacity for postreplication repair correlated with transducibility in Rec" mutants of Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 1980, v. 144, № 2, p. 608-615.

104. Dodson L.A., and Hadden C.T. Postreplication repair of deoxyribonucleic acid and daughter strand exchange in Uvr" mutants of Bacillus subtilis. — J. Bacteriol., 1980, v. 144, № 2, p. 840843.

105. Donnelly C.E. and Walker G.C. groE mutants of Escherichia coli are defective in umuDC-dependent UV mutagenesis. J. Bacteriol., 1989, v. 171, № 11, p. 6117-6125.

106. Dowden S.B. and Strike P. R46-derived recombinant plasmids affecting DNA repair and mutation in£. coli. Mol. Gen. Genet., 1982, v. 186, № 1, p. 140-144.

107. Drabble W.T. and Stocker B.A.D. R (transmissible -drug-resistance) factors in Salmonella typhimurium: pattern of transduction of phage P22 and ultraviolet-protection effect. J. Gen. Microbiol., 1968, v. 53, № 1, p.109-123.

108. Earl A.M., Mohundro M.M., Mian I.S., Battista J.R. The IrrE protein of Deinococcus radiodurans R1 is a novel regulator of recA expression. J. Bacteriol., 2002, v. 184, № 22, p. 6216-6224.

109. Egginton J.M., Haruta N., Wood E.A., Cox M.M. The single-stranded DNA-binding protein of Deinococcus radiodurans. BMC Microbiol., 2004, v. 4, № 2, p. 1-12.

110. Eggler A.L., Lusetti S.L., and Cox M.M. The C-terminus of the E. coli RecA protein modulates the DNA binding competition with SSB. J. Biol. Chem., 2003, v. 278, № 18, p. 16389-16396.

111. Eisen J.A., and Hanawalt P.C. A phylogenomic study of DNA repair genes, proteins, and processes. Mutat. Res., 1999, v. 435, № 3, p. 171-213.

112. Ennis D.G., Amundsen S.K., and Smith G.R. Genetic functions promoting homologous recombination in Escherichia coli: a study of inversion in phage X. Genetics, 1987, v. 115, №1,p. 11-24.

113. Erdman I.E., Thatcher F.S., MacQueen K.F. Studies on the irradiation of microorganisms in relation to food preservation. П. Irradiation resistant mutants. Can. J. Microbiol., 1961, v. 7. №2, p. 207-215.

114. Erickson J.W., Gross C.A. Identification of the sigma E subunit of Escherichia coli RNA polymerase: a second alternate sigma factor involved in high-temperature gene expression. -Genes Dev., 1989, v. 3, № 9, p. 1462-1471.

115. Ewing D. The directed evolution of radiation resistance in E. coli Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995, v. 216, № 2, p. 549-553.

116. Falnes P.0, Johansen R.F., Seeberg E. AlkB-mediated oxidative demethylation reverses DNA damage in Escherichia coli. Nature, 2002, v. 419, № 6903, p. 178-182.

117. Fang L., Hou Y., Inouye M. Role of the cold-shock region in the 5' untranslated region of the cspA mRNA in its transient expression at low temperature in Escherichia coli J. Bacteriol., 1998, v.180, № l,p. 90-95.

118. Fang L., Jiang W., Bae W., Inouye M. Promotor-independent cold-shock induction of cspA and its derepression at 37° by mRNA stabilization Mol. Microbiol., 1997, v. 23, № 2, p. 355-364.

119. Farr S.B., and Kogoma T. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Microbiol. Rev., 1991, v. 55, № 4, p. 561-585.

120. Faulds D., Dower N., Stahl M.M., and Stahl F.W. Orientation-dependent recombination hotspot activity in bacteriophage A,. J. Mol. Biol., 1979, v. 131, № 4, p. 681-695.

121. Fee J.A. Regulation of sod genes in Escherichia coli: relevance to superoxide dismutase function. Mol. Microbiol., 1991, v. 5, № 11, p. 2599-2610.

122. Feinstein S.I., and Low K.Bi Hyper-recombining recipient strains in bacterial conjugation. -Genetics, 1986, v. 113, № 1, p. 13-33.

123. Fischer G., Schmid F.X. The mechanism of protein folding. Implications of in vitro refolding models for de novo protein folding and trans location in the cell. Biochemistry, 1990, v. 29, № 9, p. 2205-2212.

124. Flores M.J., Sanchez N., Michel B. A fork-clearing role for UvrD. Mol. Microbiol., 2005, v. 57, p. 1664-1675.

125. Foster P.L., Trimarchi J.M., and Maurer R.A. Two enzymes, both of which process recombination intermediates, have opposite effects on adaptive mutation in Escherichia coli. — Genetics, 1996, v. 142, №1, p. 25-37.

126. Freist W., Gauss D.H. Lysyl-tRNA synthetase. Biol. Chem. Hoppe Seyler, 1995, v. 376, № 8, p. 451-472.

127. Friedberg E.C., Walker G.C., and Siede W. DNA repair and mutagenesis. Washington, D.C.: ASM Press, 1995.

128. Fujita M.Q., Yoshikawa H., and OgasawaraN. Structure of dnaA region of Pseudomonas putida: conservation among three bacteria, Bacillus subtilis, Escherichia coli and P. putida. Mol. Gen. Genet., 19S9, v. 215, № 3, p. 381-387.

129. Galitski Т., and Roth J.R. Pathways for homologous recombination between chromosomal direct repeats in Salmonella typhimurium. — Genetics, 1997, v. 146, № 3, p. 751-767.

130. Gao G., Tian В., Liu L., Sheng D., Shen В., Hua Y. Expression of Deinococcus radiodurans PprI enhances the radioresistance of Escherichia coli. DNA Repair. 2003, v. 2, № 12, p. 141927.

131. Gasparutto D., Dherin C., Boiteux В., and Cadet J. Excision of 8-methylguanine site-specifically incorporated into oligonucleotide substrates by AlkA protein of Escherichia coli. DNA Repair, 2002, v. 1,№ 6, p. 437-447.

132. Georgopoulos C., Ang D. The Escherichia, coli groE chaperonins. — Semin. Cell Biol., 1990, v. 1, № l,p. 19-25.

133. Gibson F.P., Leach D.R., and Lloyd R.G. Identification of sbcD mutations as cosuppressors of recBC that allow propagation of DNA palindromes in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol., 1992, v. 174, № 4, p. 1222-1228.

134. Gillen J.R., Willis D.K., and Clark A.J. Genetic analysis of the RecE pathway of genetic recombination in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol., 1981, v. 145, № 1, p. 521-532.

135. Ginsburg H., Edmiston S.H., Harper J., Mount D.W. Isolation and characterization of an operator-constitutive mutation in the recA gene of E. coli K-12. — Mol. Gen. Genet., 1982, v. 187, № 1, p. 4-11.

136. Glassberg J., Meyer R.R., and Komberg A. Mutant single-strand binding protein of Escherichia coli: genetic and physiological characterization. J. Bacteriol., 1979, v. 140, № 1, p. 14-19.

137. Glickman B.W. rorA mutation of Escherichia coli K-12 affects the recB subunit of exonuclease V. J. Bacteriol., 1979, v. 137, № 1, p. 658-660.

138. Glickman B.W., Zwenk H., Van Sluis C.A., and Rorsch A. The isolation and characterization of an X-ray-sensitive ultraviolet-resistant mutant of Escherichia coli. — Biochim. Biophys. Acta, 1971, v. 254, № 1, p. 144-154.

139. Goerlich О., Quillardet P., Hofnung M. Induction of the SOS response by hydrogen peroxide in various Escherichia coli mutants with altered protection against oxidative DNA damage. — J. Bacterid., 1989, v. 171, № 11, p. 6141-6147.

140. Goff S.A., Goldberg A.L. Production of abnormal proteins in E. coli stimulates transcription of Ion and other heat shock genes. Cell, 1985, v. 41, № 2, p. 587-595.

141. Goldstein J., Pollitt N.S., Inouye M. Major cold shock protein of Escherichia coli Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1990, v. 87, № 1, p, 283-287.

142. Goze A. and Devoret R. Repair promoted by plasmid pKMIOl is different from SOS repair. Mutat. Res., 1979, v. 61, № 1, p. 163-179.

143. Grant R.A., Filman D.J., Finkel S.E., Kolter R., Hogle J.M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Natl Struct. Biol., 1998, v. 5, № 4, p. 294-303.

144. Graumann P. L., Marahiel M.A. Cold shock proteins CspB and CspC are major stationary-phase-induced proteins in Bacillus subtilis. Arch. Microbiol., 1999, v. 171, № 2, p. 135-138.

