Микробиологический синтез и деградация гиалуроновой кислоты бактериями р. Streptococcus

Белодед, Андрей Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Микробиологический синтез и деградация гиалуроновой кислоты бактериями р. Streptococcus
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологический синтез и деградация гиалуроновой кислоты бактериями р. Streptococcus"

На правах рукописи

OU344-

Белодед Андрей Васильевич

Микробиологический синтез и деградация гиалуроновой кислоты бактериями р. Streptococcus

Специальность: 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0 2 от 2Ш

Москва, 2008 г.

003447405

Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева и в ГУ научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Научный руководитель:

кандидат технических наук, доцент

Марквичев Николай Семенович

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Самойленко Игорь Иннокентьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Складнев Дмитрий Анатольевич

доктор биологических наук, вед. научн. сотр.

Михальчик Елена Владимировна

Ведущая организация: Московский государственный университет прикладной биотехнологии (МГУПБ).

Защита состоится 21 октября 2008 г. в 10.30 часов на заседании Диссертационного Совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева по адресу: 125047 г. Москва, Миусская пл., д. 9, в аудитории 443 (конференц-зал), тел. (499) 978-74-66.

С диссертацией можно ознакомиться в информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И.Менделеева.

Автореферат диссертации разослан сентября 2008 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета ' ---ШакирИ.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Прогресс в понимании биологических функций гиалу-роновой кислоты (ГК) [Toole, 2000] привел и, безусловно, еще приведет к расширению сфер применения данного гликозаминогликана в составе различных медицинских, косметических, ветеринарных препаратов и дальнейшему увеличению спроса на биополимер. При этом уже сейчас наблюдается определенный дефицит ГК высокой и относительно небольшой молекулярной массы, что отражается на высокой цене этого полисахарида, особенно по сравнению с аналогичными соединениями растительного, животного или микробного происхождения.

В последнее время появляется все больше сведений о размероспецифичности биологических функций и свойств ГК [МсКее et al., 1996; Horton et al., 1998, 1999; Ohkawara et al., 2000]: препараты ГК различной молекулярной массы стимулируют ангиогенез или проявляют антиангиогенные и противовоспалительные свойства, обладают иммуномодулирующими и антиоксидантными свойствами. Полисахарид, фракционированный по молекулярной массе, может найти разнообразное применение в медицине, ветеринарии, косметологии, поэтому работы по совершенствованию методов получения ГК и препаратов из ее отдельных фракций с заданной молекулярной массой имеют большое научное и практическое значение.

Традиционный способ получения ГК основан на экстракции биополимера из различных органов млекопитающих и птиц, например, из стекловидного тела глаза крупного рогатого скота, гребней кур или пупочных канатиков новорожденных. Даже при беглом анализе животных источников ГК видно, что сырьевая база промышленного получения данного полисахарида весьма ограничена и не может полностью удовлетворить постоянно растущий спрос на ГК. Кроме того, выделение Г*К из животного сырья часто осложняется тем, что в тканях и органах млекопитающих и птиц биополимер находится в комплексе с белками; присутствие родственных гли-козаминогликанов также затрудняет выделение ГК. Этих недостатков лишен биотехнологический способ получения ГК, основанный на культивировании микроорганизмов-продуцентов ГК. Сырьем для получения полисахарида микробиологическим синтезом являются доступные соединения и компоненты: глюкоза, дрожжевой экстракт (ДЭ), минеральные соли и т. п. Производство ГК на основе микробиологического синтеза не зависит от поставок животного сырья, а также легко масштабируется и перепрофилируется в случае изменения конъюнктуры рынка.

В силу данных причин можно полагать, что биотехнологическое производство постепенно будет вытеснять получение ПС методом традиционной экстракции из животного сырья. Следует отметить, что в настоящее время биотехнологическое производство ГК в России отсутствует. Отечественная ПС представлена препаратами, полученными экстракцией из гребней кур, а объем производимой ГК не удовлетворяет внутреннему спросу, что приводит к зависимости от импорта биополимера. Поэтому исследование процессов синтеза и деградации ГК микроорганизмами может лечь в основу создания биотехнологического производства ГК в России.

Цель исследований. Изучить физиологические и биохимические аспекты метаболизма (биосинтеза и деградации) ГК бактериями р. Streptococcus, а также раз-

работать научные основы управляемого культивирования и оптимизировать процесс микробиологического синтеза ГК штаммом-продуцентом, подобрав питательную среду, физико-химические условия и режимы культивирования. Исследовать процесс ферментативной деполимеризации ГК стрептококковыми гиалуронатлиа-зами для получения фракций полисахарида с заданной молекулярной массой и анализа ГК в биопробах сложного состава.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Методом индуцированного мутагенеза получить высокопроизводительный штамм-продуцент ГК.

2. Произвести выбор среды для культивирования штамма-продуцента ГК, оптимизировать состав среды и физико-химические условия культивирования с целью увеличения выхода ГК.

3. Исследовать связь синтеза ГК с физиологическим состоянием культуры микроорганизмов и выявить возможные механизмы регуляции синтеза ГК. Изучить влияние степени аэрации ферментационной среды на биосинтез ГК.

4. Исследовать кинетику деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой. Разработать метод получения препаратов ГК различной молекулярной массы, подобрав оптимальные условия проведения деполимеризации как для получения ГК низкой молекулярной массы, так и для осуществления полного гидролиза ГК.

5. Разработать метод определения концентрации ГК в сложных многокомпонентных смесях и биологических объектах, включающих разнообразные сопутствующие биополимеры, используя специфичность энзиматической деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой.

Научная новизна работы.

1. Установлено, что потеря капсул, состоящих из ГК, штаммом Streptococcus equi subsp. zooepidemicus B-80I4 на поздней экспоненциальной и стационарной фазах культивирования происходит вследствие проявления штаммом гиалуронатлиазной активности. Этим же явлением объясняется снижение концентрации ГК в культу-ральной жидкости (КЖ) и "немукоидный" характер колоний, формируемых штаммом на агаризованной среде. УФ-индуцированным мутагенезом получен штамм S. equi subsp. zooepidemicus КБ-04, характеризующийся стабильностью формируемых капсул и мукоидной морфологией колоний.

2. Выявлено влияние основных компонентов предложенной питательной среды (источника углерода, азота, фосфора, солей органических и неорганических кислот) на биосинтез ГК. Обнаружено, что наибольшее отрицательное влияние на биосинтез ГК бактериями S. equi subsp. zooepidemicus оказывают ионы Mg2+.

4. Исследована кинетика деградации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой и показано, что незавершенность реакции деполимеризации обусловлена необратимой инактивацией стрептококковой гиалуронатлиазы, которая вызвана частичным авто-протеолизом фермента. Предложен способ получения препаратов ГК различной

молекулярной массы, используя метод ферментативной деполимеризации ГК. Разработан метод определения ГК в сложных биологических образцах, содержащих мешающие примесные биополимеры со сходной с ГК структурой, основанный на ВЭЖХ продуктов энзиматической деградации ПС.

Практическая значимость работы.

1. Впервые в России методом микробиологического синтеза получены препараты ГК. В качестве продуцентов биополимера использовались бактерии р. Streptococcus, обладающие естественной способностью к биосинтезу данного гли-козаминогликана. Штамм S. equi subsp. zooepidemicus КБ-04, полученный УФ-индуцированным мутагенезом родительского штамма 5. equi subsp. zooepidemicus В-8014, характеризуется стабильностью образуемых капсул на всем протяжении культивирования. Концентрация ГК в КЖ S. equi subsp. zooepidemicus КБ-04 превышает концентрацию, достигаемую при культивировании штамма S. equi subsp. zooepidemicus В-8014 в аналогичных условиях, в 3 - 5 раз. Оптимизация состава питательной среды, физико-химических условий и режимов культивирования позволила многократно увеличить выход ГК.

2. Исследование кинетики деградации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой позволило предложить схему проведения ферментативной реакции, позволяющую добиться практически полной деполимеризации ГК, что, в свою очередь, позволило разработать метод определения концентрации ПС в сложных многокомпонентных смесях и биологических объектах, включающих разнообразные мешающие биополимеры, используя специфичность энзиматической деполимеризации ГК.

3. Методом энзиматической деполимеризации получены препараты ГК различной молекулярной массы. Показано, что вискозиметрия может использоваться для наблюдения за ходом расщепления ГК стрептококковой гиалуронатлиазой, поскольку падение вязкости растворов и уменьшение молекулярной массы ГК хорошо коррелируют.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на: 15th International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Analysis (Флоренция, 2004 г.); международных конференциях "Успехи в химии и химической технологии" (Москва, 2004 г.; Москва, 2005 г.); Ш и IV Московских международных Конгрессах "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2005 г.; Москва, 2007 г.); VI научно-практической конференции "Социально-значимые заболевания в дерматовенерологии" (Москва, 2006 г.); Всероссийской научно-технической конференции "Наука-производство-технологии-экология" (Киров, 2008 г.).

Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 2 статьи и 7 материалов докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы из 302 наименований. Работа изложена на 174 страницах машинописного текста и содержит 55 рисунков, 13 таблиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава 1. Объекты и методы исследования

Штамм-продуцент ГК. В работе использован штамм S. equi subsp. zooepidemicus (S. zooepidemicus) B-8014 (ATCC 39920) из коллекции ВКПМ ФГУП "ГосНИИгенетика". Данный штамм обладает естественной способностью к синтезу ГК, не проявляет гемолитической активности, является аттенуированным штаммом TV группы патогенности, не способным в норме вызывать заболевания человека, что и послужило основанием для его выбора в качестве объекта исследования. Стрептококковая гиалуронатлиаза представляет собой очищенный, лиофильно высушенный ферментный препарат, полученный при культивировании Streptococcus pneumoniae, производства филиала "МедГамал" ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Глубинное культивирование S. zooepidemicus осуществляли (а) в стеклянных колбах без отбойников на 100 мл с ватно-марлевыми пробками на качалке "New Brunswick" G10 при скорости вращения платформы 150 об/мин и температуре 37 "С. Аэрацию регулировали степенью заполнения колб питательной средой, (б) В лабораторном биореакторе на 10 л с обечайкой из стекла, (в) в лабораторном биореакторе на 1,5 л с обечайкой из стекла. Культивирование в ферментерах осуществляли при температуре 37 °С с автоматическим контролем pH среды подачей стерильного 10 % раствора NaOH. Для культивирования применяли различные среды: МПБ, L-бульон, модифицированная среда MRS [Нетрусов и др., 2005]. При культивировании в ферментере добавлялся пеногаситель структол (0,02 % от рабочего объема). Объем посевного материала культуры, находящейся в конце экспоненциальной фазы роста, составлял 5 % от объема среды.

Ферментативную реакцию деполимеризации ГК проводили следующим образом. Гиалуронат натрия в количестве, учитывающем необходимое содержание ПС, растворяли при температуре 80 °С в 0,05 М ацетатном буфере pH 5,5 с содержанием 10 мМ СаС1г*6НгО и 14,5 мМ NaCl в конечном растворе. Охлаждали до 38 °С и добавляли фермент в виде раствора в том же ацетатном буфере до содержания белка 0,08 мг/мл в конечном растворе. За ходом реакции следили 1-24 часа с помощью вискозиметрической, спектроскопической и хроматографической техник.

ГК определяли по реакции глюкуроновой кислоты с карбазолом [Bitter et al., 1962] и по реакции N-ацетилглюкозамина с реактивом Моргана - Элсона [Reissig et al., 1955].

Молекулярную массу ГК определяли вискозиметрическим методом по уравнению Марка-Хаувинка:

M = ([q]/K)1/a, (1)

где [ij] - характеристическая вязкость ГК, мл/г; М - средневязкостная молекулярная масса ГК, Да; К и а - константы Марка-Хаувинка (для раствора ГК в 0,1 М растворе NaCl при 25 °С К = 0,016, а= 0,841 [Armstrong et al., 1995]).

Микробиологические методы исследований. Окраска капсул осуществлялась по методу Омелянского [Нетрусов и др., 2005]. Определение размеров клеток и капсул, характера гемолиза, способности расти в присутствии NaCl, способности сбраживания углеводов и другие микробиологические, физиологические и биохимические тесты исполнялись по стандартным методикам [Нетрусов и др., 2005].

Глава 2. Биосинтез 1 К культурой S. zooepidemicus Кинетика роста и синтеза I 1С штаммом 5. zooepidemicus В-8014

Наибольшее количество работ, связанных с биосинтезом ГК бактериями р. Streptococcus, указывает на постоянный характер образования ГК в ходе периодического культивирования, которое коррелирует с ростом биомассы. На рис. 1 представлены кривые роста и синтеза ГК и иных метаболитов штаммом S.

10 15 20 25

Время, ч.

8 6 4 2 о

2 £

Рис. 1. Глубинное периодическое культивирование штамма S. zooepidemicus В-8014 на сложной питательной среде № 5. 1 -кривая роста культуры (здесь и далее биомасса выражена через единицы оптической плотности бактериальной суспензии при длине волны 540 нм); 2 - кривая биосинтеза ГК; 3 - общая гиалуронидазная активность (ОГА) бактериальной суспензии; 4 - кривая потребления глюкозы; 5 - кривая накопления молочной кислоты (МК). ОГА [мПа*с/мин] выражена как скорость падения вязкости раствора 5,0 мг/мл высокомолекулярной (1100 кДа) ГК в ходе ее деполимеризации суспензией клеток в стандартных условиях.

zooepidemicus В-8014 на среде № 5 (глюкоза 10 г/л, ДЭ 10 г/л, пептон 5 г/л, триптон 5 г/л, NaCl 2 г/л, К2НР04 1 г/л, MgS04 0,1 г/л) при глубинном периодическом культивировании в биореакторе.

Характер кривой роста культуры - типичная

для роста микроорганизмов 8-образная кривая. В ходе всего культивирования из продуктов катаболизма глюкозы образуется преимущественно молочная кислота, что вызывает падение рН с 7,4 до 4,3 - 4,4. ГК в концентрациях, превышающих вносимые с инокулятом, начинает обнаруживаться в КЖ на стадии экспоненциального роста культуры. По ходу всей логарифмической фазы концентрация ГК растет, достигая значения 0,65 мг/мл, однако уже в ходе фазы замедленного роста концентрация ГК в КЖ перестает расти и даже снижается до 0,5 мг/мл. Экономический коэффициент ферментации составил 0,2 г/г; экономический коэффициент по продукту (ГК) на 24 час культивирования составил 0,077 г/г.

Микроскопия препаратов бактерий на различных стадиях глубинного аэробного

Рис. 2. Микрофотография препарата штамма S. zooepidemicus В-8014 (негативное окрашивание тушью) на 24 час культивирования в аэробных условиях. Клетки микроорганизмов указаны стрелками. Увеличение 10x100.

культивирования с окрашиванием капсул по Омелянскому показала, что штамм S. zooepidemicus В-8014 характеризуется наличием слабовыраженных капсул, истончающихся по ходу культивирования и полностью исчезающих на стационарной фазе роста культуры (рис. 2).

Снижение концентрации ГК в КЖ и истончение капсул клеток S. zooepidemicus В-8014 может быть связано с синтезом микроорганизмами фермента гиалуронатлиазы (бактериальной гиалуронидазы). Проведенные исследования ферментативной активности культуры микроорганизмов на разных фазах роста показали, что штамм S. zooepidemicus В-8014 обладает заметной гиалуронидазной активностью, проявляемой в самом конце экспоненциальной фазы роста культуры, что совпадает по времени с уменьшением концентрации ГК в КЖ (рис. 1). При этом на стационарной фазе ферментативная активность бактериальной суспензии довольно быстро снижается, что позволяет говорить о том, что индукция фермента начинается в фазе замедления роста и прекращается с выходом культуры на стационар, после чего происходит инактивация фермента.

Получение мукоидных штаммов S. zooepidemicus При высеве на МПА штамма 5. zooepidemicus В-8014 на 24 час инкубирования при 37 °С были получены однотипные небольшие круглые колонии (диаметром 1 -2 мм) с фестончатым краем и с нетипичной для продуцентов ГК "немукоидной" морфологией: шероховатой матовой поверхностью, невязкой консистенцией. Это, также как и отсутствие выраженных капсул при микроскопировании с негативным окрашиванием (рис. 2), свидетельствовало о низком уровне образования ГК клетками S. zooepidemicus В-8014. Для того чтобы получить мукоидные мутанты S.

zooepidemicus, характеризующиеся повышенной секрецией ГК, исходный штамм В-8014 было решено подвергнуть мутагенному воздействию жесткого УФ (X = 254 нм) с последующей селекцией штаммов, колонии которых отличались бы типичной мукоидной морфологией: крупными размерами, глянцевой поверхностью, вязкой, слизистой структурой.

Всего в 20 сериях экспериментов по УФ облучению суспензий клеток S. zooepidemicus В-8014 после высева на МПА было исследовано более 30 тысяч колоний, что позволило отобрать 8 мутантных штаммов мукоидного типа. Наиболее стабильным в отношении сохранения мукоидной морфологии колоний оказался штамм S. zooepidemicus, обозначенный КБ-04. Для выявления особенностей полученного мукоидного штамма S. zooepidemicus КБ-04 были проведены серии экспериментов по сравнению морфологических, физиологических и биохимических характеристик штаммов S. zooepidemicus В-8014 и КБ-04. Результаты этих исследований продемонстрированы на рис. 3, 4 и сведены в табл. 1.

Рис. 3. Микрофотография препарата штамма zooep¡demicus КБ-04 (негативное окрашивание тушью) на 24 час культивирования в аэробных условиях. Хорошо видны массивные капсулы, окружающие цепочки клеток большим светлым ореолом. Увеличение 15x100.

Табл. 1. Сравнение некоторых морфологических, физиологических и биохимических характери-

стик штаммов £ гооерк1ет1си$ В-8014 и КБ-04

Характеристики Штаммы

Б 200ер\с1ет1си5 В-8014 5 гооер^етюиз КБ-04

Описание колоний, формируемых штаммами на МПА за 24 часа инкубирования

Цвет бежевый бежевый

Диаметр 1 - 1,5 мм 4 - 4,5 мм

Поверхность матовая, слабошероховатая глянцевая, гладкая

Края фестончатые ровные

Профиль выпуклый выпуклый

Консистенция невязкая вязкая

Описание препаратов с окрашиванием капсул на 24 час культивирования

% капсулированных клеток 1-2 70 ±10

Толщина капсулы за пределами измерительной способности микрометра 2-4 мкм

Физиологические особенности штаммов при культивировании в жидкой питательной среде

Достигаемая оптическая плотность культуры на длине волны X = 540 нм при культивировании на среде №5 2,1 2,2

Конечный рН ферментационной среды 4,36 ±0,05 4,40 ±0,05

Устойчивость к рН 9,5 - -

Устойчивость к прогреванию при 60 °С в течение 20 мин

Гемолиз - -

Биохимические особенности штаммов

Сбраживание углеводов

Мальтоза + +

Лактоза - -

Сахароза + +

Сорбитол _ -

Глицерин - -

Манитол - -

Синтез ГК + +

Качественные реакции на ГК, проводимые с выделенным полисахаридом

Реакция преципитации с раствором БСА в ацетатном буфере + +

Реакция на глюкуроновую кислоту + +

Реакция на N1-ацетилглюкозамин + +

"-" - признак отсутствует, "+" - признак выражен

Рис. 4. Морфология колоний штаммов 5". гооер1ёетюи5 В-8014 (А и В) и ¿ооер\с1ет1си$ КБ-04 (Б и Г) при посеве на МПА штрихом (А и Б) и методом Коха (В и Г).

Анализ гиалуронидазной активности суспензии клеток штамма £ :ооер1-(¡еткш КБ-04 на разных фазах культивирования однозначно показал ее отсутствие (рис. 5). При сравнении рис. 1 и рис. 5 видно, что штамм 5. гооер1с1е1тсш КБ-04 по

характеру роста существенно не отличается от исходного штамма В-8014, но при этом, по-видимому за счет отсутствия гиалуронидазной активности, снижения скорости синтеза или падения концентрации ГК на пред- и стационарной фазах культивирования не происходит. Концентрация ГК при культивировании на среде № 5 достигает 1,6 мг/мл, что почти в 3 раза выше, чем у исходного штамма. Экономиче-

Время, ч.

Рис. 5. Глубинное периодическое культивирование штамма гооер1с1ет1сш КБ-04 на среде № 5. 1 - кривая роста культуры; 2 - кривая биосинтеза ГК; 3 - ОГА бактериальной суспензии.

ский коэффициент ферментации составил 0,2 г/г; экономический коэффициент по продукту (ГК) составил 0,2 г/г.

Таким образом, методом УФ-индуцированного мутагенеза удалось получить стабильный штамм-продуцент ГК, отличающийся от исходного штамма 5. гооер1с!ет1сш В-8014 отсутствием гиалуронидазной активности и характеризующийся наличием выраженных капсул из ГК, не исчезающих по ходу культивирования, мукоидной морфологией колоний на МПА и большим выходом ГК при культивировании в периодических условиях.

Оптимизация состава питательной среды и режимов культивирования 5.

гооерШеткиь КБ-04 На первом этапе исследования влияния состава питательной среды на синтез ГК штаммом 5. гооер1с1еткш КБ-04 по методу Плакетта-Бурмана были выявлены значимые компоненты среды МЕЙ, оказывающие наиболее существенное влияние на синтез ГК. Причем установлено, что ДЭ, пептон, триптон, К2НРО4, Мп804 положительно влияют на синтез ГК, а ацетат натрия и - отрицательно.

Дальнейшую оптимизацию питательной среды и режима культивирования было решено проводить по методу раздельной оптимизации каждого фактора при постоянном фоне. Культивирование осуществлялось в колбах на 100 мл (заполнение средой 35 мл) с ватными пробками. По ходу культивирования и через 24 часа инкубирования при постоянном перемешивании на качалке и термостатировании при 37 °С анализировалось содержание ГК, биомассы микроорганизмов, а также остаточное содержание Сахаров и рН, если это было необходимо.

Исследование влияния концентрации глюкозы на рост культуры и биосинтез ГК проводилось путем варьирования начального содержания глюкозы в питательной среде от 0 до 75 г/л. Результаты экспериментов представлены на рис. 6. Оптимальная для роста микроорганизмов начальная концентрация глюкозы в питательной среде составляет 15-20 г/л. При таком начальном содержании глюкозы еще сохраняется линейная зависимость между концентрацией образовавшейся биомассы и потребленного субстрата: экономический коэффициент равен 0,2 г/г (рис. 7).

Гпюкоза, г/л

Рис. 6. Зависимость выхода биомассы, концентрации ГК и остаточного содержания глюкозы в КЖ штамма 5. юоер^еткия КБ-04 от начального содержания глюкозы в питательной среде. 1 - оптическая плотность бактериальной суспензии; 2 -концентрация ГК; 3 - остаточная концентрация глюкозы.

С ростом начальной концентрации глюкозы в среде экономический коэффициент по продукту постепенно снижается (рис. 7), и, хотя выход ГК и увеличивается вплоть до концентрации глюкозы 25 г/л (рис. 6), но на каждый следующий потреб-

ленный грамм глюкозы синтезируется все меньше полисахарида. Максимумы зависимостей выхода био-

0,35 1--массы и концентрации

ГК от концентрации глюкозы в питательной среде практически совпадают. Дальнейшее увеличение начальной концентрации глюкозы в питательной среде ведет к ингибированию роста культуры микроорганизмов и уменьшению выхода ГК. Это проявляется в снижении удельной скорости роста культуры, выхода биомассы и уменьшении экономического коэффициента. Количество недоутилизированной глюкозы при этом резко возрастает, а концентрация ГК в ферментационной среде снижается (рис. 6).

Влияние катионов двухвалентных металлов на синтез ГК штаммом 5. гооер1<1етк№ КБ-04. Предполагается, что оперон синтеза ГК входит в группу генов, определяющих па-

Глюкоза, г/л

Рис. 7. Зависимость экономического коэффициента (1) и экономического коэффициента по продукту (2) от начальной концентрации глюкозы в питательной среде.

£ £

из S

а LQ

2,5

2 -

1,5-

1 -

0,5 -

Cj Л*

тогенность бактерий р. Streptococcus. Для стрептококков группы А вероятным эффектором экспрессии данных генов являются ионы Mg2* [Gryllos et al., 2003]. Возможно, что катионы Mg2+ являются эффекторами сенсорно-регуляторной системы, подавляющей экспрессию генов синтеза ГК и у стрептококков группы С, к которым относится S. zooepidemicus. Для выявления количественной зависимости влияния ионов двухвалентных металлов на синтез ГК было проведено исследование, в котором рост штамма S. zooepidemicus КБ-04 и биосинтез ПС оценивались при различных концентрациях ионов Mg2+ и Са2+ в питательной среде № 5. Результаты представлены на рис. 8.

Рис. 8. Влияние ионов двухвалентных металлов и Са2+) на рост культуры и синтез ГК штаммом & гооерЬИеткш КБ-04. По оси абсцисс отложена концентрация вводимых в питательную среду ионов и Са2+ в ммоль/л.

Высокие концентрации дополнительно вводимых в питательную среду ионов Mg2"" оказывали ингибирующее воздействие на синтез ГК, частично снимающееся присутствием в среде ионов Са2+. Сами катионы Са2+ не оказывали достоверно различимого влияния на синтез ГК штаммом S. zooepidemicus КБ-04. На выход биомассы изменение концентрации в питательной среде солей MgS04*7H20 и СаС12*6Н20 практически не влияло. Исключение составляет случай совместного присутствия солей в максимальных исследованных концентрациях (10 г/л MgS04*7H20 и 10 г/л СаС12*6Н20).

Влияние аэрации ферментационной среды на синтез ГК. ГК как фактор защиты от токсического действия кислорода. Бактерии р. Streptococcus осуществляют гомоферментативное молочнокислое брожение. Особенностью метаболизма S. zooepidemicus является то, что при биосинтезе ГК образуются дополнительные восстанови-

ь-

О С;

£ s

СО £

Объем среды

[□Биомасса ■ ГК □ ОСТ Глюкоза

тельные эквиваленты в форме НАДН2, что нарушает окислительно-востановительный баланс метаболизма. Это могло бы существенно затруднить дальнейший синтез ГК. В аэробных условиях избыточные восстановительные эквиваленты НАДН2 окисляются молекулярным кислородом с помощью НАДН-оксидазы, поэтому можно предположить, что оптимальная аэрация ферментационной среды будет существенно влиять на биосинтез ПС. Исследование влияния аэрации на синтез ГК культурой 5. zooepidemicus проводились в колбах на 100 мл с различным заполнением питательной средой (от 5 до 70 мл), что моделировало различную степень аэрации (для проведения процесса в анаэробных условиях использовались колбы с гидрозатвором). Результаты представлены на рис. 9.

При достаточно малом объеме питательной среды в колбе (5 мл) результаты эксперимента искажались преждевременным пересыханием, поэтому полученые данные исключены из дальнейшего рассмотрения. Результаты исследования свидетельствуют, что степень аэрации существенно влияет на биосинтез ГК: интенсивная аэрация увеличивает выход ГК в 4 - 5 раз по сравнению с выходом ГК, достигаемым в анаэробных условиях (рис. 9).

Необходимо отметить, что для анаэробных по своему метаболизму микроорганизмов кислород играет немаловажную роль, что наглядно демонстрирует увеличение выхода биомассы культуры с ростом степени аэрации. Степень утилиза-

Рис. 9. Влияние аэрации ферментационной среды на рост культуры & 2<юер1д1етки5 КБ-04, биосинтез ГК и остаточную концентрацию глюкозы (ОСТ глюкоза) при культивировании в аэробных и анаэробных условиях.

ции глюкозы также увеличивается с усилением аэрации среды. Увеличение выхода ГК и биомассы микроорганизмов, а также степени утилизации глюкозы при культивировании в аэробных условиях, по-видимому, связано со снижением внутриклеточного пула восстановительных эквивалентов НАДН2 путем их окисления молекулярным кислородом при участии НАДН-оксидазы. Это существенно облегчает образование предшественников ГК, а также повышает эффективность катаболизма глюкозы.

В то же время, для роста S. zooepidemicus существует определенный оптимум аэрации - чрезмерная аэрация начинает подавлять рост культуры (рис. 9). Поэтому одной из стратегий защиты клеток анаэробных по метаболизму микроорганизмов от избыточного количества молекулярного кислорода может быть образование капсул и слизей из ГК [Cleary et al., 1979]. Дело в том, что секреция культурой ГК существенно повышает вязкость ферментационной среды, что затрудняет массопе-ренос кислорода к клеткам, уменьшая таким образом газообмен. Кроме того, массивные капсулы из ГК, окружающие клетки S. zooepidemicus КБ-04, (рис. 3) затрудняют диффузию растворенного кислорода непосредственно к поверхности клетки и, возможно, нейтрализуют активные радикалы биотического, химического, фотохимического и механохимического происхождения.

Действительно, повышение аэрации ферментационной среды в наших экспериментах сопровождается непропорциональным приросту биомассы увеличением концентрации ГК - удельный выход ГК возрастает (рис. 10), что свидетельствует о

повышении уровня биосинтеза и секреции ГК каждой отдельной клеткой S.

zooepidemicus КБ-04, а не всей популяцией за счет увеличения ее численности. Возможные причины данного феномена обсуждались выше, а следствием является зашита от токсического действия активных форм кислорода. Таким образом, культуры бактерий р. Streptococcus, образующие капсулы из ГК, являются своеобразными саморегулирующимися системами: при малой аэрации синтез ГК затруднен, и незначительные количества полисахарида практически не препятствуют диффузии кислорода к клеткам; как только аэрация усиливается настолько, что может негативно сказываться на росте микроорганизмов, то удельный выход ГК возрастает, и клетки приобретают массивные капсулы, частично защищающие их от избытка кислорода.

Объем среды и условия культивирования

Рис. 10. Влияние аэрации ферментационной среды на удельный выход ГК при культивировании штамма 5. гоое/лУе/ш'а« КБ-04 в аэробных и анаэробных условиях.

Данный вывод подтверждают исследования, проведенные с родительским акапсулированным штаммом S. zooepidemicus В-8014. В анаэробных условиях выход биомассы акапсулированного штамма практически не отличался от выхода для штамма КБ-04, зато при интенсивной аэрации рост штамма В-8014 существенно подавлен, тогда как выход биомассы для штамма КБ-04 лишь немного ниже, чем при оптимальной для роста данных микроорганизмов аэрации.

Таким образом, в результате проведенной работы получен штамм S zooepidemicus КБ-04, характеризующийся крупными размерами и мукоидной морфологией колоний, которая обусловлена образованием клетками микроорганизмов массивных капсул, содержащих ГК. В работе также апробированы физико-химические условия, состав сред и режимы глубинного культивирования данного штамма. Оптимизация состава питательной среды, физико-химических условий и режимов культивирования (исключение из питательной среды солей магния, интенсификация аэрации, проведение периодической ферментации с подпитками по глюкозе) позволили повысить выход ГК с 0,6 до 3,4 г/л, то есть в 5,6 раза.

Глава 3. Деполимеризация гиалуроновой кислоты стрептококковой гиалуронатлиазой Кинетика деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой Для ферментативного расщепления ГК стрептококковой гиалуронатлиазой, исходя из предполагаемого механизма каталитического действия [Li et al., 2000], предложена кинетическая схема, представленная на рис. 11.

Рис. 11. Кинетическая схема расщепления ГК стрептококковой гиалуронатлиазой Е - фермент (гиа-луронатлиаза), S - субстрат (ГК), Р и Р' - продукты расщепления ГК, D - конечный продукт расщепления ГК стрептококковой гиалуронатлиазой (дисахарид) Стадии реакции на кинетической схеме соответствуют следующим стадиям механизма реакции расщепления ГК 1 - образование фермент-субстратного комплекса, 2 - диссоциация фермент-субстратного комплекса, 3, 4 - катализ расщепления цепи ГК, 5 - высвобождение продукта реакции, 6 - протонный обмен, 7, 8 - транслокация субстрата Математически можно доказать, что данная кинетическая схема описывается уравнением Михаэлиса-Ментен (2):

k3k5 k4+k5+kfi E°S° 0 <5 fh- k3k5 ч So+ V kl + Mk4+k5+k6);

1.4

E+S

JL Y

•ES

i EFT

ti\U

P или D -

Выражение начальной скорости ферментативной реакции формально аналогично классическому уравнению Михаэлиса-Ментен, где Км = (k2/k| + (k3*k5)/(ki*(k4+k5+k6))), a Vmax = ((k3*k5)/(k4+k5+k6))*E0.

Нами экспериментально показано, что вязкость водных растворов ГК данной

молекулярной массы существенно зависит только от концентрации раствора и температуры, в то время как изменение ионной силы и замена ионного окружения с NaCl на СаС12 в ацетатном буфере на реологические свойства растворов практически не повлияли. Поскольку вязкость раствора ГК данной концентрации непосредственно зависит от молекулярной массы полимера, то возможно проведение кинетического эксперимента по энзиматическому расщеплению ГК с использованием вискозиметрической техники для контроля молекулярной массы получаемых препаратов. На рис. 12 приведены типичные кривые падения вязкости в ходе энзиматического расщепления ГК. Реакция деполимеризации проводилась в ячейке ротационного вискозиметра РПЭ-1М, термостатированной при 38 °С.

В контрольном опыте в аналогичных условиях проведены реакции с использованием в качестве субстратов других биополимеров (альгиновой кислоты, хитоза-на, коллоидных растворов крахмала и различных белков). Все они демонстрировали стабильность - сохранение вязкости на протяжении 3-6 часов эксперимента (рис. 12). Это свидетельствует об отсутствии у препарата существенной протеоли-тической активности, выявляемой вискозиметрическими методами анализа, и специфичности бактериальной гиалуронатлиазы к ГК.

Для определения состава реакционной смеси по ходу процесса деполимеризации ГК была использована ВЭЖХ. На рис. 13 представлена типичная хромато-грамма продуктов деполимеризации высокомолекулярной ГК (раствор 5 мг/мл) стрептококковой гиалуронатлиазой спустя 1 час ферментативного воздействия. Наибольшую массовую долю (28,4 % или 1,42 мг/мл) среди продуктов реакции составляет 4,5-ненасыщенный дисахарид - конечный продукт деполимеризации ГК гиалуронатлиазой S pneumoniae. Также представлен весь спектр олигосахаридов, образующихся в ходе ферментативной реакции, разделяющихся при данных условиях хроматографирования: тетра-, гекса-, и т. д.

* иу/ц м^Т*

4 5 6

Т.

100

Время, мин

150

200

Рис. 12. Падение вязкости растворов высокомолекулярной ГК разных концентраций и растворов других биополимеров в ходе расщепления стрептококковой гиалуронатлиазой 1 - раствор ГК 7,6 мг/мл, 2 - раствор ГК 5,0 мг/мл, 3 - раствор ГК 2,7 мг/мл, 4 - раствор альгината натрия 10 мг/мл, 5 - раствор хи-тозана 10 мг/мл, 6 - коллагеновая суспензия 10 мг/мл

Рис. 13. ВЭЖХ продуктов расщепления ГК стрептококковой гиалуронат-лиазой Детектирование осуществлялось УФ спектрофотометрией при длине волны 232 нм Начальная концентрация образца высокомолекулярной ГК 5 мг/мл Время реакции ферментативной деполимеризации ГК 1 час 15 - пик 4,5-ненасыщенного диса-харида (4-дезокси-Ь-треогексозо-4-енопиранозилуроновая кислота-Р-1,3-Ы-ацегил-П-глюкозамин), 1,2.3 - высокомолекулярные компоненты реакционной смеси (белковая составляющая ферментного препарата и крупные неразделяемые фрагменты ГК), 4 - 14 промежуточные продукты энзи-матической деградации ГК

О 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Бремя шн

Инактивация стрептококковой гиалуронатлиазы в ходе деполимеризации ГК

Обращено-фазовая ВЭЖХ продуктов реакции расщепления ГК стрептококковой гиалуронатлиазой показала наличие спектра олигосахаридов (рис. 13). Выход конечного продукта реакции составляет 28 % спустя час проведения ферментативной реакции в случае деполимеризации ГК в растворе 5 мг/мл и 55 % спустя 6 часов - времени полного самопроизвольного прекращения реакции. Остаточная вязкость растворов (рис. 12) и пики высокомолекулярной ГК и различных олигосахаридов на хроматограмме после длительного проведения ферментативной реакции свидетельствуют о неполном протекании реакции расщепления ГК, что может быть вызвано инактивацией фермента либо обратимым или необратимым ингибирова-нием ферментативной реакции продуктами внутримолекулярного гидролиза ГК.

Было обнаружено, что реакционная смесь, прошедшая гидролиз, после внесения в раствор ГК не способна катализировать ее расщепление. Чтобы выяснить, не является ли этот эффект обратимым ингибированием продуктами реакции, смесь подвергалась суточному проточному диализу против стабилизирующего ацетатного буфера при 4 °С. Гиалуронатлиаза, прошедшая один цикл гидролиза и последующий диализ, демонстрировала крайне низкую начальную ферментативную активность. В то же время, внесение достаточно большого количества (до 50 % от начального содержания ГК) продуктов реакции в реакционную смесь в начальный момент времени существенным образом не отражалось на протекании ферментативной реакции, из чего можно заключить, что падение активности вызвано исключительно инактивацией фермента, а не обратимым или необратимым ингибированием продуктами реакции.

Кинетика процесса инактивации гиалуронатлиазы в ацетатном буфере в присутствии ионов кальция при температуре 38 °С описывается экспоненциальной функцией, что определено по характерному снижению начальной активности гиалуронатлиазы в ходе предынкубации фермента без субстрата. Такая потеря актив-

ности может происходить вследствие, например, тепловой денатурации фермента или протеолиза. Из литературы [Li et al., 2001] известно, что бактериальные гиалу-ронатлиазы являются весьма лабильными ферментами, склонными к автодеградации. Возможно, что потеря активности в ходе деполимеризации ГК или инкубации в ацетатном буфере у гиалуронатлиазы происходит за счет автопротеолиза - отрезания небольшой аминокислотной последовательности, переводящего фермент в неактивное состояние. Такой механизм инактивации отвечает кинетической схеме первого порядка (Еа —> Е,) и также может описываться экспоненциальной зависимостью активности фермента от времени [Варфоломеев и др. 1982].

Для проверки данного предположения электрофоретическим методом были исследованы пробы гиалуронатлиазы, взятые до проведения реакции деполимеризации ГК и спустя 6 часов реакции. Электрофорез в ПААГ показал (рис. 14), что ферментный препарат гиалуронатлиазы S. pneumoniae представлен в основном двумя белками с молекулярными массами около 110 и 95 кДа. Ферментативная активность может быть связана с одним из них или с обеими формами, на что чаще всего ссылаются в литературе [Li et al., 2001]. В ходе проведения ферментативной реакции белок с молекулярной массой 95 кДа постепенно переходит в форму с массой около 85 кДа. По-видимому, этим и объясняется инактивация стрептококковой гиалуронатлиазы: наиболее активная форма фермента с массой 95 кДа подвергается автодеградации, образуя неактивный белок с массой 5Э кда.

Секретируя гиапуронатлиазу, S. pneumoniae размягчает и растворяет матрикс соединительной ткани, облегчая колонизацию межклеточного пространства и дальнейшую инвазию в ткани хозяина. Однако патогенез заболеваний, вызываемых S. pneumoniae, подчиняется и другим закономерностям, исследование которых выходит за рамки данной работы. Можно лишь отметить, что для защиты от клеточного и гуморального иммунного ответа хозяина 5. pneumoniae формирует капсулу, содержащую ГК. Вполне возможно, что на определенном этапе развития инфекционного процесса (когда деполимеризация ГК матрикса окружающих тканей уже создала условия для инвазии возбудителя) функция гиалуронатлиазы оказывается исчерпанной, а проявляемая активность даже может снижать защитные свойства бактериальной капсулы из-за деградации содержащейся в ней ГК. Биологическое значение инактивации стрептококковой гиалуронатлиазы по механизму автопротеолиза заключается в том, что молекула фермента в таких случаях самостоятельно выводит себя из дальнейшего участия в жизнедеятельности pneumoniae.

Таким образом, у патогенных бактерий р. Streptococcus существуют разнообразные механизмы инвазии и преодоления иммунного ответа хозяина, включающие два на первый взгляд противоположных явления - синтез ГК и ее деградацию

Рис. 14. Электрофорез в ПААГ препаратов гиалуронатлиазы S. pneumoniae до проведения ферментативной реакции деполимеризации ГК (справа) и после 6 часов реакции (слева).

гиалуронатлиазами. Тонкий баланс между этими двумя механизмами осуществляется при помощи регуляции экспрессии и ферментативной активности гиалуронат-синтазы с одной стороны и регуляции экспрессии, ферментативной активности и автопротеолиза гиалуронатлиазы с другой.

Получение фракций низкомолекулярной ГК с заданной молекулярной массой путем энзиматической деполимеризации высокомолекулярной ГК

Вискозиметрический метод наблюдения за процессом ферментативной деполимеризации ГК дает возможность определять среднюю молекулярную массу продуктов расщепления ГК, что является, по сути, методом контроля хода деполимеризации в реальном времени. Нами построена математическая модель падения вязкости раствора ГК в ходе расщепления биополимера стрептококковой гиалуронат-лиазой, с помощью которой возможно рассчитать изменение относительной молекулярной массы ГК:

М/М0 = Шпл^ммяш*)?*", (3)

где М( и Мо - молекулярные массы ГК в момент времени I и до начала реакции соответственно, Да;

Щл и Чл - относительные вязкости раствора в момент времени I и до начала реакции соответственно;

с^я/Л и с^к/ск - скорость падения вязкости раствора ГК в момент времени I и начальная скорость падения вязкости раствора ГК соответственно, мин"1 (определяются графически).

В табл. 2 приводится сравнение изменения средней молекулярной массы, определенной экспериментально по характеристической вязкости и рассчитанной по уравнению (3), для растворов с концентрацией ГК 5,0 и 7,6 мг/мл в ходе ее деполимеризации стрептококковой гиалуронатлиазой.

Табл. 2. Изменение средней молекулярной массы ГК в ходе ее деполимеризации стрептококковой гиалуронатлиазой в растворах различной концентрации по данным математической модели и непосредственного измерения. _

ГК, мг/мл Экспериментально определенная (1) или рассчитанная (2) молекулярная масса, кДа Средняя молекулярная масса ГК, кДа

Время, мин

0 5 10 15 20

5,0 (1) 1100 550 320 - 80

(2) 1100 590 393 290 189

7,6 (1) 1100 650 - - 100

(2) 1100 740 520 360 270

Экспериментально определенная молекулярная масса высокомолекулярной ГК в процессе деполимеризации стрептококковой гиалуронатлиазой уменьшилась с 1100 ±100 кДа до 650 ± 80 кДа за 5 мин при начальной концентрации субстрата 7,6 мг/мл, что хорошо согласуется с рассчитанным по уравнению (3) - 740 кДа. За 20 мин молекулярная масса падает до 100 ± 50 кДа (расчетное значение начинает отклоняться от действительного и составляет 270 кДа, что может объясняться

принятыми допущениями и накоплением дисахарида, искажающим вискозиметри-

ческое определение молекулярной массы (рис. 15)). Для деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой в растворах меньших концентраций, например 5,0 мг/мл, совпадение экспериментально установленного значения молекулярной массы и рассчитанного по характеру падения вязкости по уравнению (3) еще лучше: за 5 мин молекулярная масса падает до 550 ± 50 кДа, а расчетное значение составляет 590 кДа (рис. 15).

Таким образом, контролируя вязкость растворов, методом деполимеризации стрептококковой гиалуронатлиазой возможно получение препаратов ГК с заданной молекулярной массой, причем процесс деполимеризации довольно эффективен: уже за 5 мин для раствора ГК 5,0 мг/мл молекулярная масса уменьшается в 2 раза, а за 20 мин - в 14 раз (рис. 15).

Определение ГК по продуктам ее энзиматической деградации стрептококковой гиалуронатлиазой.

Помимо получения низкомолекулярных продуктов гидролиза ГК для медицинских препаратов иммуномодулирующего действия метод энзиматической деградации применим для определения содержания ГК в сложных биологических образцах (тканях и жидкостях) по продуктам расщепления полимера. Полученные данные по кинетике инактивации стрептококковой гиалуронатлиазы позволили оптимизировать процесс деградации ГК с целью повышения выхода конечного продукта деполимеризации до 95 - 97 %, для чего была разработана схема проведения реакции, включающая трехкратное внесение фермента через равные промежутки времени (1 час).

Последовательность действий при определении концентрации ПС в биологических образцах методом деполимеризации стрептококковой гиалуронатлиазой с дальнейшим определением продуктов расщепления ГК методом ВЭЖХ представлена на рис. 16. В табл. 3 приведено сравнение разработанного нами метода анализа ГК с известными химическими методами.

Практическое применение данный метод может найти, например, в определении содержания ГК в экстрактах куриных гребней, стекловидных тел глаза, используемых для получения ГК, а также в некоторых тканях и биологических жидкостях человека и животных при диагностике заболеваний, сопровождающихся

Время, мин

Рис. 15. Падение молекулярной массы ГК в процессе деполимеризация стрептококковой гиалуронатлиазой при начальной концентрации ГК 5 мг/мл. 1 - молекулярная масса, рассчитанная по уравнению (3); 2 - экспериментально определенная молекулярная масса; 3 - дисахарид, определяемый методом ВЭЖХ.

изменением содержания ГК. Нами показана хорошая точность и воспроизводимость разработанной методики на модельных системах, включающих ГК и мешающие белки и полисахариды, а также на реальных биообъектах (гребнях кур).

Табл. 3. Содержание ГК в некоторых биологических образцах и модельных смесях, определенное различными методами. А - карбазольный метод анализа ПС; Б - метод анализа по реакции >1-ацетилглюкозамина с реактивом Моргана-Элсона; В - метод определения концентрации ГК по

Образец, содержащий ГК, или модельная смесь биополимеров Концентрация ГК (если известна) Содержание ГК, определенное методом

А Б В

Высокомолекулярная ГК 95% 95% 95% 94%

Низкомолекулярная ГК 99% 99% 99% 96%

Белок-альгинат-хитозан-ГК 25% 60% 74% 24,5 %

КЖ£ гооергскткш КБ-04* - 1,46мг/мл 2,1 мг/мл 1,52 мг/мл

Куриные гребни** - 1,6 % 6,6 % 1,45 %

♦ГК осаждалась спиртом. Результат пересчитывался на содержание ГК в КЖ. **ГК при определении методами А и Б экстрагировалась горячим водно-солевым раствором, осаждалась спиртом. Результат пересчитывался на массу образца естественной влажности.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Полученный с помощью УФ-индуцированного мутагенеза штамм S. zooepidemicus КБ-04, характеризуется крупными размерами и мукоидной морфологией колоний, формируемых на богатых питательных средах. Установлено, что му-коидная морфология штамма S. zooepidemicus КБ-04 обусловлена повышенным уровнем биосинтеза ГК и образованием стабильных капсул, что связано с отсутствием у штамма S. zooepidemicus КБ-04 какой-либо гиалуронатлиазной активности.

2. Оптимизирован состав питательной среды для культивирования S. zooepidemicus КБ-04 с целью микробиологического синтеза ГК. Определено, что наибольшее влияние на рост культуры и синтез ГК оказывает концентрация источника углерода. Показано, что на выход ГК положительно влияют ДЭ, пептон, триптон, ионы Мп2+; отрицательно - ацетат натрия и сульфат магния.

3. Обнаружено, что улучшение массообменных характеристик ферментационного процесса и повышение аэрации питательной среды увеличивает как конечную концентрацию ГК, так и ее удельный выход. Повышение секреции ГК при интенсивной аэрации носит регулируемый адаптивный характер, поскольку ГК может участвовать в защите клеток бактерий р. Streptococcus от токсичных форм кислорода.

4. Предложена кинетическая схема расщепления ГК стрептококковой гиалуронат-лиазой и показано, что данная схема описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. Вискозиметрическим методом исследован процесс деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой.

5. Показано, что незавершенность реакции деполимеризации обусловлена необратимой инактивацией стрептококковой гиалуронатлиазы, что обусловлено частичным автопротеолизом фермента. Подобраны оптимальные условия функционирования стрептококковой гиалуронатлиазы.

6. Впервые разработан метод анализа ГК в сложных биопробах по продуктам энзи-матической деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой с использованием ВЭЖХ. Предложен способ получения фракций ГК со средней и низкой молекулярной массой с помощью деполимеризации гликозаминогликана стрептококковой гиалуронатлиазой и показана применимость вискозиметрического метода контроля молекулярной массы ГК в ходе ее энзиматической деполимеризации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Белодед, А.В. Деполимеризация гиалуроновой кислоты стрептококковой гиалу-ронатлиазой / А.В. Белодед, Н.С. Марквичев, И.И. Самойленко, Р.Н. Цепилов // Биотехнология. - 2007. - №5. - С. 80-87.

2. Beloded, A.V. HPLC Quantification of Hyaluronic Acid by the Products of Its Enzymatic Degradation with Streptococcus Hyaluronate Lyase / A.V. Beloded, S.A. Mulyashov, N.S. Markvichev, I.I. Samoylenko, F.S. Sirovski // New Research on Biotechnology in Biology and Medicine / Eds. Egorov, A.M., Zaikov, G. - New-York: Nova Science Publishers, 2006. - Ch. 14. - P. 133-143.

3. Белодед, А.В. Исследование ферментативной деградации гиалуроновой кислоты стрептококковой гиалуронидазой / А.В. Белодед, С.А. Муляшов, Н.С. Марквичев // Успехи в химии и хим. технол. - 2004. - Т. XVIII. - № 6. - С. 53-55.

4. Белодед, А.В. Культивирование Streptococcus zooepidemicus - продуцента гиалуроновой кислоты на средах, содержащих мясные экстракты / А.В. Белодед, И.Г. Филиппов, Н.С. Марквичев, И.И. Самойленко // Успехи в химии и хим. технол. -2005. - Т. XIX. - № 5. - С. 82-85.

5. Белодед, А.В. Анализ гиалуроновой кислоты по продуктам ее энзиматической деградации стрептококковой гиалуронидазой методом HPLC / А.В. Белодед, Н.С. Марквичев, И.И. Самойленко // Тез. докл. Ш-го Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 14-18 марта 2005. -М.: "Экспо-Биохим-Технологии", 2005. - Ч. 1.-С. 192-193.

6. Белодед, А.В. Культивирование мукоидного штамма Streptococcus equi subsp. zooepidemicus - продуцента гиалуроновой кислоты / А.В. Белодед, Н.С. Марквичев, И.И. Самойленко // Тез. докл. IV-ro Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 12-16 марта 2007. - М.: "Экспо-Биохим-Технологии", 2007. - Ч. 2. - С. 44-45.

7. Grechishkina, О. HPLC Quantification of Hyaluronic Acid by the Products of Its Enzymatic Degradation / O. Grechishkina, S. Mulyashov, A. Beloded, F. Sirovski // Proceedings of the 15-th International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Analysis, May 2-6 2004. - Florence: РВА, 2004. - P. 114.

8. Самойленко, И.И. Изучение свойств гиалуроновой кислоты для применения в дерматокосметологии / И.И. Самойленко, А.В. Белодед, Р.Н. Цепилов, О.И. Самойленко // Труды VI-ой научно-практической конференции "Социально-значимые заболевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика", 28-29 сентября 2006 г. - М., 2006. - С. 153-154.

9. Белодед, А.В. Синтез гиалуроновой кислоты мукоидным штаммом Streptococcus zooepidemicus / А.В. Белодед, И.И. Самойленко // Сб. мат. Всероссийской научно-технической конференции "Наука-производство-технологии-экология". - Киров: Изд-во ВятГУ, 2008. - Т. 1. - С. 231-233.

Заказ № 446. Объем 1 пл. Тираж 100 зкч.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белодед, Андрей Васильевич

Введение.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. ГК: строение и свойства, биологические функции и 11 метаболизм у различных организмов, получение и применение.

1.1. История открытия ГК и основные этапы ее изучения.

1.2. Химическое строение и некоторые физико-химические свойства 15 ГК.

1.2.1.' Пространственная структура ГК. Вторичная и третичная 18 структуры ГК в водных растворах.

1.3. Нахождение и биологические функции ГК у различных 22 организмов.

1.3.1. Наличие ГК у организмов разных таксонов.

1.3.2. ГК в тканях млекопитающих и человека. Функции ГК.

1.3.3. ГК как компонент капсул бактерий.

1.4. Метаболизм ГК.

1.4.1. Биосинтез ГК. Биохимические и генетические аспекты 31 процесса: ферменты, гены, регуляция.

1.4.1.1. Биохимический путь синтеза ГК.

1.4.1.2. Функциональные и кинетические характеристики, 34 локализация, строение и каталитический механизм действия гиалуронатсинтаз.

1.4.1.3. Характеристика оперона синтеза ГК бактерий 40 p. Streptococcus: структура, клонирование и регуляция экспрессии.

1.4.2. Катаболизм ГК у бактерий p. Streptococcus.

1.4.2.1. Классификация ферментов, осуществляющих 44 деполимеризацию ГК.

1.4.2.2. Гиалуронатлиаза бактерий p. Streptococcus: 45 функциональные и кинетические характеристики, строение, механизм действия.

1.4.2.3. Биологическая роль гиалуронатлиаз у бактерий 50 p. Streptococcus.

1.5. Получение ГК.

1.5.1. Получение ГК экстракцией из животного сырья.

1.5.2. Получение ГК микробиологическим синтезом.

1.5.2.1. Штаммы-продуценты ГК.

1.5.2.2. Среды, условия и режимы культивирования 54 штаммов-продуцентов ГК.

1.6. Практическое использование ГК.

1.6.1. Медицинское применение ГК.

1.6.2. Применение ГК в косметологии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Микробиологический синтез и деградация гиалуроновой кислоты бактериями р. Streptococcus"

В конце XX - начале XXI века наметилась отчетливая тенденция к повсеместному внедрению в промышленность различных биопроцессов и к замене традиционных способов производства целого ряда веществ, имеющих медицинское, косметическое, пищевое, кормовое или иное назначение, на биотехнологические способы получения. Одновременно с этим раскрытие функций и механизмов биологического действия ряда биополимеров способствует созданию все новых продуктов и препаратов на их основе. Одним из таких биополимеров животного происхождения является гиалуроновая кислота (ГК). Прогресс в понимании биологических функций ГК [1] привел и, безусловно, еще приведет к расширению сфер применения данного гликозаминогликана в составе различных медицинских, косметических, ветеринарных препаратов и дальнейшему увеличению спроса на биополимер. При этом уже сейчас наблюдается определенный дефицит ГК высокой и относительно небольшой молекулярной массы, что отражается на высокой цене полисахарида, особенно по сравнению с аналогичными соединениями растительного, животного или микробного происхождения.

Традиционный способ получения ГК основан на экстракции биополимера из различных органов млекопитающих и птиц, например из стекловидного тела глаза крупного рогатого скота, гребней кур или пупочных канатиков новорожденных. Даже при беглом анализе животных источников ГК видно, что сырьевая база промышленного получения данного полисахарида весьма ограничена и не может полностью удовлетворить постоянно растущий спрос на ГК. К тому же поставки данного сырья могут носить сезонный или неравномерный характер. Данных недостатков лишен биотехнологический способ получения ГК, основанный на культивировании микроорганизмов-продуцентов ГК. Сырьем для получения полисахарида микробиологическим синтезом являются доступные соединения и компоненты: глюкоза, дрожжевой экстракт (ДЭ), минеральные соли и т. п. Производство ГК на основе микробиологического синтеза не зависит от сезонных поставок животного сырья, а также легко масштабируется и перепрофилируется в случае изменения конъюнктуры рынка.

Выделение ГК из животного сырья часто осложняется тем, что в тканях и органах млекопитающих и птиц (например, в гребнях кур) биополимер находится в комплексе с белками, протеогликанами, и, кроме того, в животном сырье часто присутствуют родственные гликозаминогликаны [2]. Дешевые препараты косметического назначения для наружного применения могут содержать небольшое количество животных белков и других сопутствующих биополимеров, но содержание белков в препаратах ГК медицинского назначения недопустимо. Получение ГК микробиологическим синтезом вследствие отсутствия в культуральной жидкости (КЖ) примесных гликозаминогликанов и связанных с ГК белков предусматривает относительно легкую и недорогую очистку, поэтому препараты "биотехнологической" ГК отличаются более высокими показателями качества (чистотой, а иногда и молекулярной массой), а также меньшей себестоимостью. Биотехнологический способ позволяет получать ГК с заранее известными характеристиками и показателями качества, поскольку возможности контроля технологических параметров при данном методе производства существенно шире. В то же время при традиционном получении ГК следует учитывать зависимость содержания биополимера и его молекулярной массы от возраста животного, его здоровья и даже сезонного времени забоя [3].

Помимо вышеперечисленного использование биологических соединений животного происхождения или препаратов, выделяемых из человеческих тканей, в терапии заболеваний человека приобретает все большее число противников. Кроме возникающих этических проблем существует риск инфицирования неспецифическими к определенному хозяину вирусами (вирус птичьего гриппа) и другими инфекционными агентами. Этого недостатка лишено применение ГК, полученной биотехнологическим способом и прошедшей требуемую очистку.

В силу данных причин можно спрогнозировать, что биотехнологическое производство постепенно будет вытеснять получение ГК методом традиционной экстракции из животного сырья. Следует отметить, что в настоящее время биотехнологическое производство ГК в России отсутствует. Отечественная ГК представлена препаратами, полученными экстракцией из гребней кур, а объем производимой ГК не удовлетворяет внутреннему спросу, что приводит к зависимости от импорта биополимера. Поэтому исследование процессов синтеза и деградации ГК микроорганизмами может лечь в основу создания биотехнологического производства ГК в России.

В последнее время появляется все больше сведений о размероспецифично-сти биологических функций и свойств ГК [4-9]: препараты ГК различной молекулярной массы стимулируют ангиогенез или проявляют антиангиогенные и противовоспалительные свойства, обладают иммуномодулирующими и антиок-сидантными свойствами. Полисахарид, фракционированный по молекулярной массе, может найти разнообразное применение в медицине и косметологии, поэтому работы по совершенствованию методов получения ГК и препаратов ее отдельных фракций с заданной молекулярной массой имеют большое научное и практическое значение.

Цель исследований. Изучить физиологические и биохимические аспекты метаболизма (биосинтеза и деградации) ГК бактериями p. Streptococcus, а также разработать научные основы управляемого культивирования и оптимизировать процесс микробиологического синтеза ГК штаммом-продуцентом, подобрав питательную среду, физико-химические условия и режимы культивирования. Исследовать процесс ферментативной деполимеризации ГК стрептококковыми гиалуронатлиазами для получения фракций полисахарида с заданной молекулярной массой и анализа ГК в биопробах сложного состава.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Методом индуцированного мутагенеза получить высокопроизводительный штамм-продуцент ГК.

4. Провести сравнительные реологические исследования растворов коммерческих препаратов и полученных образцов ГК. Определить молекулярную массу образцов ГК.

5. Исследовать кинетику деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиа-зой. Разработать метод получения препаратов ГК различной молекулярной массы, подобрав оптимальные условия проведения деполимеризации как для получения ГК низкой молекулярной массы, так и для осуществления полного гидролиза ГК.

6. Разработать метод определения концентрации ГК в сложных многокомпонентных смесях и биологических объектах, включающих разнообразные сопутствующие биополимеры, используя специфичность энзиматической деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой.

Научная новизна работы.

1. Установлено, что потеря капсул, состоящих из ГК, штаммом Streptococcus equi subsp. zooepidemicus B-8014 на поздней экспоненциальной и стационарной фазах культивирования происходит вследствие проявления штаммом гиалуро-натлиазной активности. Этим же объясняется снижение концентрации ГК в культуральной жидкости (КЖ) и "немукоидный" характер колоний, формируемых штаммом на агаризованной среде. УФ-индуцированным мутагенезом получен штамм S. equi subsp. zooepidemicus КБ-04, характеризующийся стабильностью формируемых капсул и мукоидной морфологией колоний.

3. Показано, что улучшение аэрации ферментационной среды способствует увеличению удельного выхода ГК, что связано, по-видимому, с окислением избыточных восстановительных эквивалентов НАДН2, образующихся в процессе биосинтеза ГК и затрудняющих ее дальнейший синтез, а также нарушающих окислительно-восстановительный баланс молочнокислого брожения. 4. Исследована кинетика деградации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой и показано, что незавершенность реакции деполимеризации обусловлена необратимой инактивацией стрептококковой гиалуронатлиазы, которая вызвана частичным автопротеолизом фермента. Предложен способ получения препаратов ГК различной молекулярной массы, используя метод ферментативной деполимеризации ГК. Предложен и обоснован вискозиметрический метод контроля процесса деполимеризации ГК. Разработан метод определения ГК в сложных биологических образцах, содержащих мешающие примесные биополимеры со сходной с ГК структурой, основанный на ВЭЖХ продуктов энзиматической деградации ГК.

Практическая значимость работы.

1. Впервые в России методом микробиологического синтеза получены препараты ГК. В качестве продуцентов биополимера использовались бактерии р. Streptococcus, обладающие естественной способностью к биосинтезу данного гликозаминогликана. Штамм S. equi subsp. zooepidemicus КБ-04, полученный УФ-индуцированным мутагенезом родительского штамма S. equi subsp. zooepidemicus В-8014, характеризуется стабильностью образуемых капсул на всем протяжении культивирования. Концентрация ГК в КЖ S. equi subsp. zooepidemicus КБ-04 превышает концентрацию, достигаемую при культивировании штамма S. equi subsp. zooepidemicus В-8014 в аналогичных условиях, в 3 - 5 раз. Оптимизация состава питательной среды, физико-химических условий и режимов культивирования позволила многократно увеличить выход ГК.

2. Исследование кинетики деградации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой позволило предложить схему проведения ферментативной реакции, позволяющую добиться практически полной деполимеризации ГК, что, в свою очередь, позволило разработать метод определения концентрации ГК в сложных многокомпонентных смесях и биологических объектах, включающих разнообразные мешающие биополимеры, используя специфичность энзиматической деполимеризации ГК.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Белодед, Андрей Васильевич

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Полученный с помощью УФ-индуцированного мутагенеза штамм S. zooepidemicus КБ-04, характеризуется крупными размерами и мукоидной морфологией колоний, формируемых на богатых питательных средах. Установлено, что мукоидная морфология штамма S. zooepidemicus КБ-04 обусловлена повышенным уровнем биосинтеза ГК и образованием стабильных капсул, что связано с отсутствием у штамма S. zooepidemicus КБ-04 какой-либо гиалуро-натлиазной активности.

3. Обнаружено, что улучшение массообменных характеристик ферментационного процесса и повышение аэрации питательной среды увеличивает как конечную концентрацию ГК, так и ее удельный выход. Повышение уровня секреции ГК при интенсивной аэрации носит регулируемый адаптивный характер, поскольку ГК может участвовать в защите клеток бактерий p. Streptococcus от токсичных форм кислорода.

4. Предложена кинетическая схема расщепления ГК стрептококковой гиалуронатлиазой и показано, что данная схема описывается уравнением Миха-элиса-Ментен. Вискозиметрическим методом исследован процесс деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой.

6. Впервые разработан метод анализа ГК в сложных биопробах по продуктам энзиматической деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой с использованием ВЭЖХ. Предложен способ получения фракций ГК со средней и низкой молекулярной массой с помощью деполимеризации гликозаминогли-кана стрептококковой гиалуронатлиазой и показана применимость вискозимет-рического метода контроля молекулярной массы ГК в ходе ее энзиматической деполимеризации.

4.7. Заключение.

Вискозиметрическими методами были исследованы растворы коммерческих препаратов ГК и образцы, полученные нами при культивировании S. zooepidemicus КБ-04. Реологические исследования позволили определить молекулярную массу исследованных образцов ГК. Препараты высокомолекулярной ГК (HMW) были подвергнуты энзиматической деполимеризации с использованием стрептококковой гиалуронатлиазы. За кинетикой ферментативной деградации ГК наблюдали с использованием ВЭЖХ, а также спектрофотометриче-ским и вискозиметрическим методами. Метод ВЭЖХ позволил выявить неполноту протекания деполимеризации ГК, которая, как оказалось, обусловлена необратимой инактивацией стрептококковой гиалуронатлиазы, которая, в свою очередь, вызвана частичным автопротеолизом фермента. Для проведения исчерпывающей деполимеризации ГК рекомендовано трехкратное дробное внесение ферментного препарата в реакционную смесь по ходу гидролиза. Субстратная специфичность стрептококковой гиалуронатлиазы в сочетании с подобранными условиями проведения гидролиза ГК позволила разработать метод определения ГК в сложных биологических образцах, содержащих мешающие биополимеры. Кроме того, энзиматическая деполимеризация может служить методом получения фракций ГК различной молекулярной массы. И, как было показано нами, для контроля реакции деполимеризации ГК стрептококковой гиалуронатлиазой хорошо применим вискозиметрический метод.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белодед, Андрей Васильевич, Москва

1. Toole В .P. Hyaluronan is not just a goo! // J. Clin. Invest. 2000. - V. 106. - № 3. - P. 335-336.

2. O'Regan M., Martini I., Crescenzi F., DeLuca C. et al. Molecular Mechanisms and genetics of hyaluronan Biosynthesis. // Int. J. Biol. Macromol. 1994. - V. 16. - P. 283-286.

3. Игнатова Е.Ю., Гуров A.H. Принципы извлечения и очистки гиалуроновой кислоты. // Хим.-фарм. журн. 1990. - Т. 24. - № 3. - С. 42-46.

4. McKee С.М., Penno М.В., Cowman М., Burdick M.D., Strieter R.M., Вао С., Noble P.W. Hyaluronan (HA) fragments induce chemokine gene expression in alveolar macrophages: the role of HA size and CD-44. // J. Clin. Invest. 1996. - V. 98. - P. 2403-2413.

5. Noble P.W., Lake F.R., Henson P.M., Riches D.W.H. Hyaluronate activation of CD-44 induces insulin-like growth factor-1 expression by a tumor necrosis factor-al-dependent mechanism in murine macrophages. // J. Clin. Invest. 1993. - V. 91. - P. 2368-2377.

6. Horton M.R., Burdick M.D., Strieter R.M., Вао C., Noble P.W. Regulation of hyaluronan-induced chemokine gene expression by IL-10 and IFN-y in mouse macrophages. // J. Immunol.1998. V. 160. - P. 3023-3030.

7. Horton M.R., Shapiro S., Вао C., Lowenstein C.J., Noble P.W. Induction and regulation of macrophage metalloelastase by hyaluronan fragments in mouse macrophages. // J. Immunol.1999.-V. 162.-P. 4171-4176.

8. West D.C., Hampson I.N., Arnold F., Kumar S. Angiogenesis induced by degradation products of hyaluronic acid. // Science. 1985. - V. 228. - P. 1324-1326.

9. Ohkawara Y., Tamura G., Iwasaki Т., Tanaka A., Kikuchi Т., Shirato K. Activation and transforming growth factor-beta production in eosinophils by hyaluronan. // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 2000. - V. 23. - P. 444-451.

10. Meyer K., Palmer J. The polysaccharide of the vitreous humor. // J. Biol. Chem. 1934. -V. 107.-P. 629-634.

11. Linker A., Meyer K. Production of Unsaturated Uronides by Bacterial Hyaluronidases. // Nature. 1954. - V. 174. - P. 1192-1194.

12. Weigel P.H., Hascall V.C., Tammi M. Hyaluronan Synthases. // J. Biol. Chem. 1997. -V. 272. - № 22. - P. 13997-14000.

13. Meyer K. Highly viscous sodium hyaluronate. // J. Biol. Chem. 1948. - V. 176. - № 2. -P. 993-997.

14. Fraser J.R., Laurent Т.С., Pertoft H., Baxter E. Plasma clearance, tissue distribution and metabolism of hyaluronic acid injected intravenously in the rabbit. // Biochcm. J. 1981. - V. 200. -P. 415-424.

15. Stern R. Devising a pathway for hyaluronan catabolism: are we there yet? // Glycobiol-ogy. -2003.- V. 13.-№ 12.-P. 105-115.

16. Kendall F.E., Heidelberger M., Dawson M.H. A serologically inactive polysaccharide elaborated by mucoid strains of group A hemolytic Streptococcus. // J. Biol. Chem. 1937. - V. 118.-P. 61-69.

17. Seastone C.V. The virulence of group С hemolytic streptococci of animal origin. // J. Exp. Med. 1939. - V. 70. - P. 361-378.

18. Topper Y.J.,- Lipton M.M. The biosynthesis of a streptococcal capsular polysaccharide. // J. Biol. Chcm. 1953. - V. 203. - P. 135-142.

19. Roseman S., Moses F.E., Ludowieg J., Dorfman A. The biosynthesis of hyaluronic acid by group A Streptococcus. Utilization of l-C14-glucose. // J. Biol. Chem. 1953. - V. 203. - P. 213-225.

20. Cifonelli J.A., Mayeda M. The purification of hyaluronic acid by the use of charcoal. // Biochim. et Biophys. Acta. 1957. - V. 24. - P. 397-400.

21. Warren G.H., Gray J. Isolation and purification of streptococcal hyaluronic acid. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1959. - V. 102. - P. 125-127.22. http://www.cheque.uq.edu.au/research/bioengineering/index.html

22. Markovitz A., Cifonelli J.A., Dorfman A. The biosynthesis of HA by group A Streptococcus. VI. Biosynthesis from uridine nucleotides in cell-free extracts. // J. Biol. Chem. 1959. - V, 234,-№9.-P. 2343-2350.

23. Prehm P. Hyaluronate is synthesized at plasma membranes. // Biochem. J. 1984. -V. 220.-№2.-P. 597-600.

24. Philipson L.H., Schwartz N.B. Subcellular localization of hyaluronate synthetase in oligodendroglioma cells. // J. Biol. Chem. 1984. - V. 259. - P. 5017-5023.

25. Prehm P., Mausolf A. Isolation of streptococcal hyaluronate synthase. // Biochem. J. -1986. V. 235. - № 3. - P. 887-889.

26. Triscott M.X., van de Rijn I. Solubilization of hyaluronic acid synthetic activity from streptococci and its activation with phospholipids. // J. Biol. Chem. 1986. - V. 261. - P. 60046009.

27. Ng K.F., Schwartz N.B. Solubilization and partial purification of hyaluronate synthetase from oligodendroglioma cells. // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264. - P. 11776-11783.

28. Lansing M., Lellig S., Mausolf A., Martini I., Crescenzi F., Oregon M., Prehm P. Hyalu-ronate synthase: cloning and sequencing of the gene from Streptococcus sp. // Biochem. J. 1993. -V. 289.-P. 179-184.

29. Van de Rijn I., Drake R. R. Analysis of the streptococcal hyaluronic acid synthase complex using the photoaffmity probe 5-azido-UDP-glucuronic acid. // J. Biol. Chem. 1992. - V. 267. - P.24302-24306.

30. DeAngelis P.L., Papaconstantinou J., Weigcl P.H. Isolation of a Streptococcus pyogenes gene locus that directs hyaluronan biosynthesis in acapsular mutants and in heterologous bacteria. // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268. - P. 14568-14571.

31. DeAngelis P.L., Papaconstantinou J., Weigel P.H. Molecular cloning, identification and sequence of the hyaluronic acid synthase gene from Group A Streptococcus pyogenes. // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268. - P. 19181-19184.

32. DeAngelis P. L., Weigel P.H. Immunochemical confirmation of the primary structure of streptococcal hyaluronan synthase and synthesis of high molecular weight product by the recombinant enzyme. // Biochem. 1994. - V. 33. - P. 9033-9039.

33. Weissman В., Meyer K. The structure of hyalobiuronic acid and of hyaluronic acid from umbilical cord. // J. Am. Chem. Soc. 1954. - V. 76. - P. 1753-1757.

34. Радаева И.Ф., Костина Г.А., Змиевский A.B. Гиалуроновая кислота: биологическая роль, строение, синтез, выделение, очистка и применение (обзор). // Прикл. биохим. микро-биол. 1997. - Т. 33. - №2. - С. 133-137.

35. Scott J.E. Secondary structures in hyaluronan solutions: chemical and biological implications. The Biology of Hyaluronan. // Ciba Foundation Symposium. 1989. - V. 143. - P. 6-15.

36. Armstrong D.C., Johns M.R. Improved molecular weight analysis of streptococcal hyaluronic acid by size exclusion chromatography. // Biotechnol. Techniq. 1995. - V. 9. - № 7. - P. 491-496.

37. Armstrong D.C., Johns M.R. Culture Conditions Affect the Molecular Weight Properties of Hyaluronic Acid Produced by Streptococcus zooepidemicus. // Appl. Environ. Microbiol. -1997. V. 63. - № 7. - P. 2759-2764.

38. Atkins E.D., Phelps C.F., Sheehan J.K. The conformation of the mucopolysaccharides. Hyaluronates. // Biochem. J. 1974. - V. 128. - P. 1255-1263.

39. Sheehan J.K., Arundel С., Phelps C.F. Effects of the cations sodium, potassium and calcium on the interaction of hyaluronate chains a light-scattering and viscosimetric study. // Int. J. Biol. Macromol. - 1983. - V. 5. - P. 222-228.

40. Sheehan J.K., Gardner K.H., Atkins E.D. Hyaluronic acid: a double helix structure in the presence of potassium at low pH and found also with the cations ammonium, rubidium and calcium. // J. Mol. Biol. 1977. - V. 117. - P. 113-35.

41. Atkins E.D., Sheehan J.K. Hyaluronates: Relation between Molecular Conformations. // Scicnce. 1973. - V. 179. - № 4073. - P. 562-564.

42. Dea I.C., Moorhouse M.R. Hyaluronic Acid: A Novel, Double Helical Molecule. // Science. 1973. - V. 179. - № 4073. - P. 560-562.

43. Guss J.M., Hukins D.W., Smith P.J., Winter W.T., Arnott S. Hyaluronic acid: molecular conformations and interactions in two sodium salts. // J. Mol. Biol. 1975. - V. 95. - P. 359-384.

44. Winter W.T., Arnott S. Hyaluronic acid: the role of divalent cations in conformation and packing. // J. Mol. Biol. 1977. - V. 117. - № 3. p. 761-784.

45. Cleland R.L., Wang J.L. Ionic polysaccharides. III. Dilute solution properties of hyaluronic acid fractions. // Biopolymers. 1970. - V. 9. - № 7. - P. 799-810.

46. Cleland R.L. The persistence length of hyaluronic acid: an estimate from small-angle x-ray scattering and intrinsic viscosity. // Arch. Biochcm. Biophys. — 1977. — V. 180. P. 57 — 68.

47. Cleland R.L. Ionic polysaccharides. II. Comparison of polyelectrolyte behavior of hyaluronate with that of carboxymethyl cellulose. // Biopolymers. 1968. - V. 6. - № 11. - P. 15191529.

48. Darke A., Finer E.G., Moorhouse R., Rees D.A. Studies of hyaluronate solutions by nuclear magnetic relaxation measurements. Detection of covalently-defmed, stiff segments within the flexible chains. // J. Mol. Biol. 1975. - V. 99. - № 3. - P. 477-486.

49. Ribitsch G., Schurz J., Ribitsch V. Investigation of the solution structure of hyaluronic acid by light scattering, SAXS and viscosity measurements. // Colloid Polymer Sci. 1980. - V. 258.-P. 1322-1334.

50. Scott J.E., Tigwell M.J. Periodate oxidation and the shapes of glycosaminoglycuronans in solution. // Biochem. J. 1978. - V. 173. - P. 103-114.

51. Scott. J.E., Heatley F., Hull W.E. Secondary structure hyaluronan in solution. A lH-n.m.r. investigation at 300 and 500 MHz in 2H6.dimethyl sulphoxide solution. // Biochem J. 1984. - V. 220.-P. 197-205.

52. Atkins E.D.T., Meader D., Scott J.E. Model of hyaluronic acid incorporating four intramolecular hydrogen bonds. // Int. J. Biol. Macromol. 1980. - V. 2. - P. 318-319.

53. Almond A., Sheehan J.K. Predicting the molecular shape of polysaccharides from dynamic interactions with water. // Glycobiology. 2003. - V. 13. - P. 255-264.

54. Almond A., Brass A., Sheehan J.K. Oligosaccharides as model systems for understanding water-biopolymer interaction: hydrated dynamics of a hyaluronan decamer. // J. Phys. Chem. B. -2000. V. 104. - P. 5634-5640.

55. Cowman M.K., Spagnoli C., Kudasheva D., Li M., Dyal A., Kanai S., Balazs E.A. Extended, Relaxed, and Condensed Conformations of Hyaluronan Observed by Atomic Force Microscopy. // Biophys. J. 2005. - V. 88. - P. 590-602.

56. Kogan G., Soltes L., Stern R., Gemeiner P. Hyaluronic acid: a natural biopolymer with a broad range of biomedical and industrial applications. // Biotechnol. Lett. 2007. - V. 29. - № 1. -P. 17-25.

57. Asari A., Miyauchi S., Kuriyama S., Machida A., Kohno K., Uchiyama Y. Localization of Hyaluronic Acid in Human Articular Cartilage. // J. Histochem. Cytochem. 1994. - V. 42. - № 4. -P. 513-522.

58. Cleland R.L., Sherblom A.P. Isolation and Physical Characterization of Hyaluronic Acid Prepared from Bovine Nasal Septum by Cetylpyridinium Chloride Precipitation. // J. Biol. Chem. -1977. V. 252. - № 2. - P. 420-426.

59. Levy P., Picard J., Bruel A. Glycosaminoglycan Biosynthesis in Arterial Wall Sulfation of Heparan Sulfate in Cell Membrane of Aortic Mcdia-Intima. // Eur. J. Blochem. 1981. - V. 115. -P. 397-404.

60. Nardinia M., Oria M., Vigettid D., Gornatid R., Nardia I., Perris R. Regulated gene expression of hyaluronan synthases during Xenopus laevis development. // Gene Expression Patterns. -2004. V. 4.-P. 303-308.

61. Schmidt A., Prager M., Selmke P., Buddecke E. Isolation and Properties of Proteoglycans from Bovine Aorta. // Eur. J. Biochem. 1982. - V. 125.-P. 95-101.

62. Itano N., Kimata K. Expression cloning and molecular characterization of HAS protein, a eukaryotic hyaluronan synthase. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 9875-9878.

63. Shyjan A.M., Heldin P., Butcher E.C., Yoshino Т., Briskin M.J. Functional cloning of the cDNA for a human hyaluronan synthase. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 23395-23399.

64. Spicer A.P., Augustine M.L., McDonald J.A. Molecular cloning and characterization of a putative mouse hyaluronan synthase. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 23400-23406.

65. Watanabe К., Yamaguchi Y. Molecular identification of a putative human hyaluronan synthase. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 22945-22948.

66. Maccari F., Tripodi F., Volpi N. High-performance capillary electrophoresis separation of hyaluronan oligosaccharides produced by Streptomyces hyalurolyticus hyaluronate lyase. // Carbohydrate Polym. 2004. - V. 56. - P. 55-63.

67. DeAngclis P.L., Jing W., Graves M.V., Burbank D.E., van Etten J.L. Hyaluronan synthase of chlorella virus PBCV-1. // Science. 1997. - V. 278. - P. 1800-1803.

68. Graves M.V., Burbank D.E., Roth R., Heuser J., DeAngelis P.L., van Etten J.L. Hyaluronan synthesis in virus PBCV-1-infected chlorella-like green algae. // Virology. 1999. - V. 257. -P. 15-23.

69. Stoolmiller A.C., Dorfman A. The biosynthesis of hyaluronic acid by Streptococcus. // J. Biol. Chcm. 1969. - V. 244. - № 2. - P. 236-246.

70. Kass E.H., Seastone C.V. The role of the mucoid polysaccharide (hyaluronic acid) in the virulence of group A streptococci. // J. Exp. Med. 1944. - V. 79. - P. 319-330.

71. Carter G.R., Annau E. Isolation of capsular polysaccharides from colonial variants of Pas-teurella multocida. // Am. J. Vet. Res. 1953. - V. 14. - P. 475-478.

72. DeAngelis P.L., Jing W., Drake R.R., Aehyuthan A.M. Identification and molecular cloning of a unique hyaluronan synthase from Pasteurella multocida. // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. -P. 8454-8458.

73. Evanko S., Wight T. Intracellular hyaluronan. Электронный ресурс. 2001. - Доступно на: http://www.glycoforum.gr.jp/science/hyaluronan/HA20/HA20E.html.

74. Rreil G. Hyaluronidases a group of neglected enzymes. // Protein Sci. - 1995. - V. 4. -P.1666-1669.

75. Toole B.P. Proteoglycans and Hyaluronan in Morphogenesis and Differentiation. // Cell Biology of Extracellular Matrix / ed. Hay E.D. New York: Plenum Press, 1991. - P. 305-341.

76. Toole B.P. Hyaluronan in morphogenesis. // J. Intern. Med. 1997. - V. 242. - P. 35-40.

77. Juhlin L. Hyaluronan in skin. // J. Intern. Med. 1997. - V. 242. - P. 61-66.

78. Португалова B.B., Ерзикян K.JI. Гиалуроновая кислота и ее роль в жизнедеятельности организмов. // Успехи современ. биол. 1986. - Т. 101. - № 3. - С. 344-358.

79. Prehm P. Hyaluronan. // Biopolymers: biology, chemistry, biotechnology, applications. -V. 5: Polysaccharides I. Polysaccharides from prokaryotes. / eds. Vandamme E.J., DeBaets S., Steinbuchel A. Weinheim: Wiley-VCH, 2000. - P. 379-404.

80. Schiller J., Fuchs В., Arnhold J., Arnold K. Contribution of rcactive oxygen specics to cartilage degradation in rheumatic diseases: molecular pathways, diagnosis and potential therapeutic strategies. // Curr. Med. Chem. 2003. -V. 10. - P. 2123-2145.

81. Soltes L., Mcndichi R., Kogan G., Schiller J., Stankovska M., Arnhold J. Degradative action of reactive oxygen spccies on hyaluronan. // Biomacromol. 2006. - V. 7. - P. 659-668.

82. Tammi M.I., Day A.J., Turley E.A. Hyaluronan and homeostasis: a balancing act. // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P. 4581-4784.

83. Feinberg R.N., Beebe D.C. Hyaluronate in vasculogenesis. // Science. 1983. - V. 220. -№4602.-P. 1177-1179.

84. Xu H., Ito Т., Tawada A., Maeda H., Yamanokuchi H., Isahara K., Yoshida K., Uchiyama Y., Asari A. Effect of hyaluronan oligosaccharides on the expression of heat shock protein 72. // J. Biol. Chem.-2002.-V. 277.-P. 17308-17314.

85. Stern R., Asari A.A., Sugahara K.N. Hyaluronan fragments: an information-rich system. // Eur. J. Cell Biol. 2006. - V. 85. - P. 699-715.

86. Lancefield R.C. A serological differentiation of human and other groups of hemolytic streptococci.//J. Exp. Med. 1933. - V. 57.-P. 571-595.

87. Lancefield R.C., Dole V.P. The properties of T antigens extracted from the group A hemolytic streptococci. // J. Exp. Med. 1946. - V. 84. - P. 449-471.

88. Lancefield R.C. Current knowledge of type-specific M antigens of group A streptococci. // J. Immunol. 1962,-V. 89.-P. 307-313.

89. Stevens D.L. Invasive group A streptococcus infections. // Clinic. Infect. Dis. 1992. - V. 14. - P. 2-11.

90. Timoney J.F., Mukhtar M.M. The protective M proteins of the equine group С streptococci. // Vet. Microbiol. 1993. - V. 37. - P. 389-395.

91. Bradley S.F., Gordon J.J., Baumgartner D.D., Marasco W.A., Kauffman C.A. Group С streptococcal bacteremia: analysis of 88 cases. // Rev. Infect. Dis. 1991. - V. 13. - P. 270-280.

92. Carter G.R. Pasteurellosis: Pasteurella multocida and Pasteurella hemolytica. // Adv. Vet. Sci. 1967. - V. 11. - P. 321-379.

93. Mortimer E.A., Vastine E.L. Production of Capsular Polysaccharide (Hyaluronic Acid) by L Colonics of Group A Streptococci. // J. Bacteriol. 1967. - V. 94. -№ 1. - P. 268-271.

94. Chong B.F., Blank L.M., Mclaughlin R., NielsenL K. Microbial hyaluronic acid production. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. - V. 66. - P. 341-351.

95. DeAngelis P.L. Enzymological characterization of the Pasteurella multocida hyaluronic acid synthase.//Biochem. 1996.-V. 35.-P. 9768-9771.

96. Van de Rijn I. Streptococcal Hyaluronic Acid: Proposed Mcchanisms of Degradation and Loss of Synthesis During Stationary Phase. // J. Bacteriol. 1983. - V. 156. - № 3. - P. 10591065.

97. Salzbcrg S.L., White O., Peterson J., Eisen J.A. Microbial genes in the human genome: lateral transfer or gene loss? // Science. 2001. - V. 292. - P. 1903-1906.

98. Lander E.S., Linton L.M., Birren В., Nusbaum C. et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. // Nature. 2001. - V. 409. - P. 860-921.

99. Hirst G.K. The effect of polysaccharide-splitting enzyme on streptococcal infection. // J. Exp. Med. 1941,- V. 73.-P. 493-506.

100. Wessels M.R., Moses A.E., Goldberg J.B., Dicesare T.J. Hyaluronic acid capsule is a virulence factor for mucoid Group A streptococci. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991. - V. 88. -P. 8317-8321.

101. Wessels M.R., Goldberg J.B., Moses A.E., DiCesare T.J. Effects on virulence of mutations in a locus essential for hyaluronic acid capsule expression in group A streptococci. // Infect. Immun. 1994. - V. 62. - P. 433-441.

102. Schrager H.M., Rhcinwald J.G., Wessels M.R. Hyaluronic acid capsule and the role of streptococcal entry into keratinocytes in invasive skin infection. // J. Clin. Investig. 1996. - V. 98. -P. 1954-1958.

103. Husmann L.K., Yung D.-L., Hollingshead S.K., Scott J.R. Role of Putative Virulence Factors of Streptococcus pyogenes in Mouse Models of Long-Term Throat Colonization and Pneumonia. // Infect. Immun. 1997. - V. 65. - № 4. - P. 1422-1430.

104. Pruimboom I.M., Rimler R.B., Ackermann M.R. Enhanced adhesion of Pasteurella mul-tocida to cultured turkey peripheral blood monocytes. // Infect. Immun. 1999. - V. 67. - P. 12921296.

105. Wessels M.R., Bronze M.S. Critical role of the group A streptococcal capsule in pharyngeal colonization and infection in mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 91. - P. 1223812242.

106. Cunningham M.W. Pathogenesis of Group A Streptococcal Infections. // Clinic. Microbiol. Rev. 2000. - V. 13. - № 3. - P. 470-511.

107. Magee A.D., Yother J. Requirement for Capsule in Colonization by Streptococcus pneumoniae. // Infect. Immun. 2001. - V. 69. - № 6. - P. 3755-3761.

108. Jadoun J., Eyal O., Sela S. Role of CsrR, Hyaluronic Acid, and SpeB in the Internalization of Streptococcus pyogenes M Type 3 Strain by Epithelial Cells. // Infect. Immun. 2002. - V. 70. - № 2. - P. 462-469.

109. Field T.R., Ward P.N., Pedersen L.H., Leigh J.A. The Hyaluronic Acid Capsule of Streptococcus uberis Is Not Required for the Development of Infection and Clinical Mastitis. // Infect. Immun.-2003.-V. 71.-№ l.-P. 132-139.

110. Cleary P.P., Larkin A. Hyaluronic Acid Capsule: Strategy for Oxygen Resistance in Group A Streptococci. // J. Bacterid. 1979. - V. 140. - № 3. - P. 1090-1097.

111. Matsubara C., Kajiwara M., Akasaka H., Haze S. Carbon-13 nuclear magnetic resonance studies on the biosynthesis of hyaluronic acid. // Chem. Pharm. Bull. 1991. - V. 39. - P. 24462448.

112. Chong B.F., Nielsen L.K. Aerobic cultivation of Streptococcus zooepidemicus and the role of NADH oxidase. // Biochem. Engineer. J. 2003. - V. 16. - P. 153-162.

113. Cifonelli J.A., Dorfman A. The Biosynthesis of Hyaluronic Acid by Group A Streptococcus V. The Uridine Nucleotides of Group A Streptococcus. // J. Biol. Chem. 1957. - V. 228. -P. 547-557.

114. Sugahara K., Schwartz N.B., Dorfman A. Biosynthesis of Hyaluronic Acid by Streptococcus. // J. Biol. Chem. 1979. - V. 254. - № 14. - P. 6252-6261.

115. Markovitz A., Cifonelli J.A., Dorfman A. The biosynthesis of HA by cell-free extracts of group A Streptococcus. // Biochim. Biophys. Acta. 1958. -V. 28. - P. 453-455.

116. Tlapak-Simmons V.L., Kempner E.S., Baggenstoss B.A., Weigel P.H. The activc streptococcal hyaluronan synthases (HASs) contain a single HAS monomer and multiple cardiolipin molecules. // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 26100-26109.

117. Tlapak-Simmons V.L., Baggenstoss B.A., Clyne Т., Weigel P.H. Purification and lipid dependence of the recombinant hyaluronan synthases from Streptococcus pyogenes and Streptococcus equisimilis. // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - № 7. - P. 4239-4245.

118. Appel A., Horwitz A.L., Dorfman A. Cell-free synthesis of hyaluronic acid in Marfan syndrome. // J. Biol. Chem. 1979. - V. 254. - P. 12199-12203.

119. Philipson L.H., Westley J., Schwartz N.B. Effect of hyaluronidase treatment of intact cells on hyaluronate synthetase activity. // Biochem. 1985. - V. 24. - P. 899-906.

120. Prehm P. Synthesis of hyaluronate in differentiated teratocarcinoma cells: characterization of the synthase. // Biochem. J. 1983. - V. 211. - P. 181 -189.

121. Tlapak-Simmons V.L., Baron C.A., Gotschall R., Haque D., Canfield W.M., Weigel P.H. Hyaluronan Biosynthesis by Class I Streptococcal Hyaluronan Synthases Occurs at the Reducing End.//J. Biol. Chem. 2005. - V. 280.-№ 13.-P. 13012-13018.

122. Heldermon C., DeAngelis P.L., Weigel P.H. Topological Organization of the Hyaluronan Synthase from Streptococcus pyogenes. // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - № 3. - P. 20372046.

123. Kumari K., Weigel P.H. Molecular Cloning, Expression, and Characterization of the Authentic Hyaluronan Synthase from Group С Streptococcus equisimilis. // J. Biol. Chem. 1997. -V. 272. -№51. -P. 32539-32546.

124. Prehm P. Synthesis of hyaluronate in differentiated teratocarcinoma cells. Mechanism of chain growth. // Biochem. J. 1983. - V. 211. - P. 191-198.

125. Asplund Т., Brinck J., Suzuki M., Briskin M.J., Heldin P. Characterization of hyaluronan synthase from a human glioma cell line. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - V. 1380. - P. 377388.

126. Ashbaugh C.D., Wessels M.R. Cloning, identification, and expression of the group A streptococcal guaB gene encoding inosine monophosphate dehydrogenase. // Gene. 1995. - V. 165.-P. 57-60.

127. Crater D.L., van de Rijn I. Hyaluronic acid synthesis operon (has) expression in group A streptococci.//J. Biol. Chem. 1995. - V. 270.-№31.-P. 18452-18458.

128. Dougherty В.A., van de Rijn I. Molecular characterization of hasA from an operon required for hyaluronic acid synthesis in group A streptococci. // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 169-175.

129. Dougherty B. A., van de Rijn I. Molecular characterization of hasB from an operon required for hyaluronic acid synthesis in group A streptococci. Demonstration of UDP-glucose dehydrogenase activity. // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268. - P. 7118-7124.

130. Ashbaugh C.D., Alberti S., Wessels M.R. Molecular analysis of the capsule gene region of group A Streptococcus: the hasAB genes are sufficient for capsule expression. // J. Bactcriol. -1998.-V. 180.-P. 4955-4959.

131. Caparon M.G., Scott J.R. Identification of a gene that regulates expression of M protein, the major virulence determinant of group A streptococci. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. -V. 84.-P. 8677-8681.

132. Robbins J.C., Spanier J.G., Jones S.J., Simpson W.J., Cleary P.P. Streptococcus pyogenes type 12 M protein gene regulation by upstream sequences. // J. Bacteriol. 1987. - V. 169. -№ 12.-P. 5633-5640.

133. Boyle M.D., Hawlitzky J., Raedcr R., Podbielski A. Analysis of the genes encoding two unique type Ha immunoglobulin G-binding proteins expressed by a single group A Streptococcus. // Infect. Immun. 1994. - V. 62,-№2. -P. 1336-1347.

134. Gryllos I., Cywes C., Shearer M.H., Сагу M., Kennedy R.C., Wessels M.R. Regulation of capsule gene expression by group A Streptococcus during pharyngeal colonization and invasive infection. // Mol. Microbiol. 2001. - V. 42. - № 1. - P. 61-68.

135. Gryllos I., Levin J.C., Wessels M.R. The CsrR/CsrS two-component system of group A Streptococcus responds to environmental Mg2+. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V. 100. -№ 7. - P. 4227-4232.

136. Bemish В., van de Rijn I. Characterization of a two-component system in Streptococcus pyogenes which is involved in regulation of hyaluronic acid production. // J. Biol. Chem. 1999. -V. 274.-P. 4786-4793.

137. Dalton T.L., Scott J.R. CovS Inactivates CovR and Is Required for Growth under Conditions of General Stress in Streptococcus pyogenes. // J. Bacteriol. 2004. - V. 186. - № 12. - P. 3928-3937.

138. Zhang J., Hao N., Chen G.-Q. Effect of expressing polyhydroxybutyrate synthesis genes (plibCAB) in Streptococcus zooepidemicus on production of lactic acid and hyaluronic acid. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. - V. 71. - P. 222-227.

139. Meyer K. Hyaluronidases. // The Enzymes. V. 5. / ed. Boyer P.D. - New York: Academic Press, 1971. - P. 307-320.

140. Chain E., Duthie E.S. Identity of hyaluronidase and spreading factor. // Br. J. Expl. Path. 1940. -V. 21. -P. 324-338.

141. DeSalegui M., Pigman W. The existence of an acid-active hyaluronidase in serum. // Arch. Biochem. Biophys. 1967. - V. 120. - P. 60-67.

142. Afify A.M., Stern M., Guntenhoener M., Stern R. Purification and characterization of human serum hyaluronidase. // Arch. Biochem. Biophys. 1993. - V. 305. - P. 434-441.

143. Frost G.I., Csoka Т., Stern R. The hyaluronidases: a chemical, biological and clinical overview. // Trends Glycosci. Glycotech. 1996. - V. 8. - P. 419-434.

144. Hovingh P., Linker A. Hyaluronidase activity in leeches (Hirudinea). // Сотр. Biochem. Physiol. Biochem. Mol. Biol. 1999. - V. 124. - P. 319-326.

145. Yuki H., Fishman W.H. Purification and Characterization of Leech Hyaluronic Acid-endo-p-glucuronidase. // J. Biol. Chem. 1963. - V. 238. -№ 5. - P. 1877-1879.

146. Karlstam В., Vincent J., Johansson В., Bryno C. A simple purification method of squeezed krill for obtaining high levels of hydrolytic enzymes. // Prep. Biochem. 1991. - V. 21. — P. 237-256.

147. Karlstam В., Ljungloef A. Purification and partial characterization of a novel hyaluronic acid-degrading enzyme from Antarctic krill (Euphasia superba). // Polar Biol. 1991. - V. 11. - P. 501-507.

148. Hynes W.L., Walton S.L. Hyaluronidascs of Gram-positive bacteria. // FEMS Microbiol. Lett.-2000. V. 183.-P. 201-207.

149. Byers S.O., Tytell A.A., Logan M.A. The production and some properties of Clostridium perfringens hyaluronidase. // Arch. Biochem. Biophys. 1949. -V. 22. - P. 66-86.

150. Li S., Kelly S.J., Lamani E., Ferraroni M., Jedrzejas, M.J. Structural basis of hyaluronan degradation by Streptococcus pneumoniae hyaluronate lyase. // EMBO J. 2000. - V. 19. - P. 1228-1240.

151. Ohya Т., Kaneko Y. Novel hyaluronidase from Streptomyces. // Biochim. Biophys. Acta.- 1970.-V. 198.-P. 607-609.

152. Tam Y.-C., Chan E.C. Purification and characterization of hyaluronidase from oral Pep-tostreptococcus species. //Infect. Immun. 1985. - V. 47. - P. 508-513.

153. Linker A., Meyer K., Hoffman P. The production of unsaturated uronidcs by bacterial hyaluronidases. // J. Biol. Chem. 1956.-V. 219.-P. 13-25.

154. Hill J. Purification and Properties of Streptococcal Hyaluronate Lyase. // Infect. Immun.- 1976. V. 14. - № 3. - P. 726-735.

155. Kelly S.J., Taylor K.B., Li S., Jedrzejas M.J. Kinetic properties of Streptococcus pneumoniae hyaluronate lyase. // Glycobiology. 2001. - V. 11. - № 4. - P. 297-304.

156. Allen A.G., Lindsay H., Seilly D., Bolitho S., Peters S.E., Maskell D.J. Identification and characterisation of hyaluronate lyase from Streptococcus suis. // Microbial Pathogenesis. 2004. -V. 36.-P. 327-335.

157. Lin В., Hollingshead S.K., Coligan J.E., Egan M.L., Baker J.R., Prichard D.G. Cloning and expression of the gene for group В streptococcal hyaluronate lyase. // J. Biol. Chem. 1994. -V. 269. - P. 30113-30116.

158. Li S., Jedrzejas M.J. Hyaluronan binding and degradation by Streptococcus agalactiae hyaluronate lyase. // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - № 44. - P. 41407-41416.

159. Ponnuraj K., Jedrzejas M.J. Mechanism of hyaluronan binding and degradation: structure of Streptococcus pneumoniae hyaluronate lyase in complex with hyaluronic acid disaccharide at 1.7 A resolution. // J. Mol. Biol. 2000. - V. 299. - P. 885-895.

160. Calvinho L.F., Almeida R.A., Oliver S.P. Potential virulence factors of Streptococcus dysgalactiae associated with bovine mastitis. // Vet. Microbiol. 1998. - V. 61. - P. 93-110.

161. Gunther В., Ozegowski J.H., Kohler W. Occurrence of extracellular hyaluronic acid and hyaluronate lyase in streptococci of groups А, В, C, and G. // Zentralbl. Bakteriol. 1996. - V. 285. - P. 64-73.

162. Homer K.A., Denbow L., Whiley R.A., Beighton D. Chondroitin sulfate depolymerase and hyaluronidase activities of viridans streptococci determined by a sensitive spectrophotometric assay.//J. Clin. Microbiol. 1993. - V. 31.-P. 1648-1651.

163. Schaufuss P., Sting R., Schaeg W., Blobel H. Isolation and characterization of hyaluronidase from Streptococcus uberis. // Zentralbl. Bakteriol. 1989. - V. 271. - P. 46-53.

164. Berry A.M., Paton J.C. Additive attenuation of virulence of Streptococcus pneumoniae by mutation of the genes encoding pneumolysin and other putative pneumococcal virulence proteins. // Infect. Immun. 2000. - V. 68. - P. 133-140.

165. Granlund M., Oberg L., Scum M., Norgren M. Identification of a novel insertion element, IS 1548, in group В streptococci, predominantly in strains causing endocarditis. // J. Infect. Dis. 1998. - V. 177. - P. 967-976.

166. Homer K., Shain H., Beighton D. The role of hyaluronidase in growth of Streptococcus intermedin on hyaluronate. // Adv. Exp. Med. Biol. 1997. - V. 418. - P. 681-683.

167. Seddon S.V., Hemingway I., Borriello S.P. Hydrolytic enzyme production by Clostridium difficile and its relationship to toxin production and virulence in the hamster model. // J. Med. Microbiol. 1990. - V. 31. - P. 169-174.

168. Linker A., Hoffman P., Meyer K., Sampson P., Korn E.D. The formation of unsaturated disaccharides from mucopolysaccharides and their cleavage to alpha-keto acid by bacterial enzyme. // J. Biol. Chem. 1960. - V. 235. - P. 3061-3065.

169. A. c. № 219752 СССР. Способ получения гиалуроновой кислоты. / Бычков С.М., Колесников М.Ф. (СССР). 1968. - Бюл. № 19. - С. 90.

170. Патент № 2017751 РФ. Способ получения гиалуроновой кислоты. / Ряшенцев В.Ю., Никольский С.Ф., Вайнермен Е.С. и др. (РФ). 1994. - Бюл. № 15. - С. 75-76.

171. Shimada Е., Matsumura G.J. Molecular Weight of Hyaluronic Acid from Rabbit Skin. // J. Biochem.- 1977.-V. 81.-№ l.-P. 79-91.

172. Patent № 4713448 USA. Chemically modified hyaluronic acid preparation and method of recovery thereof from animal tissues. / Balazs E.A., Leshchiner A., Leshchiner A., Band P. (USA). 1987.

173. Schmut O., Hofmann H. The change of hyaluronic acid of the vitreous humour by oxidation-reduction-systems. Deutsch. //Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. [Deutsch]. 1976.-V. 201.-№2.-P. 169-174.

174. Boas N.F. Isolation of hyaluronic acid from the cock's comb. // J. Biol. Chem. 1949. -V. 181,-№2.-P. 573-575.

175. Swann D.A. Studies on hyaluronic acid. I. The preparation and properties of rooster comb hyaluronic acid. // Biochim. Biophys. Acta. 1968. - V. 156. - № l.-P. 17-30.

176. A. c. № 1616926 СССР Способ получения гиалуроновой кислоты. / Стекольников Л.И., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е. и др. (СССР). 1990. - Бюл. № 48. - С. 85.

177. Patent № 4141973 USA. Isolating modified hyaluronic acid. / Balazs E., Leshchiner A. (USA). 1979.

178. Kim J.H., Yoo S.J., Oh D.K., Kweon Y.G. et al. Selection of a Streptococcus equi mutant and optimization of culture conditions for the production of high molecular weight hyaluronic acid. // Enzyme Microb. Technol. 1996. - V. 19. - P. 440-445.

179. Patent № 6090596 USA. Method and means for the production of hyaluronic acid. / Stangohl S. (USA). 2000.

180. Patent № 6537795 USA. Method and means for the production of hyaluronic acid. / Stangohl S. (USA). 2003.

181. Widner В., Behr R., Von Dollen S., Tang M., Ней Т., Sloma A., Sternberg D., DeAngelis P.L., Weigel P.H., Brown S. Hyaluronic Acid Production in Bacillus subtilis. // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V. 71. - № 7. - P. 3747-3752.

182. Armstrong D.C., Cooney M.J., Johns M.R. Growth and amino acid requirements of hya-luronic-acid-producing Streptococcus zooepidemicus. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - V. 47.-P. 309-312.

183. Van dc Rijn I., Kessler R.E. Growth characteristics of group A streptococci in a new chemically defined medium. // Infect. Immun. 1980. - V. 27. - № 2. - P. 444-448.

184. Holmstrom В., Ricica J. Production of Hyaluronic Acid by a Streptococcal Strain in Batch Culture. // Appl. Microbiol. 1967. - V. 15. - № 6. - P. 1409-1413.

185. Patent № 4897349 USA. Biosynthesis of hyaluronic acid. / Swann D.A., Sullivan B.P., Jamieson G., Richardson K.R., Singh T. (USA). 1990.

186. Patent № 5496726 USA. Streptococcus zooepidemicus medium and process for preparing hyaluronic acid. / Park M.G., Jang J.D., Kang W.K. (KR). 1996.

187. Patent № 5071751 USA. Proccss for preparing hyaluronic acid. / Morita H., Fujii M. (JP).- 1991.

188. Patent № 5023175 USA. Novel production process of hyaluronic acid and bacterium strain therefor. / Hosoya H., Kimura M., Endo H., Hiraki Y., Yamamoto S., Yoshikawa S., Omine H., Miyazaki K. (JP). 1991.

189. Patent № 5316926 USA. Method for the microbiological production of non-antigenic hyaluronic acid. / Brown K.K., Ruiz L.L.C., van de Rijn I., Greene N.D., Trump S.L., Wilson C.D., BryantS.A. (USA).- 1994.

190. Mausolf A., Jungmann J., Robenek H., Prehm P. Shedding of hyaluronate synthase from streptococci. // Biochem. J. 1990. - V. 267. - P. 191-196.

191. Leonard B.A., Woischnik M., Podbielski A. Production of stabilized virulence factor-negative variants by group A streptococci during stationary phase. // Infect. Immun. 1998. - V. 66.-P. 3841-3847.

192. Patent № 5411874 USA. Production of hyaluronic acid. / Ellwood D.C., Evans C.G.T., Dunn G.M., Mclnnes N. et al. (GB). 1995.

193. Patent № 5563051 USA. Production of hyaluronic acid. / Ellwood D.C., Evans C.G.T., Dunn G.M., Mclnnes N. et al. (GB). 1996.

194. Строителев В., Федорищев И. Гиалуроновая кислота в медицинских и косметических препаратах. // Косметика и медицина. 2000. - № 3. - С. 21-31.

195. Butler J.E., Hammond Т.Н., Gray S.D. Gender-related differences of hyaluronic acid distribution in the human vocal fold. // Laryngoscope. 2001. - V. 111. - P. 907-911.

196. Chan R.W., Gray S.D., Titze I.R. The importance of hyaluronic acid in vocal fold biomechanics. // Otolaryngol. Head Neck Surg. 2001. - V. 124. - P. 607-614.

197. Ward P.D., Thibeault S.L., Gray S.D. Hyaluronic acid: its role in voice. // J. Voice. -2002.-V. 16.-P. 303-309.

198. Yun Y.H., Goetz D.J., Yellen P., Chen W. Hyaluronan microspheres for sustained gene delivery and sitespecific targeting. // Biomatcrials. 2004. - V. 25. - P. 147-157.

199. Shu X.Z., Liu Y., Palumbol F.S., Luo Y., Prestwich G.D. In situ crosslinkable hyaluronan hydrogels for tissue engineering. // Biomaterials. 2004. - V. 25. - P. 1339-1348.

200. Turner N.J., Kielty C.M., Walker M.G., Canfield A.E. A novel hyaluronan-based bioma-tcrial (Hyaff-11®) as a scaffold for endothelial cells in tissue engineered vascular grafts. // Biomaterials. 2004. - V. 25. - P. 5955-5964.

201. Vasiliu S., Popa M., Rinaudo M. Polyelectrolyte capsules made of two biocompatible natural polymers. // Eur. Polym. J. 2005. - V. 41. - P. 923-932.

202. Esposito E., Mencgatti E., Cortcsi R. Hyaluronanbased microspheres as tools for drug delivery: a comparative study. // Int. J. Pharm. 2005. - V. 288. - P. 35-49.

203. Edmonds M.E., Foster A.V. Diabetic foot ulcers. // Brit. Med. J. 2006. - V. 332. - P. 407-410.

204. Amarnath L.P., Srinivas A., Ramamurthi A. In vitro hemocompatibility testing of UV-modified hyaluronan hydrogels. // Biomatcrials. 2006. - V. 27. - P. 1416-1424.

205. Abatangelo G., Martinelli M., Vecchia P. Healing of hyaluronic acid-enriched wounds: histological observations.//!. Surg. Res. 1983. - V. 35,-№5.-P. 410-416.

206. Balazs E.A., Denlinger J.L. Viscosupplementation: a new concept in the treatment of osteoarthritis. // J. Rheumatol. Suppl. 1993. - V. 39. - P. 3-9.

207. Goa K.L., Benfield P. Hyaluronic acid. A review of its pharmacology and use as a surgical aid in ophtalmology and its therapeutic potential in joint disease and wound healing. // Drugs. -1994. V. 47. - № 3. - P. 536-566.

208. Gressner A.M., Bachem M.G. Molecular mechanisms of liver fibrogenesis: A homage to the role of activated fat-storing cells. // Digestion. 1995. - V. 56. - P. 335-346.

209. Костина Г., Радаева И. Использование гиалуроновой кислоты в медицине и косметологии. // Косметика и медицина. 1999. - № 2-3. - С. 53-57.

210. Толстых П.И., Стекольников Л.И., Рыльцев В.В. и др. Лекарственные препараты животного происхождения для наружного применения. // Хим.-фарм. журн. 1991. - Т. 25. — № 4. - С. 83-87.

211. ShimadaM., Uchida Т. et al. Immobilization of hyaluronic acid on egg sholl membrane. // J. Soc. Fiber. Sci. Technol. 1988. - V. 44. - № 2. - P. 108-109.

212. Patent № 5356883 USA. Water-insoluble derivatives of hyaluronic acid and their methods of preparation and use. / Kuo J.-W., Swann D.A., Prestwich G.D. (USA). 1992.

213. Патент № 9404238 РФ. Композиция для лечения ран и фиброзных заболеваний, способ получения композиции, способ лечения ран и фиброзных заболеваний. / Вилльям М., Ферпосон Д., Шах М. (GB). 1992.

214. Patent № 4711780 USA. Composition and process for promoting epithelial regeneration. / Fahim M.S. (USA). 1986.

215. Костина Г.А., Радаева И.Ф, Колосов В.Н. Использование гиалуроновой кислоты в ожоговой терапии. // Тезисы докладов международного симпозиума "Новые методы лечения ожогов". Тула, 1996. - С. 22-23.

216. Hadhazy G., Horvath Е. Simultaneous inhibitory action on virus multiplication of interferon and some natural mucopolysaccharides (heparin, hyaluronic acid). // Acta Microbiol. Acad. Scient. Hung. 1966,-V. 13.-№3.-P. 193-196.

217. Patent № 5990096 USA. Formulations containing hyaluronic acid. / Asculai S.S., Hochman D., Purschke D., Harper D.W., Klein E.S., Falk R.E. (CA). 1999.

218. Patent № 5985850 USA. Compositions comprising hyaluronic acid and drugs. / Falk R.E., Asculai S.S. (CA). 1999.

219. Prestwich G.D., Vercruysse K.P. Therapeutic application of hyaluronic acid and hyaluronan derivaties. // PSTT. 1998. - V. 1. - № 1. - P. 42-43.

220. Balazs E.A. Sodium hyaluronate and viscosurgery. // Healon (sodium hyaluronate). A guide to its use in ophthalmic surgery. / eds. Miller D., Stegmann R. New York: Wiley, 1983. - P. 5-28.

221. Fukuda K., Dan H., Takayama M., Kumano F., Saitoh M., Tanaka S. Hyaluronic acid increases proteoglycan synthesis in bovine articular cartilage in the presence of interleukin-1. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996. - V. 277. - P. 1672-1675.

222. Asari A., Miyauchi S., Matsuzaka S., Ito Т., Kominami E., Uchiyama Y. Molecular weight-dependent effects of hyaluronate on the arthritic synovium. // Arch. Histol. Cytol. 1998. -V. 61.-P. 125-135.

223. Gotoh S., Onaya J., Abe M., Miyazaki K., Hamai A., Horie K., Tokuyasu K. Effects of the molecular weight of hyaluronic acid and its action mechanisms on experimental joint pain in rats. // Ann. Rheum. Dis. 1993. - V. 52. - P. 817-822.

224. Iwata H. Pharmacologic and clinical aspects of intraarticular injection of hyaluronate. // Clin. Orthop. 1993. - V. 289. - P. 285-291.

225. Kikuchi Т., Yamada H., Shinmei M. Effect of high molecular weight hyaluronan on cartilage degeneration in a rabbit model of osteoarthritis. // Osteoarthritis Cartilage. 1996. - V. 4. -P. 99-110.

226. Patent № 5194253 USA. Aqueous gel, usable in cosmetics, based on hyaluronic acid and deoxyribonucleic acid, and a preparation process. / Garrido R. (FR). 1993.

227. Olenius M. The first clinical study using a new biodegradable implants for the treatment of lips, wrinkles, and folds. // Aesthetic Plast. Surg. 1998. - V. 22. - № 2. - P. 97-101.

228. Duranti F., Salti G., Bovani B. et al. Injectable hyaluronic acid gel for soft tissue augmentation. The clinical study. // Dermatol. Surg. 1998. - V. 24. - № 12. - P. 1317-1325.

229. Zacchi V., Soranzo С., Cortivo R. et al. In vivo engineering of human skin-like tissue. // J. Biomed. Mater. Res. 1998. - V. 40. - № 2. - P. 187-194.

230. Pianigiani E., Andreassi A., Taddeuci P. et al. A new model for studing differentiation and growth of epidermal cultures on hyaluronan-based carrier. // Biomaterials. 1999. - V. 20. - № 18.-P. 1689-1694.

231. Choi Y.S., Hong S.R., Lee Y.M. et al. Studies on gelatin-containing artificial skin: II. Preparation and characterization of cross-linked gelatin-hyaluronate sponge. // J. Biomed. Mater. Res. 1999,-V. 48,-№5.-P. 631-639.

232. Kielty C.M., Whittaker S.P., Grant M.E., Shuttleworth C.A. Type VI collagen microfibrils: evidence for structural association with hyaluronan. // J. Cell Biol. 1992. - V. 118. - № 4. -P. 979-990.

233. Bernard E., Horncbeck W., Robert L. Effect of hyaluronan on the elastase-type activity of human fibroblasts. // Cell. Biol. Int. 1994. -V. 18. -№ 10. - P. 967-971.

234. Shepard S., Becker H., Hartmann J.X. Using hyaluronic acid to create a fetal-like environment in vitro. // Ann. Plast. Surg. 1996. - V. 36. - № 1. - P. 65-69.

235. Grcco R.M., Icono J.A., Ehrlich H.P. Hyaluronic acid stimulates human fibroblast proliferation via collagen matrix. // J. Cell. Physiol. 1998. - V. 177. - P. 465-473.

236. Jia C., Chen В., Arnold F. The effect of ultrapure hyaluronic acid with different molecular weights on the healing of porcinc full thickness skin wound. Chinese. // Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke ZaZhi. [Chinese]. 1998. - V. 12,-№4.-P. 197-200.

237. Patent № 6147059 USA. Formulations containing hyaluronic acid. / Falk R.E., Asculai S.S., Klein E.S., Harper D.W., Hochman D., Purschke D. (CA). 2000.

238. Заявка Франции № 2642971. "Косметический препарат и способ его получения". Francais.- 1989.

239. Заявка Японии № 5-38726. "Косметический состав для питания, роста волос и профилактики облысения". Japanese. 1986.

240. Кушко И.В., Малофеева Т.П., Галачьянц О.П. О ферментативной однородности диагностического препарата стрептококковой гиалуронидазы. // Журн. МЭИ. 1980. - № 11. -С. 116-117.

241. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, JI.M. Захарчук и др.; под ред. А.И. Нетрусова. М.: Изд. центр "Академия", 2005. - 608 с.

242. Dische Z. A new specific color reaction of hexuronic acids. // J. Biol. Chem. 1947. -V. 167.-P. 189-198.

243. Bitter Т., Muir H.M. A modified uronic acid carbazole reaction. // Anal. Biochem. -1962,-V. 4.-P. 330-334.

244. Reissig J.L., Strominger J.L., Leloir L.F. A modified colorimetric method for the estimation of N-acetylamino sugars. // J. Biol. Chem. 1955. - V. 217. - P. 959-966.

245. Методы общей бактериологии. Том 2; под ред. Ф. Герхардта и др. М.: Мир, 1984. -472 с.

246. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991.-554 с.

247. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи JI. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир, 1982. - 448 с.

248. Barker S.B., Summerson W.H. The colorimetric determination of lactic acid in biological material. // J. Biol. Chem. 1941. - V. 138. - P. 535-554.

249. Шакир И.В., Красноштанова А.А, Парфенова ЕВ. Лабораторный практикум по общей биотехнологии. М.: Из-во РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2001. - С. 68.

250. Рабек Я. Экспериментальные методы в химии полимеров: в 2-х частях. М.: Мир, 1983.-384 с.

251. Венчиков А.И., Венчиков В.А. Основные приемы статистической обработки результатов наблюдений в области физиологии. М.: Медицина, 1974. - 160 с.

252. Melancon D., Grenier D. Production and Properties of Bacteriocin-Like Inhibitory Substances from the Swine Pathogen Streptococcus suis Serotype 2. // Appl. Environ. Microbiol. -2003. V. 69. - № 8. - P. 4482-4488.

253. Straus D.C., Brown J.G., Garner C.W. High-density and Low-density Capsule Production by Streptococcus zooepidemicus. // Curr. Microbiol. 1987. - V. 16. - № 1. - P. 1-8.

254. Lowther D.A., Rogers H.J. The Role of Glutamine in the Biosynthesis of Hyaluronate by Streptococcal Suspensions. // Biochem. J. 1956. - V. 62. - P. 304-314.

255. Harrington D.J., Sutcliffe I.C., Chanter N. The molecular basis of Streptococcus equi infection and desease. // Microbes Infect. 2002. - V. 4. - № 4. - P. 501-510.

256. Каленов C.B. Культивирование дрожжей и галобактерий в условиях контролируемого окислительного стресса.: Дис. канд. техн. наук. -М., 2007. 195 с.

257. Gohel V., Chaudhary Т., Vyas P., Chhatpar H.S. Statistical screenings of medium components for the production of chitinasc by the marine isolate Pantoea dispersa. // Biochem. Engin. J. -2006. V. 28.-P. 50-56.

258. Plackett R.L., Burman J.P. The design of optimum multifactorial experiments. // Bio-metrika. 1946. - V. 37. - P. 305-325.

259. Lamy M.-C., Zouine M., Fert J., Vergassola M. et al. CovS/CovR of group В streptococcus: a two-component global regulatory system involved in virulence. // Mol. Microbiol. 2004. -V. 54,-№5.-P. 1250-1268.

260. Reinhart R.A. Magnesium metabolism. A review with special reference to the relationship between intracellular content and serum levels. // Arch. Intern. Med. 1988. - V. 148. - № 11. -P. 2415-2420.

261. Carr F.J., Chill D., Maida N. The Lactic Acid Bacteria: A Literature Survey. // Critical Rev. Microbiol. 2002. - V. 28. - № 4. - P. 281-370.

262. Sakamoto M., Komagata K. Aerobic growth of and activities of NADH oxidase and NADH peroxidase in lactic acid bacteria. // J. Ferment. Bioeng. 1996. - V. 82. - P. 210-216.

263. Gibson C.M., Caparon M.G. Insertional inactivation of Streptococcus pyogenes sod suggests that prtF is regulated in response to a superoxide signal. // J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - № 3.-P. 4688-4695.

264. Higuchi M. The effect of oxygen on the growth and mannitol fermentation of Streptococcus mutans.//J. Gen. Microbiol. 1984.-V. 130.-P. 1819-1826.

265. Uchiyama H., Dobashi Y., Ohkouchi K., Nagasawa K. Chemical change involved in the oxidative reductive depolymerization of hyaluronic acid. // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. - № 14.-P. 7753-7759.

266. Balogh G.T., Illes J., Szekely Z., Forrai E., Gere A. Effect of different metal ions on the oxidative damage and antioxidant capacity of hyaluronic acid. // Arch. Biochem. Biophys. 2003. -V. 410.-№1.-P. 76-82.

267. Laurent T.C., Ryan M., Pietruszkiewicz A. Fractionation of hyaluronic acid. The polydispersity of hyaluronic acid from the bovine vitreous body. // Biochem. Biophys. Acta. -1960.-V. 42.-P. 476-485.

268. Patent № 4780414 USA. Method of producing high molecular weight sodium hyallro-nate by fermentation of streptococcus. / Nimrod A., Greenman В., Kanner D., Landsberg M., Beck Y. (USA).- 1988.

269. Lind J., Merenyi G., Nilvebrant N.O. Hydroxyl Radical Induced Viscosity Loss in Cellulose Fibres.//J. Wood Chem. Technol. 1997. - V. 17.-№1&2.-P. 111-117.

270. Seller P.C., Dowson D„ Wright. V. The rheology of synovial fluid. // Rheol. Acta. -1971.-V. 10.-P. 2-7.

271. Takahashi Т., Tominaga K., et al. A decrease in the molecular weight of hyaluronic acid in synovial fluid from patients with temporomandibular disorders. // J. Oral Pathol. Med. 2004. -V. 33.-P. 224-229.

272. Schurz J. Rheology of Synovial Fluids and Substitute Polymers. // J. Macromol. Sci. -Pure Appl. Chem., Part A. 1996. - V. 33,-№9.-P. 1249-1262.

273. Creuzet C., Kadi S., Rinaudo M., Auzely-Velty R. New associative systems based on alkylated hyaluronic acid. Synthesis and aqueous solution properties. // Polymer. 2006. - V. 47. - P. 2706-2713.

274. Fouissac E., Milas M., Rinaudo M. Shear-rate, concentration, molecular weight, and temperature viscosity dependences of hyaluronate, a wormlike polyelectrolyte. // Macromol. -1993.-V. 26.-P. 6945-6951.

275. Синицын А.П., Гусаков A.B., Черноглазое B.M. Биоконверсия лигнино-целлюлозных материалов. М.: Из-во МГУ, 1995. - С. 146-147.

276. Yamagata Т., Saito H., Habuchi О., Suzuki S. Purification and Properties of Bacterial Chondroitinases and Chondrosulfatases. // J. Biol. Chem. 1968. - V. 243. - P. 1523-1535.

277. Варфоломеев С.Д., Зайцев C.B. Кинетические методы в биохимических исследованиях. М.: Из-во Моск. Ун-та, 1982.- 345 с.

Информация о работе

Белодед, Андрей Васильевич
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.23

Диссертация

Микробиологический синтез и деградация гиалуроновой кислоты бактериями р. Streptococcus - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы