Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробный синтез индивидуальных фузикокцинов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Микробный синтез индивидуальных фузикокцинов"

' ¡|7,0 5 3?

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕН!!!« НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЪСКИЯ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи ГОРБАТШ МАРИНА СЕРГЕЕВНА

МИКРОБНЫЙ СИНТЕЗ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ФУЭИКОКНШЮВ (03.00.23. - биотехнология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии

Научный руководитель - академик РАСХН

Г.С. Муромцев

Официальные оппоненты - доктор биологически

наук,профеооор

Е.П. Феофилова

кандидат биологических

наук 11.Б. Никитина

Ведущее учреждение Сельскохозяйственная Академия

им. К.А. Тимирязева,

Защит« состоится "—" --1992 Г. в - час на

заседании специализированного совета Д 020.40.01 при НИИ сельскохозяйственной биотехнологаи (127253; Москва, ул. Псковская, д.TZ, корп.4)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ сельскохозяйственной биотехнологии

Автореферат разослан г.

Учений секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук С.А. Мелинова

(f.

I вт-л, I

4?ii0-5bsqctb. В нестоящее время bsjowm фяктором понижения урожайности сельскохозяйственных культур становится применение регуляторов роста растения. Среди них особенно цешш экологически безопаснне вещества, получаемые путем микробного синтеза. К последнтг относится, в честности, регулятор роста растений нового покопения Фк А, физиологический спектр действия которого (стимуляция растяжения клеток, открывшгле устьиц на свету и в темноте, выведение семян из состояния покоя и ускорение их прорастания,- активация клеточного транспорта через мембраны, индукция корнеобрззоваиия, а также антистрессовая активность при прорастании семян яри повышенной концентрации соли) обусловливает постоянное расширение обласги его применения в сельском хозяйстве. В настоящее время разработаны биотехнологии получения и применения Фи А в сельском хозяйстве (Муромцев, 1989; Краснопольсквя, 1989, Приеде, 1991у.

Фк А -гликозид карботрициклического дитерпена (рис. 1). Его продуцент - гриб- Fusicoccum amygdall Del. синтезирует семейство ФК» в которое входят Фк А, его биогенетические предшественники (to Н и Фк J) и продукты его дальнейших превращений (Фк С, Фк D и др.). Именцйеся в литературе отдельные сведения о-физиологическом действии индивидуальных ФК позволяют предполагать, что не только Фк А, но и другие ФК могут быть агрономически аффективными. Однако работа по

«к А: В,=СНЛ; R2=Ac; R3=H; R4=-C(CH )2СН=СН2; R5=CH20Ac; Hg-QH

C: R1.3,4.5.6 как у Фк A H3=H

D: П1 .2.3.4.6 как y C:

r5=ch2oh

Фк J: R1f5=CH3; R2(3=H; R4="C(CH3)2CH=CH2; R6=0H

Фк H: R.

Рисунок Я 1. Структура фузикокцинов

.2,3.4,6

сн.

l3

Список принятых сокращений: ФК - фузикокцигга, Фк А - фузлкон-цин А, Фк С - фузикокцин С, Фк D- фузикокцин D, Фк Н - Фузикокцин Н. Фк J - фузикокцин J, *- - минорные фузикокцжы ?, Е, 16 0 - деметилфузикокцигг J я др., КЖ - кудьтуралънея жидкость, [ФК] - суммарная концентрация фузикокцинов).

изучению их применения в сельском хозяйстве не проводились из-за отсутствия соответстэувдда препаратов.

Химическое разделение смесей ФК - сложный а дорогостоящий процесс, поэтому направленный микробный синтез может облегчить производство индивидуальных ФК. Изучение закономерностей микробного синтеза индивидуальных (Ж может служить основой дальнейшего усовершенствования способа производства Фк А и разработки биотехнологий получения перспективных для сельского хозяйства ФК.

Цель_и_зад8чи_рабоэд- Целью настоящей работы являлось изучение зависимости биосинтеза индивидуальных ФК от состава среды и других параметров культивирования, выбор условий, обеспечиващих: преимущественное накопление индивидуальных ФК и разработка на атой основе способов направленного биосинтеза наиболее перспективных ФК. Для этого необходимо было решить следующие конкретные задачи:

1) провести сравнительное изучение спектров индивидуальных ФК у штаммов Риз1соссш атувйаИ и выбрать штамм-продуцент с преимущественным синтезом Фк С, Фк Я, Фк Н и ФК 3-,

2) для выбранного штамма разработать рецептуры ферментационных сред (варьирование источников С и N. их соотношения), обеспечиващих преимущественное накопление тех или иных ФК;

3) выяснить влияние параметров культивирования штамма-продуцента ( начальный рН среды, аэрация, свет, температурный режим, длительность процесса) на накопление в КЖ индивидуальных ФК и предложить условия, обеспечивающие направленный биосинтез индивидуальных ФК;

4) получить высокоочшцешше препараты индивидуальных ФК; разработать способ выделения ФК из КЖ с применением смолы толисорб;

5) изучить физиологическую активность индивидуальных ФК в качественно различных биотестах: прорастание семян, развитие проростков семян, прорастание семян и развитее проростков в условиях засоления (высокие концентрации НаСЬ), удлинение апикальных сегментов корней, потеря веса черенками; выбрать наиболее перспективные для применения индивидуальные ФК;

6) разработать способ направленного биосинтеза наиболее перспективного Фк.

на^ая нобязнв. Проведено сравнительное изучение штаммов гриба-продуцента: Показано, что спектры и соотношение синтезируемых бК у всех штаммов одинаковы; электрофореткческое исследование спектра ийюяественныХ молекулярных форм ферментов выявило возможность изоферментного Маркирования штйШэв.

Показано присутствие индивидуальных ФК в мицелии гриба и проведено сравнительное изучение динамябот юс накоапения в мицелии и КЖ.

Установлено влияние источников С И N и их соотношения на образование индивидуальных ФК.

Проведено rfc следование зависимости образования йндивидуальных ФК от условий' культивирования продуцента (начального рН среда, аэрации, света, температурного режима, длительности процессе ), tf предложены' условия культивирования, обеспечивающие преимущественное накопление индивидуальных ФК.

Показана способность Фк С, Фк J и Фк Н, наряду с Фк А, снимать неблагоприятное действие NaCÎ при прорастании семян, а также развитии проростков ряда сельскохозяйственных культур.

ОрактетескаязначиМость. В результате проведенной работы тредложены условия культивирования продуцента, обеспечивапцие треимущественное накопление индивидуальных ФК в KS.

Разработан перспективный для промышленного производства трепаратов ФК способ их выделения путем сорбции на полисорбе.

Физиологические эффекты индивидуальных ФК в' биотестах йа ■оматах, салате, кукурузе свидетельствуют о перспективности [рименения Фк С и Фк J в сельском хозяйстве.

Разработан способ микробного биосинтеза Фк С н!э основе ;ешевоЙ и высокоэффективной ферментационной среды. Получен' и зучается в вегетационных и полевых опытах препарат Фк С.

Предложенная ферментационная среда в зависимости' от словий' культивирования обеспечивает преимущественное экопление Фк А и Фк С. Среда рекомендована для совершенствования биотехнологии производства Фк А.

- Основные положения диссертационной зботы доложены на Всесоюзных конференциях "Управляемое гльтивирование микроорганизмов" (Пущино, 1987), "Регуляторы >ста растений" (Киев, 1988), па 2 международной конференции | регуляторам роста растений С/ена, 1''■•.;.■}), на международной 'нференции "Проблемы и перспективы биотехнологии" Братислава, 1989), на Всесоюзной конференции "Микроорганизмы-

- стимулятору и ингибиторы роста растений" (Ташкент, 1989), на 4 ом междурядном микологическом конгрессе (Регенсбург, 1990), на Всесоюзной конференции "Пути эффективного использования достижений биотехнологии, в агропромышленном комплексе" (Черновцы, 1991), на 14-й международной конференции по регулятором роста растений (Амстердам. 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатан* работ, имеытся акты об испытании ферментационной ' среды и препарата фузикокцша С.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методики исследования, 6 глав с изложением экспериментальных даышх, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения.

Работа изложена на 118 страницах, включает 39 рисунков и 37 таблиц. Список литературы содержит 123 наименований, в том числе 86 наименований «иностранной литературы.

В приложении представлены акты об

испытании ферментационной среды на основе молочной сыворотки и препарата- Фк С на овощных культурах: салат, томат, огурцы, морковь.

Автор вырашает благодарность канд. биол. наук Краспопольской Л.М. за научно-методическую помощь в проведении работы, канд. хим. наук В.Л. Садовской за проведение качественного анализа Фк, канд. тех. наук Р.С.' Аре и канд. биол, наук М. А. Приеде за практическую помощь в испытании ферментационной среды на основе молочной сыворотки.'

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали 4 штамма У.алвдЛаИ (Р1, ¥2, КЗ, У А) коллекции КИЯ Сельскохозяйственной Биотехнологии. Хранение исходных культур, вегетативное размножите, пршютовление посевного материала осуществляли согласно рекомендациям Краснопольской (191Ю). Для приготовления жидкого посевного материала использовали среду следующего состава (Г/л): глюкоза-20, сое пан мука-15, КН,,Р04-3, Ма30дХ'Ж20-0,3; начальный рН среда 6,0.

Рецептуру ферментационных сред, используемых для биосинтеза индивидуальных ФК при глубшшом культивировании продуцента, составляли на основе среды 2-11 (Краснопольская , 1880), применяемой в настоящее время для биосинтеза Фк А; состав среды (в %): глпкоза-й, соевая мука-0,7, НЛ?Р0.-0,ЗГ>,

MgSO^xVHgO-0,038. Концентрацию лактозы в молочной сиво ротке определяли по методу Рухлядева я соавт. (1974). Среда стерилизовали при 0,5 доб. втм в течение 20 мин.. Оптимизацию состава ферментационных сред проводили по ортогональной матрице математического планирования полнофакторного эксперимента и методу крутого восхождения Бокса-Уилсона (цлт. по Максимов, Федоров, 1969).

Глубинное культивирование проводили в колбах емкость») 500 мл (100 мл среды) или 250 мл (50 мл среда). Инокуляцию сред осуществляли из расчета 10$ посевного материала от объема ферментационной среды. Длительность ферментации ,в зависимости от задач, составляла 1-7 суток.

Концентрацию мицелия (мг/л) определяли гравиметрическим методом.

Сравнительный анализ спектров множественных молекулярных 1>орм ряда ферментов мицелия проводили методом электрофореза в злотпом reie (Корочкин, 1977; Остермая, 1988). Расчет юэффициентов попарного сходства штаммов проводили по формуле, 1риведенноЙ в руководстве Алтухова (1974).

Суммарную концентрацию ФК в КЖ и мицелии определяли моди-[пцированным спектрофотометрическим методом (Evidente, 1979). )^делегае_су^8рной_кощентарцга_ФК_в_КЖ. Пробу 5 мл 1Кстрагировали два раза по 5 мл эгилацетатом, затем экстракт наривали досуха, в отгонную колбу добавляли 5 мл 6 N HgSO^. [нкубировали 2 часа при 60° С, измеряли оптическую плотность !алиново-фяолетового раствора на спектрофотометре M 56 с ильтром Я 6. Одновременно строили калибровочную кривую по тандарташ растворам ФК. Концентрацию ФК в КЖ выражали в

г/л. Для определения__суммарной__концентрации__ФК__в__мщелии

авеску (5 гр) измельчали на холоду. Затем измельченный ицелий экстрагировали 15 мл этилацетата. Дальнейшее яределение концентрации ФК в мицелии проводили согласно этоду, приведенному выше. Концентрацию ФК в мицелии выражали мг на литр КЖ, из Которого был собран мицелий.

Опыты проводили в 3 крятсца повторностях. Математическую Зработку данных осуществляли по методу Доспехова (1985).

При изучения качественного состава ФК в КЖ и мицелии ;пользовали метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) (Кобрина с шит. 1980), метод вторичной ионной масс-спектрометрия '.адовская с соевт. 1389). Количественное определение

индивидуальных ФК проводили с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Muroœstsev et al, 1989), и вторично-ионной ыасс-спектрометрии (Садовская с соав., 1991). Содержание индивидуальных ФК выражали в мг/л. от суммарной концентрации ФК^ Для сравнения содержания Фк А и Фк С использовали также коэффициент к{д j/[о]

[фк С)

При экстракции ФК из КЖ использовали хлороформ, атилацетат, бутанол. Колонку с цолисорбом (для выделения ФК непосредственно из КЖ) готовили согласно рекомендациям руководства "Методы биохимшм" (1981).

Разделение ФК, экстрагированных из КЖ, проводаши методом препаративной ТСХ на силуфоловых пластинках фирмы Cavalier; использовали хроматографические системы хлороформ:изопропанол (9:1) или (8:2), я тзкжэ методом колоночной хроматографии на силикателе. Элкиго ФК с полисорба проводили водным ацетоном.

Изучение физиологической активности ФК осуществляли б следующих биотестах: 1 )прорастаюш семян, 2)развитие щюростков семян, 3)прорастание семян и развитие проростков в условиях шзвышешюЯ концентрации NaOL, 4 Удлинение апикальных сегментов корней, 5)потеря веса черенками томатов. Постановку бйотестоп осуществляли согласно методам, изложенным в методических рекомендациях "Методы определима некоторых регуляторов роста растений" (1984).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕЖЕ •

1. Определение спектров фузжокципов, синтезируемых ктеммами гриба.

1.1. Выбор условий экстракции tfK.

Использовали 3 растворителя (хлороформ, этилацетат, бутанол); варьировали рН КЖ (рН 4,0-8,0); изменяли соотношение объема КЖ и растворителя (1:0,5 - 1:2). Экстракцию растворителями проводили двумя способами: 1) порцию Ш последовательно экстрагировали хлороформом, ^тилацетатом, бутанолом (последовательная экстракция), 2) брали 3 порции КЖ и каждую из них экстрагировали одним из указанных выше растворителей (параллельная экстракция). Суммарное количество Ш и их соотношение в сумме 3 "последовательных" экстрактов мы рассматривала, кок объективный показатель содержи«!! адкизадуалышх ФК в КЖ.

С

Результаты опытов показали, что экстракция этилацетатом (1:2) наиболее полно отражает соотношение содержания индивидуальных ФК в КЯ. Показано тэкже, что хлороформ преимущественно экстрагирует Фк А, бутанол - Фк Н. Установлено также, что для выделения минорных ФК (ФК Р и Фк Е), необходимо использовать вариант последовательной экстракции 3 растворителями.

рН КЯ практически не оказывал влияния на полноту экстракции ФК из КЯ. В последупцей работе проводили экстракции КЗ этилацетатом (1:2).

1.2. Спектры ФК, синтезируемых штаммами гриба. Работу проводили со штаммами Р1, Р2, КЗ, ?4. Культивирование проводили на среде 2-11. В табл. 1 представлены дашше о содержании индивидуальных ФК в КХ.

Таблица Я 1

Содержание индивидуальных фузикокцянов в ' культуралытх гядкостях штаммов Риз1соссш аяуййаИ.

штамм (ФК! мг/л содержание индивидуальных ФК в %

Д С П Н J *

Р1 72 1 8,1 53 20 3 6 14 4

?2 120 ± 6,7 '50 ' 23 6 8 10 8

?3 250 ♦ 2,8 48 16 3 4 20 9

Р4 460 ♦ 4,1 48 17 2 1 1 15 7

Квк следует из табл. 1 наибольшей бяосинтетическоЗ активностью обладает штвмм У4. Спектры образуемых стаМмаки ЗК существенно не различаются, соотношения индивидуальпых ФК такге практически одинаковы. Наибольшее сходство по фузикокцинсинтезирующей активности проявили штаммы ?4 я РЗ. Для дальнейшей работы был выбрей штамм Р4 - макро-продуцейт Ж.

