Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модификация систем размножения растений на основе методов культуры in vitro

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Эльконин, Лев Александрович, Саратов

Ti

/

Cfci 2

./ J; №

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА ЮГО-ВОСТОКА

.// 99 ^chi На правах

MifiM'tUWjCtLK ... ^

рукописи

С/

ЭЛЬКОНИН Лев Александрович

УДК( 631.522+ 581.085): 633.17

МОДИФИКАЦИЯ СИСТЕМ РАЗМНОЖЕНИЯ РАСТЕНИЙ НА ОСНОВЕ МЕТОДОВ КУЛЬТУРЫ

IN VITRO (НА ПРИМЕРЕ СОРГО)

Специальность 03.00.15 - Генетика

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант доктор биологических наук профессор В.С.Тырнов

Саратов - 1998

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ........................................................4

1. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ДЛЯ МОДИФИКАЦИИ СИСТЕМ РАЗМНОЖЕНИЯ РАСТЕНИЙ ... 13

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................... . 24

2.1. Методы культуры In vitro ..................................24

2.1.1. Получение каллусных культур и растений-регенерантов .....24

2.1.2. Получение эмбриогенных клеточных суспензий ..............27

2.1.3. Анализ влияния факторов, модифицирующих системы размножения в культуре in vitro ................................28

2.2. Цитологические методы.....................................32

2.3. Выявление и генетический анализ мутантов с мужской стерильностью и фертильных ревертантов.................... 34

2.4. Индукция мутаций мужской стерильности путем обработки каллусов раствором стрептомицина .................................35

2.5. Получение ревертантой линии с частичной мужской фертильностью АС-1 ........................................ 36

2.6. Изучение восстановления фертильности на новых типах ЦМС-индуцирующих цитоплазм природного происхождения ...........37

2.7. Испытание селекционной ценности полученных линий

и гибридов ................................................ 38

3. СИСТЕМЫ РАЗМНОЖЕНИЯ РАСТЕНИЙ СОРГО В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ...... 39

3.1. Морфотипы каллусных тканей сорго...........................39

3.2. Морфогенез и регенерация растений в культурах с ОМ ........ 41

3.3. Компактный эмбриоидогенный каллус ......................... 47

3.4. Рыхлый эмбриоидогенный каллус .............................55

3.5. Эмбриоидогенные клеточные суспензии сорго ................. 62

4. МОДИФИКАЦИЯ СИСТЕМ РАЗМНОЖЕНИЯ СОРГО В КУЛЬТУРЕ IN VITRO____70

4.1. Влияние фитогормонов ......................................70

4. 2. Влияние источников азота.................................. 79

4.3. Влияние ионов фосфора.....................................88

4.4. Влияние эпигенетических факторов ..........................91

4. 5. Влияние освещения .........................................95

4.6. Влияние сезонных факторов .................................96

4.7. Управление плоидностью культивируемых клеточных

популяций ................................................. 98

5. ИНДУКЦИЯ МУТАЦИЙ МУЖСКОЙ СТЕРИЛЬНОСТИ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ..104

5.1. Генетические основы формирования признака ЦМС ............106

5.2. Индукция мутаций генетических систем, контролирующих ЦМС,

с помощью экспериментального мутагенеза..................114

5.3. Использование культуры in vitro для получения ЦМС-мутантов .............................................120

5.3.1. Мужски-стерильные мутанты сорго, полученные на основе

сомаклональной изменчивости............................ 121

5.3.1.1. Изучение генетической природы мутации мужской

стерильности.........................................123

5.3.1. 1. А. Наследование при самоопылении .....................123

5.3.1.1. Е. Наследование в шестерных скрещиваниях .............130

5. 3. 1.1. Е. Анализ генетической нестабильности.........................134

5.3.1.2. Питэлогическое исследование действия мутации мужской стерильности ......................................... 146

5.3.2. Индукция мутаций мужской стерильности с помощью стрептомицина в культуре in vitro ......................157

5.4. Анализ восстановления мужской фертильности на ЦМС-инду-цирующкх цитоплазмах, выделенных из природных популяций ..168

6. РЕВЕРСИЯ К МУЖСКОЙ ФЕРТИЛЬНОСТИ В КУЛЬТУРЕ ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ

С ЦМС ......................................................190

6.1. Получение и характеристика ревертантной линии АС-1 с

частичной мужской фертильностью .......................... 191

6.2. Анализ генетической природы реверсии к мужской

фертильности ............................................. 197

7. ИНДУКЦИЯ МЕЙ-МУТАНТОВ В КУЛЬТУРЕ ГАПЛОИДНЫХ ТКАНЕЙ СОРГО ...203

7.1. Характеристика и анализ наследования мутации полной стерильности ............................................. 204

7.2. Анализ мейоза у растений с полной мужской и женской стерильностью ............................................ 205

8. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ IN VITRO ДЛЯ СОЗДАНИЯ ЛИНИЙ

С ЭЛЕМЕНТАМИ АПОМИКТИЧНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ IN VIVO.............. 213

9. ОЦЕНКА СЕЛЕКЦИОННОЙ ЦЕННОСТИ ПОЛУЧЕННЫХ ЛИНИЙ СОРГО

В СЕЛЕКЦИИ НА ГЕТЕРОЗИС .................................... 229

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ....................................................239

ВЫВОДЫ........................................................246

ЛИТЕРАТУРА..........................................................................250

ПРИЛОЖЕНИЕ____................................................ 291

Актуальность темы диссертации. Исследования генетического контроля систем размножения высших растений, индукция и анализ мутаций, контролирующих те или иные звенья данного процесса, имеют первостепенное значение для понимания многих фундаментальных проблем генетики и эволюции растений, а также для решения прикладных задач селекции. В этом плане наибольший интерес представляют мутанты с генной и цитоплазматической мужской стерильностью (ГМС и ЦМС), мей-мутанты, мутанты с апомиктичным размножением. Использование клеточных технологий в сочетании с методами классической генетики и селекции открывает большие возможности для разработки новых подходов к получению таких форм на основе сомаклональной изменчивости, соматической гибридизации, генной инженерии. Данные методы позволяют создавать принципиально новые комбинации ядерных и цитоплазматических генов, отсутствующие в природных популяциях, но которые, тем не менее, могут иметь значительную научную и практическую ценность. Использование стерильных мутантов, фертильных ревертантов, цибридов позволило выявить цитоплазматические гены, участвующие в контроле ЦМС у ряда видов растений (Boeshore et al., 1985; Fauron et al., 1987, 1990; Wise et al., 1987a, 1987b; Bonhomme et al., 1991, 1992; Chetrit et al., 1992; Grêlon et al., 1994; Wang et al., 1995; Akagi et al., 1995; и др.).

В основе использования системы культуры in vitro для размножения растений и получения разнообразных мутантов лежит управление морфогенетическими процессами в культивируемых клеточных популяциях. В этой связи первостепенное значение приобретает выявление факторов, управляющих морфогенезом в культуре in vitro и позволяющих получать клеточные системы с различными морфогенетическими потенциями, разными морфотипами тканей и структурных образований,

обеспечивающие генетическую стабильность или, наоборот, вызывающие генетическую изменчивость.

В результате действия различных факторов на механизмы клеточной пролиферации и дифференциации - как на эпигенетическом уровне» так и путем индукции мутаций - в культуре in vitro происходит отбор клеточных линий с теми или иными морфогенетическими потенциями. Такой отбор может оказывать влияние не только на размножение растений на клеточном уровне, но и на генетические системы, контролирующие половое размножение растений in vivo, т.е. формирование генеративных органов, мужских и женских гаметофитов и фертильных гамет. Однако возможность использования культуры in vitro для отбора мутаций, контролирующих гаметогенез и половое размножение растений, - признаков, не подвергаемых непосредственной селекции на уровне меристематических недифференцированных клеток, - изучена чрезвычайно слабо.

Данные исследования открывают возможность для непосредственного решения многих важных задач селекции и сельскохозяйственного производства, таких, как селекция новых стерильных линий, используемых для производства гибридов F1, создание полиморфизма типов ДМС и преодоление цитоплазматического единообразия возделываемых гибридов, несущего потенциальную угрозу эпифитотий. Эти проблемы актуальны для многих возделываемых растений, у которых явление ЦМС нашло коммерческое применение.

Использование в качестве объекта для данных исследований сорго - типичного представителя семейства злаков, уникального по своей засухоустойчивости, входящего в число пяти ведущих возделываемых культур - позволяет экстраполировать полученные выводы на многие другие виды данного семейства. Кроме того, эти исследования делают возможным решение некоторых специфических задач селекции сорго, в частности, таких, как создание скороспелых стерильных ли-

ний. Распространение гетерозисных гибридов сорго в северных зонах соргосеяния, в том числе, во многих регионах России, сдерживается из-за отсутствия скороспелых линий с ЦМС. Для создания таких линий необходимы новые источники ЦМС, так как многие селекционно-ценные скороспелые образцы сорго несут гены-восстановители ЦМС стандартного типа (milo, Al), что делает принципиально невозможным получение стерильных аналогов таких образцов с помощью бэккроссов с ЦМС-линиями на цитоплазме Al.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось изучение возможности модификации систем размножения растений в культуре in vitro и in vivo на основе использования клеточных технологий. При этом были поставлены следующие задачи:

1. Выявить закономерности формирования и разработать методические основы получения различных клеточных систем со стабильной регенерационной способностью, необходимых для размножения сорго in vitro и проведения экспериментов по генной и клеточной инженерии; изучить генетическую стабильность таких систем.

2. Изучить принципиальную возможность использования культуры in vitro для отбора мутаций генов, контролирующих признаки, не подвергаемые непосредственной селекции на уровне меристематических недифференцированных клеток.

3. Выявить и изучить характер экспрессии и наследования индуцированных в культуре in vitro мутаций генетических систем, контролирующих половое размножение растений:

- мутаций мужской стерильности;

- реверсий к фертильности у форм с ЦМС;

- мутаций генов, контролирующих мейоз;

- мутаций, контролирующих элементы апомиксиса.

4. Провести сравнительный анализ генетических систем, контролирующих восстановление мужской фертильности у мутантов, получен-

ных из культуры тканей, и известных источников стерильности.

5. Создать стерильные аналоги скороспелых фертильных селекционно-ценных линий сорго и изучить возможность их использования в селекции на гетерозис.

Научная новизна полученных результатов. Впервые выявлены закономерности формирования различных клеточных систем, способных к стабильной массовой регенерации растений сорго. При этом показано, что морфологические признаки тех или иных типов тканей являются маркерами их морфогенетических потенций; на основе селекции определенных морфотипов возможно создание каллусных культур со стабильной регенерационной способностью. Установлена специфическая потребность морфогенного каллуса сорго в наличии в составе среды экзогенных цитокининов (6-БАП или кинетина), высокого уровня ионов Ш4 и Ш3~. Впервые показано, что добавка в питательные среды (МБ или N6), содержащие 2,4-Д, одновременно Ь-аспарагина и Ь-пролина в высоких концентрациях (1.0-3.0 г/л) усиливает пролиферацию эмбри-оидогенного каллуса (ЭК) и снижает продукцию токсического пигмента, характерного для культивируемых тканей сорго, при этом на средах с определенным уровнем ионов N63" и соотношением М03~/МН4 + у некоторых сортов происходит формирование нового морфотипа ЭК -рыхлого эмбриоидогенного, - имеющего большую ценность для генной и клеточной инженерии. Впервые показано, что фосфат является эффективным индуктором соматического эмбриогенеза. Разработаны составы новых сред для индукции ЭК сорго (среды М2, МП). Впервые у разных образцов сорго получены стабильные эмбриоидогенные клеточные суспензии.

Показана возможность экспериментальной регуляции уровня пло-идности растений, регенерируемых из каллусных культур гаплоидного происхождения, при этом установлено влияние на этот процесс концентрации 2,4-Д в среде и онтогенетического возраста экспланта.

Впервые продемонстирована принципиальная возможность использования культуры in vitro для отбора мутаций, контролирующих гаме-тогенез и половое размножение растений, - признаков, не подвергаемых непосредственной селекции на уровне меристематических недифференцированных клеток. Впервые у сорго в культуре in vitro получены мутанты с мужской стерильностью (МС), мей-мутанты, а также фер-тильные ревертанты от растений с ЦМС.

Получены мутанты с необычным характером наследования МС: при самоопылении и при скрещивании с исходной формой мутации МС проявляются как цитоплазматические, демонстрируя соматическое расщепление и неменделевское расщепление в потомстве полустерильных растений; в тестерных скрещиваниях с разными линиями-восстановителями ЦМС А1 одна и та же мутация проявляется либо как ядерная доминантная, либо ядерная рецессивная. Высказано предположение, что эти различия обусловлены существованием разных генетических систем восстановления мужской фертильности - основанных на действии доминантных и рецессивных генов-восстановителей.

Разработан метод индукции мутантов с мужской стерильностью, основанный на совместном воздействии на клетки условий культуры in vitro и цитоплазматического мутагена стрептомицина. При этом частота возникновения МС-мутантов у многих образцов достигает 100% от числа жизнеспособных регенерантов и в 20-30 раз превышает частоту появления таких форм в Ml после воздействия стрептомицина на семена. Материнское наследование МС свидетельствует о цитоплаз-матической природе индуцированных мутаций.

Обнаружен необычный характер восстановления мужской фертильности на ЦМС-индуцирующих цитоплазмах сорго типов А4 и 9Е и у мутантов, полученных из культуры in vitro: у гибридов F1-BC1 проявляется мужская стерильность, тогда как в последующих бэккроссах возникают фертильные ревертанты. Высказана гипотеза о том, что

данное явление обусловлено рецессивными генами-восстановителями.

Впервые показано, что при замещении с помощью последовательных бэккроссов генома ЦМС-линии ([9Е] Тх398) геномом ее.линии-закрепителя (Майло-10), у вновь полученной ЦМС-линии ([9Е] Майло-10) измененяется взаимодействие цитоплазматических генов, участвующих в контроле ЦМС, с доминантными ядерными генами тестеров-восстановителей фертильности, эффективными для исходной линии.

Впервые показано, что на основе сомаклональной изменчивости и селекции клеток с высокой способностью к эмбриоидогенезу in vitro возможно усиление проявления апомиктичных потенций in vivo. Показана возможность прямого отбора на частоту апоспории в потомстве растений-регенерантов и. увеличения количественной выраженности данного признака в 4-8 раз за 4 цикла такого отбора.

Практическая значимость полученных результатов. На разных типах цитоплазм созданы 13 новых изогенных линий с ЦМС и стерильных аналогов ряда селекционно-ценных образцов зернового сорго. Данные линии являются скороспелыми (вегетационный период 95-100 дней в условиях г.Саратова), многие из них характеризуются такими признаками, как сочностебельность, светлая окраска зерна, восковидный эндосперм. На цитоплазме А2 выявлены гибридные комбинации с высокой зерновой продуктивностью в сочетании со скороспелостью и другими агрономически-ценными признаками. Госкомитетом по охране селекционных достижений принята заявка на выдачу патента на гибрид Волгарь, превосходивший по урожаю зерна районированные стандарты на 28-80%%.

Полученная из культуры тканей линия АС-1, способная к развитию апоспорических зародышевых мешков, может быть использована в качестве донора в работе по созданию апомиктичного сорго.

Разработанные методы получения эмбриогенных каллусных и суспензионных клеточных культур имеют значительную научную и прак-

тическую ценность и могут использоваться в экспериментах по генной и клеточной инженерии, при получении трансгенных растений сорго, при изучении закономерностей регуляции морфогенеза.

Созданные изогенные аллоплазматические линии на разных типах ЦМС-индуцирующих цитоплазм могут использоваться как модельные системы для изучения генетики ЦМС и эффекта ядерных и цитоплазма-тических генов на формирование различных признаков у сорго.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Возможность создания в культуре тканей сорго различных клеточных систем с высокой регенерационной способностью на основе селекции в каждом пассаже, начиная с первичных культур, определенных морфотипов каллусных тканей, характеризующихся морфологическими признаками, являющимися маркерами их морфогенетических потенций, и их субкультивировании на соответствующие питательные среды. Формирование таких систем и морфотип эмбриоидогенного каллуса зависят от концентрации 2, 4-Д, цитокинина, аминокислот.Ь-аспарагина и Ь-пролина, уровня и соотношения ионов Ы03~ и Ш4+:

- среды, содержащие 2,4-Д и цитокинин, вызывают формирование гетерогенных культур, содержащих меристематические образования (ОМ, очаги морфогенеза) и компактный эмбриоидогенный каллус;

- среды с высокими концентрациями аспараг