Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метакрилатредуктаза Geobacter sulferreducens АМ-1

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Микулинская, Оксана Викторовна, Пущино

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

ИМЕНИ Г.К. СКРЯБИНА

На правах рукописи

МИКУЛИНСКАЯ ОКСАНА ВИКТОРОВНА

МЕТАКРИЛАТРЕДУКТАЗА (¡ЕОВЛСГЕК БШЕиШЕОиСЕЖ АМ-1:

РОЛЬ И СВОЙСТВА

03.00.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., проф. В.К. Акименко

/

Пущино - 1999 г.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. НЕНАСЫЩЕННЫЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ КИСЛОТЫ -

ТЕРМИНАЛЬНЫЕ АКЦЕПТОРЫ ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНЫХ

ЦЕПЕЙ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ 8

1.1 Фумарат - наиболее изученный акцептор электронов

1.1.1 Организация электрон-транспортных цепей, терминальным акцептором которых является фумарат 10

1.1.2 Синтез АТР в ходе "фумаратного дыхания" 12

1.1.3 Транспорт фумарата в клетку 14

1.2 Ключевой фермент "фумаратного дыхания" - фумаратредуктаза

1.2.1 Фумаратредуктаза бактерии Wolinella succinogenes 15

1.2.2 Фумаратредуктаза бактерии Escherichia coli 16

1.2.3 Фумаратредуктаза Shewanellaputrefaciens 19

1.3 Насыщение двойной связи в боковой цепи фенилпропеноата бактерией Acetobacterium woodii 21 Глава 2. ОКИСЛЕНИЕ АЦЕТАТА АНАЭРОБНЫМИ

ХЕМОТРОФНЫМИ БАКТЕРИЯМИ 24

2.1 Способы активирования ацетата для вовлечения

его в метаболизм анаэробных бактерий 25

2.2 Окисление ацетата через цикл трикарбоновых кислот

2.2.1 Ферменты и особенности ЦТК 26

2.2.2 Транспорт восстановительных эквивалентов от ЦТК

к терминальным акцепторам электронов 29

2.2.3 Анаплеротические реакции ЦТК 31

2.3 Окисление ацетата через СО-дегидрогеназный путь

2.3.1 СО-дегидрогеназный путь 32

2.3.2 Перенос восстановительных эквивалентов

от СО-дегидрогеназного пути к терминальным акцепторам 34

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ 3 6

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Работа с чистой культурой СеоЬаЫег яМ/иггейисет АМ-1

3.1.1 Культивирование бактерии 3 9

3.1.2 Контроль чистоты культуры 40

3.1.3 Определение параметров роста штамма АМ-1 40

3.2 Определение ферментативных активностей

3.2.1 Измерение активности метакрилатредуктазы 41

3.2.2 Определение активностей ключевых ферментов СО-дегидрогеназного пути окисления ацетата 42

3.2.3 Измерение активностей ферментов ЦТК 43

3.2.4 Определение активностей ферментов, участвующих в переносе восстановительных эквивалентов от ЦТК

к метакрилату 47

3.3 Препаративные процедуры

3.3.1 Подготовка суспензии клеток 4 8

3.3.2 Получение грубого экстракта 48

3.3.3 Получение фракции периплазматических белков 49

3.3.4 Фракционирование сульфатом аммония 49

3.3.5 Хроматография на гидроксиапатите 50

3.4 Аналитические процедуры

3.4.1 Определение концентрации и типа флавина.

Разрушение флавинов 50

3.4.2 Определение содержания цитохромов с в различных препаратах и количества гемов цитохрома с (30 кДа) 52

3.4.3 Определение количества Бе 53

3.4.4 Экстракция и определение типа хинонов 53

3.4.5 Электрофорез в денатурирующих условиях 54

3.4.6 Обнаружение цитохрома с в полиакриламидных гелях

после ОЗ-Иа-электорофореза 55

3.4.7 Определение аминокислотной последовательности К-конца 55

3.4.8 Определение количества белка 5 6

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Ацетат является одним из наиболее

распространенных компонентов в трофической цепи анаэробных

консорциумов микроорганизмов. Он образуется в виде конечного метаболита

в результате жизнедеятельности ацетогенной микрофлоры, включающей

обширный спектр бактериальных микроорганизмов. Образованный ацетат

потребляется многими аэробными и анаэробными микроорганизмами,

способными использовать его в качестве единственного источника углерода и

энергии. С точки зрения донорно-акцепторных свойств процесса, утилизация

ацетата строго анаэробными бактериями осуществляется при сопряженном

i

восстановлении либо неорганических акцепторов, таких как СО2, SO4 S03 S2032", S3062_, S°, N03", MY, Se042", Se032', Fe3+, Co3+, Mn4+, U4+, Ass+, либо органических акцепторов, таких как фумарат (Lovley etal., 1988, 1993; Масу et al., 1989, 1993, 1996; Thauer et al., 1989). При этом, если окисление ацетата, сопряженное с восстановлением неорганических акцепторов электронов, достаточно широко представлено среди бактериальных организмов, то использование органических акцепторов электронов при сопряжённом окислении ацетата показано только для Desulfuromonas acetoxidans и Geobacter sulfurreducens {Pfennig and Biebl, 1976; Caccavo et al., 1994), которые восстанавливают фумарат до сукцината. Однако D. acetoxidans и G.sulfurreducens, восстанавливая органические вещества, окисляют ацетат неполностью, так как фумарат в данном случае является одновременно и промежуточным продуктом дегидрирования ацетата, и терминальным акцептором электронов.

Единственным организмом, способным использовать органическое соединение в качестве конечного акцептора восстановительных эквивалентов с одновременным полным окислением органического вещества, является А-

протеобактерия ОеоЪа^ег яЫ/иггесклсет АМ-1 (Галушко и др., 1994; Галушко, неопубликованные данные). Она растет за счет окисления ацетата до С02 при сопряженном восстановлении такого неприродного соединения как метакрилат (2-метилпропеноат) до изобутирата. Многие бактерии способны в анаэробных условиях использовать ненасыщеннае органические кислоты в качестве акцептора электронов. Ферменты, участвующие в процессе восстановления фумарата, и их локализация детально изучены. Данные о ферментных системах, восстанавливающих ненасыщенные монокарбоновые кислоты, фрагментарны или полностью отсутствуют. Исследование новой редокс системы, вовлеченной в катаболизм ацетата С.8и1/иггес1исет АМ-1, представляет существенный интерес.

Цель и задачи работы. Цель работы состояла в выяснении механизма восстановления метакрилата строго анаэробной бактерией ОеоЬаМег яи1/иггес1исет АМ-1. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

- проверить, не является ли восстановление метакрилата неспецифической функцией фумаратредуктазы;

- определить локализацию фермента с метакрилат-восстанавливающей активностью;

- выделить, очистить и охарактеризовать метакрилатредуктазу;

- установить путь окисления ацетата и предложить схему переноса восстановительных эквивалентов от ацетата к метакрилату.

Научная новизна. В работе исследован механизм восстановления метакриловой кислоты - синтетического соединения, которое О.ягй/иггесЬлсет АМ-1 использует в качестве терминального акцептора электронов. Показано, что процесс восстановления метакрилата осуществляется в периплазматическом пространстве бактериальных клеток. Установлено, что метакрилатредуктазная активность не связана с неспецифичностью

фумаратредуктазы, локализованной внутри клетки. Выделен и очищен флавинсодержащий фермент, осуществляющий восстановление метакрилата -метакрилатредуктаза. Обнаружена строгая зависимость метакрилат-редуктазной активности от периплазматического цитохрома с (30 кДа) и уточнено название фермента - цитохром ометакрилат-оксидоредуктаза. Определены молекулярные и каталитические свойства цитохром с-метакрилат-оксидоредуктазы.

В бесклеточных экстрактах G.sulfurreducens АМ-1 найдены активности всех ферментов ЦТК - пути окисления ацетата. Предлагается схема переноса восстановительных эквивалентов от ацетата к метакрилату у G.sulfurreducens АМ-1. Впервые изучена минерализация ацетата, сопряженная с восстановлением органического соединения.

Практическая значимость. Разработана эффективная схема очистки метакрилатредуктазы, которая может использоваться для наработки фермента для исследовательских целей.

Полученные данные расширяют существующие знания о редокс системах анаэробных микроорганизмов и семействе флавоцитохромов с и могут быть использованы в микробиологических и биохимических курсах ВУЗов как пример необычной редокс системы, вовлеченной в окисление ацетата до С02.

Работа может быть принята во внимание при усовершенствовании микробиологических методов очистки сточных вод метакрилатных производств.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Городской научной конференции молодых ученых (Пущино, 1996), на международных конференциях: посвященной памяти акад. А.А.Баева (Москва, 1996) и "Methanogenesis for sustainable environmental protection" (Санкт-Петербург, 1996).

Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 6 печатных работах.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания объекта и методов исследований (1 глава), результатов и их обсуждения (4 главы), выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 116 страницах машинописного текста и включают 9 таблиц и 21 рисунок. Список литературы содержит 152 наименования работ.

Место проведения работы. Работа выполнена в Лаборатории анаэробного метаболизма микроорганизмов (зав. лабораторией - профессор В.К.Акименко) Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН и Отделе биохимии (зав. лабораторией профессор R.K.Thauer) Института почвенной микробиологии {Institut für terrestrische Mikrobiologie, Marburg, Germany).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. НЕНАСЫЩЕННЫЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ КИСЛОТЫ -ТЕРМИНАЛЬНЫЕ АКЦЕПТОРЫ ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНЫХ ЦЕПЕЙ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ

Многие анаэробные бактерии запасают энергию в форме АТР, образуемого как в результате субстратного фосфорилирования, так и фосфорилирования, сопряженного с электронным транспортом. При этом в качестве терминальных акцепторов восстановительных эквивалентов могут быть использованы как органические, так и неорганические соединения, окислительно-восстановительные потенциалы которых, как правило, более отрицательны, чем у кислорода. В результате этого энергетический выход получается гораздо ниже, чем при аэробном дыхании (образуется не более 1 молекулы АТР на 2 электрона, перенесенные по электрон-транспортной цепи) {Thauer et al., 1977).

Одним из вариантов "анаэробного дыхания" является насыщение двойных связей органических кислот, служащих терминальными акцепторами редуктазных цепей. Способность восстанавливать органические кислоты широко распространена среди различных таксономических групп строго и факультативно анаэробных бактерий (табл.1). Однако, спектр ненасыщенных соединений, которые бактерии используют в качестве терминальных акцепторов электронов, невелик.

Достаточно подробно изучены механизмы восстановления фумарата. Сведения о ферментных системах, насыщающих двойные связи других органических кислот, фрагментарны или полностью отсутствуют.

В данной главе обобщены литературные данные об использовании бактериями ненасыщенных органических кислот в качестве терминальных акцепторов цепей переноса электронов.

Таблица 1. Ненасыщенные органические кислоты, используемые некоторыми бактериями в качестве терминальных акцепторов электронов.

Акцепторы Бактерии Литература

Escherichia coli Lambden P.R., Guest J.R. (1976)

Shewanella putrefaciens Myers C.R., Myers J.M. (1992), Morris C.J. et al. (1994)

Bacillus macerans Schirawski J., Unden G. (1995)

Фумарат Wolinella succinogenes Wolin M.J. et al. (1961)

Desulfuromonas acetoxidans Pfennig N., Bieble H. (1976)

Desulfovibrio multispirans Caccavo F.J.R. (1994)

Geobacter sulfurreducens He S.H. et al. (1986)

Ферулат Кофеат Acetobacterium woodii Bache R., Pfennig N. (1981)

Пентеноат Syntrophospora bryantii Dong X. et al. (1994)

Акрилат Desulfovibrio acrylicus Van der Maarel M.J.E.C. (1996)

Метакрилат Geobacter sulfurreducens AM-1 Галушко и др. (1994)

1.1 Фумарат - наиболее изученный акцептор электронов 1.1.1 Организация электрон-транспортных цепей, терминальным акцептором которых является фумарат

Использование фумарата в качестве акцептора восстановительных эквивалентов анаэробными бактериями - явление достаточно рапространенное и в значительной степени изученное. В зависимости от организма и условий роста, в качестве доноров электронов для восстановления фумарата служат молекулярный водород, формиат, NADH, лактат, глицерол-1-фосфат, малат или ацетат (Caccavo et al., 1994; Kröger, 1978; Kröger, 1980; Kröger et al., 1992a; Pfennig and Biebl, 1976). Например, Escherichia coli и Wolinella succinogenes растут, восстанавливая фумарат водородом или формиатом:

Н2 + фумарат => сукцинат (а)

Формиат + фумарат + Н^ => С02 + сукцинат (б)

Восстановление фумарата осуществляется электрон-транспортной цепью, локализованной в цитоплазматической мембране бактерий {Kröger, 1978; Kröger, 1980; Kröger et al., 1980). Она состоит, по меньшей мере, из одной мембраносвязанной дегидрогеназы (специфичной в отношении одного из перечисленных выше доноров), нафтохинона (менахинона или деметилменахинона) и фумаратредуктазы (ЕС 1.3.99.1) {Kröger, 1978; Kröger, 1980; Kröger et al., 1992a; Kröger et al., 19926; Wissenbach et al., 1990). Дегидрогеназы катализируют восстановление бактериального менахинона в соответствующий гидрохинон субстратами-донорами электронов, а фумаратредуктаза (менахинол - фумарат - оксидоредуктаза) реокисляет гидрохинон в хинон фумаратом {Kröger, 1978; Kröger, 1980; Kröger et al., 19926; Kröger and Dadak, 1969; Kröger et al, 1971).

Установлено, что цепь переноса электронов у W. succinogenes состоит из четырех компонентов: фумаратредуктазы, гидрогеназы, формиат-дегидрогеназы и менахинона (Unden and Kröger, 1982; Graf et al., 1985; Schröder et al., 1988). Три упомянутых фермента имеют сходную структуру {Kröger et al., 19926). Каждый состоит из двух гидрофильных и одной гидрофобной субъединиц. Гидрофобные субъединицы представляют собой три разных цитохрома ¿-типа, которые удерживают ферменты в мембране и содержат участки взаимодействия с хиноном {Graf et al., 1985; Unden et al., 1982; Kröger et al., 1979; Kröger and Innerhofer, 1976a; Unden and Kröger, 1983). Центры связывания субстратов располагаются на больших по размеру гидрофильных субъединицах {Albracht et al., 1986; Kröger et al., 1979). Меньшие по размеру гидрофильные субъединицы представляют собой белки с одним или более железо-серными центрами, которые осуществляют электронный транспорт между другими двумя субъединицами {Albracht et al., 1986; Kröger et al., 1979).

Располагаются ферменты - участники переноса электронов от формиата и водорода к фумарату - следующим образом {Kröger, 1980; Kröger et al., 1992a; Kröger et al., 19926). Гидрогеназа и формиатдегидрогеназа своими гидрофильными субъединицами обращены в периплазматическое пространство, а фумаратредуктаза - в цитоплазму.

Тот факт, что восстановленные хиноны могут выступать в качестве доноров для восстановления фумарата {Е%г +30 мВ) и окисленные хиноны могут служить акцепторами для окисления формиата {Е£г -416 мВ) или водорода -420 мВ), следует из стандартных окислительно-

восстановительных потенциалов: для деметилменахинона Е?1= +36 мВ, для менахинона -74 мВ {Kröger, 1978; Kröger and Innerhofer, 1976a; Unden, 1988; van Hellemond and Helens, 1994). Убихинон имеет слишком высокий окислительно-восстановительный потенциал +113 мВ) для такого

взаимодействия. Таким образом, функция хинонов состоит в том, что они собирают восстановительные эквиваленты от различных дегидрогеназ и переносят их к фумаратредуктазе {Guest, 1979; Lambden and Guest, 1976; Kröger, 1980; Kröger and Innerhof er, 1976a; Kröger and Innerhofer, 19766; Unden and Kröger, 1983).

Организация электрон-транспортной цепи бактерии Е. coli, с фумаратом в качестве терминального акцептора восстановительных эквивалентов, тоже вписывается в общую схему, изложенную выше. Например, глицерол-3-фосфат/фумаратная редокс цепь бактерии Escherichia coli, представлена глицерол-3-фосфатдегидрогеназой {Е^ -190 мВ), менахиноном (Е^ -74 мВ) и фумаратредуктазой {ЕЦ^= +30 мВ) {Cole et al., 1985). Дегидрогеназы (NADH-дегидрогеназа, глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа, формиатдегидрогеназа) и фумаратредуктаза локализованы на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны {Gutowski and Rosenberg, 1976). Возможно участие цитохрома b в электронном транспорте к фумарату {Lambden and Guest, 1976; Singh and Bragg, 1976). Мембраны клеток, выросших на глицерине и фумарате, содержат, как минимум, два цитохрома ¿-типа {Cole et ah, 1985; Масу et ah, 1976). Однако связь этих цитохромов с восстановлением фумарата вызывает сомнения, так как они имеют слишком высокие средние редокс потенциалы: +140 мВ и +250 мВ.

1.1.2 Синтез АТР в ходе "фумаратного дыхания"

Согласно теории Митчелла {Mitchell, 1961; Mitchell, 1977), в роли связующего звена между электронным транспортом и фосфорилированием выступает Арн+ (протонный трансмембранный потенциал).

В ходе реакций (а) и (б) (стр.10), около 180 мВ (снаружи положительный) генерируется на бактериальной мембране бактерии

W.succinogenes {Kröger et al., 1986). Сходный по величине АЦН+, но противоположного знака (положительный внутри), генерируется реакцией (б) инвертированными везикулами цитоплазматической мембраны. Отношение Н7е" равно 1 {Kröger et al., 1986) или немного выше {Geisler et al., 1994). Используя энергию электрохимического потенциала Ацы+, АТР-синтетаза цитоплазматической мембраны бактерии W. succinogenes осуществляет синтез ATP {Kröger et al., 1986). Фосфорилирование ADP было продемонстрированно на липосомах, содержащих гидрогеназу, менахинон, фумаратредуктазу и АТР-синтетазу {Graf et al., 1985).

Предполагается, что Лцн+ бактерии W. succinogenes создается трансмембранным электронным транспортом без векторного переноса протона с одной стороны цитоплазматической мембраны на другую, как показано на рисунке 1 {Kröger, 1978; Kröger et al., 1986; Geisler et al., 1994). Эту гипотезу подтверждает ориентация субстрат-связывающих цетров ферментов - участников цепи переноса электронов. Видимо, только электроны субстратов-доноров транспортируются векторно к акцептору-фум