145. Graumann P., Marahiel M.A. Some like it cold: response of microorganisms to cold shock. — Arch. Microbiol., 1996, v. 166, № 5, p. 293-300.

146. Gray W.J., Green M.H., and Bridges B.A. DNA synthesis in gamma-irradiated recombination deficient strains of Escherichia coli. J. Gen. Microb., 1972, v. 71, № 2, p. 359-366.

147. Grecz N., Jaw R., McGarry T. J. Genetic control of heat resistance and thermotolerance by recA and uvrA in£. coli K12. Mutation Res., 1985, v. 145, № 3, p. 113-118.

148. Grimaud R., Ezraty В., Mitchell J.K., Lafitte D., Briand C., Derrick P.J., Barras F. Repair of oxidized proteins. Identification of a new methionine sulfoxide reductase. J. Biol. Chern., 2001, v. 276, № 52, p. 48915-48920.

149. Groisman E.A., Castilho B.A., Casadaban M.J. In vivo cloning and adjacent gene fusing with a mini-Mu-/ac bacteriophage containing a plasmid replicon. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1984, v. 81, №5, p. 1480-1483.

150. Gross J.D., Grunstein J., and Witkin E.M. Inviability of recA' derivatives of the DNA polymerase mutant of De Lucia and Cairns. J. Mol. Biol., 1971, v. 58, № 2, p. 631-634.

151. Grossman A.D., Erickson J.W., Gross C.A. The htpR gene product of E. coli is a sigma-factor. -Cell, 1984, v. 38, № 2, p: 383-390.

152. Grossman L. Enzymes involved in the repair of damaged DNA. Arch. Biochem. Biophys., 1981, v. 211, №2, p. 511-522.

153. Grove A., Wilkinson S.P. Differential DNA binding and protection by dimeric and dodecameric forms of the ferritin homolog Dps from Deinococcus radiodurans. J. Mol. Biol., 2005, v. 347, № 3, p. 495-508.

154. Gualerzi С., Brandi A., Falcone M., 1994 неопубликованные данные.

155. Guerrero R., Llagostera M., Villaverde A., Barbe J. Changes in ATP concentration in Escherichia coli during induction of the SOS system by mitomycin С and bleomycin. — J. Gen. Microbiol., 1984, v. 130, № 9, p. 2247-2251.

156. Gur E., Biran D., Shechter N., Genevaux P., Georgopoulos C., and Ron E.Z. The Escherichia coli DjlA and CbpA proteins can substitute for DnaJ in DnaK-mediated protein disaggregation. -J. Bacteriol., 2004, v. 186, № 21, p. 7236-7242.

157. Gutman P.D., Carroll J.D., Masters C.I., Minton K.W. Sequencing, targeted mutagenesis and expression of a recA gene required for the extreme radioresistance of Deinococcus radiodurans. Gene, 1994, v. 141, № 1, p. 31-7.

158. Hall S.D., and Kolodner R.D. Homologous pairing and strand exchange promoted by the Escherichia coli RecT protein. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1994, v. 91, № 8, p. 3205-3209.

159. Hanawalt P.C. The U.V. sensitivity of bacteria: its relation to the DNA replication cycle. — Photochem. Photobiol., 1966, v. 5, № 1, p. 1-12.

160. Hanawalt P.C., Cooper P.K., Ganesan A.K., and Smith C.A. DNA repair in bacteria and mammalian cells. Annu. Rev. Biochem., 1979, v. 48, p. 783-836.

161. Harmon F.G., and Kowalczykowski S.C. RecQ helicase, in concert with RecA and SSB proteins, initiates and disrupts DNA recombination. Genes Dev., 1998, v. 12, № 8, p. 1134-1144.

162. Harris D.R., Tanaka M., Saveliev S.V., Jolivet E., Earl A.M., Сох M.M., Battista J.R. Preserving genome integrity: the DdrA protein of Deinococcus radiodurans Rl. PLoS. Biol., 2004, v. 2, № 10, p. e304.

163. Hendrick J.P., and Hartl F.-U. Molecular chaperone function of heat-shock proteins. Annu. Rev. Biochem., 1993, v. 62, p. 349-384.

164. Hengge-Aronis R. Survival of hunger and stress: the role of rpoS in early stationary phase gene regulation in E. coli. Cell, 1993, v. 72, № 2, p. 165-168.

165. Hidalgo E., Ding H., Demple B. Redox signal transduction via iron-sulfur clusters in the SoxR transcription activator. Trends Biochem. Sci., 1997, v. 22, № 6, p. 207-210.

166. Higashitani A., Ishii Y., Kato Y., Koriuchi K. Functional dissection of a cell-division inhibitor, SulA, of Escherichia coli and its negative regulation by Lon. Mol. Gen. Genet., 1997, v. 254, №4, p. 351-357.

167. Holliday R. A mechanism for gene conversion in fungi. — Genet. Res., 1964, v. 5, p. 282-304.

168. Horii Z.-I., and Clark A.J. Genetic analysis of the RecF pathway of genetic recombination in Escherichia coli K-12: isolation and characterization of mutants. J. Mol. Biol., 1973, v. 80, № 2, p. 327-344.

169. Horiuchi Т., and Fujimura Y. Recombinational rescue of the stalled DNA replication fork: a model based on analysis of an Escherichia coli strain with a chromosomal region difficult to replicate. J. Bacterid., 1995, v. 177, № 3, p. 783-791.

170. Horn G., Hofweber R., Kremer W., Kalbitzer H.R. Structure and function of bacterial cold shock proteins. Cell Mol. Life Sci., 2007, v. 64, № 12, p. 1457-1470.

171. Horwich A.L., E.U. Weber-Ban and D. Finley. Chaperone rings in protein folding and degradation. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1999, v. 96, № 20, p. 11033-11040.

172. Howard-Flanders P. DNA repair and recombination. Br. Med. Bull., 1973, v. 29, № 3, p. 226235.

173. Howard-Flanders P., Theriot L., and Stedeford J.B. Some properties of excision-defective recombination-deficient mutants of Escherichia coli K-12. J. Bacterid., 1969, v. 97, № 3, p. 1134-1141.

174. Howarth S. Resistance to the bactericidal effect of ultraviolet radiation conferred on enterobacteria by the colicin factor Coli. J. Gen. Microbiol., 1965, v. 40, № 1, p. 43-55.

175. Hsieh P., Camerini-Otero C.S., and Camerini-Otero R.D. The synapsis event in the homologous pairing of DNAs: RecA recognizes and pairs less than one helical repeat1 of DNA. — Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1992, v. 89, № 14, p. 6492-6496.

176. Ни K.H., Liu E., Dean K., Gingras M., DeGraff W., Trun N.J. Overproduction of three genes leads to camphor resistance and chromosome condensation in Escherichia coli. Genetics, 1996, v. 143, № 4, p. 1521-1532.

177. Jeggo P. Isolation and characterization of Escherichia coli K-12 mutants unable to induce the adaptive response to simple alkylating agents. J. Bacteriol., 1979, v. 139, № 3, p. 783-791.

178. Jeggo P., Defais M., Samson L., and Schendel P. An adaptive response of E. coli to low levels of alkylating agent: comparison with previously characterized DNA repair pathways. Mol. Gen. Genet., 1977, v. 157, № 1, p. 1-9.

179. Jiang W., Hou Y., Inouye M. CspA, the major cold-shock protein of Escherichia coli, is an RNA chaperone. J. Biol. Chem., 1997, v. 272, № 1, p. 196-202.

180. Jones P.G., Inouye M. The cold-shock response: a hot topic. — Mol. Microbiol., 1994, v. 11, № 5, p. 811-818.

181. Jones P.G., Mitta M., Kim Y., Jiang W., Inouye M. Cold shock induces a major ribosomal-associated protein that unwinds double-stranded RNA in Escherichia coli. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1996, v. 93, № 1, p. 76-80.

182. Jones P.G.,Van Bogelen R.A., Neidhardt F.C. Induction of proteins in response to low temperature in Escherichia coli. J.Bacteriol., 1987, v. 169, № 5, p. 2992-2095.

183. Kalinin V.L., Kuznetsova L.V., Verbenko V.N. Is main cold stress CspA protein negative regulator of heat-shock proteins in E. coli? Abstr. Meet. "Molecular Genetics of Bacteria and Phages", Cold Spring Harbor Lab., 1995, p. 128.

184. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Krup'yan E.P. Preliminary mapping of Escherichia coli gaml2 mutation enhancing heat-shock synthesis at normal temperature. PNPI Res. Reports, 1996-1997, p.298.

