Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая характеристика наследственного гемохроматоза у российских больных

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика наследственного гемохроматоза у российских больных"

На правах рукописи

Лавров Александр Вячеславович

Молекулярно-генетическая характеристика наследственного гемохроматоза у российских больных

УДК 616-056.7:616-003.829.1

03.00.15 - «Генетика»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 2004

Работа выполнена в ГУ Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова

Научный руководитель: академик РАМН, проф., д.м.н. Н.П. Бочков

Официальные оппоненты: проф., д.м.н. А.Н. Петрин

проф., д.б.н. Н.К. Янковский

Ведущее учреждение: ГУ Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.

Защита состоится «__»_2004 г. в «_» часов на

заседании диссертационного совета Д 001.016.01 в ГУ Медико-генетический научный центр РАМН по адресу: 115478, Москва, Москворечье, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ Медико-генетический научный центр РАМН по адресу: 115478, Москва, Москворечье, 1.

Автореферат разослан «__»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Доктор биологических наук, профессор Л.Ф. Курило

Введение

Актуальность проблемы

Наследственный гемохроматоз (НГХ) - наследственное системное заболевание, связанное с избыточным поглощением железа из пищи, и характеризующееся поражением различных органов накапливающимся в них железом.

По данным зарубежной литературы НГХ является самым распространенным наследственным заболеванием среди лиц европеоидного происхождения. Его частота по данным различных авторов колеблется от 3 до 8 на 1000 населения [Andrews N.C., 2000; Camaschella С, 1997]. Оцениваемая частота гетерозигот достигает 10%. Меньшие частоты приводятся для некоторых обследованных популяций Сибири: русские - 3,5%, алтайцы, нивхи, тувинцы, чукци, финно-угры - менее 1% для аллеля C282Y [Михайлова СВ., 2001].

В отечественной литературе имеются работы, посвященные молеку-лярно-генетической диагностике НГХ [Зборовский С.С., 2001, Лавров А.В., 2002, Михайлова СВ., 2001] и описанию популяционных частот в малочисленных этнических группах Восточной и Западной Сибири [Михайлова СВ., 2001; Хусаинова Р.И.,2003]. Кроме того, есть работы посвященные проблемам клинической диагностики [Павлов Ч.С, 2001; Сухарева Г.В., 2002] и лечения НГХ [Щербинина СП., 2002]. Однако до сих пор не было выполнено работ, определяющих этиологическую значимость известных мутаций в развитии НГХ в России. Не были разработаны рекомендации по применению новых возможностей молекулярной диагностики заболевания. Популяцион-ные частоты были оценены на небольших выборках, при этом не были достаточно освещены вопросы соответствия клинически регистрируемого НГХ определяемым мутациям.

Цель исследования

Целью данного исследования является молекулярно-генетическая характеристика наследственного гемохроматоза и оценка важности определения мутаций при диагностике наследственного гемохроматоза.

Задачи исследования

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. сформировать выборку больных наследственным гемохроматозом;

2. провести молекулярно-генетическую диагностику и определить частоту мутаций в генах ИГЕ и в группе больных НГХ;

3. сформировать выборку больных с высоким риском наследственного гемохроматоза;

4. провести молекулярно-генетическую диагностику и оценить частоту мутаций в гене ИГЕ в сформированной выборке;

5. сравнить частоты мутаций в группе больных НГХ и в группе с высоким риском НГХ;

6. разработать рекомендации по применению молекулярно-генетической диагностики наследственного гемохроматоза.

Научная новизна

Впервые проведено генотипирование по мутациям C282Y и H63D в гене ИГЕ выявленных больных с признаками НГХ в России и продемонстрирована низкая частота мутаций, считающихся наиболее важными для развития НГХ.

Впервые проведено генотипирование по мутации Y250X в гене Т/Я2 обследованных и генотипированных по мутациям в гене ИГЕ больных НГХ.

Впервые проведено генотипирование по мутациям C282Y и H63D в гене ИГЕ больных из групп риска по развитию НГХ и проведено сравнение полученных частот генотипов с популяционными частотами.

Практическая значимость

Полученные результаты показали, что просеивающее обследование на наличие мутаций в гене ИГЕ, в силу низкой пенентрантности генотипа, не

целесообразно. Низкая частота мутантного генотипа среди лиц с признаками НГХ предполагает большее значение клинических данных и результатов биохимических анализов, чем результатов генотипирования, для установления диагноза «НГХ» в ходе дифференциально-диагностического поиска.

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ. Из них - 2 статьи и 7 тезисов. Материалы диссертации доложены на XXX сессии Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии и Пленуме правления Научного Общества гастроэнтерологов России (Москва, 2003), конференции «Информационные технологии в биологии и медицине» (Ялта, 2003), IV Съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2004), научных конференциях кафедры медицинской генетики ММА им. И.М.Сеченова.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Текст изложен на 81 стр. машинописного текста, иллюстрирован 14 таблицами и 7 рисунками. Библиографический указатель включает 96 источников, из них 13 отечественных.

Положения, выносимые на защиту

1. Мутации C282Y и H63D гена ИГЕ относительно редко (9% и 26,6% для соответствующих аллелей) встречаются среди больных с признаками НГХ, а самих больных, выявляемых по клиническим и биохимическим критериям в практике врача, встречается мало.

2. Среди больных терапевтического профиля мутации C282Y и H63D гена ИГЕ встречаются с частотой (2,9% и 15,8%), сопоставимой с популяционными частотами европейских популяций, а также некоторых популяций Урала и Сибири.

3. Частота клинически выраженного НГХ в несколько раз ниже частоты мутантных генотипов. Это позволяет говорить о неопределяющем влия-

нни мутаций гена ИГЕ на развитие НГХ. Применение широкого скрининга на указанные мутации с целью ранней диагностики болезни не оправдано.

4. Генетическое тестирование целесообразно только с целью подтверждения диагноза, а также у родственников больных для оценки риска.

