Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая характеристика района возможной локализации гена, ответственности за множественную экзостозную хондродисплазию (ЕХТ1)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика района возможной локализации гена, ответственности за множественную экзостозную хондродисплазию (ЕХТ1)"

V Г 6 од

- академия медицинских наук

Медико-Генетический Научный Центр

На правах рукописи УДК 575.113.2+616-056.7

Яценко Александр Николаевич

Молекулярно-генетическая характеристика района возможной локализации гена, ответственного за множественную экзостозную хондродисплазию (ЕХТ\).

03.00.15 "Генетика"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в лаборатории клинической цитогенетики Института клинической генетики и наследственной патологии Медико-генетического научного центра РАМН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Д. В. Залетаев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Н. А. Ляпунова, кандидат биологических наук М. И. Просняк.

Ведущая организация: НИИ педиатрии и детской хирургии Министерства Здравоохранения и Медицинской промышленности РФ, Москва.

* с"

Защита диссертации состоится "/// * ^"/'•^'/ыл; 1996 г. в //час, на заседании Диссертационного Совета Д 001.16.01 по адресу: Москва, 115478, ул. Москворечье, дом. 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

МГНЦ РАМН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор биологических наук,

профессор

Л. Ф. Курило

Общая характеристика работы.

Настоящая работа посвящена исследованию предполагаемой области локализации гена ЕХТ1, ответственного за возникновение множественной экзостозной хондродисплазии (МЭХД).

Актуальность темы. Обнаружение и исследование генов, мутации в которых приводят к возникновению наследственных заболеваний человека, позволяют не только понять молекулярно-гене-тические механизмы возникновения этих заболеваний, но и разработать эффективные методы их диагностики.

МЭХД является достаточно распространенным аутосомно-доминантным заболеванием, имеющим частоту 1 на 50000-100000 человек в различных популяциях (Shmate et at., 1994), и составляет до 10% обращений в специализированные клиники. До 80% МЭХД составляют семейные случаи (Lе Merrer et at., 1994). На эту патологию приходится около 27% всех доброкачественных опухолей, опухолелодобных и диспластических поражений скелета (Eder et al., 1993). Серьезным осложнением при множественных экзостозах (МЭ) является трансформация отдельных экзостозов во вторичную хондрому и/или хондросаркому. Частота таких случаев достигает 5% (L ackert-Wickland et al., 1994).

На сегодняшний день известно, что МЭ- гетерогенное заболевание. Гены, ответственные за возникновение этого заболевания, картированы на хромосомах 8, 11, 19. При генетическом картировании МЭХД с использованием микросателлитных маркеров показано, что примерно в 50% семей с МЭ предполагаемый ген заболевания локализуется в области хромосомы 8q24.11 (Cook el al , 1993; Blanton et al, 1996). Хромосома 8 человека содержит около 155 миллионов пар муклеотидов (м.п.н.) и составляет около 4% генома человека На ней локализовано 249 STR (Short Tandem Repeats) (Dib et al 1996). За последние годы на хромосоме 8 картировано около 200 генов, в том числе гены пигментного ретинита 2-го типа, атипичной макулярной дистрофии, аде-нилциклазы мозга человека, а также гены ответственные за возникновение опухоли предстательной железы, плейоморфной аде номы слюнных желез, рака прямой кишки и др. Участок длинного ппеча хромосомы 8q23-24 12 имеет протяженность около 25 м п н., и на нем картированы 4 гена: рецептор тиреотропин-по-добного гормона, трихо-рино-фаланговый синдром !-типа; множественная экзостозная хондродисплазия; дистрофин-ассоциирован-ный пептид (Spurr et al., 1994; Chen et al., 1996).

\

Ранее было проведено делеционное картирование у в больны* с синдромом Лангвра-Гидиона (СЛГ) и 3 больных с трихо рино-фаланговым синдромом 1-типа (ТРФС-1). Показано, что наиболее вероятным районом локализации гена ЕХГ1 является локус 08867(см.рис.10.) из хромосомной области 8q24.11 (Немцова V др., 1996). Из этого локуса был выделен и клонирован новый ДНК-маркер 49С2Н14 (далее М5). При использовании его в качестве ДНК-зонда был выявлен дополнительный гибридизационный сигнал, около 6.5 т.п.н., у 8 больных из 4 семей с МЭХД. Это позволило предположить, что этот маркер является внутригенным илу расположен в непосредственной близости от предполагаемого гена ЕХТ1 (Немцова, 1994). Все выше сказанное определило цель и задачи настоящего исследования.

Основной цель|0 исследования была молекулярно-генети-ческая характеристика локуса 08867, которая является областьк предполагаемой локализации гена МЭХД (ЕХТ 1). Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Характеристика ДНК-маркера М5 из локуса 08867 на основе секвенирования и компьютерного анализа нуклеотидной последовательности;

2. Скрининг кДНК-библиотек человека с использованием ДНК маркера М5 для выявления клонов, содержащих кодирующук последовательность из локуса 08867;

3. Молекулярно-генетическая характеристика отобранных кДНК-клоноа на основе секвенирования и компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей;

4. Характеристика полиморфных районов локуса 08867 в норме и при множественной экзостозной хондродисплазии;

5. Поиск и характеристика мутаций в ДНК лимфоцитов и секционного материала экзостоза и хондросаркомы у больных МЭХД.

Научная новизна. Впервые проведен молекулярно-генетиче ский анализ нуклеотидной последовательности из локуса 08в67 с районе хромосомы 8q24.11, который является предполагаемое областью локализации гена МЭХД {ЕХТ 1). Определена нуклеотид-ная последовательность ДНК-маркера М5 протяженностью 555! п.н., при помощи компьютерного анализа выявлены 3 вероятны) »«она а его составе. Определена нуклеотидная последовательность 5 отобранных кДНК-клонов общей протяженностью боле« 4000 п.н. и проведен их компьютерный анализ. Один из кДНК-кло

нов локализован в последовательности ДНК-маркера MS. Получены 6 новых STS (Sequence Tagged Site- секвенированный маркерный участок) и один EST (Expressed Sequence Tag- экспресси-рующийся секвенированный маркер) для локуса D8S67. В районе этого локуса выявлен ранее не описанный, высокополиморфный несовершенный тетрануклеотидный повтор (СТТТ)п/(ССТТ)п, охарактеризована вариабельность его аллелей в норме и у больных с МЭХД. Впервые проведен поиск мутаций в нескольких районах локуса D8S67 у больных с МЭХД и в секционном материале экзостоза и хондросаркомы. В результате исследования выявлены 4 случая вероятных мутаций и одна структурная перестройка в ДНК лимфоцитов и секционного материала экзостоза.

Практическая ценность. В результате проделанной работы охарактеризованы последовательность ДНК-маркера MS и новые STS и EST в локусе D8S67, которые могут быть использованы для физического и генетического картирования. Полученная информация является вкладом в программу "Геном человека". Разработана модификация метода окраски ДНК нитратом серебра, которая позволяет сократить время окрашивания с 2 часов до 30 мин. Нами получен и охарактеризован новый, уникальный для района хромосомы 8q23-24.1 1 высокополиморфный тетрануклеотидный повтор (СТТТ)п/(ССТТ)п. Повтор может быть использован для анализа сцепления района в семьях, для косвенной пренатальной и пресимптоматической ДНК-диагностики МЭХД, ТРФС-1 и ТРФС-И Выявлены 4 случая вероятных мутаций в 4 семьях с МЭХД и структурная перестройка района в ДМК лимфоцитов и секционного материала экзостоза у больного еще одной семьи с заболеванием. Показана целесообразность использования ДНК-маркера М5 для характеристики состояния локуса D8S67 при МЭХД и в секционном материале экзостозов Дальнейшее изучение района позволит прояснить причину возникновения МЭХД и разработать прямую ДНК-диагностику этой патологии.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на IV Съезде медицинских генетиков России (Москва, 1094), на 11-ом Международном рабочем совещании по картированию хро мосомы 8 (Великобритания, 1994), на 27-ой и 28-ой Европейских ежегодных конференциях по генетике человека (Париж, 1004, Берлин 1995), на научных семинарах Института клинической генетики МГНЦ РАМН в мае 1995 г. и в июне 1996 г., на IV и V Российских конференциях "Геном человека" (Черноголовка 1094, 1008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 25 рисунков. Список литературы включает 105 работ.

Положения, выдвигаемые на защиту.

1. ДНК-маркер из локуса D8S67 содержит по крайней мере один эк-зон гена-кандидата МЭХД(£Х7"1).

2. Выявленный новый повтор (СТТТ)п/(ССТТ)п является высокополиморфным, уникальным по структуре и единственным в локусе D8S67 района хромосомы 8q24.11.

3. Район 4-х случаев вероятных мутаций в семьях с МЭХД, возможно является критическим при возникновении этой патологии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Пациенты поступали из КПО МГНЦ РАМН, Института педиатрии и детской хирургии МЗ МП РФ и ЦИТО им. Приорова МЗ МП РФ. Было обследовано 30 больных МЭХД из 21 семьи. Пациенты имели множественные экзостозы, которые были выявлены с использованием рентгенологических методов. Все больные были обследованы при помощи высокоразрешающих методов хромосомного анализа в лаборатории клинической цитогенетики МГНЦ РАМН. У пациентов хромосомной патологии не выявлено.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и молекулярного веса геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови стандартным методом (Sambrook et at.. 1989).

Рестрикцию ДНК и электрофорез проводили стандартным методом (Sambrook et al., 1989).

Для проведения блот-гибридизации с радиоактивно меченым зондом. ДНК из геля переносили на мембрану HybondN фирмы "Amersham" (Великобритания). Перенос проводили методом вакуумного блоттинга (Sambrook et al., 1989), при помощи прибора "VacuGeneXL" фирмы "Pharmacia" (Швеция). Включение метки в двунитевую плазмидную ДНК проводили методом ник-трансляции используя Nick-translation kit фирмы "Boehringer Mannheim* (Германия) и изотопы dCTP[P") и dATP[P"j, АО ГНЦ РФ ФЭИ (Обнинск), с удельной активностью 3000 Кю/ммоль. Процедуру

гибридизации проводили по протоколам фирмы на приборе "Hybridiser НВ-2" фирмы "Techne" (Великобритания).

Для радиоавтографии использовали рентгеновскую пленку фирмы "Туроп" (Швейцария).

Скрининг кДНК-библиотек проводили гибридизацией исследуемого зонда с фильтрами библиотеки в среде Church. В работе использованы кДНК-библиотеки фетального мозга и дифференцированных тканей (легкое, сердце, печень) человека. кДНК-биб-лиотека фетального мозга человека любезно предоставлена доктором Н.Lehrach, (ICRF, Великобритания). кДНК-библиотеки дифференцированных тканей были любезно предоставлены доктором P.Willems, (Антверпенский Университет, Бельгия).

Дот-гибридизацию проводили для отбора клонов, несущих вставку ДНК.человека с зондом, меченым ник-трансляцией.

Для субклонирования ДНК космидных клонов использовали плазмиды Bluescript sk-, pUC19, Для реакции лигирования использовали ДНК-лигазу Т4 фирмы 'МВГ(Литва).

Трансформацию компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК проводили с применением CaCI2, по методу Sambrook et al.,1989.

Выделение плазмидной ДНК проводили стандартным методом (Маниатис и др., 1984).

Секвенироаание ДНК методом Сенгера. Определение нук-леотидной последовательности фрагментов ДНК больше 500 п.н. проводили способом "step by step" (шаг за шагом) стандартным методом (Sambrook et al.,1989; Tabor et al., 1990) с двух цепей ДНК, на приборе "Macrophor" фирмы Pharmacia (Швеция).

Попимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартной схеме (Saiki, 1989), при помощи программируемого термоциклера МС-2 фирмы "DNA-Teehnology LTD."(Россия), с использованием термофильной ДНК-полимаразы Taq фирмы "МВГ и праймеров, синтезированных на приборе ASM102U фирмы "Биоссет" (Новосибирск).

Для радиоактивной детекции ДНК использовали меченые [Р53] dATP и dCTP, которые вводили в реакционную смесь ПЦР.

Для нерадиоактивной детекции ДНК использовали разработанную нами, модификацию метода AgNOj-окраски ДНК. По сравнению со старой методикой (Lieberman, 1990) она позволяет сократить время анализа до 40 мин. Модификация включает изменение концентрации НСОН в растворе проявителя с 0.1М до 0.5М.

Для Поиска мутаций использовали стандартный метод SSCP (Landegren, 1996) и электрофорез образцов ДНК в полиакрила-мидном геле (ПААГ).

