Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метилотрофные бактерии, развивающиеся при повышенных температурах

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Метилотрофные бактерии, развивающиеся при повышенных температурах"

Всесоюзный научно-исследовательский проектно-конструкторский институт прикладной биохимии

На правах рукописи УДК 579.222.3:579.84

ГРИШИНА ЕЛЕНА МУРАТОВНА

МЕШОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ, РАЗВИВАЮЩИЕСЯ ПРИ ПОВЫШЕННЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ

(специальность 03.00.23 — биотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1991

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте биосинтеза белковых веществ.

Научный руководитель — доктор биологических наук Диканская Эстер Матвеевна.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Горленко Владимир Михайлович; кандидат биологических наук Милько Елена Серафимовна.

Ведущая организация — Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР.

Защита состоится 199*£ г.

в -у С часов на заседании Специализированного совета Д 098.09.01 во Всесоюзном научно-исследовательском проектно-конструкторском институте прикладной биохимии по адресу: 125299, г. Москва, ул. Клары Цеткин, 4/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке' Всесоюзного научно-исследовательского про-ектно-конструкторского института прикладной биохимии.

• Автореферат разослан 199

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук^у

И. И. ГУСЕВА

- I -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Метанол рассматривается как один из наиболее ,перспективных углеродных субстратов для микробиологических произйбдств. Этим обуславливается возросший интерес к метилотроф-ным микроорганизмам н быстрый прогресс в их изучении.

Активные исследования метилотрофов начались сравнительно недавно, но по этЬй проблеме уае накоплена обширная литература и имеется опыт производства белка одноклеточных (БО) на метаноле, в частности, промышленное производство фирмы Ай-Си-Ай с облигатно-метилотрофными бактериями (Великобритания) и опытно-промышлешшй процесс института "ВНИИсинтезбелок" с факультативно-метилотрофнн-ш ацидофильными бактериями (СССР). Разрабатываются также способы получения на основе метанола различных других продуктов микробиологического синтеза.

Внимания в этом отношении безусловно заслуживают представители новых немногочисленных и пока малоизученных групп метилотрофов, к которым, в частности, относятся бактерии, растущие при повышенных температурах, и грамполояителыше бактерии.

Абсолютное большинство научных и практических разработок по проблеме метилотрофии касалось грамотрицателышх и преимущественно мезофильных бактерий. О грашоложителышх метилотрофах к началу настоящего исследования имелись лишь единичные сообщения,и до сих пор сведения об этой группе ограничены. Еще меньше данных имеется о термофильных метилотрофах. До самого последнего времени была описаны только ассоциативные культуры термофилов и лишь совсем недавно стало известно о получении чистых культур термофильных ызти-лотрофных бацилл.

Шесте с тем, работа с бактериями этих групп может открыть новые возможности для применения метанола как углеродного субстрата, в том числе для получения термостабильных белков и других продуктов микробиологического синтеза.

Пополнение фонда метилотрофных бактерия представителями" малоисследованных групп и изучение их свойств помимо прикладного имеет и самостоятельный научный интерес, в частности для расширения имеющихся знаний о метилотрофии и метилотрофных микроорганизмах.

Цель и задачи. Основная цель работы - выделение терг/офальных я термотолерантных граиположителышх метилотрофтх бактерий, их изучение, в том числе как возможных объектов биотехнологи», я пополнение фонда метилотрофов представителями этих новых к ггаловзу-

чешшх групп. - 2 -

Б процессе работы решались следующие задачи:

- выделение и отбор метилогрофных бактерий, растущих при повышенных температурах; выявление среди них грамполокительных бактерий;

- общая характеристика полученных термофильных ассоциативных культур;

- исследование физиологических особенностей и определение систематического положения, нового грамположительного метилотрофа (штамм ВСБ-Э15);

- оценка штамма ВСБ-915 и термофильных культур в условиях непрерывного выращивания;

- оценка штамма ВСБ-915 и термофильных культур по уровню синтеза некоторых физиологически активных соединений.

Научная новизна. Селекционирован и исследован новый термотолерантный штамм неслорообразующих грамполокительных факультатпв-по-метилотрофных бактерий ВСБ-915 (ЦМПМ-В-2664), единственный из известных представителей этой группы, имеющий оптимальную температуру роста 40-42°. На основании комплексного таксономического исследования с использованием современных методов штамм отнесен к роду ,!Уу(сЬлс1сг/нм и ему присвоен новый вид <Лу с о ¿л с¿е 1с Рои/т Ж

Селекционированы и исследованы новые ассоциативные культуры термофильных бактерий, растущие на средах с метанолом при 50-60°.

Впервые в стране с использованием полученных ассоциативных культур осуществлен процесс непрерывного выращивания мпкроорганя: ков на средах с метанолом при высокой температуре - 50°. Выявлен; зависимость состава ассоциации от скорости разбавлегзия среды. Показана возможность непрерывного культивирования нового штамма грамположигельных неспорообразующях метилотрофных бактерий - ВСБ 915 при 40° со стабильными технологическими показателями без изменения свойств.

На модели штамма ВСБ-915 впервые установлена способность ме тилотрофов к диссоциации и диссоциакты («5 - и Я -формы) исследованы в сравнительном аспекте.

Впервые исследован уровень флавиногенеза у представителя грамполоялтельных метилотрофов. Показано, что по содержанию ФАД ВСБ-915 отличается от известных грамотрицательных метилотрофных

бактернИ и близок к мет;шзтрофннм дрожкам. Установлено, что высокий уровень синтеза ФЛД у ВСБ-915 - функция метилотрсфноло типа питания.

Показано, что штамм ВСБ-915 образует значительные колпчост-

отих

ва коррииондов и мохет представить интерес как истопник . соединении.

Практическая значимость. В результате выполненной работы пополнен фовд метилотрофов представителями новых групп метшготроф-ншс бактерий, перспективных в качестве объектов биотехнология.

Селекция термофильных и термотолерантшсс кетклотрофннх бактерий позволила впервые в наией стране начатг разработку процессов культивирования на средах с метанолом при повышенных температурах. Положительные данное технологической оценки штамма ВСБ-915 и термофильных ассоциаций, полученные в условиях непрерывного культивирования даит основу для разработки способов получения термо-стабильних белков и других полезных соединений.

Значительные уровни синтеза Флавиноз п корриноидов свпдетель-ствупт о возможности использования биомассы ВСЕ-915 как источника этих соединений.

Апро&щия работы. Результаты работы докладывались на Всесоюзной конференции "Термофильные микроорганизмы в природе и практике народного хозяйства" Москва, 1983 г., Всесоюзной конференции "Микроорганизмы - продуценты физиологически активных веществ", Рига, 1984 г., на УП съезде Всесоюзного микробиологического общества, Алма-Ата, 1985 г., на Всесоюзной конференции "Пути эффективного использования достижении биотехнологии в агропромышленном комплексе", Черновцы, 199Г г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, получено I авторское свидетельство.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы); экспериментальной части (6 глав),заключения, выводов. Работа изложена но Т г о страницах машинописного текста, содержит 15 рисунков, .'¡г. таблиц. Список литература включает 225 наименований.

Сбьектн и методы исследования

Основными1 объектами работы служили селекционированные в процессе настоящего исследования смешанные культуры термофильных метилотгофных бактети.: и побил мотолерантии.-: грампо-лояителышх <5акультстлзнс-глетрлогго-:них £а?.тег.21! '-'"Я.С. Гля

сравнения использовали облигатные и ацидофильные метилотрофные , бактерии из коллекции института "ВНШсинтезбелок"а также шташ сапрофитных корине- и нокардиоподобных бактерий из коллекции кафедры микробиологии МГУ и. ВКМ АН СССР.

Систематическое положение штамма ВСБ-915 определяли по суш культурально-ыорфологических, физиолого-биохимических1^, молеку-лярно-генетических и хемотаксономических признаков2^, необходимь при определении корине- и нокардиоподобных бактерий. Таксономиче ские исследования проводили с использованием общепринятых методе

Бактерии выращивали в колбах на качалке и в ферментере фирь "Марубиши" с рабочим объемом 13 л. Использовали специально подобранную минеральную среду с метанолом в качестве единственного I точника углерода. В отдельных опытах в колбах метанол заменяли другими углеродными соединениями или использовали в смеси с этш соединениями. Непрерывное культивирование осуществляли по типу : мостота с регуляцией метанолом^'.

Рост оценивали по оптической плотности и (или) весу сухой биомассы. Скорость роста рассчитывали по формуле Моно-Иеру салим-ского, выход - по весу сухой биомассы относительно метанола. Истинный белок определяли по Лоури, сырой протеин - по Кьельдалю. Для контроля за состоянием исследуемых бактерий в условиях непр| равного культивирования использовали световую микроскопию, посе: на минеральные агаризовашше среды с метанолом и другими источн каш углерода, а также на стандартные среды - МПА и сусло-агар. Кроме того, при идентификации культур применяли серодиагностику со специфическими иммунными антисыворотками. Сыворотки получали при иммунизации кроликов прогретыми целыми клетками гомологично штамка ^.

1) Совместно с сотрудниками кафедры Микробиология МГУ А.И.Нетру< совым и О.М. Куликовой.

2) Совместно с сотрудниками ИБФМ АН СССР И.Б.Дорониной и Ю.А.Троценко.

3) Непрерывноеадльтивирование проводили совместно с технологами ВНИйоинтезбелок под рук. Н.П.Калунянц.

4) Работы по получению.сывороток проводили совместно с сотрудников института "БНИИсинтезбелок" В.Р.Архиповой.

Общее содержание флавинов и количество ФАД определяли флуо-рометричеисим методом, ИДИ - фщуорометрическим и спектрофотомет-рическим методами, витамин В^ - микробиологическим чашечным методом с бл^ег/с/и'а ссб 113-3 в качестве тест-культуры.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Ассоциативные культуры метилотрофных бактерий,

растущие; при 40° и при 50° 1.1. Общая характеристика полученных культур

Для выделения метилотрофных бактерий были использованы растущие при 40 и 50° накопительные культуры, полученные ранее в лаборатории из различных природных образцов. Культуры длительно, в течение полутора лет, пассировали в элективных условиях на минеральных средах с метанолом при соответствующих температурах. В процесое пассирования их оценивали по составу микрофлоры и активности роста за счет метанола. В итоге для дальнейшей работы в каждой группе было отобрано по три наиболее активных смешанных культуры. Их анализ позволил сделать несколько общих заключений:

- в культурах, растущих и при 40°, и при 50° в результате пассирования формировались бактериальные ассоциации с относительно

постоянным составом, включающим как метилотрофную, так и немети-лотрофную флору;

- в культурах, растущих при одной и той же температуре, выделенных из разных природных образцов, отбиралась сходная метилотроф-ная флора. Это могло быть связано либо с условиями селекции, либо с тем, что исходные образцы были взяты из однотипных экологических ниш (для термофилов, например, горячие источники и гейзеры Камчатки и горячие источники Кавказа), которые по составу соответствующих метилотрофных микроорганизмов сходны. Не исключено, однако, что метилотрофы,исследованных групп вообще представлены небольшим числом видов;

- в ассоциативных культурах могут сосуществовать несколько видов метилотрофных бактерий. В частности, из одних и тех же ассоциаций, растущих при 40° нами выделены и гифомикроби,и коринепо-добные бактерии. В термофильных культурах такяе обнаружено по крайней мере два типа метилотрофов - розоьые бактерии и бесплг-ментные споровые палочки. Сосуществование в одно/ культуре двух типов метилотрофов объясняется, видимо, отсутствием ли:,;:та по субстрату в условиях колб.

15з ассоциативных культур, растущих при 40°, чистые культуры нетилотрофов выделялись традиционными методами в отличие от кульТУР. растущих при 50°, компоненты которых представляли устойчивый комплекс бактерий, трудноразделимый обычными методами.

1.2. Смешанные культуры, растущие при 50°

Все три отобранные ассоциации этой группы тлели розовый цвет и содержали по 5-6 типов бактерий, среди которых преобладали бактерии с розовым пигментом. Колонии розовых бактерий в большом числе обнаруживались при посевах ассоциаций на минеральные агари-зованные среды с метанолом, но в смеси с другими бактерия™. Значительное доминирование этих бактерий в культурах, пассируемых на средах о метанолом, позволило предположить, что это метилотро-фу. По форме клеток исследуемые бактерии сходны с розовыми юезофяльннми метнлотрофами р, а по способности к росту при 50° - также и с пигментированными бактериями р.-~\1\гр?Ш6 , среди которых, однако, способность к метилотрофии не описана.

Для выделения этих метилотрофов были использованы разнообразные методы: метод предельных разведений, выделение бактерий на агарязованной среде в парах метанола, разделение с помощью мембранных фильтров, а такяе посевы на стандартные среды и ага-ризованные среды с метанолом как без органических добавок, так и с различными добавками. Кроме ■ того, выделение проводили на агари зова иных .средах с другими источниками углерода и энергии (глюкоза этанол, ацетат), фцнако отделить метилотрофные бактерии от другой микрофлоры и выделить их в чистом виде не удавалось. Видимо, между розовыми и другими типами бактерий существуют устойчивые связи трофического или х£8актера. Но многократной расчисткой перечислен ними выше методами была получена хорошо растущая на средах с мет£ нолом культура Кр-3, состоящая всего из трех морфологически различных форм бактерий, 80-90$ которой составляли розовые бактерии.

После прогревов ассоциации Кр-3, приведших к гибели розовых бактерий, был Еыявлен другое метилотроф -споровые беспигментные палочки, и получена хорошо растущая на среде с метанолом ассоциация № 3. В ней на 90$ доминировали споровые палочки, но оставалось 1-2 типа бактерий, которые, по всем данным, представляли неыетилотрофную флору.

Далее исследования проводили с полученными ассоциативными культурами. Их изучали по активности роста на средах с метанолом

отношению к температуре, рН, составу среди и источником

углерода.

На рис.1 видно, что исходная 05 I) и частично расчищенные ассоциации (Кр-3 и № 3) - это термофильные культуры, оптимум температуры которых лежит в районе 50-60°. Видно также, что частичная расчистка не привела к снижению уровней роста полученных ассоциаций по сравнении с исходной. Видимо, бактерии, которые элиминировались, не обязательны для жизнедеятельности метилотрофов. Оптимум рН для всех этих культур лежит,как и у большинства метилотрофов, в нейтральной или слабощелочной зоне (рН 7,0-8,0).

В ассоциациях гё I и Кр-3 розовые бактерии преобладали при пассировании на средах с метанолом и с глюкозой, а' споровые бактерии получали препмуцество при пассировании на средах с ацетатом.

Поело многократного пассирования на средах с глюкозой и ацетатом ассоциации не потеряли способности к использованию метанола. Это говорит о том, что метилотрофц в исследуемых ассоциативных культурах представлены факультативными бактериями.

Рис.1. Отношение ассоциативных культур к температуре.

Комбинацией разных методов выделения из ассоциации # 3 была получена культура споровых палочек,- в которой других типов клеток пока не обнаружено. Сна перевивается на средах с метанолом, но даже с добавками разнообразных дополнительных ¡¿к то рог. растет

на этих средах слабо.

2. Новый штамм грамположительннх бактерий, растущий при 40° Из ассоциаций, развивающихся при 40°, чистые культуры мети-лотрофоввыделяли общепринятыми методами. Было получено пять изо-лягов, два из которых,грамотрицателыгах, по морфологии оказались близки к р. НУрУт/егоби/ю у а три, грамположительннх - к ко-ринеподобным бактериям. Из них для дальнейших исследований был отобран штамм грамположительннх бактерий, обладающий наиболее высоким уровнем роста на средах с метанолом. Он был проверен на натогенность я получил коллекционный номер ВСБ-915. 2.1. Описание и определение систематического

положения штамма ВСБ-915 Классификация метялотрофов, как известно, недостаточно разработана. Это тем более относится к малоизученной груше неспоро-образующих грамположительннх метилотрофных бактерий. Все известные неспорообразувдие грамположительные метилотрофы отнесены авторами к разным родам группы Корине- и нокардиоподобных бактерий. Но в большинстве случаев даже их родовая принадлежность определена недостаточно надежно.

Исходя из перечисленных ниже культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков, принадлежность штамма ВСБ-915, как и уже описанных грамположительннх неспорообразующш: ме-тилотрофов, к группе Корине- и нокардиоподобных бактерий не вызывала соШений:

клетки - прямые, булавовидные или У-образные неподвижные па лочки, часто образуют палисады , размер 0,4-0,9 х 1,5-8,0 мкм. Размножение - бинарным делением, обособление дочерних клеток - п способу "раскалывания" ( днаррмд - механизм), спор, воздушног мицелия, капсул не образуют, пигмент отсутствует, грамположитель ны на всех стадиях роста;

колонии - серовато-белые, округлые, непрозрачные нефлуорес-цирующие, с ровным краем и гладкой блестящей поверхностью, 0,52,0 мм в диаметре, образуются на 3-4 сутки, могут диссоци ироват с образованием 3 - и К-форм;

физиолого-биохимические свойства - строгий аэроб, ацетоин (УР-тест), индол - не образует; сахара не сбраживает; кислоту образует только из арабинозк и ксилозы; тесты на каталазу, окси-дазу, уреазу - положительны; крахмал, желатин, целлюлозу, твин-8 не гидголизуе?;

источники углерода - (^-соединения - метанол, формальдегид; С-С-соединения - спирты - этанол, пропанол, н-бутанол, маннит, сорбит, шюзит; органические кислоты - ацетат, пропвднат, пиру-ват, лактат, малат, цитрат; сахара - глюкоза, фруктоза, трегяло-за, манноза, рамноза, сахароза, мальтоза;

источники азота - нитраты, нитриты, соли аммония, мочевина, некоторые аминокислоты;

отношение к антибиотикам - устойчив к рифампицину (5 мкг), ампициллину, пенициллину, гентамицину (10 мкг), новобиоцину, ка-намицину, тетрациклину, хлорамфениколу, надидиксовой кислоте (530 мкг), эритромицину; умеренно чувствителен к неомицину (30 мкг), полимиксину В (300 ед.); высокочувствителен к стрептомицину (5-10 мкг).

По суше исследованных признаков, а также составу ДНК, который при хроматографическом определении оказался близким к составу ДНК р. Ссгуле^ае^ег/'а'Гг , штамм ВСБ-915 бил предварительно отнесен к этому роду и депонирован в Центральном музее промыпшенных микроорганизмов как СогулеЗас&г/'г//?; зр. ЛСБ-915 (ДМШ-В-2664).

Далее для более достоверной идентификации нового штамма были исследованы молекулярно-^генетические и хемотаксономическ^е признаки, а также использованы специальные тесты, рекомендуемые при определении систематического положения Корине- и нокардиоподобных бактерий (Нестеренко, 19Р5). Полученные данные (табл.1) выявили принадлежность исследуемого .штампа к р. иЯ/мс^ас/ег/о''?? . К этому роду отнесены также некоторые известные штаммн грамположителыгых метилотрофных бактерий, хотя в определителях данные о способности микобактерий к метилотрофии отсутствуют. Часть известных штаммов до вида не определена (Ураками, Яно, 1?Я9), некоторые отнесены к уже известным видам микобактерий (Керстен, 1964; Като, 1988). Однако достаточных доказательств принадлежности последних не только к этим видам, но и к р. г/^уся/сгс/ег;'*//??, авторы не приводят.

Штамм ВСБ-915 отличается от известных неспорообразуюаих грам-полоиительных метилотрофов более высокой оптимальной температурой роста, а от штатов, отнесенных к р. ¡/¿/¿/себас/ег/й'/г/ , кроме того, и способностью ассимилировать Формальдегид. Учитывая все вышеизложенное, ему присвоено новое видовое наименование - ^/¿/¿¿¿л^^е-г/'ил/ ¿р. ж/ ВСБ-915.

2.2. Сравнительная характеристика ¿- и ТНГср:; Т.Т!М15 Как и многие ненетплоттоТные когиие^орпше бакто^иа, стамм

- ю - Таблица I

Таксономпчески значимые признаки штамма ВСБ-915 в сравнении с близкими коринеподобными бактериями

Признак

ВСБ-915

!Сапрофитные !Сапрофитные !коринебакте-!быстрорастущий .'щае микобак-! !терии

Морфология

Кислотоустойчиво с ть

Отношение к лизощоду

Рост на ШБ с

5% ма

1С$ МгС£

прямые или булавовидные палочки, образуют У-об-разные формы и палисады, деление по способу раскалывания"

устойчив

коринеподоб-ная

коринеподоб-ная

чувствитель- устойчивы ны

растет

оч.слабо растет

В составе жир- 16:0; 16:1; 18:1; ныг кислот ¿-19:0 преобладают

Миколовые кисд есть

Температура плавления

, кардиолипин, фИГЛ МК-р (Н2)

растут растут

растут не растут

16:0; 16:1; 16:0; 16:1; 18:1; иногда 18:1; ¿19:0

10:1; <19:0

Фосфолипида

Тип менахи-нона

Состав и тип

клеточной

стенки

Состав ДНК, мол.%

60-63°

есть

менее 45°

ФГ, ФИ, ФИМ :-э (Не

мезо-ДПК, арабиноза, галактоза; 17 тип

,61,7 хроматогройич. 68,3 по теш.плавл.

репер3Н-Д1Ж

МК-9 ( МК-8 (Н|

мезо-ДПК, арабиноза, галактоза; 17 тип

51-61

есть 45-70°

ФЭ, ФИ, ФИЛ МК-9 (Н2)

мезо-ДПК, арабиноза, галактоза; 17 тип

62-70

Уровни гомологии ДНК-ДНК

(%) С

Л/, ¿теша¿/б 2>$М М£Ъ 2Г) Л/, {пШим ЖС НЫ 18

С1 В МШ_'

I) 0Э - фосфатддплэтано.тапн;, ч<4 - фосСатгашлга-юзпт, £ИМ - фосбо. тидилино злтмакт'о зида.

- ЛШу'мЖ'!/ - ...О?.;; Я-тужМ33%; Л.-,е/. ¿-¿«/¿СМ _ ■■ (\т.: ¿¿Шм-Лж/ивЯ- 32%.

Сравнительная характеристика 3 - и Я-форм ВСБ-915

Таблица 2

Признак

3 -форма

Г' 'Л-форма

Рост в жидкой минеральной среде с метанолом в

, ед.опт.плотн. г/л

Выход к заданному субстрату, % Окраска по Грану

в виде гомоген- хлопьевидный ной суспензии

3,6 —

1,82 1,4

43-45 27

Кислотоустойчивость

Отношение к лизоциму

Рост на МПБ с 5% ¡¡а(1

с 10^ М

В составе жирных кислот преобладают^/ . 0

16:1 18:1 И9;0

Отношение к антибиотикам: рифашшции(5 мкг); амищиллин, пенициллин,гента..1ИЦШ1 (10 мкг); новобиоцин, канаиицин ,на лидиксо-вая кислота .хлотж.гбеникол (530 мкг).карбенициллин (50 мкг), неомивдн (30 мкг).полпмиксин В ? (300 ед.) ]

стрептомицин (5-10 мкг)

Отношение к иммунным сывороткам против $ -Форш й-формы

Структура • популяции при хпа-неиии в течение 18 месяцев \%): на жидкой минеральной среде с метанолом

на агаризованной среде с частотой пересевов I раз/нед., I раз/мес.

положительная (на всех стадиях роста)

устойчива

устойчива

растёт

слабо растет

2319 5,7 22,3 30,7

устойчива

умеренно чувст. высоко чувст.

+++ ++

положительная (на всех стадиях роста)

устойчива

устойчива

растет

слабо растет

20,9 6,4 20,2 26,5

устойчива

умеренно чузет. высоко чувст,

не определяли

99,959 70

0,001

30

ВСБ-915 оказался способным к диссоциации на гладкие (5 ) и склад1-чатые (Е ) колонии. Диссоциация у метилотрофов ранее не описана. При хранении в коллекции складчатые формы регулярно появлялись в популяции в количестве от 0,001$ до 30% в зависимости от способа хранения. Типичные гладкие и складчатые формы были выделены и исследованы более подробно (табл.2).

Из таблицы видно, что помимо морфологии ■ колоний ¿-и &-фор-мы отличаются друг от друга только по характеру и активности роста на средах с метанолом. По всем другим проверенным признакам они практически идентичны. 5 -форма штамма реагирует с иммунными сыворотками против обеих форм. Все это убедительно доказывает,что появление складчатых колоний не контаминация, а действительно диссоциация. Кроме того, диссоцианты оказались сходны по уровню синтеза корриноидОв и особенностям флавиногенеза (гл.4).

2.3. Отношение к температуре, рН, источникам азота и факторам роста

ВСБ-915 - типичный термотолерантный штамм. Способность к росту проверена в интервале температур 20-50°, рост наблюдали при температурах 20-45°. Хороший рост был отмечен в диапазоне 30-43°, с оптимумом при 40-42° (рис.2).

Рис.2. Рост ВСБ-915 при разной температуре (опыты в колбах на качалке, среда Я) I, 1-5С°; 2-45°; 3-37°; 4-43°; 5-30°; Й - 40-42°. а) кривые роста; б) выход р;;солп?но сухой биомассы в % к заданному метанолу.

Из известных неспорообразующих грамположителъных метилотроф-ных бактерий штамм ВСЕ обладает наиболее высокой оптимальной тем- ' лературой роста, что является его существенным преимуществом перед многими метилотрофами. Оптимальное значение рН для штамма ВСБ-915, как и для большинства других метилотрофов, лежит в районе 7,0, хотя он способен к росту в сравнительно широком диапазоне начальных значений рН от 5,0 до 9,0. У исследуемого штамма не обнаружена потребность ни в одном из витаминов группы В. Рост в широком диапазоне рН, ауксоавтотрофность и способность использовать различные формы азота (раздел 2.1) также относятся к практически вапным свойствам нового штамма.

2.4. Рост на средах с метанолом и другими источниками углерода

Метанол. Кривые роста штамма ВСБ-915 на средах с метанолом имеют традиционный характер, с выраженной лаг-фазой, достаточно короткой экспоненгиальной фазой и продолжительной (более 20 часов) стационарной фазой.

Между штаммом ВСБ-915 и некоторыми описанными в литературе изолятами микобактерий (Ураками, Яно, 1989) нет принципиальных отличий в характере роста на средах сметанолсм. Близкие значения получены и по времени удвоения, у ВСБ-915 - 5,5 часа (^тах -0,17-0,18 ч-1), а у наиболее активных изолятов этих авторов - 5,3 часа. Остальные . . изоляты растут медленнее. Относительно невысокие скорости роста этих бактерий очевидно обусловлены их принадлежностью к р. , представители которого, как известно,- относятся к медленно растущим микроорганизмам.

Другие источники углерода. Штамм ВСБ-915 - типичный факультативный метилотроф (раздел 2.1). Его рост исследовали на индивидуальных соединениях я в смеси их с метанолом. В'качестве альтернативных' источников углерода использовали формальдегид и формиат как продукты метаболизма метанола, этанол, как наиболее близкий к нему го гомологическому ряду спирт, ацетат как продукт окисления этанола и глюкозу в качестве модельного субстрата углеводной природы.

* Рост штамма ВСБ-915 на перечисленных субстратах, сбалансированных по содержанию углерода относительно 0,2%Доб.) метанола, представлен на рис.3.

Рост, ед. опт. пл. , 1

К лучшим источникам углерода для исследуемого штамма . относятся метанол и глакоза.Формальдегид, этанол, ацетат в качестве единственных источников углерода используются слабее, а на формиате рост отсутствует. Адаптация к каждому из исследованных субстратов, кроме глюкозы, не приводит к улучшению роста.

2,0

I 2

1,0

6

а

Рис.3. Рост штамма ВСБ-915

на разных источниках углерода I - метанол, 2 - глюкоза, 3 -этанол, 4 - ацетат, 5 - формальдегид, 6 - форыиат

У культуры, адаптированной к глюкозе, лаг-фаза на средах с глюкозой значительно короче, чем у культуры, адаптированной к метанолу. На рост за счет метанола предварительная адаптация культуры влияния не оказыва-

ет (рис.4). Видимо, ферменты ме таболизма метанола у ВСБ-915 имеют конститутивную, а глюкозы -индуцибельную природу. Это подтверждено и данными Н.В.Дорониной о высокой базовой активности ключевого фермента РШ-пути метаболизма метанола - -гексулозофосфатсинтазы при выращивании штамма на средах с метанолом и полиуглеродными субстратами.

При выращивании ВСБ-915 на смесях субстратов глюкоза и ацетат практически не оказывали влияния на потребление метанола. Формальдегид и формиат ипгибировали рост штамма за счет метанола. В присутствии этанола (рис.5, кривые 1,2,3) в первые сутки выращивания культура росла, как на индивидуальном этаноле. Затем уровень роста увеличивался-за счет потребления метанола, но это происходило тем позже, чем выше была первоначальная концентрация этанола в среде..При внесении этанола не сразу, а спустя сутки в культуру, растущую на метаноле (рис.5, кривая 5), рост прекращался (плато на кривой), а затем культура начинала расти как на индивидуальном этаноле. Таким образом, на физиологическом уровне показано, что в присутствии этанола потребление метанола блокируется, видимо, по типу катаболитной репрессии. В литературе есть сведения о том, что этанол может репрессировать такт/, способом гоксу.'.озс^осоатсинтазу.

Рост,

ед.опт.

плотн.

3,0

2,0

1,0

24 48 '72 96 120 144 Время,

час

Рис.4. Рост штамма ВСБ-915 на средах с метанолом и глюкозой. Культуры, адаптированные к глюкозе - I - метанол 0,5$ (об.);

4 - глюкоза 0,5% (вес.); адаптированные к метанолу- 2 - метанол, 3 - глюкоза

Рост, ед.опт. плотн.

3,0

2,0

Т,0

24 48 72 96 120 144 Время,

час

Рис,5. Рост ВСБ-915 на средах с метанолом и этанолом и смесях субстратов. I - метанол 0,5$+этанол 0,05$; 2'- метанол 0,5$+этэ~ нол 0,1$; 3 - гетанол 0,5$+этанол 0,2$; 4 - кетанол 0,5$; 5 -метанол 0,5$+этпнол 0,2$ через сутки; 6 - этанол 0,2$; 0,4$.

3.' Непрерывное культивирование.

Для характеристики выделенных культур и изучения возможности -их использования как объектов биотехнологии рост штамма ВСБ-915 и ассоциативных термофильных культур исследовали в условиях непрерывного культивирования при оптимальных для них значениях температур 40° и 50° соответственно.

3,1. Непрерывное культивирование термотолерантного штамма ВСБ-915

Выращивание ВСБ-915 осуществляли на минеральной среде с метанолом в качестве единственного источника углерода при разных скоростях протока (рис.6).

На рисунке видно, что вымывание культуры начиналось при скорости-протока выше Д - 0,18 ч"1, то есть при значениях, близких к значении ^ твХ- , рассчитанному при периодическом выращивании. Наиболее высокие технологические показатели соответствовали значениям скорости протока 0,08-0,12 ч-1. В этих условиях были осуществлены стабильные процессы с выходом биомассы 38-43$ к заданному метанолу и содержанием в ней сырого протеина 78-83$,.

Рост, ед. опт. плотн.

' 4,0 ^

3,0

2,0 1,0

0,08 0,15 ' 0,2

Д, (час-1)

Рис.6. Зависимость роста штамма ВСБ-915 от скорости протока.

Проведешшй микробиологический анализ показал, что в таких условиях ВСБ-915 доминирует в ферментере на 90-97$ и не изменяет своих свойств (табл.3).

В биомассе из колб (в условиях, гарантирующих чистоту куль-тугы) определяли содержание истинного белка по Лоури, который составил 75$ к сырому протеину, и аминокислотный состав биомассы.

Таблица 3

Микробиологическая характеристика ВСБ-915 при непрерывном культивировании

Культура

Стадия процесса

Доминирование ВСБ-915,

Признаки

морфология клеток

¡морфология !колоний

!реак-!ция с !гомоло-!гичной !сыворот-!кой '

Коллек- колбы 100 ционная (засев-

ная куль- • тура)

Из не- начало 97-99 прерывного конец 90-97 процесса

прямые или бу- серовато-белые, лавовидные па- круглые с ров-лочки, много ным краем,глад--V-образных кой блестящей форм и пали- поверхность!), садов выпуклые,« -

0,5-2,0 мм

та же та же

та же та же

+ +

+

Сравнение •... ■ ВСБ-915 с изученными в этом отношении штам-

мами (Мимура, 1978), грамположятелышм глетилотрофом СмУЯс'ЗасА''-Ним тМстсрб/Ьт Ъс-194 и грамотрицателышм метилотрофом -

/пеМялс^Ш . предлагаемыми в качестве продуцентов белка одноклеточных, показала, что принципиальных отличий в составе аминокислот между ними нет^ Биомасса штамма ВСБ-915 отвечает требованиям РАО, предъявляемым к продуцентам белка одноклеточных.

3.2. Непрерывное культивирование термофильных ассоциаций

Технологические показатели, полученные в непрерывных процессах на средах с метанолом при 50° с термофильными смешанными культурами, ■■ близки к показателям грамположительного штамма ВСБ-915. Выход биомассы при всех исследованных значениях скорости протока (0,08-0,25 ч-1) составлял 39-43% относительно метанола, а содержание в ней сырого протеина 80-85$. Микробиологический анализ показал, что соотношение метилотрофой в ассоциациях меняется в зависимости от скорости протока (изменение цвета суспензии, табл.4). На стадии накопления и при низких значениях;скорости протока преобладают розовые бактерии, а при более высоких скоростях - бесплгментные спорообразующие бактерии. Однако полного вы-

теснешш какого-либо метилотрофа в пределах исследованных скоростей не происходило. Такшл образом, скорость протока можно рассматривать как фактор, регулирующий соотношение типов микрофлоры в смешанных культурах.

Таблица 4

Микробиологическая характеристика процесса непрерывного культивирования ассоциативной термофильной культуры Кр-3

Стадия !Продол-процесса !жит ель-!ность !стадии, ! ч I

Д

Я

!Цвет !Микроскопиро- !Высевы па агари-|культуры|вание !зовашше среда

!Число !Соотно-!с металлов !шение !„ЛПП,Д) !клеток!метало-!нолоы ! !трофов !

ША-

I)

Накопле- 23 ние

Непрерыв- 51 ное куль-тивирова-

ние 'с

45 8 28 28

0,08

0,10

0,120,15

0,17 0,20 0,25

розовый 3-4 12)-50| 2 —30 /о

ярко-ро- 5-6 I- 70$ зовый 2 -20$

розовый 5

белый

4

35$ 20$

бледно- 5 _ _____

розовый 2 -45$

розоватый 4-5 I -10$ 2 -50$

белый 4-5 1-5-7$ 2-40-50$

1-5-7$ ^

2-40-50$

3 типа 3 типа 3 типа 3 типа

_ 3)

3-4 типа 3 типа

3-4 типа 4 типа 3 типа 4 типа

1) На всех средах во всех вариантах наблюдали образование двух-трех смешанных колоний.

2) I - розовые' бактерии; 2 - беснигментные спорообразующие бак'тери

3) Высев не делали.

Следует померкнуть, что специальные релями культивирования для исследованных бактерий, учитывающие индивидуальные особенности этих культур и повышенные температуры их выращивания, не подбирались. II термофильные бактерии, и штамм ВСБ-915 выращивали в тех режимах, за исключением температуры, которые были разработаны ранее для мезофплъных метилотрофов.

чтимк исследованиями установлена принципиальная возможность культивирования штамма ВСЕ-915 и термофильных смешанных культур непрерывным способом при оптимальных для них значениях температур

40 и 50° с хорошими технологическими показателя?,и, близкими к таковым у известных мезофшгьшх грамотряцательных факультативных метилотрофов, а ташке у известных неспорообразующих грампологлтель-пых и термофильных метилотрофов. Результаты, получешше при непрерывном культивировании,дают основание рассматривать и ВСБ-915, и термофильные смешашше культуры в качестве перспективных объектов биотехнологии. Это подтвердили и данные, полученные при исследовании синтеза витаминов и В12, а также других физиологически активных соединений исследуемыми бактериями.

4. Физиологически активные соединения

Витамины определяли в культурах, выращенных в колбах на качалке на минеральной среде с метанолом. Для штаюла ВСБ-915 их исследовали у - и Н-форм, а у $ -форш, кроме того, па среде с" глюкозой.

Флавины и НАЦ. Уровни флавиногенеза у штата ВСБ-915 и термофилов в сравнении с грамотрицателышми метилотрофшми бактериями, а также метилотро^ными дрожжами, отличающимся, как известно, на средах с метанолом высоким уровнем синтеза ФАД, представлены в табл.5. Из таблицы видно, что по количеству синтезируемых флави-нов ВСБ-915 существенно превосходит термофильные метилотрофы и исследованные ранее (Диканская, Горобцова) грамотрицательные метило-трофЕше бактерии. Количество витамина, наделяемого в среду, характерно для обычных нефлавиногенных микроорганизмов. Почти весь витамин в клетках штамма ВСБ-915 (»3-й Н-формы) представлен в виде ФДЦ. По общему количеству фшавинов и необычно высокой дола ФАД ВСБ-915 существенно отличается от исследованных грамотряцательных бактерий и сходен с дрожжами (табл.5).

Известно, что высокий синтез ФАД у дрожжей, в отличие от грам-отрицательных бактерий, связан с участием ФАД-за!висимой алкоголь-оксида зы в первом этапе окисления метанола. У штамма ВСБ-915 ни один из известных ферментов окисления'метанола, не обнаружен, но высокий уровень -ЗДД у пего, как и у дрожжей, связан с метилотрофы ным типом питания. Из таблицы видно, что при выращивании штамма на средах с глюкозой уровень ФАД снижается вдвое. '* В отличие от ФАД, уровень НАД у исследуемого штамма, по-видимому, не связан с метилотрофией, так как при выращивания ВСБ-915 на средах с метанолом и глюкозой его количества одинаковы и составляют около 1000-1200 тг/г СВ.

Таблица 5

Флавины ВСБ-915 и термофильных культур в сравнении с грамотрицательными бактериями и метилотрофными дрожжами

Культуры

!

(Источник!Число ! Витамин Во

! углерода! исслед!---—

! !образ-!в среде, !в клет-! мкг/г

! !цов !мкг/мл !ках, !

! ! ! !мкг/г !

ФАД

\%,к фла-!винам ¡клеток

ВСБ-915-^ глюкоза 3 метанол 7

ВСБ-915-В

Термофилы -"2)

Грамотрица-' -"-тельн.бакт.

Метилотроф. дрожжи

очень слабый цвет

0,58-0,69

0,38 0,20

до 1,0

152,018910

147,0185,0 (163,0+ 20)'ГГ

140,0172,0

75,0100,0

70100,0

180,0500,0

73,2-94,0 50

129,0168,0

139,0172,0

75-95

до 100

40-60

до ТОО

1) Статистическая обработка данных.

2) Данные для сравнения - , предоставлены Э.М.ДиканскоЙ и, Т.А.Горобцовой.

Значительное содержание флавинов в клетках говорит о возможности использования ВСБ-915 как источника этого витамина. Данные о зависимом от источника углерода высоком уровне ФАД представляют также интерес для выявления путей метаболизма метанола у грамполо-жительных метилотрофов.

Витамин В^ и другие соединения. Уровень синтеза витамина В12 определяли не только у ос^ектов настоящей габоты ... ., но и у представителей других групп метилотрофов, не нуждающихся в получении витамина извне, так как ранее их как синтетиков витамина не исследовали. На рис.7 видно, что ВСБ-915, термофильные культуры, о также мезофпльные грамотрицательные розовые метилотрофы синтезируют соединения,' определяемые чашечным методом с ЬбЬгн'с/нО ПЗ-З, кок витамин в количествах, сопоставимых с его содержанием в продуктах, богатых этим соединением. По количеству образуемого витамина они существенно превосходят ацидофильные и сблигат-

,Д>

ше грамотрицательные метилотрофа . Синтез витамина у активных синтетиков стимулировался кобальтом, который, как известно, добавляется в среду при культивировании микроорганизмов - продуцентов этого соединения. У штамма ВСБ-915 витамин даже начинал выделяться в среду. И его содержание бнло сопоставимым с количеством витамина у некоторых известных его синтетиков из числа метилотрофов (ряс.7). Неспецифичность используемого чашечного метода определения витамина не позволяет пока с уверенностью сказать, какие формы корринолдов синтезируются исследуемым штаммом. Но по их количеству штамм ЗСБ-915 без сомнения заслуживает внимания.

При определении химического состава клеток штамма ВСБ-915 были выявлены соединения лшшдной природы, в том числе менахиноны, а также углеводаой'природы (экзополисахариды, авт.сввд. СССР № • 1063131), которые представляют практический интерес. 40

В-

'12,'.

мкг/г

8,0

7,0 6,0 5,0 '1.0

3,0 2*0 1.0

33

13

Ь

мут„шт

3,2 &

с12' мг/л

2,0' 1.5 1,0 . 0,5

а. д

ВСБ-915 термо- <*9к.ро-обл.ацид.-Ироду- ВСБ Ш. РЫ. филн зовые метилотр кты 6o-t9I5 sf>- spj

ютам метано^ -без добавки кобальта . 1#печ4нь Кр.р.с*№

-с добавкой CoClc 100мкг/мл 2.печень судака й 3. активный'ил

Рис.7. Витамин Bj2 у ВСБ-915 и термофилов в сравнения, с метилотрофамз других групп и известными синтетиками (Еыховский, 1984).

Проведенные исследования позволили получить ^результаты, представляющие и научный и практический интерес. Селекция, идентификация и характеристика нового метанолутилизирую-

I) Определение витамина у бактерий разных групп проводилось

совместно с М.Б.Долгой.

щего шташа грамполонительных неспорообразующих бактерий дала возможность пополнить отечественный фонд микроорганизмов представителем новой группы мзтилотрофов. По своим свойствам и технологическим показателям в условиях непрерывного культивирования штамм ВСБ-915 является перспективны:.! объектом для биотехнологических работ. Получение термофильных ыетилотрофов позволило впервые у нас в стране осуществить процесс непрерывного культивирования на средах с метанолом при высоких температурах и выявить особенности поведения в таких условиях ассоциаций термофильных бактерий. Этим положены основы для разработки на средах с метанолом процессов получения термостабильных Ащесгб, а также продуктов, синтезируемых грашологителышми бактериями.

ВЫВОДЫ

1. Селекционированы и изучены термофильные бактерии, развивающиеся на средах с метанолом при 50-60° в смешанных культурах, и новый штамм факультативно-метилотрофных грамположительных бактерий - ВСБ-915, растущий при температуре до 45°. Селекционированные бактерии относятся к новым группам метилотрофов, которые в пашей стране исследуются впервые.

2. Термофильные смешанные культуры представляют собой устойчивые ассоциации метплотрофных и неметилотрофных бактерий. Ассоциации, полученные из разных природных образцов, сходны по метилотро-

фной флоре, представленной по крайней мере двумя типами бактерий. Комбинацией разных методов выделения получена ассоциативная куль-, тура с одним типом метилотрофных бактерий - беспигментными споровыми палочками.

3. Установлена принадлежность штамма ВСБ-915 к роду Ьсишп На основании полного таксономического исследования свойств штамма, включающих комплекс хеыотаксономических и молеку-лярно-генетических признаков ему присвоено новое видовое наименование - с/II тН/гу^гГепу/гг ¿р./юь' . Шташ непатогенен, де-

. понирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов под номером 1Ш.М-В-2664.

4. Установлена способность штамма ЕСБ-915 к диссоциации с образованием гладки ( £ ) и складчатых (Я ) форы, отличающихся друг от друга характером и активностью роста на средах с метанолом. По исследованным таксоксгшчески-значпшм признака!.!, включая отношение к окткЛютгаак а пммунг-шг сывороткам, а также по особен-

ности синтеза флавинов и уровню синтеза корриноидов обе формы сходны между собой.

5. Изучены основные физиологические свойства ■ ^уссйас/ег/ям те£6у&г?оги/п ВСБ-915. Показано, что: штамм термотолерантен, хорошо растет в интервале значений температуры 30-43°, с оптимумом 40-42° и рН 7,0, не нуждается в витамтах; источниками азота для него могут служить нитраты, нитриты, соли аммония, мочевина, аминокислоты; из Ст соединений понтго метанола использует формальдегид; к лучшим источникам углерода относятся метанол и глюкоза, этанол л ацетат используются хуже; на средах со смешанными субстратами этпнол блокирует потребление метанола, видимо, по типу катаболитно": репрессии, глюкоза и ацетат рост за счет метанола

не угнетают.

6. По уровню синтеза флавинов.(витамин В2) и особенностям флавикогенеза штамм ВСБ-915 отличается от исследованных метило-трофных бактерий и сходен с метилотрофными дрожжами. Он накап-лтает значительное количество флавинов в клетках, в основном в форме ФАД. Высокий уровень синтеза ФАД У ВСБ-915, как и у дрожжей, - функция метилогрофного типа питания.

Штакл ВСБ-915 образует значительное количество корриноидов, синтез которых стимулируется кобальтом,и представляет интерес как возможный их источник, а также кормовой источник витамина В£.

7. С использованием селекционированных культур осуществлены процессы непрерывного культивирования на средах с метанолом при 40° и при 50°. Термофильные ассоциации и грамположительнш термо--толерантный и?а\м ВСБ-915 хорошо растут в этих условиях при оптимальных для них значениях температуры. В процессеедльтизирования ВСБ-915 сохраняет свои двойства, а в ассоциативна: термофильных культурах в зависимости от скоросйГпро-тока меняется соотношение метилотрофов.

Для птамма РОБ-915 при 40° и термофильной ассоциации при 50° выход биомассы составляет 39-43$ относительно метанола, а содержание в ней сырого протеина - 78-85$.

Голучениге данные показывают перспективность новых метило-тройов как объектов для бкотехнологпческпх разработок процессов получения продуктов микробиологического синтеза на основе метанола прл повштенЕ::х температурах.

- 24 -

' Список работ, опубликованных® теме диссертации:

1. Калунянц Н.П., Диканская Э.М., Дерябин В.В., Федулова О.В.,

" Долгая М.Б., Халимова Е.М. и др. Микробиологический способ получения полисахаридов // Авт.свид. JE I063I3I. - 1983.

2. Диканская Э.М., Халимова Е.М., Долгая М.Б., Куликова В.П., Тю-.хина H.A. Термофильные и термотолерантные бактерии как продуценты белка одноклеточных из метанола // В сб. "Термофильные микроорганизмы в природе и практике народного хозяйства". -Москва: АН СССР. - 1983. - С.23-32.

3. Диканская Э.М., Халимова Е.М., Горобцова Т.А. Выделение мети-лотрофных бактерий, растущих при повышенных температурах. //

■ В сб. "Термофильные микроорганизмы в природе и практике народного хозяйства". Москва: АН СССР. - 1983. - С.50.

4. Диканская Э.М., Халимова Е.М. Селекция метилотрофннх бактерий, растущих при повышенных температурах. // Микробиол.пром-сть. -1983. - JS 6. - С. 14.

5. Гришина Е.М. Исследование свойств термофильных и термотолерантных бактерий. // В сб. "Микроорганизмы - продуценты биологически активных веществ". Рига: АН Лавт.ССР. - 1984. - С.142.

6. Гришина Е.М., Долгая М.Б. Смешанные культуры термофильных метилотрофов. // Тез.докл. 7 съезда ВМО. Алма-Ата: Наука - 1985.

. - Т.6. - С.46.

7. Деканская Э.М., Калунянц Н.П., Долгая М.Б., Гришина Е.М. Мети-лотрофные бактерии как источник полисахаридов. // В сб. Химия и биохимия углеводов. Пущино: НЦЕИ АН СССР. - 1987. - С.18.

• 8. Диканская Э.М., Халимова Е.М., Горобцова Т.А. Выделение мети-лотрофных бактерий, растущих при повышенных температурах // Биология термофильных микроорганизмов. Москва: Паука - 1986. -С. 135-136. '

9. Диканская Э.М.., Гришина Е.М., Гуликова GiWI., Нетрусов А.И. Свойства нового термотолерантного штамма грамполокительных метилотрофннх бактерий. // Биотехнол, - 1991. - К 3. - С. 8-12.

10. Диканская Э.М., Гришина Е.М., Федулова О.В,, Калунянц Н.П. Культивирование грамполоаительного метилотрофа Л усе ¿acte г/jp.

. ВСБ-915. // Вютехнол.'- 1991. - JS 6. - С.8-И.

11. Доронина H.H., Гришина Е.М., Диканская Э.М., Троценко Ю.А. Новый грамположительный факультативный метилотроф Jl/yceSacftzW" milfoUtmff!// Mr-кробиол. - 1991. - Т.60 - ¡5 4 - С.725-732.