Материалы и методы

Характеристика материала

Для исследования было отобрано 54 больных (группа «НГХ»). Критерием для отбора больных являлись: установленный ранее диагноз «наследственный гемохроматоз»; совокупность клинических признаков и изменений лабораторных показателей, характерных для наследственного гемохроматоза, а именно: бронзовая окраска кожи, гиперпигментация кожи в типичных местах (пах, подмышечная область, наружные половые органы, открытые поверхности, старые рубцы); гепатит или цирроз печени неизвестной этиологии; сахарный диабет в сочетании с гепатитом или циррозом установленной этиологии; артропатии неустановленного генеза; нарушение половой функции наряду с вялостью, апатией, поражением печени и/или поджелудочной железы; насыщение трансферрина железом более 45%; уровень ферритина сыворотки выше 200 мкг/л. Отбор больных проходил в двух отделениях Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии (зав. консультативно-диагностическое Сухарева Г.В., директор проф. Лазебник Л.Б.), в отделении гепатологии (врач Павлов Ч.С., зав. Маевская М.В.) клиники пропедевтики внутренних болезней им. В.Х. Василенко ММА им. И.М. Сеченова (зав. клиникой проф. Ивашкин В.Т.), в отделении гепатологии (врач Одинцов А.В.) клиники нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний им. Е.М. Тареева ММА им. И.М. Сеченова (директор проф. Мухин Н.А.), в отделении диагностики и лечения гемохроматозов (зав. Щербинина СП.) Гематологического научного центра РАМН. Средний возраст больных составил 44,3 года, а стандартное отклонение - 13,3. Соотношение мужчины/женщины составило 3,5:1.

Все больные прошли клиническое обследование, результаты которого были занесены в разработанную формализованную карту учета признаков. В эту же карту занесены данные лабораторных анализов.

Вторая группа («ТП») была сформирована из больных терапевтического профиля. Из отделений гастроэнтерологии Центрального научно-

исследовательского института гастроэнтерологии получено 253 образца крови. Из отделения гепатологии клиники пропедевтики внутренних болезней им. В.Х. Василенко ММА им. И.М. Сеченова - 39 образцов. Из отделения гепатологии и при амбулаторном приеме гепатолога клиники нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний им. Е.М. Тареева ММА им. И.М. Сеченова- ПО образцов. Из отделения кардиологии клиники неотложной и профилактической кардиологии ФППО ММА им. И.М. Сеченова (зав. клиникой проф. Сыркин А.Л.) - 74 образца. Из отделения клиники эндокринологии ММА им. И.М. Сеченова (зав. клиникой проф. Дедов И.И.) - 91 образца. У всех больных забирали кровь для рутинного биохимического анализа крови, аликвота которой использовалась для анализа генотипа. Всего было собрано 567 образцов крови. Средний возраст составил 50,1 года, а стандартное отклонение - 26,8. Соотношение мужчин к женщинам составило 1:1,16.

Регистрацию, осмотр больных и оформление документов проводил аспирант МПЩ РАМН Баев А.А.

Методы исследования

ДНК выделяли из лейкоцитов венозной крови с использованием коммерческого набора ДНК-Экспресс («Литех»). Предварительно кровь инкубировали 20 минут при комнатной температуре в дистиллированной воде, центрифугировали при 4000 g, осадок ещё дважды ресуспендировали в дистиллированной воде и центрифугировали при 4000 g. Дальнейшая обработка происходила в соответствие с рекомендацией производителя набора.

Для генотипирования мутаций в гене ИГЕ за основу была использована методика, описанная в патенте РФ на изобретение № 2144566, с любезного разрешения авторов.

Для выявления мутации C282Y гена ИГЕ проводилась ПЦР с прайме-

рами:

5*-СТАСС-СССАО-ААСАТ-САССА -3' 5'-СТССА-АТСАС-ТАСОа-ТСССА-3'

ПЦР проводили на амплификаторе Терцик-2 («ДНК-Технология») по модифицированной нами схеме: 95°С - 5 мин, 30 циклов (94°С - 40 сек, 59°С - 40 сек, 72°С - 40 сек), 72°С - 5 мин, 10°С - хранение. Состав реакционной смеси на основе набора Амплисенс-200 («Хеликон») объемом 15 мкл: 1,5 мМ М^С1; 0,2 мМ каждого дНТФ; 0,6 мкМ каждого праймера; 0,04 ЕД/мкл Тад-полимеразы и 0,04-0,08 мкг ДНК.

Успешность проведения ПЦР проверяли нанесением 5 мкл полученного амплификата на агарозный гель (1,8%) с этидия бромидом (0,5 мкг/мл) и электрофорезом в течение 10-15 минут. Фрагмент ДНК визуализировали в проходящем УФ свете.

Далее амплификат длиной 394 п.о. в объеме 5 мкл подвергали обработке рестриктазой &8а1 («СибЭнзим») (0,3 ЕД/мкл) в течение 12-20 часов при 37°С в соответствие с рекомендацией производителя. В амплифицированном фрагменте находится, как минимум, один сайт рестрикции для Яза1 (вТ|ЛС), служащий для внутреннего контроля эффективности работы фермента. Мутация С282У приводит к образованию второго сайта рестрикции. Рестрикт в объеме 10 мкл наносили для электрофореза на 1,8% агарозный гель с этидия бромидом в концентрации 0,5 мкг/мл. После электрофореза (40 мин, 10-15 В/см) в проходящем УФ выявляли полосы, соответствующие длине фрагментов: 126 п.о. и 268 п.о. у гомозигот дикого типа (СС), 126 п.о. и 239 п.о. (фрагмент 29 п.о. не учитывался) - у гомозигот мутантного типа (УУ); 126 п.о., 239 п.о., 268 п.о. (фрагмент 29 п.о. не учитывался) - у гетерозигот (СУ). Для выявления мутации И63Б гена ИГЕ проводили ПЦР с праймерами: 5' -ЛЛОСТ-ТТООО-СТЛСО-ТООЛТ-ОЛТСЛ-в- 3' 5' -СССТС-ТССЛС-ЛТЛСС-СТТвС-Тв- 3'

ПЦР проводили на амплификаторе Терцик-2 («ДНК-Технология») по схеме: 95°С - 5 мин, 30 циклов (94°С - 40 сек, 65°С - 40 сек, 72°С - 40 сек), 72°С - 5 мин, 10°С - хранение. Состав реакционной смеси на основе набора Амплисенс-200 («Хеликон») объемом 15 мкл: 2,5 мМ М^С1; 0,2 мМ каждого

дНТФ; 0,6 мкМ каждого праймера; 0,04 ЕД/мкл Taq-полимеразы и 0,04-0,08 мкгДНК.

