Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетическая изменчивость, связанная с полуавтономными генетическими элементами дрозофилы
ВАК РФ 03.02.07, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая изменчивость, связанная с полуавтономными генетическими элементами дрозофилы"
На правах рукописи
Андрианов Борис Витальевич
Молекулярно-генетическая изменчивость, связанная с полуавтономными генетическими элементами дрозофилы
03.02.07 - генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
1 2 МАЙ 2011
Москва-2011
4845462
Работа выполнена в отделе генетики животных Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им Н.И. Вавилова РАН и в лаборатории генетики Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им Н.К. Кольцова РАН
Научные консультанты: - доктор биологических наук В.Г. Митрофанов - доктор биологических наук Н.Г. Шуппе
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Гордеев Михаил Иванович (МГОУ)
доктор биологических наук, профессор Елена Алексеевна Ляпунова (ИБР РАН)
доктор биологических наук, профессор Марлен Мкртычевич Асланян (МГУ) им. М.В. Ломоносова.
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии РАН
Защита состоится на заседании
диссертационного совета Д002.238.01 созданного при Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 26. Сайт: http://idbras.comcor.ru; E-mail: idbras@bk.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 26, и на сайте http://idbras.comcor.ru
Автореферат разослан ^^p-S-^J?/ 2011
года.
Ученый секретарь диссертационного совета, /
кандидат биологических наук Е.Б. Абрамова
E-mail: ele0806 @ yandex.ru
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Автономные генетические элементы выделяют по признаку наличия собственной ДНК, репликация которой частично независима от репликации клеточного генома. Сравнительно небольшие размеры и высокий уровень изменчивости геномов автономных генетических элементов делают их чувствительным маркёром микроэволюционных процессов. Все эукариотические клетки содержат митохондрии и репликационно компетентные семейства транспозонов, а многие виды ещё и внутриклеточные бактерии. Изменчивость ядерного генома, вызываемая автономными генетическими элементами, связана с процессами рекомбинации, ретротранспозиции и горизонтального переноса ДНК. Эти события ведут к увеличению размеров и сложности эукариотических геномов. Другой, не менее важной особенностью изменчивости, связанной с автономными генетическими элементами, является её направленность. Как было впервые показано С.М. Гершензоном, наличие ДНК в цитоплазме является мутагенным фактором, вызывающим определённый спектр мутаций, обычно нестабильных и часто ревертирующих к норме. Мутации, вносимые транспозонами, так же носят направленный характер определяемый специфичностью ферментов интеграции. Так как разные виды имеют разные наборы функционально активных транспозонов, а мутации, вносимые ими, многократно и независимо повторяются, то вероятность фиксации этих мутаций в популяциях возрастает. Из этих фактов следует, что автономные генетические элементы имеют существенное значение в определении сценария эволюционного преобразования вида.
Изучение структурной и функциональной изменчивости, вносимой в геном ретротранспозонами, остается актуальной проблемой современной генетики.
Выделение функционально-активного семейства ретротранспозонов из генома любого вида организмов существенно расширяет возможности дальнейшего изучения генетики этого вида и его возможного биотехнологического применения. Задача эта, однако, не проста, так как большинство копий ретротранспозонов в геноме дефектны и либо вовсе не способны к перемещению, либо могут перемещаться только в присутствии ретротранспозона-помощника. В данной работе представлено выделение, клонирование и характеристика нового функционально-активного семейства ретротранспозонов Ту/ из генома ОгояоркИаМгШз. Применённый метод может быть использован для выделения и характеристики функционально-активных семейств ретротранспозонов из других видов животных.
В работе представлена молекулярно-генетическая характеристика экспрессии Ту1 и применение гипервариабельных последовательностей Ту/ в качестве селективно нейтральных маркёров для характеристики популяционной структуры природных популяций дрозофил группы \4rilis и в качестве маркёров сайтов инсерций митохондриальных псевдогенов.
Определена нуклеотидная последовательность митохондриального генома Drosophila.littora.lis и на этой основе проведено изучение межвидовой,
2
внутривидовой и внутрипопуляционной изменчивости митохондриального генома природных популяций дрозофил группы virilis. Группа virills состоит из одиннадцати широко распространённых видов дрозофил, обитающих в Евразии и Северной Америке. Предполагаемое время дивергенции предковых форм D.virilis и D.melanogaster оценивается в 40 миллионов лет.
Начиная с классических исследований (Patterson & Stone, 1952), данная группа активно изучается как модельный объект микроэволюции и видообразования. Изучение дрозофил группы virilis в России имеет давнюю историю. Первые исследования систематики и экологии D.lummei и D.littoralis проведены Н.Н. Соколовым. (Соколов, 1948). Интерес к исследованию популяционно-генетических и микроэволюционных процессов в группе virilis сохраняется и в настоящее время. Одно из перспективных направлений в этой области - связь микроэволюционных процессов с активностью ретротранспозонов. Дрозофилы группы virilis - удобный модельный объект для сравнительного исследования популяционной структуры природных и синантропных видов.
В настоящее время все больше видов вовлекается во взаимодействие с человеком, возникают синантропные расы, изменяется генетическая структура популяций. Изучение закономерностей в ответе на эти изменения со стороны наиболее лабильной части генома, представленной ретротранспозонами и другими автономными генетическими элементами, представляет несомненный интерес.
Цель работы. Изучить структуру и популяционную динамику изменчивости, связанную с полуавтономными генетическими элементами дрозофил.
Задачи исследования
1. Разработать метод выделения функционально-активных семейств ретротранспозонов и выделить функционально-активные семейства ретротранспозонов D. virilis.
2. Определить нуклеотидную последовательность митохондриального генома одного из видов группы virilis (D.littoralis).
3. Охарактеризовать межвидовую изменчивость митохондриальной ДНК у дрозофил группы virilis по трем признакам: Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) тотальной мтДНК, изменчивость фрагмента гена 16S рРНК, изменчивость фрагмента гена coxl .
4. Изучить особенности внутривидового полиморфизма мтДНК в группе virilis у четырех видов дрозофил: D.littoralis, D.americana, D.virilis, и D.montana.
5. Исследовать внутрипопуляционную структуру и динамику митохондриальной изменчивости в локальной, чётко ограниченной, природной популяции D.littoralis (пос. Рыбинский, Ростовская обл.) на протяжении нескольких лет. Для этого провести анализ сопряженности митохондриальных гаплотипов с полиморфным ядерным ДНК-маркером для выявления расовой структуры популяции.
6. Получить новую пересеваемую клеточную линию дрозофилы, инфицированную внутриклеточными бактериями №о1ЬасЫа для изучения горизонтального переноса ДНК между клеткой дрозофилы и бактерией.
Научная новизна работы
Разработан метод выделения функционально-активных ретротранспозонов и этим методом впервые выделено и охарактеризовано функционально-активное семейство ретротранспозонов ОМпШ - Ту1.
Предложен простой метод электронно-микроскопической идентификации вирусоподобных частиц ретротранспозонов.
Впервые показана трансактивация синтеза вирусоподобных частиц Ту1 в клеточной культуре.
Впервые определена полная нуклеотидная последовательность митохондриального генома ОЛШогаШ.
Впервые проведен многолетний анализ динамики митохондриальных маркеров в локальной природной популяции ОЛШогаШ. Обнаружено устойчивое соотношение мт-гаплотипов. Анализ сопряженности несцепленных ядерных и митохондриальных маркеров в выборке из природной популяции ОЛШогаШ позволил выявить скрытую расовую структуру, способствующую поддержанию генетической гетерогенности и стабильности популяционного генофонда.
На основе анализа изменчивости митохондриальной ДНК в группе утШ получен ряд новых данных, позволивших уточнить филогенетическую структуру группы утШ. В частности, показано единство митохондриального генофонда двух подвидов 0.атепсапа\ а также получено подтверждение разделения вида ОЛШогаШ на два подвида: ОЛШогаШ 1ШогаШ и ОЛШогаШ ¡теМепхгз.
Теоретическая и практическая значимость работы
Разработанный метод выделения функционально-активных ретротранспозонов может быть применён для оценки геномной стабильности клеточных культур животных по наличию/отсутствию и количеству вирусоподобных частиц эндогенных ретротранспозонов.
Описание и анализ полного митохондриального генома ОЛШогаШ даёт новые данные для изучения эволюции митохондриального генома дрозофилы.
Полученные результаты вносят вклад в фундаментальные исследования по генетике популяций, разрабатываемые на дрозофиле как модельном объекте, и закладывают основы для дальнейшего изучения динамики митохондриальных генофондов насекомых. Полученные результаты важны для исследований в области охраны и мониторинга популяций редких и исчезающих видов, а также рационального использования эксплуатируемых популяций. Результаты работы могут быть применены в исследованиях, проводимых в учреждениях системы РАН и РАСХН, таких как Институт общей генетики РАН, Институт молекулярной биологии РАН, Институт биологии развития РАН, Институт биологии гена РАН, Институт комплексного освоения природных ресурсов РАН, Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и
4
разведения сельскохозяйственных животных РАСХН, Всероссийский научно-исследовательский институт охотничьего хозяйства и звероводства РАСХН.
Положения выносимые на защиту
1. Клетки дрозофил содержат вирусоподобные частицы одного или нескольких семейств эндогенных ретровирусов и/или ретротранспозонов. Клонирование нуклеиновых кислот из клеточной фракции вирусоподобных частиц позволяет клонировать функционально-активные семейства ретротранспозонов данного вида
2. Суперинфекция вирусоподобными частицами клеток пересеваемой культуры может приводить к временной индукции синтеза вирусоподобных частиц ретротранспозонов клетки.
3. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность митохондриального генома D.littoralis и выявлены области, изменчивость которых специфична для группы virilis.
4. В условиях клеточной пересеваемой культуры ускоряется перенос митохондриальной ДНК в ядро с образованием новых митохондриальных псевдогенов.
5. Структура митохондриальной изменчивости природных и синантропных видов насекомых существенно различается. Локальные популяции синантропных видов мономорфны, тогда как у видов, образующих природные популяции, митохондриальная изменчивость образована совокупностью нескольких митохондриальных гаплотипов, находящихся в равновесии.
6. Анализ сопряжённости несцепленных митохондриальных и ядерных ДНК маркёров в локальных, частично изолированных популяциях позволяет выявить криптические расы, обитающие симпатрически.
7. В пересеваемых клеточных линиях дрозофилы возможна персистенция внутриклеточных бактерий Wolbachia pipientis.
Апробация результатов диссертации
Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:
• International Conference «Molecular Phylogenetics" (MolPhy-2) Moscow, May 18-21,2010;
• 51th Annual Drosophila Research Conference. Washington, DC.April 7-11. 2010;
• IV съезда ВОГиС. Москва 21-22 июня. 2009;
• Международная научно-практическая конференция
• Актуальные проблемы биоэкологи. 21-24 октября 2008;
• XX International Congress of Genetics Berlin, Germany, 2008;
• 48th Annual Drosophila Research Conference, Philadelphia, Pennsylvania, USA, 2007;
• 47th Annual Drosophila Research Conference, Houston, Texas, 2006;
• 19th European Drosophila Research Conference, Eger, Hungary, 2005;
• 46th Annual Drosophila Research Conference, San Diego, USA, 2005;
• III съезда ВОГиС, 2004;
• 45th Annual Drosophila Research Conférence, Washington, USA, 2004. Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 статей в российских и международных рецензируемых журналах,
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 257 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, заключения, выводов, списка литературы по теме диссертации, списка цитируемой литературы, в который входит 515 ссылок. Работа проиллюстрирована J4. таблицами и 67 рисунками.
Результаты и обсуждение
1. Выделение и характеристика нового функционально-активного семейства ретротранспозонов D.virilis - Tvl.
1.1. Выделение и клонирование Tvl. Метод выделения функционально активных ретротранспозонов основывался на универсальности цикла автономной репликации ретротранспозонов относящихся к суперсемействам gypsy и copia. Цикл ретротранспозиции данных ретротранспозонов включает стадию вирусоподобной частицы (ВПЧ), в которой компартментализована активность обратной транскриптазы и геномная РНК ретротранспозона. В составе ВПЧ обнаруживают как РНК-геномы ретротранспозонов, так и различные промежуточные продукты их обратной транскрипции, включающие полиаденилированные РНК-ДНК гибридные формы и конечный продукт обратной транскрипции - линейную двухцепочечную ДНК. Полиаденилированные РНК-ДНК гибридные формы особенно удобны для клонирования, так как с помощью афинной хроматографии их можно отделить от примесей фрагментов хромосомной ДНК. Из культивируемых клеток D.virilis была получена клонотека полиаденилированных нуклеиновых кислот ВПЧ. Чтобы найти среди них последовательности ретротранспозонов, использовали хорошо известное свойство ретротранспозонов активно транскрибироваться в культуре клеток. Для этого был получен меченый зонд кДНК, синтезированный на основе препарата тотальной поли(А) РНК из клеток D.virilis. Клон pf7Dvl4, связывавший максимальное количество зонда, отобрали как возможный ретротранспозон.
Другая клонотека была получена на основе клонирования двухцепочечной ДНК ВПЧ клеток D.virilis. Используя в качестве зонда клонированный фрагмент pf7Dvl4, из второй клонотеки отобрали гомологичный клон pflV-59, содержащий фрагмент размером 7 т.п.н. Секвенирование этого фрагмента и анализ полученной последовательности позволили определить его как новое семейство ретротранспозонов.
На (рис. 1) представлена схема структурной организации ретротранспозона Tvl. На концах Tvl выявляются идентичные ДКП. Тело элемента содержит три протяженные открытые рамки считывания. Поиск последовательностей, гомологичных Tvl, в GenBank, выявил наибольшее сходство Tvl с компактной группой ретротранспозонов gypsy-Tpymu,
Генетическая карта ретротранспоэона Tvl
Pr RT RNaseH Int
atatatat. 5'ДКГ!
env I I
gag УДКП г
atatatat
Транскрипция Tv1 в клеточной культуре
1 2 т.н.
_23.1
Л - 9-4
Щ - «•?
4.4
2.3
Рис. 1. Генетическая карта ретротранспоэона Tvl. ORF - открытая рамка считывания. Белковые домены: Рг -протеаза, RT - обратная транскриптаза, RNaseH - рибонуклеаза Н, Int -интеграза (GenBank ID: AF056940)
Транскрипция Tvl в клетках линии 79f7Dv3g. Nothern блот-гибридизация 5 мкг поли(А) РНК клеток 79f7Dv3g, фракционированной в денатурирующем агарозном геле с (32Р) меченым зондом Tvl.
Дорожки: 2 - поли(А) РНК; 1 - тот же материал, что и на дорожке 2, обработанный РНКазой А в растворе с низкой ионной силой.
