Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микроспоридиоз сверчка Gryllus bimaculatus, вызванный Nosema grylli

ВАК РФ 03.00.09, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Микроспоридиоз сверчка Gryllus bimaculatus, вызванный Nosema grylli"

На правах рукописи

СЕЛЕЗНЁВ Константин Владимирович

Микроспоридиоз сверчка Gryllus bimaculatus, вызванный Nosema grylli

Специальность: 03.00.09 - Энтомология.

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ - 1997

Диссертационная работа выполнена в Цитологическом научно-исследовательском институте (ЦИН РАН) и Всеросийском научно-исследовательском институте защиты растений (ВИЗР РАСХН).

Научный руководитель

Официальные оппоненты

Ведущее учреждение

Доктор биологических наук, профессор И.В. Исси

Кандидат биологических наук, доцент A.A. Добровольский,

Доктор биологических наук, проф. H.A. Вилкова.

Зоологический научно-исследовательский институт РАН.

Защита состоится 15 января 1998 г. в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д.020.01.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений по адресу:

189620, г. Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, д.З.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты ратений.

Автореферат разослан 8 декабря 1997 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Г.А. Наседкина.

Актуальность темы. Широко распространённые у насекомых паразиты, регулирующие численность популяций ряда сельскохозяйственных вредителей, микроспоридии привлекают к себе внимание специалистов в области защиты растений как возможные продуценты биологических препаратов. Применение микроспоридий в микробиологическом методе борьбы с вредителями затруднено из-за слабой изученности механизмов их воздействия на своих хозяев. Изучение тонких механизмов взаимоотношений паразита с хозяином перспективно для разработок и применения новых подходов к борьбе с сельскохозяйственными вредителями (Canning, 1982; Онацкий, 1983).

Микроспоридии - тип внутриклеточных паразитических простейших. Жизненный цикл включает мерогонию (пролиферацию), спорогонию и спорогенез (формирование спор) и проходит в одной клетке хозяина. Споры - расселительные инвазионные стадии. Попав с кормом в организм хозяина, они, выстреливая полярную трубку, вводят зародыш паразита прямо в клетку хозяина (рис. 1).

Рис. 1. Жизненный цикл микроспоридии Nosema grylli

Большинство работ по изучению взаимоотношений микроспоридий и их хозяев на клеточном уровне касается ультратонких изменений клетки хозяина, тогда как биохимические исследования еденичны. Это объясняется, главным образом, сложностью работы с данным объектом, как внутриклеточным паразитом, так как существует проблема отделения его от тканей хозяина.

К началу проведения данной работы не было удобной экспериментальной модели - объекта, позволяющего вести лабораторные и биохимические исследования круглый год. Многие насекомые трудно культивируются в лабораторных условиях, особенно в зимний период. Объект

для наших исследований должен был удовлетворять следующим требованиям: быть легким для культивирования, доступным в любое время года и иметь достаточную для биохимических исследований биомассу.

Цель исследования. Исследование паразито-хозяинных взаимоотношений микроспоридии Nosema grylli и сверчка Gryllus bimaculatus и описание основных биохимических особенностей патогенеза при микроспоридиозе.

Задачи исследований

1. Описать основные особенности микроспоридиоза сверчков G. bimaculatus, вызванного микроспоридией N. grylli, на организменном уровне и связать полученные материалы с дальнейшими биохимическими исследованиями.

2. Разработать метод выделения и очистки преспоровых стадий развития микроспоридий от тканей хозяина с целью обеспечения возможности проведения биохимических исследований.

3. Изучить изменение содержания резервных белков и вителлоге-нинов при заражении в целях выяснения влияния болезни на пластические и энергетические ресурсы насекомого-хозяина.

4. Изучить изменение содержания белка теплового шока hsp-70 в жировом теле сверчков в ответ на заражение микроспоридиями в целях доказательства возникновения состояния стресса у заражённых насекомых.

Научная новизна

1.Дано научное обоснование использования объекта, пригодного для проведения биохимических исследований паразито-хозяинных отношений микроспоридий и насекомых - сверчка G. bimaculatus, заражённого новым видом микроспоридии N. grylli.

2. Впервые в мире разработан метод очистки преспоровых стадий развития микроспоридий непосредственно из органов насекомых центрифугированием в градиенте плотности перколла.

3. Описаны основные особенности микроспоридиоза сверчков, заражённых N. grylli, на организменном уровне.

4. Впервые в мире показано для насекомых изменение содержания при микроспоридиозе следующих белков:

Вителлогенинов. накапливающихся в гемолимфе, группы резервных белков, исчезающих из жирового тела, белка теплового шока hsp-70. накапливающегося в жировом теле, белка с молекулярным весом 110 kDa (р-110). накапливающегося в жировом теле, белка с молекулярным весом 90 kDa (р-90). исчезающиего из гемолимфы самок.