Успешность проведения ПЦР проверяли нанесением 5 мкл полученного амплификата на агарозный гель (1,8%) с этидием бромида (0,5 мкг/мл) и электрофорезом в течение 10-15 минут. Фрагмент ДНК визуализировали в проходящем УФ свете.

Полученный амплификат длиной 212 п.о. в объеме 5 мкл подвергали обработке рестриктазой Ksp22I («СибЭнзим») (0,3 ЕД/мкл) в течение 12-20 часов при 37°С в соответствие с рекомендацией производителя. В амплифи-цированном фрагменте находится, как минимум, один сайт рестрикции для К$р221 (Т|ОАТСА), служащий для внутреннего контроля эффективности работы фермента. Мутация H63D приводит к исчезновению второго сайта рестрикции, присутствующего у дикого типа. Рестрикт в объеме 10 мкл наносили для электрофореза на 1,8% агарозный гель с этидия бромидом в концентрации 0,5 мкг/мл. После электрофореза (40 мин, 10-15 В/см) выявляли полосы, соответствующие длине фрагментов: 171 п.о. и 21 п.о. вместе с 20 п.о. у гомозигот дикого типа (НН), 192 п.о. и 20 п.о. - у гомозигот мутантно-го типа (DD); 171 п.о., 192 и.о., и 21 п.о. вместе с 20 и.о.-у гетерозигот (HD).

Огромную помощь в генотипировании оказала ординатор кафедры медицинской генетики ММА им. И.М. Сеченова Суркова И.К.

Для выявления мутации У250Х гена Т/Я2 проводили ПЦР с праймера-

ми:

5' -С<ХС0-СТСС0-0<ЗССС-ТСАСС- 3' 5' -ССТСА-АССАТ-ТСТСА-СТСОС- 3'

ПЦР проводили на амплификаторе Терцик-2 («ДНК-Технология») по схеме: 95°С - 5 мин, 32 цикла (94°С - 30 сек, 56°С - 45 сек, 72°С - 45 сек), 72°С - 5 мин, 10°С - хранение. Состав реакционной смеси на основе набора Амплисенс-200 («Хеликон») объемом 25 мкл: 2,0 мМ М^С1; 0,2 мМ каждого дНТФ; 0,4 мкМ каждого праймера; 0,04 ЕД/мкл Taq-полимеразы и 0,04-0,08 мкг ДНК.

Успешность проведения ПЦР проверяли нанесением 5 мкл полученного амплификата на агарозный гель (1,8%) с этидием бромида (2,5мкл/50мл) и электрофорезом в течение 10-15 минут. Фрагмент ДНК визуализировали в проходящем УФ свете.

Полученный амплификат длиной 450 п.о. в объеме 5 мкл подвергали обработке рестриктазой FspBI («Fermentas») (0,3 ЕД/мкл) в течение 12-20 часов при 37°С в соответствие с рекомендацией производителя. В амплифици-рованном фрагменте находится, как минимум, один сайт рестрикции для FspBI (C|TAG), служащий для внутреннего контроля эффективности работы фермента. Мутация Y250X приводит к образованию второго сайта рестрикции. Рестрикт в объеме 10 мкл наносили для электрофореза на 1,8% агарозный гель с этидия бромидом в концентрации 0,5 мкг/мл. После электрофореза (40 мин, 10-15 В/см) выявляли полосы, соответствующие длине фрагментов: 169 п.о. и 281 п.о. у гомозигот дикого типа (YY), 169 п.о., 104 п.о. и 177 п.о. - у гомозигот мутантного типа (YX); 281 п.о., 169 п.о., 177 п.о. и с 104 п.о. - у гетерозигот (XX).

Генотипирование по мутации Y250X осуществила студентка ФПНПК ММА им. И.М. Сеченова Литвинова М.М.

Статистическую обработку проводили с использованием программы Excel Microsoft Office ("Microsoft").

При анализе предполагаемых различий между выборками «НГХ» и «ТП» исходили из нуль-гипотезы об отсутствии различий, которую проверяли с помощью расчета критерия X2 и его сравнения с табличными данными. При расчете критерия X2 применяли поправку Йейтса, так как значения в ячейках таблицы были менее 5, а применение точного критерия Фишера (даже одностороннего варианта) было затруднено в связи с высокими значениями в некоторых ячейках таблицы (см. таблицы).

Уровень значимости р<0,05 был принят достаточным для признания различий достоверными.

Результаты

Результаты обследования больных НГХ

На первом этапе работы выявляли лиц с НГХ. При этом для отбора использовали как катамнестические данные и ранее установленный диагноз «наследственный гемохроматоз», так и данные, получаемые в ходе текущих обследований. Учитывали как клинические признаки, характерные для НГХ, так и отклонения лабораторных показателей. Работа проводилась в крупных клиниках нескольких институтов и были проведены беседы с врачами городской поликлиники № 170 для выявления наблюдавшихся у них больных НГХ и для повышения их внимания в отношении больных с характерными для НГХ признаками. Тем не менее, за два с половиной года самой активной работы выявлено и обследовано только 54 человека, соответствующих нашим критериям отбора. Сопоставление медианы по возрасту (44 года) и 16-ого и 84-ого процентилей (28,5 и 56 лет) со средним возрастом выборки (44,3 года) и стандартным отклонением (13,3 года) возраста больных показало, что распределение близко к нормальному. Поэтому допустимо описывать выборку с помощью средних. Соотношение мужчин к женщинам составило 3,5:1. Для генотипирования были доступны образцы крови 39 больных.

Результаты генотипирования выявленных больных по мутации C282Y в гене ИГЕ представлены в табл. 1.

