Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моделирование синуклеинопатии у трансгенных животных с целью изучения механизма действия нейропротекторных препаратов

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Моделирование синуклеинопатии у трансгенных животных с целью изучения механизма действия нейропротекторных препаратов"

084612012

На правах рукописи

Устюгов Алексей Анатольевич

Моделирование синуклеинопатии у трансгенных животных с целью изучения механизма действия нейропротекторных препаратов

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010 <| рПЯ 7(]"Л)

004612012

Работа выполнена в лаборатории нейрохимии и лаборатории генетического моделирования нейродегенеративных процессов Учреждения Российской академии наук Института физиологически активных веществ РАН

Научные руководители: кандидат биологических наук

Н. Н. Нинки на

доктор химических наук, член-корреспондент РАН, профессор С. О. Бачурин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, член-корреспондент

РАМН, профессор К. Н. Ярыгин

кандидат биологических наук И. Ю. Шамакина

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биологии гена РАН

Защита состоится « // » ЦОЯк, 2010 г. в _ часов на заседании

Диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н.Баха по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

Автореферат разослан « -7 » $ ¿"Р? 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В основе патогенеза многих нейродегенеративных заболеваний (НДЗ) лежит нарушение конформации определённых белков с последующей их агрегацией и формирование фибрилл, что приводит к образованию в нервной системе характерных патологических образований: сенильных бляшек, нейрофибриллярных клубков, телец Леви, прионовых бляшек и других патологических отложений. Множественность и распространенность этих патологических образований в пораженных отделах нервной системы прямо коррелирует с тяжестью заболевания. Накопление в тканях нервной системы промежуточных продуктов белковой агрегации - олигомеров и протофибрилл, многие из которых обладают цитотоксическими свойствами, приводит к функциональным нарушениям и, в итоге, к гибели нейронов. Конечные продукты белковой агрегации - фибриллярные и аморфные отложения - могут достигать больших размеров, часто соизмеримых с размерами самих нервных клеток, и, накапливаясь в пораженных тканях по мере прогрессирования нейродегенера-тивного заболевания, также могут становиться причиной гибели клеток. Такой тип патологии, получивший название протеинопатии, объединил в одну группу неврологические расстройства с существенно различающимися клиническими проявлениями. К протеинопатиям относят болезнь Альцгеймера, болезнь Пар-кинсона, хорею Гентингтона, боковой амиотрофический склероз и ряд демен-ций, также характеризующихся присутствием различного типа патологических включений. В связи с ростом распространённости этих заболеваний в развитых странах становятся все более актуальными изучение тонкого механизма патологических процессов данного типа и разработка нового поколения лекарственных препаратов, действие которых будет патогенетически обосновано. В настоящее время в терапии НДЗ используются в основном симптоматические средства. Разрабатываются, однако, и новые препараты, положительные эффекты которых обусловлены воздействием на ключевые звенья патогенеза. Одним из них является отечественный препарат димебон. Детальная характеристика патогенетических механизмов НДЗ, на которые он влияет, позволит наметить

стратегию поиска и создания нового поколения препаратов для лечения про-теинопатий, основанную на знании молекулярных и клеточных механизмов развития этих болезней.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования является разработка генетической модели, воспроизводящей ключевые звенья протеинопа-тий для изучения молекулярного механизма действия димебона и скрининга новых лекарственных препаратов, действующих на патогенез нейродегенера-тивных заболеваний.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать прогрессирующую гамма-синуклеинопатию, воспроизводящую в трансгенных мышах линии ТЬу ] ключевые звенья патогенеза нейродегенеративных заболеваний человека с прогрессивным накоплением белковых включений амилоидного типа:

а) проанализировать возрастную динамику уровня экспрессии и накопления в клетках нервной системы трансгенных животных экзогенного гамма-синуклеина;

б) проанализировать количество и распределение патологических включений, сформированных конечными продуктами белковой агрегации гамма-синуклеина, в тканях нервной системы трансгенных животных на разных стадиях патологии;

в) выявить корреляцию между развитием клинических симптомов нейроде-генеративного процесса и накоплением в нервной системе гистопатоло-гических структур, основой которых является гамма-синуклеин.

2. Изучить механизм действия отечественного препарата димебон и выявить его возможные молекулярные мишени, используя трансгенных мышей линии ТЬу 1 пг/БЫ в качестве модели прогрессирующей гамма-синуклеинопатии:

а) оценить влияние димебона на развитие клинических проявлений нейро-нальной патологии в модели прогрессирующей гамма-синуклеинопатии;

б) исследовать влияние димебона на процесс формирования и/или стабильности гистопатологических амилоидных структур в нервной системе трансгенных животных;

в) изучить влияние димебона на специфическую нейровоспалительную реакцию, сопровождающую нейродегенеративный процесс.

Научная новизна работы. В ходе выполнения работы получены оригинальные данные по характеристике новой модельной системы синуклеинопатии в трансгенных мышах, воспроизводящей основные звенья патогенеза нейроде-генеративных процессов, начиная от изменения уровня синтеза и локализации ключевого белка протеинопатии, и заканчивая массированным формированием патологических белковых включений амилоидного типа в тканях нервной системы с развитием тяжелой неврологической патологии и преждевременной гибелью модельных животных. Впервые для изучения механизма действия отечественного лекарственного препарата димебон, обладающего выраженными нейропротекторными свойствами, были использованы модельные трансгенные животные. Получены новые важные данные о подавлении димебоном образующихся агрегатов амилоидного типа, являющихся основой патологических белковых включений.

Практическая значимость. Установлено, что в использованной генетической модели - трансгенных мышах линии Thy lmySN - воспроизводятся ключевые звенья патогенеза протеинопатий, лежащих в основе многих нейродеге-неративных заболеваний человека: образование амилоидных включений в различных отделах нервной системы, поражение моторных нейронов спинного мозга и, как результат, моторная дисфункция. Таким образом, данная линия трансгенных животных на сегодняшний день является одной из самых адекватных моделей для изучения молекулярного механизма развития протеинопатий человека и может успешно использоваться для тестирования потенциальных нейропротекторных препаратов.

Полученные результаты являются первым прямым указанием на то, что отечественный препарат димебон может непосредственно влиять на молеку-

лярно-клеточные процессы образования и/или распада патологических белковых отложений, образованных агрегированными формами амилоидогенного белка, что служит основанием для дальнейшей работы по созданию лекарственного средства на его основе.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 4-й конференции «Успехи в изучении молекулярных механизмов неврологических нарушений» (ESN Conference on Advances in Molecular Mechanisms of Neurological Disorders, Лейпциг, Германия, 2009), на 5-м Международном междисциплинарном конгрессе «Нейрохимия для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2009), на 11-м Международном симпозиуме по достижениям в области терапии болезни Альцгеймера (llth International Geneva/Springfield Symposium on Advances in Alzheimer Therapy, Женева, Швейцария, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 статьи в периодических изданиях, соответствующих Перечню ВАК, и 4 работы в сборнике материалов докладов научных конференций.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методов и материалов, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 120 страницах и иллюстрирована 27 рисунками, 3 таблицами и 1 схемой. Список цитируемой литературы включает 150 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Лабораторные зкиеотные. Линия трансгенных по гамма-синуклеину мышей ThylmySN была получена из лаборатории В.Л. Бухмана (University of Cardiff, Великобритания). Данные трансгенные животные, характеризующиеся высоким уровнем экспрессии гамма-синуклеина, были созданы путем встраивания в геном мышей инбредной линии C57B16J экспрессирующей кассеты, содержащей нормальный кДНК ген гамма-синуклеина мыши под Thy-1 промотором, который обеспечивает экспрессию экзогенного белка в нейронах. Колония ThylmySN поддерживалась путём скрещивания гемизиготных по трансгену

мышей. Экспериментальные и контрольные группы животных были сформированы из потомства от скрещивания гемизиготных родителей. В экспериментах использовались когорты гомозиготных по трансгену самцов и самцов дикого типа. Определение количества трансгенных аллелей в геноме проводилось с помощью количественной ПЦР в реальном времени.

Введение препарата димебоп. Экспериментальные животные получали препарат димебон (3,6-диметил-9-(2-метил-пиридил-5)-этил-1,2,3,4-тетрагидро-у-карболин дигидрохлорид) с питьевой водой (10 мкг/мл), доступ к воде не ограничивался. Питьевой раствор меняли 3 раза в неделю.

Методы анализа состояния нервной системы экспериментальных животных. Анализ равновесия и координации животных проводился с помощью теста на вращающемся стержне (Rotarod Ugo Basile 7650, США) и теста на способность развернуться и пройти по горизонтальной перекладине («Beam test system»). Анализ походки проводили в узких камерах длиной 50 см. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью непараметрического критерия Колмогорова-Смирнова.

Гистохимический анализ. Спинной и головной мозг фиксировали в холодном растворе Карнуа. После дегидратации образцы заключали в парафин. Срезы толщиной 8 мкм приготавливали с помощью ротационного микротома Leica RM2265 и монтировали на предметные стекла SuperFrost (BDH, Poole, Великобритания). Срезы депарафинизировали в ксилоле с последующей регид-ратацией в серии спиртов понижающейся концентрации.

Для выявления амилоидных включений проводили окраску срезов в 0.5% растворе Конго красного (Sigma, США) в 50% этаноле при комнатной температуре. Фиксацию окраски осуществляли в 0.2% КОН в 80% этаноле. Срезы промывали дистиллированной водой, дегидратировали в серии спиртов и ксилоле и заключали в синтетическую среду DPX (BDH, Великобритания). Анализ и регистрацию изображения проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DMI 4000В. Микрофотографии получали при помощи фотокамеры Leica

DFS 490 и программного обеспечения Leica Application Suite 2.8.1 (Leica Microsystems, Германия).

Иммуногистохимический анализ. Спинной и головной мозг фиксировали 4% раствором параформальдегида в фосфатном буфере. После дегидратации образцы заключали в парафин. Срезы толщиной 8 мкм монтировали на стекла Gold Seal Slides (Gold Seal Products, Великобритания). После депарафинизации препараты инкубировали в 3% растворе Н2О2 в метаноле для инактивации эндогенной пероксидазы. Для детекции маркерного белка активированных астро-цитов использовали поликлональные антитела кролика против ГФКБ (глиаль-ного фибриллярного кислого белка) (DAKO, США) в разведении 1:1000; для детекции гамма-синуклеина использовали аффинно-очищенные поликлональные антитела кролика против гамма-синуклеина мыши (клон SK23) в разведении 1:300; для детекции убиквитинированых белков использовали монокло-нальные антитела мыши rnAb 1510 (Chemicon, США) в разведении 1:300. Реакцию с первичными антителами проводили при температуре +4°С в течение ночи. В качестве вторичных антител были использованы: антитела козы к IgG кролика, меченные FITC (Invitrogen, США, 1:200), антитела козы к IgG мыши, меченные Alexa Fluor 546 (Invirtogen, США, 1:500), антитела козы к IgG кролика, конъюгированные с пероксидазой (Vectastain ABC kit, Vector Laboratories, Великобритания, 1:200). Реакцию со вторичными антителами проводили в течение 30 минут при комнатной температуре. При использовании вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой, для визуализации использовали DAB (Thermo Scientific, США). Дегидратацию срезов проводили в серии спиртов и ксилоле и заключали в синтетическую среду DPX (BDH, Великобритания). Анализ и регистрацию изображения проводили как описано в предыдущем разделе.

Анализ содержания и клеточной локализации белков. Анализ содержания белков в тканях нервной системы проводили с помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле. Использовали цитоплазматическую фракцию, полученную путем гомогенизации ткани в стандартном буфере Трис-

Тритон. Для анализа агрегированных белковых форм использовали метод частичного дифференциального фракционирования высокосолевыми буферами с различным содержанием детергентов Тритон Х100 и SDS, с последующим высокоскоростным центрифугированием при lOOOOg при +4°С в присутствии набора ингибиторов протеаз Complete Mini (Roche, Германия). Специфическую детекцию различных белков проводили методом иммуноблоттинга. Для этого белки после разделения в денатурирующем полиакриламидном геле переносили на PVDF-мембрану Hybond-P (Amersham Biosciences, США) в камере для блоттинга на приборе Hoefer ТЕ70 (Amersham Biosciences, США). Мембрану блокировали в растворе 5% сухого обезжиренного молока при комнатной температуре и инкубировали в растворе первичных антител при +4°С в течение ночи. Для детекции гамма-синуклеина использовали поликлональные аффинно-очищенные антитела кролика (клон SK23); альфа-синуклеина - моноклональ-ные (клон 42) (BD Transduction Laboratories, США); бета-синуклеина - моно-клональные (клон 8) (BD Transduction Laboratories, США); ГФКБ - поликлональные аффинно-очищенные антитела кролика (Sigma, США). Все первичные антитела были использованы в разведении 1:10000. В качестве внутреннего контроля использовали моноклональные антитела (клон 6С5) против глице-ральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (ГАФДГ) (Santa Cruz Biotechnology, США). В качестве вторичных антител были использованы антитела козы к IgG кролика или мыши конъюгированные с пероксидазой хрена (Amersham, Великобритания, 1:5000). Реакцию со вторичными антителами проводили в течение 2 часов при комнатной температуре. После инкубации мембрану отмывали и проводили хемилюминесцентную детекцию с помощью ECL-реагентов (Amersham, Великобритания) по протоколу производителя. Оценку и анализ экспрессии белков проводили при помощи установки Alphalmager 2200 и программного обеспечения AlphaEase 220 Analysis Software (Alpha Innotech Corporation, США).

Анализ экспрессии РНК. Для выделения тотальной РНК из нервной ткани использовали набор RNAEasy plus (Qiagen, США) согласно инструкции производителя, который содержит дополнительную ступень очистки от приме-

сей геномной ДНК на g-колонках. 1 мкг тотальной РНК использовали в реакции обратной транскрипции, сопряженной с амплификацией, с использованием вырожденных гексамерных праймеров (Promega, США) и обратной транскрип-тазы SuperScriptHI и Taq-полимеразы (Invitrogen, США). Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для количественной ПЦР в реальном времени, проведенной на установке StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США) с использованием набора DyNAmo HS SYBR Green supermix (Finn-zymes, Финляндия) и референтного красителя ROX. В качестве внутреннего контроля был взят уровень экспрессии гена ГАФДГ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Характеристика синуклеинопатии, вызванной повышенной экспрессией экзогенного гамма-синуклеина в трансгенных мышах линии

ThylmySN

Моделирование протеинопатии. В данной работе была использована линия трансгенных мышей ThylmySN, характеризующихся повышенным уровнем экспрессии гамма-синуклеина мыши. Применение для получения трансгенных животных пан-нейронального промотора Thy-1 обеспечило экспрессию экзогенного гамма-синуклеина в различных типах нейронов практически всех отделов нервной системы. Основная колония поддерживалась как группа геми-зиготных животных на чистой C57B16J генетической основе. В экспериментах использовались когорты гомозиготных особей и особей дикого типа, полученные в результате скрещивания гемизиготных общих родителей. Трансгенные гомозиготные животные жизнеспособны, фертильны, не имеют выраженных признаков патологии и практически неотличимы от мышей дикого типа в первые месяцы жизни, несмотря на высокий уровень экспрессии мРНК гамма-синуклеина во всех отделах нервной системы. Однако с возрастом у всех особей, как самок, так и самцов, развиваются признаки нейрональной дегенерации.

А. ТЬуШуБМ

В. дикий тип

Г. ТЪу1ту8К

Рис. 1. Развитие неврологического фенотипа у трансгенных животных с повышенной экспрессией гамма-синуклеина в нервной системе. А. Нарушение рефлекса переворачивания. Б. Характерная патологическая посадка с выгнутой спиной. Сведение конечностей (рефлекс клешни) наблюдается у трансгенных животных (Г), но не у животных дикого типа (В).

Нами были охарактеризованы основные проявления патологического процесса, который является следствием накопления в нервной системе трансгенных животных белка гамма-синуклеина. Нарушения локомоторной функции, как следствие поражения спинного мозга, оценивались по анализу походки и тесту на вращающемся стержне. К двенадцати месяцам

9 месяцев

дикиитип

Т11у1ту8Ы

12 месяцев

дикиитип

ТЬу1ту8Ы

*.

I

V-

к

отмечались выраженное нарушение рИс. 2. Анализ походки. Развитие пара-

походки, асимметричная потеря лича конечностей с возрастом. Маркировка передних конечностей - красный двигательной функции (первыми цвет, задних конечностей-синий цвет.

всегда поражались передние конечности), патологическая посадка с выгнутой

спиной, терялась способность животными разводить конечности в вертикальном положении - рефлекс «клешни» (рис. 1 и 2). Фенотипические признаки нейрональной патологии у гомозиготных животных отмечались, начиная с 6-ти месячного возраста, а к 12-ти месячному возрасту уже практически все выжившие особи находились на терминальной стадии заболевания.

Анализ экспрессии трансгена на уровне мРНК и белка. Высокий уровень экспрессии экзогенного гамма-синуклеина наблюдался в нейронах трансгенных животных через несколько недель после рождения. Thy- 2 промотор неактивен в период эмбрионального развития и в раннем постнатальном периоде, что позволяет избежать влияния экзогенного белка на процессы становления и развития нервной системы. Поскольку Thy-1 промотор является пан-нейрональным и регулирует экспрессию генов в подавляющем большинстве нейронов всех типов и отделов нервной системы, то и экспрессия экзогенного гамма-синуклеина регистрировалась на высоком уровне во всех отделах нервной системы, даже в тех нейронах, где в норме содержание эндогенного гамма-синуклеина невысоко.

Уровень экспрессии мРНК гамма-синуклеина в нервных тканях животных был проанализирован методом количественной ПЦР в реальном времени. Уровень экспрессии экзогенного гамма-синуклеина в тканях спинного мозга молодых трансгенных животных был почти в 8 раз выше, чем уровень экспрессии эндогенного гамма-синуклеина у мышей дикого типа в ткани ганглиев тройничного нерва (ГТН), где в норме наблюдается наиболее высокий уровень экспрессии эндогенного гамма-синуклеина (рис. 3). У животных же, несущих обе аллели трансгена, уровень экспрессии был ещё выше и в 16 раз превышал уровень экспрессии эндогенного гамма-синуклеина в ГТН животных дикого типа.

На фоне высокой экспрессии трансгена наблюдалось значительное накопление белка гамма-синуклеина в тканях всех отделов нервной системы модельных животных. На рис. 4 представлены результаты анализа содержания гамма-синуклеина методом иммуноблоттинга в тканях коры головного мозга,

мозжечка, грудного отдела спинного мозга и полосатого тела у трансгенных и

контрольных животных. А.

20-,

18 16 14 12 10 8 б 4 2 0

Б.

3 о.

ДТ

14 12

10 8 6 4 2 0

, геми гомо,

8 нед: ГШ спинной мозг

I ДТ гомо, | ДТ гомо, 12 мес: КСМ

спинон мозг

Рис. 3. Анализ экспрессии мРНК гамма-синуклеина в тканях нервной системы животных дикого типа (ДТ) и трасгенных животных, содержащих одну аллель трансгена (геми) или обе аллели трансгена (гомо). На гистограмме А показано увеличение уровня экспрессии мРНК гамма-синуклеина, выявленное с помощью количественной ПЦР в реальном времени, в спинном мозге взрослых 8-ми недельных трансгенных мышей по отношению к уровню мРНК в ганглиях тройничного нерва (ГТН) у мышей дикого типа того же возраста. На гистограмме Б показано увеличение уровня экспрессии мРНК гамма-синуклеина в ганглиях задних корешков спинного мозга (КСМ) и в тканях спинного мозга у 12-ти месячных трансгенных животных по сравнению с животными дикого типа.

У животных дикого типа количество эндогенного гамма-синуклеина во всех исследованных тканях было сравнительно невысоко (рис. 4А). Для всех исследованных областей головного и спинного мозга количество экзогенного гамма-синуклеина у трансгенных животных значительно превышало количество эндогенного гамма-синуклеина у животных дикого типа. Даже при короткой экспозиции рентгеновской пленки детектируется сигнал, намного превосходящий по интенсивности сигнал от эндогенного гамма-синуклеина. Повышенный уровень содержания гамма-синуклеина был обнаружен в тканях нервной системы как геми-, так и гомозиготных животных. При этом количество синтези-

рованного белка у гомозиготных животных заметно превышало таковое у геми-зиготных (рис. 4Б).

А. I—дг—11-гомо -1

В»-«- 37кДа

] Д (1) ] | | "гт И- иШ' ШШ0 '

у-синуклеин

у-синуклеин

-ДТ—| |- гомо

17 кДа

«о ИЩ « 17кДа

1:1000 1:500 1:250

Б.

мозжечок

/ / Ф

у-синуклеин

а-синуклеин

(3-синуклеин

КГМ / / $

полосатое тело спинной мозг

/ / Ф

№ <7Т

$ I»

о»

ГАФДГ

Рис. 4. Иммунодетекция гамма-синуклеина в нервной ткани 12-ти месячных животных дикого типа и трансгенных животных. Пробы нормированы по количеству общего белка. В качестве внутреннего контроля использовалось выявление ГАФДГ. А. Сравнение содержания гамма-синуклеина в спинном мозге гомозиготных трансгенных мышей и животных дикого типа. Нижний ряд: то же количество тотального белка в образцах из тканей животных дикого типа и разведения 1:1000, 1:500 и 1:250 для образцов из тканей трансгенных животных. Б. Сравнение содержания гамма-синуклеина в различных отделах нервной системы у гомо- и гемизиготных трансгенных животных и животных дикого типа. Нижний ряд: иммунодетекция альфа- и бета-синуклеина в тех же образцах.

Был изучен также уровень экспрессии других двух членов семейства си-нуклеинов: альфа- и бета-синуклеина. Известно, что в случае нокаутных животных отсутствие гамма-синуклеина не приводит к изменению экспрессии

альфа- или бета-синуклеина, хотя функция отсутствующего гамма-синуклеина полностью компенсируется, по крайней мере, в первой половине жизни. При исключении гена, кодирующего гамма-синуклеин, из генома мыши, происходит функциональная компенсация, однако не за счёт усиления экспрессии двух других членов семейства. С другой стороны, при повышении количества гамма-синуклеина за счёт оверэкспрессии гена в нейронах также не влияет на метаболизм альфа- и бета-синуклеина (рис. 4Б).

Гистологический анализ тканей нервной системы трансгениых животных линии ТНу1туБ№ Иммуногистохимический анализ препаратов головного и спинного мозга ТЬу 1 туЯЛ трансгенных мышей с использованием специфических поликлональных антител против гамма-синуклеина мыши также показал высокий уровень содержания гамма-синуклеина во всех отделах нервной системы и в различных типах нейронов. Большое количество гамма-синуклеин реактивного белка было зафиксировано в подавляющем большинстве нейронов, а не только в нервных клетках, для которых характерно присутствие эндогенного гамма-синуклеина. Накопление в тканях нервной системы трансгенных животных экзогенного гамма-синуклеина сопровождалось образованием внутриклеточных патологических структур.

Патологические включения, образованные гамма-синуклеином Большинство нейронов в тканях трансгенных животных имело диффузное распределение вновь синтезированного гамма-синуклеина в цитоплазме и отростках. При этом у животных с выраженными признаками нейрональной патологии в большом количестве клеток были выявлены образованные гамма-синуклеином цитоплазматические включения, которые присутствовали во всех отделах нервной системы, но наибольшее их количество обнаруживалось в спинном мозге.

Примеры характерных гистопатологических включений, обнаруживаемых на срезах спинного мозга трансгенных животных при окрашивании антителами против гамма-синуклеина, приведены на рис. 5. Они имеют различную форму и внутриклеточную локализацию. В цитоплазме нейронов трансгенных животных выявляются крупные сфероидные образования, а также структуры,

напоминающие тельца Леви; отложения в отростках имеют форму точечных включений по длине отростка и крупных раздутых удлиненных формирований. Окраска гематоксилин-эозином препаратов, ранее окрашенных антителами против гамма-синуклеина, показала, что выявленные гамма-синуклеин реактивные включения являются одновременно эозинофильными.

А. дикий тип Б. ТЬу1шу8К В. дикий тип Г. ТЬу 1 шуБК

ШШНННМИВНВШВШВН явннниннш ИЕШЯЭШЁ ¥у' ...............

' , 1§ЙЁ1 •

--■■-у;,::,,. -у Ч

— .. - т-—

Рис. 5. Иммуногистохимическая окраска срезов спинного мозга 12-ти месячных мышей антителами против гамма-синуклеина. А, Б. Увеличение 100Х. В, Г. Увеличение 400Х. Шкала 25 мкм. Стрелками указаны патологические гамма-синуклеин реактивные включения, выявляемые в тканях трансгенных животных: сфероиды (острие стрелки), аномальные нейриты (сплошная стрелка) и внутриклеточные включения (тонкая стрелка).

Интересно отметить, что подобные патологические структуры выявляются при нейродегенеративных заболеваниях, вызванных нарушением метаболизма другого члена семейства синуклинов - альфа-синуклеина, где он является одним из основных компонентов характерных гистопатологических структур -телец Леви. В ряде случаев при синуклеинопатиях описаны похожие патологии нейритов.

Формируемые в тканях нервной системы трансгенных животных патологические включения специфически окрашиваются Конго красным (рис. 6), что является характерным признаком амилоидных структур. По мере прогрессиро-вания протеинопатии с возрастом в тканях спинного мозга трансгенных животных происходит накопление амилоидных включений, при этом их количество коррелирует с выраженностью клинических симптомов нейрональной дис-

А. ТЪу1шу8К

Б. дикий тип

» * . ■.

Г* И

V

/

•• . • »' —

Рис. 6. Окраска амилоидных включений Конго красным в препаратах грудного отдела спинного мозга трансгенных животных (А) и животных дикого типа (Б) в возрасте 12-ти месяцев.

функции. Таким образом, повышенная эктопическая экспрессия гамма-синуклеина в нервной системе трансгенных животных приводит к образованию патологических белковых амилоидных включений и развитию протеинопатии.

Анализ нейровоспалительной реакции при развивающейся протеинопатии. Нейродегенеративные процессы обычно сопровождаются специфической нейровоспалительной реакцией и активацией глии. У трансгенных животных с агрегацией гамма-синуклеина наблюдалась активация астроглии, что яв-

Б. дикий тип

У,

(у

г, -

1

Рис. 7. Астроглиоз при развитых формах гамма-синуклеинопатии. Иммуногистохимическое выявление ГФКБ на срезах спинного мозга трансгенных животных (А) и животных дикого типа (Б) в возрасте 12-ти месяцев.

ляется характерным признаком нейроинфламмации. На срезах спинного мозга в сером веществе наблюдается большое количество клеток, морфологически соответствующих активированным астроцитам и положительно окрашиваемых на специфический маркер астроглиоза - ГФКБ. В образцах спинного мозга контрольных животных того же возраста активированные астроциты практически отсутствовали (рис. 7). Таким образом, астроглиоз сопровождал гамма-синуклеинопатию, что было показано при анализе различных отделов спинного мозга (шейного, грудного и поясничного) трансгенных животных на продвинутых стадиях развития протеинопатии.

2. Использование модельной системы гамма-синуклеинопатии для изучения механизма действия отечественного препарата димебон

Трансгенные животные линии ThylmySN были применены в качестве ш vivo модели для изучения механизма действия отечественного препарата димебон, обладающего выраженными нейропротекторными свойствами. Результаты 2-й фазы клинических испытаний показали, что димебон существенно улучшает когнитивную функцию при болезни Альцгеймера у пациентов со средней тяжестью заболевания. Показатели когнитивных функций пациентов, получавших димебон 26 или 52 недель, были существенно лучше не только по сравнению с контрольной группой, получавшей плацебо, но и по сравнению с их исходным состоянием. Эти результаты позволили высказать предположение, что димебон может быть отнесён к потенциальным болезнь-модифицирующим агентам, воздействующим непосредственно на патогенез заболевания. Болезнь Альцгеймера является классической протеинопатией, при которой выявляются внеклеточные отложения в виде сенильных бляшек, основным компонентом которых является Ар-пептид, а также внутриклеточные нейрофибриллярные клубки с основным компонентом в виде гиперфосфорилированного фибриллярного белка тау, который в норме ассоциирован с микротрубочками. Различные типы нейродегенераций имеют общее патогенетическоге звено - образование белковых агрегатов, что объединяет их в группу протеинопатий. Получен-

ные результаты дают основание полагать, что димебон может либо действовать на стабильность уже предсформированных агрегатов, например, активируя внутриклеточные системы очистки от патологических структур, либо препятствовать формированию амилоидогенным белком новых агрегатов.

Охарактеризованная в предыдущей главе модель гамма-синуклеинопатии в трансгенных животных была использована для изучения молекулярно-клеточного механизма действия препарата димебон. Гомозиготные трансгенные животные получали димебон с питьевой водой в концентрации 10 мкг/мл в свободном доступе. Животные были разбиты на следующие группы: первая группа начинала получать димебон в 3-х месячном возрасте (до появления первых признаков нейрональной патологии); вторая группа начинала получать димебон в 6-ти месячном возрасте, когда клинические симптомы нейрональной патологии были уже ярко выражены; третья (контрольная) группа трансгенных животных того же возраста димебон не получала, при этом содержалась параллельно в идентичных условиях с экспериментальными животными.

Результаты анализа равновесия и координации животных на «вращающемся стержне» показали, что обе группы трансгенных мышей, получавших димебон, находились на более ранней стадии развития нейродегенеративного процесса, по сравнению с контрольной группой трансгенных животных, не получавших димебон. На рис. 8 представлены результаты, показывающие, что димебон замедляет развитие нарушений равновесия и координации - характерных признаков развивающихся нейродегенеративных процессов. Животные, получавшие димебон, способны удерживаться на вращающемся стержне значительно дольше, чем трансгенные мыши, не получавшие этого препарата (рис. 8). Сходные результаты были получены как для трансгенных животных, начинавших получать димебон до развития симптомов нейродегенерации, так и для трансгенных животных, начинавших получать димебон после развития симптомов нейродегенерации.

Следует отметить, что в обеих экспериментальных группах результаты тестирования получавших димебон трансгенных животных с возрастом ухудшались

и никогда не достигали уровня результатов, показанных здоровыми, не несущими трансгена, животными (рис. 8). Таким образом, хроническое применение димебона хотя и не предотвращает полностью, но существенно замедляет развитие нарушений равновесия и координации, являющихся типичными проявлениями нейрональной патологии в использованной модели протеинопатии.

А. группа 1: димебон с 3-х месяцев

250

£ ^ 200 р, а

150

100 50 0

димебон возраст

т —г~ г

ИЕ .......1'......

М яц ■

дт ТГ ТГ ДТ тг ТГ

- - + - - +

6 6 6 9 9 9

Б. группа 2: димебон с 6-ти месяцев

250

Р 200

II

а "5" 150

100 50 0

димебон возраст

ДТ

тг

тг

ДТ

тг

тг

Рис. 8. Анализ равновесия и координации мышей на вращающемся стержне. Животные тестировались на вращающемся стержне со ступенчатым ускорением через 3 и б месяцев после начала приёма димебона. Представлены средние по группе значения, полученные при тестировании контрольных мышей, пе несущих трансгена («ДТ - димебон», п=12), и трансгенных мышей, получавших («ТГ + димебон», п=9) или не получавших («ТГ - димебон», п=11) димебон. А. Результаты тестирования мышей, получавших димебон, с 3-х месячного возраста. Б. Результаты тестирования мышей, получавших димебон с б-ти месячного возраста.

Влияние димебона на образование амилоидных включений в тканях нервной системы трансгенных животных с прогрессирующей нротеино-шшшей. Гистохимическое исследование срезов спинного и головного мозга трансгенных животных, получавших димебон, показало значительное уменьшение числа окрашиваемых Конго красным амилоидных отложений по сравнению с животными того же возраста, которые не получали препарат. На рис. 9 представлен пример существенного снижения количества выявляемых при окрашивании Конго красным амилоидных агрегатов в тканях спинного мозга трансгенных животных, получавших димебон в течение 9 месяцев. Этот ре-

зультат позволяет предположить, что одной из молекулярно-клеточных мишеней действия димебона может являться процесс патологической агрегации белков. Димебон может либо предотвращать образование новых агрегатов, либо влиять на стабильность уже предсформированных включений, например, активируя собственные защитные механизмы клетки, направленные на очистку внутреннего функционального пространства от аберантных белков и фибриллярных структур.

дикий тип трансген трансген + димебон

Рис. 9. Окраска амилоидных включений Конго красным в поперечных срезах грудного отдела спинного мозга 12-ти месячных мышей, не несущих трансгена (дикий тип) и гомозиготных трансгенных мышей, получавших димебон с 3-х месячного возраста (трансген + димебон), либо не получавших димебон (трансген). Увеличение 400Х. Стрелками указаны амилоидные включения.

Влияние димебона на астроглиоз Реактивный астроглиоз является одним из наиболее характерных клеточных процессов, сопровождающих нейро-дегенерацию, в том числе дегенерацию мотонейронов в спинном мозге трансгенных мышей исследуемой линии. Количество активированных астроцитов, а также уровень экспрессии ими специфических белковых маркеров, например ГФКБ, прямо коррелируют с интенсивностью нейродегенеративных процессов в проанализированных структурах центральной нервной системы. Мы показали, что хроническое применение димебона существенно снижает количество активированных астроцитов и интенсивность их окраски антителами к ГФКБ в спинном мозге гомозиготных трансгенных мышей (рис. 10).

Рис. 10. Иммуногистохимическая окраска антителами к ГФКБ поперечных срезов грудного отдела спинного мозга 12-ти месячных мышей, не несущих трансгена (дикий тип) и гомозиготных трансгенных мышей, получавших димебон с 3-х месячного возраста (трансген + димебон), либо не получавших димебон (трансген). Увеличение 100Х и 400Х. Стрелками показаны клетки с характерной морфологией активированных астроцитов и высоким уровнем синтеза маркерного белка ГФКБ.

Возможно, пониженный уровень реактивного астроглиоза отражает ослабление нейродегенеративных процессов в нервной системе трансгенных мышей, получавших димебон. Результаты наших исследований свидетельствуют, что, по крайней мере в использованной модельной системе, хронический прием димебона существенно замедляет развитие патологических процессов, индуцированных повышенной экспрессией амилоидогенного белка. Полученные данные являются первым прямым указанием на то, что димебон может влиять непосредственно на молекулярно-клеточные процессы образования и/или ликвидации патологических белковых отложений в структурах нервной системы. Таким образом, выявление звеньев патогенеза нейродегенеративных заболеваний, на которые действует димебон, позволяет наметить оригинальную стратегию поиска и создания нового поколения препаратов для лечения протеинопатий, действующих на ключевые стадии патогенетического процесса.

выводы

1. Повышенная экспрессия склонного к агрегации белка гамма-синуклеина в нейронах различных отделов нервной системы трансгенных мышей линии ThylmySN приводит к формированию амилоидных включений, основным компонентом которых является агрегированный и частично убиквитиниро-ванный гамма-синуклеин.

2. Развитие протеинопатии у трансгенных мышей линии ThylmySN носит прогрессивный характер; выраженность клинических симптомов нейродегене-рации, включающих нарушение равновесия и координации движений, нарастает с возрастом и прямо коррелирует с накоплением в структурах нервной системы гистопатологических белковых включений амилоидного типа.

3. Процессы нейродегенерации, вызванные гамма-синуклеинопатией, сопровождаются специфической нейровоспалительной реакцией - астроглиозом.

4. Присутствие повышенного количества белка гамма-синуклеина в нейронах трансгенных мышей линии ThylmySN не влияет на метаболизм двух других членов семейства синуклеинов: альфа-синуклеина и бета-синуклеина.

5. Экспериментальные данные, полученные при изучении новой генетической модели, свидетельствуют о том, что патологические изменения в нервной системе мышей трансгенной линии ThylmySN воспроизводят ключевые звенья патогенеза протеинопатий.

6. Хроническое применение димебона существенно снижает количество амилоидных отложений в тканях спинного мозга трансгенных животных линии ThylmySN.

7. Димебон ингибирует реактивный астроглиоз, обычно сопровождающий про-теинопатию в тканях спинного мозга трансгенных животных линии ThylmySN.

8. Хроническое применение димебона существенно замедляет развитие клинических проявлений протеинопатии - нарушения равновесия и координации у трансгенных животных линии ThylmySN.

9. Положительный эффект димебона на течение протеинопатии, вызванной повышенной экспрессией белка гамма-синуклеина в нейронах трансгенных мышей линии ТЬу1ту8М, выявляется при применении его как на ранних до-симптомных стадиях развития патологического процесса, так и на развитых стадиях протеинопатии с выраженной нейродегенеративной симптоматикой.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГАФДГ глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа

геми гемизиготные животные несущие одну трансгеиную аллель

гомо гомозиготные животные с двумя трансгенными аллелями

гтн ганглии тройничного нерва

ГФКБ глиальный фибриллярный кислый белок

ИФАВ Институт физиологически активных веществ Российской академии

РАН наук

КГМ кора головного мозга

кДа Килодальтон

кем корешки спинного мозга

ндз нейродегеггративные заболевания

ПЦР полимеразпая цепная реакция

ЕСЬ от англ. ЕЬпасеё сЬетПитшеБсепсе - усиленная реакция хемилю-

минесценции

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Бачурин С.О., Устюгов А.А., Петере О., Шелковникова Т.А., Бухман В.Л. и Нинкина Н.Н. Блокада нейродегенеративных процессов, вызванных протеи-нопатией, как новый механизм действия нейропротекторных и когнитивно-стимулирующих препаратов. // Доклады Академии наук: Биохимия и Биофизика. - 2009. - Т.428(2). - С.262-265.

2. Ustyugov А.А., Tucker N.R., Bryantsev A.L., Konkel M.E., Shelden E.A. Hsp27 is persistently expressed in zebrafish skeletal and cardiac muscle tissues but dispensable for their morphogenesis. // Cell Stress Chaperones. - 2009. - T.14(5). -C.521-533.

3. Нинкина H.H., Устюгов А.А. и Бухман В.Л. Моделирование синуклетинопа-тий в генетически модифицированных животных - успехи и неудачи. // Молекулярная биология. - 2008. - Т.42(5). - С.840-855.

Тезисы докладов:

4. Ustyugov А.А., Shelkovnikova Т.А., Ninkina N.N. and Bachurin S.O. Synu-cleionapthy is tempered by Dimebon. // Материалы симпозиума "11th International Geneva/Springfield Symposium on Advances in Alzheimer Therapy", -Geneva, Switzerland.-2010.-C.8l.

5. Ustyugov A.A., Shelkovnikova T.A., Ninkina N.N. and Bachurin S.O. Dimebon slows the progression of neurodegeneration in transgenic model of synucleinopa-thy. // Материалы конференции "4th Conference on Advances in Molecular Mechanisms of Neurological Disorders", - Лейпциг, Германия. - 2009. - С. 132.

6. Устюгов А.А., Шелковникова Т.А., Нинкина Н.Н. и Бачурин С.О. Агрегация белка - роль в нейродегенерации и как мишень для разработки новых лекарственных средств. // Материалы 5-го Международного междисциплинарного конгресса «Нейрохимия для медицины и психологии», - Судак, Украина. -2009. - С.228-229.

7. Бачурин С.О., Устюгов A.A. и Нинкина H.H. Использование генетически модифицированных мышей для моделирования нейродегенеративных процессов с целью выявления новых эффективных мишеней для скрининга препаратов с нейропротекторными свойствами. // Материалы конференции по научному направлению Российской академии наук «Фундаментальные науки - Медицине». - 2008. - С. 10.

Подписано в печать:

04.10.2010

Заказ № 4211 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 wwvv.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Устюгов, Алексей Анатольевич

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

Современные представления о механизме действия отечественного препарата димебон как эффективного нейропротекторного агента.

Характеристика димебона.

Свойства димебона как когнитивно-стимулирующего агента.

Димебон и нейродегенерация.

Использование генетических моделей для изучения нейродегенеративных процессов.

Этиология и патогенез протеинопатии на примере болезни Паркинсона

Синуклеинопатии как новая нозологическая форма.

Участие альфа-синуклеина в нейродегенеративных процессах.

Моделирование синуклеинопатий методом генетического модифицирования экспрессии гена в модельных организмах.

Современные линии трансгенных мышей с пан-нейрональной экспрессие гена синуклеина.

Линии трансгенных мышей с экспрессией гена альфа-синуклеина в нейронах.

Моделирование протеинопатии и роль эндогенного белка на примере синуклеинопатии у беспозвоночных животных.

Развитие нейродегенеративных процессов и функция альфа-синуклеина

Разработка новых подходов в лечении протеинопатий на примере генетической модели с измененной экспрессией синуклеина.

Глава 2. Методы и материалы.

Получение трансгенных животных с пан-нейрональной экспрессией гаммасинуклеина.

Лабораторные животные.

Генотипирование.

Введение препарата димебон.

Характеристика полученных животных.

Методы анализа состояния нервной системы экспериментальных животных.

Тест «вращающийся стержень».

Тест «горизонтальная перекладина».

Анализ походки.

Гистологический анализ образцов тканей нервной системы экспериментальных животных.47:

Фиксация и заключение в парафин.

Приготовление гистологических срезов.

Окрашивание Конго красным и подсчет амилоидных отложений.

Иммуногистохимический анализ.

Анализ содержания и клеточной локализации белков.

Выделение белка.

Фракционирование белков.

Анализ белков в денатурирующем 8В8-РАОЕ.

Иммуноблоттинг белков.

Анализ экспрессии РНК.

Выделение РНК.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

Моделирование протенопатии.

Характеристика синуклеинопатии, вызванной в трансгенных мышах со сверхэкспрессей гена гамма-синуклеина.

Анализ экспрессии трансгена на уровне мРМК.

Анализ экспрессии трансгена на уровне белка.

Гистологический анализ нервной системы ТЬу1шу8Н трансгенных животных.

Патологические включения, образованные агрегированным гаммасинуклеином.

Убиквитин и гамма-синуклеинопатия.

Анализ нейровоспалительных процессов, сопровождающих протеинопатию.

Анализ детергент нерастворимых фракций содержащих гамма-синуклеин

Прогрессирующий характер развития протеинопатии в трансгенных животных.

Использование модельной системы гамма-синуклеинопатии для изучения механизма действия отечественного препарата димебон.

Инструментальные тесты трансгенных животных со сверхэкспрессией; гамма-синуклеина принимающих димебон.

Влияние димебона на образование амилоидных включений и астроглиоз в тканях нервной системы трансгенных животных с прогрессирующей протеинопатией.

Эффект димебона на смертность гамма-синуклеин трансгенных животных.

Потенциальный клеточный механизм действия димебона.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Моделирование синуклеинопатии у трансгенных животных с целью изучения механизма действия нейропротекторных препаратов"

Актуальность темы. В основе патогенеза многих нейродегенератив-ных заболеваний (НДЗ) лежит нарушение конформации определённых белков с последующей их агрегацией и формирование фибрилл, что приводит к образованию в нервной системе характерных патологических образований: сенильных бляшек, нейрофибриллярных клубков, телец Леви, прионовых бляшек и других патологических отложений. Множественность и распространенность этих патологических образований в пораженных отделах нервной системы прямо коррелирует с тяжестью заболевания. Накопление в тканях нервной системы промежуточных продуктов белковой агрегации - оли-гомеров и протофибрилл, многие из которых обладают цитотоксическими свойствами, приводит к функциональным нарушениям и, в итоге, к гибели нейронов. Конечные продукты белковой агрегации - фибриллярные и аморфные отложения - могут достигать больших размеров, часто соизмеримых с размерами самих нервных клеток, и, накапливаясь в пораженных тканях по мере прогрессирования нейродегенеративного заболевания, также могут становиться причиной гибели клеток. Такой тип патологии, получивший название протеинопатии, объединил в одну группу неврологические расстройства с существенно различающимися клиническими проявлениями. К протеинопатиям относят болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, хорею Гентингтона, боковой амиотрофический склероз и ряд деменций, также характеризующихся присутствием различного типа патологических включений. В связи с ростом распространённости этих заболеваний в развитых странах становятся все более актуальными изучение тонкого механизма патологических процессов данного типа и разработка нового поколения лекарственных препаратов, действие которых будет патогенетически обосновано. В настоящее время в терапии НДЗ используются в основном симптоматические средства. Разрабатываются, однако, и новые препараты, положительные эффекты которых обусловлены воздействием на ключевые звенья патогенеза. Одним из них является отечественный препарат димебон. Детальная характеристика патогенетических механизмов НДЗ, на которые он влияет, позволит наметить стратегию поиска и создания нового поколения препаратов для лечения протеинопатий, основанную на знании молекулярных и клеточных механизмов развития этих болезней.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования является разработка генетической модели, воспроизводящей ключевые звенья протеинопатий для изучения молекулярного механизма действия димебона и скрининга новых лекарственных препаратов, действующих на патогенез нейроде-генеративных заболеваний.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать прогрессирующую гамма-синуклеинопатию, воспроизводящую в трансгенных мышах линии ТЬу1шу8М ключевые звенья патогенеза нейродегенеративных заболеваний человека с прогрессивным накоплением белковых включений амилоидного типа: а) проанализировать возрастную динамику уровня экспрессии и накопления в клетках нервной системы трансгенных животных экзогенного гамма-синуклеина; б) проанализировать количество и распределение патологических включений, сформированных конечными продуктами белковой агрегации гамма-синуклеина, в тканях нервной системы трансгенных животных на разных стадиях патологии; в) выявить корреляцию между развитием клинических симптомов нейро-дегенеративного процесса и накоплением в нервной системе гистопа-тологических структур, основой которых является гамма-синуклеин.

2. Изучить механизм действия отечественного препарата димебон и выявить его возможные молекулярные мишени, используя трансгенных мышей линии ТЬу1шу8Ы в качестве модели прогрессирующей гамма-синуклеинопатии: а) оценить влияние димебона на развитие клинических проявлений нейро-нальной патологии в модели прогрессирующей гамма-синуклеинопатии; б) исследовать влияние димебона на процесс формирования и/или стабильности гистопатологических амилоидных структур в нервной системе трансгенных животных; в) изучить влияние димебона на специфическую нейровоспалительную реакцию, сопровождающую нейродегенеративный процесс.

Научная новизна работы. В ходе выполнения работы получены оригинальные данные по характеристике новой модельной системы синуклеинопатии в трансгенных мышах, воспроизводящей основные звенья патогенеза нейроде-генеративных процессов, начиная от изменения уровня синтеза и локализации ключевого белка протеинопатии, и заканчивая массированным формированием патологических белковых включений амилоидного типа в тканях нервной системы с развитием тяжелой неврологической патологии и преждевременной гибелью модельных животных. Впервые для изучения механизма действия отечественного лекарственного препарата димебон, обладающего выраженными нейропротекторными свойствами, были использованы модельные трансгенные животные. Получены новые важные данные о подавлении димебоном образующихся агрегатов амилоидного типа, являющихся основой патологических белковых включений.

Практическая значимость. Установлено, что в использованной генетической модели - трансгенных мышах линии ТЬу1ту8Ы - воспроизводятся ключевые звенья патогенеза протеинопатий, лежащих в основе многих ней-родегенеративных заболеваний человека: образование амилоидных включений в различных отделах нервной системы, поражение моторных нейронов спинного мозга и, как результат, моторная дисфункция. Таким образом, данная линия трансгенных животных на сегодняшний день является одной из самых адекватных моделей для изучения молекулярного механизма развития протеинопатий человека и может успешно использоваться для тестирования потенциальных нейропротекторных препаратов.

Полученные результаты являются первым прямым указанием на то, что отечественный препарат димебон может непосредственно влиять на молеку-лярно-клеточные процессы образования и/или распада патологических белковых отложений, образованных агрегированными формами амилоидогенно-го белка, что служит основанием для дальнейшей работы по созданию лекарственного средства на его основе.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 4-й конференции «Успехи в изучении молекулярных механизмов неврологических нарушений» (ESN Conference on Advances in Molecular Mechanisms of Neurological Disorders, Лейпциг, Германия, 2009), на 5-м Международном междисциплинарном конгрессе «Нейрохимия для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2009), на 11-м Международном симпозиуме по достижениям в области терапии болезни Альцгеймера (11th International Geneva/Springfield Symposium on Advances in Alzheimer Therapy, Женева, Швейцария, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 статьи в периодических изданиях, соответствующих Перечню ВАК, и 4 работы в сборнике материалов докладов научных конференций.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методов и материалов, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 120 страницах и иллюстрирована 27 рисунками, 3 таблицами и 1 схемой. Список цитируемой литературы включает 150 наименований.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Устюгов, Алексей Анатольевич

Выводы

1. Повышенная экспрессия склонного к агрегации белка гамма-синуклеина в нейронах различных отделов нервной системы трансгенных мышей линии ТЬу1шу8Ы приводит к формированию амилоидных включений, основным компонентом которых является агрегированный и частично убиквитиниро-ванный гамма-синуклеин.

2. Развитие протеинопатии у трансгенных мышей линии ТЬу1ту8Н носит прогрессивный характер; выраженность клинических симптомов нейродегене-рации, включающих нарушение равновесия и координации движений, нарастает с возрастом и прямо коррелирует с накоплением в структурах нервной системы гистопатологических белковых включений амилоидного типа.

3. Процессы нейродегенерации, вызванные гамма-синуклеинопатией, сопровождаются специфической нейровоспалительной реакцией - астроглиозом.

4. Присутствие повышенного количества белка гамма-синуклеина в нейронах трансгенных мышей линии ТЪу1ту8М не влияет на метаболизм двух других членов семейства синуклеинов: альфа-синуклеина и бета-синуклеина.

5. Экспериментальные данные, полученные при изучении новой генетической модели, свидетельствуют о том, что патологические изменения в нервной системе мышей трансгенной линии ТЪу1ту8М воспроизводят ключевые звенья патогенеза протеинопатий.

6. Хроническое применение димебона существенно снижает количество амилоидных отложений в тканях спинного мозга трансгенных животных линии ТЬу1ту8К

7. Димебон ингибирует реактивный астроглиоз, обычно сопровождающий про-теинопатию в тканях спинного мозга трансгенных животных линии ТЬу1ту8К

8. Хроническое применение димебона существенно замедляет развитие клинических проявлений протейнопатии — нарушения равновесия и координации у трансгенных животных линии ThylmySN.

9. Положительный эффект димебона на течение протеинопатии, вызванной повышенной экспрессией белка гамма-синуклеина в нейронах трансгенных мышей линии ThylmySN, выявляется при применении его как на ранних до-симптомных стадиях развития патологического процесса, так и на развитых стадиях протеинопатии с выраженной нейродегенеративной симптоматикой.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Устюгов, Алексей Анатольевич, Москва

1. Auluck P.K., Chan H.Y., Trojanowski J.Q., Lee V.M. and Bonini N.M. Chap-erone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila model for Parkinson's disease. Il Science 2002. - T.295(5556). - C.865-8.

2. Bachurin S.O., Shevtsova E.P., Kireeva E.G., Oxenkrug G.F. and Sablin S.O. Mitochondria as a target for neurotoxins and neuroprotective agents. // Ann N Y Acad Sei 2003. - T.993. - C.334-44; discussion 345-9.

3. Bar-On P., Rockenstein E., Adame A., Ho G., Hashimoto M. and Masliah E. Effects of the cholesterol-lowering compound methyl-beta-cyclodextrin in models of alpha-synucleinopathy. // JNeurochem — 2006. T.98(4). — C.1032-45.

4. Beyer K. Alpha-synuclein structure, posttranslational modification and alternative splicing as aggregation enhancers. // Acta Neuropathol — 2006. — T.l 12(3). C.237-51.

5. Beyer K. and Ariza A. Protein aggregation mechanisms in synucleinopathies: commonalities and differences. // J Neuropathol Exp Neurol — 2007. -T.66(l 1). C.965-74.

6. Beyer K., Domingo-Sabat M. and Ariza A. Molecular pathology of lewy body diseases. //Int J Mol Sei-2009. T. 10(3). - C.724-45.

7. Buchman V.L., Hunter H.J., Pinon L.G., Thompson J., Privalova E.M., Ninkina N.N. and Davies A.M. Persyn, a member of the synuclein family, has a distinct pattern of expression in the developing nervous system. // JNeurosci — 1998. -T.l 8(22). C.9335-41.

8. Cabin D.E., Gispert-Sanchez S., Murphy D., Auburger G., Myers R.R. and Nussbaum R.L. Exacerbated synucleinopathy in mice expressing A53T SNCA on a Snca null background. // Neurobiol Aging 2005. - T.26(l). - C.25-35.

9. Chandra S., Gallardo G., Fernandez-Chacon R., Schluter O.M. and Sudhof T.C. Alpha-synuclein cooperates with CSPalpha in preventing neurodegeneration. // Cell 2005. - T. 123(3). - C.383-96.

10. Chen L., Thiruchelvam M.J., Madura K. and Richfield E.K. Proteasome dysfunction in aged human alpha-synuclein transgenic mice. // Neurobiol Dis -2006. T.23(l). - C.120-6.

11. Chiba-Falek O. and Nussbaum R.L. Regulation of alpha-synuclein expression: implications for Parkinson's disease. // Cold Spring Harb Symp Quant Biol2003. T.68. - C.409-15.

12. Choi D.Y., Liu M., Hunter R.L., Cass W.A., Pandya J.D., Sullivan P.G., Shin E.J., Kim H.C., Gash D.M. and Bing G. Striatal neuroinflammation promotes Parkinsonism in rats. // PLoS One 2009. - T.4(5). - C.e5482.

13. Dev K.K., Hofele K., Barbieri S., Buchman V.L. and van der Putten H. Part II: alpha-synuclein and its molecular pathophysiological role in neurodegenerative disease. // Neuropharmacology 2003. - T.45(l). - C. 14-44.

14. Doble A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. // Pharmacol Ther 1999. - T.81(3). - C.163-221.

15. Drolet R.E., Behrouz B., Lookingland K.J. and Goudreau J.L. Mice lacking alpha-synuclein have an attenuated loss of striatal dopamine following prolonged chronic MPTP administration. // Neurotoxicology 2004. - T.25(5). - C.761-9.

16. Duan Y., Gross R.A. and Sheu S.S. Ca2+-dependent generation of mitochondrial reactive oxygen species serves as a signal for poly(ADP-ribose) polymerase-1 activation during glutamate excitotoxicity. II J Physiol 2007. -T.585(Pt 3). - C.741-58.

17. Feany M.B. and Bender W.W. A Drosophila model of Parkinson's,disease. // Nature — 2000. T.404(6776). - C394-8.

18. Fink A.L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. // Acc Chem Res ~ 2006. T.39(9). - C.628-34.

19. Fleming S.M., Salcedo J., Fernagut P.O., Rockenstein E., Masliah E., Levine M.S. and Chesselet M.F. Early and progressive sensorimotor anomalies in mice overexpressing wild-type human alpha-synuclein. // J Neurosci 2004. -T.24(42). - C.9434-40.

20. Fortin D.L., Troyer M.D., Nakamura K., Kubo S., Anthony M.D. and Edwards R.H. Lipid rafts mediate the synaptic localization of alpha-synuclein. // J Neu-rosci 2004. - T.24(30). - C.6715-23.

21. Frasier M., Walzer M., McCarthy L., Magnuson D., Lee J.M., Haas C., Kahle P. and Wolozin B. Tau phosphorylation increases in symptomatic mice overex-pressing A30P alpha-synuclein. // Exp Neurol- 2005. T. 192(2). - C.274-87.

22. Gallardo G., Schlüter O.M. and Sudhof T.C. A molecular pathway of neurodegeneration linking alpha-synuclein to ApoE and Abeta peptides. // Nat Neurosci 2008:-T.l 1(3).-C.301-8.

23. Galvin J.E., Lee V.M. and Trojanowski J.Q. Synucleinopathies: clinical and pathological implications. // Arch Neurol 2001. - T.58(2). - C. 186-90.

24. Gao H.M., Kotzbauer P.T., Uryu K., Leight S., Trojanowski J.Q. and Lee V.M. Neuroinflammation and oxidation/nitration of alpha-synuclein linked to dopaminergic neurodegeneration. // J Neurosci 2008. - T.28(30). - C.7687-98.

25. Gasser T. Update on the genetics of Parkinson's disease. // Mov Disord 2007. -T.22 Suppl 17.-C.S343-50.

26. George J.M. The synucleins. // Genome Biol 2002. - T.3(l). -C.reviews3002.1-3002.6.

27. Giasson B.I., Duda J.E., Forman M.S., Lee V.M. and Trojanowski J.Q. Prominent perikaryal expression of alpha- and beta-synuclein in neurons of dorsal root ganglion and in medullary neurons. // Exp Neurol 2001. - T. 172(2). -C.354-62.

28. Giasson B.I., Duda J.E., Quinn S.M., Zhang B., Trojanowski J.Q. and Lee V.M. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. // Neuron 2002. - T.34(4). - C.521-33.

29. Goedert M. and Spillantini M.G. Lewy body diseases and multiple system atrophy as alpha-synucleinopathies. // Mol Psychiatry — 1998. T.3(6). - C.462-5.

30. Grigorev V.V., Dranyi O.A. and Bachurin S.O. Comparative study of action mechanisms of dimebon and memantine on AMP A- and NMDA-subtypes glutamate receptors in rat cerebral neurons. // Bull Exp Biol Med 2003. -T. 136(5). - C.474-7.

31. Hamamichi S., Rivas R.N., Knight A.L., Cao S., Caldwell K.A. and Caldwell

32. G.A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson's disease model. // Proc Natl Acad Sci USA- 2008. T. 105(2). -C.728-33.

33. Hashimoto M., Rockenstein E., Mante M., Mallory M. and Masliah E. beta-Synuclein inhibits alpha-synuclein aggregation: a possible role as an antiparkinsonian factor. // Neuron 2001. - T.32(2). - C.213-23.

34. Kahle P.J., Neumann M., Ozmen L. and Haass C. Physiology and pathophysiology of alpha-synuclein. Cell culture and transgenic animal models based on a Parkinson's disease-associated protein. // Ann N Y Acad Sci 2000. - T.920. -C.33-41.

35. Kahle P.J., Neumann M., Ozmen L., Muller V., Jacobsen H., Schindzielorz A., Okochi M., Leimer U., van Der Putten H., Probst A., Kremmer E., Kretzschmar

36. H.A. and Haass C. Subcellular localization of wild-type and Parkinson's disease-associated mutant alpha -synuclein in human and transgenic mouse brain. // JNeurosci 2000. - T.20(17). - C.6365-73.

37. Kahle P.J., Neumann M., Ozmen L., Muller V., Jacobsen H., Spooren W., Fuss

38. B., Mallon B., Macklin W.B., Fujiwara H., Hasegawa M., Iwatsubo T., Kretzschmar H.A. and Haass C. Hyperphosphorylation and insolubility of al-pha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes. II EMBO Rep — 2002. -T.3(6). C.583-8.

39. Kaplan B., Ratner V. and Haas E. Alpha-synuclein: its biological function and role in neurodegenerative diseases. // J Mol Neurosci 2003. - T.20(2). - C.83-92. j

40. Klein C. and Lohmann-Hedrich K. Impact of recent genetic findings in Parkinson's disease. // Curr Opin Neurol 2007. - T.20(4). - C.453-64.

41. Klivenyi P., Siwek D., Gardian G., Yang L., Starkov A., Cleren C., Ferrante R.J., Kowall N.W., Abeliovich A. and Beal M.F. Mice lacking alpha-synuclein are resistant to mitochondrial toxins. // Neurobiol Dis 2006. - T.21(3).1. C.541-8.

42. Klucken J., Shin Y., Masliah E., Hyman B.T. and McLean P.J. Hsp70 Reduces alpha-Synuclein Aggregation and Toxicity. // J Biol Chem 2004. - T.279(24). - C.25497-502.

43. Kruger R., Kuhn W., Muller T., Woitalla D., Graeber M., Kosel S., Przuntek H., Epplen J.T., Schols L. and Riess O. Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson's disease. // Nat Genet 1998. - T.18(2). -C.106-8.

44. Lakso M., Vartiainen S., Moilanen A.M., Sirvio J., Thomas J.H., Nass R., Blakely R.D. and Wong G. Dopaminergic neuronal loss and motor deficits in Caenorhabditis elegans overexpressing human alpha-synuclein. // J Neurochem 2003. - T.86(l). - C. 165-72.

45. Lavedan C. The synuclein family. // Genome Res 1998. - T.8(9). - C.871-80.

46. Lee J.K., Tran T. and Tansey M.G. Neuroinflammation in Parkinson's disease. // JNeuroimmune Pharmacol 2009. - T.4(4). - C.419-29.

47. Lee J.T., Wheeler T.C., Li L. and Chin L.S. Ubiquitination of alpha-synuclein by Siah-1 promotes alpha-synuclein aggregation and apoptotic cell death. // Hum Mol Genet -2008. T.17(6). - C.906-17.

48. Lermontova N.N., Lukoyanov N.V., Serkova T.P., Lukoyanova E.A. and Bachurin S.O. Dimebon improves learning in animals with experimental Alzheimer's disease. // Bull Exp Biol Med 2000. - T. 129(6). - C.544-6.

49. Lynch G. Memory enhancement: the search for mechanism-based drugs. // Nat Neurosci 2002. - T.5 Suppl. - C.1035-8.

50. Manning-Bog A.B., McCormack A.L., Purisai M.G., Bolin L.M. and Di Monte D.A. Alpha-synuclein overexpression protects against paraquat-induced neurodegeneration. // J Neurosci 2003. - T.23(8). - C.3095-9.

51. Marti M.J., Tolosa E. and Campdelacreu J. Clinical overview of the synuclei-nopathies. //MovDisord-2003. -T.18 Suppl 6. C.S21-7.

52. Martin L.J., Pan Y., Price A.C., Sterling W., Copeland N.G., Jenkins N.A., Price D.L. and Lee M.K. Parkinson's disease alpha-synuclein transgenic mice develop neuronal mitochondrial degeneration and cell death. // J Neurosci — 2006. T.26(l). - C.41-50.

53. Melnikova I. Therapies for Alzheimer's disease. // Nat Rev Drug Discov — 2007. T.6(5). — C.341-2.

54. Morris R. Thy-1 in developing nervous tissue. // Dev Neurosci 1985. -T.7(3). - C.133-60.

55. Neumann M., Kahle P.J., Giasson B.I., Ozmen L., Borroni E., Spooren W., Muller V., Odoy S., Fujiwara H., Hasegawa M., Iwatsubo T., Trojanowski J.Q.,

56. Kretzschmar H.A. and Haass C. Misfolded proteinase K-resistant hyperphos-phorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies. // J Clin Invest 2002. -T.l 10(10). -C. 1429-39.

57. Ninkina N., Peters O., Millership S., Salem H., van der Putten H. and Buchman V.L. Gamma-synucleinopathy: neurodegeneration associated with overexpression of the mouse protein. U Hum Mol Genet -2009. T.l 8(10). - C. 1779-94.

58. O'Neill M.J. and Dix S. AMPA receptor potentiators as cognitive enhancers. // IDrugs 2007. - T. 10(3). - C. 185-92. .

59. O'Neill M.J. and Witkin J.M. AMPA receptor potentiators: application for depression and Parkinson's disease. // Curr Drug Targets — 2007. — T.8(5). -C.603-20.

60. Papachroni K., Ninkina N., Wanless J., Kalofoutis A.T., Gnuchev N.V. and Buchman V.L. Peripheral sensory neurons survive in the absence of alpha- and gamma-synucleins. IIJ Mol Neurosci- 2005. T.25(2). - C. 157-64.

61. Papachroni K.K., Ninkina N., Papapanagiotou A., Hadjigeorgiou G.M., Xiro-merisiou G., Papadimitriou A., Kalofoutis A. and Buchman V.L. Autoantibodies to alpha-synuclein in inherited Parkinson's disease. // J Neurochem — 2007. T.101(3). - C.749-56.

62. Parsons C.G. and Gilling K. Memantine as an example of a fast, voltage-dependent, open channel N-methyl-D-aspartate receptor blocker. // Methods Mol Biol 2007. - T.403. - C. 15-36.

63. Pendleton R.G., Parvez F., Sayed M. and Hillman R. Effects of pharmacological agents upon a transgenic model of Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. // J Pharmacol Exp Ther- 2002. T.300(l). - C.91-6.

64. Periquet M., Fulga T., Myllykangas L., Schlossmacher M.G. and Feany M.B. Aggregated alpha-synuclein mediates dopaminergic neurotoxicity in vivo. // J Neurosci 2007. - T.27(12). - C.3338-46.

65. Rathke-Hartlieb S., Kahle P.J., Neumann M., Ozmen L., Haid S., Okochi M., Haass C. and Schulz J.B. Sensitivity to MPTP is not increased in Parkinson's disease-associated mutant alpha-synuclein transgenic mice. // J Neurochem -2001.-T.77(4).-C.l 181-4.

66. Reddy P.H., Mao P. and Manczak M. Mitochondrial structural and functional dynamics in Huntington's disease. // Brain Res Rev 2009. - T.61(l). - C.33-48.

67. Riedel G., Piatt B. and Micheau J. Glutamate receptor function in learning and memory. // Behav Brain Res 2003. - T. 140(1-2). - C.l-47.

68. Rothermel B.A. and Hill J.A. The heart of autophagy: deconstructing cardiac proteotoxicity. // Autophagy 2008. - T.4(7). - C.932-5.

69. Sabbagh M.N. and Shill H.A. Latrepirdine, a potential novel treatment for Alzheimer's disease and Huntington's chorea. // Curr Opin Investig Drugs — 2010. -T.ll(l). -C.80-91.

70. Sharon R., Bar-Joseph I., Frosch M.P., Walsh D.M., Hamilton J.A. and Selkoe D.J. The formation of highly soluble oligomers of alpha-synuclein is regulated by fatty acids and enhanced in Parkinson's disease. // Neuron 2003. - T.37(4). - C.583-95.

71. Skipper L., Liu J.J. and Tan E.K. Polymorphisms in candidate genes: implications for the current treatment of Parkinson's disease. // Expert Opin Pharmaco-ther 2006. - T.7(7). - C.849-55.

72. Skovronsky D.M., Lee V.M. and Trojanowski J.Q. Neurodegenerative diseases: new concepts of pathogenesis and their therapeutic implications. // Annu Rev Pathol 2006. - T. 1. — C. 151 -70. .

73. Song D.D., Shults C.W., Sisk A., Rockenstein E. and Masliah E. Enhanced substantia nigra mitochondrial pathology in human alpha-synuclein transgenic mice after treatment with MPTP. // Exp Neurol 2004. - T. 186(2). - C. 158-72.

74. Specht C.G. and Schoepfer R. Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred mice. // BMC Neurosci 2001. - T.2(l). -C.ll.

75. Specht C.G., Tigaret C.M., Rast G.F., Thalhammer A., Rudhard Y. and Schoepfer R. Subcellular localisation of recombinant alpha- and gamma-synuclein. // Mol Cell Neurosci 2005. - T.28(2). - C.326-34.

76. Spillantini M.G. and Goedert M. The alpha-synucleinopathies: Parkinson's disease, dementia with Lewy bodies, and multiple system atrophy. // Ann N Y Acad Sci 2000. - T.920. - C. 16-27.

77. Stefanova N., Kollensperger M., Hainzer M., Cenci A., Poewe W. and Wenning G.K. High dose levodopa therapy is not toxic in multiple system atrophy: experimental evidence. II Mov Disord-2007. T.22(7). - C.969-73.

78. Stefanova N., Poewe W. and Wenning G.K. Rasagiline is neuroprotective in a transgenic model of multiple system atrophy. // Exp Neurol — 2007. —.

79. Stichel C.C., Zhu X.R., Bader V., Linnartz B., Schmidt S. and Lubbert H. Mono- and double-mutant mouse models of Parkinson's disease display severe mitochondrial damage. // Hum Mol Genet 2007. - T. 16(20). - C.3377-93.

80. Strong M.J., Kesavapany S. and Pant H.C. The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy? // J Neuropathol Exp Neurol 2005. -T.64(8). - C.649-64.

81. Su H. and Wang X. The ubiquitin-proteasome system in cardiac proteinopathy: a quality control perspective. // Cardiovasc Res T.85(2). - C.253-62.

82. Tan E.K. and Skipper L.M. Pathogenic mutations in Parkinson disease. // Hum Mutat- 2007. T.28(7). - C.641-53.

83. Thiruchelvam M.J., Powers J.M., Cory-Slechta D.A. and Richfield E.K. Risk factors for dopaminergic neuron loss in human alpha-synuclein transgenic mice. // Eur JNeurosci 2004. - T. 19(4). - C.845-54.

84. Tofaris G.K., Garcia Reitbock P., Humby T., Lambourne S.L., O'Connell M., Ghetti B., Gossage H., Emson P.C., Wilkinson L.S., Goedert M. and Spillantini

85. M.G. Pathological changes in dopaminergic nerve cells of the substantia nigra and olfactory bulb in mice transgenic for truncated human alpha-synuclein(l-120): implications for Lewy body disorders. // JNeurosci — 2006. T.26(15). -C.3942-50.

86. Ustyugov A.A., Shelkovnikova T.A., Ninkina N.N. and Bachurin S.O. Dime-bon slows the progression of neurodegeneration^ in transgenic model of synu-cleinopathy. // Journal of Neurochemistry 2009. - T. 110(s 1 ). - C.42.

87. Ustyugov A.A., Shelkovnikova T.A., Ninkina N.N. and Bachurin S.O. Synu-cleionapthy is tempered by Dimebon. // Материалы симпозиума "11th International Geneva/Springfield Symposium on Advances in Alzheimer Therapy", Geneva, Switzerland, - 2010. - C.81.

88. Wakamatsu M., Iwata S., Funakoshi T. and Yoshimoto M. Dopamine receptor agonists reverse behavioral abnormalities of alpha-synuclein transgenic mouse, a new model of Parkinson's disease. // J Neurosci Res — 2008. T.86(3). -C.640-6.

89. Wang L., Fleming S.M., Chesselet M.F. and Tache Y. Abnormal colonic motility in mice overexpressing human wild-type alpha-synuclein. // Neuroreport — 2008. — T.19(8). — C.873-6.

90. Williams A., Jahreiss L., Sarkar S., Saiki S., Menzies F.M., Ravikumar B. and Rubinsztein D.C. Aggregate-prone proteins are cleared from the cytosol by autophagy: therapeutic implications. // Curr Top Dev Biol — 2006. T.76. — C.89-101.

91. Winner B., Lie D.C., Rockenstein E., Aigner R., Aigner L., Masliah E., Kuhn H.G. and Winkler J. Human wild-type alpha-synuclein impairs neurogenesis. // JNeuropathol Exp Neurol 2004. - T.63(l 1). - C. 1155-66.

92. Winner B., Rockenstein E., Lie D.C., Aigner R., Mante M., Bogdahn U., Couil-lard-Despres S., Masliah E. and Winkler J. Mutant alpha-synuclein exacerbates age-related decrease of neurogenesis. // Neurobiol Aging — 2007.

93. Winner B., Rockenstein E., Lie D.C., Aigner R., Mante M., Bogdahn U., Couil-lard-Despres S., Masliah E. and Winkler J. Mutant alpha-synuclein exacerbates age-related decrease of neurogenesis. // Neurobiol Aging 2008. - T.29(6). -C.913-25.

94. Xun Z., Sowell R.A., Kaufman T.C. and Clemmer D.E. Protein expression in a Drosophila model of Parkinson's disease. // JProteome Res — 2007. T.6(l). -C.348-57.

95. Yavich L., Jakala P. and Tanila H. Abnormal compartmentalization of norepinephrine in mouse dentate gyrus in alpha-synuclein knockout and A3 OP transgenic mice. // JNeurochem 2006. - T.99(3). - C.724-32.

96. Yavich L., Tanila H., Vepsalainen S. and Jakala P. Role of alpha-synuclein in presynaptic dopamine recruitment. // J Neurosci 2004. - T.24(49). -C.l 1165-70. ;

97. V. (Moscow, RU) (2001). Agent for treating neurodegenerative disorders. United States, Selena Pharmaceuticals, Inc. (San Francisco, CA).

98. Zhou W., Milder J.B. and Freed C.R. Transgenic mice overexpressing tyrosine-to-cysteine mutant human alpha-synuclein: a progressive neurodegenerative model of diffuse Lewy body disease. II J Biol Chem 2008. - T.283(15). -C.9863-70.

99. Нинкина Н.Н., Устюгов A.A. and Бухман B.JI. Моделирование синуклети-нопатий в генетически модифицированных животных успехи и неудачи. // Молекулярная биология - 2008. - Т.42(5). - С.840-855.