Компьютерный анализ последовательностей ДНК проводили при помощи программ Genbank Pustell, Genepro, Autogene 1.1, ORFJ, Oligo 4.0. и баз данных Blast, Fasta, GDB, TIGR.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Характеристика субклонов ДНК-маркера М5.

Ранее проведенное исследование позволило предположить, что наиболее вероятным местом локализации гена ЕХТ1 является локус D8S67. Из этого локуса нами был получен ДНК-маркер М5. Длина нуклеотидной последовательности маркера составила около 5.5 т.п.н. При гибридизации маркера с ДНК больных из 4 семей с МЭХД, гидролизованной ферментом Taq\, выявлен дополнительный гибридизационный сигнал молекулярной массой около 6.5 т.п.н. Этот сигнал отсутствовал у здоровых индивидов (Немцова, 1994). Было сделано предположение, что маркер М5 является внутригенным или расположенным в непосредственной близости от гена-кандидата ЕХТ 1.

ДНК-маркер М5 гидролизовали ферментом EcoRI и субклони-ровали в плазмидные векторы pUC19 и pBluescript sk-. Получены три плазмидных субклона МЗ, М17, М07. Методом пошагового свк-венирования определили нуклеотидные последовательности субклонов. Длина последовательностей составила 3146, 1733 и 688 п.н. соответственно. При помощи праймеров из соседних субклонов, которые были ориентированы "йаружу" (на рис.1, выделены жирным шрифтом), наши субклоны были ориентированы в последовательность ДНК-маркера М5, протяженностью 5555 п.н.

Анализ последовательности ДНК-маркера М5 при помощи программ Grail, Autogene1.1 и ORFJ с вероятностью около 90%, показал расположение экзонов и последовательность вероятного белкового продукта (Рис.1). Поиск гомологичных пептидов к предсказанному пептидному фрагменту по базам данных выявил несколько подобных (гомология составила около 80%) белков- лизо-сомный гликопротеин а2 (LMP-a2), гликопротеин-3 (G//3), Т-кле-точный антиген CD1. Эти белки являются трансмембранными и образуют внеклеточный метрике мембраны. Гликопротеин-3 кроме указанных свойств имеет сходство с рецепторами стероидных гормонов и различных онкогенов. Известно, что рост МЭ напря-

s

мую зависит от воздействия стероидных гормонов, а изменение структуры рецепторов стероидных гормонов может приводить к заболеванию.

1 8 1 TAAGCTCAAGGACCAAGCTGTGTTGACTTTTAGACAGATTCATTT 226 AACCTTTCTACACCTCGATTTCCCCATTTGTTAGAAAAAATATTG 211 AACATCCAACTTCTGGGAGTTCAAGGAACACTTGGGGATTGGTAA 316 GTGTCAGTGCAGGCACACAGTAGGGGTCAGTAAATCTTAATTCAA

3 61 TCAATTAGGAACACTGTTTTGGGGGCGGGGGGGTAGGCATTGGAG

4 0 6 GCAAAGTTCCAGGGACAAAGGAAGGGAGGTTCAGCTGGCGGGAAA 451 AAAAAGGGAGGGAAAGAGAGAGAGCGAT ААААТТ АС GT Т G TAT GA 196 ОAATGTTGTGGTTGTTTTCATGCCTGTGTCTCTAAGAC

534 AAATCAGCAACATGGAACATTTGCAAAC АС Т TGATCCACACCAAG 1 KSATWNICKHLIHTK ЭКЗОН 1

580 ACGTCTGGAGAAGGCCCCAAGGGAGAGCTGCTCCGTTCTGCCCTC 16 TSGEGPKGELLRSAL 625 CCTTCAGGCCAGCTGGGGGTGCCTCACTTGTTTCCAATCCTAAAT 31 PSGQLGVP. HLFPILN 670 CATTTGTTGTCAAAGAATTCCATGGACAGAAGCAGCGACTGCAGC 46 HLLSKNSMDRSSDCS 715 TCAGCCCTCAAGCAC. 61 S А L К Н

72 9 G TGCACACC ТТСС TGCGTTTCCT TGAGACAACATCACAC Т TCÄGC

774 ACACAGCAGGAGTGCTTTAJ GTATACTTCCCATTTCCCAATATT'i . . .

3554 TATAGGTCACTGTCTGGTTGCAGCCACATÜAGAGCCCTGAGCAAG

66 YRSLSGCSHMRALSK ЭКЗОН 2

3599 ACCATCCAGCTAAGCCCAGTTATCCCTCAGAACCATGAG AG

81 TIQLSPVI PQNHE

3 640 GTAATAACAAAGTGATGATGTTGTTGTAGGCTACTACATTTTTAG

3 68 5 CATGCTCGCTTACAGTCAGAGATCACAGTGCGTATACATGGGTGGG. . .

4 304 CGACATGGATGGAACTGAAGGTCATTAL'CTTAAGGGAAACCACTCA

94 SDMDGTEGHYLKGNHS ЭКЗОН 3 4 350 GACACAGAAGAACAACTACTGCATGTGCTCACTTACAAA 110 DTEEQL.LHVLTYK 4 38 9 TGAGAGCTAAATAATATGTCTACATGGACATAGACTGTGGAATGG 4 4 34 ACAACAGAGATTCAGAAAGGTGAGAGGATGTGAGGGCGATGAATG .. 4 614 GAAAGCCTAGATTTGAACCCACTTATTAGTTGCTTGACTTTGAGA. . .

Рис.1. Расположение вероятных экзонов в последовательности ДНК-маркера М5 и первичная последовательность фрагмента предсказанного пептида Жирным шрифтом выделены ориентированные "наружу" праймеры

Также известно, что при дифференцировке хрящевой ткани происходит изменение структуры гликопротеин-гликозаминоглика-нового матрикса на поверхности клеток. Подобные изменения ло сравнению с нормальным хрящем были показаны в растущем экзостозе (Фещенко, 1986). Следовательно, можно с осторожностью предполагать, что выявленный нами ген-кандидат может участвовать в происхождении заболевания.

При помощи компьютерного анализа программой Autogene 1.1 в последовательности ДНК-маркера М5 выявлено расположение вероятных функциональных элементов (Рис.2).

OctR, NF-АЗ Oct3,4,5

АР2 АР2 Oct3,4,5 CTF AP2

lili Mil

800 1600 2400 3200 4000 4800 5600

) | - вероятный промоторный район ЦЦ - последовательность иТИ

Ц - последовательность тетрануклеотидного повтора ¡Щ - последовательность вероятных экзонов * - сайты фермента рестрикции Тад1 Рис.2. Расположение функциональных элементов в направлении 5-3' в последовательности ДНК-маркера М5. (1) Район БС-обогащения, протяженностью около 200 п.н. начинается в позиции 300-го нуклеотида. (2) Нетранслируемый район (11ТЯ) располагается в позиции 500 нуклеотида. В указанном районе выявлены энхансерные сайты связывания консервативных регуляторов транскрипции: АР2, ^1, СР1, ЫТР1. (3) В позиции 534-728 п.н. располагается 1-й предсказанный экзон. (4) В позиции 920 нуклеотида выявлен необычный по структуре тетра-нуклеотидный повтор (СТТТ)п/ (ССТТ)п, протяженностью 285 п.н. Необычная (несовершенная) структура микросателлита позволяет предположить высокую скорость изменений в данном хромосомном районе, которая возникла вследствие близкого расположения мобильного элемента (ретротранспозона). В результате анализа итого района предположение подтвердилось, были выявлены 2 возможных сайта интеграции ретротранспозона. (5) В позиции 3500 нуклеотида выявлен возможный промоторный район. Высокая вероятность предсказания подтверждается наличием промо-торных сайтов связывания консервативных тканеспецифичных регуляторов транскрипции ЫР-АЗ, СТР1, Ос13, Ос14, Ос15, О^. (в) В позиции 3554-3639 п.н. располагается 2-й предсказанный экзон.

*

+

ю

(7) В позиции 4000 нуклеотида расположен консервативный не-транслируемый район (UTR). При сравнении последовательности района с базами данных выявлена высокая (более 80%) гомология к нескольким хромосомным районам человека'. Xq27.3, 1 1 р 15 5, 22q12, 4р16.3. (8) В позиции 4304-4388 п.н. располагается 3-й предсказанный экзон.

2.Скрининг кДНК библиотек.

Для подтверждения рабочей гипотезы, о том что маркер М5 является внутригенным, проведен скрининг тотальной кДНК-биб-лиотеки фетального мозга человека и кДНК-библиотек легкого, печени, сердца. В качестве гибридизационного ДНК-зонда использовали маркер М5. При скрининге тканеспецифичных кДНК-биб-лиотек кДНК-клонов не выявлено. Это позволило предположить, что фрагмент гена-кандидата из маркера М5 не экспрессируется в дифференцированных тканях и, возможно, его продукт является белком эмбриональных тканей. В результате двукратного скрининга кДНК-библиотеки фетального мозга отобраны 14 кДНК клонов: А0163, I0237, К1169, 02456, М0152, F0642, I05378, J2334, В0430, 010269, D03143. Р11211, Н0794, Р08148.

3. Характеристика отобранных кДНК клоков.

ДНК кДНК-клонов гидролизовали ферментами рестрикции £coRI+ Н/'лсПП и каждый из них использовали в качестве ДНК- зон дов для перекрестной гибридизации. В результате проведенного исследования отобраны 5 кДНК клонов К1169, 02456, М0152, F0642, 010269.

Результат перекрестной гибридизации клонов 02456 и F0642 оказался идентичным. Секвенирование клонов это подтвердило. Последовательность кДНК представлена на рис.3.

При помощи компьютерного анализа последовательности кДНК-клона 02456 выявлены кодирующий район и поли-Т трек длиной 30 п.н. Фрагмент кодирующего района, длиной 90 п.н., найден в районе 3-го предсказанного экзона из ДНК-маркера М5 Поиск лс- базам данных гомологичных генов к последовательности кДНК-клона 02456 выявил несколько подобных (гомология составила более 80%) генов- пизосомный гпикопротеин а2 ILMP-а2), гликопротеин-3 (G//3), Т-клеточный антиген С01.

На следующем этапе было проведено секвенирование 3 других кДНК-клонов и определены их нуклеотидные последоватвль-

ности. При помощи компьютерного анализа последовательностей кДНК-клонов не выявлено явной гомологии с последовательностью исходного маркера М5.

1 соасат<з<зат «заасталаа отсаттатст таасюодаас састсаоаса саоааоаасл

61 АСТАСТССАТ ОТ(ЗСТСАСТТ АСАААССААА ОТвСТОООАТ ТАСАОвСАТО АОСАССОСАС 121 ССаЗССТТаЗ ТТТСАТТТСТ ОСААААССАС АС-ОССАСТСЗС ТОССАСТТОС ТСТОТООАОА

181 ТСТАССТТСА СТАТАСАСТС ТСТСААААТС ССАСТСАССС ТАСТААСТТТ ТССАСЗАТСТС

241 САСАСОССГС АЕТТССАССТ СТСаАШЗТАА САТОАТТТСС СТСССССАТА СТТСССАААС

301 САСТТТТТТТ ТТТТТТТТТТ ТТТТТТТТТТ ТТТСТАСТАС АТАСАССССТ СТАСвОАТСС

361 А(ЗААТСССАА СТТТТАСТТв СТССАТ«^ ТТТССААСАТ СТСГТССААС ААЛСАТСвСТ

421 ТСТСАААСвТ СССТТСТТАА АААТДААААА йСАААААААА ААСТАСАСЯТ ССААСГТТТС

481 ТТТТТААТАД АААТАТТССТ СССАСТТААС ТСТСТССТТТ СТТТТТТС5АС СТАТТТТТСС

541 ТТАААТТТСТ СТСТАСГТТС ССТСТАТСТС ТАТАТТТТТС СТАСТССАСТ АААСААТОСА

601 АТСАААСаАА ТАААААССАС ССГССАСТСТ ТСССССАААС АСТОААСАСС СТСЛААСАСЗА

661 АОАААТСССЛ ОСАСОСЗАААА ТвССССАССТ СТАААТАТАС АААСААСАТТ АААААС Рис. 3. Последовательность кДНК клона 02456, длиной 716 п.н. Жирным шрифтом выделен« кодирующая последовательность, подчеркиванием выделены поли-Т трек и возможны) сайты полиаденилирования.

4.Характеристика новых EST и STS. В рамках стратегии "позиционного клонирования" ключевым моментом является четкая локализация гена заболевания в определенном хромосомном локусе. Дальнейшие исследования направлены на создание физической и генетической карты хромосомного участка. Для этого необходима идентификация STS и EST, которые используют для построения физической карты исследуемого района (Davies et al., 1993). С этой целью для локуса 08S67 из последовательности ДНК-маркера MS были получены 1 экспрессирующийся маркер (EST) и 6 секвенированных маркеров (STS). На рис.4 приводится схема расположения EST и STS на последовательности ДНК-маркера М5. Последовательности прайме-ров, условия ПЦР и длины продуктов амплификации приводится в табл. 1.