Таблица 1. Частоты генотипов по мутации C282Y среди больных с признаками НГХ

Генотип Кол-во Частота (%)

СС 34 87,2

СУ 3 7,7

УУ 2 5,1

Всего 39 100

Как видно из табл. 1, больше всего в группе больных НГХ выявлено нормальных гомозигот, тогда как мутантных гомозигот, ответственных за

развитие НГХ выявлено всего лишь пяти процентов; немногим больше (7,7%) обнаружено гетерозигот.

Результаты генотипирования выявленных больных по мутации H63D в гене ШЕ представлены в табл. 2.

Таблица 2. Частоты генотипов по мутации H63D среди больных с признаками НГХ

Генотип Кол-во Частота (%)

НН 20 51,3

HD 1S 46,1

DD 1 2,6

Всего 39 100

Как видно из табл. 2 половина обследованных - нормальные гомозиготы, следом по частоте с небольшим отставанием идут гетерозиготы, а му-тантные гомозиготы составляют всего 1/39 числа больных.

При этом было обнаружено 2 компаундных гетерозиготы C282Y/H63D (5,1%).

На основе определенных генотипов рассчитаны частоты аллелей, приведенные в табл. 3 для аллелей C/Y и H/D.

Таблица 3. Частоты аллелей С и Y среди больных с признаками НГХ

Аллель Кол-во Частота (%)

С 71 91,0

Y 7 9,0

Всего 78 100

Н 58 74,4

D 20 25,6

Всего 78 100

Как видно из табл. 3, частота аллеля Y не достигает и 10%, в то время как частота аллеля D в два с половиной раза выше.

Результаты обследования больных ТП с повышенным риском НГХ на наличие мутаций Ш3Р и C282Y в гене ИГЕ

На втором этапе было получено 567 образцов крови от больных отделений терапевтического профиля. У этих больных, как предполагалось, может быть повышена частота НГХ. Основываясь на этой единой гипотезе, все группы больных из разных отделений были объединены в одну группу.

Результаты генотипирования объединенной группы больных по мутации C282Y в гене ИГЕ представлены в табл. 4.

Таблица 4. Частоты генотипов по мутации C282Y среди больных терапевтического профиля

Генотип Частота (%) Кол-во

СС 94,53 536

СУ 5,12 29

УУ 0,35 2

Всего 100 567

Как видно из табл. 4 в подавляющем большинстве случаев были выявлены нормальные гомозиготы, что подтверждают следующие данные: чаще всего встречались нормальные гомозиготы СС; незначительный процент составляют гетерозиготы. На 567 человек обследованных выявлено всего 2 му-тантных гомозиготы.

Результаты генотипирования объединенной группы больных по мутации H63D в гене ИГЕ представлены в табл. 5.

Таблица 5. Частоты генотипов по мутации H63D среди больных терапевтического профиля

Генотип Частота (%) Кол-во

Всего

100

567

Как видно из табл. 5 больше всего обнаружено нормальных гомозигот НН; на втором месте по частоте находятся гетерозиготы; однако мутантные гомозиготы DD встречаются в сравнительно большом количестве (2,5%), если сопоставлять частоту с частотой гомозигот по мутации C282Y (0,35%).

В группе больных терапевтического профиля выявлено 2 (0,35%) ком-паундных гетерозиготы (C282Y/H63D).

На основе определенных генотипов рассчитаны частоты аллелей C/Y и H/D, приведенные в табл. 6.

Таблица 6. Частоты аллелей Си Y среди больных терапевтического профиля

Аллель Частота (%) Кол-во

С 97,1 1101

Y 2,9 33

Всего 100 1134

Н 84,2 955

D 15,8 179

Всего 100 1134

Как видно из табл. 6, частота аллеля Y не достигает и 3% в то время как частота аллеля D в пять раз выше.

Результаты обследования больных НГХ на наличие мутации Y250X в гене ТШ.2

На третьем этапе было проведено генотипирование вышеописанных выявленных больных НГХ на наличие мутации Y250X в гене ^2. Ни у одного больного мутации обнаружено не было.

Обсуждение

Исследования мутаций гена БЕЕ ведутся с момента его открытия в 1996 году. Отмечены значительные различия, как в популяционных частотах мутаций, так и в корреляциях генотипа с фенотипом при обследовании разных групп больных и здоровых в разных странах (табл. 7).

Таблица 7. Частоты генотипов и аллелей C282Y и H63D гена БЕЕ среди здоровых лиц или пациентов профилактических центров по данным различных авторов

Страна Число обследо- Частота генотипов и аллелей, %

ванных YY CY DD HD Y D

Дания [Steffensen R, 1998] 200 6,8 12,8

Англия [Chambers V, 2003] 0,3 10,4 21,7

[Jackson НА, 2001] 8,23 15,3

Шотландия [Campbell S, 2003] 1009 0,9 17,7 2,1 25,5

Франция [Deugnier Y, 2002] 9396 0,6

Германия [Raddatz D, 2003] 500 0,0 0,6 4,6 10,8

Италия [Pietrapertosa А, 2003] 0,51,5 12,614,0

Греция [Menyweather-Clarke 392 1,3 13,5

AT, 1997]

США [Beutler £] 41038 0,4

[Bradley LA, 1998] 6,17,5 13,615,8

Индия [Tbakur V, 2004] 249+134 0,0

Тунис [Zorai A, 2003] 97 0,5 17,5

Россия [Михайлова C.B., 2003], 590 3,7- 8-27

[Хусаинова Р.И., 2003] 6,1

Собственные данные 567 0,35 5,12 2,5 26,6 2,9 15,8

В нашей работе исследована частота различных мутаций среди больных НГХ. С самого начала наша группа столкнулась с трудностью набора

клинического материала. Больных выявляли, как с помощью анализа историй болезни, так и в контакте с лечащими врачами, ориентируя их внимание на пациентов с определенным сочетанием признаков. Несмотря на то, что работа проводилась в нескольких крупных клиниках и НИИ, где работают высококвалифицированные врачи, выявление больных было затруднено.

