Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая характеристика штаммов вируса Западного Нила, выделенных на территории России

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика штаммов вируса Западного Нила, выделенных на территории России"

На правах рукописи

САДЫКОВА ГАЛИНА КАДЫМОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ВИРУСА ЗАПАДНОГО НИЛА, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ.

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0046(34949

Москва

2010

004604949

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ Вирусологии имени Д.И.Ивановского РАМН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Алексей Геннадьевич Прилипов

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук

доктор биологических наук Марина Ридовна Бобкова

кандидат биологических наук Владимир Глебович Лунин

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук

Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится «3^» А^г*-—> 2010 г. в

/г* часов на заседании Диссертационного Совета Д.001.020.01 при НИИ Вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН (адрес: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ Вирусологии Вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан «¿9» а ^ 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук

Е .И.Бурцева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Род Flavivirus семейства Flaviviridae состоит более чем из 70 вирусов, большинство из которых является арбовирусами, т.е. вирусами, передающимися путем биологической трансмиссии восприимчивым позвоночным кровососущими членистоногими переносчиками.

Флавивирусы способны инфицировать широкий круг организмов, включающий в себя млекопитающих, насекомых, птиц и рептилий. Многие из них могут вызывать тяжелые заболевания человека - желтую лихорадку, лихорадку Денге, клещевой энцефалит, японский энцефалит и др. Наиболее значимые для человека флавивирусные инфекции связаны с вирусами Денге, желтой лихорадки, японского энцефалита, клещевого энцефалита и Западного Нила. Ежегодно Всемирная Организация Здравоохранения регистрирует более 50 миллионов случаев заболевания лихорадкой Денге, около 200 ООО случаев заболевания желтой лихорадкой и около 50 000 случаев заболевания японским энцефалитом. Смертность от заболеваний, вызванных этими наиболее патогенными представителями семейства флавивирусов, варьирует в пределах 5%-30%.

Дополнительным фактором значимости проблем, связанных с флавивирусными инфекциями, становится существенное изменение их ареала. Здесь ярким примером может служить вирус японского энцефалита, который во второй половине XX века широко распространился в Азии, Океании, а в конце 1990-х достиг австралийского континента. Другой хорошо известный пример связан с проникновением в 1999 году и последующим стремительным распространением вируса Западного Нила на североамериканский континент. Возможность переноса флавивирусов перелетными птицами, их способность реплицироваться в новых видах млекопитающих, быстрая адаптация к природным условиям обеспечивает формирование новых природных

L

очагов флавивирусных инфекционных заболеваний, в которые вовлекается и проживающее на этой территории население. Отсутствие на сегодняшний день вирусоспецифических препаратов, эффективных методов лечения, а, нередко, и профилактики заболеваний, вызванных флавивирусными инфекциями, объясняет интерес работников науки и практического здравоохранения к данной проблеме.

Для России наиболее актуальными являются вирус клещевого энцефалита (несмотря на существование эффективной вакцины) и вирус Западного Нила. Вирус Западного Нила является этиологическим агентом лихорадки Западного Нила, которая может протекать у людей в форме менингитов и менингоэнцефалитов. В нашей стране активные очаги ЛЗН расположены в Астраханской области, на территории дельты Волги. Здесь, в дельте Волги, в силу географических и экологических особенностей сформированы чрезвычайно благоприятные условия для поддержания активной циркуляции вируса ЗН и почти ежегодно фиксируется спорадическая заболеваемость ЛЗН, иногда эпидемические вспышки.

Особую значимость вирус Западного Нила приобрел после ряда крупных эпидемических вспышек, произошедших в конце 1990-х годов в различных частях света и характеризующихся необычно частыми, для данной инфекции, случаями поражения ЦНС и высокой смертностью. В 1994 году произошла вспышка в Алжире, в ходе которой было зарегистрировано около 50 случаев заболевания с 8 летальными исходами. Последующая вспышка ЛЗН была зарегистрирована в Румынии в 1996 году, где также наблюдался необычно высокий (~9%) уровень смертности. В 1997 году на гусиных фермах в Израиле случилась крупная эпизоотия ЛЗН с острыми неврологическими проявлениями. Среди людей эпидемия случилась в 2000 году, хотя еще в 1999 году было отмечено два смертельных случая заболевания ЛЗН. В общей сложности в 2000 году в Израиле было зарегистрировано 417 подтвержденных случаев

заболевания ЛЗН, причем в половине случаев с поражениями ЦНС. Уровень смертности при этом составлял, по разным данным, от 8 до 14 %. В 1999 году почти одновременно эпидемические вспышки ЛЗН произошли на юге России и в Нью-Йорке, США, при сходном (~ 10%) уровне летальности. Вопрос, чем обусловлено серьезное изменение характера патогенности эпидемических вспышек, вызванных в последнее время вирусом ЗН, остается открытым. Сравнительный и эволюционный анализ первичной структуры различных изолятов ВЗН, поиск и изучение генетических детерминант вируса, отвечающих за его патогенные свойства являются в настоящее время предметом интенсивных исследований.

Настоящая работа была выполнена в рамках комплексного изучения биологии вируса ЗН, циркулирующего на территории юга Русской равнины, которое проводится в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН с 1999 года. В рамках этого исследования были, в частности, выполнены работы по генетической характеристике российских штаммов ВЗН, вызвавших эпидемии 1999-2000 гг., созданию новых чувствительных тест-систем для детекции возбудителя, а также работы по мониторингу циркуляции вируса, включающему в себя наблюдение за вирусной активностью во всех звеньях экологической цепи.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение генетических свойств вирусной популяции, циркулирующей на эндемичной территории юга Астраханской области России. В этой связи были поставлены следующие задачи:

1. Установить первичную структуру геномов 18-ти штаммов вируса Западного Нила, изолированных в 2001-2005 гг. на территории Астраханской области.

2. Охарактеризовать генетические свойства вирусной популяции, циркулировавшей на данной территории в период с 2001 по 2005 гг.

3. Разработать экспериментальную систему для изучения биологических свойств вируса ЗН методами обратной генетики на основе низкопатогенного штамма LEIV-Krnd88-190.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Установлена нуклеотидная последовательность геномов (с 24 н.п. по 10834 н.п. включительно) 18-ти изолятов вируса ЗН, изолированных в 2001-2005 годах в Астраханской области из птиц, комаров и клещей.

2. Проведена молекулярно-генетическая характеристика данных штаммов, включающая в себя анализ их нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, а также поиск известных функциональных детерминант вируса, отвечающих за его патогенные свойства.

3. Создана экспериментальная система для транскрипции вирусной РНК in vitro на основе бактериальной высококопийной плазмиды, несущей полноразмерную кДНК копию вирусного генома.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Клонирована кДНК копия полного генома вируса Западного Нила, относящегося к IV генотипу на основе низкопатогенного штамма LEIV-Krnd88-190. Создана экспериментальная система для получения вирусной РНК in vitro.

Впервые определена нуклеотидная последовательность генома для 10 изолятов ВЗН, кодирующая все структурные и неструктурные белки, а также нетранслируемые области генома (частично). Для 9 штаммов ВЗН

впервые определена первичная структура, кодирующая неструктурные белки вируса, а также 3' -нетранслируемый регион (частично).

Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей исследуемых штаммов выявил их высокую идентичность с астраханскими штаммами Ast99-986 и Ast99-901, выделенными из крови больных людей во время эпидемических вспышек в 1999-2000 гг.

Проведен поиск функциональных детерминант вируса, отвечающих за его вирулентные свойства. В частности, показано, что у 6 из 18 исследованных штаммов имеется потенциальный сайт гликозилирования в белке Е, который является одним из ключевых факторов нейроинвазивности вируса в мышах, три штамма имеют гетерогенную (смешанную) NYS/NYP позицию, а у остальных 9 штаммов сайт потенциального гликозилирования отсутствует.

Кроме того, у всех исследованных штаммов имеется аминокислота пролин в 249-й позиции геликазного домена неструктурного белка NS3, которая, как было показано в опытах in vivo, также отвечает за патогенные свойства вируса Западного Нила.

Данные о первичной структуре вирусов являются важными, как для практических научных вопросов, связанных с эпидемиологией вирусных инфекций, так и для многих фундаментальных исследований, связанных с происхождением, распространением и эволюцией вирусов. Современный прогресс в молекулярной биологии и вирусологии позволяет изучать вирус на популяционном уровне, оценивать гетерогенность популяции и влияние этой гетерогенности на основные характеристики вируса, в том числе и патогенетические.

Публикации и апробация работы.

По материалам диссертации в журналах, рекомендованных ВАК, опубликовано 4 научных статьи. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной

вирусологии и экологии вирусов и Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН (30.10.08).

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 121 странице машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, приложения и содержит 6 таблиц и 17 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве исследуемого материала были использованы 18 штаммов вируса Западного Нила, выделенных из птиц, комаров и клещей на территории Астраханской области Российской Федерации (табл.1) в 20012005 гг. Пробы были предоставлены лабораторией экологии вирусов НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского.

