Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модельная биологическая система желточных липопротеидов: параметры спонтанной и Fe2+-инициированной окислительной модификации белков в комплексе с уровнем молекул средней массы

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Модельная биологическая система желточных липопротеидов: параметры спонтанной и Fe2+-инициированной окислительной модификации белков в комплексе с уровнем молекул средней массы"

На правах рукописи

Рубцов Георгий Константинович

МОДЕЛЬНАЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ЖЕЛТОЧНЫХ ЛИПОПРОТЕИДОВ: ПАРАМЕТРЫ

СПОНТАННОЙ И Ре2+-ИНИЦИИРОВАННОЙ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ В КОМПЛЕКСЕ С УРОВНЕМ МОЛЕКУЛ СРЕДНЕЙ МАССЫ

03.01.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005556895

10 ДЕК 2014

Пенза-2014

005556895

Работа выполнена на кафедре биохимии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пензенский государственный университет».

Научный руководитель - доктор биологических наук, доцент Безручко Наталья Валериановна.

Официальные оппоненты: Алексеева Людмила Владимировна, доктор

Ведущая организация - Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».

Защита состоится 12 февраля 2015 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.263.08 на базе ФГБОУ ВПО «Тверской государственный университет» по адресу: 170002, г. Тверь, пр-т Чайковского, д. 70.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБОУ ВПО «Тверской государственный университет», university.tversu.ru.

биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Тверская государственная сельскохозяйственная академия» (ФГБОУ ВПО Тверская ГСХА), заведующая кафедрой физиологии, общей биологии и основ ветеринарии;

Зайцев Валерий Геннадьевич, кандидат биологических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет», доцент кафедры теоретической биохимии с курсом клинической биохимии.

Автореферат разослан «/7.^ » Xе-7' /У

г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

М.Н. Петушков

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЖЛП - желточные липопротеиды

МБС - модельная биологическая система

МСМ - молекулы средней массы

ОМБ - окислительная модификация белков

2,4-ДФГ - 2,4-динитрофенилгидразин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Изучение биохимических механизмов развития окислительного стресса весьма актуально, так как затрагивает большое число заболеваний и патологий, но - необычайно сложно, так как требует решения комплекса проблем методического и теоретического плана (Е.Б. Меныцикова и соавт., 2006, 2008). Одним из аспектов исследований составляющих окислительного стресса может служить анализ свободно-радикальных процессов, затрагивающих белки.

Значимость исследований окислительной модификации белков в комплексе с уровнем веществ средней молекулярной массы обусловлена тем, что данные биохимические тесты — маркеры выраженности эндотоксикоза, чувствительные к изменению степени окислительного стресса. (Р.Н. Белоногов и соавт., 2009; Т.В. Копытова и соавт., 2009; Н.Ю. Келина и соавт., 2012; О. Халдун и соавт., 2012; Н.В. Безручко и соавт., 2013; Г.К. Рубцов и соавт., 2013.) Изучение их в совокупности, в одной пробе биологической среды, позволит увеличить информативность каждого из этих параметров и снизить расход используемого материала, что особенно важно в клинической биохимии.

Метод оценки окислительной модификации белков (ОМБ) в совокупности с уровнем молекул средней массы (МСМ) может быть реализован в соответствии с авторским способом (Г.К. Рубцов и соавт., 2012). Метод предполагает определение в одной и той же пробе биологического материала и уровня МСМ, и величин ОМБ. Для этого проводят осаждение белков три-хлоруксусной кислотой. Надосадочную жидкость используют для регистрации экстинкций МСМ (при 254 нм), а осадок - для определения величин ОМБ (при 356 нм, 370 нм, 430 нм, 530 нм). Уровень ОМБ изучают в реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДФГ) с образованием карбонильных производных белков (2,4-динитрофенилгидразонов). Регистрация уровней ОМБ спектрофотометрически на четырех длинах волн позволяет выявить уровни 2,4-динитрофенилгидразонов различной природы: при 356 нм - алифатические альдегиддинитрофенилгидразоны нейтрального характера, при 370 нм — алифатические кетондинитрофенилгидразоны нейтрального характера, при 430 и 530 - алифатические альдегиддинитрофенилгидразоны и кетондинитрофенилгидразоны основного характера (Е.Е. Дубинина и соавт., 1995).

Для изучения спонтанной и инициированной (металлкатализируемой) окислительной модификации белков и уровня молекул средней массы удобно использовать модельные биологические системы (МБС), например МБС желточных липопротеидов (ЖЛП).

Металлкатализируемое окисление представляет собой местный специфический процесс, протекающий в нормально функционирующем организме, и его уровень является важным прогностическим показателем. Т.е. диагностическое значение имеет не только определение спонтанной ОМБ, кото-

рая указывает на количество модифицированных аминокислот, но и метал-линдуцированная деструкция белковых молекул. Индуцированная ОМБ позволяет выявить как изменения аминокислот, входящих в состав полипептидной цепи, так и модификации, связанные с конформацией молекулы и состоянием белкового окружения. (М.В. Ведунова и соавт., 2010.)

В связи с этим в работе проведены серии наблюдений не только в условиях спонтанного, но и в условиях металлкатализируемого окисления, в качестве которого было применено Ре2+-индуцированное окисление. Выбор способа индуцирования ОМБ в пуле МСМ с помощью ионов Ре2+обусловлен следующим.

Введение в систему ионов Ре2+ сопровождается ускорением процессов свободно-радикального окисления, уровень аутоокисления плазмы крови и суспензии желточных липопротеидов крайне мал, причем плазма крови, по сравнению с желточными липопротеидами, в присутствии ионов Ре2+ окисляется намного меньше (Г.И. Клебанов и соавт., 1988). Г.И. Клебанов и соавт. (1988) предположили, что в самом общем случае ингибирование плазмой крови пероксидации липидов желточных липопротеидов в присутствии ионов Ре2+ обусловлено наличием в плазме крови антиоксидантов и (или) веществ, обеспечивающих окисление и связывание ионов Ре2+.

С этих позиций представляют практический интерес разработка и оптимизация методического обеспечения исследования данных параметров (МСМ и ОМБ) в комплексе, в одной пробе биологической среды. Актуально применение для этого модельной биологической системы желточных липопротеидов в условиях спонтанной и инициированной ОМБ, что позволяет апробировать предложенный метод оценки ОМБ и уровня МСМ.

Наше исследование ориентировано на изучение биологического значения параметров спонтанной и Ре2+-инициированной окислительной модификации белков и молекул средней массы на модельной биологической системе желточных липопротеидов. Это направлено на решение задачи повышения информативности исследуемых биохимических тестов путем исследования их в комплексе - в одной и той же пробе, снизив расход биологического материала, имеющей ключевое значение для развития медицинской биохимии и ее клинического раздела.

Таким образом, необходимость изучения как спонтанной, так и индуцируемой ионами металлов ОМБ, обусловлена тем, что это дает возможность определить чувствительность модельной биологической системы к изменению условий процессов свободно-радикального окисления. В нашей работе в основе применяемого метода регистрации уровня ОМБ использовалась реакция с 2,4-динитрофенилгидразином, в процессе которой могут образовываться динитрофенилгидразоны альдегидной и кетонной природы. Изучение инициированной ОМБ проводилось в модельной биологической системе в присутствии ионов железа (Ре2+).

Цель исследования: предложить маркерные параметры оценки уровня спонтанной и Ре2+-инициированной окислительной модификации белков,

коррелирующие с уровнем молекул средней массы, и обосновать диапазоны их чувствительности к изменению условий процессов свободно-радикального окисления на модельной биологической системе желточных липопротеидов.

Задачи исследования:

1. Изучить спонтанную и Ре2+-инициированную окислительную модификацию белков и уровни молекул средней массы на модельной биологической системе желточных липопротеидов, продуктах пчеловодства как веществах природного происхождения, обладающих антиоксидантным действием, и сыворотке крови экспериментальных животных (крысы).

2. Исследовать спонтанную и Ре2+-инициированную окислительную модификацию белков и уровни молекул средней массы на модельной биологической системе желточных липопротеидов при добавлении продуктов пчеловодства как веществ природного происхождения, обладающих антиоксидантным действием, и сыворотки крови экспериментальных животных (крысы).

3. Определить особенности спонтанной и Ее2+-инициированной окислительной модификации белков и уровней молекул средней массы на модельной биологической системе желточных липопротеидов при одновременном добавлении продуктов пчеловодства как веществ природного происхождения, обладающих антиоксидантным действием, и сыворотки крови экспериментальных животных (крысы).

4. Выявить возможности комплексного использования маркерных параметров оценки уровня спонтанной и Ре2+-инициированной окислительной модификации белков, коррелирующих с уровнем молекул средней массы, на модельной биологической системе желточных липопротеидов.

Научная новизна.

Предложен способ определения уровня окислительной модификации белков и молекул средней массы (патент на изобретение Российской Федерации № 2525437, в соавторстве).

Исследованы спонтанная и Ре2+-инициированная окислительная модификация белков и уровни молекул средней массы на модельной биологической системе, в качестве которой были выбраны желточные липопротеиды. Соответствующие тесты определены в продуктах пчеловодства как веществах природного происхождения, обладающих антиоксидантным действием, и сыворотке крови экспериментальных животных (крысы).

Изучены особенности проанализированной модельной биологической системы по уровню окислительной модификации белков различного характера (в условиях спонтанного и Ре2+-индуцированного окисления), регистрируемой по изменению концентрации карбонильных соединений, реагирующих с 2,4-динитрофенилгидразином. Выявлено, что наиболее показательна регистрация уровней ОМБ при длинах волн 430 и 530 нм, на которых отмечается образование алифатических альдегиддинитрофенилгидразонов и ке-тондинитрофенилгидразонов основного характера.

Установлены возможности комплексного использования изученных маркерных параметров оценки уровня спонтанной и Ре2+-инициированной окислительной модификации белков, коррелирующих с уровнем молекул средней массы, на модельной биологической системе желточных липопро-теидов.

Практическая ценность работы.

Работа является фрагментом научных исследований Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пензенский государственный университет». Научно-практическим значением данной работы является повышение информативности биохимических тестов окислительной модификации белков и молекул средней массы: предложена методика исследования их в комплексе, в одной и той же пробе, апробированная на модельной биологической системе. Эта методика может быть рекомендована к практическому использованию.

Реализация результатов исследования. Полученные результаты внедрены с 2013 г. в учебный процесс на кафедре биохимии Пензенского государственного университета. Издано учебное пособие по медицинской биохимии (в соавторстве): «Медицинская биохимия: Учебное пособие. - Издательство Пензенского государственного университета» (2013). (Данное учебное пособие было представлено на IV Дальневосточный региональный конкурс изданий высших учебных заведений «Университетская книга -2013» и награждено грамотой: выписка из протокола заседания жюри № 4 от 01.10.2013.)

Получен патент на изобретение Российской Федерации (№ 2525437, в соавторстве) по способу определения окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы.

Положения, выносимые на защиту.

Ре2+-инициированная окислительная модификация белков на модельной биологической системе желточных липопротеидов, продуктах пчеловодства как веществах природного происхождения, обладающие антиоксидант-ным действием, и сыворотке крови экспериментальных животных (крысы) наиболее показательно изменялась, по отношению к спонтанному окислению, при 430 нм и 530 нм (длинах волн, проявивших себя как маркерные).

Установлены возможности комплексного использования маркерных параметров оценки уровня спонтанной и Ре2+-инициированной окислительной модификации белков, коррелирующих с уровнем молекул средней массы, на модельной биологической системе желточных липопротеидов.

Выявлены тенденции увеличения величин окислительной модификации белков, регистрируемых при 430 нм и 530 нм, и молекул средней массы при Ре2+-индуцированном окислении, по отношению к спонтанному окислению, на модельной биологической системе желточных липопротеидов при добавлении продуктов пчеловодства как веществ природного происхождения, обладающих антиоксидантным действием, и сыворотки крови экспериментальных животных (крысы).

Показана перспективность комплексного использования модельной биологической системы желточных липопротеидов при одновременном до-

бавлении продуктов пчеловодства как веществ природного происхождения, обладающих антиоксидантным действием, и сыворотки крови экспериментальных животных (крысы) при спонтанном и Ре2+-индуцированном окислении: «желточные липопротеиды + продукты пчеловодства или сыворотка крови крыс», «желточные липопротеиды + продукты пчеловодства + сыворотка крови крыс».

Апробация диссертации.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на совещаниях кафедры биохимии Пензенского государственного университета, а также на:

■ XI межвузовской биохимической научно-практической конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2012,2013);

■ V Беломорском симпозиуме (Архангельск, 2013);

■ V ежегодной конференции «Балтийский форум. Актуальные проблемы анестезиологии и реаниматологии» (Светлогорск, 2012);

■ XVII Форума «Национальные дни лабораторной медицины России -2013» (Москва, 2012, 2013);

■ Девятой международной крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Судак, Крым, Украина, 2012,2013).

Публикации результатов исследования.

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе двух на международных научно-практических конференциях, 9 статей в российских рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученых степеней.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа иллюстрирована 8 таблицами, 31 рисунком. Список литературы включает 189 источников (140 отечественных, 49 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования.

Выбор применяемой нами модельной биологической системы оценки уровня окислительной модификации белков и молекул средней массы был обусловлен ее способностью реагировать на изменение уровня свободно-радикальных процессов.

В работе были использованы в качестве базовой модельной биологической системы желточные липопротеиды, полученные по методике Г.И. Клебанова и соавт. (1988). В соответствии с указанной методикой, желточные липопротеиды - одна из модельных систем, позволяющая оценить антиокси-дантную активность исследуемых веществ и чувствительная к инициации свободно-радикальных процессов ионами Fe2+.

К модельной биологической системе добавляли сыворотку крови белых беспородных крыс (самок и самцов) и продукты пчеловодства — прополис, гомогенат трутневого расплода, мед, маточное молочко (препарат «Апилак»), в виде 30 % водных растворов. Протокол приготовления растворов продуктов пчеловодства для исследования in vitro был стандартизирован. Растворы прополиса, гомогената трутневого расплода и препарата «Апилак» готовили по методике, аналогичной предложенной Е.А. Дубцовой (2009).

Продукты пчеловодства, по данным литературы (Ю.Л. Баймурзина, 2002; Л.Р. Ялалетдинова и соавт., 2011), обладают различной степени выраженности антиоксидантной активностью.

Считается, что по уровню белков трутневый расплод идентичен маточному молочку, но выраженно отличается от него по показателям окисляемо-сти. Трутневый расплод содержит меньшее количество ненасыщенных соединений, о чем свидетельствует показатель окисляемости, коррелирующий с меньшим количеством деценовых кислот. (Л.А. Бурмистрова, 1999.) По данным Т.В. Вахониной (1995), в личинках деценовые кислоты содержатся в основном в связанном состоянии, в виде эфиров с миристиновой, пальмитиновой, стеариновой и себациновой кислотами; их уровень в трутневом расплоде составляет около 42% от количества в маточном молочке.

Прополис может оказывать антикатаболический и антиоксидантный эффекты (Ш.М. Омаров, А.Ш. Омаров, 1995).

Н.И. Белостоцкий и соавт. (2009) отметили наличие у меда, маточного молочка и прополиса общего конечного функционального вектора воздействия на экспериментально вызванный язвенный процесс, а именно репарационного заживляющего вектора, который выражается в ускорении заживления язвенного дефекта. При этом конечный репарационный вектор является для различных исследованных продуктов результирующей различных по составу и интенсивности внутренних процессов, определяемых их функциональным воздействием на различные звенья патогенеза язвенного процесса. Для меда выделяют несколько элементов воздействия: стимуляция эндогенных анти-оксидантных систем, общее анаболическое действие, стимуляция цитопро-текции. Действие прополиса основано на его противовоспалительных и ан-

тиоксидантных свойствах. Маточное молочко обладает антиоксидантными свойствами и способно воздействовать на все виды метаболизма.

Продукты пчеловодства — это биологически активные вещества, содержащие белки, липиды, углеводы, витамины, минеральные вещества, энзимы, гормоны и благодаря своей высокой биологической активности способные влиять на множество функций организма (Е.А. Дубцова, 2009).

Таким образом, применение выбранной модельной биологической системы может служить основой для изучения окислительной модификации белков в комплексе с молекулами средней массы. Изучение биохимических особенностей продуктов пчеловодства по исследуемым тестам может быть перспективно в плане дальнейших разработок фармакологических препаратов и индикаторных тест-систем оценки свободно-радикальных процессов.

В соответствии с поставленной целью и задачами исследования были сформированы серии наблюдений в условиях спонтанного и Fe2+-индуцированного окисления:

I. в изучаемой модельной биологической системе (желточные липопро-теиды), а также в сыворотке крови крыс, продуктах пчеловодства (прополис, гомогенат трутневого расплода, мед, маточное молочко);

II. в модельной биологической системе с добавлением продуктов пчеловодства или сыворотки крови экспериментальных животных (крысы);

III. в модельной биологической системе с одновременным добавлением продуктов пчеловодства и сыворотки крови экспериментальных животных (крысы).

Экспериментальные животные содержались в стандартных условиях вивария на обычном рационе питания. Кровь у крыс забиралась из хвостовой вены, с соблюдением необходимых требований к проведению экспериментов.

В каждой серии наблюдений эксперименты проводили в 7 повторно-

стях.

Схема построения серий наблюдений в модельных биологических системах (МБС) в условиях спонтанного и Ре2+-индуцированного окисления показана на рисунке 1.

Изучались уровни окислительной модификации белков (ОМБ) в пуле молекул средней массы (МСМ) с помощью разработанного способа (патент на изобретение Российской Федерации № 2525437, в соавторстве).

Спецификой метода, используемого нами, является его нацеленность на увеличение информативности биохимических тестов определения МСМ и ОМБ путем исследования их в комплексе — в одной и той же пробе и снижение расхода биологического материала (рисунок 2). Т.е. одновременно в пробах производят определение уровня и МСМ, и ОМБ.

Для проведения измерений экстинкций МСМ (при 254 нм) и ОМБ (при 356 нм, 370 нм, 430 нм, 530 нм) использовался спектрофотометр СФ-2000 (лаборатория кафедры биохимии Пензенского государственного университета).

Рисунок 1. Схема построения серий наблюдений в модельных биологических системах (МБС) в условиях спонтанного и Ре2+-индуцированного окисления.

Рисунок 2. Схема метода оценки окислительной модификации белков в пуле

молекул средней массы.

Для обработки и интерпретации полученных результатов применены стандартные методы статистического анализа полученных данных с использованием компьютерной программы «Excel»: вариационная статистика для малых выборок с применением t-критерия Стьюдента, корреляционный анализ (С. Глянц, 1998).

Результаты собственных исследований.

В нашей работе применена модельная биологическая система желточных липопротеидов, на которой исследованы уровни окислительной модификации белков и молекул средней массы по запатентованному способу (патент на изобретение Российской Федерации № 2525437, в соавторстве).

Комплексная оценка величин МСМ и уровней ОМБ при спонтанном и Ре2+-индуцированном окислении проведена:

1) в модельной биологической системе желточных липопротеидов с добавлением и без добавления сыворотки крови крыс при спонтанном и Fe2+-индуцированном окислении (уровень МСМ показан на рисунке 3);

2) в модельной биологической системе желточных липопротеидов с добавлением и без добавления продуктов пчеловодства (уровень МСМ показан на рисунке 4);

3) в модельной биологической системе желточных липопротеидов с добавлением и без добавления продуктов пчеловодства и сыворотки крови крыс (уровень МСМ показан на рисунке 5)._

спонтанное окисление

индуцированное ионами железа (1!) окисление

желточные сыворотка крови сыворотка крови ЖЛП+сыворотка ЖЛП+сы воротка лигтопрогенды (самки! (самцы} крови (самки) крови (самцы]

(ЖЛП)

Рисунок 3. Уровни МСМ в модельной биологической системе желточных липопротеидов (ЖЛП) с добавлением и без добавления сыворотки крови крыс при спонтанном и Ре2+-индуцированном окислении (* - р<0,05 по отношению к желточным липопротеидам).

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

Г

■ спонтанное

■ индуцирован»«* ионами жалиаа (11)

желточный ЖЛП+прополис ЖЛГХ-мед ЖЛП+гомогеиат ЖЛП4*латочное липопрогеиды трутневого молочка

Рисунок 4. Уровни МСМ в модельной биологической системе желточных липопротеидов (ЖЛП) с добавлением и без добавления продуктов пчеловодства при спонтанном и Ре2+-индуцированном окислении _(* - р<0,05 по отношению к желточным липопротеидам)._

0,7 -

Рисунок 5. Уровни МСМ в модельной биологической системе желточных липопротеидов (ЖЛП) с добавлением и без добавления продуктов пчеловодства и сыворотки крови крыс при спонтанном и Ре2+-индуцированном окислении (* - р<0,05 по отношению к желточным липопротеидам).

В первом и втором случаях была установлена общая тенденция увеличения уровня МСМ при Ре2-индуцированном окислении, по сравнению со спонтанным окислением. Анализ уровней МСМ в модельной биологической системе желточных липопротеидов с добавлением продуктов пчеловодства и сыворотки крови крыс при спонтанном и Ре2+-индуцированном окислении показал аналогичные тенденции.

При использовании модельной биологической системы «желточные липопротеиды + сыворотка крови» выявлено, что уровень МСМ в ней меньше, чем в сыворотке крови самок и самцов (р<0,05): при спонтанном окислении - в 3 раза и в 3,3 раза соответственно; при Ре2+-индуцированном окислении - в 1,3 раза и 1,4 раза соответственно.

Уровень ОМБ, регистрируемый при 430 нм, рассмотрен аналогично анализу величин МСМ:

1) в модельной биологической системе желточных липопротеидов с добавлением и без добавления сыворотки крови крыс при спонтанном и Ре2+-индуцированном окислении (рисунок 6);

2) в модельной биологической системе желточных липопротеидов с добавлением и без добавления продуктов пчеловодства (рисунок 7);

3) в модельной биологической системе желточных липопротеидов с добавлением и без добавления продуктов пчеловодства и сыворотки крови крыс (рисунок 8).

В первом и втором случаях была установлена общая тенденция увеличения уровня ОМБ, регистрируемой при 430 нм, в условиях Ре2+-индуцированного окисления, по сравнению со спонтанным окислением, при добавлении к желточным липопротеидам сыворотки крови или продуктов пчеловодства. Анализ уровней ОМБ, регистрируемой при 430 нм, в модельной биологической системе с добавлением продуктов пчеловодства и сыворотки крови крыс при спонтанном и Ре2+-индуцированном окислении (третья серия наблюдений) показал аналогичные тенденции, за исключением модельной биологической системы «желточные липопротеиды + мед + сыворотка крови (самцы)»._

I I

ЖЛПныворол« жлгисыворожа

■ спонтанное окисление

! индуцированное ионами железа (И) окисление

Рисунок 6. Уровни ОМБ, регистрируемые при 430 нм, в модельной биологической системе желточных липопротеидов (ЖЛП) с добавлением и без добавления сыворотки крови крыс при спонтанном и Ре2+-индуцированном окислении (* - р<0,05 по отношению к желточным липопротеидам).

Рисунок 7. Уровни ОМБ, регистрируемые при 430 нм, в модельной биологической системе желточных липопротеидов (ЖЛП) с добавлением и без добавления продуктов пчеловодства при спонтанном и Ре2+-

индуцированном окислении _(* - р<0,05 по отношению к желточным липопротеидам)._

Рисунок 8. Уровни ОМБ, регистрируемые при 430 нм, в модельной биологической системе желточных липопротеидов (ЖЛП) с добавлением и без добавления продуктов пчеловодства и сыворотки крови крыс при спонтанном и Ре2+-индуцированном окислении (* - р<0,05 по отношению к желточным липопротеидам).

При использовании модельной биологической системы «желточные

липопротеиды + сыворотка крови» выявлено, что уровень ОМБ, регистрируемый при 430 нм, в ней выше, чем в сыворотке крови самок и самцов: при спонтанном окислении - в 1,1 раза; при Ре2+-индуцированном окислении - в 1,3 раза (р<0,05).

Уровень ОМБ, регистрируемый при 530 нм, рассмотрен аналогично анализу значений МСМ и величин ОМБ, определяемых при 430 нм:

1) в модельной биологической системе желточных липопротеидов с добавлением и без добавления сыворотки крови крыс при спонтанном и Ре2+-индуцированном окислении (рисунок 9);

2) в модельной биологической системе желточных липопротеидов с добавлением и без добавления продуктов пчеловодства (рисунок 10);

3) в модельной биологической системе желточных липопротеидов с добавлением и без добавления продуктов пчеловодства и сыворотки крови крыс (рисунок 11).

желточные сыворотка крови сыворотка крови ЖЛП+сыеоротка ЖЛП4сыворотка липопротеиды (самки) (самцы) крови (самки] крови (самцы)

(ЖЛП)

Рисунок 9. Уровни ОМБ, регистрируемые при 530 нм, в модельной биологической системе желточных липопротеидов (ЖЛП) с добавлением и без добавления сыворотки крови крыс при спонтанном и Ре2+-индуцированном окислении (* - р<0,05 по отношению к желточным липопротеидам).

желточные ЖЛП+прополис ЖЛП+мед ЖЛП+гомогенат ЖЛП+глаточное липоп роте иды трутневого молочко

(ЖЛЛ) расплода

Рисунок 10. Уровни ОМБ, регистрируемые при 530 нм, в модельной биологической системе желточных липопротеидов (ЖЛП) с добавлением и без добавления продуктов пчеловодства при спонтанном и Ре2+-индуцированном окислении _(* - р<0,05 по отношению к желточным липопротеидам)._

Рисунок 11. Уровни ОМБ, регистрируемые при 530 нм, в модельной биологической системе желточных липопротеидов (ЖЛП) с добавлением и без добавления продуктов пчеловодства и сыворотки крови крыс при спонтанном и Ре: -индуцированном окислении (* - р<0,05 по отношению к желточным липопротеидам).

В первом и втором случаях была установлена общая тенденция увеличения уровня ОМБ, регистрируемой при 530 нм, в условиях Ре2+-индуцированного окисления, по сравнению со спонтанным окислением, при добавлении к желточным липопротеидам сыворотки крови или продуктов пчеловодства. Исключение составила модельная биологическая система «желточные липопротеиды + маточное молочко», у которой не были обнаружены статистически значимые отличия по величине изучаемого теста от его значений в желточных липопротеидах.

Анализ уровней ОМБ, регистрируемой при 530 нм, в модельной биологической системе желточных липопротеидов с добавлением продуктов пчеловодства и сыворотки крови крыс при спонтанном и Ре2+-индуцированном окислении (третья серия наблюдений) показал аналогичные тенденции.

Таким образом, изучены биохимические характеристики модельной биологической системы желточных липопротеидов путем сравнительной оценки в условиях спонтанной и Ре2+-инициированной ОМБ и уровня МСМ для обоснования возможного их комплексного использования. Установлена чувствительность анализируемой модельной биологической системы к условиям Ре2+-индуцированного окисления, что проявилось изменением уровней анализируемых тестов, по сравнению со спонтанным окислением.

Выводы

1. При Ре2+-инициированной окислительной модификации белков, по сравнению со спонтанным окислением, уровни молекул средней массы на модельной биологической системе желточных липопротеидов, продуктах пчеловодства как веществах природного происхождения, обладающие ан-тиоксидантным действием, и сыворотке крови экспериментальных животных (крысы) проявили тенденцию увеличения значений.

2. Спонтанная и Ре2+-инициированная окислительная модификация белков и уровни молекул средней массы на модельной биологической системе желточных липопротеидов при добавлении к ней продуктов пчеловодства как веществ природного происхождения, обладающих антиоксидантным действием, и сыворотки крови экспериментальных животных (крысы) показали следующие тенденции:

2.1. увеличение уровня ОМБ, регистрируемой при 430 нм, в условиях Ре2+-индуцированного окисления, по сравнению со спонтанным окислением, при добавлении к желточным липопротеидам сыворотки крови или продуктов пчеловодства;

2.2. при 530 нм — аналогично, за исключением модельной биологической системы желточных липопротеидов с добавлением маточного молочка;

2.3. при использовании модельной биологической системы желточных липопротеидов с добавлением сыворотки крови выявлено, что уровень МСМ в ней меньше, чем в сыворотке крови самок и самцов (р<0,05): при спонтанном окислении - в 3 раза и в 3,3 раза соответст-

венно; при Ре2+-индуцированном окислении - в 1,3 раза и 1,4 раза соответственно.

3. Спонтанная и Fe2+-инициированная окислительная модификация белков и уровней молекул средней массы на модельной биологической системе желточных липопротеидов при одновременном добавлении продуктов пчеловодства как веществ природного происхождения, обладающих анти-оксидантным действием, и сыворотки крови экспериментальных животных (крысы) проявили аналогичные тенденции.

4. Выявлены возможности комплексного использования маркерных параметров оценки уровня спонтанной и Ре2+-инициированной окислительной модификации белков, коррелирующих с уровнем молекул средней массы, на модельной биологической системе желточных липопротеидов.

Практические рекомендации

1. Модельная биологическая система желточных липопротеидов позволяет оценить уровень ОМБ в пуле МСМ при комплексном их анализе на 430 нм и 530 нм.

2. Особенности изученной модельной биологической системы по уровням ОМБ различного характера могут служить биохимическими тестами, отличающими их реакционную способность в условиях спонтанного и Fe2+-индуцированного окисления.

3. Комплексное использование оценки уровня спонтанной и Fe2+-инициированной окислительной модификации белков, коррелирующих с уровнем молекул средней массы, на модельной биологической системе желточных липопротеидов может быть информативно для характеристики величин 2,4-динитрофенилгидразонов как маркерных биохимических тестов, отличающих спонтанное и Ре2+-индуцированное окисление.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Besruchko N.V., Vasilkov V.G., Kelina N.U., Osinkin D.V., Rubsov G.K. Program of clinical-laboratory monitoring biochemical markers of estimation from endogen intoksikation during chronicle and acute cholecystitis// Tomsk state pedagogical university bulletin. - 2011. - Vol. 8. - P. 115-118. (Журнал, реферируемый ВАК.)

2. Рубцов Г.К., Безручко Н.В., Васильков В.Г., Генгин М.Т., Кузнецова Е.А., Ганяева Н.Б., Козлова Г.А., Садовникова Д.Г., Дивеева Е.Ю., Широкина A.A., Кривченкова Е.В. Уровни каталазы, церулоплазмина, малонового диальдегида и пула молекул средней массы в оценке эндотоксикоза при холецистите// Обмен веществ при адаптации и повреждении (дни медицинской лабораторной диагностики): материалы XI региональной конференции с международным участием (г. Ростов-на-Дону, 28.02, 11-12.05 2012 г.) / Под ред. проф. З.И. Микашинович. - Ростов-на-Дону: ГБОУ ВПО РостГМУ. - 2012. - С. 44-47.

3. Келина Н.Ю., Безручко Н.В., Рубцов Г.К. Биохимические проявления эн-дотоксикоза: методические аспекты изучения и оценки, прогностическая значимость (аналитический обзор)// Вестник Тюменского государственного университета (серия медико-биологические науки). - 2012. - № 6. -С. 143-147. (Журнал, реферируемый ВАК.)

4. Безручко Н.В., Васильков В.Г., Рубцов Г.К., Генгин М.Т., Дивеева Е.Ю., Широкина A.A., Кривченкова Е.В. Биохимическая оценка эндотоксикоза при холецистите по соотношению уровней составляющих пула молекул средней массы в крови и моче// Известия ПГПУ им. В.Г. Белинского. Естественные науки. - 2012. - № 29. - С. 12-16. (Журнал, реферируемый ВАК.)

5. Безручко Н.В., Рубцов Г.К., Анопин К.Д., Кривченкова Е.В. Клинико-биохимические перспективы разработки неинвазивных методов оценки эндогенной интоксикации, значение показателей мочи и слюны// Технологии живых систем. - 2013. - № 1. — С. 47-52. (Журнал, реферируемый ВАК.)

6. Рубцов Г.К., Безручко Н.В., Садовникова Д.Г., Козлова Г.А., Анопин К.Д. Клинико-биохимическое значение комплексного изучения молекул средней массы и окислительной модификации белков для оценки эндотоксикоза// Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -2013. -№ 2. - С. 41-47. (Журнал, реферируемый ВАК.)

7. Безручко Н.В., Рубцов Г.К. Модельные биологические системы и метод оценки спонтанной и инициированной окислительной модификации белков в пуле молекул средней массы// Технологии живых систем. - 2013. -№ 5. - С. 46-50. (Журнал, реферируемый ВАК.)

8. Рубцов Г.К., Безручко Н.В., Генгин М.Т. Разработка и оптимизация модельных биологических систем для оценки уровня ОМБ в пуле МСМ// Обмен веществ при адаптации и повреждении (дни медицинской лабораторной диагностики): материалы XII межвузовской биохимической научно-практической конференции с международным участием.. - Ростов-на-Дону: ГБОУ ВПО РостГМУ. -2013. - С. 59-63.

9. Рубцов Г.К. Комплексное применение модельных биологических систем для оценки окислительной модификации белков в пуле молекул средней массы// Вестник Томского государственного педагогического университета. - 2013. - № 8. - С. 81-90. (Журнал, реферируемый ВАК.)

10.Безручко Н.В., Рубцов Г.К., Генгин М.Т. Обоснование подходов комплексного использования модельных биологических систем для изучения спонтанной окислительной модификации белков в пуле молекул средней массы// Сборник докладов и тезисов V Беломорского симпозиума. — Архангельск: СГМУ, 2013. - С. 86-87.

П.Рубцов Г.К., Безручко Н.В., Генгин М.Т., Васильков В.Г., Борисова Е.Ю., Анопин К.Д., Васильева А.Д., Садовникова Д.Г., Козлова Г.А., Кручинина А.Д., Гамзин С.С. Методика анализа окислительной модификации белков

в пуле веществ средней молекулярной массы// Клиническая лабораторная диагностика. - 2013. - № 9. - С. 93. (Журнал, реферируемый ВАК.)

12.Рубцов Г.К., Безручко Н.В., Генгин М.Т. Методологическое обоснование комплекса модельных биологических систем оценки окислительной модификации белков в пуле молекул средней массы// Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии: материалы восьмой международной крымской конференции. - Судак, Крым, Украина: ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ РФ. -2013. — С. 60.

13.Рубцов Г.К., Безручко Н.В. Модельная биологическая система желточных липопротеидов: параметры инициированной окислительной модификации белков в пуле молекул средней массы// Вестник Тверского государственного университета. Серия «Биология и экология». — 2014. - Вып. 2 . -С. 30-37. (Журнал, реферируемый ВАК.)

14.Рубцов Г.К., Безручко Н.В., Генгин М.Т., Васильков В.Г., Борисова Е.Ю., Анопин К.Д., Васильева А.Д., Садовникова Д.Г., Козлова Г.А., Кручинина А.Д., Гамзин С.С. Применение анализа окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы в клинико-биохимической оценке эндотоксикоза при холецистите// Эфферентная терапия. - 2014. - Т. 20, № 1. Специальный выпуск - материалы V Балтийского форума «Актуальные проблемы анестезиологии и реаниматологии». — С. 25. (Журнал, реферируемый ВАК.)

15.Безручко Н.В., Рубцов Г.К. Методология и метод оценки окислительной модификации белков в комплексе с молекулами средней массы, перспективы их применения// Вестник Томского государственного педагогического университета. - 2014. -№ 8. - С. 185-189. (Журнал, реферируемый ВАК.)

Учебное пособие

Безручко Н.В., Рубцов Г.К., Борисова Е.Ю. Медицинская биохимия: Учебный комплекс. - Пенза: Изд-во ПГУ, 2013. - 76 с. (Данное учебное пособие было представлено на IV Дальневосточный региональный конкурс изданий высших учебных заведений «Университетская книга — 2013» и награждено грамотой: выписка из протокола заседания жюри № 4 от 01.10.2013.')

Патент на изобретение Рубцов Г.К., Безручко Н.В., Генгин М.Т., Васильков В.Г., Борисова Е.Ю., Анопин К.Д., Васильева А.Д., Садовникова Д.Г., Козлова Г.А., Кручинина А.Д., Гамзин С.С. Способ определения окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы в сыворотке крови, плазме, эритроцитах и в моче. — Патент на изобретение № 2525437. Заявка на патент на изобретение Российской Федерации № 2012153044, приоритет от 7.12.2012, решение о выдаче патента от 14.04.2014, заявитель - Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пензенский государственный университет».

Подписано в печать 30.11.2014. Бумага офсетная. Печать оперативная. Тираж 100 экз. Заказ № 35. Отпечатано в типографии ООО «ИМА-Пресса». г. Пенза, ул. Куйбышева, д. 11. телефон: 34-31-78