За время исследования удалось выявить всего 54 человека, соответствующих нашим требованиям, что, исходя из приблизительно 6-7 млн. людей в возрасте от 20 до 65 лет в Москве, соответствует примерной частоте заболевания 1:100000. Аналогичные результаты были получены в ходе гораздо более обширного и репрезентативного исследования, проведенного в Дании с использованием анализа клинических данных за 37 лет - частота клинически выявляемого НГХ составила 0,58:100000 - 1,4:100000 за разные периоды времени [Milman N., 2001].

При генотипировании выявленных больных оказалось, что среди них практически нет мутантных гомозигот. Так, частота наиболее частого и важного генотипа, как принято считать, в патогенезе заболевания — гомозиготы по мутации C282Y- составила лишь 5,1%, что совершенно расходится с данными, полученными для большинства европейских популяций, особенно, стран северо-запада Европы, где, например, в Дании частота гомозигот C282Y среди больных НГХ составила 94,8% [Milman N., 2003] или в Швеции - 92% [Cardoso E.M., 1998].

Частота гомозиготы по мутации H63D составила 2,6% и было обнаружено 5,1% компаундных гетерозигот C282Y/H63D.

Такая низкая частота данных мутаций среди больных НГХ выявлена впервые. Даже в странах, отличающихся более низкой частотой мутаций по сравнению, например, с Данией, гомозиготность по мутации C282Y встречается не менее, чем у 50% больных (Табл. 8).

Таблица 8. Частоты генотипов C282Y и H63D гена HFE среди больных НГХ по данным различных авторов

Страна

Число обследо- Частота генотипов, %

ванных YY CY DD HD

Дания [Milman N, 2003] 58 94,8

Швеция [Cardoso И.М., 1998] 87 92 1,1 1,1 1,1

Великобритания [Robson KJH, 1997] 115 91,3 0,9 0,9 0

Франция [BorotN, 1997] 94 72,3 4,3 2,1 8,5

Италия [Carella М, 1997] 75 64 2,7 1,3 4,0

Германия южная [Hellerbrand С., 2001] 36 72 2,8

США [Beutler Е., 1996] 147 82,3 1,4 1,4 2,7

Бразилия [Bittencourt P.L., 2002] 15 53 7 7

Собств. данные 39 5,1 7,7 2,6 46,1

Крайне низкая частота гомозигот С282У в нашей выборке может быть объяснена двумя причинами - недостаточно жесткими и четкими критериями отбора больных и/или действительно незначительным вкладом мутаций в гене БЕЕ в развитие гемохроматоза в обследованной популяции в России.

Ужесточение критериев отбора (увеличение пороговых значений биохимических показателей) не дало существенных изменений частот аллелей и генотипов. В то же время косвенно подтверждается правильность формирования выборки. Полученные характеристики выборки по полу и возрасту соответствуют характеристикам больных с НГХ: преобладающее количество мужчин по сравнение с женщинами среди больных НГХ - 3,5:1; средний возраст женщин на 9 лет больше среднего возраста мужчин (0,1>р>0,05), что так ' же характерно для НГХ.

Не исключено, что частота мутаций может быть действительно низкой в нашей группе больных НГХ. Уже было показано ранее [НеИегЬгапё С, 2001], что частота замены С282У среди выявленных по клиническим критериям больных НГХ падает по мере удаления от северо-западной части Европы, где частота этой замены в гомозиготном состоянии приближается к 95100% среди больных НГХ [МПшап К., 2001].

Частота гомозигот по мутации Н63Б при крайне низкой частоте гомозигот по С282У трудна для интерпретации. Однако интересно в связи с этим

отметить высокую частоту гетерозиготного носительства H63D - таких гете-розигот практически в 6,5 раз больше, чем гетерозигот по C282Y. При этом частоты мутантных гомозигот находятся в обратном соотношении: равновесие Харди-Вайнберга по-разному не соблюдается для частот генотипов по одной и второй мутациям. Частоты генотипов действительно по-разному смещены относительно равновесия, описываемого законом (Табл. 11). И если отклонение в частоте гомозигот по мутации C282Y в большую сторону дает право говорить о её роли в развитии болезни у отобранных больных, то в случае мутации H63D можно думать о влиянии именно гетерозиготы, а не гомозиготы. Эти предположения были подтверждены в ходе дальнейшей работы. Конечно, отклонение частот генотипов от равновесия Харди-Вайнберга может наблюдаться и в результате малой величины выборки.

Таблица 11. Несоответствие распределения генотипов закону Харди-Вайнберга в группе больных НГХ.

Генотип Экспериментальные данные, % Ожидаемые величины, %

СС 87,2 82,9

СУ 7,7 16,3

УУ 5Д 0,08

нн 51,3 55,3

ш 46,1 38,1

ОБ 2,6 6,6

Что касается компаундных гетерозигот, которые принято считать такими же важными в диагностике НГХ, как и гомозиготы C282Y, то следует отметить, что рутинные молекулярно-генетические процедуры, используемые в большинстве случаев при определении генотипа, не позволяют утверждать, в какой именно из хромосом находится мутация. Поэтому обнаружение компаундных гетерозигот в большинстве случаев не гарантирует, что исследователь нашел две мутации в одной хромосоме (цис-положение). Это утверждение в равной степени относится и к нашей работе. Вероятно, по этой причине было показано, что пенетрантность этого генотипа составляет

лишь 1% от пенетрантности гомозигот по C282Y [Beutler E., 1997]. Ввиду недостоверности оценки компаундного состояния гетерозигот рассматривать их значение нецелесообразно.

Кроме неожиданно низких частот мутаций и патологических генотипов низкая выявляемость больных также вызывала сомнения и трудности объяснения. Полученное несоответствие наших данных литературным источникам, утверждавшим о высокой частоте заболевания, исходя из частоты генотипа, и о высокой частоте определенных генотипов у больных, требовало объяснений для возможной коррекции исследования. Малое количество выявленных больных можно было объяснить низким уровнем диагностики и плохим знанием большинства врачей этой патологии, когда становится возможной маскировка заболевания под другими формами, тем более, что такое сочетание очень вероятно. В первую очередь это относится к сочетанию НГХ с алкогольным поражением печени и с вирусными гепатитами. Не исключалось, однако, и то, что в России, действительно, частота НГХ значительно ниже, чем в европейских странах, что соответствовало бы теории кельтского происхождения мутации, подтверждаемой данными многочисленных исследователей стран европейских стран от Скандинавии до восточной Европы [Lu-cotte G., 2000]. Кроме того, уже в тот момент работы стоял вопрос о низкой пенентрантности генотипа. Следовательно, посылка о высокой частоте заболевания на основе высокой частоты мутантного генотипа была исходно неправильной. Проверить, какое из предположений является правильным, можно было бы, только определив частоту генотипов и аллелей в популяции или в группе лиц с повышенным риском НГХ, исходя из наиболее характерной патологии при развернутой картине заболевания. Такой подход обеспечивал бы большую вероятность найти мутантные генотипы при меньшем объеме выборки. И был практически более целесообразным, так как контингент отобранных для этих целей людей представлял собой пациентов терапевтического профиля упомянутых выше отделений. А значит любые полу-

ченные результаты становились практически значимыми, по крайней мере, для врачей соответствующих специальностей.

Была сформирована выборка из 567 человек - больных терапевтического профиля. Условия отбора больных были определены, опираясь на данные по распространенности синдромов в развернутой клинической картине НГХ. В первую очередь были выбраны для обследования больные гепатоло-гических и гастроэнтерологических отделений, так как в 100% случаев больные НГХ имеют цирроз печени. У 75-80% больных НГХ встречается сахарный диабет, поэтому были также взяты больные эндокринологического отделения, страдающие сахарным диабетом вне зависимости от формы, так как не исключали сочетание, маскирование и усугубление друг друга двух болезней одновременно. Кроме того, часто (в 88%) у больных с развернутой клинической картиной НГХ наблюдаются изменения ЭКГ, а само заболевание в некоторых случаях дебютирует с патологии сердца. Поэтому нами были обследованы больные кардиологического отделения. Таким образом, мы предполагали, что среди больных названных отделений должны с большей, чем в популяции, частотой встречаться больные НГХ.

Генотипирование больных выявило, что частота, как генотипов, так и аллелей в среднем соответствует популяционным частотам европейских стран. Наиболее близкими по частотам являются популяции стран юго-востока Европы (Италия [Р1ей-аре11с«а А., 2003], Греция [Мепул'еаШег-Оагке А.Т., 1997]). Однако, следует отметить два важных обстоятельства. Во-первых, наша выборка изначально, как мы полагаем, обогащена мутантными аллелями, а значит, можно предполагать, что действительно популяционные частоты в России ниже полученных данных. В то же время подчеркнем, что доступные данные о популяционных частотах в российских популяциях [Михайлова С.В, 1999; 2003], примерно соответствуют полученным нами данным. Во-вторых, выборка «ТП» богаче аллелем H63D, как за счет гомо-, так и за счет гетерозигот, если сравнивать с данными по Европе, что также соответствует ранее опубликованным в России данным [Михайлова С.В

1999, Хусаинова Р.И., 2003 ]. Учитывая, что наша выборка не представляет собой популяционную, а частоты соответствуют популяционным, полученным другими авторами, можно предположить, что наша группа больных терапевтического профиля в действительности не отличается по частотам аллелей от популяции, а значит, исследуемые мутации не делают заметного вклада в структуру заболеваемости больных гастроэнтерологического, эндокринологического и кардиологического профилей. В этой группе мы наблюдаем полное соответствие частот генотипов закону Харди-Вайнберга (Табл. 12), что также было показано для популядионных частот в России ранее [Хусаинова Р.И., 2003].

Таблица 12. Соответствие распределения генотипов закону Харди-Вайнберга в группе больных ТП.

Генотип Частота экспериментальная Частота теоретическая

СС 94,53 94,3

СУ 5,12 5,7

УУ 0,35 0,08

НН 70,9 70,9

ГО 26,6 26,6

ОБ 2,5 2,5

При сравнении частот генотипов с применением метода Хи-квадрат выявлены достоверные различия между выборками ТП и НГХ по генотипам по обеим мутациям. (Табл. 13).

Таблица 13. Сравнение групп ТП и НГХ по частотам генотипов и аллелей.

УУ 5Д 0,35

нн 51,3 70,9 0,043 6,30

но 46,1 26,6

2,6 2,5

Эти данные свидетельствуют в пользу влияния мутаций С282У и H63D на развитие синдрома перегрузки железом, характерного для НГХ. Особенно подчеркнем, что если в случае с С282У более важны гомозиготы по этой мутации (5,1% в «НГХ» и 0,35% - в «ТП» (р=0,011; Х2=6,45 с учетом поправки Йейтса на множественные сравнения)), то в случае с H63D выше оказывается роль в развитии заболевания гетерозигот (46,1% в «НГХ» и 26,6% - в «ТП» (р=0,014; Х2=5,98 с учетом поправки Йейтса на множественные сравнения)), что и было предположено выше. Эта роль также подтверждается соответствием распределения генотипов закону Харди-Вайнберга в группе ТП при несоответствии закону в группе НГХ.

Кроме межгруппового сравнения частот генотипов было выполнено сравнение частот генотипов между группами пациентов ТП для поиска возможной группы с повышенным риском. Сравнение частот генотипов между группами больных с различным характером заболевания никаких различий не выявило. Это обстоятельство может быть расценено, как аргумент в пользу того, что выборка больных ТП не отличается от популяционной выборки.

При проведении исследования планировалось оценить соответствие генотипов и фенотипов, для чего была создана специальная карта формализованного учета клинических признаков и лабораторных данных больных НГХ. Предполагалось при достаточном объеме выборки (100-200) человек выявить различия в особенностях течения НГХ у лиц с разными генотипами. К сожалению, объем выборки, как уже было сказано, оказался незначительным. Малое число обследованных и высокая гетерогенность клинической картины наряду с низкими частотами мутантных генотипов не позволяют выявить возможные корреляции тяжести заболевания с генотипом. Трудность в установлении соответствующих корреляций косвенно свидетельству-

ет о наличии ещё неизвестных генов и/или мутаций, выявление которых позволит сформировать целостную картину патогенеза НГХ. Кроме того, нельзя забывать о факторах окружающей среды, роль которых, хоть и велика, но трудно оцениваема в общих схемах причинно-следственных связей.

