Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МЕТОДЫ IN VITRO В СЕЛЕКЦИИ ОГУРЦА {CUCUMIS SATWUS L.) НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ФУЗАРИОЗУ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "МЕТОДЫ IN VITRO В СЕЛЕКЦИИ ОГУРЦА {CUCUMIS SATWUS L.) НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ФУЗАРИОЗУ"

# - з cm

На правах рукописи УДК 635-152:6^5.63.631.147

ТКАЧЕВА Анна Анатольевна

dfr

МЕТОДЫ IN VITRO В СЕЛЕКЦИИ ОГУРЦА {CUCUMIS SA TIVUS L.) НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ФУ ЗАРИ ОЗУ

Специальности: 06.01.05 - селекция и семеноводство 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соисканий ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва - 2007

Работа выполнена 8 Государственном научном учреждении Всероссийский

К о/Ч ¡С СмСДОВ иТСЛ ^СкИп мНСТгГГуТ ОБищСиОДСТои ГОСС ь Л Ь^ ОЗиК^ДСии п н в

2002-2006 гг. Научный руководитель:

доктор биологических наук, Поляков

старший научный сотрудник Алексей Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ

доктор биологических наук, профессор

Примак Алексей Павлович

Калашников« Елен»Анатольевна

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно - исследова

тельскнй институт селекции и семеноводства овощных культур

Защита диссертации состоится «_25 » января 2007 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.022.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте овощеводства по адресу: 140153 Московская обл., Раменский район, д, Верея, строение 500, ГНУ ВНИИО РАСХН.

Факс (49646) 2-43-64

E-mail: vniio@trancom.ru. www.vniio.com

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института овощеводства.

Автореферат разослан — декабря 2006 года

Ученый секретарь

диссертационного совета «"у 1 Л.Н.Прянишникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из важных направлений селекции является создание форм, сортов и гибридов растений, устойчивых к биотическим факторам. Это обусловлено большими потерями урожая сельскохозяйственных растений, вызванными поражением их грибными, бактериальными, вирусными болезнями к повреждением вредителями. Снижение урожайности сельскохозяйственных культур до 30% является следствием широко распространенного и вредоносного заболеваяия-фузариоз (Коновалов Ю.Б., 1999). Наиболее перспективным способом зашиты растений от фитопатогенов является селекция, создание комплексно устойчивых сельскохозяйственных культур. Однако продолжительность периода создания сортов и гибридов достигает 10 н более лет, при этом часто степень устойчивости растений к вредным организмам является недостаточной н далеко не всегда отвечает требованиям производства (Калашникова Е.А^ 2003).

Решение большинства практических задач селекции во многом может определяться эффективностью вовлечения современных методов в селекционный процесс. Значительное место в решении этих задач занимает клеточная селекция, основанная на отборе клеточных популяций, устойчивых к селективному фактору, и регенерации из них растений (Поляков A.B., 2003; Калашникова Е.А., 2003).

При использовании методов клеточной селекции в нашей стране и за рубежом достигнуты значительные результаты: созданы устойчивые линии люцерны (Мезенцева О.Н., 1992) и льна (Поляков A.B., 2000; Пролетова Н.В., Поляков A.B., 2003) к фузариозу; томатов (Нгусн Х.М., 199]) и моркови (Калашникова Е.А., И патова Н.В., 2004) к альтернарнозу; картофеля - к фитоф-торозу и бактериальной гнили (Калашникова ЕЛ., 2000). Благодаря достижениям клеточной селекции стало возможным получение in vitro растений— регене рантов с измененными признаками, среди которых-селекционер может отобрать устойчивые к болезням формы и при этом сохранить положительные черты исходного образца (Бутеико Р.Г., 1999). Однако, несмотря на определенные успехи, имеющиеся в селекции огурца, до настоящего времени не созданы сорта и гибриды, устойчивые к фузариозному увяданию, В связи с этим необходимо шире использовать в селекционном процессе методы in vüro.

Цель Ii задачи исследований

Цепью исследований являлось усовершенствование методов in vitro применительно к культуре огурца доя повышения эффективности селекционного процесса этой культуры и ссгдания форм, характеризующихся повышенной устойчивостью к

фузарнозу.

РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева ЦКБ кмекн В.И, г

Дня достижения поставленном цели необходимо было решить следующие задачи:

- оптимизировать факторы, влияющие на морфогенетическую способность экстшангов огурца;

• разработать селективные условия для создания in vitro тканевых культур, устойчивых к фильтрату культуральной жидкости (ф.к.ж.) гриба Fmar'tum са-yspomm и фуээриевой кислоте (ф.к.);

- усовершенствовать элементы методики экспресс-оценки огурца на устойчивость к фузариозу, основанные на проращивании семян на ф.к.ж. гриба F. axysporum и культивировании проростков in viiro на селективных средах, содержащих ф.к.ж. гриба F. axysporum;

- оценить полученные от гибридов и линий формы огурца на устойчивость к фузариозу на искусственном инфекционном фоне с использованием традиционных методов.

Объект исследований - методы культуры ткани и органов в селекции огурца и метады селекции на устойчивость к фузариозу.

Предмет исследований - каллус, почки, побеги, сегменты растений, растения — регенераты, семена огурца.

Научная новизна. Усовершенствована методика экспресс-оценки огурца на устойчивость к фузариозу, основанная на культивировании семян и растений на ф.юк. и селективной среде, содержащей ф.кж. гриба F. axysporum в концентрации 10% в условиях in vitro, позволяющая в течение 12 и 14 суток оценить селекционный материал и вылетать образцы с повышенной устойчивостью к фузариозу.

Усовершенствован метод клеточной селекции in vi&o, основанный на ступенчатом культивировании жеплакго» и транеитаншв огурш на селективной среде, содержащей ф.кж гриба F. axysporum в концентращги J0% и на среде без селективного фактора, позволяющий получать каллусныс лини» растения огурна с повышенной устойчивое] ыо к фнтопатогену.

01ггпмизированы условия получения растеннй-регенерантов огурца. Подобран режимы стерилизации семян и сегментов растений для введения в культуру in vitro. Определено соотношение фитогормонов в питательной среде для культивирования эксплантов и трансплантов.

Практическая ценность работы состоит в том, что оптимизирован процесс получения растений — регенератов огурца in viiro на основе верхушечных почек, ш-покотилъных сегментов и каллуса. Получены расгення - регенераты, характеризующиеся повышенной устойчивостью к фузариозу. Разработаны и опубликованы методические рекомендации «Получение растений огурца с повышенной устойчивостью к фузарнозному увяд анию методами in vitro» (2006 г.).

Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все вьшеды

и предложи ни подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой подученных данных,

Лпробаа:!Я рабспл. Осиогкыс результаты ¿hù 1сримсн1альнои работы по днссерташш, выводы и прелложеюя были дагкхмгны или представлены на Ш Международной конференции, посвященной памяти Б.В, Квасникова (Москва, 2003). Международной научно—практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных ti малораспространен ных культура (Москва, 2004), Международной научно-практической конференции «Проблемы научного обеспечения овощеводства юга России» (Краснодар, 2004), Ш Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние н перспективы развития» (Москва, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения бшразнооб-радия растительного мира» (Волгоград, 2006).

Основные положения диссертации, выносимые на зашит

- элементы технологии получения растений-регенерантов огурца в условиях

in vitro;

- система селективных условий для создания in vitro тканевых культур, устойчивых кф.к.ж. гриба F. oxysporum if ф.к.;

- усовершенствованный метод экспресс-оценки огурца на устойчивость к фу-зариозу.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, выводов, предложений для использования в селекционной практике, списка использованной литературы, содержащего 155 наименовании, в том числе 37 иностранных авторов и приложений.

Диссертационная работа изложена на 133 страницах машинописного текста., шинострирована 22 таблицами, 20 рисунками.

УСЛОВИЯ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили в тепличном грунтовом боксе «Селекцентра» и в условиях отдела биотехнологии ГНУ ВНИИО, расположенном в Раменском районе Московской области в период 2002 -2006 гт,

В качестве исходного материала использовали 12 образцов огурца селекции ГНУ ВНИИО, характеризующиеся различной полевой устойчивостью к фузариозу: высокоустойчивые - гибриды F, Натали, Норд, Тополек; среднеустойчнвые - гибриды F, Восход, Кристалл, Костик, Дуняша, Рябинушка; слабоустойчивые ■ гибрид Pi Зодиак; срелнеустойчивые линии: Л-138, JI-340 и восприимчивая линия JI-113. Семена образцов огурца были

предоставлены заведующей лабораторией тыквенных культур отдела селекции ГНУ ВНИИО, кандидатом с.-х. наук Н,К. Бирюковой.

Лабораторные исследования проводили в соответствии с «Методическими указаниями по культуре ткани и органов в селекции растений» (Бутен-коР.Г., 1964; Бута г ко Р. Г., Хромова Л. М., СеднииаГ.А., 1984).

Сслешиго на устойчивость к фузаркозу проводили согласно мегемихе, описанной в статъе<<Разрзботка способа предварительной оиенкн растений огурца на устойчивость к фузариозу» (Настенш Н.В., Шмыкоеа НА., Балашова Н.Н., К'ушиерева

вл, ¡ту

8 опытах использовали питательную среду М5 (МигазЬ^е Т., Бкоо$ Р., 1962), состав которой изменялся в зависимости от этапа культивирования.

В качестве селективного фактора использовали ф.к. и ф.к.ж. гриб» Р. ахузрогит, Длительное культивирование гриба К охузрогит осуществляли на агар изо ванной среде Чапека при температуре 4°С. Ф.к.ж. получали путем культивкроваиия гриба в течение 30 суток на жидкой питательной среде Чапека при темперапуре 25°С.

Математическую обработку экспериментальных данных проводили на основе методов математической статистики по методикам, опубликованным у Б.А. Доспехова (1979).

Дисперсионный и регрессионный анализы проводили на ПЭВМ с использованием пакета программ БИОСТАТ и ЕСХЕЬ 7,0.

Суммарное содержание фенольных соединений в растениях огурца, определяли в соответствии с «Колориметрическим методом с использованием реактива Фолина-Дениса» (Запрометов М.Н., 1974).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1, Оптимизации факторов, влияющих на морфотенетическую способность экешишя о гурда

1.1. Стерилизация семян и сегментов растений огурца для введения в культуру (п гИго

Стерилизация необход има для удаления с поверхности семян и сегментов ве* гетирующих растений инфекции, которая может развиться при дальнейшем культивировании экегшантов т и'Пт» н вызвать поражение и гибель растительного материала В связи с згим цель данного этапа - получение стерильных проростков и экшлаигов.

Проведенные исследования позволит! подобрать режим стерилизации. Наибольшее число стерильных морфогенньк проростков (86,7% от чиста культивируемых) было получено при стерилизации семян рагтвором гипохлор»па натрия в концентрации 1% иэкепшнши 15 млнфис. I).

Исследования по изучению режимов стерилизации сегмектов вегетируюших растений огурца 1% - ным раствором гипохлорта натрия втечение 10,15,20 и 25 ми-

ityr показали, что намоошиим выход стерильных морфогениьк окспланпи» (70,0%) наблюдался посте 10-минупюго воздействия стсркнаующим веществом (рис, 2).

Ю 15 20 30 ЭкопоаициИ) минут

PJ СТСрЧЛЬМЫК Л С ТС rjnnhMWJK Н№*0£>фОГ&>4НЫХ О 'И' OHMW**

Рис. I. Стерилизация семян огурца 1% раствором г i то хлорит натрия

з 1с> i ^ го 2S ЭЧ?ПР5ИЧИЧ, мину*

сз стерыльных »лорфчгенных ■■ О viTictMUitponarmux

Ркс. 2. Стерилизация сегментов вотирующих растений огурца 1Чо раствором пшохлорита натрия

1.2. Обоснование выбор» эксплаитпн

Выбор экспланта «грает существенную роль в проведении клеточной селекции. В наших исследования с целью изучения морф ore нети чес кой активности огурца it получения морфо re иного каллуса в качестве эксплантов использовали апикальные почки, семядоли и гипокотильные сегменты.

Проведенные исследования показали, что при культивировании апикальных почек на питательных срезах MS-0 tt MS-0,1 выявлены существенные различия по гсммо — и рнзогенезу. Наибольшее число геммогеиных эксплантов (75%) получено на питательной среде MS-0,1, ризогенных (33,3%) -

на среде М5-0, Культивирование апикальных почек на исследуемых средах приводило к индуцированию шшусогенеза. При пассировании семядолей на питательную среду МБ - 0, морфогенные эксгхланты не образовывались. Однако на питательной среде Мв- 0,1 морфогенез отмечен у 1б,б%эксплантов, При культивировании гипокотнльных сегментов на этих средах наибольшее число каллусогенных эксплантов (47%) образовывалось на среде МЭ-ОЛ, на которой геммогенных эксплакты не образовывались (табл.1).

Таким образом, установлено, что для получения морфоге иного каллуса огурца в качестве первичных эксплантов эффективно использовать ги-н о штильные сегменты.

и. Изучение влияния фитогормонов на мор фогенетн ческу ю активность тканей огурца

Изучение влияния фитогормонов на морфо генетическую способность гилокотильных сегментов огурца проводили с использованием питательной среды МБ, содержащей 30 г/л сахарозы, 7 г/л агара. Гипокотнльные сегменты огурца помещали на питательную среду с различным составом и концентрацией фитогормонов. Уже на 6-7 сутки культивирования на базаль-ной части гипокотнльных сегментов образовывались утолщения в виде разросшихся тканей, на которых в последствии формировалась каллусная ткань от желтоватого и светло-желтого до темно-зеленого цвета.

Таблица 1 - Морфогенез огурца в условиях /я \'Нго

Среда Э«-плакт 11зучено эксплантов, шт. Получено эксплантов. ®о. 1 Яр Число почек на э*сил акт, Хер

всего геммо-геннык риэо-геннык каллусогенных

мз-0* а.п. 24 87,5+6,7 54,2+10,2 333+9.6 0 0.4

с- 36 0 0 0 й 0

г.с. 36 25,0+7,2 0 25.0+7.2 0 0

М5-0,1** а.п. 24 83,3+7,6 8-3+5,6 0 1,«

с. 36 16.6+6,2 а 5.5+5,8 И. 1+5,2 0

т.е. 36 47.2+8,3 10,0+5,0 0 47,2+8.3 0,3

Примечание: а,л- апикальные почки.семядоли, г.с, - гнпоштильние сегменты; * • МЗ-0 -без гормональна« среда; **М5-0,1 - среда, солержаща» 6-ЕАП к а-НУК а конценграцияк 0,1 м г/я

Культивирование эксплантов огурца в условиях Ы уШо в течение 48 суток »а среде МБ, содержащей сахарозу в концентрации 30 г/л, агар~7 г/л и фнгогормоны: б- БАП, а-НУК и 2,4-О в концентрации 0,1 мг/л; а также 2 ¡р в концентрации 0,1 мг/л и 0,25 мг/л позволило получить морфогенный каллус у 11,1% ' 30,6% культивируемых тканей (табл. 2).

Таблица 2 - Морфогенез плокотшьных сегментов огурца в зависимости от концентрации фитогормонов в среде (45 суток культивирования) (число морфогенных -чксплянто«, я =° 36

Гормоны концентрация, мг/л 2,4-Р 0-НУК

0,1 0,5 1 2 0,1 0,5 1

2ц> { 0,1 22,2+6.9 5,513,8 0 0 16,7+6.2 5,3+3.8 2.8+2,7

0,23 30,6+7,7 8,3+4,6 0 0 16,7+6,2 13,9+4,6 11,1¿5.2

о,з 13,9+5,7 5,5+3,8 2,8+2.7 0 13,9+4,6 8,3+4,6 2.8+2.7

6-БАП 0,1 11,1±5^ 2,8+3.7 0 0 25,0+7.2 11.1 ±5.2 2,8+2,7

0,5 8,3-4.6 0 2,8+2.7 0 13,9+4,6 5,5+3,8 11,1+52

1.0 8,3+4,6 2,8+2,7 0 0 1б,7±6,2 19,4 +6,6 8.3У.6

Интенсивное образование морфогениого каллуса (75 - 100%) наблюдалось на трансплантах всех изученных образцов на среде содержащей 6-БЛП в концентрации 0,1 мг/л и «-НУК - 0,1 мг/л. При культивирован»« на среде, содержащей б-БАП в концентрации 0,1 мг/л и 2,4 Д - 0,1мг/л; а~ НУК- 0,1мг/л и 2 ¡р—0,5 мг/л; 2 ¡р - 0,25 мг/л число трансплантов, образующих морфогенный каллус не превышало 50% (табл. 3).

ТайлицаЗ - Морфогенез огурца при кудьтнвнрошнии шлокошльньк ссгментов на среде М5 с различным содержать фотогормонов, п = 160

Люшя, гиб-риаР, Концентрация фнто гормонов Число транаикшоа обра-туюпв« мирфо|НшыП каллус

шт. %+кр

Натали ¿-¿А И - 0,1чг/л+д-НУК - 0,1 мг/л 120 75.0+Д4

6-БА11 - I ж/я + 2.4 Д- 0.1 мг/л 40 25,0+3.4

о-НУК—0,1 мпГл +2 р-0^мг/л 50 313+3,6

2 ¡р-(Х25 мг/п+2,4 Д - 1 мг/1т 60 37.5+3,8

Восход Р| 6-ЬАП - 0,1 м гМ -Кг-11 УК -ОД /л 140 87,5+2.6

6-ЬАЛ-Оу1мг^л+2.4Д-0,1мгЙ1 40 25,0+3,4

я-НУК-0,1мг/п +2 ¡р-ОЗмгЯ 80 50Д+3,9

21р-025мг/п +2.4 Д-0, 1 мг/л 60 373+3.8

Л-113 6-ЫАП-О, I мг/л+л-Н УК-0.1 Н|/т 160 100

6-БАП- 0,1мг/л +2,4 Д-О.1 мтУл 40 25.0+3.4

1УК-0,1 мг/л+2 гр-О-Змг/л 40 25.0+3.4

2 ¡р-0Л5мг/л+2,4 Д-0,1 мг/л 80 50.0+3,9

Таким образом, для получения хорошо пролифериру ющей морфо-геиной каллусной ткани огу рца необходимо использовать питательную среду МЬ, содержащую 6- БАП и л-НУК в концентрациях 0,1 мг/л.

1.4. Получение растений-регене рантов огурца, укоренение м адаптация к почвенным условиям

С целью повышения укореняемости и эффективности размножения, побеги, полученные на основе эксплантов, переносили ва агар и зеванную питательную среду М5, не содержащую фитогормоны. Через 30 суток регене-ранты образовывали не менее 3-5 настоящих листьев и корней. Культивирование побегов на этой среде позволило получить 60 жизнеспособных регене-рантов, в том числе 18 регенерантов от гибрида Р[ Натали, 22 - гибрида Р, Восход и 20 -линии Л-113 (рис. 3).

t20

Нот»пи Восход П - 1 13 Овряз«ц

Рис, 3. Укстреняемссгь побегов растений огурца на ниппельной среде MS-0

Укорененные побеги адаптировали и пересаживали в сосуды с почвой. Морфологические признаки растений-регенерзнтов в первые дни роста или адаптации отличались от проростков растений данных образцов, полученных из семян, размерами и формой листьев, цветом растений. Однако ко времени цветения все различия нивелировались и растения-регенеранты не отличалась от обычных растений, полученных из семян.

2. Разработка селективных условий для создания in vitro тканевых культур, устойчивых к фильтрату культуральиоП жидкости гриба Г. ак-ysporum и фумрневой кислоте

2.1. Изучение влияния концентрации фильтрата культура л ыюй жидкости гриба F. oxysporum на тканевые культуры orypua in vitro

Основным принципом клеточной селекции является длительное культивирование клеток и тканей в стрессовых условиях. Для исключения

возможности случайного отбора клеток, возникших вследствие физиологической адаптации или определенного их состояния днфферешировки, клетки возвращают в неселективные условия, а затем процесс культивирования каллус вон ткани в селективных условиях возобновляют.

В наших исследованиях изучено влияние различных концентраций ф.кок. гриба F. oxysporum на процесс дел и фференциаии и клеток эксплантов образцов огурца. Первичную каллусную ткань получали от гнпокот ильных сегментов путем культивирования их на оптимизированных нами ранее питательных средах, содержащих ф.к.ж. патогена в концентрациях 2,5%; 5%; 7,5% и 10%.

Исследования, проведенные на каллус ной ткани, полученной от стерильных проростков огурца, выявили общие особенности их поведения, в стрессовых условиях, независимо от применяемой схемы селекции.

Таблица 4 - Морфогенез тканевых культур огурца в условиях ht vitro на среде, содержащей фильтрат культуральиой жидкости F.oxvsporum, п = /00

Концентрация ф.к.ж. % Получено морфогенных трансплантов Получено почек

всего ) вт. ч, с почками всего, шт. вт.ч. на1 эксах.Хср.

шт. % j шт. %

0 95 95-2.2 ( 75 79+4,1 120 1,3

2,5 80 80i4.0 ) 60 75+4,3 105 1,3

5 75 75±43 ! 55 73+4,4 90 1,2

7.5 70 70±4,б | 40 57+4,9 70 1,0

10 35 35-4,7 | 10 28+4,5 30 0,8

По результатам культивирования морфогенного каллуса на селективных средах, содержащих ф.клс. в концентрации 2,5%; 5%; 7,5% и 10% выявлены существенные различия по частоте образования почек и побегов. При этом в вариантах 2,5%; 5,0% и 7,5% ф.к.ж. не было отмечено существенного снижения морфогекетнческой активности каллусных клеток. Интенсивность морфогенеза снижалась более чем в 2 раза при культивировании эксплактов на среде с 10% ф.к.ж. по отношению к вышеперечисленным вариантам среды (табл. 4).

Последующее культивирование каллусной ткани на среде без селективного фактора (2 пассаж) привело к восстановлению пролиферирующей активности каллусных клеток.

При повторном культивировании (3 пасаж) каллусных клеток на среде с ф.к.ж. патогена наблюдалась гибель каллусной ткани и формирование рыхлой обводненной ткани. Присутствие в питательной среде ф.к.ж. гриба в различных концентрациях заметно кнгибировало пролиферацию каллусной

ткани. С повышением концентрации ф.к.ж. уменьшался морфогенез на 2260% (табл. 5).

Таблица 5 - Морфогенез каллусных культур огурца /я vitro на среде, содержащей фильтрат кулыуральной жидкости F. oxysporvm, п ■= 150

Концентрация ф.к.ж. V» Получено морфогениых жа тактов Полу4с1то почек

1 пассаж 2 нас саж 3 пас саж eoavi tc Т.ч. спичками всего, шт. в т. ч. с мочками на I экшя., X ср.

шт. % шг, %

0 0 0 150 100 143 95+1,8 164 1.1

10 69 46+4,1 60 8^2,3 62 0.8

10 0 147 98+U 138 94+1,9 140 i,0

10 111 74+3,6 56 50+4,1 61 0,6

5 0 0 147 95+1,1 HI 95+1,3 148 1,0

10 108 72+3,7 59 41+4.0 64 0,6

10 0 135 90+2,4 128 94+1,9 128 1,0

10 105 70±.».7 90 86±2.8 76 0,7

10 0 0 144 96+{,6 136 94^1,9 146 1,0

10 90 60+4.0 79 87+2.7 80 0,8

10 0 13« 92+2.2 132 95+1,8 143 1,0

10 110 S0+3J 84 70+3,7 S7 0,7

Исследования показали, что получение устойчивых растений-ре ге нерантов следует проводить путем культивировання каллусной ткани на среде М5, содержатся ф.к.ж. в концентрации )0% (табл. 5),

Культивирование каллуса на селективных средах в течение трех пассажей позволило отобрать каллусные линии, устойчивые к ф.к.ж. гриба Р. ох-ухрогит.

2Л. Изучение влияния фузарневоЛ кислоты на морфогенетпческую аюивность тгсмки огурца при культивировании т \itro

Каллусные культуры первого пассажа культивировали на селективных средах, содержащих ф.к. в концентрациях 2,5 мг/л; 5,0 мг/л; 7,5 мг/л и 10 мгУл. Снижение морфогенети ческой активности каллусных клеток происходило при увеличении концентрации ф.к. в среде до 7,5 -10,0 мг/л (табл. 7),

Через 20 суток морфогенный каллус, сформированный на основе га-пакотильных сегментов огурца, переносили на свежую среду без токсина и культивировали в течение 14 суток. Было отмечено, что каялусная ткань, сформированная на селективной среде, чаше всего была неоднородной и со-

стояла из рыхлых, с повышенной оводненностью и плотных структурированных тканей со слабо выраженными меристемати чески ми очагами.

Таблица 6 - Морфогенез тканевых культур огурца in vitro на среде, содержащей фуззриевую кислоту F. axysporum, п = 100

Концентрация ф.к.. % 1 (случено морфогеиных эксплантов Пол учено почек

всего в т.ч. с шимми надч, ЦГГ. в т.ч. на 1 1КСПЛ,, X Ср.

HIT, % !ИТ. %

0 100 юао 90 79±4,1 135 1,4

2А 100 100,0 80 75+4,3 120 U

5 100 100,0 75 73+4.4 95 1,0

7,5 95 95,0±2^ 50 57+4,9 85 0,8

(0 60 60,0±4,9 25 28+4,5 40 0,4

В ходе эксперимента было выявлено, что у эксплантов, культивируемых на питательной среде, содержащей ф.к. в концентрации 10 нг/л наблюдали ннгкбированне морфогенетическо(< активности, что позволило проводить отбор устойчивых клеток н получать на их основе побеги и регене-ранты (табл. б).

Таблица 7 - Влияние фузариевой кислоты F. oxysporum на тканевые культуры ог>риа в третьем пассаже в условиях invtiro, п = ¡50

Концентрация ф.к. % Исяучено морфогенных эксплантов Получен» ночек

t 2 3 всего bt. ч. с тючками всего. в т. ч. на

пас нас нас шт. % шт. % шт. 1 ■желл.*

саж саж саж Хер.

0 0 0 150 100 144 9б±1,6 191 1.4

10 п 52±4.1 65 83±3,1 63 0,8

10 0 J 47 98+U 139 95+1,8 178 1.2

10 114 76+3.5 60 53+4,1 8U 0.7

5 0 0 150 100 143 95+1,8 189 1,4

10 111 74+3,6 62 56+J.1 67 0,6

10 0 144 96+1,6 132 95+1,8 170 1,2

1» 102 68+3,8 58 57+4,0 73 0,7

10 0 0 147 98+1,1 138 94+Г,9 188 1.4

10 99 66+3,8 79 79i3.3 84 0,8

10 0 144 9641,6 132 92+2 J 146 1.0

10 129 sfr+v 114 65+3,9 0,7

Третий пассаж каллуса проводили на селективной среде, содержащей ф,к. в концентрации 10,0мг/л, при этом было отмечено отличие в росте и развитии каллусов, сформированных первоначально на селективной и неселек-тивкой средах. Так, у каллуса, сформированного на селективной среде, при переносе вновь на среду с токсином наблюдали индукцию пролиферации калдусной ткани (табл. 7). В результате исследований было установлено, что при наличии в среде 10,0 мг/л ф.к., наблюдалось снижение морфогенеза.

Используя вышеперечисленные методы, нами были получены формы огурца, характеризующиеся повышенной устойчивостью к фузариозному увяданию, которые в последующем оценивали в условиях искусственного инфекционного фона,

У сове р ше нетвование экспресс—опенки огурт на устойчивость к фузд-риозу

3.1. Усовершенствование экспресс-*щепки огурца на устойчикость к фу-1арнозу, основанной на проряшиваннн семян на фильтрате культураль-ной жидкости гриба Г. охузротт

Существует метод предварительной оценки огурца на устойчивость к корневым гнилям в лабораторных условиях, основанный на проращивании семян на фильтровальной бумаге, смоченной токсином Т - 2 гриба Р, ох-узрогит. Однако этот метод не всегда доступен в связи с трудностями производства этого токсина- Поэтому нами была изучена возможность использования в качестве селективного фактора ф.к.ж. гриба Р. ахузропт при оценке устойчивости огурца к фузаридау.

Таблица 8 - Всхожесть семян и длина первичного корня 5 суточных проростков огурца при культивировании фильтрате культуральной жидкости, п=50

Линия, гибрид Р] Концентрат и ф.кж К аизрадап. % Вэишяо семян Дшшако рнамм

1ВТ. % Хер. %

Нэтали Р1 0 50 100 59,5 100

10 49 93+1.9 17,9 30

50 2 4±17 02 03

100 0 0 0 0

Восход Г( 0 4» 96+2,7 54,6 100

10 46 92+3.3 1» 28£

50 0 0 0 0

100 0 0 0 0

Л - 113 0 46 92+3,8 47,6 100

10 41 Я2+5,4 93

50 1 2+1.9 1 2,1

100 0 0 0 0

В результате проведенных исследований выявлено, чго при проращивании семян всех образцов на ф.к.ж. в концентрациях 50% и 100%, рост кор;;сй был полностью иншоирован. При проращивании семян на 10%-ном автоклавированном ф.к.ж., наблюдалось существенное ннгнбирование прорастания. При этом обнаружены различия в прорастании ссмян разных образцов. У восприимчивой линии Л-113 длина корней была соответственно на 40% н 48% меньше по сравнению с более устойчивыми гибридами F, Восход и Натали (табл. 8),

Наилучшие результаты были получены при проращивании семян огурца на ф.к.ж. гриба F, oxysporunt в концентрации 10%, trro позволило получить селекционный материал с повышенной устойчивостью к фузариозу. Анализ полученных данных свидетельствует о возможности проведения экспресс - оценки огурца на устойчивость к фузариозу при использовании 10%-ного автокпавироваиного ф.к.ж. Предложенный метод является косвенной оценкой образцов на устойчивость к фузариозу и позволяет в лабораторных условиях ускоренно оценить селекционный материал на устойчивость к F. oxysponim и выявить растения огурца с повышенной устойчивостью к этому фитолатогепу.

3.2. Усовершенствование экспрссс-оиснкм огурца на устойчивость к фузариозу, основанной на культивировании проростков in vitro на селективных средах, содержащих фильтрат культу ральной жидкости гриба F. oxysporunt

Для изучения влияния ф.к.ж. на корни растений огурца использовали метод экспресс - оценки на устойчивость к фузариозу, основанный на культивировали» в условиях in vitro проростков на селективных средах, содержащих ф.к.ж. гриба F. oxyspotum в концентрациях 2,5 мг/л; 5,0 мг/л; 7,5 мг/л и 10 мг/л.

В результате проведенных исследований наибольшее число хорошо развитых растений (87,2% и б7,5%) получено при культивировании семян на средах С 2,5% и 5% ф.к.ж., э на средах с 7,5% и 10% ф.к.ж. здоровые растения составили соответственно 51,2% и 42,7%.

Анализ полученных данных свидетельствует о возможности проведения экспресс-оценки огурца на устойчивость к фузариозу при использовании 10%-ного ф.к.ж.

ЗД Оценка огурца на устойчивость к фузариозу на искусственном инфекционном фоне

Растения, полученные в условиях in vitro первоначально оценивали на устойчивость к фузариозу на искусственном инфекционном фоне (опилки) в лаборатор-

ных условиях, затем отобранные »еиболее развитые растения, высаживали в искусственный инфекционный фон, созданный в боксе «Селекцентра» ГНУВНИИО.

На растениях с повышенной устойчивостью проводили опыление методом инцухта. В результате скрещиваний получены семена от растений, выделенных из линий и гибридов от однократного и двукратного отборов.

Таблиш9 -Пораженность сеянцев сяуриа на искусственном инфекционном фоне

(древесные опилки)'

Линия, гибрид Средний балл поражеииялиниП и гибридов

20(0 г. 2004г. 2005 г.

Натали - к. у* 1,1 1,0 1,0

Л-113-к.в." 3,7 3,6 3,6

Рябинушка Р, 2,4 23 23

Рябинушка—1, однократный отбор (Ту - 1,7

Ря6ин>шка-1-3, двукратный отбор (Г3) - - 1,1

ДуияшаР( м 24 23

Дуняша-1 ,оЛ1 нжратний отбор (Гз) - 2.0 1,9

Дуняша-1-2 »двукратный отбор (ЕУ - 1,4'

Примечание: *ку-имкгропь, устойчивый к фуьрнму, **к.а-контроль, поспрннмчкЕМЙ к фузцрнозу

В целях уточнения устойчивости к фузариозу полученньк форм огурца нами была проведена оценка растений, полученных после двукратного отбора Исследования показали, что средний балл поражения снизился с 2,6 до 1,4 (по четырех бальной шкале), следовательно, полученные формы характеризуются повышенной устойчивостью к фузариозу (табл. 9).

Селекция огуриа на устойчивость к бшгезням должна, на наш взгляд, вестись ступенчато, т. е. путем постепенного придания селекционному материалу устойчивости к фитопатогену с формированием иммунитета.

3.4. Коэффициенты корреляции признаков при сравнительной оценке устойчивости огурца к фузариозу

Для определения корреляционных связей анализировали средние показатели признаков гибридов Р| и форм огурца, полученных от однократного н двукратного отборов на ф.юэк., используемом в концентрации 10%.

Анализ полученных данных показал, что устойчивость растений огурца, полученых при оценке на инфекционном фоне положительно коррелирует с устойчивостью растений на инфекционном фоне в тепличном грунтовом боксе (г = 0,961), а также с длиной корней растений, полученных при проращивании семян на среде с ф.к.ж. в концентрации 10% /я \itro, и всхожестью семян при проращивании на искусственном инфекционном фоне (г = 0,759- 0, 742). Всхожесть растений, полученных при оценке на искусствен-

ном фокс и in vitro на среде с ф.к.ж., положительно коррелировала (г = О, 615- 0, 878) со всхожестью и длиной корней растений, полученных при про-рашшишии семнн in vitro на ф.к.ж. и на среде с ф.к.ж. (таОл. III).

Эти данные свидетельствуют о том, что оценка растений по длине корня, а всхожести семян при проращивании на среде с 10%-ным ф.к.ж. в условиях in vitro, может быть успешно использована для экспресс-оценки огурца на устойчивость к фузарпозу.

Таблица 10 -- Коэффициенты корреляции показателей, полученных при использовании различных методов экспресс - оценки огурца на устойчивость к фузарнозу

Методы оценки Проращивание семян на искусственном инфекционном фоне (in vivo) Проращивание семян на среде с ф.к.ж. in vitro Прораши венке семян на фле.ж. in vitro

устойчивость, балд всхожесть, % ВСХОЖЕСТЬ, % длина горня, ЧУ всхожесть. % длина корня, чч

Оценка растений на иск. ин.ф. в т.г.б.(/и vino)* устойчивость, балл 0,%1 0,538 0.657 0,803 0,823 0,921

Проращивание семян на искусственном инфекционном фоне (in vivo) устойчивость, &ПЛ — 0,7 0,774 0,904 «,919 0,951

схожесть, % - * 0.764 0.694 0,910 0.653

Проршци ванне семян на среде с ф.кле. (Я vitro всхожесть, % - - 0,802 0,864 0,803

лтика корн», им - — — — 0,841 0,813

11роращивание семян на ф.к.ж./» vitro RCXO-¡КСС1Ь,% 0,921

Примечание: *- оценка растений на искусственном инфекционном фоне в тепличном грунтовом боксе (in vivo)

3.5. Био\нмнче«сая оценка растений огурца колориметрическим методом по суммарному содержанию фенольных соединений

Учитывая роль фенол ьных соединений в защите клеток от стрессового фактора, нами были проведены исследования по изучению суммарного со-

держания фенольных соединений в растениях, культивируемых в стрессовых условиях.

Исследования показали, что у изучаемых образцов ответная реакция четырехнедельных растений на действие стресс-фактора (10% ф.к.ж. гриба Р. охузрогт») была ра*личной, 'Гак, у исходных растений суммарное содержание фенольных соединений на селективном фоне увеличилось на 41 - 56% по сравнению с контролем (без стресса), в то время как у растений, подученных от двукратного - на 3 - 13 %. При этом содержание фенолов у растений, полученных из гибрида р! Рябинушка, после однократного отбора повысилось на 20%, а у растений, полученных из гибрида Г< Луняша - уменьшилось на 3%, При двукратном отборе суммарное содержание фенольных соединений снизилось соответственно на 36% и 44%,

Рис. 4. Суммарное содержание фенольных соединений в растениях oiypua, полученных при экспресс-опенке на устойчивость к F, олухропип на искусственном инфекционном фоне (древесные опилки)

Можно предположить, что воздействие ф.к.ж. патогена на растения форм orypua, полученных однократного и двукратного отборов приводит к «запуску» программы защитной реакции, проявляющейся в увеличении синтеза фенольных соединении. После двукратного отбора, вероятно, уровень фенольных соединений в клетках растений огурца настолько велик, что действие ф.к.ж. патогена не приводит к значительным его изменениям. Это свидетельствует о том, что растения потенциально способны выдержать высокие концентрации стресс-фактора, тем самым обладают повышенной устойчивостью к ф trroпатогену (рис, 4 и 5).

8 о

2,5 -,

1 £ 1.5 § я. s й 1

•е- s

® 3 0,5

tltitiLlllllii

Дуняив F1

Дуняша F2

Дуняив РябинушЛябннуцИ (ябииушЛ ¡ябинуч* |

F3

F1

F2

F3-1

F3-2

_____Тирт._.

_ Г.! ГЖОкОТЛГЪ

Рис. 5. Суммарное содержание фенольных соединений в растениях огурца, полученных при экспресс-оценке на устойчивость к F. oxysporuni в условиях in vitro

3.6. Экономическая эффективность

Сравнение изученных экспресс - методов оценки показывает возможность ускоренной оценки и экономии селекционного материала. Способ оценки па ф.к.ж. и на селективной среде с ф.к.ж. ¡п г!1го позволяет в 2,1 — 2,5 разя сократить ее длительность и в 2 раза повысить производительность оценки образцов по сравнению с традиционной оценкой на искусственном инфекционном фоне. Затраты при экспресс - оценке на селективной среде с ф.к.ж. превосходят затраты при традиционной, однако » первом случае она более достоверна проводится с использованием меньшего количества семян.

Таблица 11 -Экономическая эффективность экспресс-методов на устойчивость к фузариозу (расчет на 100 образцов)

Хе Показатели экономической эффективности Опенка на инфекционном фоне (опилки) Оценка растений

на селективной среде с ф.к.ж, in vitro на ф.к.ж, in vitro

1 Длительность оценки, сутки 30 14 12

2 Количество семян для оценки, шт. 30 5 to

3 Стоимость оценки 100 образцов, руб. 1291,55* 4212,42 #79.14

4 Производительность, обратное/смену 50 100 too

Примечание: * - затраты включают стоимость электроэнергии (.492,) руб.)

Таким образом, предложенный метод экспресс — оценки in vitro на сегодняшний день остается дорогостоящим. Однако он позволяет сократить время на проведение оцени! и расход семенного материала.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны элементы технологам получения растений-регенерантов огурца в условиях in vitro, включающие оптимизацию условий стерилизации, выбор экспланта. усовершенствованную систему регенерации.

2. Стерилизация сегментов растений и семян, полученных in vivo, раствором гипохлорита натрия в концентрации 1% в течение 10 и 15 минут позволяет получать 85,0 —97,5% стерильных зксп лантов.

3. Культивирование тканей на среде MS, содержащей сахарозу в концентрации 30 г/л, агар -7 г/л и фитогормоны: 6-БАП - 0,1 мг/л, я-НУК - 0,1 мг/л, сопровождается индуцированием геммогенеза у 54,2 — 75% эксплаитов и трансплаитов. Дальнейшее культивирование почек иа аналогичной среде приводит к образованию жизнеспособных побегов, культивирование которых на безгормональной среде сопровождается хорошим укоренением (72,0 — 88,0%).

4. Разработана система селективных условий для получения in vitro растений - регекерантов с повышенной устойчивостью к фильтрату культураль-ной жидкости гриба F. oxysporum и фузариевой кислоте, предусматривающая чередование культивирования тканей на селективной и неселективной средах.

5. Культивирование морфогенного каллуса на среде MS, содержащей сахарозу в концентрации 30 г/л, агар -7 г/л, б-БАП - 0,1 мг/л, о-НУ(С - 0,1 мг/л и фильтрат культуральной жидкости в концентрации 10% или фузарие-вую кислоту в концентрации 10 мг/л в течение 3-х пассажей, позволяет получать растения-регенеранты огурца с повышенной устойчивостью к фузари-озному увяданию.

6. Усовершенствованы элементы методики экс пресс—оценки огурца на устойчивость к фузариозу, основанные на проращивании семян иа ф.к.ж. гриба F. oxysporum и культивировании растений in vitro на селективных средах, содержащих ф.к.ж. гриба F. oxysporum в концентрации 10%. Устойчивость растений огурца, полученная при оценке на искусственном инфекционном фоне положительно коррелирует с устойчивостью, полученной в лабораторных условиях in vivo (г = 0,96), а также со всхожестью семян (г = 0,66 - 0,82) и длиной корней (г = 0,80 - 0,92) при оценке in vitro.

7. Проведение отборов на селективных фонах сопровождается повышением устойчивости селектируемого материала к фитопатогену (средний балл поражения снизился с 2,4 — 2,6 до 1,1 — 1,4) и снижением уровня обра-

зования фенолов (при двукратном отборе суммарное содержал не фенольных соединений уменьшилось на 36% — 44%).

8. Уссвер'йеястЕева;: :i Lis методики зкспрссс - оценка по-

зволяют в 2.1 - 2,5 раза сократить время необходимое для оценки селекционного материала и снизить расход семенного материала.

Предложения клепояьлшаиию в селекционной практике н производстве

1. Для получения растений-регенерантов огурца, рекомендуется осуществлять культивирование эксплантов и траисплангов на питательной среде MS, содержащей сахарозу в концентрации 30 г/л, агар- 7 г/л, б-БАП, й-НУК в концентрации 0,1 мг/л. Сегменты растений и семена, полученные in vh'o>, стерилизовать раствором гииохлорита натрия в концентрации 1% в течение 10 и 15 минут;

2. Для проведения клеточной селекции и получения растений с повышенной устойчивостью к фузариозу рекомендуется чередование культивирования каллуса на селективной и нссслективной средах. Концентрация селективного агента в среде составляет: для фильтрата культу pan ы-юй жидкости 10%, для фузариевой кислоты -10 мг;

3. Для проведения оценки огурца на устойчивость к К oxysporum рекомендуется культивировать семена на среде или проращивать их на фильтровальной бумаге, содержащих фильтрат культуральной жидкости в концентрации 10%.

Список* опубликованных работ но теме диссертации

1. Ткачева, A.A. Оценка селекционного материала огурца на устойчивость к фузариозному увяданию в лабораторных условиях/А.А. Ткачева, A.B. ПоняковЛСелекция, семеноводство и биотехнология овощных и бахчевых культур/Сб. науч. трудов ГНУ ВН И И О.-М,,2003.-С .429-432 (доля участия 80%).

2. Ткачева, A.A. Регенерация растений огурца in vitro /A.A. Ткачева, A.B. Поаяков//Б потехи ология овощных, цветочных и малораспространенных культур/ Сб. науч. трудов междун. научно-практической конференции П1У ВНИИО.- М., 20Q4.-C.118-121 (доля участия 80%).

3. Ткачева, АЛ. Усовершенствованный метод оценки селекционного материла огурца на устойчивость к фузариозному увяданию/ A.A. Ткачева, A.B. Поляков, Н.К. Енрнжова//Проблемы научного обеспечения овощеводства юга России/Материалы междун. научно-практической конференции КНИИОКХ РАСХН.-Краснодар, 2004.-С.70-75 (доля участия 80%).

4. Ткачева, A.A. Получение регенератов сельдерейных (Apiaceae), тыквенных (Cuctirbilaceae), капустных {Brasstcaceae} и ряда цветочных культур in viiro/A.B. Поляков, И.И. Тарасенков, О.И. Федоришнна, A.A. Ткачева, О.В.

Ильченко, Н.Н. Ананьина, Н,Н, Лебедева, М.И. Иванова, Т.В. Ларионова, И.Н. Боровикова// Биотехнология: состояние и перспективы развития/Ill Московский междун. кошресс (14 - 18 марта 2005 г.).-Москва, 20Q5.-C.286-287 (доля участия 10%).

Tkacheva, АЛ. Obtaining regenerants of Apiaceae, Cucurbitaceae, Brassi-caceae and some flower crops in vitro!A.V. Poliakov, I.I. Tarasenkov, O.I, Fedor-ishyna, A.A. Tkacbeva, O.V. Ilchenko, N.N. Ananina, N.N. Lebedeva, M.I. Ivanova, T.V. Larionova, I.N. BorovikovaZ/Biotechnology: state of the art and prospects of development/ III Moscow International Congress Moscow (March, 14 - IS, 2005).- M., 2005,- P. 286 -287 (доля участия 10%).

5. Ткаче&а, AA Использование наночастнц серебра в in vitro технологиях/ А.В. Поляков, О.И, Ситншсова, О.В. Ильченко, А.А. Ткачева, Н.Н. Лебедева, О.Ф. Чнкризова, А.А. Ревина//Селекция и семеноводство/Сб. науч. трудов по овощеводству и бахчеводству.-Т1 ,-М.:ГНУ ВНИИО, 2006.-С.265-272 (доля участия 10%).

6. Ткачева, А.А. In vitro размножение овощных и цветочных культур/ А.В. Поляков, АЛ.. Ткачева, О.В. Ильченко, Н.Н. Лебедева, О.Ф. Чнкризова //Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира/ Материалы Всероссийской научно-практической конференции (24 — 25 августа).-Волгоград, 2006,-С. 19-27 (доля участия 15%).

7. Ткачева, АЛ. Получение растений огурца с повышенной устойчивостью к фузариозному увяданию методами in vitro/А.В. Поляков, А.А. Ткачева, И.И. Тарасенков, Н.К. Бирюкова//Получение растений огурца с повышенной устойчивостью к фузариозному увяданию (Методические рекомендации).- М.:ГНУ ВНИИО, 2006.-28с. (доля участия 70%).

8. Ткачева, А.А. Методы in vitro в селекции огурца на устойчивость к фузариозу/А. А. Ткачева//Картофелъ и овощи.-2006,- №8.-С. 28.

Подписано в печать Об. 12.2006 г.

Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1. Кол-во знаков 38875. Заказ №1730. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО "Полиграф-Бизнес" г.Раменсхое, уя.Красноармейская, 133/2.