Taq\ Taq\ Taql

r4tH>fb" ...........: ......;„■„

—-------—,——...—+---—--——

800 1600 2400 3200 4000 4800 5600 □ - последовательность ДНК-маркера | I - последовательность STS Щ - последовательность EST Рис.4. Расположение шести STS и одного EST в последовательности маркера М5.

Таблица 1. Последовательности праймеров, условия ПЦР и длины продуктов амплификации для новых EST и STS.

Праймеры Условия ПЦР

N п/п Последовательности 5'-3' Продукт п.н. Конц:прай-меров, нМ Условия отжига, °С

EST1A EST1B GCCACTGCTGCCACTTGC GAGATACAGGGAAACTACAG 418 200 58

STS 1А STS 1В GCTCAAGGACCAAGCTGTGTTG TGGAACTTTGCCTCCAATGCC 233 200 58

STS2A STS 2В TGTGGTTGTTTTCATGCCTGTG GCACTCCTGCTGTGTGCTGAAG 287 200 58

STS3A STS3B GACGTGTACTCAGGGCACAGAGC GCAATGGTGGAGCAAAGCAC 479 200 во

STS4A STS4B AGATCCATTGCACACACTCCTC CACCCATGTATACGCACTGTGA 477 200 57

STS5A STS5B GCAAAACTCAGCCTAAGTGCCC CATTCATCGCCCTCACATCCTC 287 200 58

STS6A STS6B GCCTAAGTGCCCATAAATGA GTGGGTTCAAATCTAGGCTTTC 434 200 56

5. Характеристика повтора (СТТЛп/ (ССТТ)п в норме.

Для получения характеристики необычного тетрануклеотид-ного повтора (СТТТ)п/(ССТТ)п были исследованы образцы геномной ДНК 60 здоровых неродственных индивидов. Исследование полиморфизма этого повтора проводили при помощи амплификации повтора (Рис.5) и электрофореза амплифицированного фрагмента в 6% ПААГ (Рис.6).

оас ататАстсла (ЗосАСАалос

АСААТАААСТ ТААГААТТСТ ТАТТАТТТСА ТССАТЛАСАТ ТТАААСАТТА ААССАОАТТС

ТТТТТТСТТТ СТТТТТСТТТ стттстттсх ттстттсттт стттстттст ттстттттст

ттстттсттт стттттсттт стттстттст ттстттстсс ттссттсстт ТСТТТСТТСТ

ттсстттстт тстттстттс тттстттстт тстттстттс тссттссттс СТТТСТТТСТ

ттстттсстт ссттссттсс ТТССТТССТТ ССЛАТССТТС сттссттсст тссттссттт

стттстттст ттстттстст стттстттст тстттстттт TTAAATTGTG AGTATGTGGT

СОТОААСААС АСАССАСААС АССТАСТАСС АТТТСССССС АСТвССТСАА ТТТСТТСААА АСАССАЙТ«: ГГТОСТССАС САТТОС

Рис.5. Последовательность амплифицированного фрагмента Жирным шрифтом выделены праймеры ПЦР, подчеркиванием выделен повтор .

В результате проведенного анализа выявлен высокий уровень полиморфизма исследуемого тетрануклеотидного повтора Нам удалось выявить 17 аллелей повтора, гетерозиготноеть составила 90%. Экстремальные варианты аллелей (самые большие

отклонения длины STR) составляют 230 п.н. и 288 п.н. соответственно. Анализ полиморфизма аллелей несовершенного повтора не выявил доминирующего (мажорного) аллеля, хотя существует несколько аллелей с более высокой частотой встречаемости у нормальных индивидов- А10 (260 п.н.) с частотой встречаемости 12% и А11 (257 п.н.) с частотой встречаемости 15% (табл.2).

Г

г

288Ьр 285Ьр 280Ьр 276Ьр 267Ьр 264Ьр

U*_260bp

257Ьр ™ 254Ьр 247Ьр 236Ьр 232Ьр

Рис.6. Вариабельность тетрануклеотидного повтора у 12 здоровых неродственных индивидов. Радиоактивная детекция.

Таблица 2. Вариабельность длины тетрануклеотидного повтора (СТТТ)п/ (ССТТ)п в 120 хромосомах здоровых неродственных индивидов.

. Длина Число Частота

Аллели аллеля, п.н. хромосом хромосом %

А1 288 4 3.3

А2 286 4 3.3

A3 285 8 6.6

А4 280 9 7.5

AS 276 4 3.3

А6 272 2 1.6

А7 268 2 1.6

А8 265 5 4.2

А9 263 7 6.3

АЮ 260 14 11.7

АН 257 18 15,0

AI? 254 II 8.8

AI3 250 10 8.3

А14 247 4 3.3

AI5 236 6 5,0

А16 232 5 3.8

AI7 230 7 6.3

Однако следует подчеркнуть, что мы можем говорить лишь условно об определенных аллелях, так как последовательность микросателлита состоит из нескольких чередующихся фрагментов (СТТТ)п и (ССТТ)п. Изменения могут затрагивать различные области повтора и одинаковые по длине аллели могут, различаться по нуклеотидному составу, и следовательно, истинное число аллелей может быть значительно большим.

Для характеристики структуры повтора у нормальных индивидов мы выбрали максимальный (А1), минимальный (А17) и промежуточные (А8, All, А13, А14, А15, А16) аллели. Эти аллели были подвергнуты электрофорезу, выделены из геля и клониро-ванны. Затем были определены их нуклеотидные последовательности. Анализ нуклеотидных последовательностей аллелей (табл.3.) позволил сделать ряд интересных наблюдений. Обнаружено, что последовательность микросателлита кроме основных повторяющихся едйниц имеет набор подобных повторяющихся единиц: СТ-СТТ-СТТТ - СТТТТ- СТТТТТ- СТТТТТТ СТ - ССТ - ССТТ - ССТТТ - ССААТ

ТаблицаЗ. Анализ структуры аллелей повтора (СТТТ)п/(ССТТ)п.

Аллели микросателлита

N п/п Длина, п.н. Структура

М5 285 ( Г ГС I I 'll 1 ГС 1 ПС 1 1 1 П(С 1 1 1 )У (Л I 1 1 1 (С Г 17)3 Cl НИ (СТП)Ь СТ ССТТ)2 С(СТТТ)2 СТТСТПГС(СТТТ)9 СТ(ССТТ)2 С(СТТТ)4 (ССТТ)6 ССААТ(ССТТ)5 C(CTTTJ5 (СТ)2 (СТТТ)2 TTCTTTCTI НИ

А1 288 ТТСТТТТТТСТТТСТТТТТ(СТТТ)9 СТТТТ(СТ7Т)Э СТТТТ Г(СТТТ)5 СТ (ССТТ)2 С(СТТТ)2 СТТСТТТС(СТТТ)16 (ССТТ)в (CCAATJ2 (ССТГ)4

AI7 230 С^СПТ)5(СЧ)2 (СП Г)2 СПС! I ICI I I П 1 1 ICI 1 1 1 (CI 1 1)1/Cl (ССТТ)2 С(СТТТ)2 СТТСТТТСТТТТ(СТТТ)12 (ССТТ)7 С(СТТТ)5 (СТ)2 (СТТТ)2 СТТСТТТСГГ1 il 1

А 8 265 ТТСТТТТ(СТТТ)17 СТ(ССТТ)2 С(СТТТ)2 СТТСТТТСТТТТ(СТТТ)17 (ССТТ)5 ССААТССАТ(ССТТ)4 С(СТТТ)5 (СТ)2 (СГГГ)2 ТТСТТТ спич

All 257 1ICICCI 1 И(С( Н)У CI I I I l(CI! !)i Cl (CCI 1)2 СТТСТТТС(СТТТ)1в ССТТ)5 (ССАТ)3 (ССТТ)4 С (СТТТ)5 (СТ)2 С77ТС7ТСТ7ТСТТ

А!3 250 ТТСТТТТ(СТТТ)17 СТ(ССТТ)2 С(СТТТ)2 CUCTTTCTTTT(CTTT)12 (ССТТ)6 ССААТ(ССТТ)5 С(СГТТ)2 СТТС(СТТТ)2 (СТ}2 С ТТСТТТ СМ/ Г/Т

AI4 247 (ТТС)2 ! ГТССТТ(СП 1)8 Cl 1 1 11(СТТГ)5 СТ(ССТТ)2 (СТТТ)2 С TTC ТТТС (СТТТ)4 (СТ)2 (СТТТ)7 (ССТТ)13 С(ССТТ)2 (СТ)2 СТТТСТТС (СТ)2(СТТТ)2 СТТСТТТСТТТТТТ

А15 236 ТТСТТТТ(СТТТ)13 СТ(ССТТ)2 С(СТТТ)2 СТТСТТТСТТТТ(СТТТ)15 (ССТТ)10 CCC7TTJ5 (СТ)2 (ССТТ)2 CTTCTTTCI till 1

AI6 232 ТТСТТТТ(СТТТ)1в СТ(ССТТ)3 СТТТСТТСТТТСТТТТ(СТТТ)11 (ССТТ)Ю С(СТТГ)5 (СТ)2 (СТТТ)2 С7ТСТТТСТТТТГТ

Вариабельность повтора обусловлена изменениями в первых 222 п.н. (3/4 последовательности микросателлитного повтора). Изменения наблюдаются как по количеству (СТТТ)/(ССТТ) так и по составу нуклеотидов. Наиболее показательным является элемент ССААТ(выделен жирным шрифтом). В аллеле длиной 288 п.н. произошло удвоение этого элемента. В 4 аплелях наименьшей длины (246, 236, 232, 230 п.н.) наблюдается потеря этого элемента. В 2 промежуточных аллелях длиной 265 п.н. и 257 п.н. произошло изменение этого элемента. Фрагмент длиной 63 п.н.(выделен курсивом) из последней четверти повтора практически не изменился во всех клонированных аллелях.

Исходя из того, что первая и четвертая части микросателлитного повтора имеют подобную структуру, можно предположить, что происходит неравный обмен этих фрагментов в процессе рекомбинации и возможная причина этого явления- воздействие ретротранспозона Н, сайт которого найден в элементе ССААТ.

6. Анализ вариабельности тетрануклеотидного повтора в лимфоцитах и поврежденных тканях больных с МЭХД.

Для выявления возможной роли повтора в генезе МЭХД был проведен семейный анализ этого повтора. Для исследования были использованы образцы ДНК 26 больных из 16 семей с МЭХД. Также в исследование были включены образцы ДНК из тканей экзостоза, спорадической хондросаркомы и хондросаркомы, возникшей из множественных экзостозов. Исследование полиморфизма этого повтора проводили при помощи амплификации повтора и электрофореза змплифицированного фрагмента в 6% ПААГ (Рис.7).

Анализ аллелей тетрануклеотидного повтора у больных с МЭХД выявил высокую вариабельность длины, которая сопоставима с уровнем вариабельности в норме. Показатель гетерозигот-ности тетрануклеотидного повтора составляет 93% (табл.4). Анализ аллелей микросателлитного повтора в секционном материале экзостоза и хондросаркомы показывает, что повтор не подвергается каким-либо специфическим изменениям при этом заболевании. В то же время, повтор располагается в предполагаемой области гена МЭХД и наследуется согласно законам Менделя. Следовательно данный микросателлит является диагностически ценным маркером при проведении косвенной ДНК-диагностики, как пренатальной так и неонатальной.

ОтШ

( ь

286Ьр 285Ьр

-4-257Ьр ^ -254Ьр <- 250Ьр

^-236Ьр

Рис.7. Анализ наследования аллелей тетрануклеотидного повтора в семье с наследственной формой МЭХД.

Таблица 4. Вариабельность аллелей тетрануклеотидного повтора в 16 семьях с МЭХД.

Длина Число Частота

Аллели аллеля, п.н. хромосом хромосом %

А1 288 0.5 3.1

А2 286 0.5 3.1

АЧ 285 1.0 6.2

А4 280 0.5 3.)

А5 276 1.5 9.4

А6 272 - -

А7 . 268 • — -

А8 265 1.5 9.4

А9 263 - -

А10 260 4.0 25.0

АН 257 1.0 6.2

А12 254 2.5 15.6

А13 250 1.0 6.2

А14 247 1.0 6.2

А15 236 ~ —

А16 232 0.5 3.1

А17 230 ■ 0.5 3.1

7. Анализ последовательностей района 8q24.11 на наличие

мутаций при МЭХД,

Исходя из полученной нами возможной экзон-интронной организации ДНК-маркера М5 из локуса D8S67, мы провели исследование вероятных зкзонов предполагаемого гена на предмет мутаций. Для исследования были использованы образцы ДНК 30 больных из 21 семьи с МЭХД. Продукты ПЦР были исследованы в 9% полиакриламйдном геле, методом SSCP. Анализ последовательностей 1-го и 3-го вероятных экзонов не выявил мутаций у больных с МЭ. Анализ 2-го вероятного экзона и примыкающего района с сайтами фермента рестрикции Taqi выявил 4 случая вероятных мутаций у больных из 4 семей с МЭХД (рис.8). Для этого исследования были использованы праймеры:

Exof2: 5' AGATCCATTGCACACACTCCTC 3' Ехог2: 5' CACCCATGTATACGCACTGTGA 3' После амплификации продукт ПЦР гидролизовали ферментом рестрикции HindII. В результате гидролиза образуются фрагменты длиной 144 и 333 п.н. Изменения последовательности ДНК выявлены во фрагменте длиной 333 п.н., который содержит один сайт фермента рестрикции Taqi, 2-ой предсказанный экзон и сайты связывания консервативных регуляторов транскрипции NF-A3, CTF1, Oct3, Oct4, Oct5, OctR. Мутации в этих сайтах снижают уровень фоновой транскрипции на 60%.

" * Т

12 34 5 6 789Н ННН

Рис 9. Анализ района 2-го предсказанного зкзона на предмет мутаций у больных МЭ. 1-9 -ДНК больных; Н-ДНК здоровых индивидов. | -Обнаруженные случаи вероятных мутаций

Ранее у больных из 4 семей с МЭХД при помощи блот-гибри-дизации ДНК, гидролизованной ферментом Taq\, с маркером М5 были получены дополнительные гибридизационные сигналы размером около 6.5 т.п.н.. Мы продолжили этот анализ с ДНК лимфоцитов больных, секционного материала экзостоза, спорадической хондросаркомы и хондросаркомы развившейся из экзостоза. Были проанализированы 30 больных из 21 семьи. Также были исследованы 12 больных из Бельгии. В одной семье мы получили существенные различия в гибридизационных паттернах по ферменту Seal для экзостоза, по ферменту Taq\, как для лимфоцитов так и для экзостоза (рис.9). Можно предполагать, что появление дополнительных полос связано с перестройками в одной из гомологичных хромосом. Анализ ДНК секционного материала хондросаркомы не выявил каких-либо изменений.

Рис.9. А- Результат блот-гибридизации маркера М5 с ДНК гидролизованной по Seal: 1- зкэоетоз; 2-лимфоциты больного. В- Результат блот-гибридизации маркера М5 с ДНК гидролизованной по 7"a<jl: 1-лимфоциты здорового индивида; 2- экзостоз; 3- лимфоциты больного.

В 1995 году в локусе D8S522 хромосомы 8 был клонирован ген-кандидат ЕХТ1 (Ahn et. al. 1995). Анализ его последовательности показал отсутствие гомологии к известным генам. Предсказанный пептид также не имел гомологии с известными белками, В результате поиска мутаций в гене-кандидате у больных из 23 сомой с МЭХД была выявлена единственная точковая мутация в

двух семьях- делеция 1 нуклеотида. Делеция создает новый сайт для фермента рестрикции MspI. Мутации выявляют рестрикцией продукта ПЦР этим ферментом. Анализ района мутаций у 30 наших больных и у 12 бельгийских больных с МЭХ-Д не выявил изменений. Еще один вариант поиска мутаций заключался в блот- гибридизации полнсразмерной кДНК- последовательности гена-кандидата ЕХТ1 (Ahn et al., 1995) с геномной ДНК, гидролизованной ферментом Taq1 у 30 наших больных с МЭХД. Изменений гибридизацион-ного рисунка, по сравнению с контрольными образцами, не выявлено. Учитывая, что явных изменений в этой последовательности не выявлено, можно усомнится в причастности клонированного гена-кандидата к заболеванию. Следовательно, вопрос о возможной роли клонированного гена-кандидата ЕХТ 1 и его мутаций в генезе МЭХД остается открытым.

В результате проделанной работы была охарактеризована последовательность в локусе D8S67 из района хромосомы 8q24.11, которая является предполагаемым местом локализации гена МЭ(£ХТ1)(рис. 10). Клонирована и определена нуклеотидная последовательность ДНК-маркера М5, космидных субклонов и кДНК клонов. В общей сложности секвенировано более 9500 п.н. Результат компьютерного анализа последовательности ДНК-маркера М5 позволяет с осторожностью предположить, что нами клонированы 3 экзона гена-кандидата, гомологичного белкам клеточной поверхности. Это обнадеживает еще и потому, что ранее было показано нарушение структуры белков матрикса в экзостозах по сравнению с нормальной хрящевой тканью. Нами проведен скрининг кДНК-библиотеки (ICRF) фетального мозга человека и кДНК- библиотек легкого, печени, сердца. Выявлен один кДНК-клон 02456, фрагмент которого гомологичен 3 предсказанному экзону. Выявлен уникальный высокополиморфный тетрануклео-тидный повтор, который является единственным для исследуемого района и может использоваться как для генетического картирования так и для косвенной ДНК-диагностики. Поиск мутаций в предсказанных экзонах позволил выявить наличие 4 случаев возможных мутаций у больных с МЭ. Кроме того обнаружены изменения гибридизационного рисунка в ДНК лимфоцитов и экзостоза еще у одного больного с МЭХД.

Проделанная работа позволила решить поставленные задачи, однако возникли новые вопросы- клонирование полноразмерного гена-кандидата ЕХТ 1 и характеристика мутаций при МЭХД.

ЯТКДНК ЯП-Р/ хромосом- расстояние Лелепии космкцные полученные

- маркеры Я ГЯ ный локус м.п.н. СЛГ ТРФС-1 МЭХД клоны субклоны

V/ 1.2

1. I 1.47

1(Ю8Я27

(СА>1

6 аллелей

Шпа III Мзр I

сеп п!я85

тки к

г)8я49

148

вас I

Ш5592 ГМ.ЧЗ.<2 ШВЮОЧ М5 (Г'П'ШК'СГПп 08867

17аллелей МвШАЦ

1.24

3.4

(СА)п 5 аллелей

С3601

40кЬ

(49С2 /40кЬ

С166Р9 40кЬ

с25В8 40кЬ

с6505 40кЬ

c8IF.ll 40кЬ

250 кЬ

С16505 40кЬ

С9008 40кЬ

М07

МЗ

М1.7

1ехип1

I БТЯ

IехопЗ

Рис.10. Физическая карта района 8ц23-24.11 (25 м.п.н.) и двлеции при СЛГ.

ТРФС-1, МЭХД.

выводы

1. В локусе Р8567 определена последовательность ДНК-маркера М5 протяженностью 5555 п.н. В ее составе выявлены 3 вероятных экэона и уникальный тетрануклеотидный повтор (СТТТ)п/(ССТТ)п, протяженностью 285 п.н. Фрагмент предсказанного пептида показал гомологию с белками экстрацеллю-лярного матрикса.

2. В результате скрининга кДНК-библиотеки фетального мозга и кДНК-библиотек легкого, сердца, печени человека с использованием ДНК-маркера М5 выявлены 14 кДНК-клонов. Секвени-рованы последовательности 6 кДНК-клонов протяженностью более 4000 п.н. Установлено, что один кДНК-клон 02456 гомологичен маркеру М5 и соответствует третьему предсказанному экзону.

3. Охарактеризованы 6 новых ЭТБ и один БЭТ в локусе 08867, которые могут быть использованы в исследованиях для физического картирования.

4. В результате анализа повтора (СТТТ)п/ (ССТТ)п в 120 хромосомах здоровых неродственных индивидов и в 16 хромосомах больных МЭХД выявлен высокий уровень его полиморфизма -17 аллелей и гетерозиготность 90%. Существенных различий вариабельности повтора в норме и при патологии не выявлено. Вероятной причиной, высокой вариабельности микросателлита является симметричная структура и близкое расположение сайта транспозона 11. Показана ценность микросателлита для косвенной ДНК-диагностики.

5. Разработана модификация метода окрашивания ДНК с использованием АдМОз, которая позволила сократить время детекции с 2 часов до 30 мин.

6. В результате исследования возможных районов расположения мутаций при МЭХД в семьях, в секционном материале экзостоза и хондросаркомы изменения выявлены в 5 случаях. Четыре случая вероятных мутаций выявлены во втором эк-зоне предсказанного нами гена-кандидата МЭХД(ЕХ7"1). Еще в одном случае выявлено структурное изменение этих районов как в ДНК, ток и в секционном материале экзостоза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Яценко А.Н., Кулешов Н.П. "Молекулярно-биологическая диагностика микрсструктурной хромосомной патологии и характеристика "критических" хромосомных районов при синдромах Лгнгера-Гидиона и Прадера-Вилли." Тезисы докладов 4-ой конференции "Геном человека". Черноголовка. 1994. с 34-35.

2. Немцова М.В.. Яценко А.Н., Кулешов Н.П. Залетаев Д.В. "Цитогенетическая и молекулярная диагностика синдрома Лангера-Гидиона и множественной экэостозной хондродисплазии." Сборник научных трудов МОНИКИ "Молекулярная диагностика наследственных болезней и медико-генетическое консультирование". М.1995 (в печати).

3. Nemtsova М., Yatsenko A., Kuleshov N., Novikov P.V., Meerson Е.М., Zaletayev D.V. "Deletion length and SRO detection on patients with LGS and TRPS-I." Abstracts of the 27th Annual European Meeting for Human Genetics. 1994. Paris, p 342.

4. Zaletayev D.V., Nemtsova M.V., Yatsenko A.N , Kuleshov N P. "Attempts to hereditary multiple exostoses gene fine mapping." Abstracts of the 27th Annual Europian Meeting for Human Genetics 1994 Paris, p 468 .

5. Залетаев Д.В., Немцова M B., Яценко А Н. Кулешов Н.П. "Подходы к картированию множественной экзостоэной хондродисплазии в районе хромосомы 8q24.1." Тезисы докладов IV съезда медицинских генетиков. Москва. 1994, с. 22.

6. Немцова М.В., Яцбнко А.Н., Залетаев Д.В. Кулешов Н.П. "Делеционное картирование области хромосомы 8q24.1, повреждаемой при синдромах Лангера-Гидиона и трихо-рино-фаланговом I типа." Тезисы докладов IV съезда медицинских генетиков. Москва 1994, с 43-44.

7. Nemtsova M.V., Yatsenko A.N., Kuleshov N.P., Zaletayev D.V. "Is the 5' of the hereditary multiple exostoses gene-candidate localized at D8S67 locus?" Abstracts of the 27th Annual Meeting of the European Society of the Human Genetics, Berlin, 1995, p.242.

8. Zaletayev D.V., Nemtsova M.V., Yatsenko A.N., Kuleshov N.P. "New STSs and ESTs from the Langer-Giedion chromosome region." Abstracts of the 27th Annual Meeting of the European Society of the Human Genetics, Berlin, 1995, p.245..

9. Nemtsova M.V., Yatsenko A.N., Kuleshov N.P., Zaletayev D.V. "Molecular genetics investigation of the Langer-Giedion chromosome region 8q24.1 on LGS, TRPS-I and EXT patients." Abstracts of the 2nd International Workshop on Human Chromosome 8 Mapping. Cytogenet. Cell Genet. 1995, v.68, p. 158.

10. Яценко A.H., Немцова M.B., Кулешов Н.П., Чеснокова Г.Г., Хаспеков Г.Л., Залетаев Д.В. "Картирование гена-кандидата множественной экэостозной хондродисплаэии (ЕХТ 1) в участке хромосомы 8q24.1*. Тезисы докладов 5-ой конференции "Геном человека". Черноголовка. 1996 с. 88-89.

11. Немцова М.В., Яценко А.Н., Кулешов Н.П., Новиков П.В.. Ме-ерсон Е.М., Залетаев Д.В. "Делеционное картирование участка хромосомы 8q24.1." Тезисы докладов 5-ой конференции 'Геном че-

г

ловека". Черноголовка. 1996 с. 87-88.

12. Немцова М.В., Яценко А.Н., Кулешов Н.П., Залетаев Д.В. "Молекулярно-генетическая характеристика области делеций хромосомы 8q24.1 при синдромах Лангера-Гидиома и трихо-рино-фа-лангового I типа." Генетика, 1996, Т. 32, с.1-7.