Амплификация Tvl в клеточной культуре. Саузерн-блот-гибридизация тотальной Нра\\ расщепленной ДНК с (32Р) меченым Seal фрагментом Tvl (3236-6654). Электрофорез в 1% агарозном геле. Дорожки: 1 - клетки 79f7Dv3g, 2 - линия мух Ри40, 3 - линия мух Dv9. Стрелками отмечены внутренние фрагменты Tvl. Треугольники отмечают концевые фрагменты Tvl, возникающие при гидролизе линейных внехромосомных форм Tvl.
Внехромосомные кольцевые формы Tvl Саузерн-блот-гибридизация внехромосомной кольцевой ДНК из культуры клеток 79f7Dv3g с (32Р) меченой ДНК плазмиды pf7V-59. На каждой дорожке материал из 108 клеток, расщепленный 1 - №'ndIII, 2 - Xhol, 3 - Sail, 4 - без рестрикции. Миграция фрагментов маркера молекулярной массы X tfirtdIII отмечена на полях. Размеры фрагментов вт.п.н.
относящихся, согласно последней классификации, к эррантивирусам насекомых. Выявляемая гомология позволяет заключить, что три открытые рамки считывания Tvl соответствуют генам gag, pol и env. Анализ гена pol
Основной транскрипт
Амплификация Tv1 в Внехромосомные
клеточной культуре кольцевые формы Tv1
_ вал
позволил выявить консервативные домены протеазы, обратной транскриптазы, РНКазы Н и интегразы ретротранспозонов £}>/?уу-группы. Последовательность Tvl прилежащая к 5' ДКП, гомологична 3' концевой области тРНК?ег и, следовательно, может функционировать, как сайт связывания праймера для синтеза минус цепи ретротранспозона ((-) PBS). Последовательность Tvl прилежащая к 3' ДКП, является полипуриновым трактом и, следовательно, может функционировать как (+)PBS.
1.2. Распространение Ту1 у дрозофил группы \irilis. Все изученные линии ИМпШ содержат 7у/, причем в сходной копийности (рис. 2).
1 2 3 4 5 6 7
s 9 10 11 12
Рис. 2. Распределение Tvl в линиях D.virilis различного географического происхождения.
Саузерн-блот-гибридизация геномной ДНК мух, расщепленной Xhol, с зондом внутреннего Seal фрагмента Tvl (3236-6654). 1 - D.melanogaster (Oregon R); 2 - Dvl60\ 3 -Dvl: 4 - Dv59; 5 - DvlOl; 6 - DvlO; 7 - Dvl3\ 8 -Dvll7; 9 - Dv40; 10 - Dvll8; 11 - Dv2J; 12 -Dv42.
Миграция фрагментов маркера
молекулярной массы X HmdIII отмечена на полях.
Для линии Dv9 методом дот-гибридизации число копий Ту1 определено как 25-50 на гаплоидный геном. Значительная часть этих копий может иметь ту же структуру, что и отсеквенированная копия Ту1 . Данный вывод следует из наличия яркой полосы 4.4 т.п.н., ожидаемой при ХИо1 расщеплении Ту1 из плазмиды р/7У-59. Эта
полоса хорошо выражена у
Obi VI Vi U Iл LI Vi И .ta Но KbEz UNO Mo
i 2 3 < £ í " Я S ID " 12 Í3 и i5
всех проанализированных линий, что свидетельствует о гомогенности структуры Ту1 в геноме ЭлпгШз.
Рис. 3. Межвидовое распределение Tvl. Саузерн блот-гибридизация геномной ДНК разных видов мух из группы virilis, расщепленной Xhol, с зондом внутреннего Seal фрагмента Tvl (3236-6654). Взяты следующие линии мух: 1 - D.melanogaster (Oregon R) 2 - D. virilis (Uman); 3 - D. virilis (Magarach); 4 - D.lummei 211; 5 -D.lummei 234; 6 - D.littoralis\ 7 - D.virilis (160); 8 -D.flavomonlana; 9 - D.americana', 10 - D.borealis; 11 - D.kanekov, 12 - D.ezoana\ 13 - D.lacicola-, 14 -D.novomexicana', 15 - D.montana.
Межвидовое сравнение структуры и копийности Тм1 в группе видов-близнецов £).угп7м (рис. 3) выявило отсутствие похожих по рестриктной карте элементов и резкие различия в копийности. В жестких условиях гибридизации в геноме П.те1апо§а51ег никаких гомологичных Ту1 последовательностей не выявляется. Значительные отличия в копийности и структуре Ту1 свидетельствуют о том, что дивергенция видов группы у;'п7и сопровождалась транспозициями Ту1.
1.3. Хромосомная локализация Т\1. На (рис. 4) показан результат локализации Ту1 на хромосомах й.мтШ. Гибридизация выявляется, в основном, в прицентромерном гетерохроматине всех шести хромосом и в нескольких эухроматиновых сайтах. Такой тип локализации свойственен транспозонам, давно внедрившимся в геном данного организма.
Л
Хро.чосо ма Локус Лилия Drosophlia virillt
U6Q Vail (»! ВЧ
I ISA 15В + *
19С ♦
1Й0 ©
XX 22F +
24F 24Н Ф +
290 *
1X1 32В *
39F + + +
IV 40В 41А 46В
4 9F +
V 50С *
53Т 57Е 58А 0
58В -t
VI бос » ♦
Суикарпоо число поаитквпмх яокуоов 14 9 9
Рнс. 4. In situ гибридизация политенных хромосом клеток слюнных желез мух линии Dv9 с (3Н) меченым Seal фрагментом Tvl (3236-6654). Стрелкой отмечена интенсивная гибридизация в области хромоцентра.
Хромосомная локализация копий Tvl в линиях: Dv9, Dvl60 и Dsll(w). Кружками отмечены вновь возникшие сайты локализации Tvl в гибридной, мутантной линии.
Экспериментально наблюдаемые перемещения Ту1 удалось обнаружить при дестабилизации генома £>.уш7и в системе гибридного дисгенеза, при скрещивании линий £>у9 и £>у760 (Еу£еп'еу е1 а1., 1997). Сравнение
хромосомной локализации Tvl в геноме родительских линий и в сублинии Dsll(w), отобранной из потомства от дисгенного скрещивания по спонтанной мутации white, приведено на (рис. 4). Наблюдается полиморфизм между родительскими линиями, кроме того, в гибридной линии возникло три новых сайта, указывающих на транспозиции Tvl в системе гибридного дисгенеза. Хромосомные локусы 29С, 39F, 49F и 60С содержат Tvl во всех трех проанализированных линиях.
1.4. Идентификация сайтов интеграции Tvl. Сравнительно недавно стал доступен для анализа полный геном D.virilis (линия Dv 149) http://genome.ucsc.edu/index.html Поиск in silico с зондом в виде длинного концевого повтора Tvl выявил 211 последовательностей. Характерно наличие двух основных размерных классов. Первый имеет длину около 6,5 т.п.н. образован полноразмерными элементами с двумя ДКП. Второй, длиной 413 н.п. образован одиночными ДКП (несколько аномально длинных копий Tvl образованы рекомбинантными копиями, составленными из фрагментов двух элементов). Оба класса элементов фланкированы микросателлитными последователностями (ТА)„. Наличие таких фланкирующих последовательностей может быть обьяснено специфичностью интегразы элемента. Для выяснения длины узнаваемой интегразой последовательности и длины вносимой интегразой дупликации проведено сравнение фланкирующих последовательностей всех полноразмерных копий Tvl, выявленных в полном геноме D.virilis. Из данных представленных на (рис. S), видно 100% совпадение первых четырёх нуклеотидов, которые, следовательно, дуплицируются интегразой элемента при встраивании новой копии Tvl в хромосому.
% консенсусного основания в данной позиции
% консенсусного основания вданной позиции
| а....................................Ц
№ позиции 12 1110 987654321 123456789 10 11 12
Консенсус: а I а Га1:а1:аГа1 А6ТСА—Ту1—ТААТТа1:а(:а1:а1:а1: а I
Рис. 5. Анализ сайтов интеграции 92 полноразмерных 7\<7 из отсеквенированного генома. Строчными буквами показана консенсусная последовательность сайта интеграции. Заглавными буквам показана последовательности концов Ту1. На гистограммах сверху консенсуса показан процент консенсусного основания в данном положении.
Последовательность первых восьми нуклеотидов консервативна в 95-98% случаев. Можно предположить, что эта последовательность необходима для узнавания интегразой Tvl сайта будущей инсерции. Вне этих пределов строгость соответствия консенсусу скачкообразно снижается, следовательно, значение этих последовательностей для эффективного узнавания интегразой Tvl маловероятно. Таким образом, минимально необходимый для узнавания Tvl интегразой сайт состоит из 12 нуклеотидов - (ТА)6
1.5. Идентификация ВПЧ Tvl. Вирусоподобные частицы D.virilis выделяли из клеток эмбриональной пересеваемой культуры. Нуклеиновые кислоты, выделенные из ВПЧ культуральной среды, ядер и цитоплазмы, фракционировали в нативном агарозном геле и после переноса по Саузерну на нейлоновую мембрану гибридизовали с (32Р) меченой ДНК плазмиды pf7V-59, содержащей полноразмерную копию Tvl. Результат гибридизации, представленный на (рис. 6) дорожки 1-3, свидетельствует о наличии Tvl ДНК размером 7 т.п.н. в составе цитоплазматических и внеклеточных ВПЧ. В ядре ВПЧ Tvl отсутствуют, что подтверждает электронно-микроскопический анализ клеточных срезов. Обработка нативных частиц ДНКазой 1 не приводит к деградации ДНК Tvl, что свидетельствует об упаковке Tvl ДНК внутри частиц и исключает вероятность адсорбции свободной внехромосомной ДНК Tvl на частицы.
Непосредственная идентификация частиц Tvl на электронных микрофотографиях частиц из фракций сахарозного градиента затруднена, поскольку в культуре клеток D.virilis 79f7Dv3g присутствует персистирующий реовирус, сходный с реовирусом, идентифицированным в клетках линии 67j25D (D.melanogaster) (Алаторцев и др., 1980). Геном реовируса представлен восемью фрагментами двухцепочечной РНК. Частицы реовируса обнаруживаются как в клетке, так и в культуральной среде. ВПЧ ретротранспозонов коседиментируют с частицами реовирусов, давая совпадение пиков в сахарозном градиенте.
Рис. 6. Саузерн-блот-гибридизация нуклеиновых кислот ВПЧ из культуры клеток 79f7Dv3g с (32Р) меченой ДНК плазмиды pf7V-59. Дорожки 1-3 - нуклеиновые кислоты ВПЧ из 108 клеток 79f7Dv3g-. 1 - внеклеточные ВПЧ, 2 - ядерные ВПЧ, 3 - цитоплазматические ВПЧ. Дорожки 4,5 - нуклеиновые кислоты ВПЧ из 10 мл культуральной среды: 4 - ВПЧ обработаны ДНКазой 1, затем депротеинизированы, и нуклеиновые кислоты нанесены на гель; 5 - ВПЧ обработаны РНКазой А, затем депротеинизированы, и нуклеиновые кислоты нанесены на гель. (К препаратам 4 и 5 перед обработкой нуклеазами добавили по 10 нг линеаризованной по Sail плазмиды pUC19 размером 2.7 т.п.н. в качестве контроля активности нуклеазы).
т.п.и. 1_2_3 4_5
7.0 _ .
2,7
Для очистки частиц ретротранспозона Ту1 от реовирусов препарат внеклеточных ВПЧ фракционировали электрофорезом в агарозном геле. Для идентификации частиц Ту1 использовали различие в чувствительности реовирусов и ретровирусоподобных частиц к органическим растворителям. Частицы реовирусов устойчивы к воздействию органических растворителей, так как не содержат липидов, а ретровирусы разрушаются даже в присутствии следовых количеств органических растворителей.
На (рис. 7А) представлен результат фракционирования внеклеточных ВПЧ клеточной линии 79fDvЗg в нативном агарозном геле. Выявляются три окрашенные полосы, отмеченные на (рис. 7А) тонкими стрелками, которые соответствуют трем формам реовирусных частиц. Локализацию частиц Ту1 определяли по гибридизации с (32Р) меченой ДНК плазмиды ррУ-59 (рис. 7В). В выбранных условиях электрофореза частицы Ту! входят в гель на глубину 1-2 мм. Как и ожидалось, обработка ВПЧ хлороформом приводит к освобождению ДНК из частиц Ту1 (рис. 7В), но не разрушает частиц реовирусов.
.7.0
Рис. 7. Фракционирование внеклеточных ВПЧ ^ 2 линии клеток 79f7DvЗg в агарозном геле.
, А - гель, окрашенный бромидом этидия. На
Г дорожку нанесены ВПЧ из 20 мл среды: 1 -
предварительно обработанные хлороформом; 2 -без обработки. Тонкими стрелками отмечена область локализации реовирусных частиц, толстой стрелкой - 7\</-частиц.
В - Саузерн-блот-перенос ДНК из геля, сфотографированного в секции а, с последующей гибридизацией с (32Р) меченой ДНК плазмиды р/7У-59. 1 - ВПЧ, предварительно обработанные хлороформом; 2 - необработанные ВПЧ.
Частицы из соответствующих зон геля, определенных в предварительных экспериментах, переносили на сетки для электронной микроскопии. Электронно-микроскопические фотографии частиц из области геля, соответствующей показаны на (рис. 8А). Частицы имеют сферическую форму, диаметр частицы 75+7 нм. В центре частицы располагается капсид диаметром 46±5 нм, толщина оболочки составляет 15 нм. Частицы, выделенные из области геля, соответствующей реовирусам, показаны на (рис. 8В). Реовирусы имеют внешний диаметр 59+6 нм, диаметр сердцевины 39+5 нм, толщину оболочки 10 нм. Частицы реовирусов из клеток ЭМпШ морфологически сходны с реовирусами из клеток D.melanogaster.
Рис. 8. Внеклеточные ВПЧ культуры клеток 79]Т)\'3£, фракционированные в нейтральном агарозном геле.
А - Гу^-частицы; В - реовирусы. Фотографии получены на электронном микроскопе
'7ет200СХ". Увеличение 300 ОООх.
Идентификация внеклеточных ВПЧ ретротранспозона 7у7 с типичной для ретровирусов морфологией частиц свидетельствует в пользу предположения о инфекционности таких ВПЧ. Вместе с тем, частицы Ту1 отличаются от частиц ретровирусов, так как содержат преимущественно двухцепочечную ДНК, а не РНК, как в случае ретровирусов.
1.6. Трансактивация синтеза ВПЧ Т\1. Так как внехромосомная ДНК-форма Ту1 находится в цитоплазме только в составе частиц, то по количеству этой ДНК можно судить о количестве ВПЧ Ту1. Такой подход позволяет упростить процедуры биохимического анализа и облегчает количественные сравнения.
Препарат ВПЧ, полученный для количественного анализа, содержит еще и митохондрии, что позволяет оценивать количество собранной цитоплазмы по интенсивности флуоресценции полосы митохондриальной ДНК. Полученную ДНК цитоплазмы расщепляли Р^гI. Данная рестриктаза вносит единственный разрыв в митохондриальную ДНК В.у/пй.?, в результате чего она выглядит на электрофорезе в виде единственной полосы размером около 16 т.п.н., что делает ее удобным количественным маркером. РзЯ не расщепляет последовательность Ту1. Видимая после гибридизации с радиоактивным зондом Ту1 полоса 7.0 т.п.н. соответствует полноразмерной линейной форме Ту] из ВПЧ. На (рис. 9), дорожки 1-3, проведено сравнение копийности ВПЧ Ту1 в линиях мух /).уг'п/г5. Количество частиц Ту1 в линии £>у/60 в несколько раз превосходит их количество в линии £>у9. Гибридные мухи содержат равное с линией 1)у9 количество частиц. Межлинейные различия в копийности частиц стабильны и являются свойством линии. На (рис. 9), дорожки 5-7, представлен результат инфекции культивируемых клеток Д.у/п'/м частицами, выделенными из взрослых мух. ВПЧ из 0.5 г мух добавляли к 10 мл растущей культуры в объеме 0.5 мл. Через двое суток клетки переносили в свежую среду, и давали расти в обычном режиме, пассируя в соотношении один к трем, раз в неделю. Процедура инфекции не приводит к видимым признакам шока. Морфология клеток и скорость роста культуры оставались без видимых изменений. Сравнение копийности частиц Ту1 в цитоплазме культивируемых клеток, напротив, обнаруживает многократное увеличение числа частиц через две недели после инфекции. К пятой неделе роста количество частиц заметно
13
снижается и приближается к уровню контроля. Следует отметить, что наблюдаемая индукция не связана с внесением частиц мух, так как количество частиц в мухах много меньше их количества в клеточной культуре, кроме того, среду с частицами мух удаляли в ходе культивирования клеток и в ходе выделения цитоплазмы. Поэтому наблюдаемая индукция частиц 7\»У, несомненно, связана с их образованием в клетках пересеваемой культуры.
Для выяснения вопроса, существуют ли качественные отличия между частицами, выделенными из разных линий мух по способности индуцировать синтез ВПЧ Т\>1 в культивируемых клетках, очищенные препараты ВПЧ линий мух: £)у9, £>у/60, дисгенных мух Р1 и из клеточной культуры, нормализованные по суммарному белку, вносили в растущие клеточные культуры ОМгШз. Только ВПЧ из мух линии Бу160 и дисгенных мух Р1 проявили свойство индуцировать образование ВПЧ Ту1 в клеточной культуре.
1 2 3 4 5 6 7
1#
Рис. 9. Межлинейные различия в копийности ВПЧ тч1 и трансактивация синтеза ВПЧ Ту1 в клетках пересеваемой культуры О.ушйя.
А. Фракционирование
препаратов цитоплазматической ДНК, расщепленной I, в
агарозном геле. Гель, окрашен бромидом этидия. Дорожки 1-3 - линии мух. 1 - 2 - йуМО; 3 - Р1 дисгенные гибриды.
Дорожки 5-7 - пассажи культуры клеток О. \irilis 79РОу38 (С\\).
инфицированные ВПЧ Оу7б0. 5 - СVI - второй пассаж после инфекции; 6 -СУ1 - пятый пассаж после инфекции; 7 - контрольные СУ1. Дорожка 4 - маркер молекулярной массы ДНК V НтдШ.
Б. Саузерн-блот гибридизация геля, сфотографированного в секции А, с зондом (32Р)-меченого внутреннего Х/ю1-фрагмента Ту1.
Миграция фрагментов маркера молекулярной массы X НМЩ отмечена на полях, размеры фрагментов в т.п.н.
23.1
-
. 6-7 4.4
2.3 2.0
2. Сравнительный анализ митохондриальной изменивости у дрозофил группы \irilis.
2.1. Определение нуклеотидной последовательности митохондриального генома О./гйогаКу. Состав генов и геномная организация.
Митохондриальный геном D.littoralis представляет собой замкнутую кольцевую молекулу длиной 16017 п. н. Он содержит набор из 37 генов, которые обычно присутствуют в митохондриальном геноме животных: 22 гена тРНК, 13 генов, кодирующих белки, и 2 гена рРНК. Кроме того, в геноме есть один большой некодирующий участок, соответствующий контролирующему, или А+Т богатому району, расположенному между генами малой субъединицы рРНК и тРНК"е (рис. 10). Порядок генов идентичен таковому у Drosophila yakuba и у других видов дрозофил (Clary & Wolstenholme, 1985). Между генами есть несколько коротких некодирующих участков. Наибольший из них длиной 45 пн расположен между генами atp6 и сохЗ. Все гены, кодирующие белки, кроме coxl, имеют правильный инициаторный кодон: либо ATR метионин, либо ATY изолейцин. Семь генов начинаются с ATR: сох2, atpó, сохЗ, nad4, nad4l, cytb, nadl. Пять генов начинаются с ATY: nad2, atp8, nad3, nad5, nadó.
Недавно, на основн результатов сиквенирования митохондриальных мРНК появились экспериментальные данные ставящие под сомнение ранее принятые представления о начале инициации трансляции генов nadl и nad5.
: у
Рис. 10. Генетическая карта митохондриального генома О./ШогаИ1 (ОепВапк ГО:И447340). Гены, кодирующие белки и рРНК, обозначены стандартными сокращениями. Гены тРНК обозначены в соответствии с однобуквенным кодом. В скобках даны антикодоны. Гены, расположенные на Ы-нити, подчеркнуты.
мРНК этих генов оказалась длиннее с 5' конца чем ожидалось. мРНК гена nadl включает три дополнительных кодона (ШЮ иии 1)Аи), соответсвенно трансляция может инициироваться с неканонического кодона Шв для лейцина, мРНК гена nad5 содержит пять дополнительных кодонов (СТГО ААА
15
TUT UUA UCU) соответсвенно трансляция может инициироваться с неканонического кодона GUG для валина (Montooth et al. 2009).
Вместе с тем, полученные данные не исключают возможности инициации трансляции этих генов с канонических старт кодонов. У некоторых видов насекомых ген coxlm имеет канонического старт кодона. Открытая рамка считывания гена coxl у D.littoralis так же начинается с кодона TCG. Шесть генов, nad2, coxl, atp8, atp6, сохЗ и nad3, имеют канонические кодоны терминации ТАА или TAG. У остальных семи генов кодоны терминации неполные: Т или ТА, и их функциональность, вероятно, восстанавливается постранскрипционно за счет полиаденилирования.
Все 22 гена тРНК, типичные для мтДНК насекомых, идентифицировали по их первичной последовательности, вторичной структуре и антикодону. Антикодоны тРНК D.littoralis идентичны антикодонам соответствующих тРНК D.yakuba. Все тРНК имеют типичную структуру клеверного листа за исключением тPHF?"(AGN). Данная тРНК имеет простую DHU петлю без стебля. Необычная структура не влияет на функциональность молекулы, т.к. кодон AGN, узнаваемый данной тРНК, широко используется в митохондриальном геноме D.littoralis для кодирования аминокислот.
Единственный протяжённый некодирующий белки район митохондриального генма дрозофил локализован между геном малой субьединицы рРНК и геном тРНК"' и идентифицирован как контролирующий район (КР), содержащий ориджины репликации и промоторы для обеих нитей митохондриального генма. Контролирующий район D.littoralis имеет длину 1023 п.н. и относится к типу коротких. Короткие КР описаны как у видов дрозофил относящихся к подроду Drosophila, так и у видов дрозофил подрода Sophophora. Сравнение контролирующих районов D.littoralis и D.virilis показывает наличие консервативных доменов и характерные различия в скорости эволюции между разными областями контролирующего района. В составе КР выявлены две протяжённые полиТ последовательости, необходимые для иницияции репликации мт-ДНК. Одна, вблизи гена тРНК11', другая, на противоположной цепи ДНК в центральной области КР. В центральной части КР, между поли Т блоками идентифицирована высоко консервативная последовательность длиной 275 п.н. известная как HCSE. Если при сравнении изменчивости КР в паре видов D.littoralis и D.virilis величина (р) дистанции равна 0.15+0.01 для целых КР, то величина (р) дистанции при сравнении только HCSE в три раза меньше: р=0.05±0.01 и не превышает изменчивости нуклеотидных последовательностей белок-кодирующих генов этих же видов. В области контрольного района примыкающей к гену HSpPHK выявлена последовательность из четырёх G, или «G остров», предположительно являющийся частью сигнальной последовательности для терминации синтеза N нити мтДНК.
Нуклеотидная изменчивость митохондриальных генов, кодирующих белки, позволяет оценить мутационное давление и давление отбора для индивидуальных генов. Нуклеотидная изменчивость каждого из генов,
16
измерялась как отношение частоты синонимичных (Ks) и несинонимичных (Кп) замен на синонимичный сайт и на несинонимичный сайт соответственно, при сравнении последовательностей D.littoralis и D.virilis (GenBank ID: ВК006340). Соотношение Kn/Ks во всех 13 генах гораздо меньше единицы, что указывает на сильное действие стабилизирующего отбора. Гены nadó, nad3 и nad4L более изменчивы, чем остальные. Наиболее консервативный ген D.littoralis - coxl.
Межгенные спейсерные последовательности - самая изменчивая часть митохондриального генома. Их полиморфизм наблюдается не только между близкородственными видами, но и между расами и внутривидовыми формами. Самый протяженный спейсер, разделяющий atpó и сохЗ, имеет длину 45 пн. Нуклеотидная последовательность этого спейсера и прилежащих фрагментов генов atpó и сохЗ была определена у девяти видов дрозофил группы virilis. Все проанализированные варианты спейсера могут принимать форму шпильки (рис. 11). Наименьшую длину имеет шпилька D.kanekoi, что позволяет идентифицировать минимальный, или основной элемент шпильки. У остальных видов дрозофил шпильки более длинные за счет добавления нескольких (ТА) динуклеотидов, иногда с несколькими точковыми различиями. Шпильки разной длины на стыке atpó и сохЗ характерны только для группы virilis; у других насекомых и дрозофил эти гены расположены встык, без спейсера. Это наблюдение подсказало возможное использование микросателитов (ТА)п в митохондриальных геномах дрозофил группы virilis для обнаружения и характеристики митохондриальных псевдогенов.
ш - t
t ♦ g
а - t
t - a
íiípé) -TMatíitit.3 - t • i
Ваз дрозофилы Основной элемент шпильки Вцзоспецифич кый элемент шпллькп (число ТАпар) Номер сиквенса ПЦР фрагмент а в GenBank
Drüiophiiakaickoi 5'.АТАГГ-3' 2 FJ536197
DrosapMla а. americana J'-TIATT-3' 7 FJ536199
Drcsophila novantevxana 5'- ТТАТТ -3' 9 FJ536203
Drozophiialittoraíis 5'-ТГАТА-3' 10 FJ536201
Drosophüayirilis 5'-ТТАТА-3' 11 FJ536196
Drosophüaa. texana 5'-ТГАТГ-3' 11 FI536204
Dimophila ezoana 5'- ТГАТА-3' 12 FJ53619S
Drosophüa montana 5'-ТТАТТ-3' 17 FJ536202
Drosopíiüa lacicala 5'. ТТАТТ-3' 25 FJ536200
Рис. 11. Возможная шпилечная структура спейсерной последовательности мрб/сохЗ ОМпогаИ5 и изменчивость длины шпильки у девяти видов дрозофил группы хчгШх. Основной элемент шпильки выделен затемнением. Стоп и старт-кодоны фланкирующих генов показаны жирным шрифтом. Пары нуклеотидов Уотсона-Крика обозначены "-", а О-Т пары обозначены "+".
2.2. Митохондриальная ДНК в ядре. Выявление микросателлитных последовательностей (ТА)п в митохондриальных геномах дрозофил группы virilis позволило предположить возможность инсерции ретротранспозона Tvl в последовательность митохондриальной ДНК или митохондриального псевдогена. Инсерция Tvl в последовательность (ТА)п митохондриального псевдогена пометит его и позволит идентифицировать в геноме с помощью простой методики ПЦР. Для проверки этой гипотезы были разработаны две пары праймеров для ожидаемой последовательности митохондриального псевдогена, содержащего гены atpö/сохЗ с инсерциями Tvl в прямой и обратной ориентациях. In silico ПЦР с использованием этих праймеров и генома D.virilis (UCSC веб-сервер http: //genome.ucsc.edu/index.html) дал отрицательный результат. Результаты экспериментальной проверки представлены на (рис. 12). Положительные результаты получены только на ДНК самцов D. virilis. Клонирование полученных ПЦР-фрагментов и секвенирование отдельных клонов подтвердило их химерную ТуУ-митохондриальную природу. Этот результат позволяет картировать митохондриальный псевдоген atp6/cox3 на Y -хромосоме D.virilis. Позитивный сигнал, идентичный таковому у самцов D. virilis, был получен с использованием матрицы геномной ДНК клеточной культуры 79f7Dv3g D.virilis. Отрицательный результат данного ПЦР-теста на ДНК самок D.virilis не исключает возможности существования митохондриального псевдогена atpö/сохЗ в их геноме, но не маркированы« инсерциями Tvl.
5 6 7 8
г з
7 8
900 Ьр
_950Ьр
Рис. 12А. - ПЦР-идентификация митохондриального псевдогена Шрб ОМгШз , ассоциированного с ретротранспозоном Ту1.
Рис. 12В. - ПЦР-идентификация митохондриального псевдогена сохЗ ОМгШя, ассоциированного с ретротранспозоном
Каждая дорожка показывает результат ПЦР-анализа одной мухи. Черточка указывает локализацию ожидаемого ПЦР-фрагмента. Линии 1. 2 -самцы ОЛшогаНг, 3, 4 -самки ОЛ~ШогаИ$\ 5, 6 - самцы О.ушйг; 7, 8 - самки ОМгШз.
Для точного картирования сайтов интеграции Ту1, последовательности были удалены из сиквенсов химерных ПЦР-фрагментов и проведено выравнивание полученных митохондриальных последовательностей с последовательностями митохондриального генома О.уш/и. Во всех трех проанализированных случаях интегрировался в районе спейсера мрб/сохЗ, в микросателлитный район сразу после октануклеотида 5' АТАТАТАТ 3'
Обнаружение пседогенов агрб/сохЗ в геноме £>.угп& поднимает вопрос о времени их появления и частоте этого процесса. Для ответа на этот вопрос был проведен филогенетический анализ фрагментов генов мрб и сохЗ у дрозофил группы virilis, включая последовательности митохондриальных псевдогенов (рис. 13). Хотя филограммы были построены только на основе сравнительно короткого митохондриального фрагмента, они хорошо согласуются с известной филогенией дрозофил группы утШ (ТгосктоПоп, 1982). Все последовательности псевдогенов кластеризуются с предковыми митохондриальными последовательностями £).у/п7«, что указывает на их недавнее происхождение. Случай с геном Мрб особенно информативен. Митохондриапьный псевдоген из клеточной культуры более сходен с митохондриальным геном мух, чем митохондриапьный псевдоген из той же линии мух. Следовательно, образование митохондриальных псевдогенов -частый процесс, идущий и в настоящее время, по крайней мере в геноме клеточной линии. Этот факт может быть связан с повышенной активностью ретротранспозонов в изучаемой клеточной линии в которой наблюдается 10-кратная амплификация Ту1.
Phyiad virilis
Phylad americana
Phyiad montana
A
O.virilh ctípó i NUM ¡ «ti><>
гаи ni:Mh.' w atp''
uípó
ioo i
59L,D.novamcxicana aip(> J).ki¡ncko¡ сир*
f).u <int?i\. ..
tí), a. шачи D.wvam f.'A
D.iiHoralL* íttpb Dx'-oaua ¡ttpd />. nto>ih;n<.¡ cüpA
100
<0
ХЬки-Ы,
inp f»
D.rukuht
atp6
üL
D.mdimogosier atp6
в
7-j D.nonunrxU aiu/ a>x.i 'ООП Ц.иехшш <:<>хЗ I_ D a. c,>ne<-icam ¿:«x3
O.v
■ ( У/ N1 JM'I caxS
'} kuncb/i Cfi.xi
_D.ezi.Htna £0x3
„_ !).UiCico!<; rov:"
001..... и.....
Phylad americana Phylad virilis Pbyiad montane
100'.......... ;)
wikiihri «'X?
Рис. 13. Эволюционные взаимоотношения дрозофил группы virilis, основанные на митохондриальных последовательностях. Дерево минимальной эволюции построено в MEGA4.
A. Филогенетический анализ фрагмента митохондриального гена и митохондриального псевдогена (NUMT) atp6. Использован фрагмент длиной 261 пн, соответствующий позициям 4478-4738 полной последовательности генома D.virilis (GeneBank- ВК006340)
B. Филогенетический анализ фрагмента митохондриального гена и митохондриального псевдогена (NUMT) сохЗ. Использован фрагмент длиной 301 пн, соответствующий позициям 4791-5091 полной последовательности генома D.virilis (GeneBank - ВК006340)
3. Изучение митохондриальной изменчивости в природных популяциях дрозофил группы virilis. В данном исследовании впервые изучена митохондриальная изменчивость всех видов группы virilis. Изучена она была по трем признакам. Я/лЯ-ПДРФ полиморфизм позволяет с низким разрешением охарактеризовать весь митохондриальный геном. Для увеличения разрешающей способности метода были проанализированы фрагменты нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и coxl. Филогения группы, построенная по результатам анализа межвидовой митохондриальной изменчивости, соответствует общепринятой классификации Трокмортона (Throckmorton, 1982).
Далее был проведен анализ внутривидовой митохондриальной изменчивости для четырех видов группы: D.virilis, D.montana, D.americana и D.littoralis. Анализ обнаружил характерные отличия синатропного вида D.virilis от остальных трех видов, образующих природные популяции. Вид D.virilis мономорфен на всем ареале, в то время как виды, образующие природные популяции, представлены совокупностью митохондриальных гаплотипов.
Для объяснения наблюдаемых отличий была предложена гипотеза, согласно которой высокая изменчивость видов, образующих природные популяции, объясняется наличием скрытой внутрипопуляционной структуры, образованной несколькими симпатрическими расами. Для проверки этой
гипотезы была подробно проанализирована внутрипопуляционная изменчивость у D.americana и D. littoralis. Проведённый анализ позволил выявить расовую структуру локальных популяций D.littoralis, что подтверждает нашу гипотезу.
3.1. ПДРФ-анализ изменчивости мгДНК в группе virilis. Исследование полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) мтДНК одиннадцати видов дрозофил группы virilis проводилось с использованием мелкощепящей рестриктазы Hinñ, которая разрезает мтДНК дрозофилы на 9 -14 фрагментов. На (рис. 14) приведен результат фракционирования Hinñ рестрикционных фрагментов митохондриальной ДНК одиннадцати видов дрозофил группы virilis. Каждый вид обладает уникальным набором полос, отличающим его от любого другого по одному или нескольким признакам. Суммирование размеров фрагментов для каждого вида дает минимальную оценку размеров митохондриального генома. Эта величина оказалась различной у разных видов и колебалась от 15.5 до 17.5 т.п.н., что близко к ожидаемой величине 16 т.п.н. Исключением оказалась D.borealis, у которой размер ДНК митохондрий оказался существенно выше, чем у остальных - 19.7 т.п.н.
о •< á: j > ш —' » и. 2 -5
Рис. 14. Межвидовой ЯшЯ-ПДРФ митохондриальной ДНК в группе virilis. Сокращения видовых названий: D.virilis - Vi; D.americana americana -Aa; D. americana texana - At; D.novamexicana - No; D.lummei - Lu; клеточная культура D.virilis - CVi; D.kanekoi - Ka; D.ezoana - Ez; D.littoralis - Lt; D.borealis - Во; D.flavomontana - Fl; D.montana - Mo; D.lacicola - Le. Маркер молекулярной массы - двойное расщепление ДНК фага X EcoRl и ffindIII. Длины фрагментов (сверху вниз): 21,226; 5,148; 4,973; 4,268; 3,530; 2,027; 1,904; 1,584; 1,375; 0,947; 0,831; 0,564 т.п.н.
Рассчитаный по числу общих фрагментов индекс генетического сходства между видами (F) (доля общих фрагментов) показывает, что виды филады virilis значительно ближе друг к другу, чем виды филады montana.
Усредненные значения F для внутри- и межфиладных сравнений приведены в (табл. 1). Максимальные значения F соответствуют американской ветви филады virilis (D.a.ame ricana, D.a.texana, D.novatnexicana) и составляют в среднем 0,753. Минимальные значения F соответствуют D. kanekoi - 0,121. Данный вид одинаково удален от обеих филад.
3.2. Изменчивость 3'- концевого фрагмента гена I6S рРНК в группе virilis.
Нами было проведено секвенирование З'-концевого фрагмента гена 16S рРНК длиной 478 нуклеотидов у одиннадцати видов дрозофил группы virilis. Изучаемый фрагмент соответствует позициям NN 12902-13380 мт-генома D.yakuba (GenBank ID: NC_001322). Значения генетических дистанций (Р) при попарных сравнениях в группе приведены в (табл. 1). Среднее значение (Р) в группе 0,009. Максимальные значения Р отмечено у D.kanekoi - 0,087, что указывает на наибольшую дивергенцию этого вида от общего предка. Для определения характера нуклеотидной изменчивости гена 16S рРНК, проведено сопоставление изменчивых сайтов с предполагаемой вторичной структурой 16S рРНК. Для этого, с использованием известных скелетов вторичных структур рРНК большой субчастицы рибосомы других организмов была построена вторичная структура фрагмента 16S рРНК дрозофил группы D. virilis и выделены функционально значимые структурные элементы. Нуклеотидных замещений оказалось больше в стеблевых структурах, в то время как открытые петельные области, участвующие в формировании третичной и четвертичной структуры, оказались более консервативными. Выявлены филогенетически информативные замещения. Замещения 221 Т-А и 366 G-A объединяют кластер D.a.americana, D.a.texana и D.novamexicana; замещение 140 A-G, объединяет D.montana, D.flavomontana и D.lacicola. Несмотря на низкую вариабельность изучаемой последовательности, наблюдаются обратные и конвергентные мутации (гомоплазия). Так замещение 140 A-G, характерное для филады montana, должно было произойти независимо у предка D.montana, D.lacicola и D. flavomontana и у филогенетически удаленного от них вида D. ezoana.
3.3. Изменчивость фрагмента гена coxl в группе virilis. Исследованный фрагмент гена coxl длиной 630 п.о. находится в первой трети гена и соответствует позициям 57 - 687 гена coxl D.virilis (GenBank ID: BK006340). Всего обнаружено 154 полиморфных сайта, из которых 95 являются филогенетически информативными.
Мутации представлены в основном транзициями. Средняя величина генетических расстояний (Р) в группе по данному признаку составляет 0,088. Наименьшее значение - между D.americana и D.novanexicana - 0,003, наибольшее - у D.flavomontana - 0,118. Значения гентических дистанций представлены в (табл. 1). Филогения группы virilis, построенная по данным фрагмента гена coxl, представлена на (рис. 15).
Рис. 15. Филогения группы virilis, построенная по данным изменчивости гена
субъединицы 1 цитохром с оксидазы (coxl). Дендрограмма посторена по методу ближайшего соседа (Neighbor-Joining) с bootstrap-поддержкой 1000 псевдореплик. В качестве внешней группы используется D.melanogaster (GenBank ID: AF200828).
Несмотря на то, что значения генетических расстояний (Р) в группе по гену сох1 значительно выше, чем по гену /65 рРНК, вероятность повторных замещений, занижающих истинную степень дивергенции, невысока. Об этом свидетельствует значение соотношения транзиций и трансверсий (Тз/Ту), которое внутри группы у/п'/и не опускается ниже единицы (табл. 1). При сравнении й.утШ с представителем другого подрода - D.melanogaster количество трансверсий резко возрастает. Соотношение Те/Ту - 0,76.
Таблица 1. Характеристика изменчивости мтДНК в группе virilis.
(F) 16SpPHK coxl
(Р) (Р) Ts/Tv
Группа virilis 0,24 0,009 0,088 1,7
Филада virilis 0,48 0,005 0,038 1,735
Филада montana 0,17 0,01 0,089 2,575
Филада virilis/montana 0,14 0,009 0,102 1,189
Грп. virilis/D.melanogaster - - 0,126 0,76
D.mortana D. laa'cola
-D. ЛаютвЛаш
-D. bcreelis
-D.littoralis
-D. ezœna
-D. kaneloi
—D. virilis -Olunrrei
5?l_i
D. americana. tex D. iwamsxicam D. americana am
-D. msiancgaster
(F) - средняя доля общих рестрикционных фрагментов tfinfl для набора линий; (Р) -средние значения попарных генетических дистанций; Ts/Tv - соотношение транзиций и трансверсий.
Внутривидовая изменчивость мтДНК в дрозофил группы virilis. Изучен полиморфизм мтДНК у четырех видов дрозофи группы virilis: D.littoralis, D.americana, D.virilis, D.montana.
3.4. Митохондриальная изменчивость D.littoralis. Данный вид, образует природные популяции в умеренном и субтропическом поясах Евразии от Финляндии до Ирана. Ареал фрагментирован. Всего было проанализировано 255 изосамочных линий D.littoralis из семи географических точек в разных частях ареала При помощи метода ЯшП-ПДРФ в популяциях D.littoralis был
23
выявлен полиморфизм мтДНК. Всего было обнаружено 14 мт-гаплотипов (Рис. 16). Популяция из Ростовской области (РО) (пос. Рыбинский) представлена наибольшей выборкой - 206 линий. Ее генетическая структура складывается из двух мажорных мт-гаплотипов (Н1 и Н2), имеющих примерно равную численность и 11 минорных, представленных единичными находками. Генетические структуры популяций Ростовской и Московской (МО) областей сходны. В грузинской популяции одним из доминирующих гаплотипов является Н7. Гаплотип Н1 широко распространен и встречается по всему ареалу В.1шогаИ$. Сайты, мутации в которых приводят к взаимным превращениям трех мажорных гаплотипов (Н1, Н2 и Н7), находятся в точках с низким уровнем давления отбора: сайт 15.298 (Н1 <-> Н2) находится в гипервариабельной области некодирующего АТ-района; сайт 8.582 (Н1 <-> Н7) - в третьем положении одного из кодонов высокополиморфного гена N04.
Н1 нг из Н4 Н5 Н6 Н7 Н8 ж н«
i-iit.fi 1?-,:.
Рис. 16. Я1пП-ПДРФ мтДНК ВЛШогаИз и рестрикционная карта митохондриального генома О.1шога1 ¿5 с локализацией специфичных для индивидуальных мт-гаплотипов сайтов ШпП. Короткие радиальные штрихи обозначают консервативные сайты НтП', средние -полиморфные сайты НтП\ длинные - сайты НтП, мутации в которых приводят к взаимным превращениям трех мажорных гаплотипов (Н1, Н2 и Н7).
Следовательно, возможно многократное возникновение этих гаплотипов в истории вида. Из карты рестрикции следует, что полиморфизм распределен
неравномерно по длине молекулы. Выделяется две полиморфные области, соответствующие регуляторному АТ-району и блоку полиморфных генов ND4 - ND6. Для углублённого анализа внутривидовой дифференциации митохондриального генома D.littoralis была охарактеризована нуклеотидная изменчивость фрагмента гена coxl D.littoralis. Секвенирование и сравнение изменчивости гена coxl в выборке линий D.littoralis из различных частей ареала выявляет 41 полиморфный сайт. Филогенетический анализ исследованного фрагмента гена сох1 D.littoralis, позволяет выделить южную популяцию, образованную линиями из Закавказья, Ирана и некоторыми линиями из пос. Дивноморское (Краснодарский край). Данный кластер преимущественно состоит из гаплотипа Н7. Северная популяция образована линиями из Ростовской и Московской областей, Финляндии, Хакасии и некоторыми линиями из пос. Дивноморское. Численная характеристика нуклеотидной изменчивости гена coxl D.littoralis представлена в (табл. 2). Величины генетических дистанций (D) внутри локальных популяций северной группы равны или превышают величину D между локальными популяциями северной группы. Величина (D) между северной и южной популяциями намного выше внутрипопуляционных значений (D), что говорит о дифференциации вида на северную и южную популяции и об отсутствии дифференциации внутри северной группы популяций.
3.5. Парсимониальный нетворк (SNP) мт-гаплотипов D.littoralis.
Парсимониальная сеть митохондриальных гаплотипов, построенная по данным изменчивости фрагмента гена coxl и Hinñ-ПДРФ тотальной мтДНК D.littoralis приведена на (рис. 17).
изменчивости фрагмента гена сох! и ПДРФ тотальной мтДНК О.й/ога/и. О - линии мт-гаплогруппы Н7, линии мт-гаплогруппы Н1, линии мт-гаплогруппы Н2. Буквы в начале названий линий обозначают место соора, цифры - год сбора и номер линии. В конце названия указан митохондриальный ЯтП-гаплотип. РО - пос. Рыбинский
(Ростовская обл.); МО - пос. Куликово (Московская обл.); DVN - пос. Дивноморское (Краснодарский кр.); лабораторные линии из коллекции лаборатории генетики ИБР РАН даны под номерами: 340, 327, 357 - Грузия, 1971; 360 - Хакасия, 2003; 1013 - Швеция, 1970; 1001.3 - Иран; 1091.0 - Канада
Из полученной схемы следует, что предковым является гаплотип Н7. Наиболее распространенные в северных популяциях гаплотипы, Н1 и Н2, возникали в истории вида неоднократно. Интересен тот факт, что часть линий из популяции Дивноморского (DVN) попала в кластер южной популяции, другая часть в кластер северной. Это может быть объяснено тем, что между территориями северной и южной популяций пролегает Кавказский хребет, который служит преградой, препятствующей потоку генов между этими популяциями. Однако по побережью возможна миграция, благодаря чему на Черноморском побережье Краснодарского края возникла зона вторичного контакта северной и южной популяций.
3.8. Митохондриальная изменчивость D.americana. По признаку наличия или отсутствия слияния Х-хромосомы с четвёртой хромосомой, вид подразделяется на два подвида. У D.americana americana хромосомы слиты, тогда как у D.americana texana этого слияния нет.
Изменчивость мтДНК D.americana была проанализирована для обеих хромосомных форм D.americana в выборках из природных популяций при помощи ЯшП-ПДРФ. В работе использовались 45 изосамочных линий из 6 географических точек. Всего было выявлено 10 митохондриальных Hinñ -гаплотипов, из которых два - На1 и На8 встречались у обоих подвидов D.americana. Для выявления возможной дифференциации митохондриального генофонда обеих подвидов D.americana был проанализирован полиморфизм гена coxl у 23 линий D.americana обеих хромосомных форм с известными ЯшП-ПДРФ мт-гаплотипами. Характеристика нуклеотидной изменчивости гена coxl D.americana приведена в (табл. 2). Было обнаружено 43 полиморфных сайта. Аминокислотных замен не обнаружено. Значения генетических дистанций (D) не выявляют дифференциации популяций D.americana ни по географическому, ни по хромосомному признакам. Величины (D) внутри каждой хромосомной расы не отличаются от величины (D) между ними. Полученные результаты указывают на единство митохондриального генома вида.
В сравнении с D.littoralis изменчивость мтДНК D.americana имеет некоторые особенности. Различается богатство генетических вариантов и их относительное распределение - выравненность. Значения индекса генетического разнообразия (Н), отражающего эти два параметра для D.littoralis и D.americana составляют 1,71 и 2,65 соответственно. Различия статистически достоверны. Причиной такого различия может быть индивидуальная филогеографическая история видов, в частности "бутылочное
горлышко" в истории О.ИпогаИя и последующая демографическая экспансия на Северо-Европейской части ареала.
Таблица 2. Характеристика изменчивости мтДНК D.littoralis иD.americana.
(F) (P) coxl Ts/Tv coxl (D) coxl (H)
D.littoralis 0,706 0,013 6,7 - 1,71
D.litt Сев. - - - 0,007 -
D.litt Южн. - - - 0,010 -
D.litt Сев./Южн. - - - 0,260 -
D.americana 0,62 0,009 3,2 2,65
D.americana F - - - 0,010 -
D.americana U - - - 0,008 -
D.americana F/U - - - 0,009 -
(F) - средняя доля общих рестрикционных фрагментов Hinñ для набора линий; (Р) -средние значения попарных генетических дистанций; Ts/Tv - соотношение транзиций и трансверсий; (D) - внутри- и межпопуляционные генетические дистанции; (Н) -генетическое разнообразие (индекс Шеннона), coxl - фрагмент последовательности гена coxl. D.americana F - хромосомная форма со слиянием 4й и X хромосом (F-fused); D.americana U - хромосомная форма без слияния 4й и X хромосом (U-unfused
3.7. Митохондриальная изменчивость D.virilis. Единственный синантропный вид группы, D.virilis образует плотные популяции, развиваясь в массе на различных антропогенных субстратах, претерпевая резкие колебания численности. ЯшЯ-ПДРФ мт-ДНК D.virilis из разных географических районов (Рис. 18) обнаруживает крайне низкий уровень внутривидовой изменчивости. Единственное обнаруженное отличие найдено у мух, собранных на Сейшельских островах. ДНК митохондрий в этой линии содержит один дополнительный Hinñ сайт. Возможное объяснение столь низкого полиморфизма этого вида на огромном ареале, состоит в том, что мухи заселили его недавно, распространившись из одной популяции.
3.8. Митохондриальная изменчивость D.montana. Вид широко распространён в северном полушарии и дифференцирован, как минимум, на две популяции, северо-американскую - (D.m.standard) и европейскую -(D.m.ovivororum), У D.montana. Выявляется три ffmfl-ПДРФ мт-гаплотипа. Гаплотипы Hml и Нт2 характерны для популяций Европы и Восточной Сибири. НшЗ был обнаружен у линий из Северной Америки. Данный мт-гаплотип практически совпадает с гаплотипом D.lacicola, обитающего с ним симпатрически, но имеющего ряд экологических отличий. Изменчивость гена coxl между D.montana и D.lacicola соответствует внутривидовому уровню, характерному для других видов группы virilis (P = 0,019). Полученные данные вместе с данными по скрещиваемости видов D.montana и D.lacicola позволяют предполагать возможность интрогрессивной гибридизации между этими двумя видами на территории Северной Америки.
D. v 9 Батуми, 1965
D.V 10 Баку, 1965
D.V 25 Мцххета, 1967
D.V 40 Магарач, 1968
D.V 59 Сейшелы, 1984
D.V 101 Япония, 1966
D.v 118 Япония, 1993
D.V 119 Китай, 19 93
D.v 121 Чили, 1993
D.v 122 Аргентина, 1993
D.V 124 Калифорния, 1993
D.v Sa96 Япония, 1996
D.v 160 Лаб ораторная линия
D.v 123 Пасадена, США 1993
Рис. 18. ЯшП-ПДРФ митохондриальной ДНК йи'л/ы различного географического происхождения. Обозначения к дорожкам соответствуют номерам линий.
Внутрипопуляционная изменчивость.
3.9. Динамика внутрипопуляционного полиморфизма Д.ИИогаШ. ПДРФ-анализ сборов йЛШогаШ, проведенных в природной популяции (пос. Рыбинский, Ростовская обл.) на протяжении десяти лет, выявил стабильное соотношение частот мажорных митохондриальных гаплотипов на фоне ежегодных колебаний численности мух. Минорные гаплотипы представлены единичными находками.
Судя по количеству пойманных самок, численность Шшога/и значительно колеблется в разные годы (Рис. 19). Если бы митохондриальные гаплотипы были эволюционна нейтральными, то резкие колебания численности популяции неизбежно привели бы к изменению частот гаплотипов и даже к полной потере некоторых из них. Так как в популяциях ОЛШогаШ вместо ожидаемой изменчивости имеет место постоянное соотношение частот основных гаплотипов, что позволяет сделать вывод, что либо гаплотипы имеют самостоятельное приспособительное значение, либо маркируют географические расы, образующие зону смешения на исследуемой территории, либо, что более вероятно, служат маркерами нескольких экологических рас, занимающих одну территорию.
■ ж □ N2 □ Мжюрше гапгютипы
Рис. 19. Популяционная динамика митохондриальных гаплотипов
природной популяции ОЛШогаШ (пос. Рыбинский, Ростовская обл. (РО)). Столбцы показывают численность выборок и соотношение мт-гаплотипов на протяжении десяти лет.
Наличие частично репродуктивно изолированных в природе рас можно проверить, определив сопряженность изменчивости митохондриальных и полиморфных ядерных маркеров. Длительное частично изолированное существование должно привести к формированию достоверных отличий по высокоизменчивым ядерным маркерам и, независимо от них, к фиксации различных митохондриальных гаплотипов в пределах расы. Положительная корреляция между определенным митохондриальным гаплотипом и ядерным маркером может послужить доказательством реальности существования рас. В качестве высокополиморфного ядреного маркера использовали аллельные формы длинных концевых повторов (ДКП) ретротранспозона Т\>1. На (рис. 20) показан полиморфизм изосамочных линий ОЛШогаШ по аллельным формам ретротранспозона.
¡234 5 (1 7 Я Р 10 II ¡2 13 14 13
Рис. 20. Полиморфизм Ц* длин ПЦР-фрагментов ДКП
ретротранспозона 7>/.
Дорожка 1 - маркер молекулярной массы.
Дорожки 2-15 - анализ Длинная индивидуальных самок.
Форш-- _ - -
Короткая форма
Полиморфизм
заключается в наличии одной или двух форм ДКП. Клонирование и секвенирование длинной и короткой форм ДКП показало, что полиморфизм вызван делецией внутреннего прямого повтора размером 48 п.о. Вероятно, делеция произошла в результате гомологичной рекомбинации. Интересно, что повтор специфичен для йЛшогаИз. Та же последовательность в ДКП ЭМпШ существует в единственной копии. Сопряжение признаков митохондриального
12 3 4 5 6 7 -1 9 /0 II ¡2 13 14 13
им» щи» а »
_ . , 1? ^ ® ш ш ш - Щи
- 1111.- -Ни
гаплотипа и аллельных форм Гу/ показано в (табл. 3). Сравнение наблюдаемых значений таблицы с ожидаемыми в случае независимости митохондриального гаплотипа от числа аллельных форм ДКП Ту1 позволяет отвергнуть гипотезу о независимости этих признаков. Значение критерия у? = 13,45>{3,84; 6,64; 10,83} при одной степени свободы позволяет отклонить гипотезу о независимости признаков на уровне значимости 0,001. Следовательно, экологические расы, маркированные митохондриальным гаплотипом, действительно существуют в популяциях О.ГмогаИз.
Таблица 3. Сопряжение признаков митохондриального гаплотипа и аллельных форм
Tvl в выборке изосамочных линий D.littoralis.
1 форма ДКП Tvl 2 формы ДКП Tvl Z
Мт-гаплотип Н1 15 30 45
Мт-гаплотип Н2 25 8 33
Е 40 38 78
Цифры соответствуют количеству изосамочных линий.
4.1. Получение новой пересеваемой клеточной линии Drosophila melanogaster из линии мух инфицированных внутриклеточной эндосимбиотической бактерией Wolbachia pipientis в природе. Wolbachia pipientis - облигатно-внутриклеточная бактерия, инфицирующая ряд видов членистоногих и филярий. На уровне организма инфекция Wolbachia может вызывать партеногенез, феминизацию генетических самцов, бессамцовость, цитоплазматическую несовместимость или проходить бессимптомно. Дополнительный интерес исследованиям придает недавнее открытие возможности переноса ДНК бактерии в геном насекомого-хозяина. На клеточном уровне эффекты, вызываемые Wolbachia, менее изучены.
В данной работе получена новая пересеваемая клеточная линия Drosophila melanogaster - Dm2008Wbl из эмбрионов инфицированных Wolbachia в природе.
Распространенные клеточные культуры дрозофилы S2, S3, Кс, 67j25D не содержат Wolbachia, что может быть вызвано как случайностью, так и гибелью бактерии в процессе жесткой процедуры стерилизации эмбрионов, использованной при получении этих линий.
Для решения этого вопроса, новая клеточная линия D.melanjgaster была получена с применением более мягкой методики обработки эмбрионов.
Самок линии Черноморца инфицированных Wolbachia в природе скрещивали с самцами линии F32 и из эмбрионов Fi получали клеточную линию. Наличие Wolbachia. Определяли методом ПЦР с праймерами, специфичными к гену wsp. Полученная культура была названа Dm2008Wbl. Морфология клеток культуры имела некоторые особенности (Рис. 21А). Клетки округлые, мелкие, с диаметром около 10 мкм, что вдвое меньше типичного диаметра клеток пересеваемых культур дрозофилы. Они образуют плотные, медленно растущие
колонии, крепко прикреплённые к поверхности пластика. В культуре стабильно присутствует Wolbachia.
Полученную культуру использовали как источник для выделения Wolbachia. Метод основан на механическом разрушении клеток стеклянными шарами с последующим отделением Wolbachia от неразрушенных клеток путем фильтрации. Полученные препараты бактерий использовали для заражения клеток S2, не содержащих Wolbachia. Результат представлен на (рис. 21В). Появление специфичной для Wolbachia ПЦР-полосы происходило только в случае обработки клеток S2 живыми бактериями. Внесение термоинактивированных бактерий не вызывало инфекции. Этот результат свидетельствует о наличии живых бактерий в культуре Dm2008Wbl.
Нуклеотидная последовательность специфичных для Wolbachia ПЦР фрагментов из мух и обеих клеточных линий D.melanogaster оказалась идентичной и на 99% совпала с известной последовательностью гена белка внешней оболочки бактерии (wsp) Wolbachia pipientis strain wMel зарегистрированной в GenBank AF338346. Доказательство существования в культуре живых бактерий получено при обработке клеток тетрациклином. На (рис. 21В) видно постепенное исчезновение специфичной для Wolbachia ПЦР-полосы в течение 3-х последовательных пассажей при росте на среде с антибиотиком.
Рис. 21 .А. монослой клеток Dm2008Wb]. В. ПЦР идентификации бактерий Wolbachia. Дорожки 1 и 9 - маркёры молекулярной массы. Стрелка отмечает положение диагностической полосы, указывающей на наличие Wolbachia.
Дорожки 2, 3, 4 - последовательные пассажи клеток линии Dm2008Wbl, растущие на среде с добавлением тетрациклина 10 мкг/мл. Дорожка 4 - первый пассаж; 3 - второй пассаж; 2 - третий пассаж. Дорожка 5 - линия мух Черноморка. Дорожка б - линия клеток Dm2008Wbl. Дорожка 7 - клетки линии Schneidert. Дорожка 8 - клетки линии Schneidert инфицированные бактериями Wolbachia, выделенными из клеток Dm2008Wbl.
Удобство манипулирования с клеточными культурами и возможность их криогенного хранения делает клеточные культуры надежным банком определенных штаммов И'о1ЬасЫа, гарантирующим неизменность их свойств в постоянных условиях культуры. Возможность выделить Иго1ЬасЫа в большом количестве позволяет разрабатывать методы её трансформации плазмидными векторами. Клеточные культуры могут быть полезны и для изучения экспрессионного отклика генома клеток насекомых на инфекцию, что может составить основу для изучения тонких молекулярно-генетических взаимодействий У/о1ЬасЫа и клеток хозяина.
Выводы:
1. Разработан метод выделения и клонирования функционально активных ретротранспозонов из ВПЧ клеток пересеваемых культур. Данным методом клонировано новое семейство ретротранспозонов В.и«/«, названное Ту], определена его нуклеотидная последовательность. Анализ структуры и экспрессии 7у/ подтвердил его функциональную активность. Идентифицированы ВПЧ Ту/ и проведено их электронно-микроскопическое описание. Основной формой Ту/ в составе частиц является двуцепочечная ДНК.
2. Перемещения Ту/ обнаружены в клеточной культуре и в геноме мух после дисгенного скрещивания. В отличие от традиционной схемы гибридного дисгенеза, копийность /V/ в обеих родительских линиях почти одинакова, но в индукторной линии резко повышено количество ВПЧ Ту/. Амплификация Ту/ в пересеваемой клеточной культуре складывается из увеличения числа хромосомных копий и персистенции внехромосомных линейных и кольцевых форм.
3. Выявлена трансактивация синтеза ВПЧ Ту/ в растущей клеточной культуре ЭмпШ после инфекции препаратом ВПЧ из мух индукторной линии /). у/л/и.
4. Определена полная нуклеотидная последовательность митохондриального генома й.НиогаИх и проведен её анализ. В У хроомосоме В.у/п//.? идентифицированы митохондриальные псевдогены, содержащие инсерции ретротранспозона Ту/. Обнаружен процесс возникновения новых копий митохондриальных псевдогенов в клетках пересеваемой культуры.
5. Сравнительный анализ изменчивости мтДНК в группе \<1гШв выявил существенные различия в популяционной структуре видов, образующих природные популяции (ОЛШогаШ, О.атепсапа, Э.тошапа), и синантропного вида Лу/п/«. Синантропный вид ОМгШз мономорфен, в то время как виды, образующие природные популяции, представлены совокупностью нескольких мт-гаплотипов в локальных популяциях.
6. Наблюдения за популяционной динамикой митохондриального полиморфизма в локальной популяции О.ПпогаИя в течение 10 лет выявили
равновесные колебания частот двух мажорных мт-гаплотипов на фоне резких колебаний общей численности.
7. Выявлена сопряженность несцепленных ДНК маркёров: аллельных форм ДКП Tvl и митохондриальнЫх гаплотипов в локальной популяции D.littoralis. Проведённый анализ позволил выявить подразделенность популяции на две, генетически маркированные расы, обитающие симпатрически.
8. Получена новая пересеваемая клеточная культура Dm2008Wbl из эмбрионов D.melanogaster, инфицированных в природе Wolbachia pipientis. Наличие бактерии в клетках в свободной форме подтверждено возможностью излечения культуры от Wolbachia обработкой тетрациклином, а также успешной передачей Wolbachia в другую клеточную линию D.melanogaster -S2, в которой Wolbachia ранее отсутствовала.
Список работ опубликованных по теме диссертации
1. Andrianov B.V., Goryacheva 1.1., Mugue N.S., Sorokina S. Yu., GorelovaT.V., Mitrofanov V.G. Comparative analysis of the mitochondrial genomes in Drosophila virilis species group (Díptera: Drosophilidae) II Trends in Evolutionary Biology 2010. V. 2, No 1: e4.
2. Андрианов Б.В., Горячева И.И., Александров И. Д., Горелова Т.В. Получение новой пересеваемой клеточной линии Drosophila melanogaster из линии мух инфицированных внутриклеточной эндосимбиотической бактерией Wolbachia pipientis в природе // Генетика 2010. Т. 46. № 1. С. 14-17.
3. Андрианов Б.В., Сорокина С.Ю., Мюге Н.С., Резник Н.Л., Митрофанов
B.Г. Популяционная динамика митохондриального полиморфизма в природной популяции Drosophila littoralis II Генетика. 2008. Т. 44. № 2. С. 195-201.
4. Пантелеев Д.Ю., Горячева И.И., Андрианов Б.В., Резник Н.Л., Лазебный O.E., Куликов A.M. Эндосимбиотическая бактерия Wolbachia повышает неспецифическую устойчивость к энтомопатогенам и изменяет поведение Drosophila melanogastrer II Генетика. 2007. Т. 43. № 9. С. 1277-1280.
5. Пантелеев Д.Ю., Какпаков В.Т., Горелова Т.В., Андрианов Б.В. Изменчивость клеточных линий насекомых и их идентификация // Цитология. 2006. Т. 48. № 8. С. 653-660.
6. Сорокина С.Ю., Мюге Н.С., Андрианов Б.В., Митрофанов В.Г. Изменчивость 3'-концевого фрагмента гена 16S рРНК в группе близкородственных видов дрозофил virilis II Генетика. 2005. Т. 41. № 8. С. 1049-1054.
7. Андрианов Б.В., Резник Н.Л., Горелова Т.В., Золотова ЛИ. Ретротранспозон Tvl образует инфекционные вирусоподоблные частицы в некоторых линиях мух Drosophila virilis II Докл. Акад. наук. 2005. Т. 400. № 5.
C. 697-700.
8. Андрианов Б.В. Индуцированная ретротранспозиция // Успехи современной биологии. 2005. Т. 125. № 1. С. 78-90.
9. Андрианов Б.В., Резник H.JL, Ларина О.Н. Перспективы изучения индуцированной генетической нестабильности в условиях космического полета// Авиакосмическая и экологическая медицина 2005. Т. 39. № 3. С. 3-9.
10. Андрианов Б.В., Сорокина С.Ю., Горелова Т.В., Митрофанов В.Г. Полиморфизм митохондриальной ДНК природных популяций дрозофил группы virilis//Генетика. 2003. Т. 39. № 6. С. 762-768.
11. Митрофанов В.Г., Сорокина С.Ю., Андрианов Б.В. Изменчивость митохондриального генома в эволюции Drosophila II Генетика. 2002. Т. 38. № 8. С. 1063-1077.
12. Andrianov B.V., Zakharyev V.M., Reznik N.L., Gorelova T.V., Evgen'ev M.V. Gypsy group retrotransposon Tvl from Drosophila virilis I/ GENE 1999. V. 239. P. 193-199.
13. Золотова Л.И., Андрианов Б.В., Горелова T.B., Клицунова Н.В., Резник H.J1., Шуппе Н.Г. Полиморфизм вирусоподобных частиц ретротранспозонов в клетках дрозофилы и дрожжей // Генетика. 1996. Т. 32. № 11. С. 1528-1535.
14. Андрианов Б.В., Золотова Л.И., Горелова Т.В., Клицунова Н.В., Шуппе Н.Г. Идентификация и ультраструктурная характеристика вирусоподобных частиц ретротранспозона Tvl в клетках D. virilis II Доклады Академии наук. 1994. Т. 339. № 1.С. 127-129.
15. Андрианов Б.В., Шуппе Н.Г., Tvl - новое семейство ретротранспозонов Drosophila virilis II Генетика. 1994. Т. 30. № 4. С. 437-446.
Подписано в печать: 26.01.11
Объем: 2,2 усл.п.л. Тираж: 120 экз. Заказ № 775 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Андрианов, Борис Витальевич
Список сокращений:.
1. ВВЕДЕНИЕ.
1.1 .Актуальность проблемы.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Ретротранспозоны насекомых и связанная с ними изменчивость.
2.1.1. История открытия ретротранспозонов.
2.1.2. Гипотеза о ретровирусной природе МДГ.
2.1.3. Универсальная распространенность ретротранспозонов.
2.1.4. Стратегия экспрессии и основные группы ретротранспозонов.
2.1.5. Индуцированная ретротранспозиция в системах гибридного дисгенеза.
2.1.6 Стрессовая индукция ретротранспозиций.
2.1.7 Ретротранспозиция индуцированная межклеточным переносом ретротранспозонов.
2.2. Клеточные культуры насекомых и анализ генетической нестабильности в клеточных культурах.
2.2.1. Получение клеточных культур насекомых.
2.2.2. Кариологическая изменчивость клеточных культур насекомых.
2.2.3. Экспансия ретротранспозонов в клеточных культурах дрозофилы.
2.3. Митохондриальная изменчивость.
2.3.1. Структура и изменчивость митохондриального генома дрозофилы.
2.3.2. Структура и изменчивость регуляторного А-Т богатого района.
2.3.3. Изменчивость белок-кодирующих генов.
2.3.4. Изменчивость генов транспортных РНК (тРНК).
2.3.5. Изменчивость генов рибосомных РНК (рРНК).
2.3.6. Изменчивость межгенных последовательностей.
2.3.7. Изменчивость мтДНК при старении у дрозофилы.
2.3.8. Механизмы изменчивости мт-генома.
2.3.9. Многоуровневый отбор мт-гаплотипов.
2.3.10. Экспериментальные данные о влиянии храповика Меллера на митохондриальную изменчивость насекомых.
2.3.11. Экспериментальные доказательства селективной значимости митохондриальной изменчивости.
2.3.12. Коадаптация ядерного и митохондриального геномов.
2.3.13. Гетероплазмия у дрозофил.
2.3.14. Применение митохондриальной изменчивости для реконструкций филогенеза.
2.3.15. Теория популяционных систем.
2.3.16. Группа близкородственных видов дрозофил умНв.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Объекты исследования.
3.1.1. Эмбриональные пересеваемые линии клеток дрозофилы.
3.1.2. Линии мух.
3.1.3. Бактериальные штаммы и плазмиды.
3.2 Выделение вирусоподобных частиц.
3.2.1. Выделение вирусоподобных частиц из культуры клеток.
3.2.2. Упрощенный метод выделения цитоплазматических ВПЧ для количественных сравнений.
3.2.3. Выделение вирусоподобных частиц из мух для изучения инфекционности.
3.3 Очистка вирусоподобных частиц.
3.3.1. Очистка вирусоподобных частиц в градиенте сахарозы.
3.3.2. Фракционирование ВПЧ в агарозных гелях.
3.4. Электронная микроскопия.
3.5. Выделение нуклеиновых кислот.
3.5.1. Выделение плазмидной ДНК.
3.5.2. Выделение геномной ДНК.
3.5.3. Выделение митохондриальной ДНК.
3.5.4. Выделение кольцевой внехромосомной ДНК.
3.5.5. Выделение суммарной клеточной поли(А) РНК.
3.6. ПЦР Амплификация.
3.6.1. Амплификация митохондриального генома О.НПогаНэ в перекрывающихся ПЦР-фрагментах.
3.6.2.ПЦР-амплификация, клонирование и секвенирование.
3.7. Клонирование ДНК.
3.7.1. Клонирование фрагментов ДНК.
3.7.2. Клонирование поли(А) нуклеиновых кислот ВПЧ по гомополимерным поли(ЬА)-поли(с1Т) концам.
3.8. Получение (ЗН) и (32Р) меченых зондов ДНК.
3.9. Обработка ДНК рестрикгазами.
3.10. Секвенирование и анализ нуклеотидных последовательностей.
3.11. Трансформация Е coli.
3.12. In situ гибридизация.
3.13. Электрофорез и блот-гибридизация.
3.13.1. Электрофорез и блот-гибридизация ДНК.
3.13.2. Электрофорез и блот-гибридизация РНК.
3.14. Работа с клеточной культурой насекомых.
3.14.1. Получение клеточной линии.
3.14.2. Инфицирование клеточной линии дрозофилы бактерией Wolbachia .111 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.
4.1. Выделение и характеристика нового функционально-активного семейства ретротранспозонов D.virilis - Tvl.
4.1.1. Выделение и клонирование Tv1.
4.1.2. Структурная организация Tv1.
4.1.3. Структура длинных концевых повторов 7W.
4.1.4. Структура консервативных белковых доменов.
4.1.5. Транскрипция 7V7.
4.1.6. Географическое и межвидовое распространение 7V7.
4.1.7. Хромосомная локализация Tv1.
4.1.8. Копийность Tv1 и амплификация в пересеваемой культуре клеток.
4.19. Внехромосомные кольцевые формы 7V7 в клеточной культуре.
4.2. Идентификация и характеристика вирусоподобных частиц Tvl.
4.2.1. Идентификация ВПЧ Tv1.
4.2.2. Персистенция ВПЧ 7V7 в культуре клеток.
4.2.3.Изучение ВПЧ Tv1 в системе гибридного дисгенеза.
4.2.4. Инфекционность ВПЧ Tv1.
4.3.Сравнительный анализ митохондриальной изменивости у дрозофил группы viri/is.
4.3.1. Определение нуклеотидной последовательности митохондриального генома D.littoralis. Состав генов и геномная организация.
4.3.2. Гены, кодирующие белки.
4.3.3. Гены рибосомных и транспортных РНК.
4.3.4. Некодирующие районы.
4.3.5. Нуклеотидный состав и использование кодонов.
4.3.6. Нуклеотидная изменчивость D.littoralis.
4.3.7. Митохондриальная ДНК в ядре.
4.4. Межвидовая изменчивость мтДНК в группе virilis.
4.4.1. ПДРФ-анализ мтДНК в группе virilis.
4.4.2. Изменчивость З'-концевого фрагмента гена 16S рРНК.
4.4.3. Реконструкция вторичной структуры фрагмента 16S рРНК.176 '
4.4.4. Изменчивость фрагмента гена СОХ1 (цитохром с оксидаза, субъединица 1) в группе virilis.
4.5. Внутривидовой полиморфизм мтДНК в группе virilis.
4.5.1. ПДРФ-анализ мтДНК D.littoralis.
4.5.2. Полиморфизм фрагмента гена СОХ1 D.littoralis.
4.5.3. Парсимониальный нетворк (SNP) мт-гаплотипов D.littoralis.
4.5.4. ПДРФ-анализ мтДНК D.americana.
4.5.5. Внутривидовая изменчивость фрагмента гена СОХ1 D.americana.
4.5.6. Внутривидовой ПДРФ мтДНК D.virilis.
4.5.7. Внутривидовой ПДРФ мтДНК D.montana.
4.5.8. Внутрипопуляционная изменчивость D.littoralis (динамика митохондриального полиморфизма).
4.5.9. Сопряженная изменчивость митохондриальных и ядерных маркеров.
4.6. Получение новой пересеваемой клеточной линии Drosophila melanogaster из линии мух инфицированных внутриклеточной эндосимбиотической бактерией Wolbachia pipientis в природе.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическая изменчивость, связанная с полуавтономными генетическими элементами дрозофилы"
1Л .Актуальность проблемы
Автономные генетические элементы выделяют по признаку наличия собственной ДНК, репликация которой частично независима от репликации клеточного генома. Сравнительно небольшие размеры и высокий уровень изменчивости геномов автономных генетических элементов делают их чувствительным маркером микроэволюционных процессов. Все эукариотичсские клетки содержат митохондрии и репликацнонно компетентные семейства транспозонов, а многие виды ещё и внутриклеточные бактерии. Изменчивость ядерного генома, вызываемая автономными генетическими элементами, связана с процессами рекомбинации, ретротранспозиции и горизонтального переноса ДНК. Эти события ведут к увеличению размеров и сложности эукариотических геномов. Другой, не менее важной особенностью изменчивости, связанной с автономными генетическими элементами, является сё направленность. Как было впервые показано С.М.Гершензоном, наличие ДНК в цитоплазме является мутагенным фактором, вызывающим определённый спектр мутаций, обычно нестабильных и часто ревертирующих к норме. Мутации, вносимые транспозопами, так же носят направленный характер определяемый специфичностью ферментов интеграции. Так как разные виды имеют разные наборы функционально активных транспозонов, а мутации, вносимые ими, многократно и независимо повторяются, то вероятность фиксации этих мутации в популяциях возрастает. Из этих фактов следует, что автономные генетические элементы имеют существенное значение в определении сценария эволюционного преобразования вида.
Транспозоны разделяю!ся на две большие группы: ДНК транспозоны, структурно сходные с бактериальными транспозопами, и ретротранспозоны, амплифицирующиеся в геноме через промежуточную РНК форму. Вероятно, ретротранспозоны присутствуют у всех эукариот.
Парадоксальность ситуации состоит в том, что остаются неизвестными тс, общие для всех эукариот и, следовательно, фундаментальные функции, за которые ответственны ретротранспозоны и благодаря которым они не элиминируются из геномов, по крайней мерс, некоторых видов.
Единственным семейством ретротранспозонов, функция которого доказана, является семейство НеТ-А D.melanogastcr. Эгн ретротранспозоны образуют тандемные повторы на концах хромосом, которые защищают их от концевой недорепликации. Такой механизм, однако, уникален для D.melanogaster и не может служить причиной универсальности распространения ретротранспозонов. Хотя основная эволюционная функция ретротранспозонов неизвестна, число открытых генетических явлений, за которые ответственна активность ретротранспозонов, существенно возросло с момента их обнаружения и продолжает расти. К нестабильным мутациям добавилась ретроамплификация репликациошю компетентных транспозонов и ретропозонов, инсерции в геном псевдогенов, внедрение в гены новых сайтов сплайсинга, промоторов и терминаторов, возникновение новых регуляторных механизмов экспрессии генов. Изучение инактивации экспрессии ретротранспозонов по механизму косупрессии позволило развить новые представления о регуляции активности генов и о противовирусной защите клеток.
Все это позволяет с полным основанием заключить, что изучение структурной pi функциональной изменчивости, вносимой в геном ретротранспозонами, остается актуальной проблемой современной генетики.
Выделение функционально-активного семейства регротранспозонов из генома любого вида организмов существенно расширяет возможности дальнейшего изучения генетики этого вида и его возможного биотехнологического применения. Задача эта, однако, не проста, так как большинство копий рефотранспозонов в геноме дефектны и либо вовсе не способны к перемещению, либо могут перемещаться только в присутствии ретротранспозона-помощника. В данной работе представлено выделение, клонирование и характеристика нового функционально-активного семейства ретротранспозонов Tvl из генома D.virilis. Применённый метод может быть использован для выделения и характеристики функционально-активных семейшв ретротранспозонов из других видов эукариот. Tvl относится к близкородственной группе ретротранспозонов насекомых из суперсемейства gypsy. Особенностью регротранспозонов данной группы является наличие env гена, который кодирует белок наружной оболочки вирусной частицы. Для ряда представителей этого семейства инфекционная передача показана экспериментально, что позволило отнести их к новой группе вирусов названной — эррантивирусы. Вместе с тем, основной путь наследования этих вирусов состоит в вертикальной передаче в ряду поколений и они присутствуют в геноме всех представителей вида, что делает старое название - ретротранспозоны более адекватным.
В работе представлена молекулярно-генетическая характеристика экспрессии Tvl и применение гипервариабельных последовательностей Tvl в качестве селективно нейтральных маркёров для характеристики популяционной структуры природных популяций дрозофил группы vi lilis и в качестве маркёров сайтов инсерций митохондриальных псевдогенов.
Определена нуклеотидная последовательноегь митохондриального генома D.littoralis и на этой основе проведено изучение межвидовой и в н утр и п о пул я ш i о н н о й изменчивости митохондриального генома природных популяций дрозофил. Исследования были проведены на близкородственной группе дрозофил, объединяемой в группу virilis. Группа virilis состоит из одиннадцати широко распространённых видов дрозофил, обитающих в Евразии и Северной Америке. Филогения группы сводятся к разделению на две фи лады: virilis ('D.virilis, D.americana americana, D.americana texaua, D.novamexicana, D.lummei) и montana (D.montana, D.ladeóla, D.borealis, D.jlavomontana, D.kanekoi, D.ezoana и D.littoralis). Предполагаемое время дивергенции предковых форм D.virilis и D.melanogaster оценивается в 40 миллионов лет. В настоящее время данная группа интенсивно исследуется с точки зрения эволюции и видообразования. Внимание к этой группе, в первую очередь, связано с тем, что виды группы virilis представляют собой модель эволюции на ранних этапах дивергенции. Активно исследуются полиморфные генетические признаки и их связь с мобильными элементами. Большое внимание уделяется генетическому контролю поведенческих и морфологических признаков, связанных с формированием репродуктивной изоляции, а также признаков, связанных с адаптациями к новым условиям среды, таких как устойчивость к стрессу и диапауза.
Дрозофилы группы virilis - удобный модельный объект для сравнительного исследования внутрипопуляционной структуры природных и синантропных видов.
Видам, образующим природные популяции, свойственна генетическая гетерогенность. Это свойство определяет экологическую лабильность вида и его жизнеспособность в непостоянных условиях среды. Популяции синантропных видов, напротив, отличаются генетической мономорфностыо, очень нестабильны и подвержены резким колебаниям численности вплоть до полного локального вымирания. Быстрое возрастание генетического груза, проявляющееся в потере жизнеспособности популяции, как ответ на интенсивный отбор, хорошо известно почти для всех видов сельскохозяйственных и домашних животных. Вместе с тем, природные популяции, несмотря на отбор и большие флуктуации численности, регулярно проводящие популяцию через "бутылочное горлышко", вырождаются лишь изредка. Следовательно, различия в популяционной структуре имеют существенное значение для поддержания жизнеспособности популяций. В настоящее время все больше видов вовлекается во взаимодействие с человеком, возникают синантропные расы, изменяется генетическая структура популяций. Изучение закономерностей в ответе на эти изменения со стороны наиболее лабильной части генома, представленной ретротранспозонами и другими автономными генетическими элементами, представляет несомненный интерес.
Цель работы:
Изучить структуру и популяционную динамику изменчивости, связанную с полуавтономными генетическими элементами у дрозофил.
Задачи исследования:
1. Разработать метод выделения функционально-активных семейств ретротранспозонов и выделить функционально-активные семейства ретротранспозонов ОМНШ.
2. Определить нуклеотидную последовательность митохондриального генома одного из видов группы утНх фЛШогаШ).
3. Охарактеризовать межвидовую изменчивость митохондриальной ДНК у дрозофил группы утШ по трем признакам: ПДРФ тотальной мтДНК, изменчивость фрагмента гена 168 рРНК, изменчивость фрагмента гена СОХ1.
4. Изучить особенности внутривидового полиморфизма мтДНК в группе лчгШх у четырех видов дрозофил: и.1ШогаШ, О.атегчсапа, О. у/г/У/.у, и 0.топ(апа.
5. Исследовать внутрипопуляционную структуру и динамику митохондриальной изменчивости в локальной, чётко ограниченной, природной популяции ВЛШогаИ.у (пос. Рыбинский, Ростовская обл.) на протяжении нескольких лет. Для этого провести анализ сопряженности митохондриальных гаплотипов с полиморфным ядерным ДНК-маркером для выявления расовой структуры популяции.
6. Получить новую пересеваемую клеточную линию дрозофилы, инфицированную внугриклеточными бактериями Wolbachia для изучения горизонтального переноса ДНК между клеткой дрозофилы ti бактерией.
Научная новизна работы Разработан метод выделения функционально-акгивных ретротранспозонов и этим методом впервые выделено и охарактеризовано функционально-активное семейство ретротранспозонов D.virilis - Tvl.
Предложен простой метод электронно-микроскопической идентификации вирусоподобных частиц ретротранспозонов.
Впервые показана трансактивация сишеза вирусоподобных частиц Tvl в клеточной культуре.
Впервые определена нуклеотидная последовательность полного митохондриального генома D.littoralis.
Впервые проведен многолетний анализ динамики митохондриальных маркеров в локальной ирнродной популяции D.littoralis. Обнаружено устойчивое соотношение мт-гаплотипов. Анализ сопряженности несцепленных ядерных и митохондриальных маркеров в выборке из природной популяции D.littoralis позволил выявить скрытую расовую : структуру, способствующую поддержанию генетической гетерогенности и стабильности популяциониого генофонда.
На основе анализа изменчивости митохондриальнои ДНК в группе virilis получен ряд новых данных, позволивших уточнить филогенетическую структуру группы virilis. В частности, показано единство митохондриального генофонда двух подвидов D.americana) а также получено подтверждение разделения вида D.littoralis на два подвида: D.littoralis littoralis и D.littoralis imeretensis.
Теоретическая и практическая значимость работы Разработанный метод выделения функционально-активных ретротранспозонов может быть применён для других видов животных. Наиболее актуально это для видов, геном которых не секвенирован. Другое применение метода - оценка геномной стабильности различных клеточных культур по наличию/отсутствию и количеству вирусоподобных частиц эндогенных ретротранспозонов.
Описание и анализ полного митохондриального генома йЛШогаШ даёт новые данные для изучения эволюции митохондриального генома дрозофилы.
Полученные результаты вносят вклад в фундаментальные исследования по генетике популяций, разрабатываемые на дроюфиле как модельном объекте; и закладывают основы для дальнейшего изучения динамики митохондриальных генофондов насекомых. Полученные результаты важны для исследований в области охраны и мониторинга популяций редких и исчезающих видов, а гакже рационального использования эксплуатируемых популяции. Результаты работы могут быть применены в исследованиях, проводимых в учреждениях системы РАН и РАСХН, таких как Институт Общей генетики РАН, Институт Молекулярной биологии РАН, Институт Биологии развития РАИ, Институт Биологии гена РАН, Институт комплексного освоения природных ресурсов РАН, Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН, Всероссийский научно-исследовательский институт охотничьего хозяпс1ва и звероводства РАСХН.
Положения выносимые на защиту
1. Клетки пересеваемых клеточных культур дрозофил содержат вирусоподобные частицы одного или нескольких семейств эндогенных ретровирусов и/или ретротранспозонов. Клонирование нуклеиновых кислот из клеточной фракции вирусоподобных частиц позволяет клонировать функционально-активные семейства ретротранспозонов данного вида.
2. Суперинфекция вирусоподобными чаешцами клеток пересеваемой культуры может приводить к временной индукции сишеза вирусоподобных частиц ретротранспозонов клетки.
3. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность митохондриального генома ИАШогаШ и выявлены области, изменчивость которых специфична для группы утНз.
4. В условиях клеточной пересеваемой культуры ускоряется перенос митохондриальной ДНК в ядро с образованием новых митохондриальных псевдогенов. Процесс переноса митохондриальной ДНК в ядро может быть обнаружен по инсерциям функционально-активных ретротранспозонов в последовательности митохондриальных псевдогенов.
Инсерции ретротранспозонов маркируют митохондриальные псевдогены и делают возможным их выделение.
5. Структура митохондриальной изменчивости природных и синантропных видов насекомых существенно различается. Локальные популяции синантропных видов мономорфны, тогда как у видов, образующих природные популяции, митохондриальная изменчивость образована совокупностью нескольких митохондриальных гаплотипов, находящихся в равновесии.
6. Анализ сопряжённости несцеиленных митохондриальных и ядерных ДНК маркёров в локальных, частично изолированных популяциях позволяет выявить криптические расы, обитающие симпатричсски.
7. В пересеваемых клеточных линиях дрозофилы возможна персистенция внутриклеточных бактерий Wolbachia pipientis.
Апробация результатов диссертации
Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:
IV съезда ВОГнС. Москва 21-22 нюня. 2009;
Международная научно-пракшчсская конференция Актуальные проблемы биоэкологи. 21-24 октября 2008;
XX International Congress of Genetics Berlin, Germany, 2008;
48th Annual Drosophila Research Conference, Philadelphia, Pennsylvania, USA, 2007;
47th Annual Drosophila Research Conference, Houston, Texas, 2006;
19th European Drosophila Research Conference, Eger, Hungary, 2005;
46th Annual Drosophila Research Conference, San Diego, USA, 2005;
III съезда ВОГиС, 2004;
45th Annual Drosophila Research Conference, Washington, USA, 2004.
На заседании объединенного семинара генетических лабораторий Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 23.04 2010 г и на заседании семинара отдела генетики животных Института общей генетики им. H.H. Вавилова РАН, 21.04 2010 г.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 14 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 257 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, заключения, выводов, списка литературы по теме диссертации, списка цитируемой литературы, в который входит 515 ссылок. Работа проиллюстрирована J4 таблицами и 67 рисунками.
Заключение Диссертация по теме "Генетика", Андрианов, Борис Витальевич
Заключение
В представленной работе изучены особенности изменчивости, связанной с автономными генетическими элементами: ретротранспозонами, митохондриями и симбиотическими бактериями. Объектом исследований была выбрана близкородственная группа дрозофил, объединяемая в группу virilis. Начиная с классических исследований (Patterson & Stone, 1952), данная группа активно изучается как модельный объект микроэволюции и видообразования. Изучение дрозофил группы virilis в России имеет давнюю историю. Первые исследования систематики и экологии D.lummei и D.littoralis проведены Н.Н.Соколовым. (Соколов, 1948). Интерес к исследованию популяционно-генетических и микроэволюционных процессов в группе virilis сохраняется и в настоящее время. Одно из перспективных направлений в этой области - связь микроэволюционных процессов с активностью ретротранспозонов.
Выделение и характеристика функционально-активного семейства ретротранспозонов группы virilis - Tvl.
Идея метода выделения функционально-активных ретротранспозонов основана на гипотезе об универсальности распространения ретротранспозонов в геномах всех организмов. Следствием данной гипотезы является предсказание наличия в любых клетках вирусоподобных частиц, содержащих активность обратной транскриптазы и внехромосомную ДНК ретротранспозонов. Очевидно, что такие вирусоподобные частицы потенциально мутагенны и могут иметь значение для контроля апоптоза, клеточного старения и иммортализации пересеваемых клеточных культур, а также иметь отношение к амплификации ДНК в клетке. Кроме того, ДНК ретротранспозона, содержащуюся в частицах, можно клонировать и таким образом выделять функционально активные семейства ретротранспозонов из любого вида, не имея предварительных данных о последовательностях ретротранспозонов данного вида. Эта идея была проверена на клеточной пересеваемой культуре D.virilis. ВПЧ ретротранспозонов могут быть выделены методами дифференциальной седиментации из клеточных лизатов по протоколам, разработанным для выделения ВПЧ ретротранспозонов D.melanogaster (Schiba & Saigo, 1883; Gorelova et all., 1989). Этими методами из клеток D.virilis была выделена фракция ВПЧ, и ДНК из этой фракции была клонирована. В результате было выделено и охарактеризовано новое семейство транспозонов Tvl, относящееся к группе gypsy, что вполне подтвердило первоначальную идею.
Определение нуклеотидной последовательности Tvl показало наличие генов gag, pol и env с ожидаемой структурой доменов, что свидетельствует в пользу функциональной активности выделенного семейства и его принадлежность к группе gypsy. Интересно, что близкородственный ретротранспозон gypsy D.melanogaster идентифицирован в геноме D.virilis, но оказался неактивным (Mizrokhi & Mazo, 1990). Возможно, близкородственные ретротранспозоны находятся в геноме в конкурентных взаимоотношениях и исключают друг друга.
ВПЧ Tvl, сходные с частицами ретровирусов, были идентифицированы в клетках пересеваемой культуры и в некоторых линиях мух D.virilis. Очищенные ВПЧ способны переносить последовательность Tvl в клетки D.melanogaster, где ее раньше не было, и активировать образование эндогенных ВПЧ Tvl в пересеваемых клетках D.virilis. Последний феномен, названный трансактивацией в клетках дрозофилы, обнаружен впервые (Андрианов и др., 2005). Трансактивация сходна с явлением «гетерологичной индукции» дрожжевого ретротранспозона Ту1 под влиянием экспрессии экзогенного ретротранспозона, в том числе ретрогранспозона gypsy дрозофилы (Резник и др., 1995а). Предполагаемой причиной индукции экспрессии дрожжевого Ту1 служит обратная транскриптаза, так как индукция наблюдалась не только после трансформации дрожжевой клетки целым транспозоном, но и в случае экспрессии в дрожжах гена обратной транскриптазы вируса HIV человека (Резник и др., 1995а). Трансактивация синтеза ВПЧ Tvl в клетках дрозофилы может иметь ту же причину. ■ Источником обратной транскриптазы в этом случае являются вирусоподобные частицы, добавляемые в клеточную культуру. Ферментативная природа трансактивирующего агента весьма вероятна, так как термоинактивированные ВПЧ теряют индукционные свойства.
Анализ копий Tvl из генома D.virilis показывает, что экспансия данного семейства ретротранспозонов происходит в настоящее время. Так как 5' и 3' ДКП новой копии ретротранспозона сразу после интеграции в хромосому идентичны, возраст инссрции можно определить по степени наблюдаемой дивергенции двух ДКП. В случае Tvl большинство копий фланкированы идентичными ДКП. Такая ситуация довольно типична для ретротранспозонов дрозофилы. Сравнение выявленных в геноме D.melanogaster полных копий ретротранспозонов оценивает их возраст в среднем в 137 тыс. лет с умеренным разбросом около среднего значения -fc 89 тыс. лет [Bowen, McDonald, 2001]. Столь незначительный эволюционный возраст указывает на быструю смену копий, притом, что состав семейств весьма консервативен. Гомологичная рекомбинация между ДКП играет у D.melanogaster незначительную роль в удалении ретротранспозонов из генома. В геноме D.melanogaster выявлено 682 копии ретротранспозонов, содержащих ДКП, и только 58 единичных ДКП [Kaminker et al., 2002]. У D.virilis ситуация несколько отличается. 211 копий Tvl в геноме D.virilis разделяются примерно пополам на полноразмерные элементы и единичные ДКП. Это отличие вероятно связано с более высокой активностью ферментов гомологичной рекомбинации у D.virilis. Причиной быстрого удаления инсерций из генома D.melanogaster являются делеции менее 400 н.п., случайным образом распределенные по-геному, частота которых у дрозофилы в 75 раз выше, чем у млекопитающих [Petrov, Hartl, 1997]. Большая скорость потери ДНК обнаружена не только у D.melanogaster, но и D.virilis, что является причиной компактности геномов дрозофил [Petrov, Hartl, 1998]. Потери ретротранспозонов компенсируются их быстрым распространением. Менее чем за 100 лет в популяциях D.melanogaster распространился /-элемент [Bucheton et al., 1992]. Ретротранспозон Penelope распросграняется в настоящее время в природных популяциях D.virilis [Lyozin et al., 2001]. Интересно, что в геноме D.virilis найдены "ископаемые" формы Penelope [Lyozin et al., 2001], что вместе с данными о небольшом возрасте имеющихся копий ре гротранспозонов в геноме указывает на неоднократность заселения генома вида одними и теми же семействами ретротранспозонов.
Взаимодействие ретротранспозонов и митохондрий.
Полученные данные по митохондриальной изменчивости у дрозофил группы virilis позволяют предложить гипотезу о взаимодействии ретротранспозонов и митохондрий у насекомых. В настоящее время эта тема малоизученна, тем не менее, известно довольно много косвенных данных, указывающих как на возможность такого взаимодействия, так и на важность его для биологии насекомых.
Недавно было показано (Koulintchenko et al., 2003, 2006), что митохондрии растений и млекопитающих способны поглощать цитоплазматическую ДНК. Оптимальной формой I поглощаемой ДНК является двунитевая линейная молекула, нуклеогидная последовательность которой несущественна. Импорт осуществляют только функционально-активные митохондрии, имеющие разность потенциалов на внутренней мембране. В этом процессе участвуют митохондриальный белок-транспортер адениловых нуклеотидов и митохондриальный комплекс РТРС. Оба этих белка являются ключевыми компонентами системы транслокации в митохондриях всех животных, поэтому процесс импорта ДНК, вероятно, универсален.
Поглощаемая ДНК транскрибируется и, возможно, транслируется митохондриальной системой экспрессии. Образуемые продукты, очевидно, влияют на жизнеспособность митохондрий и могут вызывать ее апоптоз. Транспорт ДНК отличается от диффузии макромолекул через митохондриальную макропору, открывающуюся в процессе апоптоза.
Обычно цитоплазматическая ДНК в клетке отсутствует. Она появляется только при вирусной инфекции или индуцированной экспрессии ретротранспозонов. В этом случае митохондрии могут ее поглощать. Действительно, обнаружены случаи транспорта в митохондрии нуклеиновых кислот вируса HIV (Somasundaran et al., 1994). Проникновение нуклеиновых кислот вируса HIV в митохондрии вызывает апоптоз. В инфицированных клетках обнаружены вирусные частицы, локализованные в местах лизиса и вакуолизации митохондрий (Radovanovic et al., 1999). В вирусных частицах, помимо нуклеиновой кислоты вируса, находится tRNA(Lysl выполняющая роль праймера для синтеза (-)-цепи ДНК вируса, а также белок Lys tRNA синтаза. Этот белок экспрессируется с ядерного гена и образует две формы, цитоплазматическую и митохондриальную, за счет альтернативного сплайсинга. Но в составе частиц выявляется преимущественно митохондриальная форма белка (Kaminska et al., 2007). Предполагается что митохондриальная форма белка попадает в цитоплазму, к месту сборки вирусных частиц, через митохондриальную макропору индуцированную в митохондриальной мембране под действием вирусного белка Vpr (Jacotot et al., 2000). Но не исключено, что частицы HIV собираются внутри митохондрии, используя митохондриальную систему для экспрессии своего генома.
Сходную картину локализации вирусоподобных частиц можно наблюдать и в клетках пересеваемой культуры D.virilis, активно экспрессирующей ретротранспозон Tvl (рисунок 31). В случае проникновения ДНК Tvl в митохондрию и ее экспрессии с образованием ВПЧ, можно ожидать интеграции Tvl в митохондриальную ДНК. Учитывая что интеграция Tvl сайт-специфична (рисунок 22) и происходит в микросателлитные повторы
TA)n, то в митохондриальном геноме группы virilis существуют три потенциальных сайта интеграции Tvl, что следует из сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей митохондриальных геномов D.virilis и D.littoralis (см. раздел 4.3.4). Определение нуклеотидной последовательности одного из таких сайтов между генами atpó и сохЗ у девяти видов дрозофилы группы virilis выявило значительную изменчивость длины микросателлита (ТА)П, чего и следует ожидать при многократных и не вполне точных инсерциях/эксцизиях ретротранспозона с дупликацией сайта интеграции. Как показано в разделе 4.3.7., в Y-хромосоме D.virilis выявлены псевдогены atpó и сохЗ. Между этими псевдогенами обнаружены инсерции Tvl в микросателлитный сайт (ТА)П.
Процесс образования псевдогенов ускоряется в клеточной культуре, как следует из анализа их нуклеотидных последовательностей (см. раздел 4.3.7.). В этой же клеточной культуре происходит десятикраiная амплификация копий Tvl. Взятые вместе, эти факты позволяют предположить проникновение цитоплазматической ДНК Tvl в митохондрии, экспрессию в митохондриях этой ДНК с образованием ВПЧ и интеграцию Tvl в подходящие для него сайты митохондриального генома. Фрагменты митохондриальной ДНК с инсерциями Tvl могут попадать в цитоплазму при лизисе митохондрий и интегрироваться в геном как псевдогены.
Биологический смысл взаимодействия ретротранспозонов и митохондрий можно объяснить в свете открытий противовирусной системы клетки, включающей сложный комплекс белков, в том числе белки цитидинтрансаминазы семейства АРОВЕС (Mangeât, Trono, 2005). Эти белки упаковываются в вирусные частицы вместе с белками вирусного капсида gag и приводят к формированию неинфекционных частиц. Один из известных механизмов противовирусного действия белков АРОВЕС состоит в дезаминировании вирусного цитозина. Сложные ретровирусы типа HIV кодируют дополнительные малые белки, исключающие упаковку АРОВЕС в состав вирусных частиц, что обеспечивает их инфекционность. Но ретротранспозоны таких белков не имеют, поэтому их инфекционные ВПЧ могут формироваться только в клеточных компартментах, лишенных АРОВЕС, например, в митохондриях. (Эта гипотеза объясняет факт существования как инфекционных, так и неинфекционных частиц Tvl (Андрианов и др., 2005)).
Клетки способны подавлять экспрессию вирусов многими путями, главным из которых является формирование РНК-белковых комплексов образуемых специфичными малыми РНК и белками, типа Dicer, Piwi, Argonaute pi Aub, выявленными в клетках дрозофилы (Siomia et al., 2008; Vagin et al., 2006). Эти антивирусные системы блокируют экспрессию ретротранспозонов на этапах транскрипции, процессинга и трансляции, поэтому формирование цитоплазматической ДНК ретротранспозонов как финального этапа их жизненного цикла возможно только в случае несостоятельности противовирусной системы клетки.
Это обстоятельство может быть использовано насекомыми и другими высшими животными для отбраковки организмов с дефектной противовирусной системой. Отбор происходит на стадии зародышевых клеток, что сопровождается« минимальными энергетическими потерями для вида. Известно, что зародышевые клетки отличаются повышенным уровнем экспрессии ретротранспозонов самых разных семейств. В клетках с некомпетентной противовирусной защитой должен происходить синтез ДНК ретротранспозонов и ее проникновение в митохондрии. Если это проникновение носит массовый характер, клетка погибает Гибель зародышевых клеток в системе гибридного дисгенеза в результате экспрессии ретротранспозонов показана у D.virilis (Losovskaya et al., 1990).
Таким образом, биологический смысл существования активных форм ретротранспозонов можно объяснить их ролью в эмбриональной селекции по снижению-генетического груза популяции по генам системы противовирусной защиты клетки. Если это предположение верно, популяции с активными формами ретротранспозонов будут более устойчивы к вирусным инфекциям, чем популяции с неактивными транспозонами. Этот позитивный эффект ретротранспозонов может уравновесить негативное влияние перемещения ретротранспозонов на стабильность генома.
Изучение митохондриальной изменчивости в группе virilis
В данном исследовании впервые изучена митохондриальная изменчивость всех видов группы virilis. Изучена она была по трем признакам. Hinfl-ПДРФ полиморфизм позволяет с низким разрешением охарактеризовать весь митохондриальный геном. Для увеличения разрешающей способности метода были проанализированы фрагменты нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и СОХ1. Филогения группы, построенная по результатам анализа межвидовой митохондриальной изменчивости, соответствует общепринятой классификации Трокморюна (Throckmorton, 1982).
Далее был проведен анализ внутривидовой митохондриальной изменчивости для четырех видов группы: D.virilis, D.montana, D.americana и D.littoralis. Анализ обнаружил характерные отличия синатропного вида D virilis от остальных трех видов, образующих природные популяции. Внд D.virilis мономорфен на всем ареале, в то время как виды, образующие природные популяции, представлены совокупностью митохондриальных гаплотипов.
Для объяснения наблюдаемых отличий была предложена гипотеза, согласно которой высокая изменчивость видов, образующих природные популяции, объясняется наличием i скрытой внутрипопуляционной структуры, образованной несколькими симпатрическими расами. Для проверки этой гипотезы была подробно проанализирована внутрипопуляционная изменчивость у D.americana и D.littoralis.
Анализ внутрипопуляционной изменчивости D.littoralis проводили в течение 10 лет в локальной популяции. Столь длительные исследования динамики изменчивости генетических параметров популяционной системы во времени для дрозофил ранее были проведены только Ф. Добжанским (Dobzhansky et al., 1964) на калифорнийском виде D.pseudoobscura. Для выявления внутрипопуляционной структуры были проанализированы два несцепленных генетических маркера: митохондриальные гагоютипы и ядерная полиморфная минисателлитная последовательность в составе ДКП Tvl. Выбор; ядерных и митохондриальных маркеров заведомо исключает возможность их физического сцепления. Вторым условием, необходимым для выявления расовой структуры популяции, является частично изолированный островной характер анализируемой популяции, в которой возможна быстрая генетическая сегрегация маркеров, проявляющая расовую структуру, которая в иных условиях может остаться незамеченной или быть интерпретированной ошибочно.
На рисунке 67 показан выбранный экспериментальный подход, а также истинная и ошибочная интерпретация одних и тех же данных, в зависимости от схемы организации исследования. Представленная на рисунке ситуация соответствует наличию двух симпатрических рас, в которых сегрегация генетических маркёров завершена. В соседних локальных популяциях сегрегация происходила в разных направлениях и привела к фиксации двух альтернативных состояний, возможных для анализируемых маркеров. Из рисунка следует, что при неправильной организации сбора материала реально существующая расовая структура не будет обнаружена. Ситуация будет выглядеть, как географическая клинальная изменчивость.
Исследование 1
-
Андрианов, Борис Витальевич
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2011
-
ВАК 03.02.07
- Молекулярные механизмы действия метаболитов кинуренинового пути обмена триптофана на глютаматергическую и холинергическую системы нейротрансмиссии у мутантов дрозофилы
- Взаимодействие гонадотропинов и биогенных аминов в контроле адаптации имаго дрозофилы к стрессирующим условиям
- Структура и функция хромоцентра в клетках яичников Drosophila melanogaster
- Генетические эффекты у Drosophila melanogaster после хронического облучения в малых дозах
- Динамика численности монолинейных и гетеролинейных экспериментальных популяций Drosophila melanogaster на разных стадиях метаморфоза