185. Kalinin V.L., Verbenko V.N., Kuznetsova L.V., Krup'yan E.P. Rec-functions in enhanced radiation resistance of Escherichia coli K-12 Gamr mutants. PNPI Res. Reports, 1996-1997. Gatchina, 1998, p. 296.

186. Kandror O., Goldberg A.L. Trigger factor is induced upon cold shock and enhances viability of Escherichia coli at low temperatures. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, № 10, p. 49784981.

187. Kannan. P., Dharmalingam K. Induction of the inhibitor- of RecBCD enzyme is a lexA-independent SOS response. Curr. Microbiol., 1990, v. 21, № 1, p. 7.

188. Karu A.E., and Belk E.D. Induction of E. coli recA protein via recBC and alternative pathways: quantitation by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). — Mol. Gen. Genet., 1982, v. 185, № 2, p. 275-282.

189. Karu A.E., MacKay V., Goldmark P.J., and Linn S. The RecBC deoxyribonuclease of Escherichia coli K-12. Substrate specificity and reaction intermediates. J. Biol. Chem., 1973, v. 248, № 14, p. 4874-4884.

190. Karu A.E., Sakaki Y., Echols H, and Linn S. The у protein specified by bacteriophage A. Structure and inhibitory activity for the RecBC enzyme of Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1975, v. 250, № 18, p. 7377-7387.

191. Kato Т., Nakano E. Effects of the итиСЗб mutation on ultraviolet radiation-induced base change and frameshift mutations in Escherichia coli. — Mutat. Res., 1981, v. 83. № 3, p. 307-319.

192. Kawasaki Y., Wada C., Yura T. Roles of Escherichia coli heat shock proteins in mini-F plasmid replication. Mol. Gen. Genet., 1990, v. 220, № 2, p. 277-282.

193. Kenyon C.J., and Walker G.C. Expression of the E. coli uvrA gene is inducible. Nature, 1981, v. 289, №5800, p. 808-810.

194. Keyer K., Gort A.S., bnlay J.A. Superoxide and the production of oxidative DNA damage. J. Bacterid., 1995, v. 177, № 23, p. 6782-6790.

195. Kim J.I., Cox M.M. The RecA proteins of Deinococcus radiodurans and Escherichia coli promote DNA strand exchange via inverse pathways. Proc. Natl Acad Sci. USA, 2002, v. 99, № 12, p. 7917-7921.

196. Klinkert M.Q., Klein A., and Abdel-Monem M. Studies on the function of DNA helicase I and DNA helicase II of Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1980, v. 255, № 20, p. 9746-9752.

197. Kobayashi I., and Takahashi N. Double-stranded gap repair of DNA by gene conversion in Escherichia coli. Genetics, 1988,- v. 119, № 9, p. 751-757.

198. Kogoma T. Recombination by replication. Cell, 1996, v. 85, № 5, p. 625-627.

199. Kogoma T. Stable DNA replication: interplay between DNA replication, homologous recombination, and transcription. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1997, v. 61, № 2, p. 212-238.

200. Kogoma Т., Cadwell G.W., Barnard K.G., Asai T. The DNA replication priming protein, PriA, is required for homologous recombination and double-strand break repair. J. Bacteriol., 1996, v. 178, №5, p. 1258-1264.

201. Kohara Y., Akiyama K., Isono K. The physical map of the whole E. coli chromosome: application of a new strategy for rapid analysis and sorting of a large genomic library. Cell, 1987, v. 50, №3, p. 495-508.

202. Kolodner R., Fishel R.A., and Howard M. Genetic recombination of bacterial plasmid DNA: effect of RecF pathway mutations on plasmid recombination in Escherichia coli. — J. Bacteriol., 1985, v. 163, № 3, p. 1060-1066.

203. Kowalczykowski S.C. Biochemistry of genetic recombination: energetics and mechanism of DNA strand exchange. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 1991, v. 20, p. 539-575.

204. Kowalczykowski S.C., and Eggleston A.K. Homologous pairing and DNA strand-exchange proteins. Annu. Rev. Biochem., 1994, v. 63, p. 991-1043.

205. Kowalczykowski S.C., Dixon D.A., Eggleston A.K., Lauder S.D., and Rehrauer W.M. Biochemistry of homologous recombination in Escherichia coli. — Microbiol. Rev., 1994, v. 58, № 3, p. 401-465.

206. Krasin F., and Hutchinson F. Repair of DNA double-strand breaks in Escherichia coli, which requires recA function and the presence of a duplicate genome. — J. Mol. Biol., 1977, v. 116, № l,p. 81-98.

207. Krisch R.E., Flick M.B., and Trumbore C.N. Radiation chemical mechanisms of single- and double-strand break formation in irradiated SV40 DNA. Radiat. Res., 1991, v. 126, № 2, p. 251-259.

208. Krisch R.E., Krasin F., and Sauri C.J. DNA breakage, repair and lethality after 125I decay in rec+ and recA strains of Escherichia coli. Int. J. Radiat. Biol., 1976, v. 29, № 1, p. 37-50.

209. Krueger J.H., Walker G.C. groEL and dnaK genes of Escherichia coli are induced by UV irradiation and nalidixic acid in an htpR+-dependent fashion. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1984, v. 81, №3, p. 1499-1503.

210. Kuhl S.A., Zimmer J.A., Rohatgi P. Complementation of bacteriophage induction and recombination defects in Escherichia coli RecA" mutants by expression of the cloned T4 bacteriophage »v^gene. Curr. Microbiol., 2003, v. 46, № 2, p. 88-93.

211. Kulakauskas S., Wikstrom P.M., Berg D.E. Efficient introduction of cloned mutant alleles into the Escherichia coli chromosome. J. Bacteriol., 1991, v. 171, № 8, p. 2633-2638.

212. Kumura К., and Sekiguchi M. Identification of the uvrD gene product of Escherichia coli as DNA helicase II and its induction by DNA damaging agents. J. Biol. Chem., 1984, v. 259, № 3, p. 1560-1565.

213. Kushner S.R., Nagaishi H., Templin A., and Clark A.J. Genetic recombination in Escherichia coli\ the role of exonuclease I. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1971, v. 68, № 4, p. 824-827.

214. Kuzminov A. Collapse and repair of replication forks in Escherichia coli. — Mol. Microbiol., 1995, v. 16, №3, p. 373-384.

215. Kuzminov A. Instability of inhibited replication forks in E. coli. Bioessays, 1995, v. 17, № 8, p. 733-741.

216. Kuzminov A. Recombinational repair of DNA damage in Escherichia coli and bacteriophage X.- Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1999, v. 63, № 4, p. 751-813.

217. Kuzminov A. Unraveling the late stages of recombinational repair: metabolism of DNA junctions in Escherichia coli. Bioessays, 1996, v. 18, № 9, p. 757—765.

218. Kuzminov A., and Stahl F.W. Double-strand end repair via the RecBC pathway in Escherichia coli primes DNA replication. — Genes Dev., 1999, v. 13, № 3, p. 345-356.

219. Kuzminov A., and Stahl F.W. Stability of linear DNA in recA mutant Escherichia coli cells reflects ongoing chromosomal DNA degradation. J. Bacterid., 1997, v. 179, № 3, p. 880-888.

220. Madiraju M.V., Lavery P.E., Kowalczykowski S.C., Clark AJ. Enzymatic properties of the RecA803 protein, a partial suppressor of recF mutations. Biochemistry, 1992, v. 31, № 43, p. 10529-10535.

221. Madiraju M.V., Templin A., Clark AJ. Properties of a mutant rec^-encoded protein reveal a possible role for Escherichia coli recF-encoded protein in genetic recombination. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1988, v. 85, № 18, p. 6592-6596.

222. Mahajan S.K. Pathways of homologous recombination in Escherichia coli. — Genetic recombination (Kucherlapati R. and Smith G. R. ed.). Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1988. p. 87-140.

223. Mahdi A.A., Lloyd R.G. Identification of the recR locus of Escherichia coli K-12 and analysis of its role in recombination and DNA repair. Mol. Gen. Genet., 1989, v. 216, № 2-3, p. 503-510.

224. Makarova K.S., Aravind L., Grishin N.V., Rogozin I.B., Koonin E.V. A DNA repair system specific for thermophilic Archaea and bacteria predicted by genomic context analysis. Nucleic Acids Res., 2002, v. 30, № 2, p. 482-496.

225. Mandal T.N., Mahdi A.A., Sharpies G.J., Lloyd R.G. Resolution of Holliday intermediates in recombination and DNA repair: indirect suppression of ruvA, ruvB, and ruvC mutations. — J. Bacteriol., 1993, v. 175, № 14, p. 4325^1334.