Нами были также охарактеризованы спектры множественных иолекулярных форм ряда ферментов (кислой и щелочной фосфатзз, глп«озо-6-фосфат8зы, маликэнзима, каталззы, лейцялачжюлеитя-цазы, пероксидазы, церулоплазмина, фенолоксидззн, зстеразы, зупероксиддисмутазы, малатдегидрогеназы, лектадегдцрогензпы, :ути НАД-завис.имых дегддрогеназ с низкой субстратной специфичностью). Коэффициента попарного сходства итамчон по спектрам иожественшя молекулярных Форм ферментов приводе-пч г тгбл. 2.

Таблица * 2

Коэффициенты попарного сходства штаммов ?. ажуййаИ по спектрам множественных молекулярных форм ферментов.

штаммы ?3 ?2 ?\

Р4 0,788 0,719 0,563

?3 0,793 0,643

Р2 0,720

Как следует из табл. 2 выявлено существенное различие между штаммами. Наиболее близок к штамму Р4 штамм РЗ, наиболее отдален штамм ?1. В результате исследований впервые показана возможность изоферментного маркирования штаммов, в частности штаима Р4 - макро-продуцента.

1 .З.Срррение динамики содержания ФК в КЖ и мицелии.

12 24 36 48 60 72 12 24 36 48 60 Т.

г, часы г, часы

Рис. 2. Накопление фуэикокцинов в культуральной жидкости и

мицелии в процессе ферментации на среде 2-11.

Данные о содержании ФК в мицелии и КЖ приведены на рис. 2.

Следует отметить, что до наших исследований сведений о

содержании ФК в мицелии в литературе не было. Как следует из

приведенных на рис. 2 данных, суммарное содержание ФК в

мицелии (в период максимального накопления) в 20-30 раз

меньше, чем в КЖ. В мицелии содержание Фк А, Фк Н, Фк J

примерно одинаково, а в КЖ значительно доминирует Фк А.

Максимальное содержание Фк А в мицелии достигается через зе

часов, а в КЖ - через 48 часов, Фк Н и Фк Л - через 24 часа и

36 часов, соответственно.

О

2. Зависимость образования индивидуальных фузикокциноВ от условия культивирования гриба - продуцента. 2.1. Состав ферментационной среды.

Зависимость биосинтеза индивидуальных Фк от источников питания изучали на средах с различными С и Л-содержащими компонентами: (1) крахмал (2Ж)+ пептон( 0,756); (2) крахмал (2£)+соевая мука (0.7Ж); (3) мэннит (2!6)+пептоя(0,7Ж); (4) машшт (2Ж)+соевая мука (0,7$); (5)меласса (256)+соевая мука(0,7Ж). Состав солей такой же, как и в среде 2-11. Полученные данные представлены в табл. 3.

Таблице Н 3

Зависимость качественного состава и соотношения фузикокцинов в культуральной жидкости от источников С н N.

среда куль-тиви-рова-ния 3 день культивирования 5 день культивироанвия •

ГФК1 мг/л сод-ние индив. ФК в % [ФК1 мг/л |сод-ние индив. ФК в %

А С Б Н J а А С Б Н J а

1 380 10,2 28 18 17 13 15 9 225 13,0 11 54 20 7 8 ~

2 325 1 9,4 37 20 5 13 25 225 + 15,2 32 50 7 2 7

3 320 11 ,0 30 16 5 23 21 5 240 7,7 26 30 10 5 14 15

4 400 7,8 50 7 5 12 4 22 200 ± 13,2 10 50 16 "" 24

5 50 ♦ 2,1 9 26 48 11 - 6 50 4.2 10 80 10

Как видно из таб. 3, состав среды оказывает существенное влияние на преимущественное накопление индивидуальных ФК. Так например, Фк А преимущественно накапливается на среде 4 (3 суток) , Фк С- не средах 1,2,4 (5 суток), Фк Б - На среде 5 (5 суток), Фк Н и Фк о - на среде 3. Учитывая, что на среде 5 суммарная концентрация ФК была незначительна, а на среде 3 абсолютное содержания Фк Н и Фк J было очень низким, для дальнейших исследований были отобраны среды 1, 2, 4, обеспечивающие направленный биосинтез Фк С.

На образование индивидуальных $к в КЖ оказывает также влияние соотношение источников углерода и азоте. Продуцент культивировали на среде 1. Концентрацию крахмала изменяли от 3 до 1 %, концентрацию пептона от 0,3 до 1,1 %. Эксперименты проводили по методу планирования ПФЭ. Показано, что долю Фк С можно увеличить при снижении концентрации углеродсодержащего компоненте; так например, при переходе от соотношения крахмал:пептон 3:0,3 к соотношению 1:1,1 доля Фк С увеличивается; показатель (см. методы) изменяется от

2,1 до о,за.

Таким образом, из приведенных данных следует, что существует зависимость накопления индивидуальных Ж не только от природа источников С и N в ферментационной среде, но и от их соотношения.

2.2. Изучение влияния зависимости образования

индивидуальных Фк от изменения параметров культивирования..

Изучение влияния изменения параметров культивирования на

образование индивидуалышх ФК проводили на средах 1,2,4.

. ♦ (ФЮ.мг/л _ 360}- I I

// • Ц _

зооь И П

2601-

240

220 // 140(-п

100

80

60

40

20

о"

р

до

а

□ Фк А ид Фк С ¡за Фк Б (Ш ®к Н ваа Фк J се фк *

//

Рис. 3. Влияние значений начального накопление индивидуальных ФК .

нач. рН 2 на

В4^МШ?_рН_0РЕаЫ. На рис. 3 приведены данные

влиянии значения начального рН на накопление индивидувльйнх ФК на среде 2.

Как следует из приведенных на рис. 3 данных, значение начального рН оказывает существенное влияние на накопление индивидуальных ФК. Доля Фк Н и Фк J отпосительнго выше пра значении начального рН 5,5-6,0; доля Фк А - при рН 6,5-7,0; Фк С - при рН 7,5-8,0; Фк й - при рН 8,5. Сходные резуль*атн били получены и на других средах.

АЭРАЦИЯ. На рис. 4 приведены данные о влиянии условии аэрации на накопления индивидуальных ФК на среде 2.

Для создания различных условий аэрации меняли отношение объема среды к объему колбы, имея в виду, что снижение величины этого отношения улучшают условия аэрвцаи. ■Чинд.ФК], мг/л

420 400

280 260

!п

>/

//

2001//

120 100

80

ео

40 20 О

ЧУ

Н J *

1/10

Гг

/У

Н J *

хь

■®1

ч/

1/5 1/3 1/2,5

отношение объема среды к объему колбн

ис. 4. Влияние условий аэрации на накопление индивидуальных

К на среде 2.

Я

Как следует итз приведенных на рис. 4 данных, условия эрации значительно влияют на накопление индивидуальных ФК. эля Фк Н и Фк J относительно вите при снижении уровня аэрации 1/2,5), доля Фк С и Фк Б - при повызеняи уровня взрации 1/10). Сходные результаты были получены и на других средах.

СЕКТ. На рис. 5 приведены дашше о влиянии света ь накопление индивидуальных ФК на среде 1.

Как следует из приведенных на рис. 5 данных, свет оказывает существенное влияние на накопление индивидуальных ФК. Доля Фк С и Фк Б относительно выше на свету. Сходные результаты С,или получены и на других средах.

Т( индии.Фк1, мг/л 3201

//

260

240

220

20

О

С

//

D H J *

hrfL

t.

bc-riuH J *

Ъ

bL

тешюта

Рис. 5. Влияние света на накопление среде 1.

свет индивиду алышх

ФК

ТЕШЕРАТУРНЫй_РЕЖИМ. На рис. 6 приведены дашше о влиянии температуры на накопление индивидуальных ФК на среде 4.

Как следует из приведегааи на рис. 6 данных, температура оказивает значительное влияние на накопление йндиьидуалышх ФК. Доля Фк H и Фк J относительно выше при 24ПС, доля Фк А относительно выше при профильном температурном режиме (1-3 сутки 26°С, 4-5 оутки-240), доля Фк С - при 2G°C. Сходные результаты были получены и на других средах.

МЭТ?4ШН0СТЬ_КУфТЖ№0ВА1Ш. В табл. 3 приведены дашше о влиянии длительности культивирования на накопление индивидуальных ФК в КЖ. Как следует из данных, длительность культивирования оказывает существенное влияние на накопление индивидуальных ФК. На всех средах доля Фк А, Фк Н, Фк .1 относительно выше при культиви[>оватгл 3 суток, Фк С и Фк Т) -при культивировании 5 суток.

Таким образом, установлена зависимость образовании индивидуальных ФК от параметров культивироавния щюду цента. Учитывая результаты исследований (и.2.1, 2.2.), hîim.i

220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

1ИЩШВ.ФК] В М1/

П Н Л *

Б Н <1 *

ш,

26

26-24 (1-3 сутки-26°С) 4-5 сутки-24 С

24

Л А

температура

Ряс. 6.' Влияние температуы на накопление индивидуальных ш ¡¡.1 среде 4.

предложен условия культиви[юваш1я, обеспечиимы:;;К! преимущественное накопление индивидуальных ФК. Для Фк А среда 4, значение начального рН 6,0-7,0, оптимальные условия аэрации (отношение объема среды и объема колбы 1/5), темнота, профильный температурный режим, длительность культивирование -3 суток; для Фк С - среда 1, 2, 4 , значение начального 7,5-8,0, оптимальные условия аэрации (отношение объема сргд-ы и объема колбы 1/10), свет (2000 лике), температуры 2о°С, длительность культивирования - 5 суток; для Фк И - среда 5, значение начального рН среды 8.0-8,5, оптимальные усложил аэрации (отношешю объема среды и объема колбы 1/10), свет (2000 люкс), температура 26°С, длительность культнви{)ОПйШЫ -5 суток; для Фк Н и Фк J - среда 3, значение начального рН среда 5,5- 6,0, оптимальные условия аэрации (отношение оОтема среды и объема колбы 1/2,5), температура 21°С, длительность культивирования - 3 суток.

Н

С

А

А

А

,'). 11>л.учг*ни.е препаратов индивидуальных ФК. .4.1. Пыделенне индивидуальных ФК из ¡жс.трнкта 1:2.

Нерва» СТМДИН 1'!1Д(:Л£-1ШН ('.'. СТОИЛ!! В Ю.1У'№!К!Ц -

экстракта ФК. В соответствии с данными, приведенными в п.1., в качестве экстрагирулцего растворителя использовали этклацетат. Экстракт хроматогравировали на колонке (80x4) см с силикагелем (60-100 меш). В качестве элшрущей системы использоввли смеси растворителей: (1) бензол; (2) бензол:хлороформ (50:50); (3) хлороформ; (4) хлороформ:изопропанол (93:5); (5) хлороформ:изопропанол (90:10); (6) хлороформ:изопропанол (85:15); (7) хлороформ:изопропанол (80:20); (8) хлороформ:изопропанол (75:25); (9) хлороформ:изопропанол (70:30); (10) хлороформ:изопропанол (50:50).; (11) изопропанол;

(12) метанол Результаты представлены на рис. 7.

■Чиндив.ФК), мг/л

хроматографии экстракта

кг

а

Е2Э Ш

из

СЕ

Фк А Фк С Фк Б Фк Н Фк J Фк *

10

9

11 12

системы растворителей Рис. .7. Хроматография экстракта КЖ на колонке с силикагелем.

Как следует из приведенных на рис. 7 данных, наилучшей системой для влпироввния Фк А является система (4). Рассчитано, что система (4) злшрует 70 Ж Фк А от общего количества в экстракте. Лучшими системами элюирования являются: для Фк С-система (5) (62'5Б от общего количества Фк С); для Фк Н -система (7) (52 % от общего количества Фк Н); для Фк J

система (6) (50 % от общего количества Фк Л). Таким обрааом при колоночной хроматографии получаются фракции, значительно обогащенные индивидуальными ФК. Выделение индивидуальных ФК из этих фракций (получение высокоочищенных препаратов Фк) йроводили методом ВЭЖХ.

Наряду с ВЭЖХ мы применяли метод препаративной 'ГСК. Установлено, что для выделения Фк Н (из фракции 8, рис. 7) наиболее аффективной оказалась система хлороформ :нзопрошшол (8:2).

3.2.Выделение фракций, обогащенных индивидуальными ФК непосредственно из КЖ.

[индив. ФК), в мг

361 // 281-

а-Фк А; (-ц-Фк С; аа-Фл И еа-Фк Н; щя-Фк а;

-//ацетон

% ацетона в системе вода-ацетон Г'.и;. Н. Элшщи фузнкокцшюа г. полисорба водным ацегонсм

Яа!ка показана возможность сорбции <ХК га ¡'Л па с.х>ы цладсоро. в настоящее премд в подупродшштпм нижгабе

получают Фк А, используя в качестве сорбента активированные уголь. Оказалось, ч1о эффективным сорбентом для ФК, в частности для Фк А, является полисорС. Результаты типичного опыта приведены на рис. 8. На колонку (80x4) см наносили 80 мл КЖ, затем проводили ступенчатое элшрование водным ацетоном (исходное соотношение 50:50), далее применяли растворы с повышающейся концентрацией ацетона.

Как видно из полученных данных, ®к а элхшруется преимущественно 70 Ж, Фк С - 65 %, Фк Б - 65 Фк - 60 Ж, Фк Н - 50 Ж водным ацетоном.

Предлагаемый способ, заключающийся в извлечении Фк А из КЖ на колонке с полисорбом и последующем алшровании Фк А 70 Ж водным ацетоном, в настоящее время апробирется на опытных установках. Он может быть также рекомендован для выделения Фк С и других индивидуальных ФК. Предлагаемый способ характеризуется эффективность!) сорбции ФК, высокой степенью десорбции ФК, простотой регенерации сорбента и использованием небольших объемов органических растворителей.

4. Сравнительное изучение физиологической активности индивидуальных ФК: Фи А, Фк С, Фк Б, Фк Н и фк Л.

Полученные нами препараты индивидуальных ФК испытывались в ряде Оиотестов в широком диапазоне концентраций ( 10~4- 10~® М). Нами были выбраны такие 5 биотестов, в которых ранее была показана высокая активность Фк А. В проведенных биотестах все индивидуальные ФК проявляли физиологическую активность, но в различной степени. Ниже приведены наиболее показательные ряды сравнительной активности индивидуальных ФК в биотестах.

Тест_на_прорастание_семян. Использовали семена следующих культур: салат сортов "Берлинский" и "Белокочанный", томат сорта "Грибовский", кукуруза сорта "Дчепровская-705". Ряд сравнительной активности ФК в тесте на прорастание семян томата: ФкС>ФкА>ФкЛ>ФкЮ>ФкН,на семенах свлата сорта "Берлинский": 5кА = ФкС>Фк<1>ФкБ>ФкН, не семенах кукурузы: ФкА = ®кС = Фк. |Т>ФкН>ФкБ.

Йст_на_цр0р8ст§ние_се^н_в_£слдвиот_зас0ле Использовали семена томата'сорта "Грибовский" и кукурузы сорта "Днепровскнй-705". Проращивание семян осуществляет в растворах КаС1 с концентрациями 0,5 и 0,7& %, соответственно. Ряд сравнительной активности на семенах томата: ФкЛ>ФкС>ФкА

> Фк Н > Фк Б, на семенах кукурузы: Фк Л = Фк С = Фк II > 4« А

> 1« Б.

?§сТ_на_Еазвит1}е_проростков_семяц. Использовали культур, что и в предыдущем тестр. Регистрировала массу первичны! корней. Рад сравнительной активности Фк на семенах кукурузы был следупцим: ФкС>ФкА>Фк«1>ФкБ>Фк Н, в условиях засоленности ряд сравнительной активности на этих семенах: ФкН=ФкА>ФкС>ФкБ>Фк.1.

Тест^8_уа^еще_вдтальш^ Использоввли семена кукурузы сорта "Днепровская-705:. Ряд сравнительной активности ФК в этом тесте: ФкС=ФкЛ>ФкА> Фк Б > Фк Н.

_Тест__на__потерю__веса__черенками__томатов. Использовали

черенки 20-дневных томатов сорта "Прогресс". Ряд сравнительной активности ФК: ФкА>ФкС>ФкВ>Фк.1>ФкН.

Таким образом, результаты сравнительного изучения физиологической активности ФК показывают, что наряду с Фк А высокую физиологическую активность в ряде тестов проявляют Фк С и Фк Л. Отметим также, что в тесте на прорастание семян и развитие проростков в условиях засоленности высокую активность проявляет Фк Н. Эти результаты показывают, что весьма перспективным наряду с Фк А является Фк С.

Основой для получения препаратов Фк С мотет являться направленный синтез ФК, осуществляемый при использовании условий культивирования продуцента, изложенных в разд.. 2., и способ выделения на основе полисорба, приведенный в разд. 3.

5. Разработка способа направленного синтеза Фк С

При поиске относительно дешевых, и в то газ ьрыы аффективных, сред, мы установили, что весьма перспективна среда, источником С в которой является лактоза, а источником ¡1 - соевая мука. В качестве источника лактозы использовали молочную сыворотку (отходы производства творога). Учитывая, что оптимальная концентрация углеродсодерзшщего компонента составляет 2 % (Краснопольская, 1980), использовали

молочную сшю[>отку, разведенную по лактозе до соответствующей концентрации. Соли добавляли из расчета Ко11Р04 - 3, 5 г/л, 1'8£0д17Н20 - 0,38 г/л. Эта среда обеспечивала весьма высокую концентрацию Фк А на 3 сутки культивирования, Фк С - ка 5 сучки (рис. ;)).

Дальнейшую модификацию среды проводили с целью разработки способа получения Фк С. Было установлено, что исключение из состава среды КН2Р04 приводит к увеличению концентрации Фк С. Далее было проверено влияние концентрации соевой муки и М#>04х7Н20 на выход Фк С.

[ индив.ФК), мг/л

13 5 7

1;, сутки

Рис. 9. Накопление фузикокцинов в культуральной жидкости на среде с сывороткой.

Таблица * 4

1 этап оптимизации ферментационной среда на основе сыворотки

вариант культов. переменные [ФК] КГ/Л кон-ия ИНД.Ж в мг/л обозначение строк коэффициент регрессии 01

Х1 :оев мук Х2 Мв504 А С Б Н J *

1 - 5 -0,28 222±22,0 93 102 27 - - - - 302,75

2 + 9 -0,28 570±14,6 199 331 40 - - - Х1 32,25

3 - 5 +0,48 589*17,8 106 406 77 - - - *2 38,75

4 + 9 +0,48 435111.0 117 278 40 - - - Х1*2 -157,75

5 0 7 0 0,38 200±12,3 44 132 24 - - - е=162,45

Изучение проводили по схеме ПФЭ. В табл. 4 приведены

результата экспериментов па нервом этапе оптимизации, китоци: показали, что используемые в опыте концентрации переменных находятся в оптимальной поверхности отклика. При этом быю выявлено отрицательное взаимодействие между переданными.

Это послужило нам основанием осуществить 2 этап оитими защш, предусматривающий снижение концентрации соевой муки, Полученные данные приведет в табл. 5

Таблица 5

2 атап оптимизации ферментационной среда с сывороткой.

вариант куль- ТИВ. ( переменные [ФК1 мг/л кон-ия ИНД.ФК В ИГ/Л

Х1 юев мук Х2 •«50* А С В Н J А

1 7.0 0,38 212±10,3 42 125 34 75 11 20 - -

2 5,8 0,43 529*15.6 55 371 - 8

3 4.6 0,48 551± 9,2 41 406 70 34 12 — 33

4 3,4 0,53 500124,3 93 373 -

Данные табл.5 показали, что концентрация со^ычй муки ыозет быть снижена с 7 г/л до 1,6 г/л при сохранении высокого уровня содержания Фк С.

Попытки заменить соевую муку на другие азотсидерзьщ!^ источники (Ю14К03, (Ш4)2Б04, ИаМО^. ванаокислуо соль N.'1) ' иг: дали положительных результатов.

Далее было проверено влияние изменения парашт}«» культивирования продуцента на среде с молочной сывороткой (значения начального рН среды, аэрация, света,температурного режима), которые, как, покизалн исследования (п. 2.2). способствует повышению содержанию Фк С.

1'ачаль1Щй_рН„среау. Установлено, что олтшсальшй; знпчышем начального рН среда дел образования I;: С являете:; 7,5.

4УГ9УЙЗ- Установлено, что влагоприигавм у^пюши^а (.зрпцяя для биосинтеза Фк С является соотношение гиЗгемз .;>'ряентац;юнноЙ среды и обтемя колбы (1/10).

Свет. Установлено, что свет способствует .••¡:?;--1-гнаия Фк С в КИ (20:?).

Те-пшрату рныП. режим. Установлено, ч ю |;лшгешя»

содержания Фк С способствует температура 26°С.

Таким образом из результатов исследований следует, что направленный биосинтез Фк С может быть осуществлен следующим образом: 1) высокоэффективная среда на основе молочной сыворотки (в %) - лактоза -2; соевая мука - 4,6; 2) значение начального рН среды 7,5; 3) соотношения объемов среды и колбы 1/10; 4) свет; 5) температура 26°С; длительность культивирования - 5 суток. Описанный способ обеспечивает накопление Фк С в КЖ гриба 400-600 мг/л.

вывода

1) Проведен сравнительный анализ спектров синтезируемых ФК у штаммов Р1, РЗ, Р4 Риз1соссит ашу{5баИ. Показано, что штамш различаются по уровню фузикокцинсинтезирувдей активности, качественный состав синтезированных 4« и их количественное соотношение при этом практически одинаковы. Штамм ?4 выбран для дальнейшей работы, как макро-продуцент. Впервые определено содержание индивидуальных ФК в мицелии выбранного штамма гриба-продуцента. Установлено, что содержание индивидуальных № в мицелии в 20-30 раз меньше, чем В КЖ.

2) Проведен поиск ферментационных сред (путем варьирования источников С и Л) для штамма Р4. Выявлена зависимость накопления индивидуальных ФК от природы источников С и N и от их соотношения. Показано, что доля Фк С увеличивается при снижении концентрации углеродсодержащего компонента.

3) На основании данных о влиянии природы источников с и N и параметров культивирования (значение начального рН среды, аэрации, света, температуры, длительности) предложены условия культивирования штамма Р4, обеспечивающие преимущественное накопление индивидуальных ФК (Фк А, Фк С, Фк Б, Фк Н, Фк Л).

4) Из экстракта КЖ с помощью колоночной хроматографии на силикагеле и последущей ВЭЖХ получены препараты индивидуальных ФК (Фк А. ФК С, Фк В, ФК Н, Фк Л).

5) Разработан способ выделения индивидуальных ФК непосредственно из КЖ путем сорбции не смолу полисорб.

6) Высокоочищенные препараты индивидуальных Фк изучены в биостестах: 1) прорастание семян, 2)развитие проростков семян, 3)прорастание семян и развитие проростков в условиях

повышенной концентрации NaCL, 4 Удлинение апикальных свплитчи корней, 5)потеря веса черенками. Показано, что все фузикокцшш обладают физиологической активностью. Наиболее перспективные на основании данных биотестов (наряду с te А) являются ФкС а <Йк J.

7) Разработан способ направленного биосинтеза Фк С да основе дешевой высокоэффективной ферментационной среды следующего состава: лактоза -23S, соевая мука-4,6 г/л, HgS04i7H20-0.4a. Условия: начальный pH среда -7,5, температура 26°С, свет (2000 лшс), аэрация (соотношение объема среда и объема колбы 1/10), длительность - 5 суток. Предлагаемый способ позволяет достигать содержание Фк С в концентрации 400-600 мг/л

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Муромцев Г.С., Коренева B.U., Краснопольская Л.И., Кобрина Н.С., Садовская В.Д. Абрамичева H.D,' Самойлова М.С. Исследование метаболитов фузикокцановой природы фатопатогенного гриба Fuslcoccum amygdali. В сб: Биосинтез вторичных метаболитов. Тезисы докладов Всесоюзной конференции, Пущино-на-Оке, 1987, с. 6.

2.Муромцев Г.С., Краснопольская Л.Ы., Горбаиш И.С., Гришина И.И., Столпакова В.В., Садовская В.Л., Приеде Ы.А., Аре P.D. Микробный синтез, выделение» идентификация а физиологическое действие фузикокцинов. В сб: Регуляторы роста и развития, растений. Материалы Всесоюзной конференции по регуляторам роста и развития растений. Киев, 25-27 мая, 1Э8Я. с. 264.

3. liuromtsev G.S., Kraanopolskaya L.M., Goi-batyisU И.S., Stolpakqva V.V., Grlatlna I.I..Sadovakaya V.L. ?U3lcoccln: microbial syntbesls, Isolation and physiological activity. In: New Bloactlve Metabolites from mlcroorganla. 2nd Symposium Proceedings. May 2-7, 1988, Jena, h.110.

4. Краснопольская Л.!i. Горбатые U.C., Гришина ПЛ., Столпакова В.В., Муромцев Г.С. Анализ регуляторов роста растений фузикокцинов в культуральной жидкости ц мацелал ?ualcoccum amygdali. В сб: Ннкрооргацизш-стимулнтори к ингибиторы роста растений а гивотных. Часть 1. Веесонж я конференция в Ташкенте, 1989, с. 106. .

5. Цуромцев Г.С., Краснопольская Л.У., Щ^де. Ui.,

ГорОатак М.С., Столпакова В.В., Гришина И.И., Садовская B.JI., Султонов D.C. Микробный синтез фузикокцинов и практическое применение фузикокцина к. В сб: Проблемы и перспективы биотехнологии, Братислава, Чехословакия, 23 январь, 1989, с 6.

6. liuromtsev G.S..Gobatyuk M.S., Krasnopolstaya Ь.М., Prlede И.A., Sadovskaya V.b., Stolpakova V.V.. Sultonov Ju.S. Puslcoccln: microbial synthesis, identification, physiological activity and practical application. In: Bloactlve metabolites from microorganism. Progress Industrial mlcrobloligy, v. 27, 1990,p.193.

7. KresnopolskayaL.II., Gorbatyuk M.S., liuromtsev G.S. Bllosynthesls of fusicocclns by Pusicoccum amygdali. In Abstracts: Fourth International Hycological Congress, Hegensburg, Germany, 28 aug.-Ззер., 1990,p. 240.

8. liuromtsev G.S.,Krasnopolskaya L.M., Socolova L.M., Haceeva A.P., GorbatyuR M.S., Nagybnova I.A. Terpenoid plant growth regulators produced by phytopathogenlc fungi. In Abstract: 14th International conference on plant Growth Substances. Amsterdam, July, 1991,p. 21.

9. Горбатш M.C., Краснопольская Л.М., Муромцев ,Г.С. Действие индивидуальных фузикокцинов на прорастание семян сельскохозяйственных культур. Тезисы докладов "Микроорганизмы в сельском хозяйстве". Пушило-на Оке, 1992, с. 95.

Подписано в печать 14.07.92 Заказ 627 Формат 60x84/16 Тираж 100

Москва. Типография РАСХН