Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моделирование наследственной кардиомиопатии у крыс линии W. SSM: биохимические механизмы развития патологического процесса

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Моделирование наследственной кардиомиопатии у крыс линии W. SSM: биохимические механизмы развития патологического процесса"

РГ6 од

5 ЛОР РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ ЩЩЩСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ

На правах рукописи

УДК /575.1:616.001.57/:57.

084.1+575.I:/616.II.14+616,16/

ГШДАЕВА Ольга Николаевна

МОДЕЛИРОВАНИЕ НАСЛЕДСТВЕННОЙ КАРДИОМИОПАТИИ У КРЫС ЛИНИИ w/ssm: БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО ПРСЦЕССА

Биохимия - 03.00.04

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

г.Москва, 1993

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики Российской АН. (Директор - академик РАН В.К.Щумный)

Научные руководители: академик РАН, профессор

Р.И.Салганик

кандидат биологических наук • Н.А.Соловьева

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук.профессс

М.М.Г.Гаппаров

доктор биологических наук И.В.иветкова

Ведущее учреждение: Кардиологический научный центр

РАМН. Институт экспериментально® кардиологии.

Защита диссертации состоится "_"_1993 г.

в_час. на заседании специализированного Совета, шифр

Д.001.02.01. при Институте питания РАМН (109240, Москва, Устьинский проезд, д.2/14).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института питания РАМН.

Автореферат разослан "_"_1993 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат медицинских наук

В.М.Жминченко

ОВДДЯ ХАРАКТЕНЮТИКА РАБОТЫ

Актуальное^ ^оодедогаяша

Рост удельного веса наследственных заболевшей в структуре заболеваемости населения, наблюдаемый в последние де-сяуклетия, диктует необходимость изучения кг генетически:: я биохимических механизмов развития для созданий методов. ранне! диагностики л профилактики. К *а*сду распространении заболаваняй .»¿кокарда, возникающих вследствие наследственной прздрассосогвк-ности к нем, принадлежит кардиомаопатая (КШ) (Вэллетень KB, 1986). КМП является заболеванием преимущественно Жйой пологого возраста и в большинстве случаев заканчивается летально. Экология и патогенез КШ и, в частности, гипертрофической ее форма (ГКМП) остаются неясными (Rome P.C. et al.,1989). В связи е этим создание экспериментальной модели IM можзт значительно расширить возможности изучения механизмов развития этого заболевания, а также способствовать разработке способов предупреждения и лечения его. Известно, что в этиологии ШИП существенную роль играет наследственный фактор (Бюллетень BG3, 1986).

Ввиду этого особый интерес может представить создание нии яивотных с наследственной патологией сердечной мншцы, бязз-кой к той, которая встречается при ШМП человека. 3 настоящей работе развиты подходы к решение такой задачи. Kamt получена линия крыс с проявлениями наследственной ШМП. Для животных этой линии характерны гипертрофические изменения морфологических структур сердечной мышцы, весьма сходные с теми: которое наблюдаются при ГКМП человека при отсутствии анатомических и физиологических причин, вызывающих гипертрофию миокарда. Иэуче-некоторые биохимические характеристики этих животных, закономерности их наследования и выдвинуты предположения, касанияе-ся генетических и биохимических механизмов развития этого заболевания.

Цель и задачи работы

Моделирование наследственной ГКМП у крыс линии w/ssm и исследование биохимических механизмов развития патологического процесса у животных может помочь в изучении механизма развития сходной наследственной патологии у человека. .

В соответствии с этим в работе были поставлены задачи.

1. Исследовать характер морфологических изменений сердечной ышпцы у крыс линии W/SSM.

2. Изучить биохимические механизмы, предположительно участвуйте в развитии симптомокомплекса ГКМП у крыс линии w/ssm.

2.1. Изучить интенсивность транспорта Сахаров и активность ферментов, метаболизирующах сахара в крови и тканях крыс линии W/ssil и связь 'этих процессов с развитием ГКМП.

2.2. Исследовать генерирование свободных радикалов и уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) в тканях крыс линии

W/SSM.

2.3. Исследовать активность лизосомальных ферментов у крыс линии W/SSM.

2.4. Определить активность ингибитора протеиназ- ^-антитрипсина.

3. Исследовать биохимические механизмы, предположительно участвующие в развитии симптомокомплекса ГКМП у человека.

3.1. Охарактеризовать—транспорт гексоз в эритроциты больных ГКМП.

3.2. Исследовать активность ферментов, метаболизирующих сахара в клетках больных ГКМП.

Научная новизна

В работе впервые использована линия крыс w/ssm с выявленными нами признаками наследственной ГКМП для исследования биохимических процессов, лежащих в основе этой патологии. Полученные в эксперименте данные могут лечь в основу изучения биохимических механизмов, обусловливающих развитие КМП у человека. Проведенные исследования природы усиленного транспорта гексоз в клетки культуры фибробластов крыс линии w/ssm позволяют сделать заключение о первичности данного признака в развитии патологического симптомокомплекса у крыс линии w/ssm и его вероятной связи с мутацией гена транспортера гексоз.

Развитие патологических признаков у крыс линии w/ssm (кар-Диомиопатии, катаракты, гепато- и спленомегалии и иных симптомов) является результатом плейотропного действия мутантного гена, ответственного за усиленный транспорт гексоз. Полученные данные свидетельствуют о том, что плейотропное действие мутантного гена опосредуется за счет внутриклеточного накопления гоисоз.

Аутоокисленио гексоз служит причиной усиленного генерирования свободных радикалов и интенсивного перекисного окисления фосфо-липидов клеточных мембран, в частности, лизссомалышх. О эта: связан, по всей видимости, выход в клетки и межклеточное пространство лизосомальных ферментов. Действие лизосомальных про-теиназ усиливается из-за снижения активности ингибитора протеи-наз -.•(«-антитрипсина, обусловленной, очевидно,воздействием свс бодных радикалов.

Сочетанное действие свободных радикалов, перекисного окисления мембранных фосфолипидов и лизоссмных гидролаз может бытг причиной нарушения морфологии и функции сердечной мышцы, развития кардиомиопаткческсго синдрома, а также причиной ряда иных патологических процессов, кмеицих место у этих животных.

Получены данные.указывающие на то, что аналогичные нарушения биохимических процессов имеют место и у больных ГКМП:уси-ленный транспорт гексоз в клетки, увеличение активности лазосо-мальных ферментов в лейкоцитах крови.

Практическая значимость работы

Результаты экспериментальной работы позволили приблизиться к пониманию биохимических механизмов, лежащих в основа развития ГКМП. Имеются данные о том, что это заболевание полиэтио-логично (Бюллетень ВОЗ, 1986). Можно предположить, что не единственным, но одним из распространенных механизмов развития данной патологии человека является нарушение целостности клеточнш мембран, подобное тому, которое мы наблюдаем у крыс линии и возникающее в результате повышенного транспорта гексоз в клеп ки, генерирования свободных радикалов и усиления процессов перекисного окисления мембранных липидов.

Полученные данные открывают возможности для развития методов ранней диагностики, предупреждения или даже лечения наследственных форм ГКМП путем коррекции усиленного транспорта гексоз, ограничения потребления гексоз, элиминации свободных радикалов, торможения процессов перекисного окисления липидов,предположительно лежащих в основе этого заболевания у определенных групп пациентов.

Ыюбашш. работы

Представленные в диссертации результаты доложены на ХП Коя-грооов Федерации бхохимичвсюа обществ (Дрезден, 1978), П Международно* гвнемческом Конгрессе (Москва, 1978), Международном о$тадык)Л0Гичво}Сом симпозиуме "Эффективные метода диагностики и яечввяя катаракты и вопросы ее патогенеза" (Одесса, 1987) ; И МоЕЗувародном съезде мадщднетшх генетиков (Варна, 1990), Всасо-ганх конференциях "Эволюционные и гзнеткческко исследования иле-кошяащих" (Владивосток, 1990), "Геном человека" (Переяславль-Зелессяий, 1990), конференции молодых ученых ИКЭМ СО АМН СССР (Новосибирск, 1990), П Всесоюзном съезде медицинских генетиков (Москва, 1990).

Пуфгикарии. По теме диссертации опубликовано 13 работ.

Объем работа. Диссертация состоит из разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собствен-ша доследований, заключения ж выводов. Работа изложена на 123 стреаицах, включая 147 страниц машинописного текста, 15 таблиц, 24 рисунка а список литературы (203 источников).

СОДЕРЖАНИЕ РАШШ Развитие симптомов ГКМП у крыс линии w/ssm

I. Морфологические признаю! ШМП у крыс линии w/ssm

Линия крыс w/ssm была создана путем инбридинга крыс линии Вис тар, отбираемых по признаку повышенной чувствительности к катарактогенкому действию больших доз галактозы. У этих животных спонтанно возникают катаракты, гепато- к спленомегалия, происходит задержка роста и развития, имеет место пониженная плодовитость.

Одновременно отбирались крысы, устойчивые к повреждающему действию галактозы. Путем селекции и инбридинга была создана линия крыс w/ssm, у которых не наблюдалось каких-либо патологических явлений (Соловьева H.A. и др., 1975).

Определение массы сердечной мышцы и гистологические исследования у крыс линии w/ssm обнаружили изменения, сходные с теми, которые наблюдаются в сердечной мышце человека при заболевании ГОШ.

7 трехмесячных животных линия w/ssm масса сердца увеличивалась по сравнении с контрольными крысами того же возраста цр> одинаковой массе тела, в среднем, на 17%, при этом масса миокарда ЛЖ била больше, в среднем, на 15$, а ¿sc с а 1Ш - яа 42% (табл. I). При микроскопическом исследовании в даокарде обоих желудочков сердца 3-х месячных крыс не было обнаружено прззна-ков очаговых повреждений, или гипертрофии мышечных волокон. Количественный анализ популяции КВД у таяшс животных показал, что концентрация ядер мышечных клеток и садах клеток в I иг ткаки миокарда как левого, так к правого желудочка у крыс сравнкзае-мых групп одинакова, из чего следует, что увеличение массы миокарда произошло в результате увеличения общото ъяслз КЩ веявдг ствие имевшего место усиленного деления клеток, иными словами, увеличение массы миокарда желудочков обусловлено гиперплазией КЩ.

Количество одноядерных КЩ в популяции клеток ЛЖ и ПЖ у 3-х месячных крыс линии w/ssm относительно двуядерных клеток было выше, чем в аналогичных тканях контрольных животных, что также можно трактовать как следствие усиленного деления клеток.

К 10-ти месяцам жизни у крыс линии w/ssm относительная масса миокарда ПЖ была выше, чем у контрольных животных, в среднем на 25%; по общей массе сердца и массе миокарда ЛЖ эти крысы не отличались' от контрольных животных того же возраста.

При макроскопическом исследовании сердца у кркс лилии w/ssm к 10-ти месяцам жизни обнаруживалось расширение полостей желудочков сердца, особенно правого, в котором нередко встречались пристеночные тромботические отложения. При микроскопическом исследовании выявлена гипертрофия мышечных волокон миокарда ЛЖ, сочетающаяся с диффузной коллагенизацией стромы и очаговыми склеротическими изменениями (рис. I), а в легких - застойные явления в виде утолщения межальвеоляркых перегородок, дистелек-тазов и скоплений сидерофагов в просвете альвеол, то есть налицо признаки хронической сердечной недостаточности. в целом описанные изменения миокарда обоих желудочков сердца крыо линии w/ssm весьма сходны с патоморфологией миокарда при ГКМП человека.

Таблица I

Масса сердца и масса миокарда желудочков крыс патологической линии и/зэм в сравнении с контрольной линией и/зэм-й

Массы миокарда (М), левого (Л1) и правого (ГШ) желудочков

Линия крыс I 2

М Л пг М ЛЖ пж

I. и/зги-и (контроль) 281+5,25 234+6,03 45+0,87 274+9,5 224±8,21 50±1,88

2. Ш/БЗМ 328+7,65 269+5,72 64±3,42 304+13.21 233£7,94 64±1,25

Достоверность различий по критерию Стыодента, Р < 0,01 <0,01 <0,01 / 1 > 0,05 >0,05 «СО,01

Примечание: Каждая цифра - отношение общей массы миокарда или массы желудочка (мг) к массе тела (г) х 100, среднее из 7-8 опытов, I и 2 - группы крыс 3 и 10 месяцев соответственно.

Рис. I. Миокард левого желудочка крыс патологической линии иг/эвм я здоровых крыс линии да/зэм-н. А - Миокард крысы линии «/збм. Очаговый (постнекротический) кардиосклероз. Мышечные волокна увеличены в диаметре. Б - Миокард крысы здоровой линии иг/эвм-н. Патологические изменения отсутствуют. Возраст животных - 10 мес.

Окраска - коллоидное железо - ИИК-гематоксилин х 320.

2. Ейохимические механизмы развития ГКМП у крыс линии ff/ssm

2.1. Усиленный транспорт Сахаров

Проведенные исследования привели к представлению о том, что у крыс линии w/ssm множественные нарушения структуры и функции органов и клеток возникают в результате усиленного накопления гексоз в клетках, которое происходит вследствие аномально интенсивного транспорта их через плазматические мембраны из-за высокой удельной активности транспортера гексоз (Соловьева H.A., Ка-заринова Ф.С. и др., 1988).

Использование глюкозы для изучения транспорта гексоз оставляли сомнения в том, что не усиливается ли транспорт из-за возрастания метаболизма ее в клетках. В связи с этим в настоящей работе мы использовали неметаболизируемый аналог глюкозы -3Н-2-дезоксиглюкозу (3Н-Д0Г) - для исследования транспорта гексоз в эритроциты крыс. Интенсивное поглощение из инкубационной среды 3Н-Д0Г говорит об увеличении транспорта Сахаров у крыс линии w/ssm в сравнении с контролем (табл. 2), не связанном с возрастанием метаболизма их в клетке. В результате повышенного транспорта гексоз у животных линии w/ssm происходит внутриклеточное накопление моносахаридов (рис. 2) и продуктов их метаболизма. При исследовании поглощения 14с-галактозы культивируемыми in vitro фибробластами оказалось, что оно также выше в клетках крыс линии w/ssm по сравнению с контрольной линией (табл. 3). Галактоза поглощалась интенсивно как эмбриональными фибробластами, так и фибробластами взрослых крыс линии w/ssm (табл. 3). Обращает на себя внимание тот факт, что повышенный транспорт галактозы в фибробласты крыс линии w/ssm ке зависит от активности ферментов, метаболизирующих этот сахар (Гри-шаева О.Н. и др., 1988). Эти данные указывают на то, что транспорт галактозы и ее метаболизм в клетках животных находятся под контролем разных генетических систем. Раннее проявление усиленного транспорта галактозы в эмбриональных фибробластах крыс линии w/ssm и сохранение этого признака в культуре фиброблас-тов взрослых крыс свидетельствует о первичности данного признака и его клеточной генетической природе, а не следствия действия регуляторных организменных факторов.

Ю

Таблица 2

Транспорт .^-З-дезоксиглюкозы (^-ДОГ) в эритроциты крно линии и контрольной

Группы животных. ' Ус'нль 3Н-Д0Г из инкуб^ци-' онной среды ( в<1 «Д51 ) мл Достоверность отличий

Контрольная линия 7,41^0,8 0,01

Линия и/зэм 24,0+2,99

Примечание: каждая цифра - среднее из шести опытов. -

Таблица 3

Транспорт ^С-галактозы в культуре фибробластов эмбрионов к взрослых крыс линии «/бзм и контрольной линия -

Культура Убнль ^С-галактозы из ин- Достоверность

фибробластов кубационной среды отличий

( ЕЧ ♦ 102 )

__мл_

ш/взм линия контрольная

_линия__

Эмбриональная 23,3440,48 13,36+0,52 Р< 0,02

Взрослые крысы 7,8 +0,32 4,30+0,34 Р<0,05

Примечание: приведенные цифры - средние из пяти опытов.

2.2. Усиленное генерирование гидроксилькых радикалов и активация перекисного окисления липидов у крыс линии w/ssm

Известно, что накопление гексоз в клетках в результате их аутоокисления может приводить к усиленному образованию гидро-ксильных (Ш) радикалов (Krieger J. et al., 1985; Kuwabara M. et al., 1981). 'ш радикалы являются высокореакционноспособными электрофильными частицами, которые взаимодействуют с ненасыщен- ! ними жирными кислотами фосфолипидов мембран, индуцируя в них перекисное окисление липидов (ПОЛ) (Бурлакова Е.В. и др., 1985; Барабой В.А. и др., 1991). Количественным показателем этого процесса является накопление в организме малонового диальдегида(ВДА) и других ТЕК-реактивных продуктов (Барабой и др., 1991).

Мы исследовали образование'Ш радикалов в миокарде и печени крыс линии w/ssm и контрольной линии. Исследования проводили в гомогенате и митохоцдриальной фракции миокарда крыс _ в возрасте 1-1,5 мес. и 10-12 месяцев. Как видно из рис. 2 у I-1,5 месячных крыс не было обнаружено различия в генерировании'СН радикалов между контрольной и опытной линиями. При исследовании миокарда крыс 10-12 месячного возраста было обнаружено, что как в гомогенате, так и в митохондриальной фракции крыс линии w/ssm образование ОН радикалов в 1,5 раза превышало контрольный уровень (рис. 2).

Для изучения процессов ПОЛ мы исследовали образование МДА в митохондриях миокарда крыс линии w/ssm и контрольных животных, стимулированное в обоих случаях Ре -АДФ. Мы показали, что как исходный, так и стимулированный уровни содержания МДА в миокарде крыс лилии w/ssm в возрасте 3 месяцев были достоверно вше, чем у контрольных животных (рис. ЗА,Б). В противоположность тому, что наблюдалось у 3-х месячных животных количество МДА в миокарде 10-12 месячных крыс линии w/ssm было значительно ниже контрольного уровня (рис..ЗА,Б). Эти результаты согласуются с наблюдениями о том, что интенсивное развитие процессов ПОЛ при радиационном, химическом и других воздействиях на организм характеризуется инверсией уровней содержания МДА (Барабой В.А. и др., 1991).

Рис. 2. Генерирование гидроксилышх радикалов в миокарде крыс линии и/ззм и контрольной линии и/зэм-н.

1.2 - гомогенат миокарда крыс 1,5-месячного возраста (П = 15, Р ? 0,05);

3,4 - гомогенат миокарда крыс 10-12-месячного возраста (п = 7, Р ^ 0,001);

1.3 - крысы контрольной линии И/ЗЭМ-Н.

2.4 - крысы патологической линии чу/эзм.

5.6 - митохондриальная фракция миокарда крыс 1,5-ме -

сячного возраста (п = 15, Р ^ 0,05); 7,8 - митохондриальная фракция миокарда крыс 10-12-месячного возраста (п = 7, Р < 0,01);

5.7 - крысы контрольной линии;

6.8 - крысы патологической линии да/взм.

Примечание: 0 накоплении 'ОН радикалов судили по образованию спинового аддукта ДМПО-ОН.

10 20 30 40

о. за

0,33 0,30 0,27 0,24 0,21 0,1В

ода 0,12 о.оэ

0,05 0,03

о —

10

20

30

Рис. 3. Образование МДА в митохондриях из миокарда крыс патологической линии В/ББМ и здоровых животных контрольной линии и/ззы-и (в присутствии в среде 10 мМ РеАДФ); А - в возрасте 3 мес., Б - в возрасте 10 мес.; (—) - контрольная линия и/азм-й; (---) - патологическая линия и/зэм.

Для выяснения справедливости нашего предположения относи- • тельно роли накопления Сахаров в генерировании Ш радикалов- и стимулировании ПОД у крыс линии \7/35М мы содержали 1-1,5 месячных крысят патологической и контрольной линий на 405? галак-тозном рационе. На 7 сутки скармливания такого рациона в ¿шс-карде и печени крнсят обеих линий уже было обнаружено повышенное генерирование 'ОН радикалов (рис. 4). При этом отмечается более сильная активация ПОЯ в миокарде крыс линии к'/ззм, интересно отметить факт затухания процессов ПОЛ при длительном скармливании животным галактозного рациона (рис. 5). Как уже упоминалось, такая инверсия возможна в результате того, что при зн'^неявном окислении ненасыщенных жирных кислот происходят затухание ПОЛ из-за исчерпывания субстрата окисления.

2.3. Активация лизосомалышх ферментов у крыс линии Й'/ЗБМ

В современных схемах патогенеза кардяотенного стресса активации ПОЛ отводится роль ключевого фактора, непосредственно ведущего к повреждению клеточных мембран, в том числе ж лпзо-

сомных (Меерсон Ф.З., 1986). Очевидно, следствием итоге ялг:-:-ется повышение активности лизосомжгс гидролаз в плазме (Ка*д&-Гров В,В. и др., 1934) и лейкоцита-» крови у крыс линии п/язч. В настоящей работе показано, что у крыс линии ч/зэм активность дизосрмннх ферментов значительно выше также в миокарде желудочков сердца и попереч^с-полосатой .'мускулатуре. чем в есалотач-ных тк£1нях контрольных животных (табл. 4).

С6 увеличении проницаемости лнзосоюлшю .тсчбран у крыс линии ш/ззм по сравнению с животными контрольна ллаии свидетельствуют эксперименты по определении :1увствительности ли^о-сом к действа*) стандартных повровдаших факторов: зозрас-г-дацах концентраций детергента (тритона Х-100) и оологического шока. (0,1 М сахарозы). Активностьгалактозидазыв гемогекатах печени крыс линии и/взи при действии различных концентраций тритона Х-100 и преинкубации гомогената с 0,1 М сахарозой достоверно выше, чем у животных контрольной линии (табл. 5), Однако пра исследовании мембраносвязанного фермента лиэссом -у^-глшозида^ зы отмечена только тенденция к повышению активности ртого . фермента. Очевидно, увеличение активности глзкозидаз при действии повреждающих факторов на лизосомные мембраны печени отражает

Рис. 4. Генерирование гидроксильных радикалов в миокарде (А) и печени (Б) крыс линии Ш/ЭБМ (ез) и контрольной (сиз) при содержании их на 40% галактозном рационе. I - крысы контрольной линии на нормальном рационе; 2 - крысы контрольной линии на 40% галактозном рационе; 3 - крысы линии ч/гги на нормальном рационе; 4 - крысы линии и/ззм на 40% галактозном рационе. Возраст животных 1-1,5 месяца. В кавдой группе обследовано по 6 животных, длитель-• ность кормления - 7 суток (Р4- 0,01).

0,36

о.гз 0,00

0,27 | 0,24

о>

° 0,21 I 0'18

3 0,15

1 0.12

а

§ 0,09 0,06 0,03

й

гЬ

I

Рис. 5. Образование МДА в шиохондриях миокарда крыс линии "й/эвм (\zzz2) и контрольной (сп) при содержании их на 40% галактозном рационе. I - нормальный рацион; 2-2 суток кормления; 3-7 суток кормления; 4-14 суток кормления.

В каждой группе обследовано по 10 ;гавотных (Р 0,01). Возраст крыс 1-1,5 месяца.

Таблица 4

Активность лизосомнкх гидролаз в миокарде п в скелетных мышцах крыс линии w/ssm и контрольной линии w/ssh-r

Ферменты

нмоли 4-МУФ на мг белка в час

Миокард

Скелетные мшцы

контроль

w/ssm

контроль

w/ssm

I. ß -галактозидаза 145,2+8,07 217,8+19,3 I05,6tI3,8 I55,0±I2,2

(18) (17) (Ю) (9)

Р < 0,05 Р < 0,05

2. N-ацетил-/- D- 400,0+5,3 ЗЭ1,8±48,9 154,5+10,0 273,2+33,4

глюкозаминидаза (19) (19) (18) (Ю)

Р > 0,05 Р < 0,05

З.ы -ацетил-/-D- 176,0+22,4 248,1+17,7 86,3+16,3 124,7+1,34

галактозаминидаза (19) (19) (8) (Ю)

Р 0,05 Р 0,05

со

Таблица 5

Действие возрастающих концентраций детергента (тритона Х-100) и осмотического шока (О, IM сахароза) на стабильность лизосо-мальных мембран печени крыс линии w/SSM и контрольной

Ферменты

Линии животных

Контроль

ff/ssm

Достоверность отличий

-галактозидаза ß - глгокозидаза

/ - галактозидаза у3 - глюкозидаза

- галактозидаза

ß - глюкозидаза

/ - галактозидаза уб - глюкозидаза

ß - галактозидаза у0- глзокозвдаза

Без детергента (свободная активность)

34,76+6,14 23,98^2,91

62,62+6,84 37,79+4,72

0.025% тритон Х-ЮО

154,2+15,9 253,3±35,9 42,04±9,06 78,66+15,90

0.05% тритон X-I0Q

386,1+18,0 638,7±Ю5,8

232,2+26,2 299,1+35,7

0.1% тритон Х-ЮО (Общая активность)

453,8+41,7 236,1+19,2

681,5+102,7 208,5+33,8

0.1 М сахароза

146,8+22,9 241,9+20,8 39,50+9,1 57,65+9,9

Р * 0,05 PC 0,05

Р < 0,05 Р ^ 0,05

Р <■ 0,05 Р > 0,05

Р < 0,05 Р > 0,05

Р 0,05

Р> aoS

Примечание: Возраст животных 4-5 месяцев.

Каждая цифра - среднее из 5 опытов. Активность ферментов выражали в нМ метил-умбеллиферона на мг белка в час.

повышение не общей активности ферментов,а дает представление о нарушении стабильности мембран лизосом, поскольку при обработке гомогенатов высокой концентрацией детергента (0,1% тритон X-IQÜ), обеспечивающей полное "раскрытие" лизосом, уровни общей активности этих ферментов в гомогенатах печени крыс линии W/S3M и контрольной линии достоверно не отличаются (табл. 5).

2.4. Наследственная недостаточность Л -антитрипсина ( Л) -AT) у крыс линии w/ssm

У животных линии w/ssm регистрируются морфологические признаки воспалительных процессов в легких, а также множественные патологические явления: дерматиты, микрофтальмы, возникают опухоли желудочно-кишечного тракта и др. Известно, что развитие в организме человека подобных деструктивно-пролиферативных процессов часто сопровождается снижением в кровяном русле ингибиторов протеаз, большую часть которых составляет Л,-AT (Travis et al., 1983; Верзмеенко С.Т. и др., 1985).

У крыс линии ff/ssm после второго месяца жизни происходит снижение уровня активности -AT в плазме крови (табл. 6). Наиболее выраженное снижение активности -AT наблюдается к 4-6 месячному возрасту и сохраняется в течение всего первого года жизни.

Исследования генетических вариантов ¿> -AT у крыс линии w/ssm и контрольных методом изоэлектрофокусирования в диапазоне pH 4,2-4,9 в агарозном геле, а также методом иммуноблотинга с использованием кроличьих антител к Л/ -AT свидетельствуют об отсутствии отличий в подвижности, содержании и физико-химических свойствах d> -AT у животных исследуемых двух линий.Что может послужить причиной снижения активности А, -AT у крыс линии w/ssm? Показано, что генерирование 'ОН радикалов приводит к снижению активности -AT в организме человека (Dooley м.м. et al.,1982). Возможно, причиной этого является окисление метионина-ключевой аминокислоты активного центра ингибитора под воздействием свободных радикалов. Можно также допустить, -что снижение активности Ai -AT у крыс линии w/ssm происходит в результате частичного дегликозилирозания его из-за повышенной активности лизосомальных ферментов (в том числе и гликозидаз), обусловленной также активацией свободно-радикальных процессов у крыс линии w/ssm.

Таблица 6

Активность Л( -антитрипсина ( -АТ) в сыворотке крови крыс линии "Я/ЗЭК и контрольной

Возраст Активность Л -AT (Е.И./мл) Достоверность

животных -- отличий

Линия w/ssM Контрольная линия

I месяц 9,25+0,65 (6) 9,25¿0,35 (6) Р > 0,05

2 месяца 9,44iP,9I (8) I5,42±P,55 (8) Р < 0,05

5-6 месяцев 3,25+0,60 (14) 10,35+1,10 (14) Р ^ 0,001

12 месяцев 3,02+0,78 (13) 6,52+0,39 (10) Р < 0,05-

Примечание: В скобках указано количество животных.

Таким образом, в настоящей работе установлено, что у крыс линии w/ssM имеет место усиленный транспорт гексоз в клетки и вследствие этого происходит избыточное накопление их в клетках. Усиленный транспорт гексоз в клетки крыс линии w/ssm и развивающиеся на этой основе многие патологические явления коктроли -руются одним геном и наследуются доминантно. Увеличение концентрации гексоз в клетках ведет к увеличению внутриклеточного осмотического давления - фактора, поврездающего клеточные мембраны.

Очевидно, повышение концентрации Сахаров в клетках животных приводит к усиленному образованию суперксидрадикалов и далее особо активных гидроксилькых радикалов, которые инициируют пе-рекмсное окисление липидов и таким образом пойракдают мембранные структуры клетки: плазматические мембраны, мембраны лизосом, митохондрий и др. Повреждение клеточных мембран может быть главной причиной развития множественной патологии, в том числе повреждения миокарда, сходного с ГКМП человека, у животных личии w/ssm. в этиологии ГКМП человека также предполагается существенная роль наследственных факторов (Marón et al., 1984), Бюллетень ВОЗ, 1986).

У людей, больных ГКМП, нами были выявлены патобисхимичес-кие особенности, сходные с теми, которые характерна для крыс линии W/SSM.

Так, у больных ГКМП обнаружен усиленный транспорт гексоз в клетки (табл. 7), а также повышение активности лисосомальных гидролаз в лейкоцитах крови.

Таблица 7

Транспорт ^С-глнжозн и 3й-2 дезоксиглзжозы (^-ДОГ) в эритроциты больных ШМП и здоровых доноров

Убыль С-глюкозы Накопление Убыль 3Н-Д0Г из

Обследованные группы из инкубационной среды ^С-глюкозы в эритроцитах инкубационной среды

вч.102 Ва.102 Ва«102 -

мл мл мл

1. Больные ГШ

2. Здоровые доноры

36,0±1,4

28,6±1,9 < 0,05

18,0+1,1

13,8+1,0 0,05

159,5+14,6

83,6+9,0 <0,01

Примечание: приведенные цифры - средние определений у 15 больных ГКМП и 15 здоровых доноров.

Можно предположить, что одним из распространенных механизмов развития данной патологии человека является нарушение целостности клеточных мембран, подобное тому, которое мы наблюдаем у крыс линии и/зэм и .возникающее в результате повышенного транспорта гексоз в клетки, генерирования свободных радикалов и усиления процессов ПОЛ.'

Нельзя исключить, что имеются иные нарушения биохимических процессов и изменения клеточных структур, как наследственные, так и приобретенные, которые могут вести к сходным повреждениям миокарда:гиперплазии, гипертрофии и падению его сократительной функции., характерных для ГКШ человека.

Полученные данные открывают возможности для исследования эффективности лечения или предупреждения развития наследственных форм ГКШ путем корреции усиленного транспорта гексоз, элиминации ОН-радакалов, торможения процессов ПОЛ и иных нарушений метаболизма, предположительно лежащих в основе этих форм заболевания.

выводы

1. 7 крыс линии 5/ssm обнаружены морфологические измене« ния сердечной мышцы, подобные тек, которые наблюдаются у людей, больных гипертрофической формой кардиомиопатии (ГКШ). В числе наиболее характерных признаков ГКШ у этих животных отмечаются увеличение массы, расширение полостей желудочков, гипер-хро-фяя мышечных волокон миоаарда, сочетающаяся с диффузией колла-генизацией с-тромы и очаговыми склеротическими изменениям,

2. При исследовании патобиохкмических механизмов, способ— 1шх вести к развитию кардиомиопатических изменений сердечной мышцы у крыс линии г/SSM установлены следукяяе особенности этих животных:

2.1. генетически детерминированный усиленный транспорт гексоз в клетки;

2.2. повышенное содержание свободных радикалов (011) а ак- • тивация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в шокар-. де и печени;

2.3. дальнейшеэ возрастание в клетках животных концентрации 'ОН радикалов и продуктов ПОЛ при интенсивной нагрузке галактозой;

2,4» актавация лигосомальных г*:.:>.ролаз в клетках тог.дрда и иных тканях животных;

2.5. снижение активности ингибитора протекяаз -«Дан^ритрип-сина в сыворотке крови крас линии w/ssm.

3. Полученные данные позволили выдвинуть следующее представление о механизмах развития кардиомиопатпеских изменений сердечной мышцы и иных патологических процесс у з у инбреданх крыс линии w/ssm. Генетически детерминированная высока1?: активность . гексозных транспортеров в меточных мембранах веде!? к накоплению в клетках миокарда и иных тканях гексоз, г .?у?оокисленче ях служит причиной усиленного генерирования свооодк^х радикалов и активации процессов ПОЛ плазматических мембран, мембран клеточных органелл и, в частности,'мембран лизосом: с этим связан выход в клетки и межклеточное пространство лдзооома^ькых ферментов.

'Сочетанное действие свободных радикалов, перехксяого окисления мембранных фосфолипадов и лнзоооьальнах ферлеятов мехет

быть причиной нарушения морфологии и функций сердечной мышцы, развития кардиомиопатического синдрома, а также причиной ряда иных патологических процессов, имеющих место у этих .животных -катаракт, гепато- и спленомегалии, задержки роста и др.

4. У людей, больных ГКМП, выявлены патобиохимические осо-1 бенности, сходные с теш, которые характерны для крыс линии ff/ssm:

4.1. усиленный транспорт гексоз в клетки;

4.2. повышенная активность лизосомальных тидролаз в лейкоцитах крови: А- к '/-глюкуронидазы, У-ацетил-/- га-лактозаминидазы, У -ацетил-/ -2 -глюкозаминидазы, А- и у5"- га-лактозидазы.

4.3. Выдвинуто предположение о сходстве механизмов развития симптомов ГКМП у крыс линии w/ssm и больных этим заболеванием.

Основные материалы диссертации опубликованы в работах:

1. Гришаева О.Н., Соловьева H.A., Горностаев B.C., Салганик Р.И. ' Активность галактозо-1-фосфатуридилтрансферазы и транспорт

галактозы в культуре фибробластов крыс линии v7/ssm.- Бюлл. СО АМН СССР, 1988, т.5-6, с.102-105.

2. Соловьева H.A., СалганшГР.И., Кандауров В.В., Гришаева O.E., Морозкова Т.С. Создание экспериментальной модели наследственной галактоземии человека. - В кн. "Генетика - народному хозяйству". - Новосибирск, 1990, с.93-96.

3. Соловьева H.A., Гришаева О.Н., Кудряшова JC.H., Салганик Р.И. Наследственная галактоземия, множественные патологические изменения у крыс линии w/ssm и их коррекция путем геномного импринтинга. - Тез. докл. П Мевд. съезда медицинских генетиков. - Еарна, 1990, с.121.

4. Соловьева H.A., Гришаева О.Н., Косова Е.Ю., Салганик Р.И. Биохимические основы врожденных нарушений развития у крыс линии w/ssm и коррекция наследственной патологии путем геномного импринтинга. - Тез. докл. Всесоюзного совещания "Эволюционные и генетические исследования млекопитающих". ДВО АН СССР, 1990 , 4.П, С.Г70.

5. Гряшаева О.Н., Соловьева H.A., Салганик Р.И. Исследование ге-

нетико-биохшического механизма развития гипертрофической кардиомиопатиз. - Таз. докл. П Всесоюзного съезда медицинских генетиков. М., 1990, с.115.

6. Соловьева H.A., Шульга В,А., Гришаева О.Н., Салганик Р.И. Биохимические механизмы плейотропного действия мутантного гена, контролирующего развитие патологического симптомокомшгек-са у крыс линии w/ssm. Тез. докл. П Всесоюзного съезда медицинских генетиков. М., 1990, с.145.