Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы транспорта кальция в гладкой мышце

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизмы транспорта кальция в гладкой мышце"

)

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А. В. ПАЛЛАДИНА

На правах рукописи

КОСТЕРИН Сергей Алексеевич

УД к [577.352.43 + 577.352.45]: 546.41:611.664

МЕХАНИЗМЫ ТРАНСПОРТА КАЛЬЦИЯ В ГЛАДКОЙ МЫШЦЕ

03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

КИЕВ —1987

Работа выполнена б отделе биохимии мышц ордена Трудового Красного Знамени Института биохимия им. А.ВЛашидина Академии наук Украинской ССР

Официальные оппоненты : член-корреспондент АН УССР,

доктор медицинских наук, профессор ШУБА 11.Ф.,

доктор биологических наук, старший научный сотрудник 1СЖСЩ0М ЕЛ.,

доктор биологических наук, ставший научный сотрудник ОРЛОВ СЛ.

■ Ведущая организация : Институт зволтпционной физиологии

и биохимии им. И.М.Сеченова АН СССР

/.Заката диссертации состоится в / у ~ часов на заседании специализированного совета Д 016.07.01 по защите диссертаций при Институте биохимии ш. А.В.Далладша АН УССР по адресу: 252030 г .Киев 30, ул. Леонтонича 9.

С диссертацией маяно ознакомиться в библиотеке Института.

Г4

Автореферат разослан " " О^^О.-Щ Та&рт.

Ученый се1фетарь специализированного совета , КИРСЕБК0 О.В.

i-тдсл №£серт£ций

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сокращение и расслабление гладких мышц (Ш) лежит в основе функционирования желудочно-кишечного тракта, матки, кровеносных и лимфатических сосудов, мочевого пу~ 'зыря, мочеточников, сфинктера зрачка глаза, протоков желез внешней и внутренней секреции. Ионам кальция принадлежит существенное значение в активации сокращения гладкомышечных клеток (ШК). В И является эффектором специфических белков (кальмодулнна, леи-отонина), индуцирувднх контрактилызый ответ /Лспозига , ВЬоаЫ , 1980; Uarstea , 1982; Данилова, 1985/. Доказано, что при возбуждении гладкомышечной ткани увеличение концентрации Са^+ в миоци-тах происходит преимущественно за счет внеклеточного пула катиона. С помощью элактрофизиологических подходов получена важная информация о путях и механизмах поступления Са^+ в ШК, закономерностях слектро- и фармакомеханического сопряжения в Ш /Bolton 1979; Шуба, IS8I; Шуба, Еурчй, 1984; LoutzenMser et al., 1985/.

Менду тем, к началу выполнения диссертационной работы (1979 г.) сведения о биохимических механизмах, регулирунцих уровень внутриклеточной концентрации Са^+ в гладкошшечной ткшга, практически отсутствовали. Впоследствии появились неоднозиач1ше данные, указывающие на возможную роль сарколеммы различных И в реализации АТР- и Яа+-зависимого переноса Са2+ из шоцитов в межклеточное пространство /Астапова, Попкова, 1980; Grover et al, , 1981; Daniel at al. , 1982; Grover et al. , 1984, 1935; Po-pescu at al., 1986; Sakal et al. , 1986/. Что же касается сарко-плазматического ретикулума (CP), митохондрий (MX) а ядер, то в литературе нет единого мнения о значении этих внутриклеточных структур в кальциевом обмене в Ш /Popescu et al. , 1974; Ra-eymaekers et al. , 1977; Carsten, Miller , 1980; Batra , 1982; Carsten, Miller , 1985/. В целом же существующие представления о системах активного транспорта Са^+ в Ш, свойствах этих систем, их участии в поддержании кальциевого i^меоотаза в мио-плазма весьма противоречивы. Не цроведена количественная оценка вклада отделышх механизмов трансмембранного переноса Са2+ в обеспечение сокращения и расслабления ШК. Это является существенным препятствием в поисках эффективных регуляторов уровня Ca * в клетках гладкомышечной ткани. Поэтому назрела настоятельная потребность систематического изучения механизмов энергозависимой

р, о »

транслокации Са в Ш, идентификации вклада Са -транспортирующих систем в регуляцию концентрации этого катиона в ШК.

Среди ИЛ особое положение занимает миометрий, что обусловлено, в частности, той особой функцией, которую матка выполняет в организме. В соответствии с данными световой и электронной микроскопии миометрий - один из наиболее подходящих объектов, который можно использовать для выделения фракций субклеточных структур IU : содержание собственно гладкомышечной ткани в нем весьма высоко (более 90$) /Daniel et al. , I977;JaniB et al. , 1977; Matlit et al. , 1979;Grover et al. , 1980/.

Цель и задачи исследований. Цель работы заключалась в выяснении биохимических механизмов регуляции внутриклеточной концентрации кальция в IM матки. Решались следувдие задачи.

1. Поиск систем активного и пассивного транспорта Са^+ во фракциях субклеточных структур миометрия.

2. Изучение свойств этих систем.

3. Исследование вклада Са^+-транспортирувдшс систем в регуляцию концентрации этого катиона в клетках миометрия.

Научная новизна раб-ты. Впервые проведено систематическое

исследование биохимических механизмов, лежащих в основе кальцяе-

р.

вого гомеостаза в Ш, идентифицирован вклад отдельных Са -транспортирующих систем в регуляцию концентрации катиона в ШК матки.

Основными внутриклеточными депо кальция в миометрин являются ядра и MX. В Ш матки существует три пула кальция, различающиеся значением характеристических времен обмена, что свидетельст-вуе? о множественности механизмов, вовлеченных в обеспечение кальциевого гомеостаза в миоцитах.

2+

Бо фракции Ш ТЫК идентифицирована система MgT ,АТР-зависи-мого транспорта Са2+, обладающая высоким сродством к субстрату переноса (Km = 0,3 - 0,5 мкМ). Подробно изучены кинетические свойства "'g2*,Са-ЛТРазы и Са^+-транспортирузсщеЙ системы сарколеммы. Окситоцкн, сигетин, ионы двухвалентных металлов - факторы, способствуйте усилению сократительной активности миометрия, ин~ гибировали кальциевый насоо DM IMK. Этот насос вполне способен скомпенсировать входящий в невозбужденные ШК медленный диффузионный базалышй поток.и стационарно поддерживать концентрацию катиону в миоллазме на физиологическом уровне (КГ'' - 10 М). Система Mq "^-независимого АТР-зависимого транспорта Са2+ в cap-

колемме миометрия отсутствует. Оксалат нэ стимулировал М^2+,АТР-зависимое накопление Са2+ в интегральной фракции макросом ('.'С), кофеин не влиял на кальциевый обмен в этой фракции. АТР-зависимая аккумуляция Са2+ во фракции ядер шометрия не выявлена.

" О I

В Ш клеток мяометрия существует система На - Са обмана, характеризующаяся обратимостью, насыщаемостью по субстратам переноса, низким сродством к Са2+ (Кгп = -10 ~ 60 шШ. Активность об-менника не регулируется мембранным потенциалом (система "К+-нали-номхшин"). Обмошшк обеспечивает вывод Са2+ из миоцитов при большее концентрациях катиона в миоплазме II), предотвращая нарушение кальциевого гомеостаза в ПЖ при возбуздефгн.

Найдено, что ИХ ыдометрая обладают способностью шскумулиро-

вать Са2+ в энергозависимом процессе (величина Кт по Са -

4-6 мкМ). В расчете на I г массы влажной ткани максимальная акр.

тивность Са -транспортирущей систеш в 30 раз больше, чем кальциевого насоса ПЛ. Яа+ - Са2+ обмен в МХ шометрия отсутствует. Активный и пассивный транспорт Са2+ в МХ Ш регулируется величиной рН среди инкубации.

Установлено, что в основе трансмембранного выхода свободного кальция из везикул Ш ПЖ лежит его простая диффузия, тоздествен-ная медленному базалыюму входу этого катиона в невозбудденные кисциты. Проведенный анализ указывает на то, что в реальных условиях этот вход Са2+ непосредственно не вовлечен в оперативный контроль сократительной активности ШК, но он мопет вносить вклад в обеспечение базального тонуса Ш.

В Ш клеток мяометрия идентифицирована такке система электровозбудимой кальциевой проницаемости. Деполяризация Ш стимулирует выход Са2+ из везикул сарколеммы. Концентрационная зависимость потетщаалочувствителыюй компонента пассивного транспорта Са2+ описывается кривой, характеризующейся насыщением по субстрату переноса (Кт я 0,5 Ш). Эта компонента подавляет"я Д-600, Со2+, Мп2+. Кинетический анализ свидетельствует о том, что она тождественна стационарной (неинактипируюцейся) составляющей входящего в 1Щ при деполяризации Ш кальциевого тока, обеспечиваицей активацию тонического сокращения 1?.1.

Изучен механизм регуляции концентрации Са2+ в миоцитах матки.' Кинетический анализ механизма приводит к физиологически значимой величине времени снижения концентрации Са2+ в всзбу:дешшх

ШК (~18 сек).

Практическая значимость работы. Результаты цроведенннх исследований являются основой для разработки методов коррекции патологий контрактильной активности миомэтрия, причина которых кроется в нарушении внутриклеточного гомеостаза Са2+. Полученные данные служат обоснованием использования препаратов"окситоцина, сигетина, а также ионов двухвалентных металлов в акушерско-гпне-кологической практике как факторов усиления сократительной активности матки. Результаты, касаыцисся динамических закономерностей кальциевого обмана в IM, использовались автором цри чтении курса лекций "Биотическая кинетика" на кафедре биохимии Киевского государственного университета им.Т.Г.Шевченко (1979-1985 гг.). По материалам исследований в 1987 г. опубликована в соавторстве монография "Регуляция внутриклеточной концентрации кальция в мышцах", Киев, изд-во "Наукова думка", 144 с.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на У Всесоюзном биохимическом съезде, I Всесоюзном биофизическом съезде, 1У и У Всесоюзных конференциях по биохимии мышц, I'll Всесоюзном симпозиуме по биофизике и биохимии мышечного сокращения, IX-HI Всесоюзных совещаниях по транспортным АТРазам, I Региональной школе республик Средней Азии и Казахстана по биологическим мембранам, П Украинском биохимическом съезде, Республиканской научной конференции "Биохимия-медшщне", УН объединенном симпозиуме биохимических обществ ГДР и СССР (Лейпциг, 1983), III и 1У международных симпозиумах по физиологии и фармакологии гладких мышц (Варна, 1982, 1985), научном семинаре отдела биохимии мышц и нервной системы Института экспериментальной биологии им. М.Ненпкого (Варшава, 1985), совместной конференции научных работников ГДР и СССР - выпускников кафедры биофизики Киевского г (^университета им. Т.Г.Шевченко (Киев, 1985), научных семинарах Институтов биохимии им. А.В.Пал-ладина и физиологии им. А.А.Богомольца АН УССР. По теме диссертации опубликовано 20 статей, 12 тезисов докладов, I монография (в соавторстве).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы" (3 главы), "Экспериментальная часть" (7 глав), "Заключение", "Вывода", а также списка использо-

ванной литературы (750 наименований, из них 128 отечественных и 622 зарубежных публикаций). Работа изложена на 328 стр. машинописного текста (га исключением списка литературы, который приведен на 94 стр). Текст диссертации иллюстрирован 16 табл. н 73 рпс.

МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эксперименты проводили на ИД матки коров и крольчих, находящейся в состоянии функционального покоя. Некоторые опыты били выполнены на матке крольчих ври беременности (конец 2/3 периода вынашивания плода), в родах и послеродовой период (через I сутки посла родов). Эксперименты по исследованию кинетических свойств Са^-транспортарувдих систем была в основном проведены на фракциях субклеточных структур ыиометрая коров.

Фракции субклеточных структур миометрия выделяли модифицированным методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности оахарозп (за основу была принята ранее описанная методика /213*81 вt а1. , 1971/). Эти фракции идентифицировали с помощью электронномщфоскопнческого анализа, а также посредством определения активностей маркерных ферментов (51-нуклеотццазы, На+,К+-АТРазы, М^2+-АТРазы, сукщнатдегидрогеназн, цитохром с-ок-сндазн) и использования функциональных показателей. В последнем случае гаетиросали : ?1а+ - Са2+ обмен; чувствительность Мд?+,АТР-зашспмого транспорта к олсалату, фосфату и обработке фрак-гига дигитошшом; способность рутениевого красного, азида Натрия и 2,4-динитрофенола ингибировать энергозависдацй транспорт 0а^+; способность кофеина индуцировать пассивный транспорт Са2+. По степени своей чистоты и функциональной активности получаемые фрак-' щи субклеточных структур шгометрия были вполне пригодны для использования в экспериментах по исследованию механизма кальциевого гомеостаза в ПЛ.

При изучении содержания и распределения альция в миометрии методом атомно-абсорбционной с пектрофотометрии пробы препаратов ткани и фракций субклеточных структур ГМ готовили рагое описанным способом /ви.а«асЬегуа, 1981/. Содержание катионов определяли в пламени "ацетилен-воздух" на атомно-абсорбционном спектрофотометре' АА8 -I (ГДР).

Кинетические закономерности выхода Са2+ из интактных препара-

тов ткани исследовали в режиме ^Са2+ - ^5Са2+ обмена Достерин, Зимина, 1986/. Пассивный и активный транспорт "Са2+ во фракциях субклеточных структур гладкомышечной ткани изучали с использованием изотопного метода. Радиоактивность определяли на жидкостном сщштилляционном спектрометре BL-30 фирмы " Intertechnique " (Фр отдан). При исследовании влияния ионизированного кальция и халатного комплекса MgATP на начальную скорость аккумуляции данного катиона в субклеточных структурах шометрия значения концентраций реагентов в среде инкубации рассчитывали в режиме изоляции, исходя кз величин общих концентраций АТР, СаС12» MgCIg, ЭТТА и соот-ютствувдих констант равновесия / Eartfal , 1979/.

В экспериментах по изучению каталитических а кинетических CBoiicтв i.'g2+,Са2+-АТРазы фракции сарколемм! Ш матки мембранный препарат предварительно (в течение 30 мин) обрабатывали 0,2%-тш раствором дигитонина при комнатной температуре с последующим центрифугированием при 400С0g (30 мин); ферментативную активность определяли в осадке /Костерии и соавт., 1983/.

При исследовании влияния мембранного потенциала на Ка+-за-шспмый и пассивный транспорт Са2+ во фракции везикул сарколеммы миометрия потенциал формировали с "использованием системы "К^-ва-лкпомищгн" п тестировали с помощью флуоресцентного вдашшового красителя cllS- Cg - (5)/schilling, Lindenmayer , 1984/. Предварительно было доказано, что К^-диффузпонный потенциал бил достаточно стабильным во времени (характеристическое время диссипации - 3-5 мин), соответствовал рассчитанному по уравнению Нерн-ста л формировался независимо от химической природы аниона (хлор, глтаонат) или диссипирукщего катиона (натрий, литий, трис, холин).

Растьоры веществ, используемых в опытах, готовили на деиони-зированной воде, электропроводность которой (не более 1-2 мкСм) контролировали о помощью кондуктометра 0K-I02/I (Венгрия).

При анализе экспериментальных результатов применяли стандартные методы вариационной статистики. Динамические характеристики процессов транспорта Са2+, АТРазных реакций определяли методами формальной ферментативной и химической кинетики, а также с помощью специальных подходов, разработанных в процессе выполнения экспериментальных исследований /Костерини соавт., 1980, 1983, 1985; Костсрин, Бурчинская, 1987/.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Внутриклеточное распределение и обмен кальция в миометрии.

Как следует из результатов атсмно-абсорбционного спектрофо-тометрического анализа, в состоянии функционального покоя общее содержание кальция в миометрии коров и крольчих составляет 2,57± 0,30 и 4,54^0,47 ммоль на I кг массы владаой ткшш соответственно. Распределение содерглния эндогенного прочно связанного кальция в мисмэтртш коров удовлетворяет последовательности : ядра > МХ ^ "С = Ш. В осношшх внутриклеточных депо кальция (ядрах ц МХ) находится около Э0% всего прочно связанного в гладкошшечной ткани катиона. Расчет показывает, что содержание кальция, локализованного в ядрах (0,51 ммоль на I кг массы влажной ткани) и !>!Х (0,16 шаль на I кг массы влажной ткшш), соответственно в ЗоО и 100 раз больше его количзстза, необходимого для максимального контрактиль-ного ответа ПЛ.

Для всех функциональных состояний (функциональный покой, беременность, роди, послеродовой период) характерен следующий рот в расположении фракций субклеточных структур миометрия крольчих

о,

по способности адсорбировать Са : Ш> МС> МХ = ядра. Участки связывания Са2+ на Ш клеток миометрия имеют гораздо меньшее сродство к катиону (Кц = 50 - 90 тле",0, чем центры адсорбции на поверхности сарколеммы скелеишх мкшц : в последнем случае удалось идентифицировать два типа Са"+-связывакщих центров, характеризующихся значениями Кд 0,09 и 0,44 нйЛ /Костерин и соавт., 1980/. Учитывая низкое сродство Са2+ к центрам адсорбции, локализованным на Ш ШК, логично полагать, что энергонезависимое связывание катиона может приобретать сколь-шбудь существенную роль в регуляции его концентрации в миоцитах лишь при высоких ее значениях (Ю-5 - Ю""4 Г.:). Возможно, что связывание Са2+ Ш миоцатов матки 'выполняет предохранительную функцию, защищая от перегрузи! этим катионом при нарушении кальциевого гомеостаза.<

Закономерности выхода Са2+ из внутренних кошаршонтов глзд-комышечных препаратов катки крольчих (режим - 4оСаА'+ обме-

на) удовлетворяют сложной кинетике : в Ш идентифицируются три пула кальция, различающиеся значением характеристических времен обмена <Г (рис.1, табл.1). Охладдение (37°- 3° С) среды инкубации,

120 мин

г,2+

Рио.1. Кинетический анализ выхода Са из препаратов ткани миометрия крольчих (полулогарифмические координаты). I - зависимость освобождения Са^+ от времени} 2, Э и 4 - идентификация парциальных компонент кальциевого обмена на уровне пулов I, II и III соответственно (метод графе Аналитического вычитания). и ГПе(шч* текущее и максимальное количество Са^+ (нмоль на I г массы влажной ткани), освободившегося в среду инкубации в результате изотопного обмена.

Таблица I.

Емкостные и кинетические параметры кальциевых пулов миометрия крольчих.

Параметры

Пулы

II

III

Т , мин

Кальциевая емкость, мкмоль на I кг массы влажной ткани

180 ¿25 26-1 2,9 ± 0,4

890 ± 50 990 ¿'90 540 ¿ 80

Примечание: в экспериментах использовали препараты 1М б животных. ■

с

внесение в нее п-МБ (10 М) (ртутъорганического соединения, образующего меркаптвды при взаимодействии с S Н-группами транспортных АТРаэ), а также строфантина К (I Ш) (при изотонической зшле-не в растворе Кребса КГ1" на хсшш+) приводило к шггибированию освобождения Са2+ из ткани; введение в бескальциевый раствор Кребса Са2+ (5 Ш) стимулировало изотопный обмен. Результаты исследования влияния- указанных факторов на скорость изотопного обмена на уровне отдельных пулов свидетельствуют о том, что пул III наиболее быстро обменивающегося катиона в Ш - это внеклеточный и, вероятно, связанный с наружной поверхностью IM кальций. Эта фракция катиона практически полностью обменивается за 50-60 мин. Пул II представляет собой цитоплазматический и, возможно, слабо адсорбированный на внутриклеточных структурах кальций. За указанное время этот пул обменивается на 80$, его диссипация, по-видимому, сопряжена с функционированием Яа+,К*-АТРазы и системы АТР-зависимого переноса Са + из мкоцятов в межклеточное пространство. И, наконец, пул I медленно обменивающегося катиона - это кальций, локализованный во внутриклеточных компартментах. За время полного обмена пуда III кальциевая емкость пула I диссипирует лишь на ЗС$.

Итак, результаты изучения внутриклеточной локализации кальция в Ш и его пассивного связывания с субклеточными структурами, кинетического анализа изотопного обмена в препаратах гладкомышеч-ной ткана свидетельствуют о том, что в миометрии этот катион распределен гетерогенно. Данные о сложной динамике выхода Са2* из препаратов ткани Ш (рис.1) указывают на множественность механизмов, вовлеченных в поддержание его гетерогенного распределения и обеспечивающих кальциевый.гомеостаз в миометрии. Идентификации этих механизмов были посвящены дальнейшие исследования, проведенные на фракциях субклеточных структур IM матки.

II. М^2+,АТР-зависишй транспорт кальция во фракции сарколеммы миометрия.

фракция ПМ клеток миометрия обладала способностью накапливать Са2+ нз среды, содержащей АТР (3 Ш), MgCIg (5 Ш) и 45СаС12 + 40СаС12 (10 мкМ, 1-6 мкКи в I ш). Уровень накопления Са2+ во фракции сарколеммы был существенно выгае, чем во фракциях МС и ядер (табл.2). Результаты корреляционного анализа свидетель-

Таблица 2.

М^+,АТР-зависимое накопление кальция (нмоль на I мг белка за 15 шн) фракциями субклеточных структур миометрия.

Фракции

Гомогенат Ядра

Растворимая фракция

МО

ш

Коровы

Крольчихи

функциональный :Функциональный :Беременность покой (п = 5) :покой ( n а 5) : 1 о = 5)

9.8 ± 3,9 0,5 ± 0,2

0,1 - 0,0 2,1 - 0,6

6.9 i 1,0

0,7 ± 0,3 0,7 ± 0,3

0,1 ± 0,1 0,9 ± 0,4 9,4 Î 1,7

1,4 ± 0,5 1,2 ± 0,4

0,2 £ 0,1 0,9 £ 0,3 6,2 £ 1,7

'Примечание : результаты исследования энергозависимой аккумуляции Са2+ в свеяевыделенных ïvDC ШК матки в среде, содержащей АТР и сукцинат, представлены в разд.ЗУ.

ствуют о существовании хорошо выраженной линейной связи между величиной l,r.cf+ .ЛТР-завлекмого накопления Са^+ и активностью АТРазы (маркера цитоплазматической поверхности Ш ШК /Daniel , Jsais , 1975; Vallieres et al. , 1978; Квеутаекегв et al, ,

1985: Grover et al. , 1985/) в растворимой фракций, фракциях

2+

Ш, L'C л ддер. Следовательно, наблюдаемый низкий уровень J.îg. , АТР-зависимого накопления Са во фракциях ядер и ПС миометрия обусловлен примесями фрагментов сарколеммы в них.

Таким образом, энергозависикое накопление Са2+ во фракции ядер миометрия не было обнаружено. Поэтому, несмотря на то, что почти четвертая часть всего кальция в ТМ матки локализована тленно в этих структурах (разд.Г), нет оснований полагать, что ядра принимают участие в оперативной регуляции концентрации ионизированного кальция в ЕЖ. Накопление Са2+ практически отсутствовало и во фракции 1ЛС Ш матки. Введение в среду инкубации оксалата (1-5 1,11), обычно используемого дая тестирования Са2+-транспор-тирувдсй системы CP ЕЖ /Batra , 1978; Viuytack et al. , 1978; Wibo , 1981; Grover , 1985/, абсолютно не влияло на кальциевую емкость интегральной и очищенной (лишенной фрагментов Ш) фракции

Регистрация: ч** - по ХЩ

A-23I87

Рас.2. Влияние ионофора А-23187 на освобождение из везикул сарколеммы миоме трия Са2+» предварительно накопленного в

Мо2+,АТР-зависдмом просу

цессе. Концентрация ХЩ - Ю"5 М, Л 365 нм, ^

фчу.

ВОЗб. ~

= 530 им.

шн

1.5С. Эти результаты согласуются о данными, свидетельствуицими о практическом отсутствии оксалат-стймулируемой компоненты кальциевого обмена в изолированных шоцитах матки /Batra , 1982/. Кофеин С5 ¡i.l) - фактор активации выхода Са2+ из CP ряда II" /itoii et al. , 1982; Saida, Van Breemen , 1983; Stout, Sulllvsn , 1985/ также не влиял на обмен катиона во фракции MG Ш матки. Эти факты свидетельствуют о том, что в миометрии CP не принадлежит сколъ-нибудь значимая роль в регуляции концентрации Ca2"r в миоплазге.

Ол.

Итак, в случае IM матки система Mg ,АТР-зависимого накопления Са2* локализована во фракции Ш шоцитов. Дальнейшие эксперименты были посвящены изучешш кинетических и каталитических свойств транспортной систем сарколеммы миометрия.

Оксалат (1-5 Ш) не влиял на накопление Са2+ во фракции Ш 1ТЖ, фосфат (5 - 60 гЛА натрий-фосфатный буфер) активировал этот процесс. Кальциевый ионофор А-23187, введенный в среду инкубации на 15 глин после начала транспортного процесса, стимулировал быстрое тушение флуоресценции кальциевого .„¡дикатора хлор-тетрациклина (ХТЦ), освобовдеше ранее накопленного катиона (рис.2). 1 +

Следовательно, Mg ,АТР~зависимое накоплеше Са во фракции сарколеммы миометрия осуществляется против концентрационного градиента внутрь замкнутых цитоплазматической стороной нарушу фрагментов ЕМ.

Количественный анализ характера везикулированности мембранных фрагментов был основан на определении удельных активностей ферментов-маркеров (строфантин-чувствительной На+,К+-АТРазы и Mg. "'"-АТРазы) во фракции сарколеммы до и после обработки ее раствором дигитонина (0,1$) (предварительно было показано, что при такой обработке интактность везикул нарушается). Оказалось, что после воэдействм детергента активность строфантин-чувствительной На+,К+-АТРаэы, тестирующей незамкнутые фрагменты сарколеммы, возрастала в среднем в 1,9 - 2 раза; активность же М^+-АТРазы, характеризующей незамкнутые и замкнутые цитоплазматичеокой стороной наружу фрагменты Ш, не изменялась. Следовательно, фракция сарколеммы шометрия приблизительно на 5С$ (по белку) состояла из мембранных структур, замкнутых цитоплазматической стороной на-руясу; остальное количество фрагментов было представлено невези-кулированными структурами. Расчет показал, что Мф^.АТР-зависи-мая аккумуляхдая Са2+ в везикулах сарколеммы приводит к созданию 100-200 - кратного ионного градиента, направленного из внутриве-зикулярного пространства во внешнюю среду.

Специфические ингибиторы энергозависимого транспорта Са2+ в MX - азид натрия (5 Ш) и рутениевый красный (0,01 мМ) абсолютно не влияли на накопление данного катиона во фракции сарколеммы. Таким образом, в этой фракции отсутствовала примесь функционально активных MX. Ванадат - эффективный ингибитор система М^+,АТР-за-ВИС.1М0Й транслокации Са2+ через ИЛ кардиошоцитов, клеток скелетных мышц и мозга, а также эритроцитов /Bobinscn , 1981; Carafoli, IS83 ;wicbalak at al. , 1984/ значительно (на 80-90JS) подавлял накопление Са°+ во фракции Ш IMK матки цри концентрации 0,1 -I i.i,i. Следовательно, ванадат не является специйаческим ингибито-

о. р.

ром системы Мс£ ,АТР-эависимого транспорта Са , локализованной в сарколемме миометрия. Аналогичный результат получен при изучв-ш влияния ванадата на АТР-зависимую транслокацию Са2+ в Ш ШК желудка, гепатоцитов, эпителиальных клеток толстого кишечника, а также аксона /Baker, Singh. 1981; Chl;jBen et al. , I982j Ep-plng, Bygrave , 1984; Grover et al. , 1985/.

п-ХМБ, подавляющий освобождение Са из препаратов гладкош-течной ткани (разд.1), полностью'ингибировал активность транспортной системы в везикулах ИЛ ШК матки при концентрации 10 М (KL = бЛО"7 - 10-См). Этот результат свидетельствует о важной

роли S Н-групп активного центра Са2+-транспортирунцей систеш в обеспечении знергозашсимой трансяокации катиона. Снижение температуры (37° - 3° С) подавляло выход Са2+ из препаратов ткани миоме трия (раэд.1), аналогично, охлаждение среды инкубации в этом же температурном диапазоне полностью ингибировало аккумуляцию Са2+ во Фракции везикул сарколеммы. Временной режим функционирования Са -транспортирующей системы (несколько десятков; минут) (рис.Х, 4) примерно соответствует значению Т , характерному для пула II (табл.1). Следовательно, освобождение Са2+ из препаратов Ш матки действительно контролируется системой АТ?-закисимого переноса этого катиона, локализованной в Ш.

Известно, что АТР-зависимый Еыброс Са2+ из эритроцитов, си-наптосом и кардиомиоцитов обеспечивается Мд?+,Са2+-АТРазой / Sohatzmam ( 1982; Pemiston. , J983; Кудинов, 1983/. Что se касается П>1, то в литературе имеются фрагментарные сведения о свойствах системы Ы^?+,АТР-зависимого транспорта Са2+ через cap-, колемму. В основном эти сведения были получены при изучении Са2+-АТРазы фракции 13.1 миоцитов различных Ш. В собственных экспериментах активность М^2+,Са2+-АТРазы (10-15 мкмоль Р^ на I 1лг белка за I час) была идентифицирована во фракции Ш клеток миоме трия, предварительно обработанной дигитонином (.0,2%) и осажденной при 40 ООО (} (30 мин). Но наличие активности "экстра"-АТРазы в этой фракции само по себе не является доказательством того, что именно данная ферментная система обеспечивает М^2+,АТР-завпсимую транслокацию Са"+ через Ш ПЖ. Действительно, в Ш . клеток П.! идентифицированы М^2+-АТРаза, а также !.!д?+-независише Са2+-АТРазы, обладающие низким и высоким сродством к активирующему катиону. Имеются сведения, согласно которым АТР-зависимый транспорт Са2+ во фракциях МС и ПМ некоторых Ш может проявляться в безмагниевой среде при низкой концентрации иона-активатора /Tho-rens , 1979; Астапова, Попкова, 1980; I'andl, Ноу , 1984; Gro-ver cfc el. , 1984, 1985; Oakes et al. , I96U .

Между тем, в результате проведенных исследований было установлено, что Мд.2+ абсолютно необходим для проявления активности "эк-стра"-АТРаэы и транопортного-процесса во фракции ГМ миометрия: в безмагниевой среде энергозависимый перенос Са2+ не наблвдается даже в присутствии Са2+-преципитиругацего агента фосфата (20 ьМ).Име-

Таблица 3.

Кинетические и каталитические характеристики системы

,АТР-зависимого транопорта Са2+ и Mg2+,Ca2+-ATPa3H во фракции сарколеммы миометрия.

Характеристика 5 ,Са2+-АТРаза ! ,АТР-зависимое

s : накопление Са2+

!олготно необходим 3,0 - 5,0 № 0,39 Ш

АТР

i.o - 5,0 т

0,25 f.i.i

Со2+, Ып2+ 6,4 - 7,0 10 мкЫ 2,15 М 0,49 мкН

Примечание: |n-X.ffi}jQQ* - концентрация SH-реагента, при которой наблюдалось подавление ферментативной и транспортной активности.

ет место высокая субстратная специфичность по отношению к АТР: другие нуклеозидтрифосфаты практически не обеспечивали проявления ферментативной активности и трансмембранного переноса Са2+. По ряду характеристик (оптимальные значения Mg2+,ATP, рН, величины Km по Мс2+ и АТР, чувствительность к действию и-ХМБ) свойства Mg. ,Са -АТРазы и Са2+-транспортирувдей системы Ш ШК идентичны друг другу (табл.3). Следовательно, в основе АТР-зависи-мой транслокация Са + из миоцитов миометрия в межклеточное пространство лежит функционирование Ыд2^,Са2+-АТРазы.

S'e2+ и Ва"+ могут заменять Са^+ цри активации базальной Мо2+-

Рх о. р.

АТРазы, а Со и Mir1" являются аналогами Mg при реализации процесса АТР-з ависшого накопления Са2+ везикулами. При постоянных значениях концентраций ионизированного кальция (20 мкМ) и свобод-

Потребность в Мо.

+1опт.2 * Кт (по Mcf+)

Субстратная специфичность

и^опт.

Кт (по АТР) Аналоги Са2+

Oj.

Аналоги Mg.

fom., [п-ХМБ]^

Km (по MgATP)

Кт (по Са2+)

абсолютно необходим абс 5 ¡0 ьИ 0,18 Ш

АТР 1,0 Ш

0,16 т

Si

2+

Ва'

2+

6,4 - 7,410 мкМ

Рио.З. Влияние Са2+ на активность системы АТР-зави-симого транспорта данного катиона во фракции сарколеммы миометрия коров, Эксперимент выполнен в режиме юоляции о использованием Ca -ЗГТА буфера.

Ig -4 [са2+], М)

S

ной АТР (150 мкМ) уровень , АТР-зависнмого накопления субстрата переноса в ззэакулазс определяется концентрацией халатного комплекса MgATP в среде шшубации (оптимальное значение ~3 il,!) ; величина Кт по MgATP - 2,15 Ш (табл.3). Сродство ионизированного 'кальция к транспортной системе весьма велико - значение Knt по Са2+ составляет 0,49 мкМ. Величина максимальной скорости транслокации катиона V равна 3,9 нмоль Са2+ на I мг белка за I мин (0,65 нмоль Са2+ на I г массы влажной ткани за I мин) (в опытах по определении Кт и У концентрации свободных ATP, Mg2+, MgATP составляли 28 - 22, 20П - 2171 и 970 - 840 мкМ соответственно) (рис.3, табл.3).

Было найдено, что кальмодулин (3 мкг в 0,5 мл) в 1,5-2 раза активирует М^2+,АТР-завясимое накопление Са2+ во фракции везикул сарколеммы миометрпя, предварительно обработанной 3FÏA (I Ш). Активируицее действие кальмодулина подавлялось триФтазнном (ХО*"4!.!)

Итак, по своим свойствам (сродство к Са2+, М^ , АТР, MgATP, соответствующий физиологическим условиям конце нтрациохщый режим оптимального функционирования, субстратная и катиошгая специфичность, чувствительность к кальмодулину) система Mg2+,ATP-3aBMCH-мого транспорта Са2+ Ш ШК матки сходна с кальциевым насосом, локализованным в эритроцитах, а также в ПМ синаптосом, кардиомио-цитов и клеток других тканей /caronl, Caxafoli , 1981; Schatz -aann , 1982; Kraus-Frisdmen at al, , 1982; Берман, Азш.юва, 1982; Pennlatca, 1983; Кудшюв, 1983; Sfconne, Moore , 1984/.

0,49 мкМ

cd ет

53

S

о ■о

и

M

«

M + <

Ci cd О

о - I • - 2

л- 3

Рис.4. Влияние окситоцина

М) на кинетику

М о2+, АТР-з авис имого на° „ 2+ V П Tf ТТОUTJf (J П ' -DO ГЭТЛТЛЧГТГО_

копления Са везикулами сарколешы миометрия коров. I - без окситоцина; 2 - окситоцин в среде инкубации; 3 -окситоцин внутри везикул; 4 - окситоцин внутри везикул и в среде инкубации.

10

20

30 мин

Окситоцин (стимулятор сокращения матки), введенный внутрь везикул, в 2 раза подавлял АТР-зависимуи аккумуляцию Са2+ во фракции сарколеммы миометрия коров (рис.4) и крольчих. Однако пептидный гормон не индуцировал пассивное освобождение Са2+ из везикул. Следовательно, собственные результаты в совокупности с литературными данными об ингибируицем действии окситоцина на "экстра"-АТРазу сарколеммы П.1 матки / Akerman, P'ikstrom , 1979; Soloff, Sweet , 1982; Popeecu et al. , 1984, 1985/ однозначно указывают на то, что он подавляет активность системы Mq?+,ATP-зашсимого выброса Са2+ из клеток миометрия.

Стимулятор периодических маточных сокращений сиге тин (дика-лиевая соль ыезо 3,4-(п-сульфофенил)гексана), внесенный в среду инкубации - Ю-2 1«1), не влиял на пассивный .выход Са2+ из

везикул сарколеммы миометрия. Меаду тем, это вещество (5 Ш) в 2 раза подавляло ,АТР-зависикую аккумуляцию Са2+ во фракции Ш. Сигетин не изменял сродство Са2+ к транспортной системе, но снижал скорость аккумуляции катиона при насыщающих концентрациях субстрата переноса. Таким образом, сигетин является неконкурентным ингибитором систеш М^2+,АТР-зависимой транслокации Са2+ через сарколемму ПЛ матки.

Мп2*, Zn2'1" и Си - двухвалентные ионы, улучшающие сократительную функцию миометрия, на 50$ подавляли Мо2+,АТР-зависимый

транспорт Са2+ во фракции ПМ ГМК при концентрации Ю""2, КГ® и 5 •10""^ М соответственно. Совместное действие этих ионов, используемых в физиологических концентрациях, характерных для плазмы крови, вызывало значительное снижение уровня накопления Са2+ во фракции везикул сарколеммы (в 3 раза).

Таким образом, в Ш ШК матки функционирует кальциевый насос, обладавший высоким сродством к субстрату переноса. Активность насоса ингибируется фармакологическими веществами, индуиирумцими контрактилышй ответ миометрия.

III. Натрий-зависимый транспорт кальция во фракции сарколеммы миометрия.

Существование системы На+ - Са2+ обмена в Ш нервных клеток и кардиомиоцитов не вызывает сомнений / Biaustaiu, Haisoa , 1982; Beeves, Sutko , 1983; Глебов, Крыжановский, 1984/. Взаимосвязь межпу обменом На+ и Са2+ характерна и для Ш клеток скелетных мышц /Gilbert, Melssaer , 1982;Michalak et al. , 1984/, а также, других тканей/Вehlia , I97?;Scbulz, Hell , 1978; Bradley, Forrester , 1980/. Между тем, в случае IM (в частности, миометрия) Яа+ - Са2+ антипорт в Ш систематически не изучен. В связи с этим было проведено исследование влияния, натриевого градиента на трансмембранный перенос Са2+ во фракции везикул сарколеммы IM матки.

В этой фракции идентифицируется Иа+-зависимая компонента обмена Са2+. В кинетическом отношении эту компоненту можно рассчитывать по разнице меаду включением Са в везикулы типа На"£ / Kg (проба) и в контрольные везикулы (например, типа Яа+ / На* или К£ / К^), характеризующиеся отсутствием натриевого градиента (индексы е и L соответствуют вне- и внутривезикулярному пространству). Величина На+-зависимой компоненты составляет I - 1,5 нмоль Са2+ на I мг белка (рис.5).

С использованием обработки препаратов везикул (типа На*/

К+, На| / На^ и Kt /Кр 'растворами LaCI3 (0,1 iM) и ионофора A-23I87 (I миМ) было доказано, что Яа+-зависишй транспорт Са2+ осуществляется через ИМ во внутривезикулярный объем. Сахароза, К+ или холин+ не могут заменить На+ в обеспечении трансмембранного переноса Са2+. Система Ка+-зависимого транспорта Са2+ обла-

Рис.5. На+-зависимый перенос Са2+ во фракции везикул сарколеммы шометрия крольчих. I, 2 и 3 - включение Са2+ в везикулы типа На| / К^, К| / К+ и На| / Ка| соответственно; 4, 5 - На -зависимые компоненты поглощения

п 2+

Са , определенные по разнице между кривыми I (проба) и 3 и 2 (конгроли) со- '

ответственно. 6 мин

л с

со 5

в.

о 4

ХЭ

§3 3

Я 2

к

V

о

40-60 мкМ

Рис.6. Влияние концентрации Са2+ в среде инкубации на активность системы На+-завпсимо-2.

го транспорта Са во фракции везикул Ш ШК коров. Составляющие поглощения Са2+ за счет энергии натриевого градиента определяли по разница между включением Са2+ в везикулы типа Hat / К+ и На+ / На+ (I) или

t г м* / к; я Kt / KJ (2)- в 1п( [Са Ч, М) условиях соблюдения режима изотоничности (150 Ш).

дает таким свойством, как обратимость : градиент На+, направленный как изнутри везикул в окружающую среду, так и в противоположном направлении, стимулирует ангипортное движение Са2+. На+-зави-симый вход данного двухвалентного катиона в везикулы характеризуется насыщением по субстрату переноса (К^ по Са2+ - 40-60 мк?,1). Величина средней максимальной скорости транспортного процесса равна 1,0 - 2,0 ш,голь Са2+ на I мг белка за I шн (0,17 - 0,34

нмоль Ca2+ на I г массы влажной ткани за I мин) (рис.6).

Аналогично, для исследуемой транспортной сиотеш характерно насыщение по На* (значения Кт составляют 30 и 100 Ш в случае использования контрольных везикул типа На| / На* и / К* соответственно).

Вышеприведенные данные свидетельствуют о том, что в сарколемме Ш матки, как и в Ш кардиомиоцатов и нервных клеток, существует система На+ - Са2+ обмена.

Активность На* - Са2* обменника в клетках миокарда и нервной ткани регулируется таким физиологически важным фактором, как мембранный потенциал /Caroni et al. , 1980; Bleuetein, Nelsoa , 1982/. Роль мембранного потенциала ду в На*-зависимом переносе Са2* через Ш ПДК не изучена. В связи о этим было исследовано влияние А у (система. "К*-валиномицин") на этот перенос во фракции везикул сарколеммы миометрия.

Изменение величины д у в диапазоне от 0 до -60 мв (внутренняя поверхность везикул заряжена отрицательно) абсолютно не влияло на кинетику Ва*-зависимого выхода Са2+ из мембранных пузырьков. Было найдено также, что при отсутствии натриевого градиента (|На|] = [На*]) изменение содержания кальция в везикулах сарколеммы за счет энергии электрического поля не имеет места (использовались везикулы типа 60 Ш К{ + 50 Ш Еа[ + 100 Ш холда£ / А Ш + 50 Ш На* + В Ш холин*, причем А Ш + В Ш = 150 Ш в соответствии с необходимым значением д у ) (рис.?).

Содержание кальция в везикулах сарколеммы киомятрия корон при различных значениях д М в условиях отсутствия натриевого градиента. Начальное значение [Caf*] = <Ч2+] (при ду = Oh I Ш (I) и 0,1 М (2). Время инкубации - 30 с.

Рис.7.

■о

Й м

gio

о

20 ,f.

-•-2

О -20 -40 -60 дц/ ,

мв

На основании собственных результатов, а также в связи о литературными данными, свидетельствующими об .электронейтральной стехиометрии ионного обмена в ШК /Morel, Godfreind, 1984/» можно утверждать, что, в отличие от кардиомиоцитов, в клетках некоторых ПД (в частности, миометрия) сопряженный антилортный перенос ионов реализуется в потенциалонезависимом режиме по принципу 2Ка+ : 1Са . В соответствии о термодинамической моделью Яа+ -Са2+ обмена равновесное распределение ионов внутри CD и вне (е) 1слетш1, обеспечиваемое функционированием переносчика, удовлетворяет соотношению /nullius , 1977; Нестеренко, Розенштраух, 1984/:

[ВД [N4] RT r V '

где п. - стехиометрия антипорта, Г - число Фарадея, Т - абсолютная температура, ft - универсальная постоянная. Из уравнения (I) следует, что при п = 2 и физиологически значимых величинах 1.Са|+] С1СГ3 м) и [Ла*]/[Яа+] (~0,I) [Ca?+]~ I0"5 U. Следовательно, в миометрии Na+ - Са2+ обменник сам по себе не сможет обеспечить значительное снижение концентрации Са2+ в возбужденных ШК и, соответственно, релаксацию механического напряжения Ш.

Итак, во фракции везикул сарколешы миометрия транспорт Са2+ осуществляется не только за счет энергии гидролиза АТР (разд.II), но и посредством использования энергии натриевого градиента. Система Ка+ - Са2+ обмена в Ш 1Ш матки характеризуется низким сродством к Ca2*, не регулируется мембранным потенциалом. Есть основания полагать, что На+-зависимый перенос Са2+ через Ш существует и в Ш мочеточника /Burdyga et al., 1984, 1986/, кишечника и. сосудов / Morel, Godfraind , 1984; Br ad in g, Lategan , 1985/, а также желудка /Sakai et al. , 1986/.

ЗУ. Транспорт кальция во фракции митохондрий миометрия.

В ГТЛ матки идентифицирован пул медленно обменивающегося кальция ( '¡Г = 180 мин) (табл.1), локализованный предположительно на уровне внутриклеточных структур (разд.1). Эти данные соответствуют результатам, свидетельствующим о низкой пассивной црони-

цаемости внутренней мембраны изолированных MX Для Са2+ / tóela, Chance , 1968; Crompton et al. , 1977; Nedergaard , 1984/. В MX миометрия депонировано значительное количество кальция (разд. I). В соответствии с собственными (разд.II) и литературными /Batra , 1973; Jenis et al. , 1976; Malmstrüa, Carafoli , 1977; Batra , 1982/ данными молиго предполагать, что в Ш матки именно MX, а не ядра и CP являютоя основным внутриклеточным кальциевым буфером. В связи с этим дальнейшие эксперименты были посвящены изучению энергозависимого и пассивного транспорта Са2+ во фракции M миометрия.

Эта фракция обладала способностью накапливать Са2+ в энерго-занисимом процессе в среде, содержащей АТР (4 ьМ). сукцинат натрия (4 Ш), MgCI2 (2 ьМ), Р. (3 M) и 45CaCI2 + 4ôCaCI2 (50 мкМ, 0,2 мкКи в I мл). Азид натрия и рутениевый красный полностью (до уровня связывания) подавляли включение Са2+ в MX (рис.8); 2,4-динитрофенол (0,1 i.i.f) также эффективно ингибировал данный процесс. С использованием ионофора A-23I87 было доказано, что накопление Са2+ носит трансмембранный характер'и осуществляется внутрь MX. Оптимальная для транспорта Са величина концентрации Mg2+ -5Ш, значение Кт по Mg2+ - 1,72 Ш. Величины оптимальных для аккумуляции Са2+ концентраций АТР и сукцината составляют 1-2 и >4 M соответственно. Значение К^, по нуклеозидтрифосфату равно 0,47 Ш, а по субстрату дыхания - 1,08 М.

Величина максимальной скорости V накопления катиона в MX миометрия составляет 47,5 нмоль Са2+ на I мг белка за I мин (22,72 нмоль Са~+ на I г массы влажной ткани за I юш), значение Кт по Са2+ - 4,07 мнМ (рио.9). Таким образом, транспортная система MX характеризуется в 30 раз большей величиной V (в расчете на един чу массы влажной ткани), чем кальциевый насоо сарколеммы (разд.II). Сродство субстрата переноса к транспортной системе MX на порядок меньше, чем к кальциевому насосу сарколеммы (разд.II), но на порядок больше, чем к ионному обменнику IM IMK (разд.Ш).

Пассивный выход Са2+ из MX Ш матки характеризуется весьма малой скоростью ("3,5 нмоль Са2+ на I мг белка за I мин): за 10 мин инкубации из этих субклеточных структур освобождается лишь 25-30^ количества ранее аккумулированного катиона. Было найдено, что величина скорости пассивного освобождения Са2+ из MX пропорциональна значению его начального содержания в них. Частичная за-

<D

■о

M 100

о

Рио,8, Энергозашсидая аккумуляция Ça2* во фракции MX миометрия коров. I - связывание Па2+ (в среде без AIT и сукцината); 2 -накопление Са2+; 3 и 4 -накопление Са2+ в присутствии азида натрия (5 Ш) и рутениевого красного (0,01 М) соответственно.

15 шн

кт = 4^07 мкМ

Рис.9. Влияние Са2+ на активность системы энергозависимого транспорта данного катиона во фракции . МХ миометрия коров. Эксперимент выполнен в режиме изоляции с использованием Са2+-ЗГТА буфера.

^([Са^З. М)

мена КС1 (50 ьМ) в среде инкубации на изотоническое количество НаС1 на влияла на активное накопление Са2+ в МХ Ш, а также на его пассивное освобождение из них. В то же время, закисление среды инкубации (рН = 7,5-6,0) подавляло аккумуляцию Са2+ в МХ и стимулировало выход катиона из этих структур.

Итак, На+ не влияет на обмен Са2+ во фракции МХ миометрия. В случае Ш показано, что содержание кальция в МХ не зависит от

концентрации На+ в клетках /bond et al. , I985;Somlyo et al. ; 1985/, a количество натрия в. этих субклеточных структурах практически не отличается от его содержания в миоплазые /Somlyo et al. , 1932/. Следовательно, собственные, а такие литературные данные указывают на то,1 что в MX IM, в отличие от миокарда, скелетных мышц И нервной тнai л /Carafoll et al. , 1978; Brand , De Belincourt , 1980; Carafoll , 1982; Максимов и соавт., 1986/, система На+ - Са2+ обмена отсутствует. Между тем, результаты изучения влияния рН на обмен Са2+ во фракции MX миометрия свидетельствуют о наличии в них, как и в MX гепатоцитов /èrancl , 1985; Конев, Рудзянок, 1986/ и, возможно, тимоцитов /Гуновская и соавт., 1986/, системы Н* - Са2+ антипорта. Не исключено, что выход Са2+ из MX ГМ матки индуцируется не только посредством Н* - Са2+ обмена, но и под действием эстрогенов - факторов стимуляции сократительной активности миометрия/Batra , 1973; Денисов, 1981/.

Известно, что MX принадлежит важная роль в обеспечении внутриклеточного гомеостаза Са2+ в миокарде /Кравцов и соавт., 1979; Carafoll , 1985/, медленных скелетных мышцах /Sembrowich et al. , 1985/, печени и головном мозге /Евтодиенко, 1979; Кравцов и соавт., 1982; ВеНошо et al. , 1984/, жировой ткани /Орлов и соавт., 1980/, а также в сперматозоидах /Rtgoni, Desna , 1986/. Результаты атомно-абсорбционного спектрофотометрического анализа, свидетельствующие о высоком уровне содержания кальция в MX миометрия (разд.1), способность этих структур накапливать данный катион в ходе энергозависимого процесса (рио.8), соответству-квдге физиологическим оптимальные концентрационные условия функционирования Са2+-транспортирущей системы, относительно высокое сродство субстрата переноса к ней (рис.9), наличие механизмов, обеспечивающих освобождение Са2+ из MX (H4"- и эстроген-индуциру-емое) - все эти данные указывает на участие MX в кальциевом обмене в клетках Ш матки.

У. Пассивный транспорт кальция во фракции сарколеммы миометрия.

Внеклеточному кальцию принадлежит важная роль в активации сокращения Ш /Щуба, 1981; Van Breemen et al. , 1986/. Энерго-

Ve

3

!I0

4

<sJ o

Й

Pao.10. Концентрационная зависи-. мость начальной скорости диффузионного освобождения Са2 из везикул сарколеммы ыиометрия коров.

f

Г

[Са2+], Ш

в2+

независимый выход Са из везикул сарколеммы, замкнутых цитоплаз-матической стороной наружу, в изотоническую среду, содержащую ЭТТА, в определенном приближении моделирует процзсс пассивного поступления катиона в ШК. В дальнейших экспериментах был изучен пассивный транспорт Са2+ во фракции везикул сарколеммы миометрия.

По мере увеличения концентрации ионизированного кальция в . везикулах типа .250 Ш сахароза^ / 250 Ш сахарозае в физиологически значимом диапазоне, свойственном для внеклеточного пространства, начальная скорость V0 выхода катиона непрерывно возрастала, т.е. тенденция к насыщению по субстрату переноса не наб-лвдалась (рис.10). Следовательно, в основе пассивного освобоаде-. ния Са2+ из везикул типа сахароза^ / сахарозае лежит простая диффузия катиона, не требующая для своей реализации переносчика. При концентрации кальция внутри везикул I Ш значение V0 приблизительно равно 10 нмоль Са + на I мг белка за I мин (10~^ -5«10~^4 моль Са2+ на I см2 за I сек). Этот результат согласуется с данными физиологических экспериментов, указывавдими на существование в-ГМ стационарного диффузионного базального потока Са2+ (Ю-15 - 10~34 моль Са2+ на I см2 за I сек), входящего внутрь невозбужденных миоцитов / Meisheri et al. , 1981; LoutzenhiBer et al. , 1983; Godfrelnd , 1985; Van Breemen et al. , 1986/. Таким образом, идентифицированный в опытах, проведенных на замкнутых цитоплазматической стороной наружу везикулах Ш ШК матки, пассивный перенос Са^+ тождествен входящему in vivo в покоящиеся

Pho.II. Влияние д V на кинетику пассивного выхода Са2+ из везикул сарколеммы миоме трия коров. I и 2 -значения д V составляли -61 и 0 мв соответственно; 3 - по-тенциалочувствительная компонента пассивного выхода Са2+, рассчитанная по разнице мевду кривыми I и 2. .

мкошгты медленному базальному кальциевому потоку.

Расчет показывает, что время поступления в ПК матки необходимого для максимального сокращения количества Са2+, перенос которого обеспечивается базальным входящим потоком (константа скорости к — 10"® мин"*), составляет около 10 мин. Это значение в IО2 - 1С? раз больше физиологически значимого времени сокращения ЛЯС. Следовательно, базалъный вход катиона в миоциты в реальных физиологических условиях непосредственно не вовлечен в оперативный контроль сократительной активности Ш.

Изменение величины мембранного потенциала л V (система "К+ -валикошцй!") от -61 мв (везикулы типа 160 Ш К| / 16 ьМ К* + 144 Ш холин*, внутренняя-поверхность заряжена отрицательно) до О мв (везикулы типа 160 Ш / 160 Ш К*) стимулировало освобождение Са2+ в среду разведения (рис.11).

Зависимость начальной скорости потенциалочувствительного выхода Са2+ из везикул от концентрации катиона в них описывается кривой, характеризующейся насыщением по субстрату переноса (Кт = 0,5 Ш) (рис.12). Д-600 (5-Ю""5 М), а также Со2+ и Мп2"*" (5 Ш) подавляли потенциалочувствительный перенос Са .

В вышеописанных экспериментах время инкубации 1 составляло 60 с (рис.11, 12). Следовательно, эта величина гораздо больше значений постоянных времени нарастания Тт ("*10~^ с) и спада Ху, Ы0~2 с) кальциевого тока, входящего в изолированные ШК

Рис.12» Концентрационная зависимость начальной скорости потенциало-чувст: ительного освобождения Са2+ из везикул сарколеммы миомев-рия коров.

2 [са2+],

Ш

Са2+ т

где I,

т

=

г?

(3)

.е - стационарная составлящая фазы спада тока, заряд Са2+, Р - число Фарадея. Из соотношения (3) следует

цри деполяризации /Рекалов и соавт., 1984, 1985/. Аналитическое выражение для явной зависимости величины кальциевого тока I ог времени известно /Рекалов, 1985/. Основываясь на ней, можно показать, что при I (т.е. при длительных деполяризующих смещениях мембранного потенциала) количество молей перенесенное этим током, будет определяться выражением:

О

2=2-что

выявленная во фракции везикул сарколеммы 1М потенциалочувствитель-ная компонента пассивного транспорта Са2+ (рис.11, 12) обеспечивается стационарной составляющей фазы спада кальциевого тока, идентифицированной в экспериментах, выполненных на одиночных 1Т.1К. Доказано, что потенциалозависимость тонического сокращения Ш коррелирует с вольт-амперной характеристикой стационарного кальциевого тока /Щуба, Бурый, 1984; Рекалов и соавт,, 1985/. Следовательно, потенздалочувствительная компонента пассивного переноса Са2* во фргквди мембранных везикул ответственна за тоническое оокраще"-.ние миометрня. Она, по всей видимости, определяется зависимой от дМ неинактивирупцейся кальциевой проницаемостью Ш 1МК /Уда Бгеетеп вt а1. , 1986/.

У1. Механизмы транспорта кальция и регуляция его концентрации в клетках миометрия.

С целью выяснения механизма кальциевого гомеостаэа в 1МК необходимо дать ответ на следующий вопрос: какова роль отдельных транспортных систем в рез^.шции концентрации Са2+ в миоплазме?

Как уже отмечалось, Ш ШК характеризуется определенным значением базальной кальциевой про1пщаемости (в среднем 5-Ю*"^ моль Са2+ на I см2 за I сек = I мкМ Са2+ за I мин / Ме1вЬвг1 в* а1. , 1981; ЪоийгепМвег , 1983; Оод£га1аЛ , 1985/). ЕСЛИ бы В Ш не. функционировали системы, выводящие из миоцитов Са2+, то только за счет базального входящего потока катиона (при отсутствии электро-и фармакомеханического сопряжения) концентрация последнего в I л миоплазмы достигла бы значения, обеспечивавдего максимальное сокращение М), приблизительно за 10 мин. Следовательно,, в Ш ШК должен существовать механизм компенсаторного трансмембраннсго активного переноса Са2+ из цитоплазмы в межклеточное пространство, • стационарно поддерживающий концентрацию катиона в расслабленных клетках на физиологическом уровне М).

Кинетика изменения концентрации Са2+ в не возбужденных 1Ж описывается уравнением:

¿Ё^ К(гЛ -ГГгЛ) -МЖ ,

^ - «Цьо.^ ' (4)

где [Са2+] = Г Ш и [са2+] - концентрация катиона вне и внутри миоцитов| V и Кт -кинетические параметры системы, активно транспортирующей Са из ШК во внеклеточное пространство (кальциевый насос или ионный обменник), & - константа скорости базального диффузионного потока Са2+ в шоплазму. В стационарном состоянии ан+з/сн = о, поэтому, с учетом соотношения (4),

для значения стационарной концентрации кальция в ШК {Са?+]

I. сг*

можно записать:

№1.=■ <5)

Идентификация функциональной роли систем ане-ргозависимого транспорта Са2+, локализованных в Ш ШК'матки. |[Са2+] = I мкМ за I мин. Кальциевый насос (I): ^ = 5-Ю*4 (Кт -0,5 шМ>, 0 = 4,6 (разд.II); На+-Са2+ обмен-иск (2): } ="5'Юа2 (Кт а 50 мкМ), 9=1,-8 (разд.Ш).

Са^-насос Нат-Са"'т обменник

где ^ а Кт / [0а2+] - относительное сродство системы активного транспорта Са2+ к субстрату переноса, 0 = ]/ / & [Са|+] относительная максимальная скорость энергозависимого выброса Са2+ из миоцатов.

Рассчитанные с помощью выражения (5) графики зависимости [Са^]м от кинетических характеристик систем активного переноса катиона через Ш ГМК представлены на рис.13.

Из хода кривых видно, что кальциевая помпа сарколеммы Ш, функционирующая на фоне входящего в клетки диффузионного кальциевого потока, может его скомпенсировать с поддержанием [Са2+]ст в ыиоцитах на уровне 1СГ7 - 10-6 М. Ка+ - Са2+ обменник, как возможный компенсатор диффузионного потока Са2+,"сможет стационарно поддерживать концентрацию катиона в миоплазме только в диапазоне значений 10"^ - Ю"4 М (аналогичный результат следует из данных термодинамического анализа потенвдалонезависимого На+-Са2+ обмена (разд.Ш)).

По-видимому, кальциевый насос сарколеммы, чувствительный к действию физиологически активных и фармакологических веществ, ин-гибируемый инозитол 1,4,5-трифосфатом (К^ = 0,4 мкМ) /ЕеИсоп-8taIltiлoa et а1. , 1981; Рорееси еЪ а1. , 1984, 1985, 1986/ И

регулируемый фосфорилированием /рореаои et а1. » 1985/, а также, базалышй кальциевый поток могут вносить вклад (наряду с системой

потенциалозависимой неинактивирующейся кальциевой проницаемости ИМ (разд.У)) в обеспечение базального тонуса ВИС. Действительно, активация насоса вызовет уменьшение [Са?+]ст и, соответственно, снижение базального тонуса. Наоборот, ингибирование насоса приведет к возрастанию [Ca¿+]c74 и, следовательно, повышению базального тонуса. Что же касается потенциалонезависимого ионного обмен-ника, обладающего низким сродством к'Са2+ (Кт = 40-60 мкМ) (разд.III), то он препятствует повышению концентрации Са2+ в миоцитах матки выше уровня, обеспечиващего максимальное сокращение (10 М), и, тем саюм, предотвращает нарушение кальциевого го-меостаза в НДС. Таким образом, из двух систем знергозавиоимого транспорта Са2+, локализованных в Ш клеток миометрия, именно кальциевый нассс является основным фактором регуляции концентрации этого катиона в миоцитах при ее физиологических значениях (СЮ^М).

Учитывая то, что в ГМК матки Ка+ - Са2+ обменник Ш не может регулировать концентрацию Са2+ в диапазоне значений 10~® -10"® М (рис.13), естественно считать, что кальциевые насосы сарколеммы и МХ - это те транспортные системы, которые выполняют основную роль в обеспечении гомеостаза Са2+ в возбужденных миоцитах матки. Поэтому механизм понижения концентрации Cafc+ в деполяризованных ШК можно интерпретировать в соответствии со следунцей схемой:-

Кт,ПМ ^ПМ

Са?+

+ Рш - ГшСа -— Рш + Са2+

, -р Кт,МХ у пя ПК Р + Пд2+

+ pgx . ' ■■ Va ^глх + Самх

(6)

где Са?+ , Са£ и - цитоплазматический, внеклеточный и

внутримитохондриалъный кальций соответственно, Рщ и Рщ - центры связывания Са2+ на Ш и на поверхности МХ в местах его активного переноса, Кт щ, Кт щ, Уш» ^ МХ ~ К0нстант11 Михаэлиса и максимальные скорости'трансмембранного переноса Са2+ в случае транспортных систем Ш и МХ соответственно (табл.4).

Таблица 4.

pi

Кинетические характеристики Са -транспортирупцих систем сарколеммы и MX миометрия корова-

Транспортная Km по Са2+, мкМ : V

система :нмоль Са * на * .1 г массы-'влажн.ткани за* :1 мин : мйЛ Са** за I мин

Кальциевый насос сарколеммы 0,35 ± 0,07. 0,60 ± 0,12 4,20 ± 0,90

Система транспорта Са2* в MX 5,69 ± 0,83 19,8 ± 1,2 139 ± 10

Примечание: состав среды инкубации - 20 ill трис-HGI буфер (рН 7,4), 100 Ш KCI, 3 М U&IZ, 4 иМ сукцинат натрия, I Ш АТР (динатриевая соль), 3 Ш Р^ Тв виде натрий-фосфатного буфера, рН 7,4), 5-10"® - I0"4 М Са2+ (использовался Са2+-агТА буфер). В опытах по изучению транспорта Са2+ во фракции сарколеммы среда инкубации содержала также 5 ii.1 азид натрия.

, Изменение концентрации ионизированного кальция в миоплазме во времени будет описываться,в соответствии с реакцией (6), двучленным уравнением Михаэлиса-Ментен:

¿Ml. МСаУ] , Упх[СаУ] .

« " «™,™1СаГ] Кт,П»1СаГ]

Интегрирование выражения (7) приводит к следувдему соотношению:

С, ^iCtf] 3 [CaaL+]+ Сц

Рис.14. Идентификация вклада Са2+-^ транспортирукщих систем Ш

и МХ миометрия в понижение [Са?+] в миоплазме возбужденных даоцитов. Функционируют кальциевые насосы: Ш (ось абсцисс а) (I)} МХ (ось абсцисс б) (2)$ М и МХ (ось абсцисс б) (3). При расчетах использовались значения Кт и V , приведенные в

10 20 30 с та(5л-4-

-7

-8

б

а»

100 200 о

где [Са?+0| = 10~® М - концентрация Са2+ в миоплазме в соотоянии максимального сокращения (ее поддержание"обеспечивается потенци-алонезависюдым Ка+ - Са2+ обменником), причем

Г _ \/ +\Г л _ Цт,ПМ Ь?т.мх

С1 - Упм + Умх , о2 - ---— »

Кт,пн Чт Кт,мх Упм С - УпнУмх(^т,пн'^т.мх)

+Vмx)a(^m,п^|V^^x+ ^т,нх Упм) Сч ' ^т,пмУмх + .

•Интегральное уравнение (8) было использовано для расчета графиков зависимости, изменения концентрации Са2+ в цитоплазме возбужденных клеток миометрия. Оказалось, что кальциевый насос сарколеммы сам по себе (V щ в 0) может обеспечить снижение концентрации Са2+ в миоцитах матки в диапазоне 10~® - 10"® М за 3 глин, а система транспорта Са2+ в МХ ( Утцд = 0) - за 21 с. Функционирование же кальциевого насоса сарколеммы совместно с Са2+-транспортирувдей системой МХ ( Удох ^ Уш ^ приводит к ускорению выведения Са?+ из миоплазмы: понижение концентрации ка-

тиона в указанном вше диапазоне произойдет за 18 о (рис.14).

Результаты проведенного кинетического анализа свидетельствуют о том, что. кальциевый насос ИМ не способен обеспечить снижение концентрации Са2+ в возбужденных IMK матки за физиологически значимое время (десятки секуцц /Malnistrom, Carafoli , 1977; Daniel et al t 1982/), a Са2+-транспо1 мрущая система MX - способна. Полученные данные количественно обосновывают имеющееся в литературе представление о важной роли MX в обмене Са2+ в шометрии /Janls et al. , 1976; Maletrom, Oarafoli , I977;Batra , 1982/. Вклад кальциевого насоса, в регуляцию концентрации катиона в деполяризованных миоцитах проявляется на фоне аккумуляции Са2+ M и реализуется на поздней стадии процесса релаксации (при [_Са2+] = 10~® - 10"® U). В соответствии с вышеизложенным можно утверждать, что механизм понижения концентрации Са2+ в возбужденных клетках миометрия сводится к следутоцему. Потенциалонезависимый На+ - Са2+ обмешшк сарколеммы, обладающий низким сродством к Са2+, предот-" вращает возрастание его концентрации в деполяризованных миоцитах выше Ю-5 М. Снижение концентрации Са2+ в ГМК в диапазоне 10"^ -10"^ M и, как следствие этого, расслабление Ш матки осуществляется совместно Са2+-транспортирукщей системой MX и кальциевым насосом Ш. UX - основной внутриклеточный буфер кальция в Ш матки, эти структуры аккумулируют катион при больших его концентрациях в миоплазме - 10"^ М). По всей видимости, M IM штки обладают

способностью оперировать со значительными количествами Са2+, что может способствовать поддержанию внутриклеточного гомеостаза этого катиона при различных патологических состояниях миометрия. Са2+, поступивший в MX, 'выходит из этих структур в обмен на Н* (разд".1У) и (или) под действием эстрогенов /Batra , 1973; Денисов, 1981/, после чего выносится во внеклеточное пространство кальциевым насосом сарколеммы. Кальциевый насос Ш, регулируемый ФАВ (в частности, окситоцином), осуществляет тонкий контроль за величиной концентрации Са2+ в миоцитах. При низких концентрациях Са2+ в миоплазме ' (<I0~® М) именно эта транспортная система, как уже отмечалось выше, является основным фактором регуляции уровня содержания дшшого катиона в ШК матки (рис. 13).

В пользу того, что предложенный выше механизм регуляции концентрации Са + в клетках миометрия является справедливым и, следовательно, имеет место in vivo , свидетельствуют следующие данные.

Кинетический анализ механизма приводит к Физиологически значимой величине времени снижения концентрации Са в ШК (~18 о). В рамках механизма находят объяснение результаты, полученные при изучении электрофизиологии и механохимии Ш: возникновение контрактуры и значительное уменьшение вызванных потенциалов действия в ШК матки, помещенных в безнаариевый раствор /osa , 1971/; стимуляция сокращения и расслабления миометрия под действием ФАВ - эффекторов кальциевого насоса IM /Soloff, Bweet , 1982; Роревои et al,, 1984, 1985, 1986/; существование базального тонуса Ш матки /Daniel, Janls , 1975; Бакшеев, Орлов, 1976/; S -образная зависимость величины относительного, удлинения релаксирувдей мыпшн от времени /Богач, Подгорная, I98Ij Зайцев, 1981/.

к ж зе

2+

Полученные данные, каоащиеся свойств Са -транспортирующих систем миометрия, механизма внутриклеточного гомеостаза Са в ГМ матки имеют "значение для понимания биохимических и физико-химических закономерностей электро- и фармакомеханического сопряжения в гладксмышечной ткани, регуляции сократимости ШК. Результаты проведенных исследований перспективны для разработки методов коррекции нарушений внутриклеточного гомеостаза Са2+, лежащих в основе некоторых патологий контрактильной активности миометрия (слабость сокращений, чрезвычайно интенсивные сокращения, спазм' Ш матки).'

ВЫВОДЫ

1. В ккометрии кальций распределен гетерогенное Основными внутриклеточными депо эндогенного катиона являются ядра- и MX. Выявлена следующая последовательность в расположении фракпзй субклеточных структур миометрия по способности адсорбировать Са i ПМ> МС > MX = ядра. Участки связывания катиона сарколеммой имеют низкое сродство к нему (Кд = 50-90 мвМ). В IM матки существует, три пула кальция, различающиеся значением характеристических времен обмена.

2. В ПМ ШК матки отсутствует Мо2+-независимый АТР-зависимый перенос Са2+.

Введение АТР в безмагниевую среду инкубации не индуцирует на-

кошюние Са во фракции везикул сарколеммы. Внесение фосфата в эту среду (в*присутствии АТР) также не способствует увеличению кальциевой емкости везикул.

3. В Ш клеток миометрия функционирует система активного М^2+, АТР-зависш.гаго транспорта 0а2+, характеризующаяся высоким сродством к субстрату переноса ^значение К^ по Са2+ составляет 0,3-0,5 мнМ).

По ряду характеристик (оптимальные значения концентраций реагентов и рН, величины Km по ATP, чувствительность к действию п-ХМБ) свойства Mg ,Са2+-АТРазы и транспортной системы идентичны друг другу. По некоторым параметрам (сродство к

АТР, М^АТР, концентрационный ражим оптимального функциони-ровагаш, субстратная и катионная специфичность, чувствительность к активируицему действию кальмодулина) система Mg ,АТР-зависиыо~ го транспорта Са2+ сарколеммы IM матки подобна кальциевому насосу эритроцитов, а также Ш кардиомиоцитов и нервшх клеток.

4. Сарколемме принадлежит доминирующее, по сравнению с ядрами и СР, значение в обеспечении Мо2+,АТР-зависимого транспорта Са2+ в Ш матки. -

о.

В ядрах клеток миометрия система Mgr ,АТР-зависимого переноса Са2+ отсутствует. Оксалат и кофеин не влияют на обмен Са2+ во фракции МС Ш матки.

„ 5. В Ш клеток миометрия существует система потенпдалонеза-висимого На+ - Са2+ обмена.

Ха+~зависимый транспорт Са2+ обратим, характеризуется насыщением по субстратам переноса, низким сродством к двухвалентному катиону (К щ = 40-60 шМ). Мембранный потенциал (система "К+-ва-линомицин") не влияет на На+-индуцируемый перенос Са2+ во фракции Ш ГМК матки.

6. MX миометрия обладают способностью активно накапливать Са2+ в энергозависимом процессе (Кт = 4-6 bail).

Активность транспортной системы MX в 30 раз больше, чем кальциевого насоса IM (в расчете на I г массы влажной ткани). В MX Ш матки система На+ - Са2+ обмена отсутствует. Пассивное освобозде-ние Са2+ из MX шометрия регулируется уровнем содержания катиона в них, à также значением рН наружной среды.

v 7. В основе трансмембранного выхода свободного кальция из везикул типа сахароза^ / сахарозае сарколеммы Ш матки лежит диффу-

эия,' тождественная наблюдаемому Ln vivo медленному базальиому входу этого катиона в невозбужденные ЕЛК.

8. В Ш клеток миометрия существует блокируемая Д-600 система потенциалозависимого пассивного транспорта Са2+, характеризу-ицаяся насыщением по субстрату переноса (Кт = 0,5 Ш), и тождественная стационарной (неинрчтивирунцейся) составлякщой фазы спада входящего в одиночные ПК кальциевого тока.

9. Функциональная роль кальциевого насоса' сарколеммы Ш матки заключается в компенсации входшгго в невозбужденше ЕЖ ба-залыюго диффузионного потока Са2+ и стационарном поддержании величины концентрации этого катиона в миоцитах на физиологическом уровне (Ю-7 - Ю-6 М). Система потеициалонезависимого На+ - Са2+ обмена Ш не может регулировать величину содержания свободного кальция в 1Ж в диапазоне его низзшх концентраций. Обмешшк поддерживает значение концентрации Са2+ в миоплазме возбувденных

ЕЖ на уровне, не превышающем 10"® М, предотвращая нарушение кальциевого гомеостаза в миоцитах.

10. Окситоцин, сигетин, ионы двухвалентных металлов - стимуляторы сократительной активности миометрия, ингибяруют Mg2+,ATP~ зависимый транспорт Са2+ во фракции везикул ИМ ЕЖ матки.

11. Впервые предложен механизм регуляции концентрации иони-зировашюго кальции в клетках миометрия. Кинетический анализ механизма, основанный на использовании интегральной формы двучленного уравнения Михаэлиса-Ментен, приводит к физиологически значимой величине времени снижения концентрации Са2+ в возбувденных ЕЖ. В рамках механизма находят объяснение данные, полученные при изучении электрофизиологии и механохимш миометрия.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Костерин С.А., Ромась И.И., Курский М.Д. Метод определения констант диссоциации комплексов лиганд-центр связывания в случае бисмембран с неоднородной адсорбционной поверхностью // Биофизика. - 1980. - 25, & Z. - С. 281-283.

2. Курский М.Д., Костерин С.А., Браткова Н.Ф., Зимина В.П., Фо-мпн В.П. АТР-зависимое накопление Са2+ фракцией плазматических мембран миометрия // Биохимия. - 1981. - 4S , tó 8. - С.1435-1441

3. Браткова Н.Ф., Костерин O.A. АТР-зависимое накопление кальция

и На+ - Са2+ обмен во фракции плазматических мембран миометрия// Мат-ды ЗУ Всесоган, конф. по биохимии шшц. - Ленинград, 1981. -С. 10-11.

4. Курский М.Д., Стеданковская Г .К., Костерин O.A. Механизмы регуляции концентрации кальция в метка и их нарушение при патологии // Мат-лы Республик, научн. конф. "Биохимия - медицине". -Одесса, 1981. - С. 17-19. •

5. Браткова Н.Ф., Костерин С.А, Роль сарколеммы в регуляции концентрации кальция в миометрии // Мат-лы Республик, научн. конф. "Биохимия - медицине". - Одесса, 198I. - С. 47-48.

6. Браткова Н.Ф., Курский М.Д., Костерин O.A. Влияние градиента натрия на поглощение кальция во фракции плазматических мембран миометрия // Биохимия. - 1982. - 47, й 6. - С. I0I5-I02I.

7. Кашш A.A., Костерин С.А,, Курский М.Д. АТРазная активность и аккумуляция кальция во фракции плазматических мембран миометрия крольчих в состоянии функционального покоя и при беременности // Биохимия. - 1982. - 47 , Ji 9. - С. 1499г1503.

8. Костерин 0-0. Сиотеми транспорту Са2+ в кл1тинах гладеньких м'яз1в // Тез. доп. 1У Укра1нського öIoxIm. з'Ьзду.'Частина I. -Днепропетровск, 1982..- С. 69-70.

9. Костерин С.А., Браткова Н.Ф., Курский М.Д. АТР- и ^-зависимый транспорт Ca во Фракции плазматических мембран миомет-рия // Мат-лы I Всесоюзн. биофиз. съезда. Тез. докл. стенд, сообщ. (й 1-870). - Москва, 1982. - С. 238-239.

10. Курский М.Д., Костерин С.А. Регуляция внутриклеточной концентрации кальция в мышечной ткани // Биохимия и биофизика мышц / Под ред. Северина С.Е. - Москва : Наука, 1983. - С. 63-72.

11. Костерин С.А., Браткова Н.Ф., Курский М.Д., Зимина В.П. Свойства системы АТР-зависимого транспорта Ca во фракции плазматических мембран клеток миометрия // Биохимия. - 1983. - 48 .

№ 2.- 0. 244-553.

12. Костерин С.А., Курский М.Д., Капля A.A. Кинетика пассивного транспорта Ca + в везикулах сарколеммы миометрия // Биофизика. - 1Ь83, - 28 , № 4. - С. 658-662.

13. Kursky M.D., Kosteria Б.A., BratKova N.F. ATP-äependent Ca transport in earcolemma of myometrium //Abstracts. Oxidative metabolism, glycolysis end ATP. Seventh joint synposlma of

the biochemical societies of the GDR and TJSSE, Leipzig,1983.-P.72,

14. Костерин C.A., Браткова Н.Ф., Курский М.Д. Транспорт кальция и механизм регуляция сократительной активности миометрия // Мат-лы Всесоюзн. симпоз. "Биофизика и биохимия мышечного сокращения". - Тбилиси, 1983. - 0. 133-134.

15. Костерин O.A., Курский J.Д., Зимина В.П., Фомин В.П., Браткова Н.Ф. Вклад систем Mq2+,ATP- а На+-зависимого транспорта Са2+ в регуляцию его концентрации в клетках миометрия // Биохимия. -1984. - 49 , ft I. - С. 12-19.

16. Костерин С.А., Курский М.Д., Фомин В.П. Пассивный транспорт кальция во фракции плазматических мэмбран клеток миометрия // Биохимия. - 1984. - ¿9 , » 9. - 0. I407-I4I7.

17. Костерин С.'Л., Зимина В.П. Содержание и внутриклеточное распределение Ca и Mo в миометрии // Укр. биохим. курн. - 1985. -

57 , ft I. - С. 53-57.

18. Костерин O.A., Браткова Н.Ф. Равновесные параметры связывания Са2+ на внутренней поверхности мембранных везикул // Биофизика. - 1985. - 30 , й 3. - С. 436-440.

19. Костерин С.А., Курский М.Д., Браткова Н.Ф. Влияние двухвалентных ионов металлов - стимуляторов сократительной активности матки

на Mg2+,АТР-эавлсимый транспорт Са2+ во фракции сарколеммы миометрия // Воцросы мед. химии. - 1985. - № 2. - С. 97-102.

20. Костерин С.А., Браткова Н.Ф., Курский М.Д. Роль сарколеммы и митохондрий в обеспечении кальциевого контроля расслабления миометрия // Биохимия. - 1985. - 50 , У» 8. - С. I350-I36I.

21. Костерин С.А., Курский.М.Д. Механизмы регуляции концентрации Са2+ в клетках миометрия // Укр. биохим. журн. - 1985. - 57 , Л 5. - С. I00-II6.

22. Bra-*-!;ova Н.Р., Koeterin S.A. Calcium control of myometrium relaxation //Physiology and pharmacology of smooth muscle. Abstracts of papers, Varna, 1985. - P» 23.

23. Браткова Н.Ф.,'Зимина В.П., Костерин C.A. Роль сарколеммы и митохондрий в регуляции внутриклеточной концентрации кальция в гладкой мышце // Мат-дн У Всесоюзн. конф. по биохимии мышц. -Тбилиси, 1985. - С. 24-25.

24. Костерин С.А., Зимина В.П. Потоки ионов кальция в гладкой мышце глиометрия // Биофизика. - 1986. - 31 , ft I. - С. 105-108.

25. Костерин С.А. Активный транспорт кальция в гладких мышцах // Мат-лы У Всесоюзн. биохим. съезда. Тез. сишозиальн. докл. T.I. - Киев, 1986. - С, I28-Ï29.

26. Курский M .Д., Костерин O.A., Фомин В.П., Братчова Н.Ф., Шанло-ва О.П. Системы транспорта кальция в гладкошшечной клетке // Мат-члн У Воесоюзн. биохим. съезда. Тез. стенд, сообщ. Т.2. -Киев, 1986. - 0. 386-387.

27. Костерин С.А., Браткова Н.Ф., Курский М.Д. Возможный механизм регуляции расслабления гладкой мышцы ионами кальция // Биофизика. - 1987. - 32 , tí 2. - С. 327-332.

28. Шинлова О.П., Фомин В.П., Костерин С.А. Влияние окоитоцина на кальциевый насоо сарколеммы миометрия // Укр. биохим. журн. -I9G7. - 59 , й 2. - С. 75-79.

29. Костерин С.А., Бурчинская Н.Ф. Метод определения кинетических характеристик Ça -транспортирующих систем субклеточных структур гладких мышц // Укр. биохим. журн. - 1987. ~ 59 , JS 2. -С. 66-69.

30. Курский М.Д., Костерин С.А., Бурчинская И.Ф., Шлыков С.Г. Пассивный транспорт Са2+ во фракции митохондрий даоматрия // Укр. биохим. журн. - 1987. '- 59 , JS 3. - С. 35-39..

31. Курский M .Д., Костерин С.А., Воробец З.Д. Регуляция внутриклеточной концентрации кальция в мышцах. - Киев : Наукова душа, ■1987. - 144 с.

32. Курский М.Д., Фомин В.П., Шинлова О.П., Костерин С.А. Влияние" мембранного потенциала на пассивный транспорт Са2+ во фракции везикул сарколеммы миометрия // Биохимия. - 1987. - 52 , й 6. -С. 900-907.

33. Костерин С.А. Механизм поддержания кальциевого гошостаза в гладких шицах // Мат-лы XII Воесоюзн. совещ. по транспортным АТРазам. - Иркутск, 1987. - С. 44.