Подбор праймеров для проведения реакций обратной транскрипции, полимеразной цепной реакции и секвенирования выполняли с помощью программы Primer Premier 5.00 (Premier Biosoft International, США) с использованием нуклеотидных последовательностей вирусов Западного Нила из базы данных GenBank. Определение нуклеотидных последовательностей осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, США). Для построения алайментов использовали алгоритмы Clustal V и Clustal W из пакета программ DNASTAR 7, производства «Lasergene Inc.» (США).

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы MEGA 4.1. по принципу ближней связи (NJ) в рамках двухпараметрической модели М.Кимура с последующим 1000-

кратным ресемблингом, невзвешенной парногрупповой кластеризации (UPGMA) и максимальной экономии (MP).

Штамма ' 0;t Источник выделения .: ■1 Предварительная характеристика

LEIV-AstOl-66 2001 б.баклан (Ph.carbo) частичная(структурная область)

LEIV-AstOl-182 2001 Hyalomma marginatum нет

LEIV-AstOl-187 2001 ворона (С. corone) частичная (структурная область)

LEIV-Ast02-2-25 2002 ворона (С. corone) частичная (структурная область)

LEIV-Ast02-2-26 2002 H.marginatum нет

LEIV-Ast02-3-146 2002 голубь (Col, livia) частичная(структурная область)

LEIV-Asl02-3-165 2002 б. баклан (Ph.carbo) частичная (структурная область)

LEIV-Ast02-2-208 2002 грач (C.frugilegus) частичная(структурная область)

LEIV-Ast02-2-298 2002 грач (C.frugilegus) частичная (структурная область)

LEIV-Ast02-3-570 2002 сорока (P. pica) частичная (структурная область)

LEIV-Ast02-2-691 2002 Anopheles messeae нет

LEIV-Ast02-2-692 2002 Anopheles messeae нет

LEIV-Ast02-3-717 2002 б. баклан (Ph.carbo) частичная (структурная область)

LEIV-Asl04 824 2004 ворона (С. corone) нет

LEIV-Ast04-404 2005 б. баклан (Ph.carbo) нет

LEIV-Ast04-405 2005 б. баклан (Ph.carbo) нет

LEIV-Ast04-416 2005 ворона (С. corone) нет

LEIV-Ast04-418 2005 ворона (С. corone) нет

Таблица I. Штаммы вируса Западного Нила, исследованные в данной работе.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Определение и анализ первичной структуры геномов 18-ти штаммов ВЗН.

С помощью программы Primer Premier 5.00 (Premier Biosoft International, США), а также программного пакета DNASTAR (Lasergene) были выбраны' праймеры как для получения и амплификации вирусной кДНК, так и для секвенирования амплифицированных ПЦР-фрагментов.

На рисунке 1 представлена общая для всех исследованных штаммов схема получения и амплификации кДНК фрагментов вирусной РНК. КДНК, полученная с использованием праймера 10960R, использовалась для однораундовой амплификации двух перекрывающихся фрагментов длиной около 6000 и 5500 нуклеотидных пар. Два амплифицированных ПЦР-фрагмента, охватывающие почти весь (~98%) геном вируса, использовались далее для прямого секвенирования. Таким образом, концевые участки генома, соответствующие позициям 1-23 на5'-конце и 10835-11029 на 3'- конце вирусного генома нами не анализировались. Стратегия определения нуклеотидной структуры генома вируса методом секвенирования на фрагменте была выбрана нами не случайно, т.к. позволяет читать "усредненную" или консенсусную последовательность ДНК и, таким образом, избегать ошибок, которые вносит Taq-полимераза при синтезе новых индивидуальных ДНК-цепей.

2F 6085R

5'-end З'-end

5598F 10796R

„кДНК 10960R

Рис. 1. Стратегия получения и амплификации кДНК-фрагментов генома ВЗН.

Ранее в лаборатории молекулярной генетики Института вирусологии им. Д.И. Ивановского были генетически охарактеризованы еще несколько штаммов ВЗН, циркулировавших на территории Астраханской области. Два из них были изолированы во время эпидемии 1999-2000 гг. (Ast99-901 и Ast99-986) из крови больных людей, а один штамм Нр-94, был изолирован в дельте Волги из клеща Н. marginatum в 1963 году. Филогенетический анализ этих штаммов, проведенный ранее, показал, что все три штамма относятся к 1а кластеру первого генотипа ВЗН. Эти три штамма мы использовали в данной работе как референтные для анализа первичной структуры новых исследуемых штаммов ВЗН 2001-2005 года.

Анализ нуклеотидной структуры штаммов ВЗН, изолированных на территории Астраханской области в 2001-2005 годах, состоял из нескольких этапов. Сначала, с помощью программного пакета DNASTAR (Lasergene), мы определили процент нуклеотидного сходства, или идентичности, нуклеотидных последовательностей новых и трех референтных (Ast99-901, Ast99-986 и Нр94) штаммов. Результат представлен в таблице 2. Как видно из приведенных данных, процент нуклеотидной идентичности между новыми исследуемыми штаммами 2001-2005 годов варьировал от 99,6% до 99,9%, а между новыми и выделенными в 1999-2000 гг. Ast99-986 и Ast99-901 - от 99,1% до 99,7%, соответственно. Процент нуклеотидной идентичности между штаммом НР-94 1963 года и остальными (включая Ast99-986 и Ast99-901) составлял 94,5%-94,9%. Таким образом, штамм НР-94 был максимально и равным образом удален от всех новых (2001-2005 гг.) и двух референтных (Ast99-986 и Ast99-901) штаммов 1999 года.

Pscsnt Isentb

1 2 3 1 5 8 ? 8 9 1С- 11 12 13 14 15 16 17 18 20 21

1 Ш 995 п- 558 90 3 35 Я 9? 7 ЭУ5 39 5 93 7 •1р < 99 5 33 9 55° (№Р 33 5 997 -I-?/» 35 5 «92 94.5 1 25-¿¿l_clrc_05

2 сс 3 se 903 ?s.s 9г8 130 Í 39. г >3 8 99 - S5 7 93 S 59 9 гзэ ?9$ 59 s: 337 33 5 99 3 94* 2

3 03 25 шЖ 33 с 5Э7 3?S ззе ээз 99 3 996 397 £9 7 30 7 93 3 99 7 59 7 '1000 9ЭЗ 59 i 3 65-AstJHTC_01

4 У2 0.2 ."3 « 39.' 92 7 99 3 55.6 33.3 зз г 535 >98 SS3 938 99 £ 55 7 _ 93.6 95.4 : ?«6 « 145-í.st_Dif<í_02

6 с г л? 3 3 3,- 39' 99 7 99 5 Э9 33 • Л-7 597 33 & 59? 93 9 39 9 &.7JÍ7 59- 93 2 94 6 Г. 1?S-íst_3¡rd_02

6 ■ 993 i: & 33 5 99 S 55 3 93' ?<• 5 ИЗ гэ 53 3 ё? 8 55.Í 934 54 7 8 182-АЯ_Вйс_01

7 С 2 25 03 0 3 00 В эаа 55.S 99 398 59 0 957 59 8 538 39 6 5^ 8 39 8 93 5 992 W 7 137-Ast_üf3_01

8 01 ' о.о 02 01 Q.1 02 о; На 55 3 S'r-C 99 7 99 9 С&9 53.3 99 5 53 í 337" 92 г 59 3 3«Ч 8 2O8-As1_i«¡$_02

9 01 01_ 3.3 61 С 1 в г 1-2 01 рвя 93 7 59 7 99 9 150 3 93 9 •79 5 59 3 33 7 93 5 99 3 34 е 9 I98-Ast_3ir<ÍJ£

10 02 02 34 3'« V 04 ••И 0? БЭ 53 ё И í 038 se.e 39 8 38 8 £0 5 /P9.S 39 4 «D1 54 5 10 40¿->st_;i(d_55

11 33 0 3 33 ¿г С1 ог о; о :• 04 В9 юз с зз е se? 99.7 33 7 99 7 95; 33 3 С4 6 11 405-ASt_fctfC_35

V 0 3 03 03 ■j- i 3 С i 01 &з 03 0« 0 0 33 93 7 99 7 М ' 33 7 597 39' 9? 5 53 3 946 12 41á-Ast_'cire_05

13 01 0.1 53 0« 3-2 С.З оз с i ai о: С 4 5Г9.9 >3 3 59.6 33 7 Ü2.5 34 i 1J

*4 0 1 51 33 сг 0 1 ог 9» С 1 00 0 3 С.'; 33 01 "?гз 995 ^ 33 7 995 31-: 14 57WtsU>to»J52

15 01 01 3.3 o • 02 62 е 1 01 02 t2 33 01 01 39 0 53 S ' 93 7 99? 99? 916 15 f-3l^.st_fnos<i,01

16 31 : 93 02 ~81 С2 .12 01 *о~Г о г 03 03 0 1 01 31 £3 8 Чг' 95 • 93 3 94 7' 16 692r«5tjnC8íU)1

17 г: ,. У:.?. Al. Ц 0.3 02 о; "OÍ 02 04 сз 02 0 2 02 0.2 ШЯ Э&5 993 546 17 717-Аа_Угв_02

18 зз ' сз аа 03 03 02 [5 02 0? 04 С i 33 о; 0.3 33 S3 5 3 ЯВ 58 5 594 Э4* 18

19 03 ,3.3 02 0 3 03 С 2 _ 52 С 2 04 сз 3 3 03 03 03 0 3 0 3 02 н 59 7 34.9 19 901 Ast_fi i' T^r>_5D

20 оз 02 0 4 1)4 ог 32 " 03 03 Я* 03 зз" 0? 53 33 0? 53 ; 01 ■И.9.4« 20 S85-f5l_r,urr.an_93

21 54 ' 54 í 4 :5 i i 53 53 . í< . 54 56 5.4 5 5 5 í í 4 5 4 5 4 5 4 5.4" вк 21 Hp-94

i г 3 4 s в 7 8 9 10 11 12 1- 14 1Ь 16 17 18 19 70 21

Табл.2. Процент нуклеотидной идентичности и дивергенции между исследованными штаммами ВЗН.

Затем, с помощью этих данных мы оценили эволюционную генетическую дистанцию между штаммами вируса Западного Нила, изолированными в 2001-2005 годах и его более ранними вариантамк, которые циркулировали на территории Астраханской области.

Эволюционная дистанция (p-distance) между двумя очень близкими последовательностями может быть определена в простейшем случае как p=Nd/N, где Nd - число наблюдаемых нуклеотидных замен, а N - общее число нуклеотидов. Отметим также, что в данном случае она может также пониматься и как средняя частота замены каждого нуклеотида, и как процент нуклеотидной дивергенции между анализируемыми последовательностями, Как видно из табл. 4, нуклеотидная дивергенция между штаммами ВЗН 2001-2005 гг. (новыми) варьирует от 0,1-0,4%, а ее вычисленное среднее значение составляет 0,22%. Таким образом, средняя наблюдаемая генетическая дистанция между новыми штаммами составляет 0,22%. Вычисленное среднее значение эволюционной дистанции между новыми штаммами и штаммами ВЗН 1999 года составляет 0,28%, а эволюционная генетическая дистанция между старым Нр-94 1993 года и всеми остальными - 5,42%. Более наглядно

генетическое родство старого и новых астраханских штаммов ВЗН иллюстрирует филограмма, изображенная на рис. 2.

г 25-А$1_Ыг{$_02 Бед 208-.Ast_birt5_02.seq

Р165-Аз1_ЫгС_С2.5 е ч

570-Asl.bif0_02.seq 14б-Аз1_Ыгб_02.8еа 1— 71?-Л$иияИ>2.8е$

_П 167-.Ast_birc_0l.seq Ц 4ОЗД&иНг6_0£.5ец

¿¿-^ОигО^ед

324-АзЦ>1га_04..5ез 301 -.Азц™ тап_00.$ еч

5

И

чг

МийеоИбе йисгЪйгёслз (у 100:

Рис.2. Генетическое родство штаммов ВЗН, выделенных на территории Астраханской области.

Общее число нуклеотидных замен в новых штаммах варьирует от 16 до 34. Большинство из них (больше 80%) является синонимическими и не приводит к замещению аминокислот. Наиболее часто встречаются замены пиримидин на пиримидин. Так, замена С->и наблюдается в 36% , как и обратная ей Ц->С (36%). Заметно реже встречаются замены пурин на пурин А->0 (5%) и 0->А (11%). Еще более редкими являются замены пурин на пиримидин А->С (3%), А->и (4%), О^и (<1%). Замены пиримидин на пурин (С->/\, и->А, и->0) встречались менее, чем в 1% случаев. Совсем не обнаружилось замен С->С и О-^С.

Хотя большая часть нуклеотидных замен является синонимическими, их распределение по геному не является совершенно случайным. Нуклеотидные замены в 5'-нетранслируемой области, а также в области генома, кодирующей капсидный белок и белок М, почти не встречаются. Характерным является также то, что позиции, в которых происходили нуклеотидные замены в разных штаммах, часто совпадали.

В 6-ти позициях вирусного генома замены наблюдаются во всех новых штаммах (2361G-*A, 4537G->A, 5185U-»C, 6303U-»C, 7452U->C и 8691U->C) относительно штаммов Ast99-901 и Ast99-986.

Хотя синонимические замены и не приводят к замещению соответствующей аминокислоты, но, поскольку геном флавивирусов представлен однонитевой положительной РНК, которая не только кодирует вирусные белки, но и содержит важные для репликации вируса элементы вторичной и третичной структуры, даже синонимические нуклеотидные замены могут, тем не менее, влиять на репродукцию вируса через структуру и функции вирусной РНК. Рисунок 2 иллюстрирует распределение характерных позиций относительно вирусного генома. Характерными мы считали позиции, в которых замены происходили минимум в 10-ти из 18-ти исследуемых штаммов (относительно сразу двух референтных - Ast99-901 и Ast99-986).

>$ Sr->A

1361 4537 51S5 6303 7452 8691

528 1432 231Э 2409 30S3 3801 4426 5436 613S 6747 94018511 9724-10305

<П) <хо> да <ls> ач (Ii) ("> (ii) («i <") «э <u>

Ii IHM 11 1 » 1 1 III Ii

5'--H с |ргМ| E | NS1 i 2A|2B | NS3 |-»A|-ÍÍÍ| SSS |- 3'

Рис.2. Расположение характерных нуклеотидных позиций в геноме штаммов ВЗН относительно референтных штаммов А5199-901 и А5199-986. В скобках указано число штаммов, у которых наблюдалась данная замена.

2. Анализ аминокислотных последовательностей.

Число аминокислотных замен, выявленных при сравнении штаммов ВЗН 2001-2005 гг. с двумя референтными штаммами Ая199-901 и А8199-986, варьирует от одной до пяти (таблица 3). Степень аминокислотного сходства, таким образом, составляет больше 99,8%.

Таблица 3. Аминокислотные различия между штаммами ВЗН.

С M E NSI NS2A NS2b NS3 NS4A NS4b №5

ASÎ99-901 I56S 105V

Ast99-986 Ï56P 1051

Ast01-66 15ÎP 169L->M

AstOl-182 1S6P

AstOl-187 154S.156S

Ast02-2-2S 156P IOIR-Ж 125A->G 682S-»A

Ast02-2-26 156P 682S-»A

Ast№2-2-298 156S 66A-»V 682S-»A

Ast02-3-20S 156P 682S-M

Ast02-3-691 156P 682S-»A

АЯЙ2-3-692 1S6S 128L-M 682S->A

Ast02-3-146 28S-»N 682S-»A

АЯ02-3-165 21М-Ж 48M-»V 156 Y 682S-»A

AH02-3-S70 156S 66A-»V 253L-»I 682S-M

АЯ02-3-717 I56S 158N-»S 41K-»Q 682S->A

АЯ04.824А 156P !69L-»M

AsWS-404 I56P,207G-»E 465N-»S 61G-»S 2!5S-»N «82S->A

Ast0S-405 156 S 134Y->F

АЯ05-416 154S, IS«S 134Y-»F

AstOS-418 1541,156S 682S-»A

Аминокислотные замены наблюдаются как в структурных, так и в неструктурных белках вируса и, как правило, носят индивидуальный характер. Исключение составляют замена 169L->M в белке NSI у

штаммов АбЮ 1-66 и АзЮ4-824А, замена 66А->У в белке Ы82В у АзШ2-2-298 и А5«)2-3-570, а также замена 134У->Р у АбЮ5-405 и АбЮ5-418. Однако, глядя на филограмму на рис. 2, можно сделать вывод о том, что эти замены не являлись следствием независимых эволюционных событий.

Одна аминокислотная замена Б-^А в позиции 682 белка N85 встречается у 12-ти из 18-ти анализируемых штаммов. Эта аминокислотная позиция локализована в С-концевом полимеразном домене самого большого и самого консервативного флавивирусного белка N8 5. Интересно, что у представителей других генетических линий ВЗН в этом положении находится только ссрин (данные не представлены), а у вирусов Японского энцефалита, желтой лихорадки и Денге также встречается аланин. Это свидетельствует о неслучайном характере этой аминокислотной замены и ее возможном биологическом значении для функциональных или структурных свойств белка

2.3. Анализ генетических детерминант патогенности ВЗН.

Отдельно, для всех исследуемых штаммов, были проанализированы известные к настоящему моменту генетические детерминанты вируса ЗН, отвечающие за его патогенные свойства. К таким известным факторам патогенности вируса относится, в частности, потенциальный сайт И-гликозилирования оболочечного белка Е, находящийся в позиции 154-156 а.к. Здесь расположен потенциальный сайт И-гликозилирования И-Х-Б/Т у многих флавивирусов, включая ВЗН. На рис.3 показаны выровненные аминокислотные последовательности всех исследуемых штаммов ВЗН, а также некоторых других, в области белка Е в районе 154-156 а.о. У 6 из 18 штаммов ( АбЮ2-2-298, АэЮ2-3-717, АзЮ2-3-570, АэЮ1-692, А5105-404, ЬЕ1У-А8Ю5-405) присутствует мотив ЫУЭ, а еще у трех (АзЮ2-2-25, АзЮ2-3-208, А$Ш1-182) изолятов при анализе хроматограмм секвенирования позиция 1434 н.п. гена Е оказалась гетерогенной и содержала смесь нуклеотидов С/и. Это свидетельствует об исходном генетическом

полиморфизме гена Е в этих штаммах, который приводит к появлению соответствующей гетерогенной позиции серин/пролин в белке Е. Таким образом, частично мотив NYS присутствует и в этих 3 штаммах. У остальных штаммов сайт гликозилирования отсутствует, а вместо мотива NYS присутствуют варианты - NYP (Ast01-66, Ast02-2-26, Ast04-824, Ast02-3-691), SYS (AstOl-187, Ast05-416), NYY (Ast02-3-165), IYS (Ast05-418). У штамма LEIV-Ast02-3-I46 гетерогенными оказались и позиция 1427(А/С), и 1434(C/U), что потенциально допускает частичное гликозилирование белка Е и в этом штамме. Референтные штаммы Ast99-901 и Ast99-986 имеют мотив NYS и NYP соответственно. Штамм Нр94 также содержит сайт потенциального гликозилирования NYS. В опытах in vivo было показано, что дегликозилирование участка 154-156 вирусного белка Е приводило к аттенуации нейроинвазивности (но не нейровирулентносш) в мышах.

Еще несколько важных потенциальных сайтов гликозилирования находятся в белке NS1 в а.к. позициях 130, 175 и 203. Мутанты вируса, дегликозилированные по двум или трем из них, вызывали пониженную виремию и уменьшали уровень летальности in vivo. Все три потенциальных сайта гликозилирования белка NS1 сохранились в исходных позициях во всех исследуемых и референтных штаммах.

Недавно был идентифицирован еще один важный генетический фактор патогенности вируса, связанный с 249 аминокислотой неструктурного белка NS3. Анализируя аминокислотные последовательности разных представителей вируса ЗН, относящихся к разным генетическим линиям, можно убедиться, что эта аминокислотная позиция является очень вариабельной. В частности, она может быть представлена треонином, гистидином, аланином, аспарагином и пролином. Недавно с помощью эволюционного анализа было показано, что эта аминокислота подвержена высокой адаптивной селекции и, по-видимому, играет важную роль в приспособлении вируса к популяциям различных хозяев.

В опытах in vivo было показано, что в низкопатогенном исходно для американского вида ворон Corvus brachyrhynchos варианте ВЗН, единственная замена в белке NS3 по позиции 249 треонина на пролин приводила к существенному изменению патогенных свойств вируса с увеличением титра виремии больше, чем в 10(5) раз и повышением уровня смертности до 94% (против исходного в 31%). Напротив, в исходно высокопатогенном штамме обратная замена 249 пролин на треонин приводила к снижению титра виремии с 9.41og(10) до 3.6 Iog(10) Б.О.Е, а уровень смертности снизился со 100% до 12,5%. Оба штамма принадлежали к первой генетической линии и имели дополнительно 11 аминокислотных различий в геноме.

Все штаммы, выделенные в Астраханской области в 1999-2005 гг., включая референтные Ast99-901, Ast99-986, а также штамм Нр94 1963 года, имеют в данной аминокислотной позиции пролин и, таким образом, содержат в себе важный фактор патогенности ВЗН.

3. Клонирование кДНК-копии генома вируса Западного Нила.

Другой целью данной работы являлось клонирование полноразмерной кДНК копии генома вируса Западного Нила (в рамках более общей задачи по созданию обратной генетической системы для ВЗН). Для этой цели был выбран штамм LEIV-Krd88-190, изолированный на территории России в 1988 году из клеща Dermacenter marginatum и относящийся к отдельной, IV филогенетической группе. Ранее в лаборатории молекулярной генетики НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского была определена нуклеотидная структура генома этого штамма и получены фрагменты, перекрывающие весь геном вируса. Эти фрагменты вирусной кДНК были использованы для получения рекомбинатной плазмиды pGEM-WN190int, несущей полноразмерную копию кДНК вируса. При этом был использован подход,

описанный Ямщиковым и др., 2001 при создании инфекционных копий вирусов Западного Нила и Японского энцефалита. Суть метода заключается в введении короткого (133 н.п.) интрона вируса SV40 в структурную область генома вируса. Такой интрон вызывает сбой открытой рамки считывания, и, как было показано авторами, стабилизирует плазмидную конструкцию с кДНК копией вирусного генома. После трансфекции клеточной культуры плазмидой, содержащей вирусную кДНК под контролем эукариотического промотора, интрон удаляется из транскрибированной in situ вирусной РНК в результате посттранскрипционной модификации. Заметим, что простая замена прокариотического промотора на эукариотический часто не решает проблемы, связанной с нестабильностью плазмид E.coli, несущих большие последовательности эукариотических рекомбинантных ДНК. Химерный интрон вируса SV40 длиной 133 н.п. был амплифицирован из плазмиды рС1-пео с помощью праймеров pCJJntF: 5' GTAAGTATCAAGGTTACAAG 3' и pCIJntR: 5' CTGTGGAGAGAAAGGCAAAG 3', а затем введен в область гена Е по исскуственно созданному сайту Pvu II (CAGCTG). В результате была получена плазмида, названная pGEM-WN190int размером -14 000 н.п. Дополнительно была получена рекомбинантная плазмида pGEM-T7_3286, несущая всю область структурных белков вируса (без интрона), расположенную непосредственно под промотором бактериофага 77. Все нуклеотидные замены, приводящие к замещению аминокислот, были исправлены с помощью сайт-специфического мутагенеза на стадиях клонирования и объединения исходных ПЦР-фрагменгов. Полученные плазмиды использовали для получения РНК in vitro. Для этого к линеаризованной по уникальному сайту Xhol плазмиде pGEM-T7_3286 добавляли соответствующий фрагмент XhoI-NotI из плазмиды pGEM-WN190int. После лигирования лигазную смесь использовали в реакции РНК транскрипции in vitro (рис.6).

Рис.6. Схема получения РНК-транскрипта in vitro.

ВЫВОДЫ.

1. В результате анализа первичной структуры генома 18 штаммов вируса Западного Нила, изолированных в 2001-2005 гг. в Астраханской области РФ, установлена высокая идентичность их как между собой, так и со штаммами ВЗН Ast99-901 и Ast99-986, вызвавшими эпидемические вспышки в этом регионе в 1999-2000 гг.

2. В 6 из 18 штаммов, исследованных в данной работе, содержится потенциальный сайт N-гликозилирования в белке Е, отвечающий за нейроинвазивные свойства вируса. У 9 из 18 штаммов сайт потенциального гликозилирования отсутствует, а в 3 штаммах содержится частично, так как соответствующая позиция в геноме гетерогенна.

3. Все 18 штаммов, исследованных в данной работе, в геликазном домене неструктурного белка NS3 в положении 249 содержат аминокислоту пролин, которая отвечает за высокопатогенные свойства ВЗН in vivo.

4. Плазмида, полученная в данной работе и несущая полноразмерную кДНК копию генома вируса Западного Нила, может быть использована в экспериментальной системе обратной генетики для ВЗН.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Прилипов А. Г., Кинни Р. М., Самохвалов Е. И., Сэведж Г. М., Альховский С. В., Тсучия Р., Громашевский В. JI., Садыкова Г. К.. Шаталов А. Г., Вышемирский О. И., Усачев Е. В., Мохонов В. В., Воронина А. Г., Бутенко А. М., Ларичев В. Ф., Жуков А. Н., Ковтунов А. И., Гублер Д. Дж., Львов Д. К. Анализ новых вариантов вируса лихорадки Западного Нила. // Вопр. вирусол -2002.-№4.-С. 36-41.

2. Львов Д. К., Ковтунов А. И., Яшкулов К. Б., Громашевский В. Л., Джаркенов А. Ф., Щелканов М. Ю., Куликова Л. Н., Сэвидж Г., Чимидова Н. М., Михаляева Л. Б., Васильев А. В., Галкина И. В., Прилипов А. Г., Кинни Р., Самохвалов Е. И., Бушкиева Б. Ц., Гублер Д., Альховский С. К., Аристова В. А., Дерябин П. Г., Бутенко А. М., Москвина Т. М., Львов Д. Н., Злобина Л. В., Ляпина О. В., Садыкова Г. К., Шаталов А. Г., Усачев В. Е., Воронина А. Г., Лунева Л. И Проблемы безопасности при новых и вновь возникающих инфекциях // Вестник РАМН - 2004. - №5. - С. 20-25.

3. Lvov DK, Butenko AM, Gromashevsky VL, Kovtunov AI, Prilipov AG, Kinney R, Aristova VA, Dzharkenov AF, Samokhvalov EI, Savage HM, Shchelkanov MY, Galkina IV, Deiyabin PG, Gubler DJ, Kulikova LN, Alkhovsky SK, Moskvina TM, Zlobina LV, Sadykova GK, Shatalov AG, Lvov DN, Usachev VE, Voronina AG. West Nile virus and other zoonotic viruses in Russia: examples of emerging-reemerging situations // Arch Virol Suppl. 2004 - №18 - P.85-96.

4. Львов Д. К., Ковтунов А. И., Яшкулов К. Б., Громашевский В. Л., Джаркенов А. Ф., Щелканов М. Ю., Куликова Л. Н., Сэвидж Г., Чимидова Н. М., Михаляева Л. Б., Васильев А. В., Галкина И. В., Прилипов А. Г., Кинни Р., Самохвалов Е. И., Бушкиева Б. Ц., Гублер Д., Альховский С. К., Аристова В. А., Дерябин П. Г., Бутенко А. М., Москвина Т. М., Львов Д. Н., Злобина Л. В., Ляпина О. В., Садыкова Г. К., Шаталов А. Г., Усачев В. Е., Воронина А. Г., Лунева Л. И. Особенности циркуляции вируса Западного Нила (Flaviviridae, Flavivirus) и некоторых других арбовирусов в экосистемах дельты Волги, Волго-Ахтубинской поймы и сопредельных аридных ландшафтах (2000—2002 гг.) // Вопросы вирусологии - 2004. - №3. - С. 45-51.

5. Прилипов А.Г., Львов Д.К., Самохвалов Е.И., Садыкова Г.К., Альховский С.В., Воронина А.Г. Способ обнаружения вируса лихорадки Западного Нила // Патент на изобретение № 2199589 от 27.02.2003.

Благодарности.

Автор приносит искреннюю благодарность всем своим коллегам, в тесном сотрудничестве с которыми была выполнена данная работа: Е.И. Самохвалову за помощь в получении РНК и кДНК, C.B. Альховскому за данные советы и полезные дискуссии при обсуждении работы, а также всему коллективу лаборатории экологии вирусов за предоставленный материал для исследований. Автор благодарен своему научному руководителю, А.Г. Прилипову за помощь и ценные советы в работе, а также приносит отдельную благодарность директору Института вирусологии РАМН, академику РАМН Д.КЛьвову за возможность проведения данных исследований и руководство в работе.

Подписано в печать:

28.04.2010

Заказ № 3665 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Садыкова, Галина Кадымовна

ВВЕДЕНИЕ.5.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.10.

1.1. Экология, эпидемиология и географическое распространение вируса Западного Нила.10.

1.2. Филогенетический анализ вируса Западного Нила, его происхождением эволюция.18.

1.3. Генетическая организация и репликативный цикл ф лавивирусов.25.

1.4. Генетические факторы патогенности ВЗН.34.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Компьютерный анализ последовательностей ДНК.40.

2.2. Выделение РНК.40.

2.3. Реакция обратной транскрипции.41.

2.4. Проведение полимеразной цепной реакции.41.

2.5. Клонирование кДНК-фрагментов генома.41.

2.6. Приготовление компетентных клеток.42.

2.7. Трансформация плазмидной ДНК.42.

2.8. Электрофорез ДНК в агарозном геле.43.

2.9. Выделение фрагментов ДНК из агарозы.43.

2.10. Секвенирование ДНК.44.

2.11. Сайт-специфический мутагенез ДНК.44.

2.12. Транскрипция вирусной РНК in vitro.45.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Определение и анализ первичной структуры геномов 19-ти штаммов вируса Западного Нила, изолированных на территории Астраханской области в 2001-2005гг.46.

3.2. Клонирование полноразмерной кДНК-копии российского изолята вируса Западного Нила, относящегося к IV субтипу.67.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.69.

ВЫВОДЫ.74.

БЛАГОДАРНОСТИ.74.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическая характеристика штаммов вируса Западного Нила, выделенных на территории России"

Актуальность проблемы.

Род Flavivirus семейства Flaviviridae состоит более, чем из 70 вирусов, большинство из которых является арбовирусами, т.е. вирусами, передающимися путем биологической трансмиссии восприимчивым позвоночным кровососущими членистоногими переносчиками.

Флавивирусы способны инфицировать широкий круг организмов, включающий в себя млекопитающих, насекомых, птиц и рептилий. Многие из них могут вызывать тяжелые заболевания человека - желтую лихорадку, лихорадку Денге, клещевой энцефалит, японский энцефалит и др. Прототипным вирусом семейства считается вирус жёлтой лихорадки, который и дал название семейству и роду флавивирусов. (Термин "flavi" происходит от латинского слова "flavus" - жёлтый и связан с жёлтым цветом кожи у больных жёлтой лихорадкой.) В большинстве случаев передача инфекции осуществляется через укус переносчика - комара или клеща, что позволяет разделить флавивирусные инфекции на переносимые клещами и комарами, а также заболевания, для которых переносчик не установлен. Наиболее значимые для человека флавивирусные инфекции связаны с вирусами Денге, желтой лихорадки, японского энцефалита, клещевого энцефалита и Западного Нила. Ежегодно Всемирная Организация Здравоохранения регистрирует более 50 миллионов случаев заболевания лихорадкой Денге, около 200 ООО случаев заболевания желтой лихорадкой и около 50 000 случаев заболевания японским энцефалитом. Смертность от заболеваний, вызванных этими наиболее патогенными представителями семейства флавивирусов, варьирует в пределах 5%-30% .

Дополнительным фактором значимости проблем, связанных с флавивирусными инфекциями, становится существенное расширение их ареала. Здесь ярким примером может служить вирус японского энцефалита, который во второй половине XX века широко распространился в Азии, Океании, а в конце 1990-х достиг австралийского континента. Другой хорошо известный пример связан с проникновением в 1999 году и последующим стремительным распространением вируса Западного Нила на американском континенте. Возможность переноса флавивирусов перелетными птицами, их способность реплицироваться в новых видах млекопитающих, быстрая адаптация к природным условиям обеспечивает формирование новых природных очагов флавивирусных инфекционных заболеваний, в которые вовлекается и проживающее на этой территории население. Отсутствие на сегодняшний день вирусоспецифических препаратов, эффективных методов лечения, а, нередко, и профилактики заболеваний, вызванных флавивирусными инфекциями, объясняет интерес работников науки и практического здравоохранения к данной проблеме.

Для России наиболее актуальными являются вирус клещевого энцефалита (несмотря на существование эффективной вакцины) и вирус Западного Нила. В нашей стране наиболее активные очаги лихорадки Западного Нила расположены в Астраханской области, на территории дельты Волги. Здесь, в дельте Волги, в силу географических и экологических особенностей сформированы чрезвычайно благоприятные условия для поддержания активной циркуляции ВЗН, и почти ежегодно фиксируется спорадическая заболеваемость ЛЗН, иногда эпидемические вспышки.

Особую значимость вирус Западного Нила приобрел после ряда крупных эпидемических вспышек, произошедших в конце 1990-х годов в различных частях света и характеризующихся необычно частыми, для данной инфекции, случаями поражения ЦНС и высокой смертностью. В 1994 году произошла вспышка в Алжире, в ходе которой было зарегистрировано около 50 случаев заболевания с 8 летальными исходами. Последующая вспышка ЛЗН была зарегистрирована в

Румынии в 1996 году, где также наблюдался необычно высокий (-9%) уровень смертности. В 1997 году на гусиных фермах в Израиле случилась крупная эпизоотия ЛЗН с острыми неврологическими проявлениями. Среди людей эпидемия случилась в 2000 году, хотя еще в 1999 году было отмечено два смертельных случая заболевания ЛЗН. В общей сложности в 2000 году в Израиле было зарегистрировано 417 подтвержденных случаев заболевания ЛЗН, причем в половине случаев с поражениями ЦНС. Уровень смертности при этом составлял, по разным данным, от 8 до 14 %. В 1999 году почти одновременно эпидемические вспышки ЛЗН произошли на юге России и в Нью-Йорке, США, при сходном 10%) уровне летальности. Вопрос, чем обусловлено серьезное изменение характера патогенности эпидемических вспышек, вызванных в последнее время вируса Западного Нила, остается открытым. Сравнительный и эволюционный анализ первичной структуры геномов различных изолятов ВЗН, поиск и изучение генетических детерминант вируса, отвечающих за его патогенные свойства, являются в настоящее время предметом интенсивных исследований.

Настоящая работа была выполнена в рамках комплексного изучения биологии вируса Западного Нила, циркулирующего на территории юга Русской равнины, которое проводится в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН с 1999 года. В рамках этого исследования были, в частности, выполнены работы по генетической характеристике российских штаммов ВЗН, вызвавших эпидемии 19992000 гг., созданию новых чувствительных тест-систем для детекции возбудителя, а также работы по мониторингу циркуляции вируса, включающему в себя наблюдения за вирусной активностью во всех звеньях экологической цепи.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлась характеристика и изучение генетических свойств популяции ВЗН, циркулирующей на эндемичной территории юга Астраханской области России. В этой связи были поставлены следующие задачи:

1. Установить первичную структуру геномов 18-ти штаммов вируса Западного Нила, изолированных в 2001-2005 гг. на территории Астраханской области.

2. Охарактеризовать генетические свойства вирусной популяции, циркулировавшей на данной территории в период с 2001 по 2005 гг.

3. Разработать экспериментальную систему для изучения биологических свойств ВЗН методами обратной генетики на основе низкопатогенного штамма LEIV-Krnd88-190.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Установлена нуклеотидная последовательность геномов (с 24 н.п. по 10834 н.п. включительно) 18-ти штаммов вируса ЗН, изолированных в 2001-2005 годах в Астраханской области из птиц, комаров и клещей.

2. Проведена молекулярно-генетическая характеристика данных штаммов, включающая в себя анализ их нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, а также поиск известных функциональных детерминант вируса, отвечающих за его патогенные свойства.

3. Создана экспериментальная система для транскрипции вирусной РНК in vitro на основе бактериальной высококопийной плазмиды, несущей полноразмерную кДНК копию вирусного генома.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Клонирована кДНК копия полного генома вируса Западного Нила, относящегося к IV генотипу на основе низкопатогенного штамма LEIV

Krnd88-190. Создана экспериментальная система для получения вирусной РНК in vitro.

Впервые определена первичная структура генома для 9 штаммов ВЗН, кодирующая все структурные и неструктурные белки, а также нетранслируемые области генома (частично). Для 9 штаммов ВЗН впервые определена первичная структура, кодирующая неструктурные белки вируса, а также 3' -нетранслируемую область (частично).

Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей исследуемых штаммов выявил их высокую идентичность с астраханскими штаммами Ast99-986 и Ast99-901, вызвавшими эпидемические вспышки в 1999-2000 гг.

Проведен поиск функциональных детерминант вируса, отвечающих за его вирулентные свойства. В частности, показано, что у 6 из 18 штаммов в положении 154-156 а.к. оболочечного белка Е имеется потенциальный сайт гликозилирования NYS, который является одним из ключевых факторов нейроинвазивности вируса в мышах, а три штамма имеют смешанную NYS/NYP позицию. Кроме того, у всех исследуемых штаммов имеется аминокислота пролин в 249-й позиции геликазного домена неструктурного белка NS3, которая, как было показано в опытах in vivo, также отвечает за патогенные свойства вируса Западного Нила.

Данные о первичной структуре вирусов являются важными, как для многих фундаментальных исследований, связанных с происхождением, распространением и эволюцией вирусов, так и практических научных вопросов, связанных с эпидемиологией вирусных инфекций. Разработка мер по предотвращению эпидемиологических заболеваний включает в себя ряд вопросов, связанных с установлением источника и путей распространения вирусной инфекции, а также мониторингом появления новых, более опасных вариантов вируса.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Садыкова, Галина Кадымовна

ВЫВОДЫ.

1. В результате анализа первичной структуры генома 18 штаммов вируса Западного Нила, изолированных в 2001-2005 гг. в Астраханской области РФ, установлена высокая идентичность их как между собой, так и со штаммами ВЗН Ast99-901 и Ast99-986, вызвавшими эпидемические вспышки в этом регионе в 1999-2000 гг.

2. В 6 из 18 штаммов, исследованных в данной работе, содержится потенциальный сайт N-гликозилирования в белке Е, отвечающий за нейроинвазивные свойства вируса. У 9 из 18 штаммов сайт потенциального гликозилирования отсутствует, а в 3 штаммах содержится частично, так как соответствующая позиция в геноме гетерогенна.

3. Все 18 штаммов, исследованных в данной работе, в геликазном домене неструктурного белка NS3 в положении 249 содержат аминокислоту пролин, которая отвечает за высокопатогенные свойства ВЗН in vivo.

4. Плазмида, полученная в данной работе и несущая полноразмерную кДНК копию генома вируса Западного Нила, может быть использована в экспериментальной системе обратной генетики для ВЗН.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор приносит искреннюю благодарность всем своим коллегам, в тесном сотрудничестве с которыми была выполнена данная работа: Е.И. Самохвалову за помощь в получении РНК и кДНК, C.B. Альховскому за данные советы и полезные дискуссии при обсуждении работы, а также всему коллективу лаборатории экологии вирусов за предоставленный материал для исследований. Автор благодарен своему научному руководителю, А.Г. Прилипову за помощь и ценные советы в работе, а также приносит отдельную благодарность директору Института вирусологии РАМН, академику РАМН Д.К.Львову за возможность проведения данных исследований и руководство в работе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Садыкова, Галина Кадымовна, Москва

1. Andreadis T.Y., Anderson J.F., Vossbrinck R. Mosquitoes surveillance for West Nile virus in Connecticut, 2000: isolation from Culex pipiens, Cx. Salinarius, and Culiseta melanura // Emerg. Infect. Dis. 2001. -N7. - pp.670-4.

2. Bakonyi Т., Hubalek Z., Rudolf I., Nowotny N. Novel flavivirus or new lineage of West Nile virus, Central Europe // Emerg. Infect. Dis. 2005. - Vol. 11. - N2. - pp. 225-31.

3. Beasley D., Barrett A. Identification of neutralizing epitopes within structural domain III of the West Nile virus envelope protein // J Virol.- 2002,- Vol. 76. N24. - pp. 13097100.

4. Beasley D.W.C., Li Li, Suderman M.T., and Barrett A. Mouse neuroinvasive phenotype of West Nile virus strains varies depending upon virus genotype // Virology — 2002. Vol. 296. - pp. 17-23.

5. Bell J.A., Brewer C.M., Mickelson N. J. et. al. West Nile virus epizootology, Central Red river valley, North Dakota and Minnesota, 2002-2005 // Emerg. Infect. Dis. 2006. -Vol. 12.-N8.-pp. 1245-7.

6. Berthet F.X., Zeller H.G., Drouet M.T., Rauzier J„ Digoutte J.P., Deubel V., Extensive nucleotide change and deletions within the elnvelope glycoprotein gene of Euro-African West Nile viruses // J of Gen. Virology.- 1997.-Vol.78.- pp.2293-97.

7. Besselaar T. G. and Blackburn N. K. Antigenic analysis of West Nile virus strains using monoclonal antibodies // Arch. Virol.-1988.-№99.-pp.75-88.

8. Bin H., Grossman Z., Pokamunski S., Malkinson M., Weiss L., Duvdevani P., Banet C., Weisman Y., Annis E., Gandaku D., Yahalom V., Hindyieh M., Shulman L., Mendelson E.

9. West Nile fever in Israel 1999-2000: from geese to humans // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2001.-Dec. - №951. - pp. 127-42.

10. Blackwell, J. L., and M. A. Brinton. 1997. Translation elongation factor-1 alpha interacts with the 3 stem-loop region of West Nile virus genomic RNA // J. Virol. 71:64336444.

11. Bondre V.P., Jadi R.S., Mishra A.C., Yergolkar P.N. and Arankalle Y.A. West Nile virus isolates from India: evidence for a distinct genetic lineage // Journ. of Gen. Virol. 2007. -Vol. 88.-pp. 875-84.

12. Botha E.M., Markotter W., Wolfaardt M., Paweska J.T., Swanepoel R., Palacios G., Nel L.H. and Venter M. Genetic determinants of virulence in pathogenic lineage 2 West Nile virus strains. // Emerg. Infect. Dis. -2008. Vol. 14. - N2. - pp. 222-30.

13. Brault, A. C., Langevin, S. A., Bowen, R. A., Panella, N. A., Biggerstaff, B. J., Miller, B. R. & Nicholas, K. Differential virulence of West Nile strains for American crows. //Emerg Infect Dis.-2004.-Vol 10.- 2161-68.

14. Brinkworth R.I., Fairlie D.P., Leung D., Young P.R. Homology model of the dengue 2 virus NS3 protease : putative interactions with both substrate and NS2B cofactor // J. Gen.Virol. -1999.- Vol.80. P. 1167-77.

15. Brinton M.A. The molecular biology of West Nile virus: a new invader of the western hemisphere// Ann.Rev. Microbiol. 2002. - Vol.56. - P. 371- 402.

16. Brinton M.A. The molecular biology of West Nile virus: a new invader of the western hemisphere// Ann.Rev. Microbiol. 2002. - Vol.56. - P. 371- 402.

17. Campbell, M. S., and A. G. Pletnev. Infectious cDNA clones of Langat tick-borne flavivirus that differ from their parent in peripheral neurovirulence // Virology. 2000. - Vol. 269.-pp. 225-37.

18. Chambers T. J., Hahn C. S., Galler R. et al. Flavivirus genome organization, expression, and replication // Ann. Rev. Microbiol. — 1990. — Vol. 44. — pp. 649—88.

19. Chambers J., Halevy M., Nestorowicz A., Rice Ch., Lustig S. West Nile virus envelope proteins: nucleotide sequence analysis of strains differing in mouse neuroinvasiveness //Journ. of Gen. Virology.-1998.-Vol.79.-pp.2375-2380.

20. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem.- 1987. Vol.162.- N1.- pp. 156159.

21. Crabtree M.B., Kinney R.M., Miller B.R. Deglycosilation of the NS1 protein of dengue 2 virus, strain 16681: construction and characterization of mutant viruses // Arch. Virol. 2005. -Vol. 150.-pp. 771-86.

22. Dauphina C., Zientaraa S., Zellerb H., Murguec B. West Nile: worldwide current situation in animals and humans // Comparative Immunology, Microbiology and Infect. Dis. -2004. Vol. 27.- pp. 343-55.

23. Davis C.W., Nguyen H.Y., Hanna S.L. et al. West Nile virus discriminates between DC-SIGN and DC-SIGN-R for cellular attachment and infection // J Virol. 2006. - Vol.80 -pp. 1290-301.

24. Davisa C. T., Beasleya D.W., Guzmana H., Siirina M., Parsonsc R.E., Tesha R.B., Barrett A.D. Emergence of attenuated West Nile virus variants in Texas, 2003 // Virology — 2004. Vol. 330. - P. 342-50.

25. Eidson M., Komar N., Sorhage F., Nelson R., Talbot T., Mostoshari F. Crow deaths as a sentinel surveillance system for West Nile virus in the northeastern United States, 1999 // Emerg. Infect. Dis.-2001.-N7.- pp.615-620.

26. Eidson M., Kramer L., Stone W., Hagiwara Y., Schmit K. Dead bird surveillance as an early warning system for West Nile virus // Emerg. Infect. Dis.- 2001.-N7.- pp.631-635.

27. Estrada-Franco J.G., Navarro-Lopez R., Beasley D.W., Coffey L., Carrara A.S., Travassos da Rosa A., Clements T., Wang E., Ludwig G.V., Cortes A.C., Ramirez P.P.,

28. TeshR.B., Barrett A.D., Weaver S.C. West Nile virus in Mexico: evidence of widespread circulation since My 2002 // Emerg. Infect. Dis.-2003.-Vol.9.-№12.-pp. 1604-1607.

29. Grinev A., Daniel S., Stramer S., Rossmann S., Cagliotti S. and Rios M. Genetic variability of West Nile virus in US blood donors, 2002-2005 // Emerg. Infect. Dis. 2008. -Vol.14.-N3.-pp. 436-44.

30. Guo J.T., Hayashi J., Suger C. Wesr Nile virus inhibits the signal transduction pathways of alpha interferon // J Virol. 2005. - Vol. 79. - N3. - pp. 1345-50;

31. Halevy M, Akov Y, Ben-Nathan D, Kobiler D, Lachmi B, Lustig S. Loss of active neuroinvasiveness in attenuated strains of West Nile virus: pathogenicity in immunocompetent and SCID mice//Arch. Virol. 1994.-Vol.137. - pp. 355-70.

32. Hall R.A., Scherret J.H., Mackenzi J.S. Kunjin virus: an Australian variant of West Nile? // Ann. N Y Acad. Sci.-2001.-Dec.-№951.-pp. 153-60.

33. Hanna S.L., Pierson T.C., Sanchez M.D., Ahmed A.A., Murtadha M.M. and Doms R.W. N-linked glycosilation of West Nile virus envelope proteins influences particle assembly and infectivity // J Virol. 2005. - Vol. 79. - N21. - pp. 13262-74.

34. Hayes E.B., Komar N., Nasci R.S. et. al. Epidemiology and tansmission dynamics of West Nile virus disease // Emerg. Infect. Dis. 2005. - Vol.11. -N8. - pp. 1167-73.

35. Ho J.-J., Huang L.F. , Weng C. J., et al. Denge virus type 2 antagonizes IFN-alpha but not IFN-gamma antiviral effect via down-regulating Tyk2-Stat signaling in the human dendritic cell // J. Immunol. 2005. - Vol. 174. - pp.8163-72.

36. Hurrelbrink, R. J., A. Nestorowicz, and P. C. McMinn. 1999. Characterization of infectious Murray Valley encephalitis virus derived from a stably cloned genome-length cDNA //J. Gen. Virol. 1999. - Vol.80, -pp. 3115-25.

37. Jia X.Y., Briese T., Jordan I., Rambaut A., Chi H.C., Mackenzie J.S., Hall R.A., Scherret J., Lipkin W.I. Genetic analisis of West Nile New York 1999 encephalitis virus // Lancet.-1999.-Vol. 354. pp.1971-2.

38. Kanai R., Kar K., Anthony K., Gould L.H., Ledizet M., Fikrig E., Marasco W.A., Koski R.A., Modis Y. Crystal structure of West Nile virus envelope glycoprotein reveals viral surface epitopes // J. Virol. 2006. - Vol. 80. - pp. 11000-8.

39. Kapoor, M., L. Zhang, P. M. Mohan, and R. Padrnanabhan. Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain). // Gene. -1995. Vol.162. - pp.175-80.

40. Khromykh A., Westaway E.G. Subgenomic replicons of the flavivirus Kunjin: construction and applications// J. Virol.- 1997.- Vol. 71 (2). P. 1497-505.

41. Khromykh, A. A., and E. G. Westaway. Completion of Kunjin virus RNA sequence and recovery of an infectious RNA transcribed from stably cloned full-length cDNA // J. Virol. 1994. - Vol. 68. - pp. 4580-8.

42. Kinney R.M., Huang C., Whiteman M.C., Bowen R.A., Langevin S.A., Miller B.R., Brault A.C. Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus // Journ. of Gen. Virol. 2006.- Vol. 87. - P. 3611-22.

43. Komar N., Langevin S., Hinten S., Nemeth N., Edwards E., Hettler D., Davis B., Bowen R., Bunning M. Experimental infection of North American birds with the Ney York 1999 strain of West Nile virus // Emerg. Infect. Dis.- 2003. Vol.9. - N3.- pp. 311 -22.

44. Kyung Min Chung, M. Kathryn Liszewski, Grant Nybakken et al. West Nile virus nonstructural protein NS1 inhibits complement activation by binding the regulatory protein factor H // Proc Natl Acad Sei USA. 2006. Vol.103.- N50. - pp.19111-6.

45. Kuno G., Chang G.-J.J., Tsuchiya K.R., Karabatsos N. and Cropp S.B. Phylogeny of the genus Flavivirus // J. Virol. 1998. - Vol. 72. - pp.73-83.

46. Lai, C. J., B. T. Zhao, H. Hori, and M. Bray. Infectious RNA transcribed from stably cloned full-length cDNA of dengue type 4 virus //PNAS. 1991. - Vol. 88. pp. 5139-43.

47. W., McNamara T., Gubler DJ. Origin of West Nile virus responsible for an outbreak of encephalitis in the Northeastern United States // Science.- 1999.-VoI.286.- pp.2333-7.

48. Lee E., Hall R.A., Lobigs M. Common E protein determinants for attenuation of glycosaminoglycan-binding variants of Japanese encephalitis and West Nile viruses // J. Virol.-2004.-Vol. 78.- N15.-pp. 8271-80.

49. Lee J.W., Chu J.J., Ng M.L. Quantifying the specific binding between West Nile virus envelope domain III protein and the cellular receptor alphaVbeta3 integrin // J.Biol. Chem. -2006.-Vol.281.-N3. -pp. 1352-60.

50. Leung D., Schroder K., White H. et. AI. Activity of recombinant dengue 2 virus NS3 protease in the presence of a truncated NS2B co-factor, small peptide substrates, and inhibitors // J. Biol.Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 45762-71.

51. Lin C.W., Liu K.T., Huang H.D., Chen W.J. Protective immunity of E. coli-synthesized NS1 protein of Japanese encephalitis virus // Biotechnol Lett. 2008. - Vol.30.-N2. - pp.205-14.

52. Lin R.-J., Chang B.-L., Yu H.-P. et al. Blocking of IFN-induced Jak-Stat signaling by Japanese encephalitis virus NS5 through a protein tyrosine phosphatase-mediated mechanism // J. Virol. 2006: - Vol. 80. - pp.5908-18.

53. Lin Y. L., Chen L.K., Liao C.L. et al. DNA immunization with Japanese encephalitis virus nonstructural protein NS1 elicits protective immunity in mice // J. Virol. 1998. - Vol. 72.-pp. 191-200.

54. Lindenbach B.D., Rice C.M., Genetic interaction of flavivirus nonstructural proteins NS1 and NS4A as a determinant of replicase function // J.Virol.- 1999. Vol.73. - N6.-pp.4611-21.

55. Mandl, C. W., M. Ecker, H. Holzmann, C. Kunz, and F. X. Heinz. Infectious cDNA clones of tick-borne encephalitis virus European subtype prototypic strain Neudoerfl and high virulence strain Hypr // J. Gen. Virol. 1997. - Vol.78. - pp. 1049-57.

56. Marin , M.S., Zanotto P.M., Gritsun T. and Gould E.A. Phylogeny of TYU, SRE, and CFA virus: differenr evolutionary rates in the genus Flavivirus // Virology. 1995. - Vol. 206. -pp. 1133-9.

57. Molaei G., Andreatis T.G., Amstrong P.M. et. al. Host feeding patterns of Culex mosquitoes and West Nile virus transmission, Northeastern United States // Emerg. Infect. Dis. 2006. - Vol. 12. -N3. - pp. 468-74.

58. McMinn P.C. The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flaviviruses // J. of General Virology.- 1997,-Vol.78.- pp.2711-22:

59. Moudy R.M., Meola MA, Morin LL, Ebel GD, Kramer LD (2007) A newly emergent genotype of West Nile virus is transmitted earlier and more efficiently by Culex mosquitoes // Am. J. Trop. Med. Hyg. Vol. 77.- pp. 365-70.

60. Moudy R.M., Zhang B., Shi P.Y., Kramer LD. West Nile virus envelope protein glycosylation is required for efficient viral transmission by Culex vectors // Virology. 2009. -Vol. 387.-Nl.-pp. 222-8.

61. Piersona T. C., Diamond M.S., Ahmeda A.A., Valentine L.E. , Davis C.W., Samuel M.A., Hanna S.L., Puffer B.A., Doms R.W. An infectious West Nile Virus that expresses a GFP reporter gene // Virol. 2005. - Vol. 334. - P. 28-40.

62. Puig-Basagoiti F., Tilgner M., Bennet C.J. et al. A mouse cell-adapted NS4B mutation attenuates West Nile virus RNA synthesis // Virology. 2007. - Vol. 361. - pp. 229-241.

63. Samuel C. E. Host genetic variability and West Nile virus susceptibility // PNAS. -2002- Vol. 99.-N18. -pp. 11556-7.

64. Rice, С. M., A. Grakoui, R. Galler, and Т. J. Chambers. Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation // New Biol. -1989.-Vol.1.- pp:285-96.

65. Rice C.M., Strauss E.G., Strauss J.H. Structure of the flavivirus genome // В кн.: The Togaviridae and Flaviviridae / Под ред. M.J. Shlesinger.-New York.:Plenum.- 1986. pp.279.

66. Scholle F., Mason P.W. West Nile virus replication interferes with both poly (I:C)-induced interferon gene transcription and response to interferon treatment // Virology. — 2005. -Vol. 342.-pp. 77-87.

67. Shi P., Tilgner M., Lo M.K., Kent K., and Bernard K. Infectious cDNA clone of the epidemic West Nile virus from New York city // Journal of Virol.- 2002.-Vol. 76.-N12. -P.5847-56.

68. Sumiyoshi, H., С. H. Hoke, and D. W. Trent. Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro-ligated cDNA templates // J. Virol. 1992. - Vol.66. -pp. 5425-31.

69. Tilgner M., Shi P.Y. Structure and function of the З'-terminal six nucleotides ofthe West Nile virus genome in viral replication // J. Virol.- 2004.- Vol. 78. N15. - pp. 815971.

70. Wilson J. R., de Sessions P. F., Leon M. A., Scholle F. West Nile virus nonstructural protein 1 inhibits TLR3 signal transduction // J. Virol. 2008. -Vol. 82. - N 17. - pp. 8262-71.

71. Yamshchikov V., Mishin V., Cominelli F. A new strategy in design of RNA virus infectious clones enabling their stable propagation in E. coli. И Virology. 2001. - Vol. 281. -pp. 272-80.

72. Yamshchikov V. F., Compans R.W. Regulation of the late events in the flavivirus protein processing and maturation // Virology. 1993. - Vol. 193. - N1. - pp. 3 8-51.

73. Yamshchikov V. F., Wengler G., Perelygin A. A. et al. An infectious clone of the West Nile flavivirus // Virology. 2001. - Vol. 281. - pp. 294-304.

74. Yang J.S., Ramanathan M.P., Muthumani K. Et al. Induction of inflammation by West Nile virus capsid through the caspase-9 apoptotic pathway // Emerg. Infect. Dis. — 2002 — Vol. 8.-P. 1379-1384.

75. Zanotto P.M. A., Gould E.A., Gao G.F., Harvey P.H. and Holmes E.C. Population dynamics of flaviviruses revealed by molecular phylogenies // PNAS. 1996. - Vol.93. - pp. 548-53.

76. Zhang В., Dong H., Stein D.A., Iversen P.L. and Shi P.-Y. West Nile virus genome cyclization and RNA replication require two pairs of long-distance interactions // Virology. -2008.-Vol. 373.-pp. 1-13.

77. Zhou Y., Ray D., Zhao Y. et al. Structure and function of flavivirus NS5 methyltransferase //J. Virol. — 2007. — Vol. 81. — pp. 3891—3903;

78. Булычев В.П., Данияров А., Гордеева З.Е. Выделение вируса Западного Нила от комаров Culex pipiens в Таджикистане //в кн.: Арбовирусы.Инст.виросологии им.Д.И.Ивановского АМН СССР. М.-1981.- с.95-96.

79. Бутенко A.M.,Чумаков М.П., Беляева А.П. Серологическая идентификация астраханского вируса из клещей //В кн.: Клещевой энцефалит, кемеровская клещевая лихорадка и другие арбовирусные инфекции / Под ред.М.П.Чумакова.-М.-1964.-С.7-9.

80. Виноград И.А., Белетская Г.В., Чумаченко С.С., Ардаматская Т.Б., РогочшТЕ.Г. Изоляция вируса Западного Нила в южной Украине // Вопр. вирус.-1982.-№5.-С.55-57.

81. Ю2.Войнов И.Н., Рытик П.Г., Григорьев А.И. Арбовирусные инфекции в Белоруссии / Вирусы и вирусные инфекции человека.-М.-1981.-С.86-87.

82. Львов Д.К., БутенкоА.М., Гайдамович С.Я., Ларичев В.Ф., Лещинская Е.В., Лазаренко В.В., Петров В.Р., Триханов С.Т., Хуторецкая Н.В., Шишкина Е.О., Яшков

83. A.Б. Эпидемия менингоэнцефалита в Краснодарском крае и Волгоградской области, вызванная вирусом Западного Нила //Вопр.вирусол.-2000.-№1.- С.37-38.

84. Львов Д.К., БутенкоА.М., Вышемирский О.И., Гайдамович С.Я., Громашевский

85. Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я. Арбовирусы и арбовирусные инфекции.-М.:Медицина.-1986.-336 с.

86. Львов Д. К., Ковтунов А. И., Яшкулов К. Б., Громашевский В. Л., Джаркенов А. Ф., Щелканов М. Ю., Куликова Л. Н., Сэвидж Г., Чимидова Н. М., Михаляева Л. Б., Васильев А. В., Галкина И. В., Прилипов А. Г., Кинни Р., Самохвалов Е. И., Бушкиева Б.

87. Львов Д.К., Лебедев А.Д. Экология арбовирусов.-М.:Медицина.-1974.- С.184.

88. Львов Д.К., Писарев В.Б., Петров В.А., Григорьева Н.В. Лихорадка Западного Нила. // Приложение к Вестнику Волгоградского медицинского университета. Волгоград, 2004.

89. Сиденко Б.Ф., Думина А.Л., Грекова B.C. Циркуляция вируса Западного Нила среди птиц Украинского Причерноморья // в кн.: Экология вирусов, вып I.-M.-1973.-с. 164-169.

90. Федорова М.В., мат. конф. "Арбовирусы и арбовирусные инфекции" 2006.

91. Чумаков М.П., Беляева А.П., Бутенко A.M., Мартьянова Л.И. Вирус Западного Нила в СССР // Эпидемиология вирусных инфекций.-1968.-Т.12.-С.365-373.

92. Чумаков М.П., Бутенко А.М., Башкирцев В.Н. Выделение вируса Западного Нила от больных людей в Астраханской области // Этиология, эпидемиология и клиника крымской геморрагической лихорадки и лихорадки Западного Нила.-Астрахань.-1969.-С.36-38.