5. Для самих микроспоридий впервые описаны некоторые белки, в том числе: два основных цитоплазматических белка с молекулярным

весом 70 и 75 kDa (р-70), основной белок с молекулярным весом 40 kDa (р-40) клеточных стенок преспоровых стадий развития и спор.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены в Военно-медицинской академии (BMA, 1993), на 47 ежегодном собрании Американского общества протозоологов (Cleveland, Ohio, 1994), в лаборатории микробиологического метода защиты растений (ВИЗР, 1997), на кафедре зоологии беспозвоночных Санкт-Петербургского государственного университета (СПГУ, 1997), на заседании Российского протозоологического общества (ЦИН РАН, 1997) и на XI съезде Российского энтомологического общества (ВИЗР и СПГУ, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, (1 в иностранном журнале) и 3 тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 180 страницах машинописного текста, содержит 42 рисунка, 24 фотографии, 42 таблицы. Список литературы включает 180 работы.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Глава 1. Обзор литературы

Дан анализ литературы по паразито-хозяинным отношениям микроспоридий и насекомых. Выяснено, что заражение личинок приводит к увеличению смертности, сроков их развития, и, иногда, к увеличению количества личиночных линек. В некоторых случаях заражение может приводить к увеличению массы тела насекомых, но чаще наблюдается её снижение. В жировом теле происходит истощение резервных питательных веществ. Отмечены сложности в прохождении личинками линек и метаморфоза. У заражённых имаго снижается плодовитость, и уменьшается продолжительность жизни.

Предполагается, что некоторые патологические нарушения происходят вследствие выделения микроспоридиями аналогов ювенильного гормона. Отмечается однотипность воздействия на насекомых микроспоридий и паразитов других систематических групп на организменном уровне.

На- основании данных по физиологии насекомых предполагается возможность изменения содержания некоторых белков при заражении. Среди них обсуждаются: Резервные белки, накапливаемые в жировом теле для прохождения метаморфоза. Вителлогенины. синтезируемые в жировом теле взрослых самок для формирования яиц насекомых и служащие резервом при эмбриогенезе личинок. Основной белок теп-

лового шока Изр-70. который может являтся индикатором состояния стресса в клетках различных организмов.

Глава 2. Материал и методика исследования

Материал, Б результате тестирования ряда объектов на пригодность к биохимическим экспериментам наиболее подходящим оказался сверчок й. ЫтасиЫиз, заражённый микроспоридией N. §гуШ. Преимуществом этого объекта были лёгкость культивирования сверчка, возможность его круглогодичного содержания, большая биомасса заражаемых тканей и возможность получения значительных количеств паразитов. Использование этого объекта позволило описать паразито-хозяинные отношения микроспоридий и насекомых на биохимическом уровне.

Лабораторные опыты. Сверчков содержали по методу А.Н. Князева (1985) в инсектарии ИЭФ им И.М. Сеченова РАН. Часть сверчков заражали искусственно, добавляя в поилку споры. После линьки сверчков на имаго насекомых метили. Каждый день из террариумов отбирали личинок последнего возраста и взрослых сверчков 1, 5, 10, 15, 20 и 25-го дня развития после линьки на имаго. За один день снимали данные от 8-16 сверчков. Всего обработано 316 сверчков. Отобранных насекомых препарировали, и все отпрепарированные органы взвешивали. Объём жирового тела определяли при помощи отградуированной центрифужной пробирки объёмом 800 мкл.

Достоверность различий проверена по ^критерию Стьюдента. Подсчёт данных произведён в среде (З-Вазю.

Очистка стадий развития. При проведении работы по очистке стадий развития микроспоридий все процедуры производили при +4°С. Плавучую плотность определяли с использованием её маркеров (РЬагтааа).

Электронная микроскопия. Все образцы для электронной микроскопии префиксировали 15 мин в 2%-ном растворе О3О4, фиксировали 1 ч 2.5%-ным глутаральдегидом на 17 шМ фосфатном буфере (рН 7.2) с последующей дофиксацией в течение 1 часа в 1%-ном растворе 0э04 на 87 шМ ЫаС1, 50 тМ фосфатном буфере (рН 7.2). Для обезвоживания использовали спирты возрастающей концентрации от 50° до 100°. Пропитывание материала осуществляли в смесях ацетона и эпона 812 в соотношениях 3:1, 1:1, 1:3. Полимеризация блоков протекала в термостате при температуре 60-64°С в течение суток. Срезы изготавливали на ультротоме ЬКВ-Ш. Тонкие срезы контрастировали уранилаце-татом и цитратом свинца.

Электрофорез и вестерн гибридизация. Для работы с белками использовали SDS электрофорез в полиакриламидном геле. Гели фиксировали в смеси 40%-го метанола и 20%-ной уксусной кислоты 40 мин и окрашивали в 0.2%-ном Кумаси (Coomassie brilliant blue R), 40%-ном метаноле, 10%-ной уксусной кислоте 20 мин. Для определения молекулярного веса белков использовали маркеры молекулярного веса (LMW Calibration Kit, Farmacia).

Для вестерн гибридизации белки переносили с полиакриламидного геля на нитроцеллюлозу и последовательно обрабатывали антителами на тестируемый белок и вторыми антителами с пришитой пероксидазой хрена. Окраску производили с использованием DAB. Для специфической окраски белка hsp-70 использовали поликлональные антитела против этого белка,, полученные в группе Б.А. Маргулиса (ЦИН РАН) и очищенные на колонке с CNBr-сефарозой с hsp-70.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Тлава 3. Основные особенности патогенеза сверчков, вызванного микроспоридией N. grylli

Основным местом инвазии N. grylli является жировое тело сверчков. Кроме него споры и стадии микроспоридий обнаружены в тканях стенки кишечника, мышцах, придаточных половых железах, яичниках и семенниках.

Добавление спор в поилку приводит к заражению большей части сверчков, следовательно, их заражение происходит перорально. При исследовании яиц, отложенных заражёнными самками, ни спор, ни других стадий развития микроспоридий не обнаружено. Таким образом, вполне вероятно, что алиментарный путь заражения - основной для этих насекомых. Другие пути заражения нами не исследовались.

Установлены различия в реакции на микроспоридиоз у личинок и у имаго сверчков. Большая часть сверчков, заражённых в ранних личиночных возрастах, но сумевших пройти личиночно-имагинальную линьку, погибала или сразу после линьки на имаго или через несколько дней после неё. Такие сверчки часто имели деформированный яйцеклад и недоразвитые крылья. Сверчки, заразившиеся на поздрих личиночных возрастах или после линьки на имаго, напротив, свободно линяли, выглядели здоровыми и составляли значительную часть лабораторной популяции сверчков. От здоровых они отличались большим объёмом жирового тела и недоразвитыми яичниками (рис. 3, 5).

Заражение личинок сверчков приводит к увеличению их смертности, Происходит удлинение сроков развития и наблюдаются нарушения

в прохождении метаморфоза, что может являться косвенным свидетельством снижения содержания экдизона и увеличения содержания ювенильного гормона в заражённых сверчках.

У заражённых сверчков наблюдается значительное уменьшение содержания жира практически на всех сроках развития (рис. 2). Наряду со снижением содержания жира в жировом теле микроспоридиоз снижает массу сверчков (рис. 4). Особенно сильным оказывается влияние на личинок.

У имаго наблюдается увеличение объёма жирового тела у сильно заражённых насекомых, однако, сильно заражённые личинки по объёму жирового тела от здоровых не отличаются (рис. 3). Напротив, средний объём жирового тела у заражённых личинок незначительно ниже, чем у здоровых. По нашему мнению, увеличение объёма жирового тела у имаго происходит вследствие накопления в нём больших объёмов пре-споровых стадий развития микроспоридий и спор. У здоровых личинок жировое тело заполнено запасами жира, при заражении содержание жира снижается, а место жировых гранул замещается паразитами, и поэтому увеличения объёма жирового тела не происходит.

Нами показано, что микроспоридиоз препятствует нормальному развитию яичников (рис. 5). Интересно отметить, что в большинстве случаев яичники заражённых сверчков не содержали яиц или же содержали единичные яйца. Закономерен вывод, что заражение снижает плодовитость самок сверчков. При определении массы семенников у зараженных и здоровых самцов мы обнаружили, что заражение практически не влияет на этот показатель (рис. 6).

Мускулатура заражённых сверчков имеет тенденцию к уменьшению массы. Споры микроспоридий были обнаружены в грудных мышцах, и в мышцах ног заражённых сверчков. Мы полагаем, что, по всей видимости, заражаются не непосредственно мышечные клетки, а находящиеся поблизости клетки соединительной ткани.

Микроспоридиоз влияет на покровы только сверчков, заражённых в ранних личиночных возрастах. У сверчков, заражённых в поздних личиночных возрастах или после линьки на имаго, микроспоридиоз практически не влияет на массу крыльев, однако, у сверчков, заражённых в личиночном возрасте, наблюдается её значительное снижение.

В целом описанная нами картина полностью совпадает с имеющимися в литературе данными по многим другим микроспоридиозам. Таким образом, микроспоридиоз сверчков, вызываемый N. ^гу1Н, является типичным примером инвазии, вызываемой патогенами этой группы простейших.

"1-г

Л 1 5 10 15 20

дни развития

Рис. 2. Влияние заражения на содержание жира.

мкг 1200 п

900 -600 300 О

-!-1-1-1-1-1

Л 1 5 10 15 20

дни развития

Рис. 4. Влияние заражения на массу сверчков.

мм0

300

200

100

—I-1-1 I-1-1

Л 1 5 10 15 20

дни развития

Рис. 3. Влияние заражения на объём жирового тела, мкг 160

120 ■ 80 -40

О

—I-1-1-1-1-1

Л 1 5 10 15 20

дни развития

Рис. 5. Влияние заражения на массу яичников.

мкг 60 -,

О -1-1-1-1-1 I I-1

Л 1 5 10 15 20

дни развития

Рис. 6. Влияние заражения на массу семенников.

Рис. 2 - 6. Обозначения по оси абсцисс: Л -.личинки последнего возраста, 1-20 -дни после линьки на имаго. На оси ординат: изучаемые параметры. На графике: р

(1) - здоровые насекомые; п

(2) - заражённые личинки; $ (3) - насекомые, заражённые на поздних сроках развития.

Глава 4. Очистка стадий жизненного цикла микроспоридии N. ^гу1Н для биохимических исследований паразита и паразито-хозяинных отношений

Основная проблема, возникающая при изучении паразито-хозяинных отношений микроспоридий и насекомых биохимическими методами - отделение паразитарного материала от материала клетки хозяина. К началу работы такие методы в микроспоридиологии отсутствовали. Были разработаны только простые методы очистки спор микроспоридий. Однако физиологическое состояние спор и внутриклеточных стадий микроспоридий существенно различается. Для изучения биохимии паразито-хозяинных отношений была необходима разработка метода очистки внутриклеточных стадий паразита непосредственно из заражённых органов, что и послужило причиной для создания нами следующего метода (рис. 7):

Ü

3 0

tfaa ijj; jj^ ;jji Eft

6

Рис. 7. Метод очистки внутриклеточных стадий жизненного цикла микроспоридий

1. Центрифугирование перколла для создания градиента плотности. Для очистки стадий мерогонии и ранней спорогонии использовали 20%-ный перколл (от исходной концентрации) на 150 мМ фосфатносо-левом буфере (буфер ФСБ: 138мМ NaCl, ЗмМ KCl, 1.5мМ КН2Р04, 8мМ Na2HP04, pH 6.8), для разделения стадий спорогонии -50%-ный перколл на 150 мМ ФСБ в объеме 1.2 мл. Центрифугирование производили на среднескоростной центрифуге К-24 (MLW) в угловом роторе в эппендорфах на 14500 об./мин (17000 g) 20 мин. Этого времени было достаточно для проведения следующих, операций.

2. Вскрытие сверчка и препарирование жирового тела в 150 мМ ФСБ и затем гомогенизация отпрепарированного органа в 1 мл ФСБ в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком.

3. Фильтрация через щприц с вставленной ватной пробкой и одновременно через фильтр для грубых осадков (Filtrak) закреплённый в держателе (Swinnex-25, Millipore) в эппендорф.

4. Центрифугирование отфильтрованной суспензии на настольной центрифуге с угловым ротором на 1000 об./мин 4 мин.

В результате этой операции образуется трёхслойный осадок (рис. 8, ос). Верхний слой (1) содержит многочисленные стадии мерогонии и: ранней спорогонии, некоторое количество ядер клеток хозяина и мелкие везикулы. Средний слой (2) содержит молодые споры, стадии мерогонии, ядра клеток хозяина и остатки цитоплазмы клеток хозяина. Нижний слой белого цвета (3) содержит чистые зрелые споры.

5. Супернатант отбирается для работы с растворимой фракцией белков клеток хозяина, а на осадок наносится около 200 мкл ФСБ, затем аккуратно отслаивается и отбирается автоматической пипеткой верхний слой полученного осадка.

6. Центрифугирование в градиенте плотности перколла на 2000 об./мин в течение десяти мин на напольной центрифуге Т-62 (MLW) в бакет-роторе.

При центрифугировании верхнего слоя в 20%-ном перколле в районе, соответствующем плотности 1.016 г/мл, образуется хорошо отличимая зона белого цвета, содержащая стадии мерогонии и ранней спорогонии (рис. 9).

При центрифугировании среднего слоя в 50%-ном перколле молодые споры распределяются в соответствии со своей плавучей плотностью в зависимости от зрелости в диапазоне плотности от 1.033 г/мл до 1.139 г/мл.

При центрифугировании нижней "белой" зоны в 50%-ном перколле большая часть зрелых спор образует осадок на дне пробирки.

7. Автоматической пипеткой отбирается нужная зона и отмывается от перколла двумя центрифугированиями в ФСБ.

Серия электроннограмм подтвердила чистоту выделения и сохранение целостности клеток паразита, полученных этим методом. В на-

стоящее время данный метод - единственный существующий в мировой практике.

На основании разработанного нами метода очистки различных стадий жизненного цикла микроспоридии N. §ту1Н из жирового тела сверчков проведена серия электрофорезов белков различных фракций, полученных в результате разделения. Мы обратили наше внимание на следующие белки (рис. 10):

Белок с молекулярным весом 40 кОа (р-40) - основной белок клеточной стенки развивающихся стадий микроспоридий и спор. Наличие его во фракции центрифужного осадка после гомогенизирования заражённого жирового тела (4) объясняется присутствием там клеточных стенок преспоровых стадий микроспоридий, разрушенных гомогенизированием, что подтверждается электронно-микроскопическими данными.

Рис. 10. Цифрами обо- р-110 р-70

значены: 1 - ЬМ"\У, 2 - ци-

Белки с мол. весом 70 и 75 кОа (р-70) - основные белки цито-плазматической фракции очищенных в градиенте перкола преспоровых стадий развития микроспоридий. Содержание этих белков настолько значительно, что на электро-фореграммах практически не видно всех остальных белков цитоплазматической фракции микроспоридий.

Белок 110 кОа, (р-110) - белок, появляющийся в жировом теле сверчков в ответ на заражение.

Таким образом, был разработан новый метод очистки стадий микроспоридий, позволивший эффективно разделять различные фракции в количестве, достаточном для проведения биохимических исследований. Появилась возможность перейти к изучению паразито-хозяинных отношений биохимическими методами.

топлазматическая фракция белков (ЦФБ) жирового тела больных и 3 - здоровых сверчков, 4 - нерастворимая фракция белков (НФБ) больных и 5 - здоровых сверчков, 6 - ЦФБ и 7 - НФБ очищенных стадий микроспоридий, 8 -ЦФБ и 9 - НФБ спор микроспоридий.

р-40

Глава 5. Изучение паразито-хозяинных отношений N. и сверчка биохимическими методами

5.1. Истощение сверчков вследствие заражения. Мы предположили, что истощение энергетических ресурсов хозяина является базовым элементом в паразито-хозяинных отношениях, обуславливающим многие эффекты, наблюдаемые при заражении, и приводящим, в конечном итоге, к развитию у заражённых насекомых состояния, стресса.

Для подтверждения этого мы исследовали влияние заражения на резервные белки жирового тела, запасы жира и вителлогенины. К сожалению, нам не удалось изучить влияния болезни на запасы углеводов, по всей видимости, являющихся основным энергетическим субстратом для микроспоридий (Долгих, 1997). Истощение запасов гликогена при заражении, тем не менее, показано другими авторами (Метспалу, Хийесаар, 1984).

5.1.1. Снижение содержания резервных белков в жировом теле. Изменение содержания определённой группы резервных белков при заражении микроспоридиями было изучено впервые. Эти белки используются личинками как резерв аминокислот при прохождении метаморфоза. Их роль у имаго самцов не известна. На электрофоре-граммах проб из жирового тела здоровых половозрелых самцов и личинок обоих полов выявлена группа мажорных белков, основным из которых был белок с молекулярным весом 60 кБа (рис. 11 и 12, пробы 2,3 и 6). Белки, присутствующие в таком количестве в жировом теле личинок насекомых, являются так называемыми резервными белками. Количество этих белков было так велико, что они практически скрывали все остальные белки (рис. 11, пробы 2 и 3).

234 51 1666 677777771 рами обозначены: 1 -

Рис. 11 и 12. Циф-

г-

1Ж\У: белки с мол. у* весом 94, 67, 43 и

* - »щ Ил «•

«I» т

30 кБа, 2 - Жировое тело здоровых личинок самок и 3 - самцов, 4 - больных личинок самок и 5 -самцов, 6 - здоровых и 7 - больных имаго самцов. Белки р-60 и р-110 обозначены стрелками.

Однако эти белки отсутствовали в жировом теле здоровых половозрелых самок (рис. 16). Нами было показано значительное снижение содержания этой группы белков в жировом теле заражённых личинок (рис. 11, пробы 4, 5) и половозрелых самцов (рис. 12, проба 7).

По нашему предположению, снижение содержания резервных белков при микроспоридиозе должно в значительной степени препятствовать прохождению личинками линек и метаморфоза.

5.1.2. Снижение содержания жира в жировом теле заражённых сверчков. Нами показано, что микроспоридиоз снижает содержание жира (рис. 2). Это является примечательным фактом, поскольку микроспоридии не имеют митохондрий и,, по всей видимости, не способны утилизировать жиры для получения АТФ.

5.1.3. Накопление вителлогенинов в гемолимфе заражённых половозрелых самок. При сравнении электрофореграмм гемолимфы здоровых и зараженных половозрелых самок обнаружено накопление группы белков с молекулярным весом от 100 до 220 кБа (рис. 13). Эти белки отсутствуют во всех пробах гемолимфы, взятых от личинок и самцов. По данным Кэмп-Томма и др. (Кетр-Тотш е1 а1., 1960), эти белки - вителлогенины. Вителлогенины синтезируются в жировом теле взрослых самок и транспортируются через гемолимфу к яичникам при формировании яиц насекомых, служа резервом аминокислот при эмбриогенезе.

Рис. 13. Цифрами обозначены пробы: 1 - ¡-МШ - белки с мол. весом 94, 67, 43 и 30 кБа, 2 - гемолимфа здоровых и 3 - больных самок, 4 - гемолимфа здоровых и 5 - больных самцов.

р-90.

1 22233344

■■ mm*

ВГ

gr Й? Й ti fer

Xi -r ; Xt

Таким образом, несмотря на заражение жирового тела микроспоридиями, снижения содержания вителлогенинов в гемолимфе вследствие общего истощения сверчков не происходит. Это согласуется с литературны- ^ ми. данными. Так, при голодании гусениц Б возраста Bombyx mori содержание переносимого из гемолимфы куколок в ооциты вителлогенина оставалось на прежнем уровне (Yutaka et al., 1991), и, таким образом, истощение не оказывало серьёзного влияния на продукцию этого белка. Кроме того, известно, что голодание приводит к накоплению вителлогенинов в ге-

молимфе (Beil, 1971). Следовательно, факт увеличения содержания ви-теллогенинов не противоречит предположению об общем истощении организма хозяина при микроспоридиозе, тем более, что на это указывает множество других авторов (Thomson, 1958; Исси, 1986 и др.).

Таким образом, очевидно, что микроспоридиоз приводит к истощению организма хозяина.

5.2. Накопление белка hsp-70 в заражённом жировом теле как свидетельство стресса насекомых при микроспоридиозе.

По определению Селье, стресс - это общая неспецифическая нейро-гормональная реакция организма на любое предъявляемое ему требование (1936). При любом воздействии различных экстремальных факторов в организме возникают однотипные биохимические изменения, направленные на преодоление действия этих факторов путём адаптации организма к предъявленным требованиям.

По нашему мнению, ряд ответных реакций хозяина, наблюдаемых при микроспоридиозах (удлинение сроков развития личинок, появление добавочных личиночных линек, образование уродливых особей и др.), имеет своей причиной то, что заражение насекомых микроспоридиями приводит к развитию состояния стресса у хозяина, что, в свою очередь, вызывает ответ гормональной системы по классической схеме (обз.: Раушенбах, 1990).

Основанием для такого предположения была удивительная схожесть патологических нарушений в развитии насекомых при микроспоридиозе с патологией, наблюдаемой при других стрессорных воздействиях. Это предположение активно обсуждается также и для других паразитов насекомых (Lawrence, 1990). Для проверки этой гипотезы мы изучили изменения содержания основного белка теплового шока hsp-70, отвечающего накоплением на самые разнообразные повреждающие воздействия и служащего индикатором различных стрессов (Hyde, 1990; Заварзин и др., 1992).

Для опыта взяли жировое тело зрелых самок сверчков, заражённых и не заражённых микроспоридиями, и с этими пробами был провели блотинг против поликлональных антител на hsp-70. Как мы и предполагали, в жировом теле заражённых микроспоридиями сверчков произошло значительное накопление белка теплового шока hsp-70 (рис. 14).

Другим объяснением накопления hsp-70 в пробах могло быть высвобождение его из разрушенных гомогенизированием преспоровых стадий развития микроспоридий. Поэтому был поставлен блотинг против антител на hsp-70 с тремя пробами: цитоплазматической фракцией спор микроспоридий, цитоплазматической фракцией очищенных в гра-

диенте перколла преспоровых стадий микроспоридий и. лом сверчков, заражённых микроспоридиями (рис. 15).

жировым те-

ЬБр-70

Рис. 14. Цифрами обозначены пробы: 1 - жировое тело здоровых самок, 2 -заражённых только лресло-ровыми стадиями и 3 -содержащих значительное количество спор.

Ьвр.-70

Рис. 15. Цифрами обозначены пробы: 1 - цитоплазматическая фракция спор, 2 - преспоровые стадии микроспоридий, очищенные в градиенте перколла, 3 - жировое тело заражённых сверчков.

Белок 1)5р-70 обнаружен только в последних двух пробах, однако содержание его в жировом теле сверчков значительно превышало таковое в микроспоридиях. На основании этого факта сделан вывод, что белок Ьэр-70 накапливается в жировом теле зараженных сверчков вследствие микроспоридиоза.

Таким образом, есть все основния полагать, что микроспоридиоз вызывает у заражённых насекомых состояние стресса.

5.3. Изменение содержания других белков при заражении микроспоридиями. При изучении изменения содержания перечисленных выше белков мы обнаружили ответ других, не известных нам белков, на заражение N. дгуШ.

5.3.1. Накопление белка с молекулярным весом 110 кОа в жировом теле заражённых насекомых. Выявлено, что заражение микроспоридиями жирового тела сверчков любого возраста и пола приводило к накоплению в нём белка с молекулярным весом 110 1Ша (рис. 11, 12, 16). Очистка преспоровых стадий развития микроспоридий показала, что данный белок принадлежит только хозяину (рис. 10). Он был мажорным во всех пробах, полученных из заражённых самок.

Функция этого белка остаётся для нас загадочной, и мы не можем предложить никаких гипотез для объяснения его накопления.

ш» 1 1 1 1 2 3 3 3 3

94 кЭа 57 кВа

X ¿1 .а

—

Ц № М щ п? ^¿т

.„-.г й-и ьл» т» ((¡> Щ «4

* -и-» > а *

я* •••• <4 >л «. * "' >1 "

•Л .4; й

ФЗкОа

Цу!

30 кОа

р-110

Рис. 16. Появление р-110 в жировом теле заражённых самок. Цифрами обозначены пробы: 1 -жировое тело здоровых самок, 2 -заражённых только преспоровыми стадиями и 3 - содержащих значительное количество спор.

5.3.2. Исчезновение белка с молекулярным весом 90 кОа из гемолимфы заражённых половозрелых самок. В ходе экспериментов обнаружен белок с молекулярным весом 90 !Юа, исчезающий из гемолимфы зараженных самок (рис. 13). Как и.вителлогенины, этот 5елок отсутствует на электрофореграммах гемолимфы самцов и.-личинок. Белок той же массы присутствует на электрофореграммах белков, полученных из яиц сверчков методом, используемым для очистки ви-геллогенинов (Кешр-Тошш ег а1., 1990). Этот белок также виден на электрофореграммах цитируемых авторов, однако, Кемп-Томм с соавт. не обозначают его как вителлогенин по той причине, что он не отвеча-5т на антитела против этих белков.

Как и белок с молекулярным, весом 110 к1?а, этот белок является 1ля нас загадочным, и мы не можем предложить никаких гипотез, объясняющих его исчезновение из гемолимфы заражённых половозрелых :амок. ■ .

Глава 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Различие в воздействии микроспоридий на личинок и на имаго насекомых. Мы полагаем, что различное воздействие микро-:поридий на личинок и на имаго имеет в своей основе общее воздей-:твие, оказываемое микроспоридиями на хозяев. Претендуя на на энергетические ресурсы хозяина, паразиты в первую очередь воздейст-?уют на наиболее энергоёмкие процессы у насекомых, такие как рост тичинок, линьки и созревание половых продуктов. На разных этапах энтогенеза насекомых наблюдаются различия в энергетической страте-

гии. На стадии личинки энергетические затраты направлены на рост и линьку, на стадии имаго - на развитие яичников и размножение. Воздействие микроспоридий на сверчков на этих этапах тоже различно. На личиночной стадии сверчков микроспоридии используют ресурсы, предназначенные для роста и линьки, что может приводить к увеличению сроков развития, массовой гибели и образованию недоразвитых имаго. На имагинальной стадии сверчков паразиты потребляют ресурсы, предназначенные для размножения насекомых и их недостаток приводит к подавлению репродуктивной активности.

Истощение микроспоридиями организма хозяина служит наиболее важным аспектом паразито-хозяинных отношений насекомых и этих паразитов. Истощение может приводить заражённые клетки в состояние стресса путём снижения их биосинтетической и репарационной активности (Александров, 1985). Среди других факторов, могущих вызвать состояние стресса, следует назвать возможность выделения микроспоридиями конечных продуктов катаболизма (Долгих, 1990).

Накопление вителлогенинов в гемолимфе (рис. 13) не свидетельствовать об усилении синтеза этих белков, поскольку не происходит увеличения яйцепродукции и массы яичников (рис. 5). Возможно, накопление вителлогенинов - следствие того, что эти белки не утилизируются яичниками. Примечательным является сам факт, что даже при сильном заражении прекращения синтеза этих белков не происходит и заражённое жировое тело продолжает интенсивно работать на яйцепродукцию. Как указывалось, голод тоже приводит к накоплению вителлогенинов в гемолимфе (Bell, 1971), и, следовательно, данный факт отнюдь не противоречит предположению общего истощения организма хозяина при микроспоидиозе.

Влияние микроспоридиоза на массу насекомых. Снижение массы происходит вследствие истощения организма хозяина (Thomson, 1958). Увеличение массы можно объяснить интенсивным накоплением масс преспоровых стадий развития и спор микроспоридий (Thomson, 1958; Рубцов, 1966). Однако для микроспоридиозов более характерно снижение массы хозяина. О снижении массы вследствие заражения свидетельствуют 19 работ, а значительное увеличение её (при сравнении насекомых одного срока развития) описывается лишь в одной (Fischer, Sanborn, 1964). При этом, данный факт оспаривается другим автором (Milner, 1972), работавшим на том же самом объекте и получившим прямо противоположные результаты.

Кроме того, в ряде работ показанный эффект увеличения массы либо недостоверен и незначителен, либо приводится сравнение личинок последних возрастов, но разного срока развития, у которых зара-

жение приводит к удлинению личиночного развития вследствие невозможности прохождения ими метаморфоза. Личинки живут значительно дольше, но не линяют на имаго и, накапливая огромные массы паразитов, значительно превосходят по массе личинок того же возраста, уже прошедших метаморфоз и даже оставивших потомство (Рубцов, 1966).

Гипотеза паразитарного стресса при заражении насекомых микроспоридиями. Одним из последствий заражения насекомых микроспоридиями (или другими паразитами) являются патологические изменения, сходные с наблюдаемыми при гормональных нарушениях, вызванных увеличением титра ювенильного гормона. К настоящему времени в литературе сформировалась точка зрения, что подобные патологические изменения вызываются выделением вещества, обладающего активностью ювенильного гормона, не насекомыми, а самими микроспоридиями (Fischer, Sanborn, 1964; Streett, Bradfield, 1978; Исси, Онацкий, 1984; Метспалу, Хийесаар, 1984 и др.).

Однако известно, что воздействие различных неблагоприятных условий у насекомых приводят к ответу гормональной системы, характерной особенностью которого является увеличение титра ювенильного гормона.

Заражение

меронты

споры

В процессе развития паразитов клетка хозяина оказывается в состоянии стресса

Прекращение секреции нейросекреторными метками мозга проторакотропного гормона Снижение активности ЮГ- эстераз

1

Прекращение секреции экдизона (сложности в прохождении линек) Повышение титра ЮГ (сложности в прохождении метаморфоза)

Рис. 17. Гипотетическая схема ответа гормональной системы насеко-лх-хозяев на заражение микроспоридиями.

Если заражение микроспоридиями вызывает у насекомых стресс, то у них должна развиваться та же самая неспецифическая гормональная реакция. Данные о накоплении в заражённых тканях стрессорного белка hsp-70, полученные нами (рис. 14), дают свидетельство такому предположению.

По нашему предположению, при микроспоридиозе развивается следующая последовательность событий (рис. 17): Истощение энергетических запасов насекомого-хозяина и другие деструктивные последствия жизнедеятельности микроспоридий приводят к снижению биосинтетической и репарационной активности в заражённых клетках и, как следствие, к деструктивным изменениям, наблюдаемым на элек-троннограммах заражённых клеток (Juran et al., 1967; Weiser, 1976 и др.). Заражённые микроспоридиями клетки оказываются в состоянии физиологического стресса, что приводит к неспецифическому ответу гормональной системы (обз.: Раушенбах, 1990): Нейросекреторные клетки мозга прекращают секрецию в гемолимфу проторакотропного гормона.. Как следствие этого, прекращается синтез и секреция в гемолимфу экдизона и снижается титр гормона линьки. Снижается активность эстераз ювенильного гормона (ЮГ-эстераз). Как следствие этого, увеличивается титр ювенильного гормона., Интересно, что предположение об увеличении титра ЮГ в заражённых микроспоридиями насекомых вследствие падения активности отдельных фракций карбоксил эстераз, регулирующих его титр, было высказано ещё Ефименко (1989).

Мы предполагаем, что микроспоридии не могут синтезировать аналогов ювенильного гормона, и патологические изменения, сходные с наблюдаемыми при гормональных нарушениях, происходят вследст-вии развития у заражённых насекомых состояния стресса.

ВЫВОДЫ.

1. Изучение на организменном уровне особенностей микроспори-диоза, вызванного у сверчков G. bimaculatus микроспоридией N. grylli, показало, что основной путь распространения этих микроспоридий -пероральный.. Основным местом инвазии паразитов является жировое тело, но, заражаются также ткани кишечника, мускулатура, яичники, семенники и придаточные половые железы.

2. Микроспоридиоз приводит к снижению содержания в жировом теле насекомых жира и группы резервных белков, основным из которых являлся белок с молекулярным весом 60 kDa, что приводит к сильному истощению сверчков в результате заболевания.

3. В реакции на микроспоридиоз у личинок и имаго сверчков обнаружены различия. На личиночных стадиях развития сверчков недостаток запасных питательных веществ приводит к увеличению сроков развития, массовой гибели и к образованию мелких, недоразвитых имаго с деформированными яйцекладом и крыльями. Объём жирового тела у заражённых особей в этот период не увеличивается. У взрослых сверчков паразиты используют ресурсы, предназначенные для размножения насекомых, и их недостаток подавляет репродуктивную активность. Такие сверчки внешне кажутся здоровыми, среди них не наблюдается высокой смертности. От здоровых они отличаются увеличенным объёмом жирового тела и недоразвитыми яичниками.

4. Впервые разработаная нами методика выделения и очистки пре-споровых стадий жизненного цикла микроспоридий позволила приступить к изучению биохимических особенностей как самих паразитов, так и паразито-хозяинных отношений микроспоридий и насекомых.

5. Впервые электрофоретическими методами показано изменение белкового состава жирового тела и гемолимфы насекомых, заражённых микроспоридиями. Заражение жирового тела приводит к накоплению в нём белка с молекулярным весом 110 kDa, функция которого не выяснена. Электрофорез белков гемолимфы половозрелых самок показал у заражённых особей незначительное накопление вителлогенинов и исчезновение из гемолимфы белка молекулярным весом 90 kDa, функция которого не выяснена.

6. В жировом теле самок сверчков заражённых микроспоридиями впервые выявлено значительное накопление белка теплового шока hsp-70, что даёт основание полагать, что микроспоридии приводят заражённые ими клетки и весь организм насекомого к состоянию стресса.

7. На основании литературных и собственных данных предлагается объяснение нарушения гормонального баланса в результате заражения насекомых микроспоридиями. По нашему мнению, причиной этого является не выделение аналогов ювенильного гормона самими паразитами» а ответ гормональной системы хозяина на состояние стресса, вызы-ванного заражением, по схеме, типичной для действия других неблаго-прияных факторов (Раушенбах, 1990).

Практические рекомендации.

1. Для проведения биохимических исследований паразито-хозяинных отношений микроспоридий и насекомых предлагается сверчок GryHus bimaculatus, заражённый Nosema grylli. Данный объект прост в культивировании, безопасен в работе, в отличие от многих других может культивироваться круглый год, и, обладая значительными

размерами, позволяет использовать значительную биомассу как тканей хозяина, так и самого паразита, что необходимо для проведения биохимических исследований.

2. Для биохимических исследований преспоровых стадий жизненного цикла микроспоридий предлагается метод их очистки центрифугированием в градиенте плотности перколла, позволяющий эффективно разделять различные фракции в количестве, достаточном для проведения биохимических исследований. Предлагаемый метод очистки прост, занимает около 1 часа и может стать рутинным при проведении биохимических исследований.

Список работ, опубликованный по теме диссертации.

1. Селезнёв КВ., Исси И.В., Долгих В.В., Соколова Ю.Я., Бело-стоцкая Г.Б., Антонова O.A. Очистка различных стадий жизненного цикла микроспоридии Nosema grylii sp.n. (Microsporidia) из сверчков Gryllus bimaculatus центрифугированием в градиенте плотности перколла. // Паразитология. 1994. Т. 28, вып. 4. С. 298 - 302.

2. Селезнёв К.В., Долгих В.В., Маргулис Б.Н. Некоторые особенности изменения белкового состава жирового тела сверчков Gryllus bimaculatus при заражении микроспоридией Nosema grylii sp. п. / Актуальные вопросы медицинской паразитологии. С-Петербург. 1994. С. 50.

3. Селезнёв К.В., Антонова O.A., Григорьев М.В., Долгих В.В., Соколова. Ю.Я., Исси И.В.. Заражение сверчка Gryllus bimaculatus микроспоридией Nosema grylii / Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, эко-логичность. 1995. С. 362.

4. Selezniov K.V., Issi I.V., Dolgikh V.V., Belostotskaya G.B., Antonova O.A. Fractionation of different life cycle stages of microsporidia Nosema grylii from crickets Gryllus bimaculatus by centrifugation in Percoll density gradient for biochemical research / / J.Euk.Microbiol. Vol.42, 1995. N3. P.288 - 292.

5. Селезнёв K.B., Антонова O.A., Исси И.В. Микроспоридиоз сверчков Gryllus bimaculatus (Gryllidae) вызванный микроспоридией Nosema grylii (Nosematidae) // Паразитология. 1996. 30(3), 250-262.

6. Селезнёв К.В., Антонова O.A., Исси И.В. Влияние микроспори-диоза на состав белков в жировом теле и гемолимфе сверчков Gryllus bimaculatus / / Паразитология. 1997. Вып.2, С. 181-185.

7. Селезнёв К.В., Долгих В.В. Гипотеза паразитарного стресса при заражении насекомых микроспоридиями / Труды XI съезда Российского энтомологического общества (в печати).