Кроме определения частот наиболее частых мутаций при НГХ, группу больных НГХ протестировали на наличие мутации Y250X в гене Tfr2, ответственном за НГХ-3. До сих пор никто не предпринимал попыток одновременного определения частот разных мутаций в одной группе больных НГХ. Такое исследование помогло бы выявить взаимодействие генотипов и, возможно, объяснило бы клиническую гетерогенность заболевания. О частоте данной мутации ничего не известно, так как описана она была лишь в нескольких итальянских семьях [Camaschella С, 2000]. В результате генотипи-рования 39 больных НГХ не было обнаружено ни одной копии мутантного аллеля. В настоящее время описано ещё несколько мутаций в гене обнаруженных в семьях с НГХ, не обусловленным известными мутациями в гене HFE [McKusick V.A., 2004]. Об их популяционной частоте пока также ничего не известно. По всей видимости, эти мутации представляют интерес только в определенных выявленных и обследованных семьях.

Открытие мутаций в гене HFE позволяет проводить массовые обследования больных на предмет обнаружения НГХ. Однако, несмотря на то, что критерии, определенные ВОЗ для просеивающих программ в данном случае удовлетворены (надежные и безопасные процедуры тестирования, возможность определения заболевания на доклинической стадии, эффективное и недорогое профилактическое лечение) [Burke W., 1998], вопрос массового применения генетических тестов остается открытым. Все больше профессионалов - как практикующих врачей, так и специалистов исследовательских центров - сомневается в высокой пенетрантности заболевания.

В одном из недавних исследований было показано, что пенетрантность мутаций в HFEсоставляет от 1 до 4% [Beutler E., 2003]. При изучении НГХ в Англии, среди 10556 обследованных доноров было выявлено 72 (0,68%) го-

мозиготы C282Y, при этом ни у одного из 63 проинтервьюированных гомозигот не было обнаружено клинических признаков заболевания, хотя и был отмечен повышенный уровень НТЖ [Jackson НА, 2001]. Beutler с соавторами выявили только одного пациента с классическими признаками НГХ среди 152 C282Y гомозигот, хотя и было отмечено, что у этой группы достоверно чаще наблюдались отклонения в показателях функции печени. Однако это не влияло на продолжительность жизни [Beutler E., 1999].

Более того, было обнаружено, что частота мутации C282Y не снижается с возрастом, что означает отсутствие её влияния на продолжительность жизни [Willis G., 1999].

Полученные факты и их анализ делают вопрос определения НГХ особенно острым, а ответ на него далеко не таким очевидным, как представлялось ранее. Первоначально НГХ определяли исключительно по клиническим признакам, характерным для классической развернутой картины заболевания - цирроз печени, сахарный диабет, бронзовая кожа. С появлением методов определения НТЖ и сывороточного ферритина повышение этих показателей становится диагностически важным признаком, особенно при сочетании с определенными антигенами ГКГ - HLA A4, В14 и др. Таким образом, расширяется число критериев, достаточных для установления диагноза НГХ, что увеличивает количество людей, считающихся больными НГХ. Однако с открытием гена HFE и мутаций C282Y и H63D число людей предположительно больных гемохроматозом опять возросло. Кого считать больным -вопрос, по которому до сих пор нет единого мнения.

Наше исследование планировалось и проходило на волне актуализации проблемы гемохроматоза. Многие авторы рекомендовали популяционные скрининги. Лишь немногие исследователи задавались вопросом о несоответствии частот выявляемых гомозигот и реально наблюдаемых в практике больных, что четко отражено в названии одной из статей «Гемохроматоз: где все пациенты?» [Но G.T., 200152]. В настоящее время все больше авторов сомневается, можно ли называть человека больным только по результатам

генотипирования, если при этом у него нет признаков заболевания. Болезнь может так и не развиться, однако, с этого момента жизнь человека может зачастую претерпеть изменения - в вопросах получения страховки, личных взаимоотношений, психологического комфорта, а при назначении профилактического кровопускания - и в плане физического состояния. К сожалению, результаты генетических тестов иногда являются достаточными для необоснованного выставления диагноза.

Полученных нами данных достаточно, чтобы уверенно говорить о нецелесообразности популяционных скринингов на наличие мутаций С282У и Н63Б. Наши результаты демонстрируют крайне слабую связь клинических проявлений НГХ с наличием этих мутаций. В то же время, нельзя упускать из вида, что суммарная отягощенность группы «НГХ» мутантными генотипами немного менее, чем в два раза больше отягощенности группы «ТП» - сумма частот всех генотипов, содержащих мутантные аллели составляет 56,4% для группы «НГХ» и только 34,2% для группы «ТП». Безусловно, человек, у которого обнаружен один или несколько патологичных аллелей попадает в группу риска по НГХ, однако, риск этот, судя по всему, незначительный. Частота мутантных гомозигот С282У в группе «ТП» составила 1:280 (0,35%), что, несомненно, требует внимания. Однако, оцениваемая нами и известная по литературным источникам регистрируемая заболеваемость колеблется около 1:100000. Такое соотношение частот генотипа и фенотипа говорит об очень низкой пенентрантности генотипа, о чем уже было сказано ранее [БеШ:-1ег Е., 2003], и позволяет нам говорить о незначительном повышении риска для больных с патологическими генотипами.

В данной ситуации очень важно избежать именно гипердиагностики, так как рекомендуемое в настоящее время ведение выявленных мутантных гомозигот включает обязательное профилактическое кровопускание. Сама по себе неприятная процедура должна проводиться многократно на протяжении нескольких месяцев, что значительно снижает качество жизни и тем самым

нарушает одну из заповедей Гиппократа - лечение не должно быть тяжелее заболевания.

Анализ на наличие мутаций C282Y и H63D в гене HFE может быть целесообразным только в следующих случаях:

1. тестирование родственников больного при обнаружении у него характерных мутаций;

2. уточнение диагноза при наличии других признаков НГХ;

3. скрининг в возможных группах риска - среди больных, предрасположенных к избыточному ненаследственному накоплению железа - для прогноза тяжести основного заболевания.

При этом следует иметь в виду, что родственники выявленного больного НГХ должны постоянно наблюдаться и без уточнения генотипа, а отсутствие характерного генотипа у больного с явными признаками НГХ не является основанием для исключения диагноза НГХ.

Необходимо признать, что, по крайней мере, в России, целесообразнее обосновывать диагноз НГХ, опираясь на клинику заболевания и, особенно на ранних стадиях, на отклонения биохимических показателей. В первую очередь врач должен обращать внимание на повышение НТЖ и уровня сывороточного ферритина, как на самые информативные показатели нарушения метаболизма железа при НГХ. Разные авторы придерживаются различных точек зрения о значении этих показателей - некоторые рекомендуют использовать, как более достоверный, уровень насыщения трансферрина [Edwards C.Q., 1988], другие отмечают большую показательность именно уровня ферритина [Bradley L.A., 1996]. Такие разночтения могут быть связаны с тем, что имеются существенные различия в показателях как при проведении анализов в разных лабораториях, так и при использовании разных методов [Koziol J. А., 2002]. Оба показателя важно оценивать при взятии крови натощак и оценивать результаты повторных, но не одиночных анализов. Сочетание показателей ферритина и НТЖ безусловно повышают диагностическую значимость тестов. В качестве дешевого скрининга допустимо исполь-

зовать определение сывороточного железа, однако следует всегда помнить о высокой вариабельности этого показателя, даже в стандартных условиях забора крови натощак.

Выводы

1. Генотипирование по мутациям C282Y и H63D в гене НЕЕ в группе больных с диагнозом «наследственный гемохроматоз» показало низкую частоту патологических генотипов (YY - 5,1%, DD - 2,6%), считающихся наиболее важными для развития наследственного гемохроматоза, что свидетельствует о незначительном вкладе мутаций в гене НЕЕ в развитие этого заболевания у российских больных.

2. Генотипирование по мутациям C282Y и H63D в гене НЕЕ больных из отделений гастроэнтерологии, гепатологии, кардиологии, эндокринологии (предполагаемые группы риска по наличию наследственного гемохроматоза) показало соответствие частот мутантных аллелей - 2,9%; D - 15,8%) по-пуляционным частотам, полученным в ряде работ как за рубежом, так и в России. Частоты генотипов по мутациям C282Y и H63D в гене БЕЕ у больных из предполагаемых групп риска по наличию наследственного гемохроматоза соответствуют распределению генотипов по закону Харди-Вайнберга. Не выявлено существенного вклада исследованных мутаций в развитие патологии у больных терапевтического профиля.

3. У больных с диагнозом «наследственный гемохроматоз» мутация Y250X в гене Т/Я2 не обнаружена, что подтверждает редкость или отсутствие данной мутации в России.

4. Соотношение числа выявленных больных с диагнозом «наследственный гемохроматоз» в московских клиниках и популяционных частот му-тантных генотипов свидетельствует о низкой пенентрантности последних. Клинические данные и результаты биохимических анализов имеют большее значение для установления диагноза «наследственный гемохроматоз».

5. Просеивающее обследование на наличие мутаций C282Y и H63D в гене НЕЕ в России является необоснованным. Молекулярно-генетическая диагностика мутаций C282Y и H63D у больных целесообразна только с целью: 1) дополнительного подтверждения клинического диагноза «наследственный гемохроматоз»; 2) для оценки риска развития заболевания у клиниче-

ски здоровых родственников больных наследственным гемохроматозом с обнаруженными типичными патологическими генотипами; 3) проведения генетического тестирования у лиц с заболеваниями, вызывающими вторичную перегрузку железа для прогноза течения заболевания.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лавров А.В., Сухарева Г.В., Сеттарова Д.А. «Способы ранней диагностики наследственного гемохроматоза» // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология, 2002, №2, стр. 143, тезисы

2. Сухарева Г.В., Лавров А.В., Сеттарова Д.А. «Клинические наблюдения наследственного гемохроматоза у женщин» // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология, 2002, №2, стр. 152, тезисы

3. Лавров А.В., Баев А.А., Сухарева Г.В., Бочков Н.П. «Молекулярные механизмы обмена железа при наследственном гемохроматозе» // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология, 2003, № 1, стр. 127, тезисы

4. Сухарева Г.В., Шепелева С.Д., Царегородцева Т.М., Лавров А.В., Баев А.А. «Вариабельность проявления наследственного гемохроматоза» // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология, 2003, №1, стр. 133, тезисы

5. А.А. Баев, Ч.С. Павлов, М.В. Маевская, В.Т. Ивашкин, А.В. Лавров «Современные подходы к диагностике наследственного гемохроматоза» // Тезисы конференции с международным участием: «Информационные технологии в биологии имедицине». Гурзуф. Ялта. Украина. 2003, стр. 53-54, тезисы

6. А.В. Лавров, И.К. Суркова, А.А. Баев, М.М. Литвинова «Распространённость мутаций C282Y и H63D в гене наследственного гемохроматоза среди больных терапевтического профиля» // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология, 2004, № 1, стр. 125, тезисы

7. А.В. Лавров, М.М. Литвинова, Н.П. Бочков «Генетика и молекулярпые механизмы патогенеза наследственного гемохроматоза» // Молекулярная медицина, 2004, № 1, стр. 10-20

8. А.А. Баев, А.В. Лавров, Ч.С. Павлов, М.В. Маевская «Варианты клинической картины у гетерозигот по мажорным мутациям генов наследственного гемохроматоза (НГХ)» // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология, 2004, №1, стр. 117, тезисы

9. А.В. Лавров, А-А. Баев, И.К. Суркова, Г.В. Сухарева, Ч.С. Павлов, А.Ю. Асанов, Н.П. Бочков «Анализ частот мутаций C282Y и H63D гена наследственного гемохроматоза (HFE) у госпитализированных больных» // Медицинская генетика, 2004, Т.З, №8, стр. 380387

Принято к исполнению 15/09/2004 Исполнено 16/09/2004

Заказ № 322 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru