Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологические основы регулирования численности фитопатогенных микроорганизмов в ризосфере сахарной свеклы и картофеля

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологические основы регулирования численности фитопатогенных микроорганизмов в ризосфере сахарной свеклы и картофеля"

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ - АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ

РГБ ОД

1 3 МАП На правах рукописи

КУЛДЫБАЕВ МЭЛС МУХАТАЕВИЧ

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РЕГУЛИРОВАНИЯ ЧИСЛЕННОСТИ ФйТОПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В РИЗОСФЕРЕ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ И КАРТОФЕЛЯ

03.00.07 - Микробиология 06.01.11 - Защита растений

от вредителей и болезней

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Алматы - 1996

Работа выполнена в Институте микробиологии и вирусологии МН-АН РК и Казахском сельскохозяйственном институте.

Научный консультант: Академик, доктор биологических наук,профессор К.А. Тулемисова

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Доктор биологических наук Доктор биологических наук

М.Г. Саубенова С.А. Абиев А.0. Сагитов

Ведущая организация: ■ Московская сельскохозяйственная

сов на заседании специализированного совета Д 53.24.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте микробиологии и вирусологии МН-АН РК по адресу: 480100, Алматы, ул.Богенбай-батыра, 103.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии МН-АН. РК.

академия им. К.А.Тимирязева Защита диссертации состоится

" Д1Д/ 1996г.

Автореферат разослан

И.О. ученого с екретаря специализированного совета, доктор биологических наук

С.А. Абдрашитова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Важнейшей составной частью любой успешной программы получения устойчивых урожаев сельскохозяйственных культур является разработка действенных средств защиты растений.

Использование пестицидов и химических методов контроля совершило революцию в сельском хозяйстве. Химические средства защиты привлекли внимание дешевизной, разнообразием препаратов, а самое главное, высокой эффективностью. Токсичность некоторых пестицидов не вызывала особого беспокойства, и только чрезмерное насыщение среды пестицидами остро поставило вопрос об ограничении их использования и необходимости поиска альтернативных средств защиты растений. Так возникло новое направление - разработка микробиологических способов защиты растений от фитопатогенов.

Идея использования микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности в целях регулирования численности фитопато-генных форм привлекла внимание многих исследователей. Однако эти исследования в большинстве случаев носили локальный, бессистемный характер, проводились без учета конкретных экологических особенностей определенного региона. В условиях юго-востока Казахстана распространенность микромицетов, а также систематика экомикробиоценоза изучены слабо. Более того, в практических условиях диагностирование болезней растений осуществляется, как правило, на основе визуальной оценки без выделения и идентификации патогенов. Все это привело к тому, что ассортимент микробиологических средств защиты оказался ограниченным.

В связи с этим поиски новых продуцентов антибиотиков и микробов-антагонистов против патогенных микроорганизмов приобретают особую актуальность.

Сообщество микроорганизмов, населяющих почву, представляет сложную биологическую систему со специфическими взаимоотношениями и требованиями к условиям существования. Регулирование деятельности этой системы, с учетом применения биологических и химических средств защиты растений, необходимо для проведения биологической индикации, повышения эффективности процессов самоочищения почвы от патогенов и прогноза характера взаимоотношений между растениями и фитопатогенами.

В последние годы, как один из способов борьбы с болезнями сельскохозяйственных культур, широко используются биотехнологические методы оздоровления растений и получение свободного от фитопатогенов посадочного материала. Однако выращивание такого клонового материала приводит к вторичному заражению и, как следствие, к массовой гибели и снижению качества урожая. В этой связи становится актуальным изучение и разработка интегрированных мер защиты оздоровленных растений на основе использования микробиологических препаратов.

Эти принципы и легли в основу настоящей работы, являющейся итогом более чем двадцатилетних исследований автора.

Цель и задачи. Целью исследований было выявление наиболее вредоносных фитопатогенных микромицетов-возбудителей заболеваний основных сельскохозяйственных культур (сахарная свекла, картофель и огурцы) на юго-востоке Казахстана, создание новых микробиологических средств защиты этих культур от фитопатогенов и совершенствование методов их использования.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- дать характеристику фитосанитарной обстановки опытных полей, определив видовой состав фитопатогенных микромицетов;

- выделить новые культуры стрептомицетов, продуцентов антибиотиков, активных в отношении фитопатогенных микромицетов, разработать способы их получения и применения;

- выявить закономерности изменения численности патогенов и группового состава микроорганизмов в ризосфере картофеля, сахарной свеклы и огурцов в результате воздействия микробных препаратов и при различных приемах возделывания;

- определить возможность совместного применения биологических и химических препаратов для подавления развития фитопатогенных микромицетов;

- разработать приемлемые способы получения биопрепарата триходермина в условиях мелких и крупных хозяйств;

- повысить устойчивость оздоровленных клонов картофеля в полевых условиях применением микробиологических методов.

Научная новизна. Определены наиболее широко распространенные в условиях юго-востока Казахстана фитопатогенные мик-

ромицеты картофеля, сахарной свеклы и огурцов. Выявлены закономерности изменения численности микроорганизмов (токсино-образователей. антагонистов и стимуляторов) в ризосфере и прикорневой зоне растений в зависимости от стадии роста, развития и агротехники возделывания.

Выделен новый продуцент антибиотика Streptomyces roseo-flavus Arai А-23/791 (A.c. N499294), в результате селекции которого получен высокоактивный вариант (А.с.N744033). Показана возможность изменения микробного фона при использовании антибиотика А-23/791 и микробного препарата - триходермина.

Установлена перспективность комплексного использования антибиотиков, микробных препаратов и минимального количества химических средств защиты (А-23/791, 1618, Т. lignorum штамм 889, ТМТД).

Определена эффективность микробиологических средств защиты растений по снижению числа фитопатогенных микромицетов и повышению урожайности. Предложены микробиологические способы предотвращения потерь во время хранения картофеля.

Впервые предложен способ усиления устойчивости к фито-патогенным микроорганизмам оздоровленных клонов картофеля, полученных методом биотехнологии.

Практическая ценность. Предложен антибиотик против фи-толатогенов огурцов, картофеля и сахарной свеклы. Впервые разработана эффективная схема сочетанного использования триходермина, антибиотиков и химических препаратов, предоотвра-щающая заболеваемость и повышающая продуктивность и качество картофеля. Предложен новый способ производства препарата триходермина применительно к местным условиям. Модифицирован метод культивирования апикальных меристем двух сортов картофеля. Получен оздоровленный посадочный материал в культуре in vitro. Использование микробных препаратов позволило поднять показатели приживаемости оздоровленных растений картофеля в открытом грунте до 95%.

На защиту выносятся следующие положения:

- видпкт- разнообразии фитмпатпгишых микромицетов картофеля, сахарной свеклы и пгурцон в условиях юго-востока Казахстана; -

- новый штамм Streptomyces roseoflavus Aral А-23/791,

высокопродуктивный вариант 4-76 и его метаболиты, эффективно регулирующие численность и состав почвенных фитопатогенных микромицетов;

- усовершенствованный метод получения триходермина в хозяйственных условиях;

- интегрированный подход в борьбе с фитопатогенными микромицетами с учетом агротехнических приемов;

- использование микробиологических препаратов в целях повышения устойчивости оздоровленного клонового посадочного материала картофеля к фитопатогенным агентам в полевых условиях.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены в виде научных докладов и стендовых сообщений на Всесоюзных конференциях "Микробиологические методы защиты растений" (Кишинев,1976), "Проблемы изыскания и биотехнология новых антибиотиков" (Москва, 1982), на VII Республиканской конференции по споровым растениям (Алма-Ата,1984), VII Всесоюзном съезде микробиологов (Алма-Ата,1987), II съезде физиологов растений (Минск, 1990), Республиканском съезде ботаников (Алма-Ата,1990), Всесоюзной конференции биотехнологов (Москва,1991), II Международной конференции сельскохозяйственных университетов Турции и Казахстана "Агроэкология и высшее образование". Международном симпозиуме Американо-Российских университетов "Образование - XXI век" (Москва, 1993), Международной конференции по биотехнологии (Степногорск, 1995), научно-производственных конференциях Казахского сельскохозяйственного института в 1982-1994 гг.

Публикации. Результаты исследований опубликованы в 2-х монографиях и 53 научных статьях.

Структура и объем диссертационной работы. Работа изложена на 348 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 4 глав, содержащих результаты и обсуждение экспериментальной работы, заключения, выводов, списка цитированной литературы (709 источников) и приложения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение и изучение патогенных микромицетов и определение их видовой принадлежности проводили по методике В.И.Билай (1977), Н.М.Пидопличко (1977,1978). Для анализа использовали пробы, содержащие в среднем по 10-20 больных растений. Отобранные растения подвергали поверхностной дезинфекции и разделяли на фрагменты (1 см). Исходный материал инкубировали на чашках Петри с кислым картофельным агаром (рН 4-4, 5) в течение 4-5 суток и использовали для выделения, учета микромицетов и полученйя их чистых культур.

Учет поражениости растений картофеля фитопатогенными ' микромицетами проводили методом полевой апробации по К.В.Попковой и др.(1986).

Для выделения микромицетов почвенные образцы отбирались стерильным буром в пахотном слое (0-25 см) и ризосфере картофеля и сахарной свеклы три раза за вегетацию в основные фазы развития растений.

Материалом исследования для выделения стрептомице-тов-антагонистов служили почвенные образцы, отобранные в течение весны, лета и осени на глубине пахотного слоя (3-27 см). Посев почвы (разведение 1:1000) проводился одновременно на четырех плотных питательных средах с различными источниками азота и углерода.

Антагонистические свойства стрептомицетов изучали по отношению к 53 тест-микроорганизмам, являющихся в основном возбудителями болезней культурных растений. Антагонистическую активность выделенных стрептомицетов определяли методом агаровых блоков или штриха, антибиотическую активность - методом диффузии в агаре и методом серийных разведений.

При определении систематического положения выделенных стрептомицетов придерживались классификации Г. Ф. Гаузе и др. (1983), согласно которой стрептомицеты по цвету воздушного и субстратного мицелия разделяются на 15 серий. Эти серии объединены в четыре секции, различающиеся по цвету воздушного мицелия.

Культурально-морфологические свойства выделенных стрептомицетов изучали на питательных средах, рекомендованных для

этой цели Н.А. Красильниковым (1970), Г. Ф. Гаузе (1980), Т.П.Преображенской и др.(1987). Морфология спор изучалась на Klatsch - препаратах, окрашенных метиленовой синью (1:1000), а также в электронном микроскопе при увеличении в 12000 раз. В сравнительных исследованиях использовался метод Оками и Сузуки (Прокофьева-Бельговская(1963).

Чувствительность тест-микромицетов к антибиотикам, образуемым стрептомицетами определяли общепринятым методом бумажных дисков. Микроскопические наблюдения за развитием культуры на агаризованных средах проводили методом "желобков" (Соловьева и др.,1960).

Для выявления сходства и отличий метаболитов изучаемых культур стрептомицетов использовали метод восходящей хроматографии ацетоновых экстрактов мицелия (БлиновДохлов,1970).

Для определения оптимальных условий биосинтеза антибиотических веществ использовали семь питательных сред различного состава. Оптимизацию проводили по методу ортогональных латинских прямоугольников (Бирюков, 1968). Критериями оптимизации служили: вес биомассы (г/л), величина антибиотической активности (ед/мл, мкг/мл).

Глубинную ферментацию антибиотиков проводили на круговой качалке (180 об/мин) в колбах емкостью 750 мл. Для экстрагирования антибиотиков использовали следующие растворители: ацетон, н-бутанол, этанол, диметилформамид и изобутанол.

Фунгистатические и фунгицидные свойства антибиотиков изучали методом двух и трехкратных разведений. Для изучения устойчивости фитопатогенных микромицегов применялся метод пассажей на жидкой среде Чапека с добавлением антибиотика в возрастающей концентрации при каждом пассаже. Учет проводился визуально через 48-72 ч. по степени роста на поверхности среды.

Степень всасываемости антибиотиков семенами определяли по методу Э.Г.Африкян и др.(1961). Влияние антибиотиков на всхожесть и рост проростков огурцов и сахарной свеклы изучали путем проращивания предварительно замоченных семян в чашках Петри на фильтровальной бумаге. Энергия прорастания учитывалась на третий день, всхожесть - на пятый, а рост проростков и корешков - на десятый день от начала опыта (Туманян, 1961).

Анализ антибиотических комплексов А-23/791 проводили методами бумажной и тонкослойной хроматографии.

Микроскопическое исследование микробных культур проводили прижизненно или в фиксированных (фиксация жидкостью Карнуа) и окрашенных метиленовой синью (1:1000) препаратах на микроскопе МБИ-6, МБИ-15 при увеличениях 400 и 900 раз. Для выявления особенностей жизненного цикла клеток использовали метод агаровых мазков (Дмитриева, Петрухина,1973).

Стимулирующие свойства антибиотиков изучали на семенах огурцов и кукурузы. Испытывали спиртовые растворы препаратов антибиотика (концентрация 1 мг/мл ) в разведениях 1:10 тыс. и 1:100 тыс. при продолжительности воздействия на семена в течение 12 часов. Для определения стиму,пирующего эффекта антибиотика на растения учитывали длину стебля и корня, а также их воздушно-сухой вес. В качестве контроля служили семена, которые замачивали в водопроводной воде.

Для изучения влияния антибиотика А-23/791 на клетки микроорганизмов были взяты два штамма F.oxysporum и F.solani различной термотолерантности, а также бактериальные культуры, широко применяемые в качестве сухих бактериальных заквасок (ПКБ, AMC, ПМБ) для силосования кормов в Казахстане и других республиках СНГ: Propionibacterium Shermanii (ПКБ), Str. lactis diastaticus (AMC) и Propionibacterium pentoaceti-cum (ПК).

Полевые опыты по испытанию антибиотиков розеофунгина, А-23/791, 1618 и препарата триходермина проводили в условиях стационара КазНИИЗ им. Вильямса ВО ВАСХНИЛ, колхоза "Трудовик" Жамбылской области и совхозах "Кугалинский"."Калининский" Гвардейского района Талдыкорганской области. При фенологических наблюдениях отмечали фазы роста растений, густоту всходов и динамику их развития. Влияние биопрепаратов на прибавку урожая определяли гравиметрическим методом в контрольных и опытных вариантах.

Антагонистическую и гиперпаразитическую активность мик-ромицетов триходермы определяли методами встречных колоний (Сейкетов, 1951) и смежных полос (Рудаков, 1971), степень угнетения тест-организмов штаммами микромицета триходермы учитывали по 4-бальной шкале.

- 10 -

Для выявления в составе почвенных сапрофитов различных групп микроорганизмов (аммонифицирующие, нитрифицирующие, денитрифицирующие, целлюлозоразлагающие) и определения их антагонистических, стимулирующих и токсинообразуювдх свойств использовали селективные методы, основанные на принципе выделения каждой физиологической группы микроорганизмов на специальных элективных средах (Ежов,1981,Йожеф Сеги,1983).

Определение чувствительности почвенных микроорганизмов к пестицидам проводили методами диффузии в агаре и почвенных дисков. В качестве тестового микроорганизма использовали штамм Аго^Ьа^ег сйгоососсит (Йожеф Сеги, 1983).

РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ФИТОПАТОГЕШЫХ МИКРОМИЦЕТОВ В ОКУЛЬТУРЕННЫХ ПОЧВАХ ЮГО-ВОСТОКА КАЗАХСТАНА

На юго-востоке Казахстана картофелю и сахарной свекле отводится заметное место среди других возделываемых культур. В условиях интенсификации и специализации сельскохозяйственного производства необходимо знание характера развития фитог ~ патогенных микромицетов, поражающих растения в период веге-' тации и хранения. С этой целью обследованию подвергались поля специализированного по производству картофеля совхоза "Кугалинский" Талдыкорганской области и посевы сахарной свеклы колхоза "Трудовик" Курдайского района Жамбылской области.

При возделывании сельскохозяйственных культур большое значение для получения хороших урожаев имеет правильное их размещение в севообороте. В связи с этим было важно провести

■ учет распространенности фитопатогенных микромицетов на фоне

■ различных типов севооборотов и предшественников с учетом сроков и фаз вегетации.

Результаты обследования посадок картофеля сортов Мур. манский и Гатчинский (табл.1), показали,что при четырехпольном севообороте, когда картофель высевался после многолетних трав, больных растений было несколько меньше, чем при пятипольном севообороте, когда картофель высевался после картофеля. Отмечены также и сортовые отличия - сорт Мурманский больше поражается патогенными микромицетами, чем Гатчинский.

- И -

Таблица 1

Распространенность фитопатогенных микромицетов картофеля сортов Гатчинский и Мурманский

Фазы развития ¡Число ! Кол-во ! Кол-во ¡распростра-

растений ¡проб ¡обследован. ! больных ненность, %

1 ¡растении, шт!растений. шт!

Гатчинский

Полные всходы 20 300 о/о 0/0

Цветение 20 300 46/48 15, 3/16

Созревание 20 300 67/70 21,4/26,5

клубней

Мурманский

Полные всходы 20 300 2/2 0/7

Цветение 20 300 57/65 19/21.7

Созревание 20 300 82/97 27,3/32,3

клубней_____

Примечание: числитель - результаты обследования 4-поль-ного севооборота; знаменатель - 5-польного

По характерным признакам диагностированы следующие болезни: фузариозное увядание, альтернариоз, фомоз, макроспо-риоз и фитофтороз. Выпады (3%) и отставание в росте (до 6%) были вызваны фузариозным увяданием. Редко на ростках и чаще в начале цветения обнаруживались растения, пораженные фитоф-торозом, на что указывало появление бурых и коричневых пятен, которые при помещении листьев во влажную камеру покрывались налетом мицелия, и ткань размягчалась. В период цветения появлялись растения с признаками фомоза и алтернарио-за. Поражаемость макроспориозом зависит от сорта картофеля. Сорт Гатчинский меньше поражался этими микромицетами.

В посевах сахарной свеклы количество фитопатогенных микромицетов увеличивалось к концу вегетации независимо от типа севооборота и было наибольшим в фазу технической спелости. Максимальная степень развития фитопатогенов отмечена при бессменном возделывании культуры. При посеве сахарной свеклы после двухлетнего выращивания озимой пшеницы количество фитопатогенных микромицетов снижалось на 14,3%, а

трехлетнее стояние люцерны приводило к еще большему ограничению их распространенности.

Обнаружено, что при бессменном возделывании сахарной свеклы процент пораженности фитопатогенными микромицетами высок и достигает к концу вегетации 33,8%. Введение зерновых культур и многолетних трав в севооборот снижает их численность, повышает урожайность и качество корнеплодов. Возделывание сахарной свеклы по предшественникам даже после бессменного посева снижает изреживаемость посевов. Лучшими предшественниками оказались люцерна и серые хлеба (овес и рожь). Урожайность увеличивалась с 110 ц/га до 144-184ц/га.

Микофлора почв под посевами и в ризосфере картофеля многообразна, было выделено 854 штамма,которые по морфологическим и культуральным признакам отнесены к 25 видам.

В численном отношении преобладают микромицеты родов Р1-nlcllllum, Aspergillus,- Fusarlura, Trichoderma, Rhizoctonia, Alternaría. Наряду с сапрофитными почвенными микромицетами обнаружены и фитопатогенные формы. Особую опасность представляют виды Phytophthora infestans de Вагу, P.parasitica Dastur, P. cryptogea.

Наши наблюдения совпали с относительно засушливыми годами. Однако следует помнить, что в дождливые годы почвенные фитофторы могут оказаться причиной вспышки заболевания. Это подтверждается результатами микробиологического обследования больных растений.Из органов больных растений выделены микромицеты родов Fusarlura,Phytophthora, Phoma,Alternarla (табл.2).

Таблица 2

Микромицеты, выделенные из растений картофеля

! Кол-во ¡Выделено из больных растений, % к общему Органы ! анали- ! числу анализированных проб

растений !зирован-!______

!ных проб! Fusa- ! Phyto- ! Phoma ! Alter- ! другие ! ! rium ! phthora! ! narla ! грибы

_I_I_I_I_!

Листья 85 - 2,5 4,2

Стебель 77 20,0 1,9 7,8

Клубни 65 36,3 - 4,8

3,0 7,3 12,4 11,0

- 13 -

Видовой состав микромицетов на различных органах растений был не одинаков. На листьях не были обнаружены микроми-цеты рода Fusarium,а на клубнях - Phytophthora и Alternaria. Из патогенных форм преобладали микромицеты Fusarium и Phoma.

Высокая обсемененность растений микромицетами рода Fusarium и Phoma явилась причиной развития сухой гнили во время хранения клубней.

В ризосфере сахарной свеклы преобладали сапрофитные микромицеты. Из 912 штаммов 134 отнесены к родам Pénicillium, 40 - Fusarium, 35 - Trichoderma, 27 - Alternaria, 17 -Verticillium, 14 - Botrytis. Меньше всего встречаются микромицеты родов Colletotrichum и Ascochyta. В ризосфере сахарной свеклы обнаруживается большое разнообразие фитопатогенных форм. Состав микромицетов подвержен изменению в зависимости от фазы развития сахарной свеклы (табл.3).

Таблица 3

Численность микромицетов в различные фазы развития сахарной свеклы

Родовой <3 & а з ы р а з в и т и я

состав 2-3 пары смыкания ! смыкания ! технической

микро- настоящих в рядки ! в между- ! спелости

мицетов листьев ! рядьях i

кол-во! % кол-во! % ! кол-во! % ! кол-во ! % ..

1 2 ! 3 Ol ! 6 ! 7 ! 8 ! 9 . .

Потенциальные патогены

Pythlum - - 2 3,5 3 5,5 1 1.8

Rhizoctonia 4 5.9 3 5,5 4 7,5 7 13,2

Fusarium 10 14,9 8 14.8 10 16.3 4 7,5

Botrytis - 1 - • 4 6,5 4 7,5 3 6,6

Ascochyta - - - - - - 5 9,4

Сопутствующие сапрофита

Aspergillus 17 25,3 10 18,5 9 14,7 4 7,5

Pénicillium 26 38,8 9 16,6 13 21,3 16 24,3

Trichoderma 8 11.9 12 22,2 12 19,6 13 21,3

Др.микро- 54 38, 0 54 38, 0 47 15,9 33 11,2

мицеты

- 14 -

Из приведенных данных следует, что если одни группы микромидетов встречаются в течение всего вегетационного периода, то другие только на поздних стадиях развития. Известно, что микромицеты наносят серьезный ущерб не только в качестве возбудителей болезней сахарной свеклы, но и как причина гнили. Нами из пораженной гнилью сахарной свеклы, было выделено 450 штаммов микромицетов.

При определении патогенности микромицетов путем высева их на вырезки корнеплодов свеклы было установлено, что патогенными свойствами обладают 136 штаммов. Наибольшее повреждающее действие оказывали культуры Pénicillium rugulosum, Mucor hiemalis и Rhizopus nigricans. Разные виды одного и того же рода отличались по степени 'воздействия на ткани корнеплодов сахарной свеклы.

Основными болезнями сахарной свеклы, вызывающими большие потери урожая, являются церкоспороз, корневая гниль, корнеед, ризомания и др. В условиях орошаемого свеклосеяния юго-востока Казахстана наряду с мучнистой росой получают все большее распространение корневые гнили, возбудители которых представлены обширной группой микромицетов из различных систематических групп. За последние годы накопились материалы, характеризующие довольно полно, хотя и не исчерпывающе, строение, жизненный цикл микромицетов, возможность сохранения и возобновления их в природе, способность поражать растения, индуцировать функциональные расстройства в организме хозяина.

По результатам наших исследований были выделены и описаны представители наиболее важных фитопатогенных микромицетов: Cercospora beticola Sacc; Phoraa betae Frank; Pleospora betae; Pythiura de-baryanum Hesse; Botrytis cinerea Fr.; Rhizoctonia aderholdii (Ruhl.Kolosh); Aphanomyces cochlioides (Drechsler,Scott); Llgniera betae (Nemec, Kazling.); Fusarium gibbosum App.et. Vir.tm. Bilai; Fusarium heterosporum Nees, ; Ascochyta betae Prill, et Delacr. ; Ascochyta chenopodii. Rostr.Grove; Gliocladium Zaleskii: Pldopl.; Heterosporium betae Dowson; Pénicillium claviforme Bain.Raper,Thom. ; Pénicillium corymbiferum Westl. Raper, Thom. ; Pénicillium cya-neo-fulvum Biourge, Raper, Thom.; Pénicillium luteum Zukal.

Raper,Thorn. ; Pénicillium rubrum Stoll.Râper. Thorn.; Pénicillium spinulosum Thom.Râper, Thom. ; Pénicillium variabile Sopp.Raper,Thom. ; Polymyxa betae - Keskin.Karling.; Rhizoctonia violacea Tul. ; Septoria betae West. Drachovska - Sima-nova Z.F.; Vertlcilllum lateritium Berk.; Verticillium pro-llflcans Pidopl.

Картофель - одна из основных продовольственных культур. Успех в выращивании и получении высоких урожаев этой ценной культуры во многом зависит от качества семенного материала, почвенно-климатических условий возделывания и от ряда других факторов. Процессы, протекающие при хранении клубней, практически являются продолжением их жизнедеятельности, но только без участия материнского растения, потому что от правильного хранения клубней зависит успех будущего урожая. Основная причина гибели клубней в период хранения, снижения качества семенного и продовольственного картофеля -микромицеты и бактериальная гниль. Развитию их болезней при хранении способствуют заражение клубней в процессе вегетации другими микромицетами и бактериальными патогенами, повреждение их вредителями, а также воздействие неблагоприятных факторов внешней среды. Совокупность этих факторов определяет комплекс мероприятий, разработка которых позволит повысить урожайность картофеля, оздоровит его генетические свойства.

Картофель относят к культурам, в сильной степени подверженным поражению микромицетами и другими микроорганизмами. Вегетативное размножение, большое содержание углеводов в ботве и клубнях создают благоприятные условия для развития патогенных микроорганизмов на надземных и подземных органах растенийЛаибодьший ущерб урожаю картофеля наносит фитофтора

В нашей работе дана исчерпывающая характеристика фито-патогенных микромицетов картофеля как в период вегетации, так и при хранении. По результатам исследований описаны следующие представители микромицетов - Phytophthora Infes tans De Вагу; Phytophthora parasitica Dastur; Phytophthora cryp-togea Peth.et Laff; Oidium solani (Wor.) Dang.Seidl.; Oospora pustulans Owen.et Wak; Rhizopus nigricans Fhr.; Fusarium oxysporum schlecht.emend. Snyd.et Hans.; Fusarium lateritium Nees.; Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc.; Verticillium albo-at-

rum Reinke et Berth.; Ascochyta solani-tuberosi Naum.; Colletotrichum atramentarum (Berk.et Br.) Taub.; Helminthospo-rium solanl Dur.et Mont.; Phoma solanlcola Prill, et De-lacr.; Phoma tuberosa Melhus. Rosenb.et Schultz; Pythium arrhenomanes Drechser.Middl.; Rhizoctonia solanl Kuhn.; Sclerotium rolfsli (Sacc) Gursi; Vertlcillium foexil v. Bey-ma; Verticillium nigrescens Pethybr; Vertlcillium Dahliae Klebahn;Smith; Verticillium nubilum Pethybr.

Таким образом, в юго-восточных районах республики большой .вред посевами сахарной свеклы, картофеля и огурцов наносят микромицеты: Fusarium oxysporum, F.solani, F. culmorum, F.moniliforme, Phytophthora infestans, P.parasitica, P.cryp-togea, Phoma solani, P.tuberosa, Rhizoctonia solani, R.ader-holdii, Botrytis cinerea.

ПОИСК, ВЫДЕЛЕНИЕ- И ПРИМЕНЕНИЕ АНТАГОНИСТОВ И ИХ МЕТАБОЛИТОВ ПРОТИВ ФИТОПАТОГЕННЫХ ММКРОМИЦЕТОВ Глава охватывает результаты исследований по изысканию новых продуцентов антифунгальных антибиотиков, а также усовершенствованные способы получения препарата триходермина.

Из различных типов почв, на которых возделывались огурцы, люцерна, картофель, редис, а также из чистого пара выделено 918 штаммов стрептомицетов. Больше всего стрептомицетов было выделено из каштановой (310 штаммов) и темно-каштановой (248 штаммов), меньше всего - из бурой (29 штаммов) почвы.

По окраске воздушного и субстратного мицелия выделенные культуры были распределены по секциям и сериям. В численном отношении преобладали стрептомицеты секции Cinereus (429 штаммов или 46,7%) и секции Roseus (290 штаммов или 31,6%),секция Niveus представлена 192, а секция Azureus - 7 штаммами.. У всех выделенных штаммов были изучены антагонистические свойства в отношении 7 различных тест-культур фито-патогенных микромицетов ( Ascochyta melonis 275, Venturia cucumerina V-10, Al t.solani, Pythium sp.265, Fusarium solani var.argillaceum, Fusarium oxysporum 115, Fusarium oxysporum v. orthoceras). Больше всего антагонистов обнаружено по отношению к V.cucumerina и Pythium sp. Антагонисты к первому

тесту принадлежали к сериям Roseoviolaceus, Chromogenes и Violoceus, ко второму тесту - Lavendulae roseus, Roseoviolaceus, Griseus. Антагонисты к Fusarium и Ascohyta найдены в серии Fuscus. Первичная оценка антагонистических свойств проведенная по способности подавлять рост трех видов Fusarium показала, что наиболее чувствительным является вид F.so-lani var.arglllaceum, меньше всего антагонистов обнаружено в опытах с F.oxysporum. Особенно активные антагонисты выявлены среди стрептомицетов секции Roseus.

Сравнительный анализ антифунгальной активности культур микромицетов позволил отобрать для дальнейшего изучения 12 штаммов с наиболее широким спектром действия. В результате детального исследования среди представителей секции Roseus серии Fradiae был отобран штамм А-23/791, обладающий наиболее выраженным антифунгальным действием и синтезирующий в мицелии антибиотик с активностью до 3072 ед/мл ацетоновой вытяжки. Штамм А-23/791 на средах, благоприятных для споро-ношения, имеет спиральные спороносцы со спиралями в форме крючка (тип RA). По морфологическим, культуральным и физиологическим свойствам он близок к виду Str.roseoflavus Arai 1951, но отличается от него по ряду признаков.

На среде Гаузе-1 Str.roseoflavus Arai образует розовый или розово-желтый мицелий, субстратный мицелий бледно-лимон-но-желтый. Штамм А-23/791 всегда имеет на этой же среде розовый воздушный мицелий и желтовато-бурый субстратный мицелий. В литературе описаны две разновидности Str.roseoflavus: Str.roseoflavus var.roseofungini var. nov. и Str.roseoflavus Arai 1951. Исходя из этого, нами было проведено сравнительное изучение физиологических признаков штамма А-23/791 с Str.roseoflavus var. roseofungini (продуцента розеофунгина) и Str.roseoflavus Arai 1951 var. jenensis nov.var., продуцирующий антибиотик флавомикоин (табл 4).

Отмечено, что культуры отличаются по некоторым физиологическим признакам. Например, Str.roseoflavus Arai растет на клетчатке, коагулирует молоко, полностью его пептонизирует, сахарозу инвертирует слабо,а штамм А-23/791 на клетчатке не растет, молоко коагулирует без пептонизации, сахарозу инвер-

Таблица 4

Физиологические свойства штамма А - 23/791 и типовых культур стрептомицетов

Куль- ¡Рост на молоке¡Разжиже ! Гидро- ! Рост ! Восста-! ¡Инвер-

туры !коагу-! ! пепто-!ние же- !лиз кра- !на кле- 'новление! сия са

!ляция ! !низация!латины ! хмала !тчатке !нитратов! !харозы

Штамм

А-23/791- ++++ О ++++ +++ 0 ++++ ++++.

Str.roseo-

flavus

V. roseo-

fungini ++++ ++++ ++++ +++ 0 ++++ ++++.

Str.roseo-

flavus

V. .inensis ++++ +++ ++++ +++ ++ ++++ 0 .

Str.roseo-

flavus Arai

1951 ++++ ++++ ++++ ++ +++ ++++ ++

тирует интенсивно. По этим признакам он ближе к Str.roseo-flavus var.roseofungini. Поэтому особенно тщательно морфологические, культуральные и физиологические свойства штамма А-23/791 исследовались в сравнении с Str.roseoflavus var. roseofungirá. Анализ полученных результатов указывает на сходство сравниваемых культур по ряду признаков и в то же время свидетельствует об отсутствии полной идентичности.

Прежде всего они отличаются по форме и размеру спор -у Str. roseoflavus var.roseofungini они овальные и продолговатые, имеют размеры 1,5 х 1,0 мкм и 2,0 х 1,0 мкм соответственно, а у штамма А-23/791 споры во всех случаях овальные с размерами 1,6 х 1,0 мкм. Нельзя не отметить и некоторые отличительные признаки, характерные для каждой культуры. Так, на многих испытанных средах воздушный мицелий штамма А-23/791 имеет интенсивную розовую окраску, a Str.roseof-

- 19 -

lavus var.roseofunginl - светло-розовую.

Субстратный мицелий отличается у этих культур на среде Чапека (с глицерином и с глюкозой). Штамм А-23/791 на указанных средах выделяет оранжево-розовый пигмент, диффундирующий в среду. Такой признак у Str. roseoflavus var.roseofunginl не выявлен. Что касается физиологических свойств сравниваемых стрептомицетов, то они идентичны, кроме характера роста на молоке.

Штамм А-23/791 также, как и Str. roseoflavus var.roseofunginl, обладает способностью восстанавливать нитраты, гид-ролизировать крахмал, разжижать желатин, инвертировать сахарозу и образовывать сероводород. Однако штамм А-23/791 коагулирует молоко без пептонизации, a Str. roseoflavus var.roseo fungini, интенсивно коагулируя, в слабой степени его пеп-тонизирует.

При сопоставлении с данными, приведенными H.Schlegel и др. (1971), изучаемая нами культура штамм А-23/791 отличается от Str. roseoflavus Arai 1951 var. jnensis nov.var. по цвету субстратного мицелия на средах Гаузе-1, Гаузе-2, крахмальном агаре, ломтиках картофеля, а также усвоением араби-нозы, галактозы, глюкозы, лактозы, мальтозы, глицерина.

Сопоставление антимикробного и антифунгального спектра культуры Str. roseoflavus var. roseofunginl и штамма А-23/791 было проведено на средах Чапека, Гаузе-1 и крахмально-аммиачном агаре (КАА) с использованием в качестве тест-культур бактерии, дрожжеподобных и фитопатогенных микромицетов.

Антимикробный спектр у изученных культур различен. Str. roseoflavus var. roseofungini отличается от штамма А-23/791 отсутствием угнетающего действия на бактерии. Штамм А-23/791 наряду с фунгицидной активностью обладает и слабым антибактериальным действием по отношению к Staph, aureus 209; Вас. subtilis: Bact. vesicatorium; Sarcina lutea; Mycobact. rubrum. Антагонизм к бактериям не зависит от состава питательной среды.

По данным Г.Ф.Гаузе и др. (1957), типичная культура Str.roseoflavus Arai обладает выраженным антибактериальным и слабым антифунгальным действием.

- 20 -

Из бактериальных тест-культур она подавляет Staph, aureus, Bact.coli, Вас.mycoides. Вас. subUlis. Следовательно, по антибактериальной активности штамм А-23/791 занимает промежуточное положение между Str.roseoflavus Aral и Str. roseoflavus var roseofunginl, отличаясь от обоих по степени активности. Обе типовые культуры стрептомицетов проявляют более слабое действие на дрожжеподобные микромицеты Candida albicans, С. krusei и С.tropicalis.

Культуры Str. roseoflavus var.roseofungini и штамм А-23/791 обладают широким антифунгальным спектром, особенно сильно антагонизм выражен по отношению к Alternarla tenuis, Pythiumsp., V. cucumerina, F.culmorum, F.gibbosum, Botrytis cineréa и Helminthosporlum sativum.'

По сравнению с штаммом А-23/791 (7-8 мм), Str.roseoflavus var. roseofungini слабее действует (2-3 мм) на микромицеты F. oxysporum var.orthoceras, F. oxysporum var.solani, F. sporothrichiella, B.cinerea и V. cucumerina.

Следует отметить, что высокая активность по зонам задержки роста фитопатогенных микромицетов при воздействии штамма А-23/791 наблюдалась на двух средах - крахмало-ам-миачном агаре (8-20 мм) и среде Гаузе-1.

При хроматографировании экстракта из мицелия штамма А-23/791 с последующим проявлением его на Staph.aureus 209 и F. oxysporum var. orthoceras обнаружен антибиотик с фунгицид-ными свойствами, занимающий на хроматограммах положение, установленное для розеофунгина. Детальный анализ показал, что антибиотик, образуемый штаммом А-23/791, относится к типу розеофунгина и является представителем микотициново-флаво-фунгиновой группы.

Антибиотик А-23/791 превосходит розеофунгин по спектру антифунгального действия и степени антибиотической активности (табл.5).

Одним из необходимых этапов исследования эффективности антибиотика А-23/791, является определение его фунгистатиче-ской и фунгицидной концентрации в сравнении с известными высокоактивными антибиотиками. Для этой цели взяты антибиотики розеофунгин, леворин и гризеофульвин.

Таблица 5

Спектр фунгистатической активности антибиотиков розеофунгина и А-23/791

Виды микромицетов

Минимальная фунгистатическая концентрация антибиотиков,мкг/мл

розеофунгин ¡антибиотик А-23/791

Фитопатогенные микромицеты

Botrytis cinerea 0,78 1,16

Fusarium solani var. arglllaceum 1, 33 0,87

F.oxysporum var.melonis 3,32 2,24

F.oxysporum var.orthoceras 7,5 2.24

F. oxysporum var.solanl 4,01 2, 24

F.oxysporum 115 - 2,24

F. culmorum 4,0 0, 87

F. bulbugenum var. blasticola 3,9 2,24

Venturia cucumerlna 1,23 0,87

Ascochyta melonis - 0,58

Rhizoctonia aderholdi 1, 11 2.24

Rhizoctonia solanl 0,78 1. 16

Helminthosporium sativum 1, 1.1 1,16

Sclerotinia libertiana 1,33 1,16

Pythium sp. - 0,87

Alternaria tenuis - 1. 16

Дрожжеподобные и другие микромицеты

Candida albicans 1.33 1,16

С. tropicales 1,61 3,32

Trichoderma lignorura 4,6 4,98

Aspergillus niger 4,6 3,32

- 22 -

Было обнаружено, что наиболее эффективным в отношении высокопатогенных микромицетов рода Fusarium оказался антибиотик А-23/791, фунгистатическая активность которого составила 3,3, фунгицидная -6,6 мкг/мл, соответственно у розеофун-гина - 3,9/7.8, гризеофульвина - 7,8/15,6, а у леворина -30,0/60,5 мкг/мл (табл.6).

Таблица 6

Действие различных антибиотиков на микромицеты рода Fusarium,мкг/мл

Виды микромицетов'Розеофунгин! A-23/791 ! Леворин ! Гризео-

рода Fusarium : ! ! ! ! фульвин

F.bulbugenum var. 3,9/7,8 3, 0/6, 6 31,2/62,5 7,8/15,6

blasticola

F.oxysporum var. 3,9/7, 8 3, 3/6, 6 30, 0/60,5 7,2/15,0

orthoceras

F.oxysporum var. 3, 8/7,8 3, 3/6, 6 31,2/62, 5 7,7/16.0

solani

F.oxysporum var. 3,9/7,8 3.3/6,6. 31,2/62,5 7,8/15,5

melonis

F.solani var. 3.9/7,8 3,3/6,6 31,0/61,0 7,8/15,6

argillaceum

F. culmorum 3,9/7,8 ■ 3,3/6,6 30,9/62,2 7, 8/i5, 6

Примечание: числитель - минимальная фунгистатическая доза; знаменатель - фунгицидная доза

Следующим этапом исследований было изучение степени влияния антибиотика А-23/791 на растения. Результаты лабораторных опытов показали, что антибиотик А-23/791 хорошо всасывается и сохраняется в семенах до пяти суток,а в стеблях и корнях - до десяти суток. Самой подходящей дозой антибиотика А-23/791 оказалась концентрация 50 мкг/мл при экспозиции 24 ч, которая не только не угнетает растения, но и стимулирует рост проростков и корешков на 32,9-37,5%. Полученные результаты показали перспективность использования антибиотических веществ, продуцируемых штаммом А-23/791.

- 23 -

Необходимым этапом в получении препаратов является подбор оптимальных условий для биосинтеза антибиотика. С этой целью изучено накопление антибиотических веществ на различных питательных средах. В итоге сбалансированная среда для биосинтеза антибиотика А - 23/791 имела следующий состав: рыбная мука - 1%, пептон - 0,5%, сернокислый аммоний - 0,2%, глюкоза - 2%, лактоза - 1, 5%, крахмал - 0, 5%, хлористый натрий - 0,5%, углекислый кальций - 0,5% в расчете на литр воды, pH 7,0-7,2. В этих условиях на 5 сутки роста активность культуральной жидкости достигала 5000 ед/мл.

Для извлечения активного начала из мицелия использовали различные органические экстрагенты, среди которых лучшими оказались бутанол и ацетон при нейтральном значении pH. Ацетоновый экстракт окрашенный в темно-желтый цвет, имел сухой вес 8,2 мг/мл и активность 4096 ед/мл. Спиртовой концентрат, полученный упариванием на водяной бане ацетонового экстракта при 35-40° до 1/20 объема, имел активность 19000-65000 ед/мл. Антибиотик получен также и в виде желтого аморфного порошка. УФ-спектр антибиотика А-23/791 в этаноле характери-. зуется двумя максимумами: главным - при 365 нм (Е =650) и дополнительным - при 264 нм (Е =110). В ИК-спектре антибиотика (таблетки с КВг) присутствуют полосы поглощения с максимумами при 750, 850, 945, 1010, 1100, 1240, 1440, 1580, 1620, 1705, 2945, 3420 (широкая) см . При хромотографии на бумаге в смеси хлороформ-тетрагидрофурол-формамид (50:50:5) Rf антибиотика составляет 0,54. Сходство электронного спектра поглощения и "хроматографического спектра" позволило отнести антибиотик А-23/791 к группе карбонил-коньюгированных пентаенов.

При изучении естественной изменчивости Str. roseoflavus Aral из вторичных колонии штамма А-23/791 был получен новый высокопродуктивный штамм 4-76, хранящийся в коллекции Института микробиологии и вирусологии HAH PK за N70 (А.с.N744033, 1980). Антибиотик, полученный из биомассы штамма 4-76, идентичен по физико-химическим и биологическим свойствам антибиотику А-23/791.

Выделенный штамм 4-76 Str. roseoflavus Aral (1952) образует на 1 л питательной среды 273-660 мг антибиотика

А-23/791 с биологической активностью 4300-6000 ед/мг, что в 2-3 раза выше продуктивности исходного штамма (127-222 мг). Кроме того, штамм 4-76 обладает большей биологической активностью и накапливает на 1 г мицелия 9,5 - 26,0 мг антибиотика, что обеспечивает больший выход целевого продукта и позволяет при выделении антибиотика из мицелия снизить расход растворителей (табл.7).

Таблица 7

Продуктивность исходной культуры Streptomyces roseoflavus Aral А-23/791 и культуры 4-76 из вторичной колонии.

В 1 1 I Штамм!Вес ми- Выход 1 Антибио-1 1 I Продуктивность

а 1 Str. 1 целия препара- тическая | f по выходу анти-

P 1 го- |из 1 л та из актив- | Е биотика (мг) на

и 1 seo- )культу- мицелия ность, ] | 1 г мицелия

а I fla- |ральной 1л куль- ед, мг | при

н 1 vus |жидкос- туральн. 365

т . Ш 1 1ти, г 1 I жидкое ти.мг нм

1 А-23/791 57,7 127 4000 510 2,2

4-76 27,4 273 6000 840 10,1

2 А-23/791 39,4 209 3200 388 5,4

4-76 39,1 360 4300 790 9, 5

3 А-23/791 40,2 222 3200 400 5,5

4-76 25,4 660 6000 840 26,0

Отбор антагонистов - микромицетов рода Тгхс1ю11егта и получение триходермина. Использованию триходермы в растениеводстве предшествовали экологические исследования по изучению распространения микромицетов этого рода на различных типах почв.

Во всех типах почв преобладал вид Т. Н©югит. На его долю приходилось от 69 до 83,3% выделенных микромицетов. Свыше 95% выделенных культур обладали антагонистическими свойствами. Среди них штамм 72 отличается способностью синтезировать наряду с известными антибиотиками и летучие антимикробные соединения. В результате селекционной работы, со-

метающей естественный отбор с индуцированным мутагенезом, получен высокопродуктивный мутант 889 (Успанов,1971).

Эффективность действия Т. lignorum на микромицеты рода Fusarium была проверена и в опытах с искусственным заражением клубней картофеля F.solani, известным как возбудитель серой гнили. Обработка суспензией спор триходермы снижала число пораженных клубней (табл.8 ).

Таблица 8

Эффективность Т.lignorum в предупреждении

развития сухой гнили клубней --—|-,-—

Варианты опыта I Здоровые клубни | Пораженные клубни .млн. спор/мл I_щт,_I_щт,_

0, 01 46 + 1, 1 4 + 0. 6

0, 1 47 + 2,3 3 + 0,7

5,0 48 +; 2.2 2 + 0,3

10,0 50 + 3,0 0

контроль 35 3,1 15 + 1,6

Высокая антифунгалъная активность штамма 889 послужила основанием к использованию его для получения препаратов три-ходермина. В Казахстане разработаны различные способы приготовления препарата на основе микромицетов рода Тг1с1ю(3ета. Однако общим недостатком этих способов была высокая стоимость готового препарата. В связи с этим был разработан экономически выгодный способ получения препарата в достаточном количестве в условиях сельскохозяйственного производства.

Для получения препарата использовали солому, ячменную полову и перепревший навоз. Солома и полова мелко нарезались и укладывались в штабель шириной 2,5-3,0 и высотой 1,5-2,0 метра. Уложенную массу запаривали горячей водой (80-90°), что обеспечивало частичное снижение обсемененности гнилостными бактериями. В охлажденный до 28-30° субстрат вносили, с помощью опрыскивателя, маточную культуру Т. lignorum 889, содержащую до 7 млн. спор/мл. Затем вся масса в штабеле укрывалась соломой слоем 0,5-0, 6 м для создания благоприятных температурных условий. Если в качестве субстрата использовался навоз, то его перемешивали с мелконарезанной соломой и

укладывали в бурты шириной 2,0 - 2,5 и высотой 1,5 м. Солома до смешивания с навозом предварительно запаривалась горячей водой. Всю массу заражали суспензией спор триходермы (7 млн./мл) и укрывали соломой высотой 0,5 м. Сроки для размножения триходермы определялись опытным путем. Численность микромицетов учитывалась на 15, 30, 45 и 60 день. Результаты представлены в таблице 9.

Таблица 9

Численность Т.lignorum 889 (млн/г) на полове и соломе ячменной разной степени влажности

Варианты !. Время выращивания, сутки.

!_Ш ' ! 20 ! 45 ! 60

Полова ячменная, влажность 62 5,0 4,3 -

20% (контроль)

Полова ячменная, влажность 60% 87,0 265,0 282,3 276,7

Полова ячменная, влажность 70% 50,0 170,3 167,4 160,3

Солома ячменная, влажность 7,0 5,3 4,6 -

20% (контроль)

Солома ячменная, влажность 60% 53,0 103,4 175,2 160,3

Солома ячменная, влажность 70% 65,0 290,0 301,0 280,0

Наибольшая биомасса накапливалась к 45 суткам на соломе влажностью 70%. Хорошие результаты были получены при использовании навоза в качестве субстрата . На таком субстрате мик-ромицеты растут быстрее. Максимальный рост достигался при влажности 60% на 30 сутки (табл.10).

Таблица 10

Развитие Т.1^огш 889 на навозном субстрате (млн/г)

Варианты L_Время выращивания, сутки

опыта_! 15 ! 30 ! 45 ! 60.

Навоз, влажность 20% 7,5 8,3 7,8 7,0

(контроль)

Навоз, влажность 40% 48,2 152,3 140.4 120,0

Навоз, влажность 60% 182,0 342,0 312,0 296,0

Навоз, влажность 70% 128,3 173, 0 164,5 -

- 27 -

Из данных таблиц 9 и 10, следует, что рост триходермы на навозе опережает таковой на других субстратах. Наибольшая биомасса на навозном субстрате накапливается через месяц после внесения посевного материала, а на соломе и полове -через 45 дней. Тем не менее, считаем, что все три субстрата пригодны для получения биомассы триходермы в зависимости от наличия того или иного их типа в хозяйствах.

Препарат триходермина, приготовленья указанными способами, был испытан в полевых опытах при внесении его в почву под посевы картофеля. Триходермин вносился в почву совместно с навозом из расчета конечной концентрации 7 млн. спор на 1 г субстрата. Клубни перед посадкой обрабатывались ТМТД - 3,5%. В контрольных вариантах посадки проводили двумя способами: клубни обработанные ТМТД высаживали в почву без триходермина и необработанные клубни высаживались в почву с триходерми-ном. Пробы для учета микромицетов отбирались ежемесячно.

Во всех вариантах опыта, в первый месяц, доля триходермы в ризосфере картофеля увеличивалась без сколько-нибудь заметного лаг-периода. Затем в варианте с ТМТД количество её уменьшалось в 2 раза, а в вариантах с триходермой продолжало увеличиваться. Эти данные свидетельствуют о хорошей приживаемости триходермы и правильно подобранной дозе.

ВЛИЯНИЕ ИНТЕГРИРОВАННЫХ СРЕДСТВ ЗАЩИТЫ НА МИКРОФЛОРУ И РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ

Сахарная свекла и картофель относятся к культурам, сильно поражаемым патогенными микромицетами, поэтому в защите этих растений от фитопатогенов значительное место отводится профилактическим мероприятиям, основными элементами которых являются агротехнические приемы и химические пестициды.

Исходя из этого, нами было проведено изучение влияния агротехнических приемов и некоторых пестицидов на количественный состав почвенных микробиоценозов. В качестве объектов были выбраны препараты, широко используемые в защите сахарной свеклы и картофеля (гербициды шабет, этсан, трихлорацетат натрия, феназон; инсектицид омаит; фунгициды Ф-319 и ТМТД). Изучено действие указанных препаратов на сапрофитные, анта-гонистичечкие ростстимулирующие и неспециализированные пато-

генные микроорганизмы. Опыты проводились в лабораторных и полевых условиях.

Показано, что ТМТД и Ф-319 угнетали рост микромицетов и стрептомицетов, этсан и шабет оказывали слабое влияние, а омаит и феназон не влияли на число формирующихся колоний. Четыре препарата (этсан,шабет, Ф-319, ТМТД) проверены в мел-коделяночных опытах. Препараты применялись согласно принятым инструкциям. Меньше всего на действие пестицидов реагировали бактерии. Их численность мало изменялась, за исключением азотобактера и целлюлозолитических бактерий. Азотобактер в небольшом количестве обнаруживался в первую фазу развития и отсутствовал в поздние периоды.

Численность стрептомицетов уменьшалась под воздействием фунгицида Ф-319 и увеличивалась при использовании этсана и шабета. Препарат подавлял развитие микромицетов, а предпосевная обработка семян ТМТД не вызывала заметного изменения общего количества микромицетов.

Пестициды могут влиять не только на количественное содержание микромицетов, но и на качественные их характеристики. В модельных опытах с 5 музейными штаммами Aspergillus flavus, отличающимися между собой по^-способности- синтезировать афлотоксины, было обнаружено, что ТМТД обладает фунгис-татическим эффектом и вызывает изменение морфологических свойств. Изучение влияния пестицида ТМТД на морфо- и токси-ногенез микромицетов проводилось с помощью воздействия на споровую суспензию в различных режимах, а также при выращивании микромицетов на обычных питательных средах, содержащих фунгицид.

Увеличение размеров конидий и конидиеносцев отмечено в основном у нетоксичных штаммов. Изменение морфологических признаков и биометрических показателей, появление у этих штаммов признаков, характерных для афлотоксинообразующих штаммов (рельефный рисунок конидий, увеличение органов спо-роношения и др.), указывает на связь морфологических признаков с токсинообразующей способностью микромицетов. Более детальное изучение этого вопроса заслуживает особого внимания, особенно в плане выявления условий появления или усиления признака токсинообразования в природных субстратах.

- 29 -

Одним из важных средств защиты от болезней растений является севооборот, позволяющий ограничить численность почвенных патогенов. Поэтому нами было предпринято изучение влияния различных форм севооборота на численность микромице-тов в ризосфере сахарной свеклы и картофеля.

В севооборот сахарной свеклы были включены озимая пшеница, озимая рожь, овес, кукуруза, люцерна, чередующиеся в различном порядке в условиях 2-, 3-, 8- и 9-польного севооборотов. Данные по изменению общей численности микромицетов в зависимости от севооборота представлены на рис.1.

Рис.1. Численность микромицетов в зависимости от севооборота.

I - двупольный севооборот - озимая пшеница,сах. свекла

II - двупольный севооборот - овес, сахарная свекла

III - 3-польный; IV - 4-польный - люцерна (3), сахарная

свекла; V - 8-польный; VI - 9-польный.

I ! - период всходов; ^^ - смыкания в междурядья ЩЩ - технической спелости

Наибольшее количество микромицетов обнаружено в условиях 2-польного севооборота, особенно если предшественником являлась озимая пшеница. Меньше всего микромицетов обнаруживались при 8- и 9-польных севооборотах.

- 30 -

Разнообразие видового состава микромицетов и бактерий обуславливает многообразие их действия на растения и представителей микофлоры. Оно может быть нейтральным, антагонистическим, ростстимулирующим и токсичным. Соотношение физиологически активных форм микромицетов в ризосфере сахарной свеклы приведено в таблице 11.

Таблица 11

Содержание физиологически активных форм микромицетов в ризосфере сахарной свеклы в различные фазы развития

Севооборот Физиологические группы Доля, %

Фаз ы развит И я

1 1 1 2-3 пары|Смыкание|Смыкание 1Техни- настоящ.| в ряды |в между-1 ческой листьев 1 |рядьях |спелости 1 1 1

8-польный Антагонисты 22,9 18,7 17,2 14,0

Стимуляторы 9,2 13,1 16,3 12,9

Ингибиторы 19,3 23,6 29,4 33,6

9-польный Антагонисты 41,0 34; 1 27,9 18,3

Стимуляторы 6,9 12,1 14,2 16,3

Ингибиторы 18,9 22,6 36,9 43, 1

К концу вегетации отмечается увеличение доли фитотокси-ческих микромицетов и снижение антагонистов, несколько повышается число стимуляторов. Среди микромицетов рода Aspergillus, Penicillium, Fusarium встречались как ингибиторы, так и антагонисты. Стимуляторы встречались только среди сап-рофитов, большинство фигопатогенных микромицетов, например Alternaria, Botrytis, Rhizoctonia, обладали и фитотоксич-ностью.

Таким образом, включение в севооборот бобовых и злаковых растений снижает общую численность микромицетов в ризосфере, но не приводит к уменьшению фитотоксических форм.

Другой важной группой микроорганизмов являются стрепто-мицеты. Изменение численности стрептомицетов зависело от

способа возделывания сахарной свеклы. В монокультуре сахарной свеклы максимальное их количество (200 тыс/г) обнаруживалось в период посева семян, а наименьшее (100 тыс/г) - в период технической спелости. При чередовании сахарной свеклы с озимой рожью или овсом содержание сгрептомицетов увеличивалось во время появления 2-3 пар настоящих листьев и особенно в середине вегетации. В 8-польном севообороте в этот период количество стрептомицетов достигало 800 тыс/ г, что было в два раза выше их числа в период массовых всходов. В 9-польном севообороте максимальное число стрептомицетов не превышало 650 тыс/г.

Определение числа токсинообразующих и ростстимулирующих форм стрептомицетов и их изменений в течении всего периода вегетации было проведено на основании анализа 350 штаммов, выделенных из ризосферы сахарной свеклы, возделываемой по 8-польной системе. Больше всего токсинообразователей обнаруживалось в конце вегетации, меньше всего их было в период смыкания листьев в междурядьях. Наибольшее число токсинообразователей было выявлено среди стрептомицетов серии Grlseus., Fuscus, Lavendulae-Roseus.

Количественные изменения в ризосфере картофеля изучались в условиях многопольного севооборота. Картофель высевался 2 года подряд после многолетних трав. Определение общего числа сапрофитных бактерии, стрептомицетов и~микромице-тов показало, что к концу вегетации численность их в ризосфере картофеля увеличивалась. При посеве картофеля по картофелю возрастало число микромицетов.

Изучение стимулирующих, ингибирующих и антагонистических свойств 30 выделенных культур микромицетов показало, что большая их часть является антогонистами и ингибиторами роста, и только 11 штаммов обладало стимулирующей активностью. Антагонистическую активность в отношении F.solani и R.solará проявили 13 штаммов, 5 были активны против F.solani и в -против R.solani. У многих микромицетов отмечалась корреляция между ингибирующими свойствами. Среди проверенных культур только 5 штаммов одновременно проявили стимулирующую и антагонистическую активность.

- 32 -

Большинство выделенных микромицетов отнесены к родам Pénicillium, Trichoderma, Mucor и Fusarlum. Наибольшее видовое разнообразие отмечено в фазу созревания клубней и отмирания ботвы.

Существенное значение в характеристике различных анти-фунгальных биопрепаратов имеет изучение их влияния на рост и развитие растений. В этих целях были испытаны антибиотики А-23/791, 1618 и триходермин. Антибиотик 1618 синтезируется культурой S.griseoruber 1618 и его мутантом 306. Антибиотик относится к группе антрациклинонов и представляет собой пир-ромиценон-102-тавромицетин 11, галирубинон С; активен в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также некоторых микромицетов. Он малотоксичен для теплокровных животных, безвреден для растений, легко проникает в семена, накапливается в корнях и листьях.

Испытуемые антибиотики в дозе 200 мкг/мл были использованы для предпосевной обработки клубней картофеля и семян свеклы, а препарат триходермина вносили в почву вместе с навозом в дозе 7-10 млн.спор/г.

Картофель выращивался в специализированном 5-польном севообороте с насыщением картофеля до 40%, многолетних трав - 40% и озимой пшеницы - 10% с соблюдением агротехнических мероприятий, принятых в хозяйстве. Фенологические наблюдения показали, что растения, выросшие из обработанных антибиотиками клубней и в присутствии триходермы опережали по росту и развитию контрольные растения. Обработанные растения имели лучшую всхожесть, что отразилось и на густоте стояния. Наибольшие прибавки в росте получены в вариантах с использованием антибиотика А-23/791 и особенно с триходермином,

Определение сырой массы ботвы и клубней подтвердило благоприятное воздействие микробных препаратов на рост картофеля. Так, масса ботвы уменьшается за вегетацию с 612 до 193 г в контроле и с 690 до 183 г в опытных вариантах. По мере уменьшения массы ботвы увеличивается масса клубней. Средняя масса клубней к концу вегетации составляет 621 и 660 г против 535 г в контроле. Как и в предыдущем опыте лучшие результаты получены с применением антибиотика А-23/791 и триходермина.

- 33 -

Прибавка урожая под влиянием антибиотиков и триходерми-на происходит за счет повышения всхожести растений и ускорения их развития. Так, цветение в опытных вариантах наступало на 5-7 дней раньше чем в контроле. Кроме того, снижалась по-ражаемость фитопатогенными микромицетами, особенно при использовании антибиотика А-23/791 и триходермина.

Антибиотик А-23/791 способствовал получению более высоких урожаев и при выращивании сахарной свеклы. Наилучшие' результаты были получены при замачивании семян в растворе антибиотика в течение 18 часов. Урожайность сахарной свеклы, как и других сельскохозяйственных культур зависит от • типа севооборота, который используется при их возделывании. Поэтому микробные препараты были испытаны в системе севооборотов (табл.12).

Таблица 12

Урожайность сахарной свеклы при различных условиях возделывания

Препараты ! Севооборот, ! предшественники ! Урожайность, . ! ц/га

1 ! 2 ! 3

А-23/791 Бессменный Озимая рожь (2 г.) -сахарная свекла 129 ±5,5 341 ± 12,3

Триходермин Озимая рожь (2г.) -сахарная свекла 220 ±8,3

А-23/791 совместно с триходермином Бессменный Озимая рожь (2г.) -сахарная свекла 164 ±6.8 364 ± 13.5

Контроль Бессменный Озимая рожь (2г.) -сахарная свекла 94 + 4,9 182 ±7,7

- 34 -

Самая низкая урожайность сахарной свеклы наблюдалась нами при бессменном ее культивировании. Однако, даже в этих условиях применение антибиотика и особенно в сочетании с триходермином повышало урожайность с 94 до 129 ц/га (обработка антибиотиком) и 164 ц/га (совместное применение антибиотика и триходермина). Выращивание сахарной свеклы по озимой ржи повышало урожайность до 182 ц/га в контроле и 364 ц/га при совместном воздействии антибиотика и триходермина.

Известно, что на численность и соотношение микробов в почве влияют многие биотические и абиотические факторы. Среди биотических факторов ведущее место принадлежит растениям. Выше были приведены доказательства такого влияния. Обогащение среды продуктами жизнедеятельности микроорганизмов, в частности антибиотиками, или внесение в почву живых культур антагонистов может явиться дополнительным фактором воздействия на почвенную, особенно ризосферную микрофлору.

Предпосевная обработка семян сахарной свеклы антибиотиком А-23/791 оказало незначительное влияние на количество микромицетов в ризосфере растений. В динамике численности микромицетов также как и при выращивании растений из необработанных семян отмечено 2 пика - значительный в период массовых всходов и меньший - в фазу технической спелости,в период смыкания листьев в междурядьях количество их было самым низким. Численность микромицетов в ризосфере колебалась и была равной или несколько уступала контрольным значениям в середине вегетации, но к концу вегетации она была достоверно ниже контроля.

Внесение в почву триходермина оказывало более существенное влияние. Характер изменения численности микромицетов сохранял двуфазность: высокое содержание в начальный период, снижение в фазу 2-3 пар настоящих листьев и вновь повышение во второй половине вегетации и уменьшение в фазу технической спелости. Заметное снижение числа микромицетов в этот период отмечалось и при посеве семян, обработанных антибиотиком А-23/791, в обогащенную триходермином почву.

Микромицеты в ризосфере были представлены видами родов: Pénicillium, Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Alternaria, Botrytis, Mucor, Helmintosporium. Обработка семян антибиотиками не влияла на родовой состав микромицетов. Он изменялся

только в опытах с триходермином. Внесение этого препарата в почву приводило к преимущественному развитию мукоровых микромицетов. Преобладание пенициллов наблюдалось при совместном использовании триходермина и А-23/791. Такой способ воздействия приводил также к возрастанию численности стрептоми-цетов. Среди них было много антагонистов стрептомицетов, что, возможно, и явилось причиной уменьшения разнообразия фитопатогенных микромицетов.

Выделенные стрептомицеты обладали широким спектром действия. Наибольшее число антагонистов обнаружено в отношении видов Fusarium. На ростстимулирующую активность проверено 270 штаммов, из них 256 стимулировали или рост корней проростков пшеницы или рост стеблей, причем число штаммов, стимулирующих рост корней, превосходило таковое, оказывавших воздействие на рост стебля, что весьма важно для развития растений. Стрептомицеты, культуральные жидкости которых ин-гибировали рост корней проростков, были обнаружены главным образом среди серых и аспорогенных культур.

В полевых опытах с применением антибиотика 1618 и. А-23/791, препарата триходермина и пестицида ТМТД на посевах картофеля также проводили анализ различных групп микроорганизмов в динамике роста растений (табл.13). Независимо от характера воздействующих факторов ( биопрепараты или пестициды), численность бактерий во всех вариантах постепенно достигала максимума через 90 дней после обработки препаратами. Наибольшее увеличение численности бактерий наблюдалось в варианте, где применялась комбинация антибиотиков (от 1,4 до 23,2млн/г) и препарата триходермина без ТМТД (от 10,3 до 29,0 млн/г).

Численность стрептомицетов в вариантах с применением антибиотиков в первый период существенно увеличивалась (6,2 и 7,5 млн/г), а к концу вегетации, наоборот, резко снижалась (1,2 млн/г). Внесение биопрепарата в почву обуславливало интенсивное развитие микромицетов, а также обогащало видовой состав микрофлоры.

Численность микромицетов в варианте с триходермином постепенно увеличивалась и достигало максимума в конце опыта (4, 7 млн/г).

Таблица 13

Влияние пестицида, антибиотиков и триходермина на численность сапрофитных микроорганизмов в динамике роста картофеля (млн./г абсолютно сухой почвы)

Препараты Бактерии Стрептомицеты Микрэмицеты

Время от начала опыта, дни

7 21 45 90 7 21 45 90 7 21 45 90

ТМТД 6,6 7,0 8,0 9,2 0,7 1,0 1,4 0,4 1,71 0,92 1,33 1,7

Антибиотик 1618 4,4 5,6 10,4 11,8 1,8 6,2 5,8 2,6 0,51 0,55 1,00 1,4

Антибиотик 1618 + 1,4 5,5 15,4 23,2 2,4 4,4 5,4 1,2 0,51 0,95 1,05 1,6

А-23/791

ТМТД + триходермин 7,0 8,6 14,4 16,6 2,0 7,5 8,0 1,4 0,92 1,55 1,6 2,1

Триходермин 10,3 25,1 32,9 29,0 1,9 6,4 7,3 2,0 0,84 3,20 4,10 4,7

А-23/791 4,1 5,3 10,1 11,6 1,6 6,5 5,4 1,9 0,45 0,49 0,92 1,1

"СО №

- 37 -

Таким образом, применение антибиотиков и препарата три-ходермина существенно стимулирует размножение всех групп почвенных микроорганизмов: в начальный период - стрептомице-тов, в конце - бактерий и микромицетов . Высокая численность отмечалась нами при применении антибиотика А-23/791 совместно с антибиотиком 1618 и триходермина.

ПРИМЕНЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ В БИОТЕХНОЛОГИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ В условиях интенсификации сельскохозяйственного производства важное значение приобретает развитие эффективных методов биотехнологии, направленных на получение оздоровленных, свободных от фитопатогенов растений. В настоящее время эти технологии наиболее широко применяются при организации первичного семеноводства картофеля.

Система оздоровления включает ряд основных этапов: получение асептической культуры апикальных меристем и регенерация пробирочных растений; массовое микроклональное размножение пробирочных растений; адаптация пробирочных растений и высадка в грунт; размножение оздоровленных клубней в полевых условиях и получение клонового материала (меристемная элита) .

Хотя данная технология основана на хорошо разработанной методической базе, имеется ряд ограничений, существенно снижающих эффективность ее применения. В первую очередь это касается устойчивости стерильных растений к вторичному заражению фитопатогенами различной природы. Посадки исходного клонового материала в полевых условиях подвержены различным заболеваниям. что нередко приводит к их массовой гибели или снижению качества урожая клубней.

В связи с вышеизложенным, нами был проведен цикл работ по получению пздоровленного посадочного материала картофеля методами биотехнологии и изучению влияния микробиологических препаратов на устойчивость оздоровленных растений в полевых условиях.

Технология получения свободных от фитопатогенов растений картофеля основана на методах культивирования апикальных меристем и микроклоналыюго размножения. Известно, что апи-

кальные меристематические ткани, как правило, не содержат инфекционных агентов и способны регенерировать нормальные растения в условиях in vitro.

При получении оздоровленных растений картофеля мы использовали традиционную схему. Однако при выполнении ряда этапов были внесены собственные модификации, касающиеся состава питательной среды и условий выращивания. На стадии регенерации пробирочных растений выделенные фрагменты мерис-темных клеток культивировали, в отличие от принятого метода, на питательных средах двух типов - без регуляторов роста и с фитогормонами. Кроме того была усовершенствована процедура микрочеренкования, позволяющая получать пробирочные растения с хорошо развитой корневой системой jí крепким стеблем. Данные модификации позволили сократить сроки формирования пробирочных растений и увеличить их выход.

В последние годы было предложено использовать в качестве исходного посадочного материала не пробирочные растения, а микроклубни, образованные в условиях in vitro . Получение жизнеспособных микроклубней непосредственно в пробирках позволяет избежать проблем адаптации пробирочных растений к полевым условиям и ускорить процесс получения товарного картофеля. Однако недостатком этого метода является низкая эффективность клубнеобразования in vi tro.Все это стимулирует повышенный интерес исследователей к этой проблеме.

В полевых условиях главными факторами внешней среды, обусловливающими клубнеобразование, являются длина дня и температура. Однако, существует мнение, что в условиях in vitro эти процессы относительно независимы от фотопериода. В наших исследованиях обнаружено, что сокращение светового дня и снижение интенсивности освещения приводит к усилению клуб-необразования в культуре тканей картофеля сортов Мурманский и Гатчинский.

Значительное влияние на процессы клубнеобразования оказывают компоненты питательной среды. Согласно современным представлениям, в процессе клубнеобразования принимают участие вся гормональная система растений. Изучение влияния различных концентраций фитогормонов, проведенное на 15 вариантах питательной среды показало, что наиболее высокий процент

клубнеобразования наблюдается при содержании гиббереловой кислоты 0,3 мг/л и БАП - 1,0 мг/л. Важное значение в процессе формирования микроклубней имеет содержание и вид углеводов. При использовании в качестве источника углеводного метаболизма разных концентраций глюкозы (моносахарид), уровень клубнеобразования на пробирочных растениях картофеля колебался от 10 до 80%. Если питательная среда содержала сахарозу (дисахарид), то микроклубни образовывались, в зависимости от концентрации углевода на 50-70% пробирочных растений.

При использовании в качестве источника углеродного питания двух углеводов (сахароза + глюкоза) в суммарной концентрации 8% формирование микроклубней происходило на 57-87% пробирочных растений. Микроклубни, образовавшиеся на среде, содержащей 6-8% углеводов, были значительно крупнее таковых, которые сформировались на среде, содержащей 4% углеводов. Обнаружены значительные колебания по массе микроклубней. Максимальная масса микроклубня составляла 320 мг, в то время как минимальная была равна 69 мг. Средняя масса микроклубней была равна 165,9 мг.

Таким образом, изучение влияния различных концентраций разных форм углеводов, фитогормонов, интенсивности и длительности светового периода показало, что наиболее интенсивное формирование микроклубней происходит на питательных средах, содержащих 8% Сахаров, при содержании гиббереловой кислоты 0,3 мг/л и БАП - 1,0 мг/л и сокращенном световом дне. Максимальный процент клубнеобразования (87,5%) наблюдался при использовании среды Мурасиге-Скуга. обогащенной суммой углеводов - сахарозы и глюкоза (по 4% углевода.)

Одним из обязательных элементов современной интегрированной системы защиты картофеля является использование оздоровленного посадочного материала. Однако первичный семенной материал, полученный биотехнологическими методами, имеет низкую устойчивость к факторам окружающей среды и болезнетворным агентам, что вызывает необходимость применения специальных усиленных мер защиты.включая промежуточное выращивание в условиях теплицы. Очевидно, что подбор необходимых мер защиты должен быть направлен, главным образом, на поиск но-

вых факторов, усиливающих адаптационные способности и иммунитет растений за счет активизации собственных физиологических механизмов.

Исследования, проведенные на производственных посадках картофеля, показали, что используемые нами микробиологические препараты не только подавляли патогенную микрофлору, но и существенно влияли на рост и развитие самих растений. Накопленный материал послужил научно-методической основой для проведения работ по изучению влияния этих препаратов на устойчивость оздоровленных растений картофеля в полевых условиях. Предварительные эксперименты проводились на опытных делянках в ограниченном объеме, а полномаштабный опыт был заложен на территории совхоза "Калининский" Гвардейского района Талдыкорганской области. Наблюдения проводились в течение всего вегетационного периода на протяжении трех полевых сезонов. Опытные участки находились в предгорной впадине на высоте 1370 м над уровнем моря.

Пересадка пробирочных растений в грунт вызывает сильнейший физиологический стресс, нередко приводящий к их гибели. Поэтому перед высадкой растения должны пройти период адаптации к естественным условиям освещения, температуры и влажности. В наших экспериментах растения картофеля сортов Мурманский и Гатчинский выдерживали на воздухе под пленочным укрытием в открытых пробирках, содержащих питательную смесь Кноппа в течение 2-3 суток. В опытных вариантах питательная среда содержала, дополнительно, антибиотики А-23/791 и 1618 в концентрациях 10, 20, 50, 100 и 200 мкг/мл.

Перед высадкой растения извлекали из пробирок, обрабатывали слабым раствором перманганата калия и высаживали в лунки на глубину 8-10 см по схеме 0,7 х 0,25 мкм. Всего было высажено 10000 растений на площади 0,17 га.

Наиболее важными для формирования нормальных растений являются первые этапы вегетации включающие период от посадки до цветения. Эффект действия антибиотиков на устойчивость пробирочных растений на этом этапе оценивался по двум показателям - количеству погибших растений и динамике появления новых побегов и листьев (табл.14).

Таблица 14

Влияние антибиотиков А-23/791 и 1618 на выживаемость оздоровленных растений картофеля в полевых условиях

Варианты!Кон-ция! Кол-во !Кол-во растений с новыми! Кол-во опытов !антиб-в!погибших! листьями,% !выживших ! мкг/мл!растений!------------------------'.растений, ! ! % !5 дней !10 дней!15 дней ! %

сорт Гатчинский

Контроль 0 40 10 26 60 60

Антибиотик 10 25 30 65 77 77

А-23/791 20 18 40 77 82 82

+ 1618 50 5 60 90 95 95

100 10 56 85 90 90

200 32 40 61 68 68

сорт Мурманский

Контроль 0 45 12 25 65 55

Антибиотик 10 23 20 67 77 77

А-23/791 20 15 43 76 85 85

+ 1618 50 7 55 87 93 93

100 10 52 84 90 90

200 25 35 47 75 75

Результаты исследований показали, что число погибших растений в контроле у обоих сортов достигает 40-45%. Следует отметить также, что более половины этих растений погибает уже в первую неделю после высадки. Обработка пробирочных растений антибиотиками существенно снижает этот показатель. Сравнительный анализ активности используемых препаратов показал, что, независимо от сорта картофеля, наиболее эффективной является обработка смесью антибиотиков А-23/791 и 1618. При этом доля погибших растений составляет в среднем для обоих сортов 5-32%, а при раздельной обработке - 16-36% (А-23/791 - 22-36%; 1618 - 16-33%).

- 42 -

Степень влияния микробных препаратов зависит и от используемой концентрации. Наиболее оптимальной во всех вариантах является доза 50-100 мкг/мл. В этом случае доля погибших растений составляет для А-23/791 - 22-27%, 1618 - 16-20% и (А-23/791 + 1618) - 5-10%.*Увеличение концентрации антибиотиков до 200 мкг/мл снижает эффективность их действия, а доля погибших растений увеличивается до 36%.

Общее число выживших растений через 14-15 дней после высадки составляло в контроле 55-60%, а после обработки антибиотиками в дозе 50-100 мкг/мл достигает для А-23/791 -73-78%, 1618 - 80-84% и (А-23/791+1618) - 90-95%. Эффективность действия препаратов не зависела от сортовых различий.

Важным показателем степени приживаемости и жизнеспособности растений является срок появления новых побегов и листьев. В наших экспериментах массовое появление новых листьев у контрольных растений наблюдалось только в середине и конце второй недели после высадки. В то же время после обработки антибиотиками (50-100 мкг/мл) уже на 10 день 68-85% растений проявило способность к новому росту. Наибольшая активация наблюдалась при использовании смеси антибиотиков, в этом случае образование новых листьев происходило на 5 день наблюдений у 56%, а на 10 день у 85% растений.

Таким образом, предпосадочная "обработка пробирочных растений картофеля сорта Гатчинский и Мурманский антибиотиками А-23/791 и 1618 значительно повышает их выживаемость. Использование наиболее оптимальных способов обработки позволяет увеличить средние значения выживаемости на 30-32%. Анализ динамики появления новых листьев у контрольных и опытных растений показал, что используемые препараты способны эффективно стимулировать рост растений. При наиболее оптимальных условиях обработки скорость роста повышается в 2-2,5 раза.

ВЫВОДЫ

1. Определен количественный и качественный состав мик-ромицетов в окультуренных почвах юго-востока Казахстана при возделывании картофеля, сахарной свеклы и огурцов. Наибольшее разнообразие микромицетов выявлено в почвах и ризосфере картофеля и сахарной свеклы ( соответственно 854 и 912

штаммов),отнесенных к 30 родам и 47 видам. В численном отношении преобладали роды Penicilllum, Aspergillus, Fusarium, Trichoderma, Rhlzoctonia, Ascochyta, РПогаа и Botrytis.

Из пораженных гнилью огурцов и субстрата гидропонной теплицы преимущественно выделялись микромицеты рода Fusarium (79,9 - 90,7%), которые оказались высокопатогенными для ве-гетирующих растений.

2. Из различных типов почвы изолировано 918 культур стрептомицетов, среди которых отобран высокоактивный Strep-tomyces roseoflavus Aral штамм A-23/791, синтезирующий новый карбонил-коньюгированный пентаеновый антибиотик А-23/791 с широким антифунгальным спектром действия. На основе селекции из вторичных колоний Str.roseoflavus Aral А-23/791 получен вариант 4-76 с биологической активностью до 6000 ед. /мг.

3. Применение антибиотика А-23/791 в концентрации 50 мкг/л и 18 часовой экспозиции в лабораторных и полевых условиях обеспечивало эффективную защиту растений огурцов, сахарной свеклы и картофеля от патогенных микромицетов, а также стимулировало рост проростков на 25-30%.

4. Установлено изменение соотношения фитотоксических, стимулирующих и антагонистических форм микромицетов в ризосфере сахарной свеклы в течение вегетационного периода в зависимости от севооборота.

При 2-польном севообороте (предшественник - озимая пшеница) происходило увеличенйе всех форм микромицетов от 38,2 тыс.кл./г в начале до 80,0 тыс.кл./г почвы к концу вегетации. Включение в 9-польный севооборот бобовых и злаковых резко снижало общую численность микромицетов до 20.0 тыс.кл./г почвы, но при этом доля фитотоксичных форм возрастала (18,9-43,1%), а антагонистов - уменьшалась ( 43,0 -18, 3%).

5. В результате испытаний ряда пестицидов выявлено ин-гибирующее действие ТМТД и Ф-319 на рост стрептомицетов и микромицетов в лабораторных и полевых условиях. Нетоксичные штаммы микромицетов при длительном культивировании в присутствии малых доз пестицидов (ТМТД 0,01%) вызывали индукцию токсинообразования.

- 44 -

6. Разработан и внедрен в производство новый способ получения препарата триходермина на основе мутантного штамма 889 Trichoderma lignorum применительно к местным условиям. Рекомендованы к использованию в качестве субстрата ячменная солома и перепревший навоз с соломой, позволяющие получать до 301-342 млн.спор/г.

7. Предложен для производственных структур интегрированный метод защиты картофеля и сахарной свеклы на основе применения в процессе.вегетации антибиотиков А-23/791, 1618, препарата триходермина и пестицида ТМТД. Использование этого метода позволило снизить поражаемость растений и корне-, клубнеплодов патогенными микромицетами на 90-95% и повысить урожайность сахарной свеклы и картофеля на 20%.

8. Методом апикальных меристем выделен вегетативный клон оздоровленных пробирочных растений картофеля. Определены оптимальные условия (освещенность, соотношение фитогормо-нов, типы и концентарции Сахаров) процесса клубнеобразования in vitro. Получен исходный оздоровленный посадочный материал картофеля сорта Гатчинский и Мурманский, свободный от фито-патогенных агентов.

9. Установлено, что обработка пробирочных растений картофеля антибиотиками А-23/791 и 1618 в концентрации 50-100 мкг/мл увеличивала их приживаемость в открытом грунте на 30-35%. Применение комплекса микробиологических препаратов позволило получать за один вегетационный период до 93-98% здоровых растений.

ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТЫ: ' 1. Причины преждевременного увядания огурцов при возде-

■ лывании их гидропонным способом // Тр. Ин-та микробиол. и вирусол. АН КазССР.. - Алма-Ата, 1969. - Т.XII. - С. 90-99.

2. Гидропоника.- Алма-Ата: Кайнар,1972.- 98 с.

3. Стрептомицеты-антагонисты возбудителей грибных болезней огурцов //Тр. Ин-та микробиол. и вирусол. АН КазССР.-Алма-Ата,1974.- Т.XIX.- С.48-58. В соавтор.

4. Условия биосинтеза некоторыми стрептомицетами-анта-гонистами грибов рода Fusarium //Тр.Ин-та микробиол. и вирусол. АН Каз ССР, - Алма-Ата,1974,- Т.XIX.- С. 63-72.

- 45 -

5. Антибиотик А-23/791 в борьбе с фузариозным увяданием огурцов при гидропонном методе выращивания // Труды Каз. НИИ защиты растений.- Алма-Ата, 1974.- Т.2.- С.22-27.

6. Streptomyces roseoflavus Arai,А-23/791 в борьбе с корневой гнилью огурцов в гидропонных условиях возделывания // Диссертация...канд.биол. наук. - Алма-Ата, 1975,- 144с.

7. Штамм Streptomyces roseoflavus Arai-1951 продуцент антибиотика А-23/791 // A.c. СССР N 499294 от 22.09.75; опубл. в Б.и.СССР.- 1976.- С.85. В соавтор.

8. Перспективы применения антибиотиков в растениеводстве // Вестник с/х науки Казахстана.- Алма-Ата. 1977,- N6,-С. 19-31. В соавтор.

9. Влияние различных доз и экспозиций воздействия антибиотика А-23/791 на всхожесть семян и рост проростков огурцов // Тр.Ин-та микробиол. и вирусол. АН КазССР.- Алма-Ата. 1977,- Т.ХХП.- С.92-101.

10. Изучение противогрибковых свойств антибиотика, образуемого Str. roseoflavus Aral шт. А-23/791 // Тр. Ин-та микробиол. И вирусол. АН КазССР. - Алма-Ата, 1977. - Т.ХХП. -С.127-137. В соавтор.

И. Новый стрептомицет-продуцент антибиотика для растений // Вестник АН КазССР.- 1978,- N3.- С.16-33. В соавтор.

12. Применение антибиотиков А-23/791 и 1618 в растениеводстве // Тр.НИИ защиты растений,- Алма-Ата, 1978,- Т.XXV.-С. 100- ИЗ. В соавтор.

13. Использование антибиотиков в повышении урожайности овощных культур // Рукопись, депонир. в ВИНИТИ.-1980.- N И (109).- С.55-58.

14. Микробные метаболиты для повышения урожайности растений // Вестник АН КазССР,- 1980,- N6.- С. 42-48.

15. Жизнеспособность Str. roseoflavus Arai,А-23/791 -продуцента антибиотика А-23/791 при некоторых методах хранения // Известия АН КазССР,сер. биол. - 1980,- Мб, - С. 48-60. В соавтор.

16. Штамм 4-76 Str.roseoflavus Arai 1952 - продуцент антибиотика А-23/791 // A.c. СССР N744033 от 10.10.79,-Опубл.в Б. и, - 1980.- N24.- С.94-95. В соавтор.

- 46 -

17. Влияние антибиотиков на повышение урожайности пшеницы юга Казахстана // Рукопись, депонир. в ВИНИТИ.- 1981.-N 24." 1980.- С.39-43. В соавтор.

18. Роль антимикробных метаболитов в повышении урожайности растений.- Алма-Ата:Наука, 1981.- 195 с. В соавтор.

19. Изучение микробов, выделенных из ризосферы огурцов в закрытом грунте // Тр. Ин-та микробиол. и вирусол. АН КазССР. - Алма-Ата: Наука, 1982. - T. XXVII.- С. 88-105. В соавтор.

20. Изучение влияния противогрибкового антибиотика А-23/791 на количественный состав микрофлоры огурцов в почвенных и гидропонных условиях // Рукопись депонир. в ВИНИТИ. - 1982.- И 3334-82.- С.63-67.

21. Качественные изменения микрофлоры огурцов при обработке их антибиотиком А-23/791 в почвенных и гидропонных условиях //Рукопись депонир. в ВИНИТИ.-1982.-N3334-83.-С.81-85.

22. Препарат триходермин и его использование в борьбе с корневой гнилью на различных культурах // Тр.респуб. станции защиты раст. - Алма-Ата, 1982. - С. 31-33.

23. Стрептомицеты-антагонисты из ризосферы сахарной свеклы на юге Казахстана // Труды ВНИИ изыскания новых антибиотиков.- Москва,1982,- С.47-50. В соавтор.

24. Эффективность препарата триходермина в борьбе с корневой гнилью огурцов в закрытом 'грунте // Защита растений.- 1983,- Т.5,- С.36-37. В соавтор.

25. Количественное и качественное изменение микрофлоры при различной насыщенности севооборота сахарной свеклой // Изв. АН КазССР, сер.биол.- 1984.- N6.- С.31-36. В соавтор.

26. Продуктивность сахарной свеклы в зависимости от предшественников и бессменного возделывания // Тр.Ин-та микробиол. и вирусол.АН КазССР.-1986.-Т. 30.-С.55-60. В соавтор.

27. Сельскохозяйственная микробиология.- Алма-Ата: Кай-нар, 1987,- 198 с.

28. Методические указания по сельскохозяйственной биотехнологии растений.-Алма-Ата:КазСХИ,1988,- 49 с. В соавтор.

29. Практикум по физиологии растении (учебное пособие). -Алма-Ата:МСХ PK, 1993.- 62 с. В соавтор.

30. Индукция процессов клубнеобразования в культуре тканей картофеля // Рукопись депонир. в КазГосИНТИ. - 1993. -N4239-Ka93.- 13 с. В соавтор.

- 47 -

31. Оптимизация каллусогенеза в культуре тканей картофеля// Известия HAH РК, сер. биол.-1995. -N 2.-С. 6-8.В соавтор.

32. Получение оздоровленного посадочного материала картофеля методом культуры апикальных меристем // Рукопись де-понир. в КазГосИНТИ.- 1993.- N 4205-Ка93.- 18 с. В соавтор.

33. Использование микробиологических методов защиты растений в условиях индустриальной технологии возделывания картофеля // Turk devletlerl arasinda 2. Umi isbirligl konferansi.- 1993.- C.61-62.

34. Сельскохозяйственная микробиология,- Алма-Ата:ВШм,

1994.- 285 с.

35. Практикум по биотехнологии растений.- Алма-Ата,

1995,- 53 с. В соавтор.

36. Практические занятия по микробиологии (учебник для вузов РК на каз.языке).- Алматы:Б1л1м, 1995.- 125 с. В соавтор.

37. Экологические основы применения микробиологических средств защиты растений (монография).- Алматы:Республиканский издательский центр МСХ РК, 1995,- 233 с.

38. Рекомендация по борьбе о болезнями и вредителями растений сахарной свеклы в республике.- Алматы: Картпредпри-ятия МСХ РК, 1995,- 26 с. В соавтор.

39. Рекомендация по борьбе с болезнями, вредителями и сорняками картофеля в юго-восточном Казахстане,- Алматы:Кар-тпредприятие МСХ РК, 1995,- 23 с.

40. Биогенд! элементтер. -Алматы,1995.-111 б. В соавтор.

Кулдыбаев Мэлс Мукатайулы

" Кант кызылшасы мен картоптьщ тамыр аймагындагы ауру коздыргыш микроорганизмдердщ сан мелшерщ реттеудщ микробиологиялык непздерГ.

ТУЖЫРЫМ

Бул жумыста кызылша мен картоп eciMfliicrepiHiH ауру коздыргыш микромицеттерш (микроскоптык жтше саныраукулактарын) зерттеумен катар, оган карсы биологиялык жолмен куресу мэселелер! карастырылган. Кант кызылшасы мен картоптьщ ecyi барысында олардьщ тамыр аймагындыгы топырактан микробиологиялык жолмен бшмп алынган ауру коздыргыш микромицеттердщ биологиялык ерекшел1ктер1 зерттелген. Эртурл! топырак типтержен бел in алынган антагонистер ауру коздыргыш микромицеттердщ кебекине карсы багытта колданылган. Антагонистердщ ¡илндеп А-23/791 стрептомицет! тузген антибиотикт-! осы максатта пайдалану меселеЫ шешшген.

Триходермин препаратын шаруашылык жагадайында алу меселеЫ уйымдастырылган.

Антибиотик пен триходерминд1 коса колдану нетижес1нде кант кызылшасы мен картоптьщ дурыс ecyiH камтамасыз етт, олардан жогары ен1м алу мумюндИ делелденген.

Kouldybayev Mels Moukhatayevich

The microbiological principles of regulation of phytopathogenic microorganisms quantity in the rhizosphere of sugar-beet and potato.

S UMMARY

The results of study of phytopathogenic micromycetes of sugar-beet and potato and methods of biological fighting against them haven been described in this research. The biological qualities of micromycetes which haven been isolated from soil and rhizosphere of sugar-beet and potato haven been studied during the vegetative period. In order to suppress the phytopathogenic micromycetes growth, antagonists isolated from varions types of soils, haven been used.

It was solved the problem of utilization of antibiotic which produced by one of them, the streptomycet A-23/791.

It was elaborated the method of trichodermine receipt in the conditions of farms.