Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мембранний потенциал, транспорт и внутриклеточное распределение иониоз калия в изолированных гепатощитах крыс до и после действия низких температур

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Мембранний потенциал, транспорт и внутриклеточное распределение иониоз калия в изолированных гепатощитах крыс до и после действия низких температур"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ^р|ИТЩ ПРОБЛЕМ КРІОБЮЛОГЙ ТА КРІОМЕДИЦИНИ

1 1 МАР 1996 '

На правах рукопису

ГРИЩУК ВШТОРПЕТРОВИЧ

МЕМБРАННИЙ ПОТЕНЦІАЛ, ТРАНСПОРТ ТА ВНУТРШШЬОКЛГГИННИЙ РОЗПОДІЛ ІОНІВ КАЛПО в ІЗОЛЬОВАНИХ ГЕПАТОЦИТАХ ЩУРІВ ДО І ПІСЛЯ Дії НИЗЬКИХ ТЕМПЕРАТУР .

&&0&22 - кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічих наук

Харків-1995 .

Робота виконана з Інституті проблем кріобіолояї і кріамедицини Національної Академії наук України

Науковий керівник: члея-корреспондент НАН України АЖ Бшзуе

Науковий консультант; доктор біологічних тук > ОХ). Петренко

Офіційні опоненти; доктор біологічних наук, ст. к, с.

Боаиов АХ кандидат біологічних вав Гордієнко ОХ

Провідна установа: Харківський державшій

... , ■ ,. університет ш. ОЖГерздазхо

Зазкет відбудеться "2-0ш ///егего ШЗ^ р. в /З годин ва .тасідднгй СпегцалізозадоІ ради Д 50.2Ц)1 при Інспітугі краалем Еріобіологіі і кріомедаціши Національної Авядаїді наук УераІКй (310012, іь^іиаз,;^р. ^реягяізсьва, 23).

З йкеертаціда жхяш'*кявя&ашявись у Єіблісжщі Ісгшгіуїг. проблем ЕріобіологЗ і^крірмедицини Наїцошіл&ної Акздеші тащь

“ 4 - ' * и '

України

Автореферат разкаюйо "/6" С/'г^л Вчанкй секретар рттртр_п.^і^^тгпі рада,

' доггтор медичках наук, професор АМ. Гсжг^аз

Астуг-лькість. Сучасний етап розвитку експериментальної крісбіслсгії — ара^теріїзуеться підвищеною увагою щодо дослід-:яєе» мекбранозих структур, гаті багато в чому зумовлюють ікїгг-тездатність клітин. Дослідження, прсзедепі па ізольованих міто-хсндрілл, виявили їх високу чутливість до закорсжувапня-йіді-гріву [Лемеїпісо BJB., 1977, Петренко QJO., 19S4] і здатність частково нідзозлюаати функціональну акттішіість за повернення до фізіологічних умоз [Леменпсо ВЗ-, 1973, Петреїлш OJO., 1993, Hacker S., 19721 Проте, залишається мало еіпгсєнсю реакція г.ііто--снцрій у схладі клітин на дію низьких температур. Разом з тіс.ї, ізольовані ггяітини печінки (гепатсцитп) з теперішній час знаходить усе більш широке застосування у біології та медицині [Мар-гуліс М.С., Ерухімоз Е.Л., 1985], що потребус розробки методів їх тривалого зберігання.

Для поцшювакнл ефективності кріохснсерзуваїшл доцільно досліджувати такі інтегральні фушщії клітини як енергетичний етап та транспорт іоніа, які багато з чому зизначагать спрямованість метаболічних процесів. Інтегральним показником енерге-тгічнсї функції мітохондрій є наявність мембранового потенціалу (МП) па знутріхнній мембрані, який править за рушійну силу при езштезі ЛТФ. Застосування електродів, селективних до потенці-ал-залегкних ліпофідьних катіонів, дозволяє за життя досліджувати велитщу і кінетйку утворення потенціалу на цілісній клітині Н'-яеність потенціалу, на плазматичній мембрані, заданого електрохімічні ;м градієнтом іонів ісаліга [Graf et al, 1987, Fitz et al, IC'SS], приводить до накопичення частини потепціал-залегхкого погщу з цитоплазматичному комлартменті клітгаг [Rugolo М., •Lenai G., 13371

Виходячи з положення, що пошкодження .мітохондрій може відігравати визначальну роль в загибелі клітин [Masaki et al, 1989,

McGann et ai, 19S3, Volger et el, 1078], видається ваагідизим вішчкпі взаємозв'язок мітохондріалькаго МП - інтегрального показника стану енергетичної функції мітохондрій, плазматичного ЬПІ - показника іятактності плазматичної мембрани - та Енут-ріїшіьоіиіітинного розподілу і транспорту К"^ - одного з головних осмотично активних компонентів клітин, який відіграє г-азклльу роль у регуляції клітинного метаболізму [Baur et al, 1975, Howard LH, Wondergem H., 1837].

Метою роботи було дослідження МІХ, транспорту та внутрішньоклітинного розподілу К-1- в ізольованих гепатоцитах щур La б залексності від уаіоз виділення, інкубації та низькотемпературного кплизу.

Коняретнгши зазляшигжі стаді:

1. Розробити методи вкзїїанення МП на плазматичній і іііто-хсЕДріальаій ьхеіібранах, а також транспорту та внутріїлньоіглі-ті-гавого роакоділу К-1* в ізольованих гегсатещЕПш щуріз.

2. Дослідити шілиз скліаду середопища виділення . та

кнкубації гепатсцитіз па МП, транспорт і виутріш^склітащшй розподіл Х+. .

3. Доспідаги дій низьких теїіпасатур па 2ЯП щтсхоіхдрій у складі аіЬіивиділанггі та перьіеаБЬппозаіїїі:: гєіїл-гсцрітіе, а таі;сік ка транспорт та аьсЬт юніз ії&еіхз.

4. З'ясувати вплив уіязз Езглсрсзаузагаш та підігріву на зззгг-тездатаість ізольований геяатоцяггіз а яетсш розробки агетаду їх кріокоясервуганая і сдійсгеші порівняльне вивчеяня свЬшзви-діланих та іфіоісснсергцзлаївгх гепатоір;піа щурш.

Наукова новизна. Основні результати пращ одержані впарте. Вияальнхз, що умови еиділєкня та інкубації ісагьоіЕшьсї гепа.-трцихіз нтаоїваязть Еа бцллчзшн ЬІП на кітохондріальніс; та гклаііатичіий гіеїіораяал, шіутрігЕпьоклітиггіїиі розподіл та

*>

транспорт К ■ , дихальну активність гепатоцитів. З'ясовано, що заміна пнутрішкьаклітикного середовища на цукрозне за умов пермеабілізації іілезматичної мембрани сприяє частковому збереженню МП на внутрішній ме: брані мітохондрій у складі гепа-тсцитів після дії шізьких температур. Встановлено, що мітохондрії у складі гепатоцитів, підданих кріоконсервуваншо за розробленім методом, здитні генерувати МП. Деконсервовані клітини характеризуються цілісною плазматичною мембраною, про ш,о свідчить збереження на ній. МП, та здатністю АТФ-залеяшо накопичувати К"^ для відновлення рівня внутрішньоклітинного калііо. Виявлено, що збереження мітохондріального МП та матриксної концентрації К+ с необхідною умовою підтримання життєздатності клітин.

Теоретичне тп практичне значення. Загальиобіслогічне значення мають одержані дані про регулюючий вплив екзогенних субстратів (як в,продовж перфузії, так і під пас інкубації) на вг-личкіш МП та розподіл ІС5" я ізольованих гепатоцитал. Теоретично значущими с результати про ушкоджуючу дію низьких температур на МП мітохондрій у складі клітин, що зумовлюється складом зовігішньомітохондріальяого середовища і що заміна внутрішньоклітинного середовища на цукрозне сприяє збереженню тлі-тохондріального МП. Теоретичне значенії мають дані про необхідність збережешш мітохондріальної коїщентрації К~^ і, відповідно,^ мітохондріального МП для забезпечення лшттсдіяльності клітин. Практичне значення мають розроблені методи: 1) одночасного виміру різниці потенціалів на внутрішній мембрані мітохондрій у складі цілих клітин та на плазматичній мембрані з використанням ТФФ+-селективного електроду і 2} визначення під час одного виміру активності На-*-/К+-АТФази, проводимості плазматичної мембрани щодо К+ та його коїщентрації в цитоплазмі та міто-

3

хсддріальному матриксі. Практичне значення має також розробка методу кріоковсервування гепатсщитів, який захищено авторськім свідоцтвом.

Основні положення,, які виносяться на задист;

1. Введення екзогенних субстратів під час виділення та/або інкубації змінює метаболічний стан клітини, що відображається у зміні різниці потенціалів на плазматичній та мітохондріальній мембранах, транспорту та внутрішньоклгпшного розподілу К~, а також дихальної активності гехіатацитів.

’ 2. Розроблеіший метод кріоконсервування гепатоцитів дозво-

ляє у значній мірі зберегти життєздатність, внутріпшьоклітішний вміст К* та енергетичну функцію мітохондрій у складі клітин.

3. Задля збереження життєздатності та відновлення цитоплазматичної концентрації К"*", яка зменшується після кріоконсер-вуванля, необхідні наявність різниці потенціалів на мітохоїгд-ріалькій мембрані та збереження матриксної концентрації К'г.

Апробація роботу. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися та дискутувалися на Всесоюзному симпозіумі "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" (Пущине, 1986), обласній конференції молодих вчених "Актуальные проблемы м-здицйны и научно-тезаіический прогресс" (Харьков, 1288), VI Українському біохімічному з'їзді (Київ, 1992), П МЬкнародній конференції “Успехи современной криобиологии" (Харьков, 1992), 30 Annual Meetings of Society for .Cryobiology (USA, 1933), 31th Annual Meeting of Society for Cryobiology (Japan, 1994), I-cm съезде Белорусского общества фотобиологоа и биофизиков (Минск, 1994), 1 національному з'їзді фармакологів України (Полтава, 1995), 1 з’їзді Українського товариства геліобіології і кріомедицини (Харків, 1995)

Публікації. По матеріалам дт-'сгртгційігої робота спублікозаі'з 18 друкованих робіт.

Обсяг та структура роботі;. Дисертація викладена яа 133 сторінках машинописного тексту, складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, 3 розділів власних досліджень, обговорення результатів т.-) ВИСНОВКІВ, .містить 10 таблиць та 24 малюнки. Список використаної літератури нараховує 279 найменувань. •

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ. Експерименти проводили на етатеїюзрілісс щура:: лінії Віс-тар вагою тіла 200-300 г. За об'єкт дослідження праліїли свЬкови-ділені гепатоцити до і після крісвплизу. Ізогьоваш гілітішіі печінки виділяли пеферментатгпшии [Петренко О.ІО. та іп., 1989] та колагеназіпої по Сеглену [Зе£Іеп Р.О., 1378] г.гетодаїїи. Жпттсздат-ність суспензії гепатоцитів визначали за вісслюченшпі вітального барвника трипапового синього-[Згдіеп Р.О., 1972]. Концентрацію клітин у суспензії визначали стандартною і'етсдтскою з пі драпуванням у ісамері Горяєва [Неиенспа ІО.Г.І, 19721

ПермеабілізоЕані гепатоцити отримували методом [Каіз X, \т/аЬ Р., 1985] з деякими модифікаціями

Швидке заморозкування-швг<дкий відігрів суспензії ізольованих гепатоцитів здійснювали у поліетиленових пробірках об'ємом 1 мл шляхом швидкого занурювання в рідкий азот (швидкість заморожування 300-400°С/хв). Відігрів проводили на водяній бані при 38°С до 0-2°С (швидкість підігріву 400-500°С/хв).

Кріоконсервуваіпія клітин здійснювали шляхом швидкого двоступеневого заморожування до -196°С в присутності 10% ДМСО з зупинкою при -20°+ -25°С та швидкого відігріву на водяній бані при 38°С.. Швидкості охолодження та підігріву контролювали за допомогою мідь-констаптанової термопари.

. 5 \ -

Життєздатні гепатоцити відділяли бід пошкоджених у градієнті щільності перколу як описано в роботі [Berry et al, 1983].

Дихальну активність ізольованих гепатоцитів вимірювали полярографічно в комірці об’ємом 1 мл при 26°С або 37°С за допомогою закритого платішового їсисневого елеістроду Кларка на полярографі LP-7E.

Вміст АТФ в кислотному екстракті визначали за допомогою люциферіш-лшциферазного негоду [Аттаулаханов Ф.І., Пічугін АЗ., 1981] ка біохеміліомінометрі BXJI-0S.

Транспорт К*7- та його внутріншьоіглітшший розподіл визначали за допомогою К^"-селективного електроду (тіш F2312K "Radiometer”, Данія,). Виміри проводили у термостатованій і;омірці об'єі-гом 5 мл при постійному перемішуванні. Аігпівність Ка"^/К+-АТФазл паціїяовали за різіїіщею початкових швидкостей транспорту К~ за відсутності та в присутності уабаіна (1 мМ).

МеуЛраикий нотенпіші (A*F) дослідзкували по поглинанню лі-пофільного катіону тетрафекілфосфонію (ТФФ'1') за допомогою ТФФ^-селеігтпвкого електроду, Еиготозлагюго згідно [Kamo et al, 1079]. Вїд<сірїі проводили у термсстатсшгііій комиріп об'ємом 5 ця при параігішуггіягЕ. ■ ' .

Ві^згіачешш об'єму Епутрішньоклтдпіої води гєпатоцптіа проводили з “Н2О та [1^С]-пукросом при 37СС з центрифугуванням крізь силіконова масло. Внутрішньоклітіїїіний об’єм розраховували відніманням цукрового об’єму захопленої зовнїшпьоклі-тиішої рідини із загального тріггісвого об1 ему води і коригували результатні за відсот-ях^ життєздатних елгиях, встановленим, по еплдочєпггп> тріхлакоізсго синь cm.

ОдерзкзЕІ результати сброблллисл статистично за методом , Ст'юдеЕта-Фішера [Апгмаріп ІП. та іл., 1275] ка ЕОМ IBM.

б

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Найбільш перспективним sanprcsiKou для пязч’іпш фунг;ци мітохсігдрій у складі пітаїтіої клітини с с;кпачоппя пелгтпгі: Мїї (A'F). Відомо [Demura М. et al, 1985, Кіто IT. et al, 1979, Eottoa-b-erg H., 1984, Waggoner AS., 1985], rno pir.rd 2!7G2rtTTdIIQ ліпофільні іоіпі лепсо протікають через біолсгітні 7.:е"брзиті га розподіляються згідно з рівнянням Нериста.

Використовуючи рсзрсблзгяій петод, ::а ~Q"c:.;orcio k;i-

селекткзксго ■ електроду дос-іідксузал:! іаЕОтгс^' еязопїгхсїіея лі-пофінького ісатіону тотрафзкілсЬсгі?: зніго (ТСФ*^) ізояьсззісасі гепатоціітами щуріо та його розподіл у icivi.-acirc: :»і.аіарті:оіггах

і, па цій основі, вигиачалк величкші ріс:г:ііі сотехипаліа па глто-гсондріальній (А'і/2.1іт) та плаз:.:атігспгл (с'І'тгл) r/0"S7axns.

Гепатоцити, плдьіеш н е ф ер: е: гт а т; з:г . і зг.ес-с:.і без сусат-

раггз у середсзїаці парфузїї (п-гслітл-;пі), дослть швидко ПОГЛЇЯЕСОТЬ ТФФ+ (ІІал. 1). Епесеїліл дігітопіну иргізпо-ДГГГЬ до повного шподу ТФФ+ у середспіще ііку= бації, гг:е пміщус фізіологічну концентрацію Са2+. Це поп’лзапо з порушенням іптаїстхіості плазілатггапої мем-

‘ Мал. 1. Впліш діігітаїпЕїу, інпйіторів та роз'єднувачів ОФ па іргогпгчгітл ТФФ"*" гепатоцзггами під час інкубації у середовищі Дгальбекка. Добавки*. ДНФ - БО закМ, ХКЦФ - 1 к::М, NaCN - 3 мМ, аігоімщкп А (Аігт. А) - 2 пісМ, дшітотн (Діг.) 40 мкг, гопатощпті (Гц) - 2xlCJ клітигь Температура nscdpy - 37 °С. . .

брала [Katz J., Wal3 P., 1035], що веде до полапсу потенціалу на

хш-лиата.чнш та. ьито;;гл:дртльіііл кекораяах через роз єднальну дЬ:? на ьіітохондрії Са^, що про.-оп:ас у клітини [Акегшап К, 1072, McCcrmac J., Banton її., 1988]. Хлгибіторн елелтроп-ті,:елзртлсго лаїздіогу (ц;іпііід. аптиміцтп- А) та роз'едлупачі оіпісигїОЕальїіого фогфорлліозашш (ОФ) - ДЛФ або ХКЦФ -п-п:л;г.:гли їієпоепз ьішЬіьнєїшл. ТФФ^" а клітки (мал. 1). Д&5алі;а ді-гтітспіку спричіозхла додсткоза вивільнення ТФФ^\ Повне зникнення потенціалу у відповідь на добавку дигітоніну свідчить, що у ссредовкщі зозніїшіьахиіітїшкого типу МП мітохондрій реєс-трусті-сл л:гшс е інтактних гспптоцїггпзі. Відмінність у дії роз'єд-ііуїіпчіі} і шгибіторіа ОФ та дкгітсїііну обумовлена наявністю nova ігціолу на іхлееиеітїршій ьіаьібрані ізольсншиїх пшатацитів. ІІри цьозгу з еолжоіз ігірого вірогідності полена в яах-сати, хцо аідіюаіен-:ss і:опцентрацій; ТФФ~ у цнтоплпзні та середоаііщі інкубації

ТОІ1

V*

Dit-

«

t

1*

І

І

Д.-.+Д1ІО JJir.+NaClT

№-ггд| і

1 / / /

І/ / /

і “1 г"І і

VU, V- ь*» * . ft;

V

Мал. 2. Бііпг.п: суісц:іг;гт7 те ЕРТА :~ іісхіегїєіл:; ТФО'г Ьзльо^і-.іс^о: тєг^тїщгпі-ьпі :~зіттсг:датїгісіго ЕС;!- (1 і 5} і (2), які rjcvLtcLd гефсрїїсігїггіїаісгг і-х-гсда-і Єез сг, 5*- і^рфугИ. Уиог,:: eircsa-

р"^*-:-CZIT^r С /ТО 7.*. 1.. д, —TjLT.1.

су-^г^т (Сук.) - 2 кї£, ETTA - І tAL

иропорціино наліГіЯти потенціалу на пдаз-г.іат::хіі:ііі ліекорсліі кліті ін, саісі.чьіз: зк-

лелєео [Akerman Е., 1980, Gulyaevs: 1*1. et til, 1C05], що ШЩФ nprucubuii прот;ігс:,і перішіх 10 ЗСЗїІЛНа не Еііініас Д’У на плазгіа-іюткій г,:е.м5ра.'іі гепа-тоцятів і л;іь;фощітіг:. Зняття цього потенціалу дссшистъс;: по-пії:од;::с-іг:тлгі (пор:,:аа-

Такт; *пшом, вимірявши об'єм вкутрішньоклітиіюої водії, моясна визначити вііутрішіїьо.мітохондріальну та цитоплазматичну концентрації ТФС>~ і обчислити, згідно з рівнянням Неркста, різність пото;и:;;зліз на і ;л а з матичиій та мітохондріпльній мембранах а ура::узг_тікям життєздатності суспензії гепатоцитів.

Про коректність цього підходу свідчать дані з сумісного та нарізного внесення мітохондріального субстрату сукцлнату та хелатора Са^~ ЕГТЛ (мал. 2). Сукцинат спрігпіняз дуясе попільне пакогшиеіплі ТФФ~. Внесегаш ЕГТА не впливало на розподіл лілофільиого катіону, а настугша добавка сухцшіату веде до швидкого поглинання. ТФФ+ клітинами (.мал. 2). При цьому гепатоцити з життєздатністю 60% (крива 2) накопичували меншу кількість ТФФ+, иЬк з життєздатністю 80% (крива 1), а добавка суісциллгу 4- ЕГТА призводила до більшого відгуку. Спостерігаєм»: ефект сумісного внесення в середовище інкубації ЕГТА та сукцлнату відображає відновлешш МП мітохондрій у складі кліті:;: з порушеною плазматично» мембраною. Таїсии чгагом, в сольовому ссредозищі зозніїтіьоклшішіого типу МП визначається .’іглпе в інтактних гепатоцитах.

Виходячи з наведеннях результатів, молота зробити висновок, що дослідзіссіпія транспорту ТФФ^- в ізольованих гепатоцитах дозволяє поцінити величину МП внутрішньоклітишпсс літо-хондрій та 'плазматичної мембрани, а такогк одержати інформацію про зкиттєздатність суспензії. ~

Відомо [Е>сшига М. еі аі, 1985, ПсНепЬе^ Н., 1984], що за гго" е ги;ід л ~ з але; кно го накопичення ТФФ+ частіша ліпофільпого катіону в клітинах знаходиться у зв'язаному стані, через це під іас ■ обчислень АЧ'пл та А^міт робили корекцію _ стосовно знутріщньоклітиншго зв’язування ТФФ+, як пропонують автори

роботи [Бетига М. еі аі, 1985], а також щодо відсотку пошкоджених клітин, які забарвлюються трипаїювим сипім.

Відсутність субстратів у середовищі иерфузіі може бути причиною вичерпання дулу ендогенних субстратів в ізольованих гепатоцитах (к-клітшш) і приззодиги. до зміни и^ллчшш Д'Р. В зв’язку з цим, були виділені неферментатнвшш методом гепато-цихи за допомогою середовищ, що вміщували глюкозу (г-клітшш) та цитрат (ц-клітшш), а для порівняння - ферментативіпім методом (ф-клітіши). Н- і ф-клітшш генерують потенціали на плазматичній і мітохондріальній мембранах однакової величини (табл. 1). Введення глюкози до середоашца перфузіі спричиняло ашіиешш значень АУтттт на 26%, і А'Риіх - на 19% (табл. і). Виділення з цитратом не змінювало потенціал на плазматичній мембрані, але підвищувало на 13% Д'Рміт-

Таблиця 1. Вплив складу середовища та засобу лііділєглш на величини різниці потоїщіалів (мВ) на плазматичній (ДЧ'-л) та штохондріалькій (Д'Рміт) мембранах ізольованих гепатоцнтів за відсутності (контроль) та присутності сукцкпату (дослід) у середовищі інкубації (М±ш)

Засіб виділення Контроль Дослід

ЛЧ'пл Д^МІТ п Д^ПЛ Д'Рміт п

н-клітини -31.8±0.9 -172.ІІ4.8 3 -38.7±1.1* -172.513.4 4

г-клітини -23.6+3.0* -139.8+6.6* 6 -31.0+2.3’6 -155.6+4.7* 11

ц-клітани -28.7±2.8 -194.5±5.0' 6 -37.9±2.3* -168.2+5.7* 11

ф~ клітини -30.1±2.1 -171.6±11.9 7 -38.615.6* ! -161.Ш3.1 1 13

Середовище інкубації: Дюдьбекко. Температура виміру - 37°С. Зміни достовірні: * - по відношенню до контролю (Р<0.С01\ ‘ - по відношенню до ф-клітин у контролі (Р<0.002), ^ - по відношенню до ф-клітин у досліді (Р<0.001)

Відомо, що транспорт глюкози через плазматичну мембрану сполучений з градієнтом Підвищення цитоплазматичної кон-

центрації N3"^ внаслідок транспорту глюкози маже бути причиною зніотешш плазматичного потенціалу, а зниження мітохонд-ршльного потенціалу, вочевидь, пов’язане з підвищенням концентрації АДФ через аістнп&цію натрійового насосу. Для мітохои-дріального субстрату цитрату не знайдено переносників на плазматичній мембрані, але кожна вважати, що дія на ДЧ/М|Т пов'язана з його накопиченням п клітинах під час перфузії, бо у роботі [Петренко О.Ю., 109Л] виявлено, що цитрат збільшує швидкість ендогенного, а надто роз'єднаного дихання, проникаючи крізь інтактну плазматичну мембрану. Цей результат узгоджується з отриманими даними щодо збільшення ДЧ?М;Т у ц-іслітинах (табл. 1).

Можна припустити, що глюкоза і цитрат, накопичені клітинами під час перфузії, справляють різний в пліт на МП мітохонд-рій тому, що для поновлешш енергетичних витрат клітини глюкоза, головним чином, утилізується в реакціях гліколізу, тоді як цитрат е мітохондріальним субстратом ціжлу Кребса.

Присутність у середовищі інкубації зовшшньоклітинного типу мітохондріального субстрата сукцкнату спричиняє підвищення А*?пл У всіх порівнюваних клітин (табл. 1). Не змінюючи мі-тохондріальний потенціал н- і ф-клітин, сукцинат справляє "еф«;кт вирівнювання" ка' А'Уміт ц- і г-іслітии, підвищуючи його величину до рівня ф-ІСЛІТИН. .

Під час інкубації ізольованих гепатоцитів без сукцинату у середовищі внутрішньоклітинного типу (цукрозне середовище) величина ДЧ'міт не змінюється, а ЛЧдд при цьому знижується на 28% (табл. 2).

Таблиця 2. Вплив складу середовища інкубації та сукцинату на величини А'і'пл та А'ї'міт ізольованих гепатоцитів (М±гп)

Зас. виділ. Серед інкубац. Д‘РПЛ (мВ) Д^міт (мВ) сукцинат

Г-КЛІТИНИ Дюльбекко -23.6±3.0 (6) -139.816.6 (6) -

г-клітини цукрозне -16.913.4 (6) -133.716.8 (6) -

г-клітини "калійове" 1.710.9 (3) -118.7+12.3 (3) -

г-клітини цукрозне HJB. -144.4110.2 (3) -

ф-клітини цукрозне Н.Б. -173.912.3 (4) +

г-клітини цукрозне Н.В. -179.2110.8 (3) +

н-клітини цукрозне Н.В. -171.818.3 (3) +

Цуіфозне і "калійове" середовища не містили Са2+. Теїлпература інкубації - 37°С. Н.В. - ДТпл не визначали, бо дигітоніп вносився в середовище інкубації до ХКЦФ. В дужках вказана кількість експериментів.

Отримане зниження ЛТпл в цукрозному середовищі узгод-зкується з даними робіт [Henderson R.M. et al, 1987, Howard LJE)., Wondergem R., 1987], в яких мікроелектродною технікою досліджували вплив заміни NaCl цукрозою на ДЧ'пл ізольованих гепатоцитів. Хоч механізм цього ефекту залишається не з'ясованим, мозкна ввазкати, що деполярізація може бути пов'язана зі зниженням калШової прсводкмості плазматичної мембрани за цих умов [Fitz, et al, 1989]. Ішсубація гепатоцитів у ’калійовому" середовищі сіхрлчкяяла зниження ДТміт на 15%, і повне скидання Д'і'ші (табл. 2). :

Під час пермеабіпкпції плазка'щчної мембрани дигітоніном у середовищі внутрішкьсіслітіїЕпаго типу ДТ}діт, генеруємий за рахунок ендогенних субстратіз, не відрізняється від значень інтактних клітин, а в присутності сукцинату Д^шх перевищує такі зк значення для цілих елітшх (табл. 2), які генерують потенціал на ендогенний субстратах.

Як видно з мол. З, гепатоцити поглинають К~*~ з цукрозногс середовища, яке містило фізіологічну концентрацію Са2+ (кризі 1

і 3). Дія на цей процес

ч 10 '

•V

А

Я

м

3-ій1

КЛ

3-10'

Трітоа Х-ІОС Хрігси х-100 ’

у* „■

І! І *

ХКЦФ

\ Щг.

Діг. уабаіну свідчить, що ^ транспорт К+ у клітини відбувається за рахунок роботи і,Та~г-К^-АТФази. По різниці початісової швидкості входу К+ (пунктирна лінія) і швидкості виходу після дії уабаіну розраховували активність На‘г-К^-АТФаги. Дигіто-нін спричиняє ШВИДКИЙ вихід всього внутрішньогслітішпсго • к+, внаслідок пору-

шення цілісності плазііатігчної мембрани та роз'єднальної дії Сл2+. Інгібіторп та роз'єднувачі СФ гх-слнкаїаті, попільний вихід К+ з клітин, а дкгітонін ггрігсгсоргсс цей процес.

У Єезкальцієгому середов;сці характер дії роз'єднувачів тп інгиоггоріп ОФ не змінюється, тоді як дигітопш па призводить до

попного виходу К+. Лише наступна добавка ІТКЦФ або антиміци-

ну А забезпечує певний вихід (удл. З, крива 2). Таїсс.! чиііоії, використання дигітсніну у псіхцгптрацп, яка петеабілізус плаз-піатичну мембрану, та нпстушпзї дсс~п;с:і г ;іто::о:тдр Ілль них роз'єднувачів або іпгибітсріз дозволяс Екгпачютї тіутріїшіьоіиіітишЕЕҐ’/

,о-іТ І І

Гц

Мол. 2. Бплзт уаозіїїу, дигітоігіну, іїггібіторіз і рси'сдііувпчш ОФ :т трззгепорт К^" з ізольованих гспатацитах. 1 і 3 - виміри у серодопісці, яка містило 290 мМ цукрози, 1,2 їіМ СаСІг, ЗмМ М§Є04, 2 мМ Н3РО4, 5 иМ тріге-НЕРЕчЧ, рЕС 7,1 2 - це гк сародовшце без Са2+. Добапк; і: уабаін - 1 мМ, ХКЦФ - 1 пхї>ї, ДКФ - 50 мкМ, зптигііцшг А (Апт. А). - 2 мкг/мл, діптгоиіи (Діг.) - 40 кхг, тр:ггон Х-100 -й,2"с. гепатоізггп (Гц) - 2x10^ клітзгь

розподіл Кг та розрахувати мітохондрІальну та цитоплазматичну концентрації К+.

Порівняння швидкостей транспорту виявляє, що за

ШВИДКОСТЯМИ входу К"^ клітини не відрізняються, тоді як швидкість пасивного виходу після дії уабаіна в ф- і г-клітинах підвищується, а в ц-клітинах знижується порівняно з н-клітинами (Мал. 4). Необхідно відзначити, що зсі клітиші характеризувалися високою концентрацією • в мітохондріях, тоді як цитоплазматична кон-

Мал. 4. Швидкості иакошічеїшя (Увх) і виходу (Ушк) К+ під час інкубації ізольованих гепатоцитів, виділених нефермєктатішниа без субстратів (н), в присутності глюкози (г) або цитрату (ц) і ферментативним (ф) методами. Умови внміргопані. наведеш в мал. 3. ❖- зміни достовірні по відношенню до н-клітші (Р<0,05).

центрація К^" зніжувалась у ряду: ф-, г-, н- і ц-кліткни.

Зниження

{К]цит, кМ БО 100

150

Мал. 5. Вплив цитоплазматичної концентрації К+ ЦКІцит) на Д'Р плазматичної мембрани (мВ) гепатоцитів.

цитоплазматичної концентрації К+ супроводжується гіперполяріза-цією плазматичної мембрани {Мал. 5). Можна вважати, що зниження цитозольної концентрації К"*" пов'язане з активацією К+-

каналів, що, як відомо, призводить до підвищення потенціалу на плазматичній мембрані

■ , 14

Побудова у напівлогарифмічюсс координатах (Мал. 6) залеік-

К+ від глітохоядріального потенціалу показує, що критичне значення його величини, визначається з зоні -100 мВ. Необхідно відмітити, що шіжче цих значень не визначається. Спостерігається його скинення, яке супроводиться втрато» пїіутрішньоіслітинного К+.

Взаємозв'язок матри-ксної концентрації К-7* та •потенціалу дсбре простежується на пермеабілізовзних гепатоця-тах до та після заморогкувашія-відігріву. Швидке заморог-гсуваїї-іія-ппиїдіспй відігрів (ШЗ-ШВ) без кріопротептсру сзігковиділе-шсс гепзтоцитіз призводить до необоротних порушень ігезале;:сгго від використаного середовища закороїяуоаїшя - сольового, цук-рсзкога з Са2+ або без Са2+. Пернеабілізовані гепатоцити після гаморомсувапнп-зідїгріву з цугсрсг::с?.;у середовищі віхутріїпііьсклі-тиїлюго типу здатні частково зіднозліоваттї енергетичні показники, однак потенціал, на відміну від коптроля, був несталим і починав знижуватися.

Після ШЗ-ШВ змінюється і кінетика транспорту Середовища згмсрагі.уватш різного сісладу (зовішшеьоклітіпшсго тішу, цукрозне з Са.2+. внутрішньоклітинного типу) пз забезпетухоті. зберегкешія внутріїшгьоклітіашаго К^* з ізольованих гепатоцитаг: і спостерігається швидкий його вихід у середовище інкубації. При цьому ХІЩФ не впливає на швидкість Енходу Е+, що с”ідгг.:~>

■ 15 .

исаті цитоплазматичної концентрації 1ое([К]цит)

10 100 1000

Мал б. Залежність цитоплазматичної концентрації К+ ([Х]цігг) 3>Л величини по-тенці.ілу на внутрішній мембрані мітохоп-дрій (Д'і'їагг) с складі ізольооашсс гепато-іеттіз у капіалотарнфшчних координатах.

про пошкодження мітохондрій, а дигітонік незначно прискорює цей процес, що відображує порушення інт&ктпості плазматичної мембрани. ІІермеабілізованІ гепатощті після ШЗ-ШВ деякий час утримують матрккснзій К+ і його вихід корелюс з падінням Д'И міт- Отримані результати свідчать про вазклилість сісладу внутріїшшоклітшшого середовища в кріопошкодзкеїші мітогсондріл та необхідність розробки методу ■ кріоконсервувашш, який забезпечить зберелгеїшя мембранний структур.

Таблиця 3. Порівняльна характеристика гепатоцитів до {контроль) і після кріоконсервування та очищення (дослід) у градієнті щільності перколу (М±т, п=3-9).

Досліджувані параметри Контроль Дослід Зміна Р

Д'Рміт, «В -161.Ш3.1 -171.4±9.0 +е% >0.1

Д'і'пл. -38.6±5.6 -34.7-2.5 -10% >0.1

Загальний вміст К~, кмоль/10б КЛІТИН 551.2±3?.2 1Є7.2±57.0 -64% <0.001

{К+Іміт, мМ 127.7±11.9 120.3±37.4 -6% >0.1

мМ 97.1+8.1 18.3І8.5 -81% <0.001

Увх, нмоль К+/хв/10е КЛІТІШ 12.8±3.0 6.1±4.5 -52% >0.1

Увих. нмоль К+/хв/10й КЛІТИН . 11.2±1.8 4.9х0.9 -50% <0.001 .

Активність К+/Ка+-АТФази, нмоль К+/хв/ 106 клітин 24.0±3.6 10.9±5.5 -55% <0.001

В зв’язку з цим був розроблений метод швидкого двоетапного заморожування під захистом ДМСО із зупинкою в зоні -20°4-25°С. Кріоконсервувашш призводило до зниження життєздатності на 26%. При цьому за загальним вмістом внутрішпьоклтшного К+, його цитоплазматичної та мітохондріальної концентраціями та початковою швидкістю входу деконсєрвовані клітини не відрізнялись ВІД КОНГрОЛіО. Проте,

16

швидкість пиходу К"*" зростали у 8, а ахгпзність На^/К^-ЛТФазп - більш ніж у 4 рази. Швидкість ендсгезгсго дт-с'анлл нниікувалась на третину, а МП бус нгеталніл Мелена г:ЕЛг::ат:-і, ігр такий ефект спргззпшсться присугніста п серсдоглпд: ілігуСаг." досить великого відсотку загиблих під пас хфкксскссрг.улглсгт: клітин.

Дійсна, очшігзеія суспензії бід пошкоднгечшх кліт;лі у градієнті ЩІЛЬНОСТІ пергсслу ПрШЗОДИТЬ ДО відновлення КІКаТИКЇІ KaKC-пиченнл ТФФ~ до рівня коптролго і нсгначнаї гіііни хінсттллі транспорту К+ '

Деконсерволапі клітини гспсруїзть і *?пд :La P-2’^ x:c:rr-

ролмгик (табл. 3). Рапс:.: а тип спостерігається збзепйліиі аагаль-ного вмісту внутріпгаьсіглітіїїсісго шсэ шагнться па рахуло:: 5-кратного падіння цігтошіазматилпої копцянтрації, іл сб-.2ре:кеігнлгі мітс:;ондріальної. При цьог*у есг.идт-.ісгь глоду ІС** на г^-Ніг^стасг, я шьидкість пиходу і пптілзгпсть На'^Д^-АТФазп алтллуатітС." у 2 рази. Ці фзхстп свідчать про пзсггодлсох- з&рзгксаігх фук; локальної агеппнхсеп мітскогідрій длл г-гзтезабегЕЗ’ісіпїЯ лліт.’лі

■ " БИСЕЮЕПІІ

1. Вгаг-тепл" розподілу ліпсфілг-тісго х-гтіслу т^графа^ітфс-гфонга

са дсютлсіглз іс~-сол8кг;гг.пего с-лгггі'роду доанолл:: з сдпсьіу зразку вгспачстя палг-гчгсзп пог-25Ц?£Лгз za ~~-ру^'—?ї‘.'- иаігсраїїі і^толоцдрій та плззі:лтт:?лп:1 ;.:с::сріг:і гзт'гсцгггі'?-. .

2. РслрсЗлк.о г.:є-гсд ітгпійгсртгсго гжялізу, ягггй дсзноллг за дсггс-г'стх'гз ігалЬІ-сллєхтігзтіего ел^г.тпе~г б сдпс:" праглу і«±г:аі екз-начати актяззість На'г/ІІ'^-АТСазг;, :*ал:;іс"у прспсдггхіегі плаз-ї'атичлої ї.г2ітбрл~і та Eidar І*-!- л ’dTc:cc~^pi^^s.otty та пг:*іто-ксхдріальЕС’.ту лсг.гггарт: 'лгтгал іаал:-сллл~:л. г'іглтсц:,—:'.

З. Гегпісцлтк, зиділеві ферментативним і неферментатизним методами, відрізняються активностями На^/КТ-АТФази, калійовою прозідкмістю плазматичної мембрани, а такс»:; концентраціями 1'“ п цитоплазматичному та мітохондріальному компартментах.

•1 Величина мембранного ■ потенціалу і знутрішньоклітшший розподіл іоаіз калію можуть регулюватися на етапі перфузії печінки під час виділення гепатоцитів і в перебігу подальшої інкубації

5. "ПермеабЬпзащя'' гепатоцитів, яка включає часову обробку згїгькигпі концентраціями д;ігітоігіну, дозволяє . одержати клітини з прсшпа:о:о плазматичною мембраною і мітохондріпми, що мають зпсогл бюсвгргетачш шжазяшзь Виявлене часткове відновлення функціональної аіггїЛі-іості иітохондрій після заморожування-зідігрізу перм'еа^зйнгизаних геїізтоцитів у цукрозному середовищі свідчить про' роль знутршішїоклтшного середовища у кріопошкодокенні мітохондрій.

6. Метод кріоконсерБування гепатоцитів під захистом 10% ДМСО, який віслючає швидке двоетагше заморожування із зупинкою в зоні -20° -5- -25°С, швидкий відігрів та відмивання кріопротектора середовищем, що містить 0.5 М цукрозу або глюкозу, дозволяє в значній мірі зберегти життєздатність суспензії.

7. Після кріоконсервування інтактні гепатоцити зберігають МП та мітохондріальшій, але не цитоплазматичний рівень К+. ЗЄере-гкення мітохондріями мембранного потенціалу та концентрації К* с обов'язковою умовою відновлення рівня калію з цитоплазмі гепатоцитів, що знизився під час виділення або кріоконсервування. Вміст К+ в цитоплазмі збільшується під час інкубації деконсервовашіх клітин за рахунок уабаін-чутливого транспорту.

Список робіт, які опубліковані за тог.гою дисертації

1. Гришук В.П.. Петренко AJO. Распределение лкпсфильного катиона тетрафенилфосфония s изолированных гепатсцитах ирнс после замораяитания-отогрева // Биохигшческие аспекты ::рио-ггапремсдения и криозащиты клеточные систєії. - Харьков, 1939. -С. 98-103.

2. Петренко AJO., Гришук В.П. Влияние аамораїїсизания-отогреза под защитой диметс^їсульфокеида на сохранность изолированные гепатощггов крыс /} Физшго-:сшичесісие свойства и биологическое действие криопротектороз. - Харьпоз, 1230. - С. 103-114.

3. Петренко А .ОТ., Гргатхук В.П, Чувстатп^льпость л зоморакссза-шсо-отогреву шгкшщдрий з ccsrar.2 іЕтаїгтагі гх пернеабютіги-розанньп: гепатсщггсз // Влняпггз о:*.гг‘.г:;“оп':п. па бнолспгчаскле ooT-orrrbL - Харзігсз, 1025. - С. 1СЗ-1ГХ

4. Петренко А.Ю., Гп-тгт-^ 75. Т7.. Сусач AJL, Рсслгпгоз А.Д., Бгяоуе

АЗІ Srrc п г с-т: г^с ег гсо соетссгг:2 ггттоцгггсп сьгггп: кр&к,

пкдолзнпьп с псг:сщ»:э ЗДТЛ :r-rr:rjr.r?2i // Sijceeccsc. - 1S?HD. -54, Г' 12. - С 1£D2-I023. .‘ ;

5. Петренко AJO., Грггпут-г В-TL- Осргдал22г:э rjrrr-ssorn; ІТаД-

АТФагьх і; су&глстсчгсго гяпсз ^олгп s спегісезгг-

делстпнлп. гопг.тсггггг.”// Ц;:тг>.~сг:'.^. - 1GC3. - 32, M •?. - С. 944-0-15. S. Petrenko A.Yti, Gr:'~?hn;: V.P., Bo’Iynircv AJD., Mamr SIP, Bckms A.M. Survival, riotafccllc asiivli7 csd transport cf potassium. іопз c£ rat hepatocytes alter rap’d f:-eor.2-tIiat7ing under protceticn of dknethyIsuL±o"ids and csparatlrn. !r. Рггсс’І dansity gradient // Cryc-Lettors. - 1C С 2. - IS. - P. 27-?:. ■ .

?. Петрепзэ AJO, Ггг-rr.-; ь.тт, Рс=л.таз А-Д, I-Ьсур CJL Crxccc5 т:с~2ср~ггрсг"~гг: гз~~тсг*г.'С"\. // Аптс^ггхо епг'дзтс-ЛЕатгд ГГ

1с:г_ . ' '

S. Petrenko A.Yu., Sukach. AN., Grischuk VIP., Mazur SP, Roslya-kov AJD. Separation of intact and damaged hepatocytes in sucrose following non-enzymatic liver perfusion // Cytotechnology. - 1995. -17. - P.127 - 131.

9. Petrenko A.Yu., Sukach А.Ы., G rischuk V.P.t Mazur SP., Roslya-kov AJ3. Simultaneous isolation of intact and permeabilized rat hepatocytes // School of Fundamental Medicine Jornal.- Kharkov: Osnova, 1995.- Nz 1. - P. 14-17,

10. Гршдуі; В.П., Жегунов Г.Ф., Гулевский A.K. Свойства лонных насосов различных тканей гетеротермных животных"// Всесоюзный алмпсзиум. "Семен веществ при зтшей сютше к естественном сне". Тезисы дотсладоз. - Махачкала, 1985. - С. 8S.

11. Грпшук БД. Использование тетрафегоілфосфошій-селектив-ного электрода для определения мембранного потенциала в изолированных паренхиматозных. клетках печени (гепатоцитах) // "Актуальные проблемы ыедицины и научнотехнический прогресс". Тезисы докладов. - Харьков, 1983. - С. 23.

12. Петренко OJO., Сукач OJvL, Мазур С.П., Росляков А.Д, Гри-

■ щук В Д. Модифікація клітишіаго метаболізму на етапі виділення

гепатоцитів // Ш-й Український біохімічнй з'їзд. Тези доповідей.

Ч. 1. - К, 1992. - С. 219.

13. Гріадук В.П., Петренко А.Ю., Мазур C.IL, Росляков АД. Функции гепатоцитов после быстрого двухэтапного замораживания и отогрева под загцктой ДМСО// "Успехи современной криобиологии*. П Международная конференция. Тезисы. - Харьков, 1992. -а 108-109.

14. Petrenko A.Yu., Roslyakov AD., Grishehuk V.P.. Mazur S.P., Factors affecting the functions of cryopreserved rat hepatocytes during incubation // 30th Annual Meeting of Society for Cryobiology. - USA, New- York, 1993. - P. 25-2S.

' . . 20

15. Petrenko A.Yu.. Grisnchuk V.P.. Roslyakov AJ3., Mazur SJ?. Function of mitochondria in cryopreserved hepatocytea// 31th Annual Meeting of Society for Cryobiology. - Japan, Kyoto, 1994. -P. 133.

16. Гриіцух В.П., Петренко A JO. Мембранный потенциал, транспорт к знутршелеточное распределение ионов каліш в изолированных гепатоцитах // 1-й съезд Белорусского общества фото-биолегов :і отюфиззіХов. Тезисы докладов. - Мився, 1994. - СЛ8.

17. Петренко О JO., Мазур CJL, Росляков А.Д., Грістіук B.XL Модулятря специфічних і інтегральних функцій з ізольованих гепатецитах // 1 з’їзд Українського товариства кріобіологїї і згріомедггціїЕи. Тези доповідей. - Хар:ап, 1095. - С. 197-198.

13. Петренко О.Ю., Сухач О.М., Мазур CJL, Гргнггутї ВДТ Росляков А.Д. Ізольовані гепатоцтгггі - модель для піівчешіл механізму дії лікарських препаратів // 1 ітирснальїшй з'їзд фармакологів України. Тези доповідей. - Полтава, 1995. - С. 129.

Грішіук B.IL "Мембранний потенциал, транспорт п пнутрп-клетечнее рзспредеигЕке конав заяия зз изолированных гепато-цитах хрыс до и после действия низких температур". Рупспксь. Диссертация на ссисханяа ученой степени кандидата бипяспгчес-к;сс наук по спащальнссти. 03.00.22 - зркебиояогия. Институт прсслєи крисбпслоппі 7і зрксмедицини НАН Украины, Харыссз, 1935.

Защищается 17 научных работ її 1 аптсрсхса спидательста. С ncv.cirrb.'o разработанных метедез определения рагннпы потэн-гціалса яа митохондриальной и плазматической мембранах :~с-лирспапных геттатецитоз крыс, а таїсно регистрзіспі кинетики транспорта и внутриклеточного распределения 1\~~ было гтроз<»-дэяо не следование зависимости указанных параметров ст услс-

вий выделения, инкубации и низкотемпературного воздействия. Обнаружено, что условия выделения и инкубации изолированных гепатоцитов опазывазот существенное влияние на величины потенциалов митохондриальных и плазматических мембран, вку-тргжлеточкое распределение к клнс-тш«у_ транспорта К“, а также дыхательную активность гепатоцитов. Согласно полученным дан-нънв, повреждающее действие низких температур ыа митохондрии в составе клеток определяется составом внутриклеточной фнемитохондриальной) среды. С учетом полученньгх данных разработок метод быстрого двухэтапного криоконсервирсвания изолированных гепатоцитов крыс под защитой ДМСО. Обнаружено, что сохранение функциональной активности митохондрий и митохондриальной концентрации Появляется необходимым условием сохранения жизнеспособности меток после криоконсер-виронания. ■

Grishchuk VJ5. "Membrane potential, transport and Intracellular distribution of potassium ions in isolated rat hepatocytes before and after affecting of low temperatures". Thesis of the Candidate of Biological Science with the speciality in .cryobiology, Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine o£ the- National Academy of Science of the Ukraine, Kharkov, 1S35.

It have been 17 scientific papers and 1 personal sertific&te. On the basis of designed methods of determining of potential differences on mitochondrial and plasma membranes of isolated rat he-patocytec and registration of transport kinetics and intracellular distribution of potassium ions the dependence of mentioned characteristics on isolation and incubation conditions and low temperature influence on these parometeres lias been studied. It has been shown that the conditions of isolation and incubation play substantial role in the preservation of mitochondrial and plasma membrane

22

potential values, intracellular distribution of potassium lens ana hepaiocyte respiratory activity. According to obtained data the injurious influence of low temperatures ir. determined by the composition cf intracellular extramitochondrial medium. Talcing in attention of obtained data the method of fast two-step cryopreser-vaticn of isolated rat hepatccytss with using ai DMSO as a eryo-protector has teen designed. It has been shown, that the preservation of functional activity or mitochondria and intrs mitochondrial potassium ion concentration is a essential condition of cel! survival after the cryopreservation.

<5

K-no^osi cjzotsz: renarcr^tT, hrrcyca^ux, nnnaziaTmna ?a miyr-pinrsa Mirososapianisns itasiSpasn, Meaicpanrrrii noresxiias, imm ica-Tha, TpsLTiCnopT, EHyrpiiinsci^dTisHnn xcHi^eirrcai^Ls, nricsi^reH-nsDaTypue TOHcepny^azdrL -