226. Maples V.F., Kushner S.R. DNA repair in Escherichia coli: Identification of the uvrD gene product. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, № 18, p. 5616-5620.

227. Margerrison E.E.C., Hopewell R., Fisher L.M. Nucleotide sequence of the Staphylococcus aureus gyrB-gyrA locus encoding the DNA gyrase A and В proteins. J. Bacteriol., 1992, v. 174, №5, p. 1596-1603.

228. Marians K.J. Prokaryotic DNA replication. Annu. Rev. Biochem., 1992, v. 61, p. 673-719.

229. Marsden H.S., Pollard E.C., Ginoza W., Randall E.P. Involvement of recA and exr genes in the in vivo inhibition of the RecBC nuclease. J. Bacteriol., 1974, v. 118, № 2, p. 465-470.

230. Marsic N., Roje S., Stojiljkovic I., Salaj-Smic E., Trgovcevic Z. In vivo studies on the interaction of RecBCD enzyme and A. Gam protein. -J. Bacteriol., 1993, v. 175, № 15, p. 47384743.

231. Marsic N., Salaj-Smic E., Stojiljkovic I., Trgovcevic Z. Interaction of Gam protein with the RecD subunit of RecBCD enzyme increases radioresistance of the wild-type Escherichia coli. -Biochim., 1991, v. 73, № 4, p. 501-503.

232. Martins A., Shuman S. An RNA ligase from Deinococcus radiodurans. J. Biol. Chem., 2004, v. 279, № 49, p. 50654-50661.

233. Matijasevic Z, Sekiguchi M, Ludlum DB. Release of N2,3-ethenoguanine from chloroacetaldehyde-treated DNA by Escherichia coli 3-methyladenine DNA glycosylase II. -Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1992; v. 89, № 19, p. 9331-9334.

234. Matson S.W. DNA helicases of Escherichia coli. Progr. Nucleic Acids Res. Mol. Biol., 1991, v. 40, p. 289-326.

235. Matson S.W., Bean D.W., George J.W. DNA helicases: enzymes with essential role in all aspects of DNA metabolism. BioEssays, 1994, v. 16, № 1, p. 13-22.

236. Mattimore V., Battista J.R. Radioresistance of Deinococcus radiodurans: functions necessary to survive ionizing radiation are also necessary to survive prolonged desiccation. J. Bacteriol., 1996, v. 178, №3, p. 633-637.

237. McKittrick N.H., Smith G.R. Activation of Chi recombinational hotspots by RecBCD-like enzymes from enteric bacteria. J. Mol. Biol., 1989, v. 210, № 3, p. 485-495.

238. McPartland A., Green L., Echols H. Control of recA gene RNA in E. coli: regulatory and signal genes. Cell, 1980, v. 20, № 3, p. 731-737.

239. Meddows T.R., Savory A.P., Grove J.I., Moore Т., Lloyd R.G. RecN protein and transcription factor DksA combine to promote faithful recombinational repair of DNA double-strand breaks. -Mol. Microbiol., 2005, v. 57, № 1, p. 97-110.

240. Meima R., Rothfuss H.M., Gewin L., Lindstrom M.E. Promoter cloning in the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans. J. Bacteriol., 2001, v. 183, № 10, p. 3169-3175.

241. Mendonca V.M., Klepin H.D., Matson S.W. DNA helicases in recombination and repair: construction of a A uvrD khelD krecQ mutant deficient in recombination and repair. J. Bacteriol., 1995, v. 177, № 5, p. 1326-1335.

242. Mendonca V.M., Matson S.W. Genetic analysis of AhelD and A uvrD mutations in combination with other genes in the RecF recombination pathway in Escherichia coli: suppression of a ruvB mutation by a uvrD deletion. Genetics, 1995, v. 141, № 2, p. 443-452.

243. Meyer R.R., Voegele D.W., Ruben S.M., Rein D.C., Treln J'.M. Influence of single-stranded DNA-binding protein on recA induction. Mutat. Res. 1982, v. 94; № 2, p. 299-313.

244. Miesel L., Roth J.R. Evidence that SbcB and RecF pathway functions contribute to RecBCD-dependent transductional recombination. J. Bacteriol., 1996, v. 178, № 11, p. 3146-3155.

245. Miller J. A Short Course in Bacterial Genetics, 2-nd Edition. Cold Sprind Harbor: Cold Sprind Harbor Laboratory Press, 1992.

246. Minton K.W. Repair of ionizing-radiation damage in the radiation resistant bacterium Deinococcus radiodurans. Mutat. Res., 1996, v. 363, № 1, p. 1—7.

247. Minton K.W., and Daly M.J. A model for repair of radiation-indiced DNA double strand breaks in the extreme radiophile Deinococcus radiodurans. — BioEssays, 1995, v. 17, № 5, p. 457—464.

248. Mitchel R.E.J., Morrison D.P. Heat-shock induction, of ionizing radiation resistance in Saccharomyces cerevisiae, and correlation with stationary growth phase. Radiation Res., 1982, v. 90, №2, p. 284-291.

249. Mitchell R.E.J., Morrison- D.P. Heat-shock induction of ionizing radiation resistance- in Saccharomyces cerevisiae. Transient changes in growth cycle distribution and recombinational activity. Radiat. Res., 1982, v. 92, № 1, p. 182-187.

250. Mitra S., Pal B.C., and Foote R.S. 06-Methylguanine-DNA methyltransferase in wild-type and ada mutants of Escherichia coli. J. Bacteriol., 1982, v. 152, № 1, p. 534-537.

251. Mizusawa S. and Gottesman S. Protein degradation in Escherichia coli: The Ion gene controls the stability of SulA protein. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1983, v. 80, № 2, p. 358-362.

252. Modrich P. Mechanisms and biological effects of mismatch repair. Annu. Rev. Genet., 1991, v. 25, p. 229-253.

253. Modrich P. Mismatch repair, genetic stability, and cancer. Science, 1994, v. 266, № 5193, p. 1959-1960.

254. Molineux I.J., Gefter M.L. Properties of the Escherichia coli DNA-binding (unwinding) protein interaction with nucleolytic enzymes and DNA. J. Mol. Biol., 1975, v. 98, № 4, p. 811-825.

255. Monk M., Kinross J. Conditional lethality of recA and recB derivatives of a strain of Escherichia coli K-12 with a temperature-sensitive deoxyribonucleic acid polymerase I. — J. Bacteriol., 1972, v. 109, №3, p. 971-978.

256. Monti-Bragadin C., Babudri N., and Samer L. Expression of the plasmid pKM 101-determined repair system in recA' and lex strains of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet., 1976, v. 145, №. 3, p. 303-306.

257. Morel P., Hejna J.A., Ehrlich S.D., Cassuto E. Antipairing and strand transferase activities of E. coli helicase-II (UvrD). Nucleic Acids Res., 1993, v. 21, №14, p. 3205-3209.

258. Morel-Deville F., Ehrlich S.D. Theta-type DNA replication stimulates homologous recombination in the Bacillus subtilis chromosome. Mol. Microbiol., 1996, v. 19, № 3, p. 587— 598.

259. Morgan P.E., Dean R.T., Davies M.J. Protective mechanisms against peptide and protein peroxides generated by singlet oxygen. Free Radic. Biol. Med., 2004, v. 36, № 4, p. 484-496.

260. Morimatsu K., Kowalczykowski S.C. RecFOR proteins load RecA protein onto gapped DNA to accelerate DNA strand exchange: a universal step of recombinational repair. Mol. Cell. 2003, v. 11, №5, p. 1337-1347.

261. Morimyo M. Anaerobic incubation enhances the colony formation of a polA recB strain of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol., 1982, v. 152, № 1, p. 208-214.

262. Moseley B.E.B., and Copland H.J.R. Isolation! and properties of a recombination-deficient mutant of Micrococcus radiodurans. J". Bacteriol., 1975, v. 122, № 2; p. 422-428.

263. Moskovitz J. Methionine sulfoxide reductases: ubiquitous enzymes involved in antioxidant defense, protein regulation, and prevention of aging-associated diseases. — Biochim. Biophys. Acta, 2005, v. 1703, № 2, p. 213-219.

264. Moskovitz J., Weissbach H., Brot N. Cloning the expression of a mammalian gene involved in the reduction of methionine sulfoxide residues in proteins. — Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1996, v. 93, № 5, p. 2095-2099.

265. Mudgett J.S., Taylor W.D. Reciprocal and non-reciprocal homologous recombination between Escherichia coli chromosomal DNA and ultraviolet light-irradiated plasmid DNA. Gene, 1986, v. 19, №2, p. 235-244.

266. Muller В., Boehmer P.E., Emmerson P.T., West S.C. Action of RecBCD enzyme on Holliday structures made by RecA. J. Biol. Chem., 1991, v. 266, № 28, p.19028-19033.

267. Mulvey M.R., Loewen P.C. Nucleotide sequence of katF of Escherichia coli suggests KatF protein is a novel sigma transcription factor. Nucleic Acids Res., 1989, v. 17, № 23, p. 99799991.

268. Murphy K.C. X Gam protein inhibits the helicase and %-stimulated recombination activities of Escherichia coli RecBCD enzyme. J. Bacteriol., 1991, v. 173, № 18, p. 5808-5821.

269. Myasnik M.N., Morozov I.I. The phenomenon of photoreactivation in bacteria E. coli irradiated by ionizing radiation. Int. J. Radiat. Biol., 1977, v. 31, № 1, p. 95-98.

270. Nagai H., Yusawa H., Yura T. Regulation of the heat shock response in E. coli: involvement of • • • •positive and negative c/s-acting elements in translational control of ст synthesis. Biochimie, 1991, v. 73, № 12, p. 1473-1479.

271. Nakabeppu Y., Mine Y., Sekiguchi M. Regulation of expression of the cloned ada gene in Escherichia coli. Mutat. Res., 1985, v. 146, № 2, p. 155-167.

272. Nakamura Y., Osawa Т., Yura T. Chromosomal location of a structural gene for the RNA polymerase sigma factor in Escherichia coli. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1977, v. 74, № 5, p. 1831-1835.

273. Naom I.S., Morton S J., Leach D.R.F., Lloyd R.G. Molecular organization of sbcC, a gene that affects genetic recombination and the viability of DNA palindromes in Escherichia coli K-12. -Nucleic Acids Res., 1989, v. 17, № 20, p. 8033-8045.

274. Narumi I., Satoh K., Cui S., Funayama Т., Kitayama S., Watanabe H. PprA: a novel protein from Deinococcus radiodurans that stimulates DNA ligation. — Mol. Microbiol., 2004, v. 54, № 1, p. 278-285.

275. Neidhardt F.C., VanBogelen R.A., Vaughn V. The genetics and regulation of heat-shock proteins. Annu. Rev. Genet., 1984, v. 18, p. 295-329.

276. Noda A., Courtright J.B., Denor P.F., Webb G., Kohara Y., Ishihama A. BioTechniques, 1991, v. 10, №4, p. 474-477.

277. Nunoshiba Т., Hidalgo E., Amabile Cuevas C.F., Demple B. Two-stage control of an oxidative stress regulon: the Escherichia coli SoxR protein triggers redox-inducible expression of the soxS regulatory gene. J. Bacterid., 1992, v. 174, № 19, p. 6054-6060.

278. Nurse P., Zavitz K.H., Marians K.J. Inactivation of the Escherichia coli PriA DNA replication protein induces the SOS response. J. Bacterid., 1991, v. 173, № 21, p. 6686-6693.

279. Ogawa Т., Wabiko H., Tsurimoto Т., Horii Т., Masukata H., Ogawa H. Characteristics of purified recA protein and the regulation of its synthesis in vivo. — Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 1979, v. 43, Pt. 2, p. 909-915.

280. Oliveira C.L., de la Hoz L., Silva J.C., Torriani I.L., Netto F.M. Effects of gamma radiation on beta-lactoglobulin: oligomerization and aggregation. — Biopolymers, 2007, v. 85, № 3, p. 284294.

281. Раек K.H., Walker G.C. Escherichia coli dnaK null mutants are inviable at high temperature — J. Bacterid., 1987, v. 169, № 1, p. 283-290.

282. Paz-Elizur Т., Takeshita M., Goodman M., O'Donnell M., Livneh Z. Mechanism of translesion DNA synthesis by DNA polymerase II. Comparison to DNA polymerase I and III core. J. Biol. Chem., 1996, v. 271, № 40, p. 24662-24669.

283. Pelham H.R.B. Speculations on the functions of the major heat shock and glucose-regulated proteins. Cell, 1986, v. 46. № 7, p. 959-961.

284. Pellon J.R., Gomez R.F., Sinskey A.J. Association of the Escherichia coli nucleoid with protein synthesized during thermal treatment. In: Heat shock from bacteria to man. Gold Spring Harbor, 1982, p. 121-125.

285. Pembroke J.T., and Stevens E. The effect of plasmid R391 and. other IncJ plasmids on the survival of Escherichia coli after UV irradiation. — J. Gen. Microbiol., 1984, v. 130, №. 7, p. 1839-1844.

286. Perry K.L. and Walker G.C. Identification of plasmid (pKMlOl)-coded proteins involved in mutagenesis and UV resistance. Nature, 1982, v. 300, № 5889, p. 278-281.

287. Petit M.-A., Dimpfl J., Radman M., Echols H. Control of large chromosomal duplications in Escherichia coli by the mismatch repair system. — Genetics, 1991, v. 129, № 2, p. 327—332.

288. Petranovic M., Zahradka K., Zahradka D., Petranovic D., Nagy В., SalajSmic E., Petranovic D. Genetic evidence that the elevated levels of Escherichia coli helicase II antagonize recombinational DNA repair. Biochimie, 2001, v. 83, № 11-12, p. 1041-1047.

289. Phadtare S., Alsina J., Inouye M. Cold-shock response and cold-shock proteins. Curr. Opinion Microbiol., 1999, v. 2, № 2, p. 175-180.

290. Picksley S.M., Attfield P.V., and Lloyd R.G. Repair of DNA double-strand breaks in Escherichia coli K12 requires a functional recN product. Mol. Gen. Genet., 1984, v. 195, № 12, p. 267-274.

291. Picksley S.M., Lloyd R.G., Buckman C. Genetic analysis and regulation of inducible recombination in Escherichia coli K-12. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1984, v. 49, p. 469-474.

292. Pollard E.C., Fugate G.K. Relative rates of repair of single-strand breaks and post-irradiation DNA degradation in normal and induced cells of Escherichia coli. — Biophys. J., 1978, v. 24, № 2, p. 429^37.

293. Pollard E.C., Randall E.P. Studies on the inducible inhibitor of radiation-induced DNA degradation of Escherichia coli. -Radiat. Res., 1973, 55, № 2, p. 265-279.

294. Poole L.B., Ellis H.R. Flavin-dependent alkyl hydroperoxide reductase from Salmonella typhimurium. 1. Purification and enzymatic activities of overexpressed AhpF and AhpC proteins. Biochemistry, 1996, v. 35, № 1, p. 56-64.

295. Postel E.H., Abramczyk B.M. Escherichia coli nucleoside diphosphate kinase is a uracil-processing DNA repair nuclease. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2003, v. 100, № 23, p. 1324713252.

296. Prell A., Wackernagel W. Degradation of linear and circular DNA with gaps by the RecBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts. — Eur. J. Biochem., 1980, v. 105, № 1, p. 109-116.

297. Qiu Z., Goodman M.F. The Escherichia coli polB locus is identical to din A, the structural gene for DNA polymerase II. J. Biol. Chem., 1997, v. 272, № 13, p. 8611-8617.

298. Quillardet P., Huisman O, D'Ari R., and Hofhung M. SOS chromotest, a direct assay of induction of an SOS function in Escherichia coli K-12 to measure genotoxicity. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, № 19, p. 5971-5975.

299. Quillardet P., Moreau P.L., Ginsburg H., Mount D.W., Devoret R. Cell survival, UV-reactivation and induction of prophage lambda in Escherichia coli K12 overproducing RecA protein. Mol. Gen. Genet., 1982, v. 188, № 1, p. 37-43.

300. Quinones A., Piechocki R. Differential suppressor effects of the ssb-1 and ssb-113 alleles on uvrD mutator of Escherichia coli in DNA repair and mutagenesis. J. Basic Microbiol., 1987, v. 27, № 5, p. 263-273.

301. Radman M., Cordone L., Krsmanovic-Simic D., and Enera M. Complementary action of recombination and excision in the repair of ultraviolet irradiation damage to DNA. J. Mol. Biol., 1970, v. 49, № l, p. 203-212.

302. Raine S., Georgopoulos C. New Escherichia coli heat stress gene, htrC, whose product is essential for viability only at high temperatures J. Bacteriol., 1990, v. 172, № 6, p. 3417-3426.

303. Rajan R. and Bell C.E. Crystal structure of RecA from Deinococcus radiodurans: insights into the structural basis of extreme radioresistance. — J. Mol. Biol., 2004, v. 344, № 4, p. 951-963.

304. Rangarajan S., Woodgate R., Goodman M.F. Replication restart in UV-irradiated Escherichia coli involving pols II, III, V, PriA, RecA and RecFOR proteins. Mol. Microbiol., 2002, v. 43, №3, p. 617-628.

305. Rayssiguier C., Thaler D.S., Radman M. The barrier to recombination between Escherichia coli and Salmonella typhimurium is disrupted in mismatch-repair mutants. — Nature, 1989, v. 342, № 6248, p. 396-401.

306. Richet E., Nishimura Y., Hirota Y., Kohiyama M. Escherichia coli uvrD mutants with thermosensitive DNA-dependent adenosine triphosphatase I (helicase II). — Mol. Gen. Genet., 1983, v. 192, №3, p. 378-85.

307. Rinken R., Thomas В., Wackernagel W. Evidence that recBC dependent degradation of duplex DNA in Escherichia coli recD mutants involves DNA unwinding. — J. Bacteriol., 1992, v. 174, № 16, p. 5424-5429.

308. Roca A.I., Cox M.M. RecA protein: Structure, function, and role in recombinational DNA repair. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 1997, v. 56, p. 129-223.

309. Rockabrand D., Arthur Т., Korinek G., Livers K., Blum P. An essential role for the Escherichia coli DnaK protein in starvation-induced thermotolerance, H2O2 resistance, and reductive division. J. Bacteriol., 1995, v. 177, № 13, p. 3695-3703.

310. Rohankhedkar M.S., Mulrooney S.B., Wedemeyer W.J., Hausinger R.P. The AidB component of the Escherichia coli adaptive response to alkylating agents is a flavin-containing, DNA-binding protein. J. Bacteriol., 2006, v. 188, № 1, p. 223-230.

311. Rothman J.E. Polypeptide chain binding proteins: catalysis of protein folding and related processes in cells. Cell, 1989, v. 59, № 4, p. 591-601.

312. Roulland-Dussoix D. Degradation par la cellule hote du bacteriophage lambda par le rayonnement ultraviolet. Mutat. Res., 1967, v. 4, № 3, p. 241-252.

313. Ruben S.M., VanDenBrink-Webb S.E., Rein D.C., Meyer R.R. Suppression of the Escherichia coli ssb-1 mutation by an allele of groEL. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1988, v. 85, № 11, p. 3767-3771.

314. Runyon G.T., Bear D.G., Lohman T.M. Escherichia coli helicase II (UvrD) protein initiates DNA unwinding at nicks and blunt ends. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1990, v. 87, № 16, p. 6383-6387.

315. Rupp W.D., Howard-Flanders P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. — J. Mol. Biol., 1968, v. 31, №2, p. 291-304.

316. Salles В., Paoletti C. Control of UV induction of RecA protein. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1983, v. 80, № l,p. 65-69.

317. Samson L., and Cairns J. A new pathway for DNA repair in Escherichia coli. Nature (London), 1977, v. 267, № 5608, p. 281-283.

318. Sancar A. Mechanisms of DNA excision repair. Science, 1994, v. 266, № 5193, p. 1954-1956.

319. Sancar A. Structure and function of DNA photolyase. Biochemistry, 1994, v. 33, № 1, p. 2-9.

320. Sancar A., and Rupp W.D. A novel repair enzyme: UVRABC excision nuclease of Escherichia coli cuts a DNA strand on both sides of the damaged region. — Cell, 1983, v. 33, № 1, p. 249260.

321. Sancar A., Stachelek C., Konigsberg W., and Rupp W.D. Sequence of the recA gene and protein. -Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, № 5, p. 2611-2615.

322. Sandler S.J. Overlapping functions for recF and priA in cell viability and UV-inducible SOS expression are distinguished by dnaC809 in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol., 1996, v. 19, №4, p. 871-880.

323. Sandler S.J., Samra H.S., Clark A.J. Differential suppression of priA2::kan phenotypes in Escherichia coli K-12 by mutations in priA, lexA, and dnaC. — Genetics, 1996, v. 143, № 1, p. 513.

324. Saparbaev M., Laval J. Excision of hypoxanthine from DNA containing dIMP residues by the Escherichia coli, yeast, rat, and human alkylpurine DNA glycosylases. — Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1994, v. 91, № 13, p. 5873-5877.

325. Sargentini N.J., Smith K.C. м/ииС-dependent and umuC-lndependent y- and UV-radiation mutagenesis. Mutat. Res., 1984, v. 128, № 1, p. 1-9.

326. Sassanfar M., Roberts J.W. Nature of the SOS-inducing signal in Escherichia coli. The involvement of DNA replication. J. Mol. Biol., 1990, v. 212, № 1, p. 79-96.

327. Satta G., Gudas L.J., Pardee A.B. Degradation of Escherichia coli DNA: evidence for limitation in vivo by protein X, the recA gene product. Mol. Gen. Genet., 1979, v. 168, № 1, p. 69-80.

328. Schindelin H., Jiang W., Inouye M., Heinemann U. Crystal structure of CspA, the major cold shock protein of Escherichia coli Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1994, v. 91,№ 11,p. 5119-5123.

329. Schnarr M., Oertel-Buchheit P., Kazmaier M., Granger-Schnarr M. DNA binding properties of the LexA repressor. Biochimie, 1991, v. 73, № 4, p. 423^131.

330. Schulz D.W., Taylor A.F., Smith G.R. Escherichia coli pseudorevertants lacking Chi recombinational hotspot activity. J. Bacteriol., 1983, v. 155, № 2, p. 664-680.

331. Seeberg E., and Berdal K.G. Base excision repair of DNA damage: repair of alkylation damage to DNA. Ed. Hickson I.D., Landes Bioscience, USA, 1999.

332. Sell S.M., Eisen C., Ang D, Zylicz M, Georgopoulos C. Isolation and characterization of dnaJ null mutants of Escherichia coli. J. Bacteriol., 1990, v. 172, № 9, p. 4827-4835.

333. Shan Q., Bork J.M., Webb B.L., Inman R.B., Cox M.M. RecA protein filaments: enddependent dissociation from ssDNA and stabilization by RecO and RecR proteins. J. Mol. Biol., 1997, v. 265, №5, p. 519-540.

334. Shevell D.E., Friedman B.M., Walker G.C. Resistance to alkylation damage in Escherichia coli: role of the Ada protein in induction of the adaptive response. Mutat. Res., 1990, v. 233, № 1-2, p. 53-72.

335. Shurvinton C.E., Lloyd R.G. Damage to DNA induces expression of the niv gene of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet., 1982, v. 185, № 2, p. 352-355.

336. Silverstein J.L., Goldberg E.B. T4 DNA injection. П. Protection of entering DNA from host exonuclease V. Virology, 1976, v. 72, № 1, p. 212-223.

337. Sinden R.R., Cole R.S. Repair of cross-linked DNA and survival of Escherichia coli treated with psoralen and light: effects of mutations influencing genetic recombination and DNA metabolism. J. Bacteriol., 1978, v. 136, № 6, p. 538-547.

338. Singleton S.F., Xiao J. The stretched DNA geometry of recombination and repair nucleoprotein filaments. Biopolymers, 2001-2002, v. 61, № 3, p. 145-158.

339. Skalka A. A replicator's view of recombination (and repair). — Mechanisms in recombination (Grell R.F. ed.). New York, N.Y.: Plenum Press, 1974, p. 421-432.

340. Skowyra D., Georgopoulos C., Zylicz M. The E. coli dnaK gene product, the hsp70 family, can reactivate heat-inactivated RNA polymerase. Cell, 1990, v. 62, № 5, p. 939-944.

341. Small G.D. Mechanism of gap-filling during postreplication repair of ultraviolet damage in Haemophilus influenzae. J. Bacteriol., 1975, v. 124, № 1, p. 176-181.

342. Smith G.R. Conjugational recombination in E. coli: myths and mechanisms. Cell, 1991, v. 64, № 1, p. 19-27.

343. Sommer S., Bailone A., and Devoret R. The appearance of the UmuD'C protein complex in Escherichia coli switches repair from homologous recombination to SOS mutagenesis. -Mol. Microbiol., 1993, v. 10, № 5, p. 963-971.

344. Sourice S., Biaudet V., El Karoui M., Ehrlich S.D., Gruss A. Identification of the Chi site of Haemophilus influenzae as several sequences related to the Escherichia coli Chi site. Mol. Microbiol., 1998, v. 27, № 5, p. 1021-1029.

345. Steiner W.W., Kuempel P.L. Sister chromatid exchange frequencies in Escherichia coli analyzed by recombination at the t/i/resolvase site. J. Bacteriol., 1998, v. 180, № 23, p. 6269-6275.

346. Story M., R. Weber I.T., Steitz T.A. The structure of the E. coli RecA protein monomer and polymer. Nature, 1992, v. 355, № 6358, p. 318-325.

347. Storz G., Tartaglia L.A., Ames B.N. Transcriptional regulator of oxidative stress-inducible genes: direct activation by oxidation. Science, 1990a, v. 248, № 4952, p. 189-194.

348. Storz G., Tartaglia LA., Farr S.B., Ames B.N. Bacterial defences against oxidative stress. -Trends in Genet., 1990b, v. 6, № 11, p. 363-368.

349. Strauss A.B., Walter W. A., Gross C.A. The activity of a32 is reduced under conditions of excess heat shock protein production in Escherichia coli. — Genes and Devel., 1989, v. 3, № 12a, p. 2003-2010.

350. Strike P., Lodwick D. Plasmid genes affecting DNA repair and mutation. J. Cell. Sci. Suppl., 1987, v. 6, p. 303-321.

351. Szostak J.W., Orr-Weaver T.L., Rothstein R.J., Stahl F.W. The double-strand break repair model for recombination. Cell, 1983, v. 33, № 1, p. 25-35.

352. Takahashi N., Kobayashi I. Evidence for the double-strand break repair model of bacteriophage X recombination. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1990, v. 87, № 7, p. 2790-2794.

353. Takahashi N.R., Yamamoto K., Kitamura Y., Luo S.Q., Yoshikura H., Kobayashi I. Nonconservative recombination in Escherichia coli. — Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1992, v. 89, № 13, p. 5912-5916.

354. Tanabe H., Goldstein J.,.Yang M.Z., Inouye M. Identification-, of the. promoter region of the Escherichia coli major cold-shock gene, cspA. J. Bacteriol., 1992, v. 174, № 12, p. 3867-3873.

355. Taura Т., Kusukawa N., Yura Т., Ito K. Transient shut-off of Escherichia coli heat shock protein synthesis upon temperature shift down. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, v. 163, № 1, p. 438-443.

356. Taylor A.F. RecBCD enzyme of Escherichia coli. — Genetic recombination (Kucherlapati R. and Smith G.R. eds.). Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1988, p. 231-263.

357. Taylor A.F., and Smith G.R. Substrate specificity of the DNA unwinding activity of the RecBC enzyme of Escherichia coli. J. Mol. Biol., 1985, v. 185, № 3, p. 431-443.

358. Taylor A.F., Smith G.R. RecBCD enzyme is a DNA helicase with fast and slow motors of opposite polarity. Nature, 2003, v. 423, № 6942, p. 889-893.

359. Telander-Muskavitch K.M., Linn S. RecBC-like enzymes: exonuclease V deoxyribonucleases. -The enzymes (Boyer P.D. ed.), v. 9. -New York, N.Y.: Academic Press, Inc., 1981, p. 234-250.

360. Tessman I., Kennedy M.A. DNA polymerase II of Escherichia coli in the bypass of abasic sites in vivo. Genetics, 1994, v. 136, № 2, p. 439-448.

361. Thieringer H.A., Jones P.G., Inouye M. Cold shock and adaptation. BioEssays, 1998, v. 20, № l,p. 49-57.

362. Thoms В., and Wackernagel W. Suppression of the UV-sensitive phenotype of Escherichia coli recF mutants by recA(Srf) and recA(Tif) mutations requires reef. — J. Bacteriol., 1988, v. 170, №8, p. 3675-3681.

363. Thoms В., Wackernagel W. Regulatory role of recF in the SOS response of Escherichia coli: impaired induction of SOS genes by UV irradiation and nalidixic acid in a recF mutant. — J. Bacteriol., 1987, v. 169, № 4, p. 1731-1736.

364. Timmins J., Leiros I., McSweeney S. Crystal structure and mutational study of RecOR provide insight into its mode of DNA binding. EMBO J., 2007, v. 26, № 13, p. 3260-3271.

365. Tobe Т., Ito K., Yura T. Isolation and physical mapping of temperature-sensitive mutants defective in heat-shock induction of proteins in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet., 1984, v. 195, № 1-2, p. 10-16.

366. Tomasz M., Lipman R., Chowdary D., Pawlak J., Verdine G.L., and Nakanishi K. Isolation and structure of a covalent cross-link adduct between mitomycin С and DNA. — Science, 1987, v. 235, № 4793, p. 1204-1208.

367. Touati D., Jacques M., Tardat В., Bouchard L., and Despied S. Lethal oxidative damage and mutagenesis are generated by iron in Afur mutants of Escherichia coli: protective role of superoxide dismutase. J. Bacteriol., 1995, v. 177, № 9, p. 2305-2314.

368. Travers A.A., Mace H.A.F. In: Heat Shock from Bacteria to Man. (ed. Schlesinger M.J., Ashburner M., Tissieres A.). Cold Spring Harbor, N.Y., 1982, p. 121, 440 p.

369. Trewick S.C., Henshaw T.F., Hausinger R.P., Lindahl Т., Sedgwick B. Oxidative demethylation by Escherichia coli AlkB directly reverts DNA base damage. Nature, 2002, v. 419, № 6903, p. 174-178.

370. Trgovcevic Z., Petranovic D., and Zgaga V. Postirradiation fate of bacteriophage lambda DNA in the host cells. Virology, 1973, v. 55, № 1, p. 266-274.

371. Trgovcevic Z., Rupp W.D. Interaction of bacterial and lambda phage recombination systems in the X-ray sensitivity of Escherichia coli K-12. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1974, v. 71, № 2, p. 503-506.

372. Trgovcevic Z., Rupp W.D. Lambda bacteriophage gene products in X-ray sensitivity of Escherichia coli: comparison of red- and gam-dependent radioresistance. J. Bacteriol., 1975, v. 123, №2, p. 212-221.

373. Trun N.J., Gottesman S. On the bacterial cell cycle: Escherichia coli mutants with altered ploidy. Genes Dev., 1990, v. 4, № 12A, p. 2036-2047.

374. Tuteja N., Tuteja R. Unraveling DNA helicases. motif, structure, mechanism and function. Eur. J. Biochem., 2004, v. 271, № 10, p. 1849-1863.

375. Ulmer K.M., Gomez R.F., Sinskey A.J. Ionizing radiation damage to the folded chromosome of Escherichia coli K-12: repair of double-strand breaks in deoxyribonucleic acid. J. Bacteriol., 1979, v. 138, № 2, p. 486—491.

376. Upton C. and Pinney R.J. Expression of eight unrelated Muc+ plasmids in eleven DNA repair-deficient E. coli strains. Mutat. Res., 1983, v. 112, № 5, p. 261-273.

377. Uzest M., Ehrlich S.D., Michel B. Lethality of rep recB and rep recC double mutants of Escherichia coli. Mol. Microbiol., 1995, v. 17, № 6, p. 1177-1188.

378. Van Houten B. Nucleotide excision repair in Escherichia coli. — Microbiol. Rev., 1990, v. 54, № l,p. 18-51.

379. VanBogelen R.A., Kelley .P.M., Neidhardt-F.C. Differential: induction of heat shock, SOS, and oxidation stress regulons and accumulation of nucleotides in Escherichia coli. J. Bacteriol., 1987, v. 169, № l,p. 26-32.

380. Veaute X., Delmas S., Selva M., Jeusset J., Le Cam E., Matic I., Fabre F., Petit M.A. UvrD helicase, unlike Rep helicase, dismantles RecA nucleoprotein filaments in Escherichia coli. -EMBO J., 2005, v. 24, № 1, p. 180-189.

381. Vinogradskaia G.R., Goryshin I.I., Lanzov V.A. The role of ssb gene in the inducible and the constitutive pathways of recombination in Escherichia coli K-12. — Dokl. Acad. Nauk, 1986, v. 290, № l,p. 228-231.

382. Volkert M.R., and Hartke M.A. Suppression of Escherichia coli recF mutations by гесЛ-linked srfA mutations. J. Bacteriol., 1984, 157, № 2, p. 498-506.

383. Vujicic-Zagar A., Dulermo R., Le Gorrec M., Vannier F., Servant P., Sommer S., de Groot A., Serre L. Crystal structure of the IrrE protein, a central regulator of DNA damage repair in Deinococcaceae. J. Mol. Biol. 2009 Epub ahead of print.

384. Wada M., Sekine K., Itikawa H. Participation of the dnaK and dnaJ gene products in phosphorylation of glutaminyl-tRNA synthetase and thereonyl-tRNA synthetase of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol., 1986, v. 186, № 1, p. 213-220.

385. Waldstein E., Setlow J.K., Santasier L. A special type of UV-stimulated recombination in Haemophilus influenzae. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1979, v. 43, Pt 2, p. 10591062.

386. Walker G.C. Mutagenesis and inducible response to deoxyribonucleic acid damage in Escherichia coli. Microbiol. Rev., 1984, v. 48, № 1, p. 60-93.

387. Wallace S.S, and Melamede R.J. Host and phage mediated repair of radiation damage in bacteriophage T4. J. Virol., 1972, v. 10, № б, p. 1159-1169.

388. Wang T.-C., and Chang H.-Y. Effect of rec mutations on viability and processing of DNA damaged by methylmethane sulfonate in xth nth nfo cells of Escherichia coli. — Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991, v. 180, № 2, p. 774-781.

389. Wang T.C., Chang H.Y., Hung J.L. Cosuppression of recF, recR and rec О mutations by mutant recA alleles in Escherichia coli cells. Mutat. Res., 1993, v. 294, № 1, p. 157-166.

390. Wang T.C., Smith K.C. Mechanisms for recF-dependent and recZ?-dependent pathways of postreplication repair in UV-irradiated Escherichia coli uvrB. J. Bacteriol., 1983, v. 156, № 3, p. 1093-1098.

391. Wang T.C., Smith K.C. Postreplicational formation and repair of DNA double-strand breaks in UV-irradiated Escherichia coli uvrB cells. Mutat. Res., 1986, v. 165, № 1, p. 39-44.

392. Wang T.V., and Smith K.C. recF-dependent and recF recB independent DNA gap-filling repair processes transfer dimer-containing parental strands to daughter strands in Escherichia coli K-12 uvrB. J. Bacteriol., 1984, v. 158, № 2, p. 727-729.

393. Ward J.F. DNA damage produced by ionizing radiation in mammalian cells: identities, mechanisms of formation, and reparability. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 1988, v. 35, p. 95-125.

394. Washburn B.K., Kushner S.R. Characterization of DNA helicase П from a uvrD252 mutant of Escherichia coli. J. Bacteriol., 1993, v. 175, № 2, p. 341-350.

395. Way J.C., Davis M.A., Morisato D., Roberts D.E., Kleckner N. New TnlO derivatives for transposon mutagenesis and for construction of lacZ operon fusions by transposition. Gene, 1984, v. 32, №2, p. 369-379.

396. Webb B.L., Сох M.M., Inman R.B. Recombinational DNA repair: the RecF and RecR proteins limit the extension of RecA filaments beyond single-strand DNA gaps. Cell, 1997, v. 91, № 3, p. 347-356.

397. West S.C. Processing of recombination intermediates by the Ruv-ABC proteins. Annu. Rev. Genet., 1997, v. 31, p. 213-244.

398. West S.C., Emmerson P.T. Induction of protein synthesis in Escherichia coli following UV- or y-irradiation, mitomycin С treatment or tif expression. Mol. Gen. Genet., 1977, v. 151, № 1, p. 57-67.

399. Whitby M.C., Lloyd R.G. Altered SOS induction associated with mutations in recF, recO and recR. Mol. Gen. Genet., 1995, v. 246, № 2, p. 174-179.

400. White O., Eisen J.A., Heidelberg J.F. et al. Genome sequence of the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans. Science, 1999, v. 286, № 5444, p. 1671-1577.

401. Wilkins B.M., Howard-Flanders P. The genetic properties of DNA transferred from ultraviolet-irradiated Hfr cells of Escherichia coli K-12 during mating. — Genetics, 1968, v. 60, № 2, p.243.255.

402. Willetts N.S., Mount D.W. Genetic analysis of recombination deficient mutants of Escherichia coli K-12 carrying rec mutations cotransducible with thy A. J. Bacteriol., 1969, v. 100, № 2, p.923.934.

403. Williams D.L. and Calcott P.H. Role of DNA repair genes and an R plasmid in conferring cryoresistance on Pseudomonas aeruginosa. J. Gen. Microbiol., 1982, v. 128, №. 1, p. 215-218.

404. Winans S.C., Elledge S.J., Krueger J.H., Walker G.C. Site-directed insertion and deletion mutagenesis with cloned fragments in Escherichia coli. — J. Bacteriol., 1985, v. 161, № 3, p. 1219-1221.

405. Wong I., Amaratunga M., Lohman T.M. Heterodimer formation between Escherichia coli Rep and UvrD proteins. J. Biol. Chem., 1993, v. 268, № 27, p. 20386-91.

406. Woodgate R., Ennis D.G. Levels of chromosomally encoded Umu proteins and requirements for in vivo UmuD cleavage. Mol. Gen. Genet., 1991; v. 229, № 1, p. 10-16.

407. Woodgate R., Sedgwick S.G. Mutagenesis induced by bacterial UmuDC proteins and their plasmid homologues. Mol. Microbiol., 1992, v. 6, № 16, p. 2213-2218.

408. Worth LJr., Clark S., Radman M., Modrich P: Mismatch repair proteins MutS and MutL inhibit RecA-catalyzed strand transfer between diverged DNAs. — Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1994, v. 91, №8; p. 3238-3241.

409. Wright M., Buttin G., Hurwitz J. The isolation and characterization from Escherichia coli of adenosine triphosphate-dependent deoxyribonuclease directed by recB,C genes. J. Biol. Chem., 1971, v. 246, № 21, p. 6543-6555.

410. Xiao J., Singleton S.F. Elucidating a key intermediate in homologous DNA strand exchange: structural characterization of the RecA-triple-stranded DNA complex using fluorescence resonance energy transfer. J. Mol. Biol., 2002, v. 320, № 3, p. 529-558.

411. Xu W., Shen J., Dunn C.A., Desai S., Bessman MJ. The Nudix hydrolases of Deinococcus radiodurans. Mol. Microbiol., 2001, v. 39, № 2, p. 286-290.

412. Yamamori Т., Yura T. Genetic control of heat-shock protein synthesis and its bearing on growth and thermal resistance in Escherichia coli K-12. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, № 3, p. 860-864.

413. Yamanaka K. Cold shock response in Escherichia coli. J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 1999, v. 1, № 2, p. 199-203.

414. Yamanaka K., Fang L., Inouye M. The CspA family in Escherichia coli: multiple gene duplication for stress adaptation. Mol. Microbiol., 1998, v. 27, № 2, p. 247-255.

415. Yasuda Т., Morimatsu K., Horii Т., Nagata Т., and Ohmori H. Inhibition of Escherichia coli RecA coprotease activities by Dinl. EMBO J., 1998, v. 17, № 11, p. 3207-3216.

416. Yatvin M.B., Schmitz B.J., Dennis W.H. Radiation killing of E. coli K1060: role of membrane fluidity, hypothermia and local anaesthetics. Internat. J. Radiat. Biol., 1980, v. 37, № 5, p. 513519.

417. Yeung Т., Mullin D.A., Chen K.-S., Craig E.A., Bardwell J.C.A., and Walker J.R. Sequence and expression of the Escherichia coli recR locus. J. Bacteriol., 1990, v. 172, № 10, p. 6042-6047.

418. Yura Т., Tobe Т., Ito K., Osawa T. Heat shock regulatory gene (htpR) of Escherichia coli is required for growth at high temperature but is dispensable at low temperature. — Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1984, v. 81, № 22, p. 6803-6807.

419. Zahradka K, Slade D, Bailone A, Sommer S, Averbeck D, Petranovic M, Lindner AB, Radman M. Reassembly of shattered chromosomes in Deinococcus radiodurans. — Nature, 2006, v. 443, №7111, p. 517-519.

420. Zaman M.M., and Boles T.C. Chi-dependent formation of linear plasmid DNA in exonuclease-deficient recBCD' strains of Escherichia coli. J. Bacteriol., 1994, v. 176, № 16, p. 5093-5100.

421. Zieg J., Maples V.F., and Kushner S.R. Recombination levels of Escherichia coli K-12 mutants deficient in various replication, recombination, or repair genes. J. Bacteriol., 1978, v. 134, № 3, p. 958-966.

422. Zylicz M., Georgopoulos C. Purification and properties of the Escherichia coli dnaK replication protein. J. Biol. Chem., 1984, v. 259, № 4, p. 8820-8825.г

Информация о работе

Вербенко, Валерий Николаевич
доктора биологических наук
Гатчина, 2009
ВАК 03.00.15

Диссертация

Молекулярно-генетические механизмы повышенной устойчивости бактерий к потенциально-летальным повреждениям ДНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы