Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моделирование множественной лекарственной устойчивости у малярийных паразитов грызунов P. Berghei

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Моделирование множественной лекарственной устойчивости у малярийных паразитов грызунов P. Berghei"

министерство здрлв00хранен ия ссср ордена трудового красного знамени шстш'уг

медицинской паразитологии и тропическом вдвдш

им. Е ЛОйгрцшю в ского

По прэпох рукописи

Хаширюов Фахраддин Исрзфил оглц

"моделирование шшественной лекарствйшой устойчивости у маляпйшга паразш'ов грузно'3 р. ее шзнег

03.00.19 - Паразитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1990

Работа анполнена в Ордена Трудового Красного Знамзнн Институте медицинской паразитологии п тропической медицина им.Е.И.Марцииоиского Минздрава СССР.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

Хомченовский Е.И.'

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Рабинович С.А.

Официнльн«?! оппоненты:

доктор мздицинских наук, профессор Падейсиая ЕЛЬ кандидат биологических наук Гордеева Л.М,

Ведугцее учреждение: Научно-исследовательский институт

медицинской паразитологии им.Л.Н.ИсаовЕ МЗ УзССР

Защита диссертации состоится 199 О1

в __ часов на заседании специализированного совета

Д.074.39.01 при Институте медицинской паразитологии и ' тропической медицины им.Е.И.Марциновского Минздрава СССР, по адресу: . 119830 , г.Москва, ул.Малая Пироговская, д.20

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институ

Автореферат разослан "_"_ 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

КОНОВАЛОВУ

Г"-': • - -

I I

I ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

|.....1/ }

'''~'*АктуйлУость теш. Лекарственная устойчивость I' и особенно множественная устойчивость (полиусч ойчипость) продолжает оставаться одной из наиболее актуальных проблем маля-риологии. Проблема полиустойчпсости актуальна

и для нашей страны. Это обусловлено широкими сттяш с развивающимися странами, эндемичными по лекарственно устойчивой тропической малярии (ЛТМ), необходимостью разработки рациональной химиопрофилактики советских граждан при их пребывании в таких зонах и назначения аденватного лечения в случае их заболевания таи ЛТМ, а также возможностью завоза ЛТМ на территорию СССР.

Тенденция к появлению с той или иной быстротой устойчивости у к широко применяемым отдельным препаратам -хлорозам, пирииетамин, хинин, а также появление случаев устойчивости к вновь внедряемым резервным препаратам - мефлохин, артениэииин, имеющим пока ещё ограниченное применение, серьёзно ослозшяет борьбу с тропической малярией - наиболее тяжелой формой малярийной инфекции. Не составили исключения и комбинч-цни препаратов. В ряде регионов потеряли или существенно снизили свои эффективность фансидар и другие комбинированные препараты типа сульфаниламид или сульфон (пиримстамин) (Камбоджа, Таиланд и некоторые др.страны). Имеются данные о снижении ь некоторых случаях эффективности сочетания хинина с теграциклином. Уяе-отмечена устойчивость и фансимефу - сочетанию фансидаря с нефтохином. Особое значение приобретает полиустойчивость Р.Щекрагмт , когда устойчивость к препаратам, последовательно вновь внедряемым в практику, наслаивается на уже ииою-

I

щуюся устойчивость к препаратам, ранее широко применявшимся, в первую очередь - к хлорохину.

Изыскание подходов к преодолению полиустойчивости требует создания соответствующих моделей, которые должны позволить изучить динамику ее развития и спектр лекарственной чувствительности и/или перекрестной устойчивости к разным противомалярийным препаратам.

К настоящему времени разработка гн vivo вопросов лекарственной устойчивости малярийных паразитов в значительной своей части проведена на модели малярии грызунов, вызываемой P.Ue^Kei с приобретенной моноустойчивостыо к .основным противомалярийным препаратам по отдельности. Лишь единичные исследования посвящены полиустойчивости.

Широкий круг препаратов, в отношении которых у P.bs^bei. может быть выработана устойчивость, позволяет считать P.Le^lwi универсальной моделью для изучения феномена лекарственной устойчивости.

Цель и задачи исследования. Создание разных вариантов лекарственной полиустойчивости малярийных паразитов к основным противомалярийным препаратам и комбинация« препаратов на модели малярии грызунов, вызываемой P.Let^eí, - Сило основной целью исследования.

Задачи исследования заключались в следующем:

- формирование линий P.Ue^Uei с приобретенной устойчивостью к сочетаниям хлорохин/фансидар., хлорохин/фансндар/хинин, хлоро-хин/фансидар/мефлохин, хлорохда/фансидар/артемизинин;

. * v

- изучение спектра лекарственной чувствительности и/или перекрестной устойчивости этих линий паразита к основным противомалярийным препаратам;

- изучение некоторых биологических особенностей сформированных линий (вирулентность, тропизм к ретикулоцитам) ;

- изучение влияния криоконсервацш на свойства полиустойчивых линий паразита.

Научная новизна. I. Показана возможность формирования полиустойчивости-к разным сочетаниям противомалярийных препаратов на модели малярии грызунов - Р.

2. Разработана оптимальная методика формирования полиустойчивости в зависимости от токсических и фармакокинетических свойств применявшихся препаратов.

3. Сформированы полиустойчивые линии Р.^о^юх к сочетаниям хлорохин/фансидар, хлорохин/фансидар/хинин, хлорохин/фансидар/ иефяояот, хлорохш1/фансидар/артеш!зга1га1. Установлен спектр чувствительности и/или уровень устойчивости каждого из сформированных изолятов в отношении всех основных противомалярийных препаратов по отдельности - хлорохин, хин»), мефлохин, артеми-зишш, а также в отношении комбинирс анного препарата фанси-дара и компонентов его составляющих - сульфадоксина и пиримета-мша.

4. Установлено, что развитие полиустойчивости к сочетаниян хлорохин/фансидар, хлорохш/фансидар/хинин, хлорохин/фансидар/ мефлохин, хлорохин/фансидар/артемизинин сопровождается в разной степени снижением вирулентности вплоть до полной её утра для мышей у линии, устойчивой к сочетанию хлорохин/фансидар/артемизинин,» повышением тропизма к ретикулоцитам.

5. Выявлено, что при хранении в глубоком холоде, у линий

Р ___»..И.-.- т/ г»г*т?(1»гт1м * и лт\п *г\ям /(^ЬпнЛип д^'тшнин .

• " , а и,,....— .— ----, -------г-,-^-, -—.....*

хлорохин/фансидар/мефтохин, хлорохин/фансидар/артемизинин, •

наступило дальнейшее спонтанное снижение вирулентности для

3

мышей, проявившееся после размораживания в способности вызывать у них только субпатентную инфекцию; при этом у хомяков сохранилась исходная вирулентность, характерная для каждой по-лиусгойчивой Л1ШИИ до криоконсервации. Вирулентность линии, устойчивой к сочетанию хлорохин/фансидар, в процессе нриоконсе]; вации не изменилась.

Практическая значимость.I.Сформированные линии Р. 1=»ог^ко1 устойчивые к разным сочетаниям противомалярийных препаратов, как широко применяемых, так и перспективных для внедрения в практику, могут служить моделью в исследованиях, связанных с разработкой рапных путей преодоления лекарственной устойчивом) малярийных паразитов, изысканием новых специфических•препарате, и комбинаций препаратов, а также поиском неспецифических подходов восстановления активности применяемых специфических средств.

2. Полученные данные могут быть положены в основу рекомендаций по применений того или иного противомалярийного препарата в зависимости.от спектра лекарственной полиустойчивости.

3. Сформированные полиустойчивые линии Р. Ьвг^Ка! могут быть использованы в медицинских учреждениях, связанных с проблемами тропической медицины, при разработке фундаментальных 1 прикладных исследований феномена лекарственной устойчивости № лярийннх паразитов.

Положения, выносимые на зищиту.

1. Характеристика линий Р. с приобретенной устойчивостью к разным сочетаниям широко применяемых и перспективных противомалярийных препаратов по спектру устойчивости и вирулентности.

2. Влияние криоконсервации на вирулентность полиустойчив линий.

Апробация работа. Основные положения работы доложены и обсуздены на коллоквиумах отделения эпидештологии я гжологии трансмиссивных паразитарных болезней.

Публикации. По теме диссертация опубликовано 2 работы.

' Структура и объей диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 2 глав, заключения, выводов, списка литературы. Объем диссертации страниц мэиинотшско-го текста, включая рисунков, таблиц. Список литератур! включает отечественных и иностранных исто-аниковI

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал» и иетодц исследования.

Модели. Работа выполнена на модели калярйн грмзЗгИОв.-г.б^л^ беспород?щз ншт я золотистые хомяки,- вызываемой .

Изолят£С <■ Принят за эталон в отношении чувствительности к хпорохину. Вызывает у мшей острута, смертелънум иифек-цгаэ, заканчивающуюся гибелью на 5-7 день инфекции в зависимости от способа заражения (в брэйгяну,' в мшцу, подкояаю) и зораяащей-до?м (количества паразитов в'стандартной объеив крови).

йзолят иИКвб, с естественно сниженной чувствительность« к хлорохину, послугтл исходной моделью для формирования, линии» устойчивой к сочетания хлорохил/фансидар, на которую в дйл^поЯ-оеи наслаивалась устойчивость к хинину, цефлозашу, артемяэкню»у соответственно. Чувствительность этого язолята ко всем щтиво-тлярийнкд препаратам приота за эталон для всех сформировонннх полйустойчивнх линий, Изолят ЬМК65 тазтгепет заражение мзлЛсП, однако П*г3с вирулентен, чей пзолят К , и характеризуемся ск-ом-ностьп я «ятнгпцяя шфекцпп - переход остро протекающей пнфчк-цли в йатяжнуо, разпггагшауяся на фона болея низкой и болел.стабильной пяразятекяп, заканчявяххзувся иногда сломгашпгс вмзд<зроп-

} ... ......

.пением. При отсутствии исхода в выздоровление гибель мышей может наступать через 10-12 дней с момента заражения в брюшину (Московский И.Д.,1981).

Препараты. Для формирования устойчивости и определения спектра лекарственной чувствительности сформированных линий применяли: хлорохин дифосфат (=делагил), фанседар-фиксирован-нал комбинация оульфадоксина с пириметамином (=тиндурин), хинина сульфат, мсфлохина гидрохлорид и артемизинин. Использовали промглпленн.ум субстанцию (порошок) хлорохина, сульфадоксина, пириыетаминп, мефлохина и хинина»официнальнне таблетки фансида-ра и образец А-2 артемизинша (порошок), выделенный в Институте химии растительных веществ (ИХРВ) АН Узбекской ССР изД^т^аа anno Li • Хлорохин, мефпохин, хинин - в виде раствора в дистиллированной воде, фансидар, пириметамин и сульфадоксин - в виде взвеси о 1% крахмальном клейстере вводили внутрь,через зонд в желудок, артемизинин - в виде взвеси в косточковом масле вводили в М'спцу. Препараты вводили животным в соответствии с их массой. Доза препарата, рассчитанная на 20 г массы тела животного, содержалась в 0,2 мл жидкой фазы (дистиллированная вода, крахмальный клейстер, косточковое масло). Дозу препаратов, выпускаемых в виде солей, исчисляли из расчета на основание.

Формирование полиустойчивых линий P.Wev-g^pi и их обозначение. Использовали рецидивный метод. Формирование лекарственно устойчивой линии проводили на хомяках с тем, чтобы по возможности замедлить утрату способности к гамонтообразо-ваюто, характерную для исходного изолята LNK65. Препараты, в отношении которых формировалась устойчивость, вводили зараженным хомякам в период интенсивно развившейся инфекции (3-4 день после заражения, уровень паразитемии 6-6,5 балла). Схему

6

введения препаратов определяла их переносимость хомяками и длительность сохранения активности в организме ««потного. Все препара кроме хлорохина,вводили в прогрессивно нараставших • дозах, первоначально - в дозах, которые обеспечивали бы наибольший эффект, однако не приводили к излечению - падение пя-раэитемии до субмикроскопического уровня с последующим парчли-тарным рецидивом. При рецидиве кроиь донора гге]х>виппли новой партии хомяков. По мере сокращения срока ремиссии на очередных ■пассажах и далее - при отсутствии ремиссия, если оффокт ст воздействия препарата был слабо выражен или не наступал - дозу препарата на последующих пассажах повышали.

Обозначение сформированной полиустойчивой липии включало название исходного изолята, сокращенные названия соответственных противомалярийных препаратов, к которым была сформирована устойчивость, метод формирования устойчивости (табл. -А.

Типы о гостов и критерии оценки. Достигнутый уровень устойчивости у сформированной линии и спектр чувствительности в от-ношенш! препаратов, с которыми не било связано развитие устойчивости, определяли в основных сериях опытов на ¡швах, как т более экономной модели для повторюго изучения. В отдельных сериях в связи с утратой вирулентности ряда полиустойчншх линий для гютей опыта ставили на хомяках. Использо-

вали опыты двух типов - "лечебный" и "подавляющий". Выбор "лша-опыта зависел от особешгостей соответствующего препарата, в первую очередь - от переносимости юетапи или хоняками и длительности циркуляции в организма в активно« состоянии. Эффективность хдорохкип, хшпма, ыефлохина и артемиз'.тлта у яярпхтлхх мытей и всех изучавшихся препаратов - у зараженных хомяков

7

определили в опытах "подавляющего типа". Препараты вводили повторно, 4 дня подряд, первое введение - через I час после заражения, последующие три - с интервалом в 24 часа. Использование опытен "подаиляощего типа" было обусловлено тем, что дробное «ведение позволяло поддерживать активную концентрацию испытуемого вещества в тех случаях, когда однократная доза, необходимая для достижения определенного условного эффекта, оказывает токсическое действие на организм животного, или препарат относительно быстро подвергается метаболизму либо выведению.

Эффективность фансидара, сульфадоксина и пириметамина у зараженных мышей изучали в опытах "лечебного типа" при однократном введения в период умеренной паразитеши (день инфекции 2-3, уровень параэигемии - балл 4,5-5,5). Дозы препаратов подбирали таким образом, чтобы их введение не вызывало полного излечения, а оказывало лишь определенное влияние на течение инфек ции в соответствии с принятыми критериями оценки эффекта. Эффективность определяли на основании анализа ряда критериев» характеризующих .различные этапы инфекции после их воздействия , (табл.2) (Маяковский Ш.Д., Дадашева Н.Р., 19 ; Мошковский Ш.Д с соавт., 19В1). Интенсивность паразитеши определяли в динамике ежедневно:в опытах "подавляющего типа", начиная со дня 2 инфекции (день заражения - день 0) и до начала митигации шфекцш в опытах "лечебного типа", начиная со дня введения препаратов и также до начала митигации. Уровень паразитеши выражали по шкале Ш.Д.Мошховского в баллах, соответствующих логарифму числ паразитов в условном объеме крови (Рабинович С.А,, Мошковский Л/. Д., 196,;).

Таблица I

Условные обозначения иэолята/линии, происхождение исходного изолята и полиустойчивой линии

Обозначение иэолята/линии* Происхождение и спектр , лекарственной устойчивости

Ш65 изолят, первично исходный естественная устойчивость к хлорохину

1НК65С1 ИСХОДНЫЙ I 1Ж65С 1МК65С ЬККббС [ЛЯ линий лТРО^ приобретенная устойчивость к сочетанию хлорюхин/фансидар

ьккб5ск]к?кг. приобретенная устойчивость к сочетании хлорохин/фянсвдар/ хинин

ЬМКббСЫРИРК. приобретенная устойчивость к сочетанию хлорохин/фансидар/ мефлохин

ЖбскгрАгЯ приобретенная устойчивость, я сочетании хлорохин/фансидар/ артешэинин

Структура обозначения:' ШК65 - исходный изолят -

хлорохин; Р - фансидар; и - хинин ; ИГ - мефдохин: А и - ортемизинин; К - рецидивный метод формирования устойчивой линии

Таблица 2

Типы опытов и критерии оценки

Тип опыта

Критерии оценки

Лечебный I. Срок наступления паразитарной ремиссия

после введения препарата, а при её отсутствии - срок максимального снижения урода! паразятемни (дай)

2. Длительность паразитарюй ремиссии (дни)

3, Срок достижения условного уровня гаразитемяи . ___- балл 4 при паразиташом рецидиве (рни;

Подайлящий I. Численность паразитов на следутий день

после гтрекравеяия введения препарате (б&ягш

2. Срои достижения условного уровня - бал* 4 ирн продолжавшемся развитии инфекция (дни)

Суждени« об уровне лекарственной устойчивости/чувствительности строили на основании соотношения доз каждого из препаратов, приводивших к одинаковому эффекту у-сравниваемых изолятов/ линий. Для интегральной количественной оценки указанных критериев эффективности был использован специальный показатель эффективности (ПЭ), определяемый графически в условных единицах (УЕ) (Дадшева Н.Р., 1982). Для уточнения результатов микроскопического подсчета числа паразитов в препаратах крови и их статистической обработки использовали специальную компьютерную программу (Лурье A.A., с соавт.,1990).

Маолят или линию, на которых работа временно прекратилась, подвергали крисжонсервации. В качестве криоконсерванта использовали стандартную смесь Роу - глицерин с сорбитолом. Замораживание осуществляли одноступенчатым способом, путем медленного погружения контейнера в пары жидкого азота.

Всего было поставлено 96 опытов, включавших в разных аранжировках, в зависимости от поставленной цели, 2 изолята и 4 полиустойчивые линии Р. .

Результаты исследований Первоначально была сформирована линия, устойчивая к сочетанию хлорохин/фансццар - LNK65ChlFR . В связи с тем, что устойчивость у P.fialdiparum к хинину, мефдохину и вртемизинину проявилась на фоне устойчивости к хлорохину и фансидару, эта линия была выбрана в качестве исходной для создания полиуетой-чивьх линий к сочетаниям хпорохин/фансидар/хинин - L.NK65CK1FQR хлорохин/фансидар/мефлохин - ЦМК65СК1РМР(? . хлорохин/фансидар/ артемизинин - LNK65CWFArf? . Для поддержания уровня устойчивости к хлорохину и фансидару в процессе наслоения устойчивости

10

к хинину, мефлохину и артемизинину, периодически на отдельных пассажах вводили только хлорохин и фансидар.

Сп чтр лекарственной чувствительности подиустойчивых линий. Линия_ . К 166 пассажу на хомяках при одно-

кратном параллельном воздействии хлорохина с фансидаром на последовательных пассажах эффект фансидара, близкий к первоначально»^ воздейотвию был достигнут в дозе, в 10"раз болеа высокой.

В опытах на мшах установлено, что чувствительность этой линии к хлорехину снизилась в сравнении с изолятом ЬКК65 более чем в 4 раза, в сравнении с изолятом К" - в 30 раз (риг.Л). Чувствительность ЬККббСКНЧ? оказалась более низкой, чем у ЬМКбб, к фансидару и одному из его компонентов, сульфадоксиду в 2 раза (рис.2,3), к другому компоненту, пиркметамину -'» 31 раз (рис.4), Эти значительные различия, отмеченные в отношении уровня снижения чувствительности к фансидару и еульфадокашу с одной стороны, н к пиркметамину - с другой стороны, свидетельствуют о высоком потенцирующем взаимодействии сочетания сульфа-догебкн/гофйметамин, несмотря на столь высокий уровень енияекия чувствительности к гтриметамйну. У ЬЫК65Ск1ГП на выявлено перекрестной устойчивости к мефлохину и выраженной перекрестной устойчивости н хинину. Оцнако вдвое снизилась чувствительность этой линии к артемизинину^ в сравнении с изолятом 1ЛК65,

Линия При формировании »той линии хинин ия

последовательных пассажах вводили хомякам дробно, в связи с очень ограниченной возможностью повышения доз при однеярйтесм Вйедгпкй, необходимых для прогрессивного нарастания устойчивости. К 17-му пассажу суточная доза при 4-кратном введении была ' - ц

Чувствительность к хлорохгну в фансядару лиявг ЬЫК65СИР1? 2 сравненки

I с изолятами иъгКвБ м 'К •

П * ♦

я 6-

I Б-

условный уровень / -77—

" Лкй ннфекда

а

Дни инфекцаи

- заражение; * введение препарата; Ж- уровень паразитемни на следущий день после окончаягя введения препарата; □ - срок достижения условного уровня паразитемии после окончания введения препарата,Я токе, при паразитарном рецидиве; Л - наб-оэдеяие прекращено___

Линия/изолят.'Уеловн.!доза хло-!критерии оценки'! |лвния/изолят1о/сдовн. ¡Лоза Фан-!Критерии оценкиша

' ; • !обозна-!сидара !Т """ ""

иМКвВОаргК.

!обоэка~!роэиана !чения нг/кг)

I ' и.Ъь"

1 ! г—! СУЗ) I

{(баллы)? (дна) ? —373"

I

П7ГО"

игчк&к ___

0,015 0,002

0,6

6,3 3,35 | 7,1. 3,5 |

........;-Дара

!чения !(г/кг)

. 2 ! З'ЧУЕ) ! (да)! (дан)! (дан)

0,0015

7,9 2,73

ut4vi.es-

0.00075

7,7 2,75 |

Qctí

%

M

О о

о Ъ

О о

й to сл

M to

CTJ о СП CD

W JO

8 Й

л о •<

со о. о

И О fc)

Ьио

m № ц

Ю и

о о

к о р>

ь я

о

н*<

к и

to tr" i

«—« ^

Й и с)

к ы

Б! и

ев

tí

&

t*¡

ы О

w В

си

Я

§

Ич S

il

Сравнительный (Залл паразитемии f- й W ^ <р »

ай M N «

И lû О

Сравнительный балл паразятемии #. к « * m ® ч

повышена лишь до максимального предела переносимости - в 4 раза, в сравнении с первоначальной.

Определение достигнутого уровня устойчивости LNK65CK1FQR к хинину у зараженных мышей показало, что чувствительность

LNK65CWFGR. к хинину снизилась более, чем в 2,6 раза río сравнению с исходной для него линией L№65ClilFR и в 4 раза по сравнению с изолятом UJK65 (рис.5). Токсичность хинина не позволила уточнить предел повышения устойчивости. Наслоение устойчивости к хинину на устойчивость к хлорохину и фансидару привело к перекрестной устойчивости к мефлохину, чувствительность к которому снизилась в 1,5 и 2,1 раза против ЬИКба^ТТО и UJK65 соответственно. Перекрестная устойчивость к артемизинину сохранилась на уровне, характерном для исходной линии - LMK65CkTFR.

Линия ШббШГМРК . Так же, как и при формировании устойчивости к хинину, мефлохин, из-за ограниченного предела переносимости, вводили хомякам на последовательных пассажах дробно. К 15-му пассажу под воздействием мефлохина суточная доза при четырехкратном введении была повышена в 55,5 раза в сравнении с первоначальной. ч

Опытн на мышах показали, что чувствительность к мефлохину у UJK65CKLFMfR снизилась по сравнению с ЩКбБЙЯР^не менее, чем в 20,6 раз, по сравнению с LNK65 - не менее, чем в 28,6 раз (рис.6). Уточнить степень снижения чувствительности не представлялось возможным, так как-воздействие более высоких доз мефлохина, необходимых для этой Цели, оказалось за пределом их переносимости мышами. Развитие устойчивости к мефлохину йа фойе предсуществуюцей устойчивости к сочетании хлорохин/фансндар привело к более выраженной перекрестной устойчивости к хинину: чувствительность снизилась не менее, чем в 2 раза по сравнению

Чувствительность к мефлохину линии

шсег-сдамРЕ с? ио^к®!

в сравнении с линией и из слетом х.яьс&Б'.

ля яз я/и золатисх.от. .'Доза .'Критерии оценка !

!о<Зозн. 1хянана! гл„1„л. (_2~ГШЭ ! _! !г/кг | {72) 1

* М бТз 1,2 ' х/ Г

_2 0.1 О ЪЛ З!7В 1

Ш7? ---

через день после заражения теш развития инфзк-цал превысил Залл 4-

Чувствительность к хинзшу jaHHaWKBSTÇKlFQR. ¿Ue^rfKei в сравнении с линией

TtftCBSTÊWFR. и изоляюн INNbb

jit t

71

5-

условкип ^уровень цораоитощга

9 еэ

дни инфекции ~

Лгная/йзадят! j' слова Î0003H. ! ¡Лоза ме$- !жшша Ir/KT -lüpBTep] ¡M оценкиju¿> ! 2-й t

LNK65CWirMfR Li«KS5CklFR • L.NK&ST 1 2 3 . 0,1 0,006 0.0035 и.Д Ii ■ 4-8 0 2,9 7.1 4,3 6.S 3.9

с ЬНК65С№£ , и в 3 раза - п^ сравнению с ШК65. Линия

1л(\,К65С^',1.№,Р{2 сохранила уровень перекрестной устойчивости к артемизинину, характерный для его исходного линии ШК65$Л]?К .

Линия ^МКбб^ЩАЖ х В связи с быстрым выведением а рте- • мизинина из организма животного и необходимостью создания относительно стабильной концентрации,при формировании этой линии артемизинин вводили хомякам на каждом пассаже повторно. К 20-му пассажу эффект, близкий к первоначальному воздействии аргеки-зинина, был достигнут от суточной дозы в 10 раз более высокой. При заражении мшей выявилось снижение чувствительности згой линии к артемизинину в 2 раза и в 3 раза против ШК65С№К и №65 - соответственно (рис.7). Формирование устойчивости к артемизинину привело к снижению чувствительности к хинину в срав нении с - в 1,5 раза, в сравнении с ШК65 - в 2

раза. Чувствительность к мефлохину практически не изменилась, против ишббСШГК » однако, оказалась в 2 раза более низкой, чем у Ц]К65. Периодическое воздействие только сочетания хло-рохина с фансидаром на линии ЬЭДбЗДВД^ ШббЩЩ^*?,

ЬИКббС^'Щрй! позволило сохранить уровень устойчивости к хло-рохину и фансядару, характерный для их исходной линии - ШК65

'сйиг.

Вирулентность полиустойчивых линий и тропизм к ретикуло-цитам. Формирование указанных типов полиустойчивости привело к снижению вирулентности у соответственных линий для мышей и хоия ков, в меньшей степени для последних» в сравнении с изолятом

иМК65. Это нашло свое отражение в более выраженной способности к митигацни инфекции. По степени выраженности феномена мити-гации сравниваемые изоляты могу? быть расположены в следующем

16

гввтельность к артешзинину лшвия 1ЖВ5"

. а сравнении и изолятом ШС651.

с линией ШК&5 C.K1FR

Динамика паразятемлв линии

2 ь е- «s

Дшз знфекциа

« « -

со FM

сэ crt

ci

u

э-

А

и 2-

эт

я

•Í--

П)

M«

О

условии;; уровень

ларазитемии

\\

i

's

. с

V

—r~ ■а

Шшгая/изодят IJслова.¡доза арте- Аратерив оценка^?

lodosa. ! ? ?

f

U.KéffüWfcAr'W

imescwu

UKK.65- ■

i 2 3

зинина !" /кг

и.ш -

0,015 0,01 F TT

1-й ! 2-й !(УЕ)t

4,3 О О

7,0 6,2

3,8 J 3,5 !

i1 - заражение;

1.LNKG5CMF R-----

2.ШС&£Г CKIMfR—— 3 .UÍK&5- CWFQR-e-w— 4. UslK65-CblFA^R—

-t-г—г:—H Ь-

£3 7 О «о

,. Дша инфекции ö - ировь не всследозалз

Esc.В

порядке: ЬМКббС ШббСШЧМ иМК65СК1РМГТ?< ЬНК65СЬТГ<Ж<

ЬИКвбСЦРАуЛ^ (рис.ь). К наиболее резкому снижению вирулентности для мышей, вплоть до полной утраты способности вызывать у них развитие паразигемии, привело наслоение устойчивости к артемизинину, однако янфективность этой линии для хомяков сохранилась.

Исходный изолят 1Ж65, все полиустойчивпе линии характеризуются тропизмом к ретикулоцитам. При этом по мере снижения вирулентности тропизм к ретикулоцитам нарастает в такой же последовательности, как это указано в отношении способности к ми-тигации инфекции.

Влияние криоконсервации на состояние полиустойчивых линий Р.и<з^Ь<з1. Криоконсервации были подвергнуты по 5-6 крно-стоков каждой полиустойчивой линии: иЩббСШ^К , ЬШ65С1ДД?£ т криосток от зараженных хомяков и Ш£явй, ЬМКббСЙРА^Я - криосгок только от зараженных хомяков, в связи с тем, что эта линия потеряло способность вызывать патентную инфекцию ещё до криоконсервации. После хранения всех криостоков в криобанке на протяжении 5-и месяцев и последующего размораживания, введением суспензий эритроцитов всех полиустойчивых линий хомяком вызывали у них патентную инфекцию. Однако способность вызывать патентную инфекцию у.мышей сохранилась только у линии \,МК65СМГ^. Неоднократные попытки . заражения мышей разного возраста и молодых к^ыс суспензиями эритроцитов линий . ЬЖбЕСМте, ЩКббШШПг , ШКббСЬГА^ не привели к появлению паразитов в их периферической крови (наблюдение 2 месяца). Эти данные позволили предположить возможность дальнейшего

снижения вирулентности для мытей в процессе криоконсервации,

18 .

выразившегося в способности вызывать у трс только субпатентную инфекцию. Введение крови таких мышей в разные сроки с момента их заражения интактным хомякам - изодиагиостяческая проба -сопровождалось развитием у хомяков паразитемии, не отличавшейся по интенсивности от наблюдаемого до криоконсервации, что подтвердило предположение о сублатентном характере инфекции у мышей.

Известно, что ретикулоцитоэ создает более благоприятные условия для развития малярийной инф<зкции. В естественных условиях хомяки характеризуются более высоким содержанием ретикуло-цитов в периферической крови в сравнении с белыми мышами, что могло способствовать проявлению у хомяков патентной инфекции при пониженной вирулентности паразита. Однако несмотря на создание у мышей ретикулоцитоэа путем введения 3% раствора фенил-гидрозина (доля ретикулоцитов составляла 60-80% от общего числа эритроцитов) и искусственного кровопускания, парпзитемия не приняла патентный характер. Не дала также результата попытка вызвать у мышей депрессию естественного иммунитета повторным введением гидрокортизона.

Эти данные позволяют предположить, что резкое снижение ин-фективности, проявившееся у линии, устойчивой к сочетанию хло-рохин/фансидар/артемиэинин ещё до криоконсервации, а у линий, устойчивых к "сочетаниям хлорохин/фансидар/хинин и хлорохин/фан-сидар/мефлохин после размораживания, - связано с неизвестным нам механизмом, определяющим взаимодействие на уровне паразит/ эритроцит и ответственным за инфективность для мьшгей.

Лекарственный спекг£. Необходимо было выяснить | не ит^з

лась ли криоконсервация на спектре лекарственной чувствитель-

19

ности каждой из полиустойчивых линий. В связи с тем, что линии UMK65CKIFQR и LNK65CklFMPR ;'лосле криоконсерва^ш потеряли способность вызывать у мышей патентную инфекцию, а линия

LNK65CW$JW£. ещё до криоконсервации, изучение было проведено на хомяках в тех же аранжировках опытов, кок на мышах до криоконсервации. Все линии проявили характерный для них лекарственный спектр.

Заключение

Сформированные линии , устойчивые к разным со-

четаниям основных противомалярийных препаратов, широко применяемых и перспективных для внедрения в практику - хлорохин/фан-' сидар, хлорохин/фансидар/хинин, хлорохин/фансидарЛюфлохш, хлорохин/фансидар/артемизишт - позволили изучить динаьшку развития устойчивости и дать характеристику спектра и уровня кх лекарственной чувствительности и перекрестной устойчивости, в зависимости от сочетаний препаратов, вызвавших развитие устойчивости. Устойчивость указанных тйпоВ связана со егокениен вирулентности паразитов для золотистых хомяков и мышей. Криоконсервации привело ,к дальнейшему снижению вирулентности, но не отразилась на лекарственной характеристике полпуетойчивых линий.

ВЫВОДЫ

I. В результате моделирования на золотистых хошках лекар-; ственной полиустойчивости Н^ основе изолята LNK65 P.l^c^kex« , с естественно низкой чувствительностью к клорохину, сфор&шровя-' им 4 линия P,Le/^->ei с приобретенной устойчивостью к сочетаниям основных противомалярийных препаратов',-- хлорохии/фансидар - линия UiK^CkTFR. : * 20 . • ■ -

- хлорохин/фансидар/хишш ~ линия ШКббСкТРрТ?.

- хлорохкн/фансццар/мефдохш - линия ШКббС^ТРМР^

- хлорохин/фонсидар/артемизшии - линия ШКбЬСкТРЛгТ?.

При этом наведение устойчивости к хшвду, мефлохшу или

»

артелизшшгу соответственно проведено на основе линии ШК65 СШГД • • .

2. Установлено наиболее быстрое развитие устойчивости р хинину и нефлохину и наиболее медленное - к артемизинину; самый высокий уровень устойчивости получен в отношении мефло-хина.

3. Показана перекрестная устойчивость линии ШК6501£Р1^

. к артемизинину и сохранение уровня чувствительности к мефяохи-ну и хинину равное таковому исходногб нзолята ЬЫК65,

4. Обнаружено отсутствие влияния наведенной устойчивости к хинину, мефлохину или артемизишшу - линии ЬНК65СК1РС?^

ШШЖШ-?., ЬдабШ^Ши^. - на уровень устойчивости я хлорохину, фансгвдару или его компонентам - сульфздоксину и пириметамину, характерный для исходной линии - ШК65СЙР^_ .

5. При наведении устойчивости и хинину, нефлохину пли пр-темизннину установлено появление перекрестной устойчивости линии ШббСЙРОТч- к мефлсхшу, линии ШббСкТШ-Р^: к хинину и линии ШКббШЭДИ? - к хинину и мефлохину.

6. Показано отсутствие влияния нааеденной устойчивости к хинину или мефлохину на уровень перекрестной устойчивости к артемизинину, присущий исходной линии ШКббСШ^.

7. Выявлено снижение вирулентности сформированных полпус-тойчивнх линий Р. для хомяков и мылей. По степени выраженности вирулентности в сравнении с исходным иэоляток эти

21

линии могут бнтъ расположены в следующем порядке: ШК65>

шкббшгк. >• иикб5сдам^> ьдаб5СШго?г> •

1,МК65СЦШ? - при полной утрате линией иЖббСЦТАт^ способности вызывать патентнуи инфекции у мышей.

а. После хранения в глубоком холоде обнаружено дальнейшее снижение вирулентности линий Ш^бЭДОИЖ. и ,

выразившеезя в способности вызывать у мышей только субпатеит-нув инфекцию, при сохранении способности всех 4 линий вызывать патентную ик<]юкцшэ у хомяков.

9. Установлено отсутствие влияния криоконсервацнн. на лекарственную характеристику сформированных полиустойчивых линий.

Практические рекомендации Сфорикрованшэ полиустойчивые линии могут

быть использованы в медицинских учреждениях, связанных с проблемами тропической медицины, при разработке фундаментальных и прикладных исследований лекарственной устойчивости малярийных партнтов.

I

Внедрение результатов исследования в практику Сформированные линии Рполиустойчивые к сочетаниям разных противомалярийных препаратов, внедрены в практику научно-исследовательских работ на кафедре биологии (с курсом паразитологии) Военно-медицинской Академии им.С.М.Кирова и в отделе эпидемиологии и экологии трансмиссивных паразитарных болезней ШПиТМ им.Е.И.Марциновского МЗ СССР.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации I. Хомченовский Е.И., Федорова О.В., Ханмирэоев Ф.И. Изучение противомалярийной активности отечественного артемизи-ниня на -чувствительном штате Р.Ье^пех.. 532 Национальная

конференция по паразитологии.- Варна, 1987.- С.156-69.

2. Ханмирзоев Х.И., Дадашева Н.Р., Куликовская И.М., Рабинович С.А, Моделирование множественной лекарственной устойчивости малярийных паразитов.- Иед.паралитол. и паразитарные болезни.- 1990.- »5,- С.60-63.

Подписано к пачати 15.XI.90 г, Зак. 1026. Тир. 100 зна, Отпваагаво в ПК НПО "СОСЗИЕДйНФОРа».