Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МЕТАБОЛИЗМ 2,4-Д В ЗЛАКОВЫХ РАСТЕНИЯХ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "МЕТАБОЛИЗМ 2,4-Д В ЗЛАКОВЫХ РАСТЕНИЯХ"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

ЛИ/Б

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи НАЗАРОВА Татьяна Александровна

УДК 581.192.7 : 632.954.028 : 543.544

МЕТАБОЛИЗМ 2,4-Д В ЗЛАКОВЫХ РАСТЕНИЯХ

(03.00.12 — физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА -1984

1?.НАЬЬ<..1с1с,(г- 8> г,Т Сл: "-УУЬ НС ]1:~ . ;ЯСМ( Л

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте фитопатологии МСХ СССР.

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор Д. И. Чкаииков.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук К. 3. Гамбург, кандидат биологических наук В. А. Земская.

Ведущее предприятие: Институт биохимии растений АН ГрузССР.

оащилв- состоится « & (*» .1уЬ/асёи) . 1984 года

в ч/ . . часов на заседании Специализированного совета Д 120.35.07 в Московской сельскохозяйственной академии им. К- А. Тимирязева. 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 49.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской сельскохозяйственной академии: им. К. А. Тимирязева.

Автореферат разослан « —» /2-<№№Ь-Ш . 1984 года.

Ученый секретарь Ь/а1]О УХ._5—*--Л

Специализированного совета— »* Г\ллЬл- • —Л

кандидат биологических наук Д, О М. Н. Кондратьев

Актуальность темы. Соли и эфиры 2,4-дихлорфеноксиуксус-ной кислоты (2,4-Д) на протяжении четырех десятилетий широко используются в качестве средства уничтожения сорняков в посевах_зерновых-культур, а также на лугах и пастбищах. Даже там, где распространились устойчивые к 2,4-Д сорные растения, эти гербициды продолжают применять, теперь уже в смеси с другими, более эффективными, но менее избирательными препаратами. Есть основания полагать, что 2,4-Д не утратит значения и в ближайшем будущем, поскольку это вещество, кроме достаточно высокой гербнцидной активности и избирательности действия, характеризуется дешевизной, доступностью, низкой перснстентностью и относительной безопасностью для людей и животных (Майер-Боде, 1975; Мельников, 1979).

Естественно, что особенности поведения 2,4-Д в биосфере всесторонне исследовались (Чкаников и др., 1973; Тинсли, 1982). В частности, тщательно изучался метаболизм гербицида в растениях, однако по ряду причин его «судьба» в злаках оказалась недостаточно выясненной, а это затрудняло решение некоторых важных вопросов, например, разработку метода анализа «связанных» остатков 2,4-Д в сельскохозяйственных продуктах, поскольку такой метод должен основываться на знании свойств ее метаболитов. Кроме того, без знания особенностей метаболизма 2,4-Д в злаках нельзя понять причин высокой устойчивости этих растений к гербициду, которая и делает возможным успешное его применение для борьбы с сорняками.

Цель и задачи исследования. В процессе работы было необходимо изучить основные пути метаболизма 2,4-Д в наиболее важных культурных злаковых растениях (пшеница, кукуруза, ячмень), идентифицировать основные метаболиты 2,4-Д, образующиеся в злаках, изучить их свойства и выяснить физиологические функции. На основе полученных данных нужно было разработать метод анализа остатков 2,4-Д в злаках, который позволял бы выявлять не только свободный, но и связанный гербицид.

Научная новизна. "грпти.ЧтТПТ протгичитш* исполь-

ИРММ.КНЛЯ ,

НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА 1

Моек, сольаюхоз. «ксдвмми •

*М. К. А. TWJMftt:»"

зйванием меченой 2,4-Д, позволили установить, что во ficc"x изученных видах злаковых растений гербицид быстро трансформируется в различные водорастворимые продукты. Из обработанных гербицидом злаковых растений, кроме описанного ранее эфира 2,4-Д с глюкозой, впервые выделены и идентифицированы конъюгаты с дезоксисахарами, целлобио-зой и полисахаридами. Выделены и идентифицированы продукты арилгидроксилирования 2,4-Д—4-гидрокси-2,3-дихлор-феноксиуксусная кислота (4-ОН-2.3-Д) и 4-гидрокси-2,5-ди-хлорфеноксиуксусная кислота. (4-ОН-2,5-Д). Показано, что эти метаболиты способны конъюгнровать одновременно с глюкозой и пептидами различной молекулярной массы. Экспериментально доказано, что высокая интенсивность метаболизма 2,4-Д и злаках является важным фактором устойчивости этих растений к гербициду.

Практическая ценность работы. На основе данных, полученных при изучении свойств метаболитов 2,4-Д, образующихся в пшенице, ячмене и кукурузе, разработан метод определения остаточных количеств гербицида в злаковых растениях, позволяющий выявлять не только неизмененный гербицид, но и связанные формы 2,4-Д. Министерствами здравоохранения и сельского хозяйства СССР метод рекомендован в качестве официального.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на III Всесоюзном совещании по анализу остатков пестицидов (Москва, 1979), а также на конференции молодых ученых ВНИИ фитопатологии (Голицыне Московской обл., 1980).

Публикация. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, где рассмотрены процессы метаболизма 2,4-Д в растениях, описания объектов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 01 отечественную .н 100 работ на иностранных языках. Изложена на 133 страницах машинописного текста, включает 23 рисунка, 16 таблиц и 1 схему.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Растения. Для изучения процессов метаболизма 2,4-Д в злаках использовали растения пшеницы сортов Московская 21 и Краснозерная, ячменя сортов Московский 121 н Геркулес, кукурузы сортов ВИР-42 и Немчиновский гибрид. Обработка растений гербицидом проводилась в фазе двух-трех листьев, в фазах кущения и выхода в трубку. Для обработки использовали раствор 2,4-Д, меченной по углероду либо карбоксильной, либо метиленовой групп (уд. акт. 13 мКюрн/г или 219

о

Обработанные 2,4-Д листья злаковых растений, промытые,80Л-нш.1 этанолом Измельчение.в жидком азоте, экстракция 80#-ным ацетоном Фильтрация на воронке Бюхнера, промывание остатка,л':: Оильтрат, экстракция гексаном, упаривание ацетона

Концентрирование

Колоночная хроматография на амберлите ХАД-2 лабильных в * щелочной среде метаболитов'2,4-Д

Элюция водой

Концентрирование, колоночная хроматография на сефадексе 0-75

фракция, элюируемая "кулевым" объемом вода

51дентпфикащя

(Метаболит 1У) -

Элюция этанолом

Упаривание, высушивание, ацети-лирование

Колоночная хроматография на си-лпкагеле

ТСХ в системе гексан-бензол-этплацетат (1:1:1)

15-0л25 Идентификация

(Метаболит III)

Ш0,40 Идентификация (Метаболит II)

БХ стабильных в шапочной среде метаболитов 2,4-Д, элюция 80%-ннм .

ацетоном '*. •

Концентрирование, колоночная хроматография на сефадексе о-Ю, элюция водойА_А

1пик ., Ипик ., Шпик (270-340МЛ)'(340-380мл) (380-470мл)

ЕХ конъюгатов 2,4-Д с пептидами

ЕГО,35-0,65 ТАХ в системе бензол-этилацетат (4:1)

Ш"0,60 ентификаА "(Метаболит Т)

Иентификация -ая группа метаболитов до 30000 дальтон)

Идентификация (111-я группа метаболитов до 600 дальтон)

Идентификация (11-ая группа метаболитов до 2000. дальтон)

Рис.1 Схема выделения метаболитов 2,4-Д из злаковых растений.

мКюри/г), в 20%-ном этаноле с добавлением 0,1% смачивателя твин-40. Раствор (10 мкг 2,4-Д на растение) наносили в виде капель на листья.

Методы выделения метаболитов 2,4-Д. Обработанные 2,4-Д-14С растения ячменя, пшеницы и кукурузы гомогенизировали в жидком азоте и экстрагировали гербицид и его метаболиты 80%-ным ацетоном. Гомогенат фильтровали, фильтрат очищали от примесей гексаном, ацетоновый экстракт концентрировали до небольшого объема водной фазы. В полученных образцах определяли лабильные и стабильные метаболиты 2,4-Д, дальнейшие этапы выделения которых указаны в схеме на рис. 1. Для определения радиоактивности аликвоту вносили в сцинтилляционный раствор (смесь толуол-диоксан-мета-нол (5:4 : 1), содержащая 0,15% РОРОР, 0,75% РРО и 2,4% нафталина) и измеряли радиоактивность веществ на сцинтнл-ляционном спектрометре SL-40 (Интертехник).

Методы идентификации метаболитов 2,4-Д

Щелочной гидролиз. При идентификации метаболитов 2,4-Д последние подвергали щелочному гидролизу в 0,1 н растворе NaOH в течение 15 мин. при 20° С. Далее гидролн-зат доводили до рН 2,0 2н раствором НО и обрабатывали диэтнловым эфиром. Измеряли радиоактивность эфирной и водной фракций. Фракцию диэтилового эфира концентрировали и хроматографировали в тонком слое силикагеля G в системе растворителей петролеиныи эфир-диэтиловый эфир-НСООН (50:50:2). Выделенное вещество (^ 0,55) идентифицировали но поведению при хроматографированип на бумаге и в тонком слое силикагеля, а также с помощью УФ-, ЯМР- и масс-спектрометрии. Кислотный гидролиз. Для установления природы компонентов, входящих в состав конъю-гатов 2,4-Д, последние подвергали кислотному гидролизу. Кислотный гидролиз проводили в 4 н НО в течение одного часа или в 1 н CF3COOH в течение 3 часов на кипящей водяной бане. Гидролизаты обрабатывали диэтнловым эфиром, присутствующие в эфире радиоактивные вещества разделяли в тонком слое силикагеля G в системе петролеиныи эфир-диэтиловый эфир-НСООН (50:50:2). Выделенные радиоактивные вещества ^ 0,21; 0,33; 0,55) были идентифицированы по поведению при хроматографированип на бумаге, в тонком слое силикагеля G в различных системах растворителей, по характеру ЯМР-, УФ-, масс-спектров. Ферментативный гидролиз. Ферментативный гидролиз проводили с использованием р-глюкозидазы в 0,1 М ацетатном буфере рН 5,0 при 37° С в течение 30 минут. Гидролнзат доводили до рН 3,0 2 н НО и неуглеводные компоненты экстрагировали . бутанолом.

Идентификация углеводов. Водные фазы после щелочного, кислотного и ферментативного гидролизов, содержащие угле-♦ воды, концентрировали и присутствующие здесь углеводы хроматографировали в тонком слое силикагеля G, импрегнн-рованного 0,5 М NatbPCA, в системе растворителей изопро-панол-ацетон-0,1 М молочная кислота (2:2:1). Саха.ра проявляли смесью равных объемов 4%-ного раствора хлористого 2,3,5-трнфенилтетразолия и 1 н раствора NaOH в метаноле. Содержание глюкозы определяли с помощью глюкозооксидаз-ного теста (Асатиани, 1965). Идентификация аминокислот. Водную фазу кислотного гидролизата концентрировали, присутствующие аминокислоты хроматог>рафнровалн на бумаге FN-14 при 3-кратном пропускании растворителя бутапол-СН3СООН-Н20 (4:1:1). Проявляли 2%-ным раствором нингидрина в ацетоне. Количественное определение аминокислот проводили методом Хардннга-Мак-Лина (Блок, 1963).

Опытные данные обрабатывали методами математической статистики (Доспехов, 1968).

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

На основании данных, полученных при изучении метаболизма 2,4-Д главным образом в двудольных растениях, сложилось представление, что любые превращения 2,4-дихлор-феноксиуксусной кислоты в растениях приводят к детокснка-ции и (или) иммобилизации гербицида (Чкаников и др., 1973). Исходя из этого считали, что растения, способные интенсивно трансформировать 2,4-Д, проявляют высокую устойчивость к гербициду (Лус, 1971; Чканнков и др., 1976', Pillmoor, Gaunt, 1981). Однако результаты изучения метаболизма 2,4-Д в злаковых растениях, полученные к началу наших исследований, на первый взгляд противоречили этому постулату, так как в устойчивых злаках всегда обнаруживали большое количество (до 30—10%) «свободного», то есть неизмененного гербицида (Dexter et. al., 1971; Hallmen et. al., 1972; Чкаников и др., 1976). Представлялось невероятным, чтобы растения оставались неповрежденными при таком значительном содержании высокоактивного токсичного соединения. Было предположено, что обнаружение в тканях злаков «свободной» 2,4-Д может являться следствием несовершенства аналитических процедур, то есть результатом разрушения каких-либо лабильных метаболитов, так как не было оснований считать, что устойчивость злаков к гербициду достигается не ускоренной его детоксикацией, а каким-то иным путем.

1. Образование водорастворимых метаболитов 2,4-Д в злаках. Установлено, что экстракция 80%-ным ацетоном обеспечивает достаточно полное выделение всех метаболитов 2,4-Д

с сохранением нативности большей части водорастворимых продуктов (табл. 1). При изучении динамики образования во-

Таблица 1

Сравнительная эффективность двух способов выделения 2,4-Д и ее метаболитов из злаковых растений (% от количества проникшего в тканн гербицида через 7 суток после обработки)

Растения Экстракция свежеубранных растений кипящей водой Измельчение свежеубранных растений в жидком азоте, экстракция 80%-ным ацетоном

эфпро-растворимые вещества водорас-творимые вещества неэкстра-гнруе-мые вещества эфиро-растворн-мые вещества водорас-творимые вещества неэкстра-гируе-мне вещества

Пшеница Кукуруза Ячмень НСР„5 36,0 22 9 2б',0 1,7 56,3 45,6 63,5 3,0 7,7 31,5 10,5 1,4 1,9 4,0 1,5 0,8 92,6 89,0 91,5 ( 5,5 5,5 7,0 4,0 3,3

дорастворимых метаболитов 2,4-Д в растениях ячменя, пшеницы и кукурузы было установлено, что гербицид в этих растениях подвергается практически полной трансформации. Через 7 суток после обработки в этих растениях неизмененной 2,4-Д остается не более 4%, а основная часть гербицида (90—95%) находится в составе водорастворимых метаболитов (табл. 1). Можно было предполагать, что они представлены главным образом описанным ранее (Thomas et. al., 1964; Чкаников и др., 1971) 1-0-(2,4-дихлорфеноксиаце-тил)-р-0-глюкопиранозидом, который легко гндролизуется в щелочных растворах с высвобождением 2,4-Д. Однако изучение свойств водорастворимых метаболитов 2,4-Д позволило установить, что немалая их доля стабильна в щелочной среде. Так гидролиз в 0,05 н NaOH при 20° С приводил к разрушению лишь 40—60% от общего количества водорастворимых радиоактивных веществ. При этом гидролиз протекал весьма быстро и полностью завершался в течение первых 15 минут. Остальные же радиоактивные вещества оказались устойчивыми даже в значительно более концентрированных растворах щелочи. Для их разрушения с высвобождением агликонов требовалось длительное (1 час) нагревание при 100° С в 4 н НС1.

Таким образом, метаболиты 2,4-Д в злаках оказались представленными двумя группами веществ: лабильными и стабильными в щелочной среде.

2. Идентификация метаболитов 2,4-Д, лабильных в щелочной среде. Обработанные 2,4-Д-2-14С растения пшеницы

и кукурузы после фиксации в жидком азоте измельчали и 80%-ным ацетоном экстрагировали 2,4-Д и ее водорастворимые метаболиты. Экстракт очищали от примесей по схеме, приведенной выше (рис. 1). Достаточно высокая степень чистоты выделенных соединении позволила провести их идентификацию.

а) Идентификация метаболита I. По поведению при хро-матографировании в тонком слое снликагеля в ряде систем растворителей ацетилированный метаболит I (рис. 1) существенно отличался от 2,4-Д и был сходен с синтетическим 1-0-(2,4-дихлорфеноксиацетнл) -р - Б - глюкопиранозилтетра-ацетатом. После щелочного гидролиза метаболита I в его составе были обнаружены эквнмолярные количества 2,4-Д и глюкозы, которые не отличались от аутентичных образцов по поведению при бумажной и тонкослойной хроматографии. Лгликон метаболита I не отличался от 2,4-Д также и по характеристикам УФ-спектроскопин, ЯМР- и масс-спектромет-рии. Масс-спектры ацетилированного метаболита I и синтетического 1 -0- (2,4-дихлорфеноксиацетил) -р-Б-глюкопиранозил-тетраацетата полностью совпадали. Приведенные данные дали нам основание считать, что выделенный из растений пшеницы метаболит I является 1-0-(2,4-дихлорфеноксиаце-тил)-р-0-глюкопнранозилтетраацетатом.

б) Идентификация метаболита II. Молекулярная масса ацетилированного метаболита II (рис. 1) оказалась равной 492 (М + -). По характеру масс-спектра метаболит II отличался от глюкозного эфира 2,4-Д и мог быть отождествлен с синтетическим 1-0-(2,4-дихлорфеноксиацетил)-р-Б-рамно-ниранознлтриацетатом. Метаболит II отличался от глюкозно-го эфира 2,4-Д исключительно высокой лабильностью в щелочной и нейтральных средах. При его гидролизе происходило высвобождение эквимолярных количеств 2,4-Д и углевода, который по своим свойствам напоминал дезоксисахарид. Хроматографцрование гидролизата в присутствии метчиков и использование специфических цветообразующих агентов свидетельствовало о присутствии в нем фукозы. Кроме фуко-зы, в гидролнзате присутствовал также другой дезоксисаха-рид, совпадающий по подвижности как с 2-дезоксигексозой, так и с рамнозой. Таким образом, можно предполагать, что метаболит II представляет собой конъюгат 2,4-Д с дезокси-сахаридом. Углеводный компонент этого конъюгата может быть представлен либо фукозой и рамнозой, либо фукозой и 2-дезокснглюкозой, либо фукозой, рамнозой и 2-дезокси-глюкозой.

в) Идентификация метаболита III. Вещество III (рис. 1)

при хроматографировании в ряде систем растворителей существенно отличалось и от 2,4-Д, и от глюкозного эфира 2,4-Д, 6

и от конъюгата 2,4-Д с дезоксигексозой. Масс-спектрометрн-ческий анализ ацетилированного производного показал, что молекулярная масса соединения равна 836 (М +); в спектре также присутствовали фрагменты молекулярного иона с массовыми числами 617 (М*---С6Н3С12ОСН2СООН), 574

(М+ • - С,Н3С12ОСН2СООН, — СН3СО), 531 (М+- -С6Н3С12ОСН2, —2СН3СО), 331 (тетраацетилглюкоза), 220 (С6НзС1аОСН8СООН), 162 (С6Н3С120). Наличие в масс-спектре фрагмента тетраацстилглюкозы, а также величина молекулярной массы позволили нам предположить, что метаболит III представляет собой конъюгат 2,4-Д с дисахари-дом. Щелочной гидролиз метаболита III высвобождал агли-кон, который по физико-химическим параметрам был идентичен 2,4-Д, и дисахарид, который не отличался по подвижности в тонком слое силикагеля от целлобнозы. При гидролизе метаболита III в 1 н CFsCOOII при 100°С высвобождались 2,4-Д и глюкоза в соотношении 1 :2. Полученные результаты дали основание полагать, что метаболит III представляет собой конъюгат 2,4-Д с целлобиозой.

г) Идентификация метаболита IV. При хроматографиро-вании вещества IV (рис. 1) на колонке с сефадексом G-75 в присутствии метчиков (декстран голубой, миоглобнн, цито-хром С, дшштрофенилаланин) вся радиоактивность выходила с нулевым объемом колонки, одновременно с декстраном голубым. Это свидетельствовало о том, что молекулярная масса метаболита. IV равна или превышает 50 000 дальтон. Гидролиз этого вещества в 0,05 н NaOH при 20° С высвобождал полисахарид и 2,4-Д. При гидролизе полисахарида в 1 н CF3COOH при 100° С образовывалась D-глюкоза, которая не отличалась от аутентичного образца по поведению при хро-матографировании на бумаге и в тонком слое силикагеля. С помощью глюкозооксидазного метода было установлено, что одной молекуле 2,4-Д соответствует 280—300 молекул глюкозы. Таким образом, можно считать, что метаболит IV представляет собой высокомолекулярный конъюгат 2,4-Д с полисахаридом.

Итак, идентифицированные нами лабильные в щелочной среде метаболиты, являются эфирами 2,4-Д и различных углеводов. Из всех описанных здесь метаболитов к настоящему времени был изучен лишь 1-0-(2,4-дихлорфеноксиацетил)-[}--D-глюкопиранозид. Образование же эфпров 2,4-Д с дезоксигексозой, целлобиозой и полисахаридами показано нами впервые. До сих пор, вероятно, подобные метаболиты не удавалось обнаружить главным образом из-за их высокой лабильности в слабощелочной и нейтральной средах.

3. Идентификация метаболитов 2,4-Д, стабильных в щелочной среде. Растения ячменя и пшеницы, через 7 сугок после

обработки меченой 2,4-Д убирали, измельчали в жидком азоте, после чего экстрагировали гербицид и его конъюгаты 80%-ным ацетоном. Экстракт очищали от примесей по схеме на рис. 1. Желая выявить степень однородности выделенных веществ, их хроматографировали на колонке с сефадексом G10. При этом были получены три радиоактивные фракции: 1—270-340 мл; II —340-380 мл; III — 390-470 мл. Хро-матографирование веществ каждой фракции на бумаге Ватман I восходящим током растворителей н-бутанол-СН3СООН--Н20 (4:1:1) позволило освободиться от сопутствующих свободных аминокислот, благодаря чему стала возможной идентификация трех групп соединений.

а) Идентификация первой группы метаболитов. В первой радиоактивной фракции элюата — (270-340 мл) содержалась небольшая доля метаболитов, отличающихся от веществ других фракций относительно высокой молекулярной массой. Гидролиз этих метаболитов в 4 н НС1 при 100° С в течение 1 часа приводил к высвобождению радиоактивных веществ, хроматографированне которых в системе растворителей петро-лейный эфир-диэтиловый эфир-НСООН (50:50:2) позволило выделить три соединения с Rf 0,55, 0,33 и 0,21 в соотношении 1:1:8. Идентификация этих веществ с помощью бумажной и тонкослойной хроматографии, по характеристикам УФ-, ЯМР- и масс-спектров, а также с помощью цветообразующих агентов, позволила установить, что вещество с Rf 0,55 соответствует 2,4-Д, с Rf 0,33—4-0Н-2.5-Д, с Rf 0,21— 4-ОН-2.3-Д. Кроме идентифицированных веществ, в составе гидролизата фракции I были обнаружены аминокислоты. Количественное определение их с помощью нингидрнна дало возможность установить, что одной молекуле 2,4-Д или ее гидроксилированных производных соответствует примерно 220 .молекул аминокислот. Исследование состава аминокислот с помощью хроматографии свидетельствовало о преобладании аспарагиновой и глу-тампновой аминокислот, лизина, сх-аланнна, иролина, валина; глишш, серии, изо-лейцнн, тирозин присутствовали в меньших количествах. Высвобождение аминокислот происходило лишь в жестких условиях, и это могло служить доказательством существования ковалентной связи не только между аминокислотами, но и между полнпептидом и 2,4-Д или продуктами ее арилгидрокснлнрования. Гидролиз метаболитов, содержащихся в I фракции элюата, при помощи (5-глюкозидазы приводил к высвобождению D-глюкозы, что обнаруживалось с помощью ТСХ, а также глюкозооксидазы. Количество глюкозы, определегш'ое глюкозооксидазным методом, было эквивалентно количеству гидроксилированных агликонов. Следовательно, в I радиоактивной фракции элюата присутствова-

М1"2"£Ч0-дезоксигексоза

(Г' ■

II

ЗсАгАО-глюкоза

" А О - С глюкоза) 2

0_-СН2-(Ц )_(глшоЛа)

а

? 1У

о-сн2-с 'Ы_пептид

г

0-глюкоза

УП 0-глюкоза

Рис.2 Схема возможных процессов метаболизма 2,4-Д в злаковых растениях.

ла смесь конъюгатов 2,4-Д (рис. 2,У) и О-р-Б-глюкозидов 4-ОН-2.5-Д и 4-ОН-2,3-Д с полипеитидами (рис. 2, VII). При этом во фракции преобладали пептидные конъюгаты 4-0-р-Б-глюкозида 4-ОН-2.3-Д. Общей особенностью всех метаболитов этой фракции являлась относительно высокая .молекулярная масса (до 30 000 дальтон).

б) Идентификация второй группы метаболитов 2,4-Д. Вещества II радиоактивной фракции элюата (340—380 мл) с сефадекса в-10 отличались от метаболитов I фракции более низкой молекулярной массой. Гидролиз этих веществ в 4 н НС1 высвобождал соединения, которые так же, как и соединения I радиоактивной фракции, были идентифицированы с помощью различных физико-химических методов. При этом оказалось, что II фракция содержит главным образом 4-ОЫ-2.3-Д и лишь небольшое количество 4-ОЫ-2.5-Д в соотношении 10 : 1. Количественное определение аминокислот в гидролизате показало, что входящие в состав этих конъюгатов пептиды состоят в среднем из 12 аминокислотных остатков, причем состав аминокислот был примерно таким же, как и у метаболитов I радиоактивной фракции элюата. Гидролиз конъюгатов с помощью р-глюкозидазы приводил к высвобождению агликонов и Б-глюкозы в соотношении, близком к эквимолярному. Приведенные данные дают основание считать, что во II радиоактивной зоне элюата присутствуют преимущественно конъюгаты 4-0-р-О-глюкозида 4-ОН-2.3-Д с пептидом, состоящим в среднем из 12 аминокислотных остатков (рис. 2, VII).

в) Идентификация третьей группы метаболитов 2,4-Д. Идентификация агликонов III радиоактивной фракции элюата с сефадекса в-10 после гидролиза метаболитов в 4 н НО привела к заключению, что в ней присутствуют аминокислотные конъюгаты 4-ОН-2.5-Д и 4-ОН-2.3-Д в соотношении 6:1. Гидроксильная группа этих соединений, как об этом свидетельствовали результаты обработки спиртовым раствором хлорного железа и диазотированной сульфанилопой кислотой, а также наличие батохромного сдвига при УФ-сиектроскопии в 0,1 и КаОИ, оставалась свободной. Количественный анализ продуктов кислотного гидролиза показал, что пептид, блокирующий карбоксильную группу 4-ОН-2.5-Д и 4-ОН-2,3-Д, состоит в среднем из двух-трех аминокислот. В состав этого пептида входили те же аминокислоты, которые содержались конъюгатах I и II фракций. Таким образом, III радиоактивная фракция была представлена преимущественно низкомолекулярными пептидными конъюгатами 4-ОН-2.5-Д (рис. 2, VI).

Проведенные исследования позволяют заключить, что в растениях ячменя и пшеницы 2,4-Д, ее гпдрокенлпрованные

метаболиты или их 4-0-р-Б-глюкозиды способны образовывать конъюгаты с пептидами. Несмотря на то, что конъюгаты значительно различаются между собой по молекулярной массе и по подвижности при хроматографированни, для всех них характерно наличие амндной связи, которой 2,4-Д, ее гидро-ксилированные производные и их глюкозиды присоединены к пептидам с разным числом аминокислотных остатков. Обнаружение таких соединений не явилось неожиданностью, так как на возможность конъюгирования 2,4-Д с пептидами указывали Фанг и Бате (Fang, Butts, 1954), Бах и Фелиг (Bach, Fellig, 1961), неоднократно сообщалось об образовании комплексов 2,4-Д с белками (Ракитин и др., I960; Земская, Ракнтин, 1964; Павлова и др., 1966). Относительно недавно Кахниашвили (1979) в растениях фасоли, кукурузы, гороха и виноградной лозе обнаружил конъюгаты 2,4-Д с пептидами. Не исключено, что изученные указанными авторами метаболиты аналогичны описанным здесь конъюгатам 2,4-Д, 4-ОН-2.3-Д и 4-ОН-2.5-Д с пептидами.

4. Динамика образования водорастворимых метаболитов 2,4-Д. Изучение динамики образования водорастворимых метаболитов показало, что во всех исследованных нами злаках весьма интенсивно протекала этерифнкация гербицида, в результате чего накапливались лабильные в щелочной среде эфнры 2,4-Д с углеводами (табл. 2). В растениях пшеницы среди метаболитов этой группы преобладал эфир 2,4-Д с дезоксигексозой, содержание которого на протяжении эксперимента (7 суток) непрерывно повышалось. В то же время количество хорошо изученного эфира 2,4-Д с глюкозой было относительно невысоким, постепенно уменьшалось и через семь суток становилось незначительным. 25,4% поглощенного растением гербицида на первых порах находилось в составе эфира с целлобиозой, однако к концу опыта его содержание резко падало до 7,8%. Обращает на себя внимание тот факт, что по мере уменьшения содержания эфиров 2,4-Д с глюкозой и целлобиозой происходило эквивалентное накопление эфиров гербицида с полисахаридами, в составе которых через 7 суток после обработки находилось уже 29% 2,4-Д.

Небольшое (не более 1,6%) количество 2,4-Д включалось п состав высокомолекулярных конъюгатов с пептидами, содержащими до 220 аминокислотных остатков (табл. 2, рис. 2, V). Гораздо большее значение имело образование пептидных конъюгатов с гидроксилиропанными производными 2,4-Д. При этом больше всего образовывалось конъюгата 4-0-p-D-глкжозида 4-ОН-2,3-Д с пептидами, состоящими в среднем из 12 аминокислотных остатков. 4-О-р-О-глюкознды 4-ОН-2.3-Д и 4-ОН-2.5-Д конъюгировали также и с высокомолекулярными пептидами (до 220 аминокислотных остатков) (рис. 2, VII).

Динамика метаболизма 2,4-Д в злаковых растениях

Таблица 2

Процент от общего содержания радиоактивных веществ в тканях после обработки через:

Соединения

I сут. 3 сут. 7 сут. I сут. 3 сут. 9 сут. 1 сут. 3 сут. 9 сут.

пшеница

кукуруза

чч

а 2 g

4 зв

и. 3 "

Неизмененная 2,4-Д 25,7 Эфиры 2,4-Д с

дезоксигексозои 25,6

глюкозой ... 3,6

целлобиозой . . 25,4

полисахаридами 6,1 Эфиры 2,4-Д с моио-, ди-, полисахаридами

(в сумме) 60,7

Копъюгаты 2,4-Д с пептидами (до 220 аминокислотных остатков)..........0,3

Копъюгаты 4-0-р-П-глюкозидов 4-ОН-2.5-Д и 4-ОН-2.3-Д с пептидами (до 220 аминокислотных остатков).............3,2

Копъюгаты 4-О-р-О-глкжозида 4-ОН-2,3-Д с пептидом (до 12 аминокислотных остатков) . . 6,2 Копъюгаты 4-ОН-2,5-Д с пептидом (2—3 аминокислотных остатка)...........3,9

Ошибка опыта (%) 4,5

5,4 1,6 38,2 4,4 35,0 5,0 3,9

31,2 1,6 25,5 13,2 33,0 0,4 7,8 29,0

71,5 70,2 32,4 41,1 40,1 38,5 57,8 56,2

0,4 0,5 0,4 0,9 1,6 0,2 0,5 0,8

4,2 5,1 4,2 8,7 14,9 2,1 4,5 7,6

12,0 14,4 18,3 30,5 29,7 15,1 20,2 21,0

6,5 •8,2 6,5 11,4 12,6 9,1 12,0 10,5

С т

о

я я =

Низкомолекулярные пептидные конъюгаты содержали 4-ОН-2.5-Д с неблокированной' гидрокснльной группой (рис. 2, VI). Доля гербицида (или продуктов его гидроксилирова-ння), находящихся в составе пептидных конъюгатов, на протяжении эксперимента непрерывно возрастала и достигала весьма существенных величин (от 30% в растениях пшеницы до 60% в растениях ячменя).

Таким образом, в злаковых растениях существенная часть проникшей в ткани 2,4-Д трансформируется в гидроксилиро-ванные производные (рис. 2, VI, VlI), почти не обладающие гербицидной активностью (Hamilton et. al., 1971; Чкаников и др., 197G) и малотоксичные для теплокровных животных (Chkanikov et. al., 197G). Из этого следует, во-первых, что арилгидроксилированне 2,4-Д вносит существенный вклад в детоксикацию гербицида злаками, тем более что одновременно с введением гидрокснльной группы в кольцо карбоксильная группа блокируется пептидом, благодаря чему указанные метаболиты совершенно лишаются реакционной способности и подвижности. Во-вторых, это наводит на мысль о том, что при разработке метода анализа остатков 2,4-Д в злаковых растениях нужно либо добиваться высвобождения гидроксн-производных 2,4-Д, либо пренебречь присутствием этих малотоксичных веществ в растительных тканях, поскольку разрушение пептидных конъюгатов потребовало бы довольно сильных воздействий, а это обязательно приводило бы к появлению в экстракте большого количества мешающих определению веществ.

С другой стороны необходимо было принять во внимание тот факт, что не подвергшаяся арилгидроксилированню 2,4-Д находится в злаках почти целиком в виде эфнров с углеводами (рис. 2, I, II, III, IV). Метаболиты такого типа весьма лабильны in vitro, но очевидно, достаточно стабильны in vivo. Это позволяет считать, что этерификация 2,4-Д в растениях является одним из факторов если не детоксикацин, то инактивации гербицида. Кроме того, лабильность углеводных эфи-ров гербицида in vitro позволяет рассчитывать на то, что при анализе остатков высвобождение 2,4-Д может быть достигнуто гидролизом в довольно мягких условиях, исключающих загрязнение экстракта чрезмерно большими количествами коэкстрактивных веществ.

5. Метод определения остатков 2,4-Д в соломе и зерне злаковых растений. Мы считали целесообразным подобрать такие условия выявления связанного гербицида, которые обеспечивали бы высвобождение максимального количества 2,4-Д, находящейся в составе различных конъюгатов. В то же время сочли возможным не добиваться одновременного извлечения продуктов ее арилгндроксилирования, поскольку по-

следнне Отличаются от 2,4-Д гораздо более НИЗКОЙ ТОКСИЧНОСТЬЮ для теплокровных (СИкапШоу Ы. а1., 1976).

Изучение метаболизма 2,4-Д в злаках позволило установить, что основная доля неизменного гербицида присутствует здесь и виде различных конъюгатов с углеводами, легко разрушающимися в 0,05 и КаОИ. Для выяснения возможности использования 0,05 н КаОИ в качестве экстрагента был проведен эксперимент, в котором для сравнения использовали и некоторые органические растворители (50%-ный ацетон, этанол, этилацетат и другие). Его результаты показали, что присутствующие в соломе конъюгаты 2,4-Д не могут быть полностью извлечены ни одним из применявшихся органических растворителей, хотя эти же экстрагенты в достаточно полной степени извлекают гербицид, добавленный непосредственно к растительному материалу. Вместе с тем гидролиз в 0,05 и КаОИ обеспечивал практически полное высвобождение радиоактивной 2,4-Д из растительной ткани. Поэтому для извлечения 2,4-Д из соломы применяли обработку материала 10-кратным объемом 0,05 н КаОИ в течение 15 минут при 20° С при встряхивании и последующее двукратное промывание остатка на фильтре этим же экстрагентом. Для разрушения сопутствующих коэкстрактивных веществ аликвогу экстракта гидролизовали в 1 н НС1 в течение 1 часа на кипящей водяной бане, и затем 2,4-Д переводили в диэтиловий эфир.

Попытки использовать 0,05 н КаОИ для выделения 2,4-Д из зерна не увенчались успехом, поскольку такая обработка приводила к образованию трудно фильтрующейся массы, что приводило к большим потерям гербицида уже на этой стадии анализа. Однако выяснилось, что 2,4-Д и ее конъюгаты достаточно полно извлекаются из муки 50%-ным ацетоном. Все последующие этапы очистки проводились по схеме на рис. 3. Регистрация уровня радиоактивности после каждой операции позволила выявить размеры потерь вещества на каждом этане анализа (рнс. 3). Минимальная выявляемая концентрация 2,4-Д составляла 0,05 мг на 1 кг сухого растительного материала.

Определение остаточных количеств 2,4-Д в растениях яровой пшеницы, обработанных гербицидом в рекомендуемые сроки, показало, что некоторые его количества содержатся в соломе и зерне (табл. 3). При более поздних сроках обработки содержание гербицида в этих частях растений резко возрастало. Особенно большие количества 2,4-Д присутствовали в нижней части соломины растений.

Полученные данные делают необходимым уточнение санитарно-гигиенического нормирования гербицида с учетом реальной ситуации на основе данных о степени опасности ре-

Измельчение сухого растительного материала

Зерно Солома

Экстракция подаиетежьш Экстракция 0,05 н ШОИ 15 ми-1 н И.ЬО, 50%-ным ацетоном 230 минут при 20°. нут при 20 • Фильтрование Промывание осадка. 50%- экстракта,, промывание осадным ацетоном ка 0,05 н КаОИ 98—100

Г t

Гидролиз упаренного до Гидролиз фильтрата в 1 н НС1 водной фазы фильтрата в_„

в 1 н НС1 при ЖТ при 10Й° 92-97

1 I

Гндролнзат; экстракция диэтнловым эфиром 87—92

Объединенный эфирный экстракт: обработка 0,5 М раствором ЫаНСОз 83—88

Г

Бикарбонатный раствор; последовательное промывание бикар-бонатного раствора хлороформом и гексаном; доведение до

рН 1,0 НС1, экстракция диэтнловым эфиром 80—85

1

Объединенный эфирный экстракт; промывание водой эфирного

экстракта; упаривание эфирного экстракта досуха 75—80

Г

Сухой остаток; растворение сухого остатка в диэтиловом эфире, хроматографнрование на колонке с Л12Оз (элюция 2,4-Д 0,25%-ным раствором ЫаНСОз); доведение элюата до рН 1,0 НС1; экстракция диэтн-ловым эфиром; промывание эфирного экстракта водой; упаривание эфирного экстракта

досуха 71—76

{

Сухой остаток; обработка сухого остатка эфирным раствором диазометана; хроматографнрование на колонке с силикагелем (элюция метилового эфира 2,4-Д бензолом); упаривание бензольного экстракта досуха и растворение остатка в минимальном объеме гексана 08—73

Газохрочатографическое определение 2,4-Д. Хроматограф Цвет-106 с ДПР, колонка (200X0,25 см), заполненная хрома-тоном с 5% силикона 8Б-30, ТДет' = 220°С,

Ткол- = 180° С, ТИиж- =210° С, время удерживания метилового эфира 2,4-Д — 6 мин. 1 сек., в качестве внутреннего стандарта использовали 2,4,5-Т. 65—70

Рис. 3. Схема определения 2,4-Д в растительном материале (цифры в правой части схемы характеризуют степень сохранения радиоактивного вещества, % от исходного количества)

Таблица 3

Результаты определения 2,4-Д (мг/кг) в созревших растениях пшеницы газохроматографическим (ГХ) и радиоизотопным (РИ) методами

Часть растения

Зерно Солома

1979 г.

ГХ РИ ГХ

Обработка в фазу кущения

0,12+0,01 0,11+0,01 0 0,84 +0,03 0,82+0,03 3,71 +0,12 Обработка в фазу выхода в трубку

0,26 +0,02 0,30 + 0.0 / 0

4,88+0,23 5,37 +0,32

1980 г,

Зерно

Солома (два нижних

междоузлия) 22,70гЫ,50 21,20+1,20 Солома (верхние

междоузлия) 2,60 +0,11 2,50+0,10

РИ

следы 5,35гГе0,51 5,54 +0,41

ально содержащихся остатков 2,4-Д, определяемых современными чувствительными и специфичными методами.

Выводы

1. Установлено, что важнейшими реакциями метаболизма 2,4-Д в растениях пшеницы, ячменя и кукурузы являются арилгидроксилнрование и образование конъюгатов с углеводами и пептидами. Эти процессы протекают весьма интенсивно, так что уже через 3 дня после обработки неизмененная 2,4-Д в растительных тканях практически отсутствует.

2. Из обработанных гербицидом злаковых растений, кроме описанного ранее эфира 2,4-Д с глюкозой—1-0-(2,4-дихлор-феноксиацетил)-р-0-глюкопираиозида, впервые выделены и идентифицированы конъюгаты с целлобиозой и полисахаридами. Показано, что содержание последних постепенно возрастает, тогда как количество эфира 2,4-Д с глюкозой уменьшается. Это расценено как доказательство возможности превращения пизкомолекулярпых эфнров 2,4-Д с углеводами в конъюгаты, имеющие более высокую молекулярную массу.

3. Впервые идентифицирован эфир 2,4-Д с дезокеигексозой как один из терминальных продуктов метаболизма гербицида в злаковых растениях.

4. В растениях пшеницы, ячменя и. кукурузы интенсивно протекает арилгидроксилнрование 2,4-Д, причем гидроксили-рование в пара-положении сопровождается смещением атома хлора преимущественно в положение 3. Этим арилгидрокси-лнрование 2,4-Д в злаках отличается от такового в двудоль-

ных растениях, для которых характерно смещение атома хлора преимущественно в положение 5.

5. Образующиеся при арилгидроксилировании 2,4-Д 4-гидрокси-2,3-дихлорфеноксиуксусная и в значительно меньших количествах 4-гидрокси-2,5-дихлорфеноксиуксусная кислоты конъюгируют по гидроксильной группе с глюкозой, а по карбоксильной — с пептидами различной молекулярной массы. Пептидные конъюгаты 4-О-р-О-глюкозидов 4-гидрокси-2,3-и 4-гндрокси-2,5-дихлорфеноксиуксусных кислот выделены из злаков и идентифицированы нами впервые; они являются, видимо, терминальными метаболитами гербицида.

6. Сделано предположение, что описанные конъюгаты с эндогенными веществами представляют собой иммобильные и неактивные продукты трансформации 2,4-Д, поэтому их образование является важным фактором устойчивости злаковых растений к этому гербициду.

7. Изучение свойств образующихся в злаках конъюгатов 2,4-Д позволило разработать метод анализа ее остатков в продуктах растениеводства, который позволяет определить количество «связанного» гербицида: Открываемость 2,4-Д предложенным методом составляет 65 — 70% при минимальной выявляемой концентрации 0,05 мг на кг сухого растительного материала. Министерствами здравоохранения и сельского хозяйства СССР метод рекомендован в качестве официального. '

8. Выяснено, что в соломе обработанных гербицидом растений всегда содержится определенное количество 2,4-Д. Иногда остатки 2,4-Д могут быть обнаружены и в зерне. В связи с этим поставлен вопрос о необходимости совершенствования санитарно-гигиенического нормирования гербицида.

Публикации по теме диссертации

1. Чкаников Д. И., Макеев Л. М., Павлова Н. Н., Назарова Т. Л. Остатки 2,4-Д в пшенице и кормовых злаках. Химия в с. х., 1978, № 5, с. 51—54.

2. Назарова Т. Л., Павлова Н. Н., Макеев Л. М., Чкани-ков Д. И. Транспорт и метаболизм 2,4-Д в растениях ячменя разного возраста. Химия в с.х., 1978, № 11, с. 34—36.

3. Чкаников Д. П., Макеев Л. М, Павлова Н. П., Назарова Т. Л. Модификация метода анализа остатков 2,4-Д в злаках, учитывающая особенности метаболизма гербицидов в этих растениях. Тезисы докладов III Всесоюзного совещания по анализу остатков пестицидов, ВДНХ СССР, Москва, 1979, с. 37.

4. Назарова Т. А-., Павлова Н. Н., Макеев Л. М., Чкаников Д. И. Аминокислотные конъюгаты 2,4-Д в злаковых ра-

стениях. Физиол. растений, 1980, 27, № 4, с. 740—745.

5. Чкаников Д. И., Макеев А. М., Павлова Н. Н., Назарова Т. А., Чмиль В. Д. Определение остатков в соломе и зерне злаковых растений. Химия в с. х., 1981, № 5, с. 60—63.

6. Чкаников Д. И., Макеев А. М., Павлова Н. Н., Назарова Т. А. О метаболизме 2,4-Д в культурных злаках. Физиол. растений, 1982, 29, № 3, с. 542—549.

Л 68770 12/1—84 г.

Тираж 100

Объем 1 п. л. Заказ 13.

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44

Бесплатно