Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы регуляции роста и созревания ооцитов у морских звезд

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регуляции роста и созревания ооцитов у морских звезд"

На правах рукописи

Ламаш Нина Евгеньевна

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ РОСТА И СОЗРЕВАНИЯ ООЦИТОВ У МОРСКИХ ЗВЕЗД

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Владивосток - 2007

003052771

Работа выполнена в лаборатории фармакологии Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Вараксин Анатолий Алексеевич

доктор биологических наук, профессор Анисимов Алим Петрович

доктор биологических наук,

профессор Микряков Вениамин Романович

Ведущая организация: Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита состоится « апреля 2007 года в «/¿7» часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.01 при Владивостокском государственном медицинском университете (г. Владивосток, пр. Острякова, 2).

Автореферат разослан {/} С-^АяЛ^ 2007 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор (Рева Г.В.)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Изучение закономерностей оогенеза представляет собой одну из важнейших задач в современных исследованиях по биологии развития. В ряду актуальнейших проблем оогенеза - процессы, происходящие в ооците на заключительных стадиях оогенеза, а так же в период созревания, когда завершивший рост ооцит превращается в зрелое яйцо, способное к оплодотворению и дальнейшему развитию.

Характерной особенностью развития женских гамет разных животных является остановка процесса мейоза на различных фазах мейотических делений. У многих животных организмов развитие ооцитов блокируется на стадии G2/M первого деления мейоза. Возобновление делений мейоза происходит либо при оплодотворении, либо при действии гормона. Большой интерес в связи с этим представляет вопрос о механизме блокирования мейоза, и, тесно связанный с ним, вопрос о снятии этого блока при гормональной стимуляции ооцита.

Несмотря на интенсивные исследования, проводимые во многих лабораториях мира (Dunphy, 1994; Bayaa et al., 2000; Boonyaratankomkit et aL, 2001; Byskov et al., 2002; Iwasaki et al., 2002; Harada et al., 2003) рецепторы к мейозиндуцирующим гормонам и ранние внутриклеточные сигнальные пути, активированные при связывании гормона с соответствующим рецептором, точно не установлены ни у одного из исследованных организмов. Удобной экспериментальной моделью для изучения механизмов созревания являются ооциты морских звезд. Это единственные животные, у которых установлен природный гормон созревания (1-метиладенин), что позволяет моделировать процесс индукции созревания в условиях экспериментов in vitro, максимально приближенными к физиологическому созреванию. Несмотря на достижения в области изучения сигнального каскада созревания у этих животных, остается много вопросов, которые

требуют ответа. Нет сомнения, что трансдукция сигнала, генерируемого мейоз-индуцирующим гормоном, реализуется через рецептор (Yoshikuni et al., 1988; Tadenuma et al., 1991, 1992), сопряженный с гетеротримерным G-белком (Shilling et al., 1989; Chiba et al., 1992, 1993). При активации G-белок диссоциирует на две активные субъединицы Ga и G(fy комплекс, имеющие разные внутриклеточные мишени. Ведущая роль в снятии профазного блока мейоза отводится ОРу-комплексу. В то же время ничего не известно о возможных мишенях "активной" Са,-субъединицы. Тогда как, специфичность взаимодействия активированного рецептора с определенным G-белком обусловлена конфигурацией a-субъединицы гетеротримера, и диссоциация комплекса GaPy зависит от состояния ГТФ-связывающего центра и ГТФ-азной активности этой субъединицы. В связи с этим, исследования роли Оа,-белка в трансдукции сигнала, модулированного 1-метиладенином и поиск внутриклеточных мишеней с которьми эта субъединица взаимодействует, необходимы не только для расшифровки механизмов снятия профазного блока мейоза у морских звезд, но и для понимания механизмов внутриклеточного сигнализирования с участием гетеротримерных G-белков.

Фундаментальный интерес в рамках сформулированной проблемы представляет исследование формирования гормонокомпетентной аденилатциклазной системы в ооцитах морских звезд. Этот интерес обусловлен первостепенной ролью в передаче гормонального сигнала в клетку, которая отводится продукту биосинтеза аденилатциклазы, универсальному внутриклеточному посреднику - цАМФ. Существуют косвенные данные, указывающие на возможное участие аденилатциклазы в регуляции роста и созревания ооцитов морских звезд (Meijer et al., 1987, 1989; Tadenuma et al, 1992), однако подробные исследования в этом направлении не проводились.

Изучение механизмов регуляции роста и созревания ооцитов морских звезд дополнит существующие в настоящее время молекулярные модели,

описывающие процесс формирования и снятия профазного блока мейоза у беспозвоночных животных. Цель и задачи исследования

Цель работы состояла в выяснении молекулярных механизмов регуляции роста и созревания ооцитов морских звезд и получении доказательств участия аденилатциклазной системы в снятии профазного блока мейоза.

В работе решались следующие задачи:

1. Исследовать процесс созревания в условиях экспериментов in vitro и in vivo с целью оценки влияния клеток гонады на протекание делений мейоза. Изучить морфологические изменения, происходящие в поверхностном слое ооцита в момент действия 1-метиладенина. Оценить участие актинового цитоскелета в процессе снятия профазного блока мейоза.

2. Охарактеризовать функциональные свойства аденилатцилазы ооцитов у разных видов морских звезд. Идентифицировать рецепторы, сопряженные с аденилатциклазой, и -изучить особенности их регуляции в растущих и закончивших рост ооцитах.

3. Исследовать формирование функционально-активной аденилатциклазной системы (гормональных рецепторов, ГТФ-связывающих белков и собственно фермента) в процессе роста ооцитов.

4. Идентифицировать типы регуляторных G-белков, проследить количественную динамику и локализацию выявленных типов регуляторных белков в процессе роста и созревания ооцитов. Выделить в чистом виде Gi-белок с целью сравнения структуры этого белка с аналогичным белком позвоночных животных.

5. Изучить механизм снижения уровня циклических нукпеотидов и оценить роль аденилатциклазы при индукции созревания.

Научная новизна и теоретическое значение работы

Впервые установлено, что после разрушения мембраны зародышевого пузырька развитие ооцитов повторно блокируется в гонаде на стадии

метафазы первого деления мейоза под действием факторов выделяемых клетками гонады.

Впервые в ооцитах морских звезд, кроме в, и в,, идентифицированы еще два типа регуляторных белков, Оч и С12. Белок типа Он локализован в цитоплазме ооцита, а в, связан с мембраной. Синтез а-субъединиц белков всех типов начинается на ранних стадиях оогенеза. По мере роста ооцитов меняется количественное соотношение белков 05 и 0;.

Доказано наличие двух механизмов гормональной регуляции аденилатциклазы в ооцитах морских звезд: а) стимулирующего аденилатциклазную систему варианта, характерного для эффекта медиаторов моноаминергической системы и включающего идентифицированный адренорецептор, выбелок и аденилатциклазу; б) ингибирующего варианта с участием 1-метиладенинового рецептора, в.-белка и аденилатциклазы.

Впервые установлено, что падение уровня цАМФ при индукции созревания происходит в результате ингибирования аденилатциклазы. Механизм действия 1-метиладенина описывается следующей схемой: рецептор ^ в.-белок Оа,-ГТФ-субъединица ■=> аденилатциклаза •!-=> ЦАМФ4-.

Впервые в ооцитах морских звезд выявлен спектриноподобный белок. Установлено, что изменения распределения актина и спектрина в процессе созревания ооцитов коррелирует со структурными перестройками ооцита, в частности, с изменением характера поверхности ооцитов и деполимеризацией цитоскелета, поддерживающего аппарат микроворсинок. Выявлена ко-локализация актина, спектрина и активированной а-субъединицы в, белка, что может свидетельствовать о вовлечении этого белка в процесс перестройки актинового цитоскелета.

На основании собственных и литературных данных предложена гипотетическая схема ранних событий, происходящих в ооците в момент снятия профазного блока мейоза. Практическое значение работы

В связи с проблемами искусственного воспроизводства исчезающих и редких видов животных организмов информация, касающаяся механизмов гормональной регуляции роста и созревания, имеет важное прикладное значение. Известно, что система «гормон - механизм реализации его действия в клетке» возникла рано в ходе эволюции, и молекулярные механизмы ее функционирования сравнительно мало и медленно меняются, а наиболее общие из них отличаются исключительной консервативностью. В связи с этим, ооциты иглокожих могут служить модельным объектом для исследований действия разных биологически активных веществ на процесс мейоза. Познание этих процессов открывает перспективы для поиска природных факторов, контролирующих клеточный цикл и открытие новых ангимитотических компонентов. Ооциты и гонады морских звезд могут служить источником для получения препаратов, обладающих антимитотическими и пролиферативными свойствами. Основные положения работы, выносимые на защиту

1. В процессе роста,ооцитов морских звезд в поверхностной мембране происходит формирование функционально-активной аденилатщпслазной системы двух типов. Аденияатцикпаза стимулирующего типа осуществляет моноаминергическую регуляцию роста ооцитов, а аденилатциклаза ингибирующего типа принимает участие в процессе индукции созревания.

2. Основные типы гетеротримерных ГТФ-связывающих регуляторных белков (й-белков) синтезируются на ранних стадиях оогенеза. Существует специфичность взаимодействия рецепторов 1-метиладенина и адренорецепторов с в-белками.

3. Развитие ооцитов морских звезд повторно блокируется в гонаде на стадии метафазы первого деления мейоза.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Советско-финском симпозиуме по биологии развития «Сигнальные молекулы и клеточная дифференцировка» (Суздаль, 1991), на Международной конференции «Нейрофармакология на рубеже двух тысячелетий» (Санкт-

Петербург, 1992), на Международной конференции по иглокожим (Дижон, Франция, 1993), на Международном конгрессе по репродукции беспозвоночных животных (Санта-Круз, США, 1995), на 1-ом Съезде общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003). Кроме того, результаты диссертации обсуждались на межлабораторных семинарах и отчетных годовых сессиях Института биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВОРАН.

Публикации результатов работы

По теме диссертации опубликовано 16 статей, из них 5 статей в зарубежных и 11 статей в рецензированных отечественных научных журналах.

Работа выполнена в Лаборатории фармакологии Института биологии моря им. Жирмунского ДВО РАН. Все экспериментальные данные получены автором лично или при его непосредственном участии. Отдельные этапы работы выполнялись в соавторстве с сотрудниками ряда лабораторий Института биологии моря и сотрудниками Лаборатории биохимии мембранных рецепторов Института физиологии Чешской академии наук. Структура и объем работы

Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, пяти глав, отражающих результаты собственных исследований, заключения и выводов. Диссертация изложена на 234 страницах машинописного текста и включает 11 таблиц и 46 рисунков. Список литературы содержит 341 источник, из них 24 отечественных и 317 иностранных.

Автор выражает свою искреннюю благодарность заведующему лабораторией фармакологии Института биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН д.б.н. Ю.С. Хотимченко за инициацию данных исследований, моральную поддержку и всестороннюю помощь. Автор благодарит за участие в работе всех соавторов.

Часть работы выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты №№ 96-04-50061, 96-0448284, 01-04-49440), гранта ДВО (ЮООЗ-РЗ-ГрА-СОб-ИБМ) и гранта ДВО-РФФИ (№ 06-04-96039), а также Комитета по молекулярной и клеточной биологии ЮНЕСКО (грант 204/98/0474).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Исследования проводили на половозрелых особях морских звезд обитающих в заливах Петра Великого и Восток Японского моря: Patina pectinifera (гребешковая патирия), Distolasterias nipón (дистолостерия колкая), Aphelastrias japónica (афеластерия японская), Asterias amurensis (амурская звезда). Животных собирали в период активного гаметогенеза и в сезон нереста с помощью легководолазной техники и либо сразу обрабатывали, либо помещали в аквариумы с аэрируемой проточной водой, где они находились до опытов не более трех суток. Морфологические методы

Для гистологического изучения органов и тканей материал фиксировали в 2.5% глутаровом альдегиде на 0,1 М Трис-малеатном буфере, содержащем 4,5% глюкозы, pH 7,4, в течение 30 мин. Фиксированный материал заключали в парафин по общепринятым методикам. Препараты просматривали на световом микроскопе Polivar (Reichert). Микрофотографии делали с помощью цифровой камеры Nikon. Для электронно-микроскопических наблюдений ооциты фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом, дофиксировали в 1%-ном растворе 0s04 на морской воде при +4°С в течение 1 ч и заключали в эпон-аралдит. Ультратонкие срезы просматривали на электронном микроскопе Jeol JEM 100В.

Исследования совместной локализации, актина и спектрина, актина и Goti-белка в ооцитах при гормональной индукции созревания проводили методом иммуноцигохимии. Для этого ооциты фиксировали в 2,5 % глутаровом альдегиде на физиологическом растворе забуференном

фосфатным буфером следующего состава: 137 мМ NaCl, 2,7 мМ КС1,6,4 мМ Na2HP04, 1,2 мМ КН2Р04, рН 7,5 (ФБС). Материал заливали в среду LR White ("Sigma"). В работе использовали поликлональные антитела к спектрину (657981, "ICN"), актину (А 2066) и Ga,-субъединице (G 4915) ("Sigma", США). В качестве вторых антител использовали козьи аши-IgG кроличьи антитела, меченные или коллоидным золотом ("Sigma"), или флюоресцеин-5-изотиоцианатом (FITC) в разведении 1:150 (ICN Pharmaceuticals), или тетраметилродамин изотиоцианатом (TRITC) в разведении 1:150 (ICN Pharmaceuticals). Материал анализировали на электронном микроскопе Jeol JEM 100В и флюоресцентном микроскопе POLYVAR (Righert). Биохимические методы

Исследования рецепторов, G-белков и аденилатцикпазы проводились на гомогенатах или на мембранных препаратах ооцитов морских звезд, которые выделяли методом предложенным Doree (1978).

О наличии Р-адренорецепторов судили по специфическому связыванию мембранами ооцитов меченого антагониста [3Н]-дигидроальпренолола ([3Н]-ДГА) (Lefkowitz et al., 1974). Связывание [3Н]-ДГА ("Izinta", Будапешт, 2,005 Tbq/ммоль) исследовали в 20 мМ трис-НС1 буфере, рН 7,5, содержащем 4 мМ MgC!2. Мембраны (100-150 мкг в пробе) инкубировали в присутствии меченого лиганда в концентрации от 1 до 4 нМ 60 мин при 18°С. Связывание оценивали с помощью фильтрования на фильтрах GF/C фирмы "Whatman" (Англия). Специфическое связывание, составлявшее 60-70%, рассчитывали по разнице между общим и неспецифическим связыванием.

Связывание [3Н] -1-метиладенина с мембранами ооцитов проводили при температуре 20°С в 200 мкл искусственной морской воды в течение 30 мин в присутствии (неспецифическое связывание) или в отсутствии (общее связывание) немеченого 1-МеА (100 мкМ). По истечении времени инкубации пробы обрабатывали так же, как описано для адренорецепторов.

Для расчета констант диссоциации (Kd) и количества мест связывания (Вши) использовали программу GrafPad Prizm4.

Активность аденилатциклазы (АЦ, АТФ-пирофосфатлиаза, циклизующая, НФ 4.6.1.1.) определяли по методу Ткачука и Балденкова (1978) с некоторыми изменениями. Для этого 50 мкл мембранной фракции, содержащей не более 100-120 мкг белка, инкубировали при 20°С в течение 20 мин в 100 мкл среды следующего состава: 20 мМ трис-HCl (рН 7,5), 5 мМ MgCl2, 5 мМ креатинфосфата, 0.1 мг креатинкиназы в пробе (20 ед. уд активности), 2 мМ АТФ, 10 мМ теофиллина. Реакцию останавливали кипячением в течение 3 мин в водяной бане с последующим охлаждением. Осадок удаляли 10-минутным центрифугированием при 0°С (3000-4000 об/мин). В надосадочной жидкости определяли количество цАМФ с помощью набора реактивов "Cyclic AMP assay Kit" фирмы "Amersham". Радиоактивность проб измеряли на счетчике "SL-4221". Активность аденилатциклазы выражали в пмолях цАМФ на 1 мг белка за 10 мин.

Для оценки состояния G-белков в аденилатциклазном комплексе применяли как природные регуляторы (ГТФ, ионы фтора), так и негвдролизуемые аналоги ГТФ (GTP-y-S, GDP-P-S), а также холерный и коклюшный токсины. Влияние токсинов приводит к АДФ-рибозилированию Gs-белка холерным токсином и Gi-белка- коклюшным токсином.

При исследовании влияния АДФ-рибозшгарования G-белков на активность аденилатциклазы, мембранный препарат преинкубировали 60 мин при 30°С в среде, содержащей все компоненты для АДФ-рибозилирования, затем мембраны отмывали от этой среды и определяли в них активность аденилатциклазы. Контрольные пробы не содержали токсина. Для идентификации типов G-белков использовали тест с бактериальными токсинами и метод иммуноблотгинга. Мембранные препараты инкубировали в реакционной среде следующего состава: 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 2 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ АТФ, 10 мМ ДТТ, 0.01 мМ НАД, 0.1 мМ ГТФ, 1 мМ НАДФ в присутствии 20 мкг/мл коклюшного токсина или 100 мкг/мл

холерного токсина и 10 мкМ [а-Э2Р]НАД (20000 имп/мин пмоль) при 30°С в течение 60 мин. Концентрация белка в пробе составляла 40-50 мкг. По окончании инкубации белки разделяли с помощью электрофореза. Гели окрашивали красителем кумасси G-250, высушивали и автографировали в течение 24-48 ч против рентгеновской пленки РМ-В ("Таема"). Перед использованием проводили активацию токсинов. Для этого, холерный токсин (1 мг/мл) инкубировали с 40 мМ ДТТ, а коклюшный токсин (2 мг/мл) - с 13 мМ ДТТ и 1.4 мМ АТФ 30 мин при 30°С.

Иммуноблоттинг с антителами осуществляли следующим образом: клеточные фракции или гомогенаты подвергали электрофорезу (ДЦС-Na/ПААГ). В случае количественного иммуноблоттинга концентрация общего белка в образцах наносимых на пластины с гелем была одинаковой и составляла 50-75 мкг. После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (размер пор 0,2 мкм) с помощью электроблоттинга (4 часа; 18°С, 300 мА). Подготовленные мембраны обрабатывали определенными первичными антителами, растворенными в ТБФР-буфере, содержащем 1%-ный БСА и 0.2%-ный твин-20. Далее мембраны отмывали в ТБФР-буфере с 0.2%-ным твин-20 и инкубировали в растворе вторичных антител (козьи антикроличьи IgG, конъюгированкые со щелочной фосфатазой), приготовленном на этом же буфере, в течение 1 ч. После отмывания мембраны помещали в TNM-буфер (0.1 M Трис-HCl, рН 9.0, 0.1М NaCl и 0.005М MgCl2), содержащий 5-бром-4-хлор-3-инцолил фосфат (100 мкг/мл) и нитротетразолиевый синий (200 мкг/мл). После развития окраски мембраны отмывали в дистиллированной воде, высушивали и сканировали. Для количественной оценки использовали компьютерную программу Image Quant (Molecular Dynamics, Version 3.3). О количестве антигена в клеточных фракциях и гомогенатах ооцитов судили по плотности окрашивания и выражали в условных единицах плотности.

В работе использовали коммерческие кроличьи поликлонапьные антитела к актину в разведении 1: 5000 (А 2066, "Sigma") и спектрину в

разведении 1: 2000 (657981, "ICN"). Кроличьи поликлональные антитела, полученные к синтетическим пептидам: Gets - RMHLRQYELL; Ga,li2 -KNNLKDCGLF; Go, - QLNLKEYNLV; Gau - QENLKRLMLQ, Gp, -MSELDQLRQE. Антитела к Ga,, GaI2 и Gp, любезно предоставлены д-р П. Свобода (Прага, Институт физиологии Чешская АН).

Для выделения G,-белка ооциты гомогенизировали в 10 объемах 20 мМ Трис-HCl буфера, рН 7.5, содержащего 1 мМ ЭДТА, 100 мМ КС1 и 0.1 мМ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ). Гомогенат центрифугировали с охлаждением в течение 5 мин при 1000 об/мин на центрифуге К-23. Осадок дважды промывали буфером для гомогенизации и ресуспендировали в 5 объемах 20 мМ Трис-HCl буфера, рН 7.5, содержащего 1мМ ЭДТА, 1мМ дитиотриетола (ДТТ) 25 мМ NaCl, 0.1 мМ ФМСФ, 1.25% луброла-РХ. Солюбилизацию проводили при постоянном перемешивании при 4°С в течение 45 мин. Затем суспензию центрифугировали при 40000 об/мин в течение 60 мин в роторе JA-14. Супернатанг использовали для дальнейшего выделения G-белка. Луброльный солюбилизат (150 мл) наносили на колонку (4x15 см) ДЭАЭ-тойперлом 650М (Toyo Soda, Япония), предварительно уравновешенную буфером А следующего состава: 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5,1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 0.1 мМ ФМСФ, 0.25% луброла-РХ. Колонку промывали 1 объемом буфера А, дополнительно содержащего 25 мМ NaCl, затем проводили элюирование 1радиентом NaCl от 25-250 мМ в течение 7 ч. Скорость элюирования составляла 60 мл/ч. Фракции, содержащие ГТФ-азную активность, объединяли (80 мл) и концентрировали на ультрафильтре РМ-10 (Amicon, Голландия) до объема 15 мл. Белок разбавляли буфером А до 80 мл и наносили на колонку (2^10 см) ДЭАЭ-тойперлом 650S (Toyo Soda, Япония) предварительно уравновешенную буфером А, содержащем 50 мМ NaCl. Элюирование проводили в том же буфере линейным градиентом NaCl от 50-200 мМ при скорости 20 мл/ч. Фракции, содержащие ГТФ-азную активность (35 мл), наносили на колонку (1x10 см) оксиапатита "Bio-Gel НТР" (Sigma, США), уравновешенную 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 0.05 ЭДТА,

0,25% лубролом-РХ. Элюирование белка проводили линейным градиентом от 0-40 мМ К3РО4 в течение 3 ч при скорости 20 мл/ч. Фракции, содержащие ГТФ-связывающую активность (7.5 мл), концентрировали на YM-5 и хранили при -80°С.

ГТФ-связывающую активность определяли по методу описанному Гоффенбергом с соавт. (Гоффенберг и др., 1990). Концентрацию белка в пробах определяли двумя методами: Greenberg и Gaddock (1982) с помощью БФ-реактива и методом Лоури с соавторами (Lowry et al., 1951).

Количество филаментного (F-актина) и нефиламентного (G-актина) актина в ооцитах определяли методом ингибирования ДНК-а:!ы1 в модификации Мабучи и Спудича (Mabuchi, Spudich, 1980). Количество общего актина определяли суммированием значений, полученных во фракциях, и выражали в мкг на мг общего белка. Экспериментальные методы

Для получения культуры ооцитов, гонады из тела животных извлекали через разрез в луче животного, помещали в охлажденную искусственную бескальциевую морскую воду (CaFASW) и измельчали ножницами. Полученную суспензию фильтровали через тонкий газ и отмывали ооциты от фолликулярных клеток в такой же воде трехкратным переосаждением с помощью ручной центрифуги в течение 2-3 мин. Ооциты либо использовали сразу, либо хранили при 4°С и использовали для экспериментов не позднее чем через 1 ч после выделения.

Для индукции созревания применяли 1-метиладешш (1-МеА, "Sigma") в конечной концентрации 10"7М. В экспериментах in vitro 10%-ную суспензию ооцитов без фолликулярных клеток инкубировали в искусственной морской воде (ASW). Исходные растворы гормона и модификаторов были приготовлены на ASW.

В экспериментах in vivo животным вводили в полость лучей раствор 1-МеА (10"5М) приготовленный на морской воде. В зависимости от размеров

животного, объем вводимой жидкости составлял 5-10 мл (порционно по 1-2 мл в каждый луч).

Статистическая обработка данных

Данные представлены в величинах М±БЕ для трех и более отдельных экспериментов, выполненных в трех параллельных пробах для каждой экспериментальной серии. Полученные данные обработаны методами вариационной статистики. Различия между средними величинами считали достоверными при Р< 0,05.

Результаты и обсуждение 1. Экспериментальная регуляция созревания ооцитов

Изучали хронологию процесса индукции созревания и делений мейоза в условиях культивирования освобожденных от фолликулярных клеток ооцитов морских звезд в морской воде, содержащей 1-МеА, а также после инъекции раствора 1-МеА в полость лучей животных. 1.1. Влияние температуры на хронологию делений мейоза

Развитие ооцитов морских звезд блокируется в гонаде на стадии профазы первого деления мейоза. Созревание ооцитов морских звезд возобновляется в момент нереста под действием мейозиндуцирующего гормона 1-метиладенина (1-МеА), который выделяется фолликулярными клетками ооцита под влиянием гонадостимулирующего пептида из радиальных нервных тяжей (Капа1аш, 1969). Несмотря на то, что методы культивирования этих клеток достаточно хорошо разработаны (Капа1ат 1969, 1985), существуют определенные межвидовые различия, которые необходимо учитывать при выделении ооцитов и сохранении их в определенном функциональном состоянии вне гонады. Для стандартизации условий культивирования ооцитов используемых нами видов морских звезд, нерест которых происходит в разных климатических условиях, исследовали влияние температуры на индуцированное 1-МеА созревание освобожденных от фолликулярных клеток ооцитов. О снятии профазного блока мейоза судили по разрушению мембраны зародышевого пузырька (РЗП),

формирование первого полярного тельца (ПТ) свидетельствовало о завершении первого деления мейоза, образование второго ПТ рассматривали как завершение второго деления мейоза.

Гаметы помещали в искусственную морскую воду (ASW) разной температуры. Для культивирования были выбраны три температурных режима - 15°С, 18°С и 20°С. Значения 15°С и 20°С соответствовали средним температурам, при которых в природе происходит нерест морских звезд весной (A. amvrensis, D. nipón) и летом (Р. pectinifera, A. japónica), соответственно, а значение 18°С было выбрано нами как среднее между 15 и 20°С.

При всех температурных режимах после применения 1-МеА (10'7М) ооциты морских звезд A. amurensis, D. nipón, P. pectinifera, A. japónica преодолевали профазный блок мейоза и проходили оба деления мейоза. Созревание оощггов морских звезд A. amurensis и D. nipón при температуре 15° и 18°С завершалось через 130-140 мин после действия 1-МеА (10_6M), а при 20°С через 110-120 мин (рис. 1). У морских звезд P. pectinifera и А. japónica процесс индуцированного созревания при 18 и 20°С занимал 130 мин, тогда как в «холодной воде» (15°С) необходимо 175-200 мин для завершения делений мейоза. Наиболее чувствительным к изменению температуры периодом при гормональном созревании ооцитов морских звезд является период до РЗП. Изменение суммарной продолжительности делений мейоза, вызванное изменением температуры инкубации, происходило за счет изменения длительности именно этого периода. На основании полученных данных исследования в условиях экспериментов in vitro проводили при температуре морской воды 18°С. При этом температурном режиме средняя продолжительность индуцированного созревания ооцитов используемых видов морских звезд была одинаковая и составляла в среднем 130 мин.

A vmnb

Qfipcn

IS 15 20

1$ 1S 10

ТаяцягявРо

RpecfhMn

AJ^trtca

IS 18 M

TMnqp^elt}

1$ 11 20

Рис. 1. Влияние температуры инкубации на продолжительность I-метиладенин индуцированного созревания ооцитов четырех видов морских звезд.

1.2. Влияние клеток гонады на созревание, индуцированное 1-метиладеннном

Для оценки влияния клеток гонады на созревание ооцитов морских звезд животным вводили раствор 1-МеА (10"5М) в полость лучей. Через 30-40 мин после инъекции у морских звезд начинался нерест, который продолжался в течение 3-4 ч. Выметанные ооциты не имели зародышевого пузырька (3F1). Вскрытие гонад инъецированных животных показало, что через 35-40 мин у всех ооцитов произошло РЗП, но полярные тельца не выделялись даже спустя 90 и 150 мин после инъекции. При попадании ооцитов в морскую воду через 20 мин у них происходило отделение первого, а через 35-40 мин второго полярных телец. Полученные результаты

свидетельствовали о том, что развитие ооцитов морской звезды останавливается в гонаде под воздействием неизвестных факторов после РЗП. Согласно литературным данным, формированию первого полярного тельца предшествует индуцированное 1-МеА повышение уровня внутриклеточного рН за счет активации Иа+/Н+ антипорта (Нагаёа е1 а!., 2003). Не исключено что этот ионообменник может быть мишенью для факторов, блокирующих развитие ооцитов. С целью проверки выдвинутого предположения на следующем этапе наших исследований изучили влияние ионов натрия на индуцированное 1-МеА созревание ооцитов морской звезды.

1.3. Влияние ионов натрия на деления мейоза

В первой серии экспериментов культивировали ооциты в искусственной морской воде без ионов натрия (-КаА8>Л0 с гормоном созревания - (10"7М). Контролем служила группа ооцитов, созревающих при действии 1-МеА в искусственной морской воде (АБ^У) обычного состава с рН=8,0. В экспериментальной и контрольной группе ооцитов РЗП происходило в среднем через 20 мин после начала инкубации с 1-МеА (рис. 2). В контрольных клетках через 70 мин наблюдалось выделение первого, а через 90 мин после действия гормона второго полярных телец. В среде без ионов натрия формирование полярных телец не происходило. При замене -ЫаА8\У на нормальную морскую воду уже через 20 мин в ооцитах формировалось первое полярное тельце, а спустя 25-30 мин второе. Эти результаты свидетельствуют о том, что ионы натрия не влияют на РЗП, но их отсутствие во внешней среде ингибирует дальнейшие события мейоза.

К такому же заключению мы пришли после изучения влияния ионов натрия на созревание ооцитов, выделенных из гонад животных, которым предварительно была сделана инъекция 1-МеА. Через 90 мин после инъекции 1-МеА (10'5М), ооциты извлекали из гонад животных и помещали либо в обычную воду (контроль), либо в морскую воду без натрия. У всех ооцитов отсутствовал зародышевый пузырек. В контрольной груше спустя какое-то

время происходило формирование полярных телец, в то время как экспериментальные ооциты заканчивали деления мейоза только при помещении их в морскую воду обычного состава. Присутствие ионов натрия необходимо только для формирования первого ПТ, так как замена морской воды на после отделения первого ПТ не влияла на формирование

второго ПТ. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что ингибирование >1а+/Н+ ионообменника может быть одним из механизмов формирующих метафазный блок мейоза у морских звезд.

Таким образом, впервые установлено, что развитие оощггов морской звезды блокируется в гонаде вторично на стадии метафазы 1. Метафазный блок мейоза поддерживается ингибированием увеличения внутриклеточного уровня рН. В отличие от амфибий (\Vasserman (Л а)., 1986), у морских звезд увеличение уровня рН не влияет на снятие профазного блока мейоза, а необходимо для преодоления метафаза 1 ареста.

О мин

1-МсА, 10"7М

-КаАБЧУ

Рис. 2, Влияние морской воды без натрия (^аА8\\г)на процесс отделения полярных телец после действия 1-метиладенина (1 -МеА). Время указано в мин после применения гормона. Треугольником обозначены первое и второе полярные тельца. А5\У - морская вода, ЗП — зародышевый пузырек.

2. Свойства аденилатциклазной системы ооцитов морских звезд

Рост и развитие ооцитов морских звезд контролируется медиаторами моноаминергической системы - катехоламинами (Хотимченко, 1989). Во многих случаях регуляторное действие этих медиаторов осуществляется посредством активации аденилатциклазы и изменения внутриклеточного уровня цАМФ. При индукции созревания у многих видов морских звезд наблюдали резкое падение уровня цАМФ (Speaker, Butcher, 1977; Maller, 1983, Dekel, 1984), что может указывать на вовлеченность аденилатциклазы в процесс трансдукции сигнала, модулированного 1-МеА. Если предположить, что аденилатщпслазная система принимает участие не только в регуляции роста и развития ооцитов, но и в снятии профазного блока мейоза у морских звезд, то механизмы регуляции аденилатциклазы на этих этапах оогенеза различаются. Поскольку аденилатциклазная система ооцитов морских звезд это многокомпонентный комплекс взаимодействующих между собой белков, которые формируют рецепторный, регуляторный и каталитический компоненты системы (Capasso et al., 1989; Ламаш, Хотимченко, 1992; Ламаш, Шевцова, 1998), то изменения могут касаться любого из этих блоков.

В связи с этим, изучали функциональное состояние аденилатциклазной системы в ооцитах, находящихся на разных фазах оогенеза. В экспериментах использовали три группы ооцитов. В первой группе, ооциты находились на стадии большого роста (растущие ооциты), во второй - ооциты достигли максимального размера, но не созревали при действии 1-МеА в условиях экспериментов in vitro (закончившие рост ооциты), третью группу составляли гаметы, которые созревали при действии 1-МеА (созревающие ооциты).

2.1. Каталитические свойства аденилатциклазы ооцитов

Каталитическая (базальная) активность аденилатциклазы (АЦ), т.е. активность, измеренная в отсутствии активаторов и ингибиторов, в растущих ооцитах исследованных видов морских звезд составляла 10-12 пмоль цАМФ/мг белка/10 мин (табл. 1,2,3). По мере роста ооцитов происходило

Таблица 1. Влияние негормональных агентов на активность аденилатциклазы (АЦ) в мембранах ооцитов Asterias amurensis

Модификаторы СМ) Активность АЕ (пмоль цАМФ/мг бежа/10 мин)

растущие ооциты закончившие рост ооциты созревающие ооциты

- 12,2 ±0,4 7,2 ± 0,5 6,3 ± оа

Форсколин (10^) 122,8 ±12,5 59,6 ±5,8 61,1 ±3,2

A1F4' (10 мМ NaF и 1мМА1С13) 390,4 ±21,2 150,2 ± 15,3 94,5 ± 12,4

GTP-y-S (Ю'5) 41,4 ±2,2 28,4 ± 3,2 19,2 ±0,4

Таблица 2. Влияние негормональных агентов на активность аденилатциклазы в мембранах ооцитов Aphelasterias japónica

Модификаторы (М) Активность АЦ (пмоль цАМФ/мг бежа/10 мин)

растущие ооциты закончившие рост ооциты созревающие ооциты

- 8,9 ± 0.9 4,2+1,3 1,8 ±0,5

Форсколин (10^) 158,2 ±11,0 55,7 ± 7,2 8,9 ± 0.8

A1F4" (10 мМ NaF и 1мМ А1С13) 425,1 ±32.1 46,3 ± 6,6 12,2 ± 1,4

GTP-y-S (10"5) 32,2 ± 2,0 20,2 ±4,5 5,8 ± 0,4

Таблица 3. Влияние негормональных агентов на активность аденилатциклазы в мембранах ооцитов Райпа ресНш/ега

Модификаторы СМ) Активность А1: (пмоль цАМФ/мг бежа/10 мин)

растущие ооциты закончившие рост ооциты созревающие ооциты

- 10,1 ±0,7 7,8 ± 1,2 8,5 ± 0,6

Форсколин (10") 60,3 ±9,2 70,2 ±4,8 57,8 ± 4.8

A1F4" (10 мМ NaF и 1мМ А1С13) 707,3 ±35,5 325,4 ±22,5 150.2 ±11,4

GTP-y-S (Ю5) 34,4 ± 5,9 36,2 ±4,8 22,5 ± 1,4

достоверное, при Р<0,05, падение активности фермента. В мембранах закончивших рост ооцитов всех исследованных видов морских звезд активность АЦ снижалась в среднем в 1,5 раза по сравнению с растущими ооцитами. Форсколин, активатор каталитической активности фермента, в концентрации Ю^М достоверно стимулировал АЦ ооцитов. Реактивность АЦ к форсколину у разных видов морских звезд отличается, но степень

активации фермента в растущих и закончивших рост, а у амурской звезды и патирии и в созревающих ооцитах, сохраняется на одном уровне. Это свидетельствует о том, что количество самого фермента в ооциге не уменьшается в процессе роста, а снижение его активности может бьггь связано с изменением регуляторного компонента аденилатциклазной системы.

Гуаниновые нуклеотиды (негидролизуемый аналог ГТФ - GTP-y-S) и ионы фтора оказывали стимулирующий эффект на АЦ. [A1F4]' был самым сильным активатором фермента. Эффект этого агента был более выражен в мембранах растущих и закончивших рост ооцитов. В созревающих гаметах стимулирующее действие фторида на циклазу значительно снижалось. Гуаниновый нуклеотид в конценрации 10"5М стимулировал фермент ооцитов, в среднем в 3-4- раза. Полученные экспериментальные факты указывают на взаимодействие АЦ в мембранах растущих, закончивших рост и созревающих ооцитах со стимулирующим Gj-белком.

2.2. Влияние катехоламинов на аденилатциклазу

О сопряжении рецепторной и каталитической субъединиц аденилатциклазной системы в процессе роста ооцитов судили по чувствительности аденилатциклазы к катехоламинам (адреналину и норадреналину), а так же по способности гуанинового нуклеотида (ГТФ) влиять на эффект, вызванный перечисленными выше гормонами.

В мембранных препаратах растущих ооцитов морской звезды А. japónica адреналин и норадреналин оказывали стимулирующий эффект на активность фермента (рис. 3). При совместном действии ГТФ и каждого из гормонов наблюдалось отчетливое потенцирование эффекта последних. Антагонист адренорецепторов р-типа - альпренолол (5х10"®М) на 50% снижал стимулирующий эффект катехоламинов на АЦ (табл. 4), тогда как применение а-адреноблокатора - фентоламина, дофаминергического антагониста - галоперидола не было эффективным. Ни один из испытанных

аминов в концентрации 10"5 М не влиял на активность фермента мембран созревающих ооцитов.

Рис. 3. Влияние катехоламинов (10"5М) и ГТФ (Ю^М) на аденилатциклазную активность мембран ооцитов морской звезды Aphelasíerias japónica. Мембранная фракция выделена из растущих и созревающих ооцитов. 1- активность фермента в отсутствии модификаторов принята за 100%; 2 - адреналин; 3 - норадреналин; 4 -ГТФ; 5 - норадреналин + ГТФ; 6 - адреналин + ГТФ.

Таблица 4. Влияние агонистов и антагонистов на активность аденилатциклазы мембран растущих ооцитов морской звезды, %_

Агонисты Антагонисты

без добавок альпренолол, 5 Ю^М галоперидол, 10~4М фентоламин, Ю^М

без добавок 100 100 100 100

адреналин, Ю^М 419 210 410 416

норадреналин, Ю^М 340 160 345 320

Полученные результаты свидетельствуют о специфичности действия катехоламинов и о функциональной связи их рецепторов в мембранах растущих ооцитов с АЦ через выбелок.

23. Система катсхоламины - р-адренорецепторы в мембранах ооцитов

Для идентификации катехоламиновых рецепторов, а также изучения функционального состояния адренорецепторного аппарата в процессе роста ооцитов исследовали связывание меченого антагониста адренорецепторов -

дигидроальпренолола ([3Н]-ДГА) - мембранными препаратами растущих и созревающих ооцитов. Связывание радиолиганда ([3Н]-ДГА) плазматическими мембранами наблюдалось как у растущих, так и закончивших рост ооцитов. Специфическое связывание было одинаковым для исследованных групп ооцитов (рис. 4). Анализ полученных данных с помощью метода Скетчарда (вставка, рис. 4) позволил выявить один класс связывающих мест с Ка для данного радиолиганда 1.064±0,02 нМ, максимальное число центров связывания составляло 0.676 пмоль/ мг белка. Коэффициент Хилла был равен 1.0, что указывает на отсутствие кооперативности процесса связывания.

Селективность выявленных рецепторподобных участков оценивали по способности различных веществ замещать [3Н]-ДГА в центрах специфического связывания. В этой серии экспериментов из агонистов адренорецепторов использовали адреналин и норадреналин, дофаминовых рецепторов - дофамин, серотониновых - серотонин; из антагонистов адренорецепторов (З-типа - пропранолол, а-типа - фентоламин. По сродству к исследованным агонистам и антагонистам участки связывания [3Н]-ДГА как растущих, так и завершивших рост ооцитов не отличаются. Из агонистов наиболее сильным конкурирующим действием обладает адреналин. Полумаксимальное ингибирование связывания (1С50) наблюдалось при концентрации адреналина 2х10'7М (табл. 5). Менее эффективен норадреналин (1С50= 9х10"7М). Ни серотонин, ни дофамин даже при высоких концентрациях (10"5-10^М) не вытесняют меченый лиганд из участков специфического связывания. Полученные результаты по конкурентному вытеснению показывают, что из всех испытанных лигандов только Р-адренергические агонисты и антагонсты способны при физиологических концентрациях взаимодействовать с участками связывания ДГА в мембранах ооцитов.

„ 0.6-, £

1 9 o*

* I

m К

g S 0.4" ь

8 ^ 0J-« 5

v o

í i 0J-

fsf g w 0.15 0.*

bmax 0.6767 kd 1064

1 г 3 |3Н]-ДГА, нМ

Рис. 4. Специфическое связывание [Н3]-дигидроальпренолола мембранами ооцитов морской звезды Asterias amurensis. BMAX - максимальное количество мест связывания радиолигацда (пмоль/мг белка); KD-константа диссоциации (нМ). Вставка вверху - анализ связывания радиолиганда мембранами ооцитов в координатах Скэтчарда. B/F -отношение специфического связывания к общему. В - специфическое связывание.

Таблица 5. Ингибирование связывания [3Н]-ДГА мембранной фракцией ооцитов морской звезды Asterias amurensis различными лигандами _

Лиганд адреналин норадре-налин пропрано-лол дофамин серотонин фентол-амин

1С* 50 (М) 2 х 10"7 9 х 10"7 2 х 10"6 — - —

* 1С$о - концентрация немеченного конкурирующего лиганда, вызывающая 50%-ное ингибирование связывания радиолиганда. Прочерком обозначено отсутствие иншбирующего эффекта на связывание радиолиганда.

Таким образом, в мембранах растущих и завершивших рост ооцитов выявлен относительно высокий уровень специфического связывания ДГА. В

исследованный период оогенеза, судя по неизменной Kd (0,62 нМ), сродство рецептора к указанному лиганду не меняется. За участки специфического связывания конкурируют только адренергические агонисты и антагонисты. Сродство рецепторов к этим препаратам в растущих и закончивших рост ооцитах одинаковое и убывает в ряду: адреналин > норадренапин пропранолол. Такой же ряд убывающей эффективности характерен для типичных (З-адренергических рецепторов (Levitzki et al., 1980). Следовательно, в мембранах растущих и созревающих ооцитов присутствуют адренорецепторы р-типа. Однако ответ аденилатциклазы на адреналин и норадренапин обнаруживается только в растущих ооцитах. В ходе роста гамет ослабевает функциональное сопряжение аденилатциклазы с адренорецепторами, а свойства самих рецепторов (сродство к лиганду, селективность) не меняются. К концу внутригонадного оогенеза происходит нарушение взаимодействия в цепочке Р-адренорецептор - Gs-белок - АЦ. В закончивших рост ооцитах адренорецептор не сопряжен с Gj-белком. Таким образом, снижение активности АЦ в процессе роста ооцитов является результатом изменений происходящих в регуляторном компоненте АЦ системы. Следующая глава нашего исследования посвящена изучению пула регуляторных ГТФ-связывающих белков в ооцитах морских звезд.

3. G-белки в ооцитах морских звезд 3.1. Типы ГТФ-связывающих белков

Семейство G-белков на основе сходства аминокислотной последовательности их а-субъединиц (СЕ) разделяют на четыре класса: Gets, Ga¡, Go, и Gdij. Для идентификации G-белков в ооцитах морских звезд использовали антисыворотки, полученные к специфическим для этих белков последовательностям нуклеотидов: Go, - RMHLRQYELL; Ga¡ -KNNLKDCGLF; Go,,- QLNLKEYNLV; Ga12-QENLKRLMLQ.

Методом иммуноблотгинга в ооцитах двух видов морских звезд А. amurensis и A. japónica выявлены белки, которые специфически связывают

антисыворотки четырех классов й-белков (рис. 5). Молекулярные массы этих белков составляли: 37 кДа, 39 кДа, 46 кДа. 40 кДа.

Антисыворотки к:

Рис. 5. Иммуноблоттинг гомогенатов ооцитов морской звезды с антисыворотками к различным классам а-субъединиц в-белков. Стрелками указаны молекулярные массы белков, специфически связывающие антитела к Осц, Оа12,Са, и Оа, белкам.

Известно, что а-СЕ Огбелков являются субстратом для рибозилирования коклюшным токсином, а С,-белка - холерным токсином. В та время как, Ощ, Са,2 не являются субстратом для действия токсинов. Мы использовали тест с бактериальными токсинами для идентификации О-белкой в гомогенатах ооцитов морской звезды А. атигетЫ. Выявлены два белка, которые подвергались АДФ-рибозилированию бактериальными токсинами. Белок с молекулярной массой 37 кДа служил субстратом для холерного токсина (ХТ), а белок 39 кДа - коклюшного токсина (КТ) (рис. 6).

Таким образом по молекулярной массе, имму нореактивности и по рибозилируемости токсинами белки 37 «Да и 39 кДа могут бьггь определены как а-СЕ и С,-белков (соответственно), белок 46 кДа может быть идентифицирован как сц-субъедин нца в-белка, а белок 40 кДа - Оа,2. Ранее последние два типа О-белков в ооцитах морских звезд не были выявлены.

ХТ

KT

37 кДа

39 кДа

Рис. 6. [32Р]АДФ-рибозклирование бактериальными токсинами G-белков гомогенатав ооцитов морской звезды. Инкубация мембран с [32Р]НАД с холерным (ХТ) и коклюшным (KT) токсинами. Стрелкой показан рибозилированный белок.

3.2. Количественная динамика выявленных гнпов G-белков на разных стадиях полового цикла

Для исследования динамики различных типов а-СЕ G-белков использовали метод количественного иммуноблоттинга. Максимальную плотность иммунохимического окрашивания на блоте принимали за 100%. Интенсивность иммуноцитохимического окрашивания на Ga^- и Оа12-белкм одинакова в растущих, закончивших рост и созревающих ооцитах (рис. 7). Максимальное количество Gа,-белка синтезируется в плазматических мембранах растущих ооцитов. В закончивших рост гаметах содержание сц-белка уменьшается на 24%, а в созревающих ооцитах почти на 80%. По мере роста и приобретения чувствительности к гормону созревания, в мембранах ооцитов увеличивается количество Са,-белка. В закончивших рост и гаметах готовых к вымету количество этого бежа максимально. Отмеченные нами количественные изменения содержания а-СЕ Gr и Gj-белков могут быть связаны с изменяющейся ролью этих белков в ходе оогенеза. На стадии роста решающее значение имеет катехоламинергическая регуляция, осуществляемая при участии С5-белка. Накопление Gai-белка в плазматической мембране к концу внутри гонад но го оогенеза, вероятно,

связано с участием субъединиц этого белка в снятии профазного блока мейоза.

Рис. 7. Количественная динамика различных типов а-субъединиц G-белков в плазматических мембранах (Gs, G; и G4) и гомогеиатах (Gi¿) ооцитов морской звёзды Asterias amurensis.

2,3. Выделение G-белка из мембран ооцитов

Белок, выделенный из луб рольного экстракта плазматических мембран созревающих ооцитов морской звезды A. amurensis методом колоночной хроматографии, представлял из себя гетеротример с молекулярными массами 39 кДа, 37 кДа и 8 кДа (рис. 8). Белок 39 кДа обладал высокой ГТФ-азной активностью, подвергался АДФ-рибозилированию коклюшным токсином (рис. 9) и связывал антисыворотку, содержащую антитела к Ga¡i 2-белку позвоночных животных (рис. 10).

Таким образом, выделенный нами белок по молекулярной массе его субъединиц, по иммунореактивности к Gttji ¿-белку позвоночных животных и способности подвергаться АДФ-рибозилирован ию коклюшным токсином аналогичен Gi-белку позвоночных животных. Особенностью G;-белка

является отсутствие изоформ агСЕ, что свидетельствует о примитивности системы ГТФ-связывающих белков ооцитов морских звезд.

— ■

/ 39 кЛа.

37

8 кДа

Рис. 8. Электрофореграмма G-белка ооцнтов морской звезды Asterias amurensis. Выделенный из ооцитов морской звезды G-белок (0,1 мкг) разделяли в 15% полиакриламидном ]"еле в присутствии ДДС-Na, белки окрашивали серебром. Справа стрелками указаны молекулярные массы субъединиц G-белка.

Рис, 9. [мР]АДФ-рибозилирование холерным (1) и коклюшным (2) токсинами фракции содержащей выделенный в-бело к. Справа стрелкой показан рибозилированный белок.

3.4. Локализация С «¡-белка

Методом количественного иммуноблоттинга установлено, что основная часть «¡-белка в созревающих ооцитах находится во фракции, обогащенной [ и [аз м этическими мембранами, и незначительное количество присутствует в цитозоле (рис. 11), Уже через 10 мин после применения 1-МеА содержание «¡-белка в плазматической мембране снижалось, а в цитозоле возрастало и почти не изменялось до РЗП. У контрольной группы клеток (инкубация ооцитоь без гормона в течение 25 мин) количество а,-субъединицы в

2

исследуемых фракциях не изменялось, и РЗП наблюдалось не более чем у 2.4 % ооцитов. Перераспределение С О;-б елка из мембраны во внутриклеточные структуры при действии 1-МеА подтверждают данные, полученные методом электронной иммуноцитохимии с использованием п ол и клональн ьгх кроличьих антител на а, 1,2-субъединицу О-белка и вторичных антикроличьих антител, меченных коллоидным золотом.

X . ■.

Рис. 10. Иммуноблоттинг с поликлональной антисывороткой наанд-субъединицу. 1 - контроль, гомогенат мозга крысы, 2 - фракция содержащая выделенный О-белок ооцитов морской звезды. Справа стрелкой показан белок, связывающий антитела. <*-

Таким образом, в процессе гормонального созревания ооцитов морской звезды происходит погружение Са,-субъединицы в глубь цитоплазмы клетки. Поскольку общее количество с^-белка в ооцитах до и после РЗП не изменяется (рис. 11а), то, скорее всего, его нового синтеза не происходит, и мы имеем дело с перераспределением одного и того же белка из мембраны во внутриклеточные структуры. Экспериментальные данные свидетельствуют о вовлечении Оа,-белка в процесс снятия профазного блока мейоза.

9075604530150-

0 5 10 15 20

Рис. 11. Влияние 1-метиладенина на содержание Gai белка в ооцитах морской звезды, а - в объединенной фракции плазматических мембран и цитозоля (1), в плазматической мембране (2), в цитозоле (3); б -иммуноблоттинг фракции цитозоля с поли ю1 о паль ной антисывороткой на ап,гсубъединицу G-белка. По оси ординат (а) - количество Gотбелка, выраженное в условных единицах плотности в пересчете на мг белка, по оси абсцисс (а) и внизу блота (б) - время действия 1-МеА, мин,

4.1-Метиляденыи и аденилатцыклаза

4. ]. Влияние циклических нуклеотидов на индукцию созревания ооцнтов

Введение этого раздела связано с имеющимися в литературе противоречивыми данными о роли циклических нуклеотидов в регуляции делений мейоза у морских звезд. Исследовали влияние препаратов, изменяющих уровень цикл о нуклеотидов (активаторов аденилат- и гуанилатциклазы, ингибиторов циклонуклеотидзависимой фосфодиэстеразы) на процесс индуцированного 1-МеА созревания ооцитов 8 условиях экспериментов in vitro. Вещества, повышающие внуф и клеточную концентрацию цГМФ - нитропруссид натрия и дб-цГМФ не влияют на

вызванное 1-МеА созревание ооцитов морских звезд (рис. 12). Форсколин, активирующий аденилатциклазу, подавляет созревание ооцитов морских звезд. Концентрация препарата вызывающая ингибирование процесса РЗП у 50% клеток (ЕС5о) составляла 2,3х Ю^М. Негидролизуемый аналог цАМФ -дб-цАМФ, был наиболее эффективным ингибитором индукции созревания (ЕС50= 1,07x10"^). Ингибиторы цАМФ-зависимой фосфодиэстеразы (ГОМХ и теофиллин) также вызывают дозозависимое подавление созревания (ЕС50 9,02* Ю^М и 2,8><10^М, соответственно). По эффективности действия на РЗП используемые препараты расположились в следующий ряд убывающей активности: дб-цАМФ > форсколин > ГОМХ > теофиллин. На основании полученных экспериментальных данных можно заключить, что препараты, повышающие внутриклеточный уровень цАМФ, ингибируют процесс вступления ооцитов в деления мейоза. Наибольшую активность проявляют препараты активирующие аденилатциклазу. Наши данные подтверждают гипотезу о необходимости падения уровня циклонуклеотида для снятия профазного блока мейоза (Меуег е! а1., 1989) и свидетельствуют о возможном вовлечении АЦ в этот процесс. Для проверки выдвинутого предположения исследовали влияние 1-МеА на АЦ ооцитов.

4.2. Влияние 1-МеА на активность АЦ растущих и закончивших рост ооцитов

В растущих ооцитах морской звезды 1-МеА в диапазоне исследованных концентраций (10'1О-10"5М) не влиял на активность аденилатциклазы. Тогда как преинкубация мембранных препаратов закончивших рост и созревающих ооцитов приводила к значительному снижению активности цикпазы. Величина полумаксимального ингибирования аденилатциклазы мембран ооцитов (1С50) для 1-МеА составляла 5,5х10"8М (рис. 13).

10* Ю- «л »* 1Л+ »■• *4

Цитропруссид в «три я, М

I»4 10* «•* «-*

дябугнрю-цГМФ, М

5 »

10* М7 Т* »-»

Форстш^М

п* 1*' М* Ю* «•«

дбъШФ.М

1ВМХ.М Тсофилтш.М

Рис. 12. Влияние препаратов изменяющих уровень циклических нуклеотидов на индуцированное 1-МеА (10" М) созревание ооцитов морской звезды Ах/епаз атигет/з. По оси абцисс- концентрация препарата, по оси ординат - процент ооцитов с РЗП.

Изучение влияния гуаниновых нуклеотидов на ингибирующий эффект 1-МеА показало, что ГТФ (5*Ю^М) усиливал этот эффект гормона в мембранах созревающих ооцитов. Наиболее выраженным потенцирующим эффектом, как и ожидалось, обладал негидролизуемый аналог ГТФ. Гуанилдифосфат (ОБР-р-Б) блокировал ингибирующее влияние 1-МеА на фермент (табл. 6).

Рис. 13. Влияние 1-метиладенина (1-МеА) на активность аденилатциклазы созревающих ооцитов морской звезды.

Таблица б. Влияние гуаниновых нуклеотидов на 1-МеА ингибируемую аденилатциклазу мембран созревающих ооцитов морской звезды РайНа ресйт/ега __

Гормон (Ю'М) Активность АД (пмоль цАМФ/мг белка/10 мин

без добавок + ГТФ + йТР-у-З +СОР-Р-8

Контроль 8,1 ± 0,5 8,9 + 0,7 22,45 ± 1,3 6,9 + 0,4

- +10% +177% -15%

1-МеА 4,9+1,1 5,1 + 0,9 11,3 ± 1,7 7,0 ±0,6

-39% -43% -50% 1,4%

Таким образом, только в созревающих ооцитах аденилатциклаза чувствительна к действию 1-МеА. Потенцирующий эффект ГТФ и его негидролизуемого аналога на действие гормона указывает на сопряжение 1-МеА рецепторов с аденилатциклазой через ГТФ-связывающий белок. Отсутствие реактивности цикл азы к гормону созревания в растущих ооцитах может быть связано с незрелостью мембранного комплекса рецептор-аденилатциклаза. Для проверки этого предположения методом радиолигандного анализа изучали связывание [3Н]-1-МеА мембранами,

выделенными из растущих, закончивших рост и созревающих ооцитов морской звезды А. атигепж.

4.3. Рецепторы 1-метиладенина в мембранах ооцитов

Мембраны растущих ооцитов практически не связывали [3Н] -1-МеА (рис. 14). Места специфического связывания в закончивших рост и созревающих ооцитах имели достаточно высокое сродство. Константы диссоциации (К^ ) были близки по своим значениям (достоверного различия не выявлено) и составляли 0,89 и 0,8 мкМ (соответственно). Количество мест связывания (Вт!„) в закончивших рост ооцитах было немного больше (545,0 фмоль/мг белка), чем в созревающих гаметах (476,2 фмоль/мг белка). Изложенные факты свидетельствуют о том, что рецепторы к гормону созревания синтезируются в конце стадии «роста и созревания» гамет и в компетентных к созреванию клетках, количество рецепторов максимально. Только в созревающих ооцитах рецептор 1-МеА сопряжен с Сгбелком и ингибирует АЦ при действии гормона созревания. Каков механизм ингибирования АЦ гормоном?

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25

[3ÍI]l-fvfcA, мкМ

• растущие ооциты

т заносившие рост ооцигы ВМАХ 476 2 КО 0.8068

■ созревающие ооцшы ВМАХ 545.0 КО 0.8919

Рис. 14. Специфическое связывание [3Н]-1-метиладенина (1-МеА) мембранами ооцитов морской звезды Asterias amurensis.

4.4. Механизм ингибирования аденилатциклазы гормоном созревания

Для выяснения роли субъединиц в-белков в ингибирующем эффекте гормона созревания на АЦ использовали тест с бактериальными токсинами. Изучение влияния бактериальных токсинов на активность АЦ в ооцитах морских звезд показало, что ингибирующее влияние 1-МеА снималось только при действии коклюшного токсина и не изменялось в условиях действия холерного токсина (табл. 7).

Эксперименты с использованием поликлональных антител к различным субъединицам в-белков показали, что из исследованных антисывороток, только одна однозначно блокировала ингибирующее

Таблица 7. Влияние бактериальных токсинов на АЦ-ингибирующий эффект 1-МеА_

Добавка (10"7М) Активность АЦ (пмоль цАМФ/мг белка/10 мин)

контроль холерный токсин коклюшный токсин

контроль 6,3 ± 0,2 10,5 ±1,2 7,2 ±0,5

1-МеА 3,1 ±0,2 6,2 + 0,1 6,7 ±0,4

% 51 41* 6*

* - влияние токсинов на АЦ-ингибирующий эффект 1-МеА в %.

Таблица 8. Влияние поликлональных антител к субъединице G-белков на АЦ созревающих ооцитов морской звезды Asterias amurensis_

Добавка Активность фермента (пмоль цАМФ/мг белка/10 мин) добавлены антитела к субъединицам:

без антител Os 0,1,2 Оо РУ

контроль 6,3+0,2 7,2 ±0,5 6,2 ±0,4 6,6 ±0,2 5,6 ±0,5

1-МеА (10"7М) + GTP-y-S (10-41) 4,5 ±0,1* 4,8 ±0,2* 6,6 ±0,2 4,7 ±0,1* 1,9 ±0,5*

% -29 -33 +6 -29 -66

* - изменения достоверны по отношению к контрольным величинам

действие гормона на АЦ - антисыворотка содержащая антитела к а^-белку (табл. 8). Преинкубация мембранных препаратов с антителами к ßy-комплексу субъединиц усиливала эффект 1-МеА на активность фермента. Приведенные данные показывают, что только а;-СЕ G-белка может ингибировать АЦ при действии 1-МеА.

Обобщая полученные данные можно заключить, что механизм реализации действия 1-МеА на мембраны ооцитов следующий: 1-МеА рецептор - G,-6enoK - а,-СЕ - АЦ. Наше предположение об участии а,-СЕ белка в передаче сигнала подтверждается результатами проведенного исследования: 1) потенцированием гуаниновыми нуклеотидами ингибирующего АЦ действия 1-МеА; 2) блокированием ингибирующего эффекта 1-МеА только антителами к а,-белку; 3) снятием ингибирования АЦ гормоном созревания при обработке мембран коклюшным токсином.

5. Роль цитоскелета в индукции созревания ооцитов

Во многих клетках, значительная часть микрофиламентов локализована в примембранной области цитоплазмы и считается, что они могут принимать участие в трансмембранной передаче информационных сигналов, в том числе и гормональных (Janmey, 1998).

Одним из первых морфологических маркеров индукции созревания морских звезд является формирование актиновых пучков в кортикальной зоне ооцитов (Schroetter, Stricker, 1983). Поскольку модификатор G, бежа -коклюшный токсин ингибирует формирование актинсодержащих структур Sadler, Ruderman, 1998), то не исключено, что процесс полимеризации актина может регулироваться на уровне ГТФ-связывающего белка. Мы исследовали состояние актинового цитоскелета ооцитов морской звезды A. amurensis при индукции созревания, до момента РЗП. Изучали количественную динамику и локализацию актина, а также агСЕ G-белка в этот период времени. На первом этапе исследовали морфологические изменения, вызванные 1-МеА и происходящие в кортикальной зоне ооцитов.

5.1. Морфология созревающего ооцита

Для незрелых ооцитов характерно наличие на поверхности микроворсинок. Микроворсинки поддерживаются сетью актиновых микрофиламентов, продолжающихся в субапикальную зону цитоплазмы. Через 5 мин после действия 1-МеА на анимальном полюсе ооцита наружная мембрана разглаживается и микроворсинки исчезают. Количество желточных гранул в апикальной зоне цитоплазмы снижается, а содержимое оставшихся - разрыхляется. Митохондрии смещаются к вегетативному полюсу ооцита. Происходит дезинтеграция структур эндоплазматической сети, которая представлена в данном случае лишь мелкими микропузырьками. Через 10 мин после инициации созревания процесс реорганизации поверхностного аппарата клеток распространяется к вегетативному полюсу ооцита. В этот период, на вегетативном полюсе ооцита количество микроворсинок уменьшается, и наблюдаются начальные стадии реструктуризации цитоплазмы. Через 30 мин после действия гормона, происходит разрушение мембраны зародышевого пузырька и завершается перестройка всей апикальной поверхности цитоплазмы ооцита.

5.2. Количественная динамика актина при индукции созревания ооцитов

Количество общего актина, установленное методом ингибирования ДНК-азы I, в процессе созревания ооцитов не изменяется и составляет в среднем 54.86 ± 1.57 мкг/мг белка (рис. 15). До применения гормона большая часть актина не входит в состав филаментов (в-актин). Так в незрелых ооцитах на долю филаментного актина (I7- актин) приходится лишь 22% от общего пула актина, что составляет 12.3 ± 2.1 мкг/мг белка. Количество в-актина составляет 44.03 ±3.2 мкг/мг белка. Через 10 мин после применения 1-МеА соотношение Р- и в- актина достоверно не изменяется. Массивная полимеризация актина происходит на 15-20 мин действия гормона. В это время количество Б- актина увеличивается в 2.7-3 раза, а в- актина

пропорционально уменьшается. К 30 мин, когда у 100% ооцитов происходит РЗП, наблюдается тенденция к началу процесса деполимеризации актина. Таким образом, количество общего актина в незрелых и созревающих ооцитах не изменяется. Следовательно, перестройки актинового цитоскелета индуцированные 1-МеА происходят за счет белков накопленных в период роста ооцита.

Одним из белков-посредников обеспечивающих связь между филаментным актином и мембраной в ооцитах некоторых животных является спектрин (или спектриноподнобный белок). Для идентификации спекгриноподобного белка в гомогенатах ооцитов морской звезды применяли метод иммуноблотгинга. Антитела к эритроидному спектрину связывались с одним белком, молекулярной массой 230 кДа (рис. 16). Спектриноподобный белок ооцитов морской звезды по электрофоретической подвижности отличается от аналогичного белка позвоночных животных, но имеет с ним иммунологически родственный участок. Ранее спектриноподобный белок 230 кДа был выявлен в ооцитах амфибий и мышей (Бапуапоу et а1., 1986; СапйепЩо е1 а1., 1997). Возможно, что выявленный нами белок близок по строению к спектрину из ооцитов других животных, но отличается от аналогичного бежа соматических клеток.

53. Перестройка актино-спектринового цитосклета при гормональной индукции созревания

Проведенное нами иммуноцитохимическое исследование локализации актина и спектриноподобного белка в ооцитах показало, что в незрелых ооцитах антитела окрашивают кортикальную область цитоплазмы и ядерную оболочку. Незначительное количество актина выявляется в толще цитоплазмы. Через 10 мин после применения гормона флуоресцентная метка, маркирующая места связывания актина и спектрина в примембранной области уменьшается и появляется в цитоплазме на анимальном полюсе.

Выявлена ко-локализация актина и епектриноподобного белка в процессе созревания ооцитов.

Рис. 15. Количественная динамика актина в ооцитах морской звезды в процессе созревания.

По горизонтали - время действия 1-метиладенина, мин, по вертикали -количество актина, мкг/мг общего белка. Незаштрихованные столбики -в-актин, заштрихованные столбики - Р-актин, I - общий актин. Стрелкой указано время, когда у 100% клеток произошло разрушение зародышевого пузырька (РЗП). * - достоверность разницы по сравнению с ооцитам до применения гормона.

а б в

— ззо

— _ 220

_ 67

Тг- 60

- 36

-

Рис, 16. Иммуноблотгипг с антителами к спектрину гомогената незрелых ооцитов морской звезды Asterias amurensis. а - белок 230 кДа; б - контрольный препарат, инкубация без первых антител; в — стандарты молекулярных масс, кДа.

Локализацию актина и Ga,-белка в ооцитах в ходе созревания определяли иммуноцитохимически с использованием вторичных антител,

меченных коллоидным золотом с разным размером частиц. До момента индукции созревания большая часть актина и а,-СЕ расположены в зоне кортекса. Через 10 мин после применения 1-МеА скопления метки, содержащие частицы с разным размером зерен перемещаются вглубь цитоплазмы ооцита. Участки связывания антител Орбелка в цитоплазме ооцита всегда были локализованы вблизи мест связывания анти-актина.

Ко-локализация актина и спектрина, актина и во^-белка в процессе гормонального созревания ооцитов морских звезд является косвенным доказательством вовлечения актино-спектринового цитоскелета в проведение регуляторного сигнала, модулированного 1-МеА.

Заключение

В плазматических мембранах ооцитов в период роста формируется катехоламинстимулированная аденилатциклазная система, осуществляющая моноаминергическую регуляцию процесса оогенеза. Рецепторный компонент этой системы представлен адренергическими рецепторами Р-типа, сопряженными с регуляторным ГТФ-связывающим белком - в,. По мере роста в мембранах ооцитов увеличивается количество регуляторного белка 0,-типа и синтезируются 1-метиладениновые рецепторы. К концу внутригонадного оогенеза, когда развитие ооцитов блокируется на стадии профазы первого деления мейоза, рецепторы 1-метиладенина сопрягаются с регуляторным ГТФ-связывающим ингибиторным белком (в,) и формируется аденилатциклазная система, опосредующая ингибирующее действие гормона созревания 1-метиладеиина на фермент.

В момент нереста 1-метиладенин взаимодействует с соответствующим рецептором, сопряженным с в,-белком. При активации рецептора гормоном на осгсубъединице (СЕ) С-белка, происходит обмен связанного ГДФ на ГТФ, в результате гетеротример диссоциирует на а, -СЕ и р-у гетеродимер. Свободные а,- и ру -СЕ имеют разные внутриклеточные мишени и активируют несколько независимых сигнальных механизмов. Мишенью для

Ру-СЕ является ФИ-З-К, катализирующая процесс образования 3-фосфоинозитидов. Фосфоинозитиды, в свою очередь, прямо или опосредованно активируют серин-треониновую киназу Akt/PKB. Эта киназа фосфорилирует и ингибирует Weel/Mytl киназу (Okumura et al., 2002), что приводит к смещению равновесия в сторону формирования активного фактора созревания (МИФ) (рис. 17). Одной из мишеней активной а,-СЕ является аденилатциклазный ферментный каскад. При действии 1-МеА а,-белковая субъединица может прямо или через актино-спектриновый цитоскелет ингибировать аденилатциклазу (Karaseva et al., 1996; Ламаш, Елисейкина, 2006), снижать внутриклеточную концентрацию цАМФ и ингибировать цАМФ-зависимую протеинкиназу (ПКА). Даже кратковременной отмены ингибирующего влияния ПКА на Cdc25 фосфатазу достаточно для смещения равновесия в сторону активирующего дефосфорилирования МИФ. Активный комплекс Сс1с2-циклин Б через механизм положительной обратной связи» при участии киназы Plkl ингибирует Weel/Mytl киназу (Okano-Uchida et al., 2003). Таким образом, рецептор 1-МеА при сопряжении с G.-белком осуществляет двойную сигнализацию. Это происходит за счет того, что активированная а,-СЕ подавляет АЦ, а ру-комплекс, освобожденный от активированного G-белка, активирует фосфатидил-инозит-3 киназу(ФИ-ЗК) и запускает дальнейшие события мейоза.

Под воздействием неустановленных в настоящее время факторов, мейотические деления повторно блокируется в гонаде на стадии метафаза I. У морских звезд оптимальным для оплодотворения является промежуток времени между РЗП и отделением первого полярного тельца. После отделения первого полярного тельца у оощггов значительно снижается способность противостоять полиспермии (Meijer and Guerrier, 1984). Биологический смысл остановки развития ооцитов после РЗП заключается в сохранении всей популяции половых клеток в одном функциональном состоянии до нереста, который продолжается несколько часов.

При действии гормона созревания активируется нескольких независимых сигнальных путей. Одни из этих путей ведут непосредственно к активации МИФ, а другие регулируют активность внутриклеточных ферментных систем, создающих условия для активации МИФ и обеспечивающих формирование структур, необходимых для благоприятного протекания более поздних событий, происходящих в период оплодотворения и раннего эмбриогенеза. Безусловно, все сигнальные механизмы находятся в тесном взаимодействии друг с другом. Эти взаимоотношения в сигнальной трансдукции требуют специального рассмотрения.

Актино-¡спектриновый цигоскелет |

1-МеА

пепептов г

_М, активный

неактивный | уг«1/муч МЦФ

МИФ _ !

ФИ-ЗК -> АЙ/РКВ

Рис. 17. Предполагаемая схема 1-МеА индуцированного созревания ооцитов морских звезд. Объяснения в тексте.

Выводы

1. Снятие профазного блока мейоза ооцитов морских звезд при действии 1-метиладенина происходит в гонаде до нереста. Под влиянием факторов, выделяемых клетками гонады, процесс мейоза повторно блокируется на стадии метафазы 1. Метафазный блок поддерживается

ингибированием увеличения внутриклеточного уровня рН, индуцированного 1-метиладенином.

2. В мембранах растущих и закончивших рост ооцитах морской звезды Asterias amurertsis идентифицированы p-адренергические рецепторы. В растущих ооцитах адренорецепторы участвуют в стимулирующем влиянии медиаторов моноаминергической системы на активность аденилатциклазы. В ходе роста гамет ослабевает функциональное сопряжение аденилатциклазы с адренорецепторами, а свойства самих рецепторов (сродство к лиганду, селективность) не меняются.

3. В ооцитах морских звезд идентифицированы регуляторные гетеротримерные ГТФ-связывающие белки четырех основных классов - G„ G» Gq и G12. а-Субъединица G-белков каждого класса представлена одной формой. Отсутствие изоформ свидетельствует о примитивности строения системы регуляторных белков в ооцитах морских звезд. Белки G„ Gs , Gq локализованы в плазматической мембране и принимают участие в процессе трансмембранной сигнализации.

4. В ходе роста ооцитов изменяется количественное соотношение а-субъединиц G, - и Gs- белков. В растущих ооцитах количество оц-белка максимально, а в закончивших рост гаметах в большей степени экспрессируется сц-субъединица G¡ -белка. Количественные изменения коррелируют со степенью значимости этих белков в регуляции определенных стадий оогенеза.

5. 1-Мегиладениновые рецепторы синтезируются в конце стадии «роста и созревания» гамет и в компетентных к созреванию клетках, количество рецепторов максимально. Методом радиолигандного анализа в ооцитах морской звезды Asterias amurertsis выявлен один класс рецепторов с константой диссоциации - 0,89 мкМ. Только в конце внутригонадного оогенеза 1-метиладениновый рецептор функционально сопряжен с G,-белком.

ó. Актино-спектриновый цитоскелет вовлечен в процесс трансдукции сигнала, модулированного 1-метиладенином. В кортикальном слое цитоплазмы и ядерной мембране незрелых ооцитов морской звезды Asterias amurensis идентифицирован спекгриноподобный белок молекулярной массой 230 кДа. Этот белок солокализован с актиновым цитоскелетом. 1 -Метиладенин стимулирует процесс деполимеризации актина и вызывает перестройку актино-спектринового цитоскелета, которая начинается в кортикальном слое на анимальном полюсе ооцита и распространяется к его вегетативному полюсу.

7. 1-Метиладенин ингибирует аденилатциклазу компетентных к созреванию ооцитов морских звезд. Механизм действия гормона созревания может быть представлен следующим образом: 1-метиладениновый рецептор ■=> G-белок а,-ГТФ субъединица ^ ингибирование аденилатциклазы ■=> снижение внутриклеточного уровня цАМФ. Ингибирование аденипатциклазного сигнального каскада способствует снятию профазного блока мейоза и необходимо для созревания ооцитов морских звезд.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Change in water-soluble Ca2+-calmodulin target proteins during embiyogenesis of the sea urchin and starfish / D.I. Kreimer, N.E. Lamash, V.Ya. Fedoseev, V.M. Grishenko // Онтогенез. - 1991. - Т. 22, № 4. - С. 421-422.

2. Lamash, N.E. Properties of the adenylate cyclase in the oocytes of starfish Asterias amurensis / N.E. Lamash, Yu.S. Khotimchenko // Comp. Biochem. Physiol. - 1992. - V. 103C. - P. 379-382.

3. Ламаш, H.E. Характеристика аденилатциклазы на донервных стадиях эмбриогенеза морских звезд и ежей / Н.Е. Ламаш, Ю.С. Хотимченко // Тез. докл. межд. конф. «Нейрофармакология на рубеже двух тысячелетий». - С.-Петербург, 1992. - С. 119.

4. Lamash, N.E. Alteration of the starfish oocyte adenylate cyclase properties in gametogenesis / N.E. Lamash, E.M. Karaseva, Yu.S. Khotimchenko // Сотр. Biochem. Physiol. - 1993. - V.105, N3. - P.531-534.

5. Ламаш, H.E. Свойства аденилатциклазы яиц и эмбрионов морских звезд и ежей / Н.Е. Ламаш // Биология моря. -1993. - № 4. - С. 73-78.

6. Lamash, N.E. Demonstration of beta-adrenergic receptors in intact Asterias oocytes / N.E. Lamash, Yu.S. Khotimchenko, I.I. Deridovich // Ehinoderms throuth Time, David, Guille, Feral & Roux (eds), Balkema. - Rotterdam, 1994.-P. 337-341.

7. Karaseva, E.M. 1-Methyladenine inhibits adenylate cyclase in starfish oocytes / E.M. Karaseva, N.E. Lamash, Yu.S. Khotimchenko // Invert. Reprod. Dev. -1996. - V.30. - P.153-158.

8. Ламаш, H.E. Регуляция активности аденилатциклазной системы ооцитов морской звезды Asterias amurensis / H.E. Ламаш, О.И. Шевцова И Биология моря. -1998. - Т. 24, № 6. - С. 388-393.

9. Поликлональные* антитела, маркирующие клетки радиального нерва морской звезды Asterias amurensis / М.Г. Елисейкина, Н.Е. Ламаш, А.А. Булгаков, И.Ю. Долматов // Известия АН. Сер. Биол. - 2000. - №2. - С. 149-152.

10. Ламаш, Н.Е. Идентификация и выделение ГТФ-связывающего регуляторного бежа из плазматических мембран ооцитов морской звезды Asterias amurensis / H.E. Ламаш // Известия АН. Сер. Биол. -2001. -№1,- С. 121-124.

11.Subcellular shifts of trimeric G-proteins / A. Kotyk, I. Ihnatovych, G. Lapathitis, N. Lamash, P. Svoboda // Microbiol. - 2001. - V. 46. - P. 391396.

12Ламаш, H.E. Гормональная регуляция мейоза у морских звезд / Н.Е. Ламаш // Биология моря. - 2002. - Т.28, №6. - С. 395-404.

13.Ламаш, Н.Е. Влияние 1-Метиладенина на локализацию Gr-белка в ооцитах морской звезды / Н.Е. Ламаш, М.Г. Елисейкина // Онтогенез. -2002. - Т.ЗЗ, №4. - С. 303-306.

14.Ламаш, Н.Е. Перестройка актинового цигоскелета в ходе созревания ооцитов морской звезды / Н.Е. Ламаш, М.Г. Елисейкина, В.А. Кумейко // Цитология. - 2003. - Т. 45. № 9. - с. 894-895.

15.Ламаш, Н.Е. Исследование количественной динамики F-актина при созревании ооцитов морской звезды Asterias amurensis / Н.Е. Ламаш, М.Г. Елисейкина// Онтогенез. - 2006. - Т. 37, № 4.. с. 273-278.

16.Ламаш, Н.Е. Перестройка актино-спектринового цигоскелета при созревании ооцитов морской звезды / Н.Е. Ламаш, М.Г. Елисейкина // Биология моря. - 2006. - № 2. - С. 134-138.

ЛАМАШ Нина Евгеньевна

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ РОСТА И СОЗРЕВАНИЯ ООЦИТОВ У

МОРСКИХ ЗВЕЗД

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Подписано в печать 9.01.2007 Формат 60x84^. Усл.печл. 2.0, уч.-издл. 1.8

Тираж 100 экз. Издательство Дальневосточного университета 690950, г.Владивосток, ул. Октябрьская, 27 Отпечатано на множительной технике Управления научно-исследовательских работ ДВГУ 690950, г.Владивосток, ул. Суханова, 8

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Ламаш, Нина Евгеньевна

ВВЕДЕНИЕ.„

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.,.

1.1- Оогенез как этап кнднандуального развития. ,1,1. Происхождение женских половых клеток.

1.1.2. Рост н развитие ооннтов.

1.1.3. Общее предегавленне о созревший ооцнтов.

1.1.4. Гибель ойцнтой.

1.2. Фактор созревания.

1.3. Индукция сочреаоиия ооцитов.♦„„.

1.3.1. Мсйоэ-тгдуцнрукмцая субстанция.„.

1.3.2, Рецепторы мейо>нндуцирующей субстанции.

1.4, Цнтоплазматическкй контроль созревания.

1.4.1. ГТФ-свяэывающне белки (О-белкн).,.,.

1.4.2. Ионы кальция.

1.4.3. Лдсноши- 3\5''Цнклнческий монофосфат (цАМФ).

1.4.4. Фосфатнднл-кнознт -3 киназа (ФИ-ЗК). —

1.4.5. Мнтопгн-актнвкрусмые протеннкиназы (МАРК).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы регуляции роста и созревания ооцитов у морских звезд"

Актуальность проблемы Изучение закономерностей оогенеза представляет собой одну из важнейших задач в современных исследованиях по биологии развития. В ряду актуальнейших проблем оогенеза - процессы, происходящие в ооците на заключительных стадиях оогенеза, а так же в период созревания, когда завершивший рост ооцит превращается в зрелое яйцо, способное к оплодотворению и дальнейшему развитию.Характерных особенностью развития женских гамет разных животных является остановка процесса мейоза на различных фазах мейотических делений. У многих животных организмов развитие ооцитов блокируется на стадии G2/M первого деления мейоза. Возобновление делений мейоза происходит либо при оплодотворении, либо при действии гормона. Большой интерес в связи с этим представляет вопрос о механизме блокирования мейоза, и, тесно связанный с ним, вопрос о снятии этого блока при гормональной стимуляции ооцита.Несмотря на интенсивные исследования, проводимые во многих лабораториях мира (Dunphy, 1994; Bayaa et al., 2000; Boonyaratankomkit et al., 2001; Byskov et al., 2002; Iwasaki et al., 2002; Harada et al., 2003) рецепторы к мейозиндуцирующим гормонам и ранние внутриклеточные сигнальные пути, активированные при связывании гормона с соответствующим рецептором, точно не установлены ни у одного из исследованных организмов. Удобной экспериментальной моделью для изучения механизмов созревания являются ооциты морских звезд. Это единственные животные, у которых установлен природный гормон созревания (1-метиладенин), что позволяет моделировать процесс индукции созревания в условиях экспериментов т vitro, максимально приближенными к физиологическому созреванию. Несмотря на достижения в области изучения сигнального каскада созревания у этих животных, остается много вопросов, которые требуют ответа. Нет сомнения, что трансдукция сигнала, генерируемого мейоз-индуцирующим гормоном, реализуется через рецептор (Yoshikuni et al., 1988; Tadenuma et al., 1991, 1992), сопряженный с гетеротримерным Gбелком (Shilling et al., 1989; Chiba et al., 1992, 1993). При активации G-белок диссоциирует на две активные субъединицы Ga и G&y комплекс, имеющие разные внутриклеточные мишени. Ведущая роль в снятии профазного блока мейоза отводится GPy-комплексу. В то же время ничего не известно о возможных мишенях "активной" Осс,-субъединицы. Тогда как, специфичность взаимодействия активированного рецептора с определенным G-белком обусловлена конфигурацией сс-субъединицы гетеротримера, и диссоциация комплекса Gapy зависит от состояния ГТФ-связывающего центра и ГТФ-азной активности этой субъединицы. В связи с этим, исследования роли &э;-белка в трансдукции сигнала, модулированного 1метиладенином и поиск внутриклеточных мишеней с которыми эта субъединица взаимодействует, необходимы не только для расшифровки механизмов снятия профазного блока мейоза у морских звезд, но и для понимания механизмов внутриклеточного сигнализирования с участием гетеротримерных G-белков.Фундаментальный интерес в рамках сформулированной проблемы представляет исследование формирования гор монокомпетентной аденилатциклазной системы в ооцитах морских звезд. Этот интерес обусловлен первостепенной ролью в передаче гормонального сигнала в клетку, которая отводится продукту биосинтеза аденилатциклазы, универсальному внутриклеточному посреднику - цАМФ. Существуют косвенные данные, указывающие на возможное участие аденилатциклазы в регуляции роста и созревания ооцитов морских звезд (Meijer et al., 1987, 1989; Tadenuma et al., 1992), однако подробные исследования в этом направлении не проводились.Изучение механизмов регуляции роста и созревания ооцитов морских звезд дополнит существующие в настоящее время молекулярные модели, описывающие процесс формирования и снятия профазного блока мейоза у беспозвоночных животных.Цель и задачи исследования Цель работы состояла в выяснении молекулярных механизмов регуляции роста и созревания ооцитов морских звезд и получении доказательств участия аденилатциклазной системы в снятии профазного блока мейоза.В работе решались следующие задачи: 1. Исследовать процесс созревания в условиях экспериментов in vitro и in vivo с целью оценки влияния клеток гонады на протекание делений мейоза.Изучить морфологические изменения, происходящие в поверхностном слое ооцита в момент действия 1-метиладенина. Оценить участие актинового цитоскелета в процессе снятия профазного блока мейоза.2. Охарактеризовать функциональные свойства аденилатцилазы ооцитов у разных видов морских звезд. Идентифицировать рецепторы, сопряженные с аденилатциклазой, и изучить особенности их регуляции в растущих и закончивших ростооцитах.3. Исследовать формирование функционально-активной аденилатциклазной системы (гормональных рецепторов, ГТФ-связывающих белков и собственно фермента) в процессе роста ооцитов.4. Идентифицировать типы регуляторных G-белков, проследить количественную динамику и локализацию выявленных типов регуляторных белков в процессе роста и созревания ооцитов. Выделить в чистом виде Giбелок с целью сравнения структуры этого белка с аналогичным белком позвоночных животных.5. Изучить механизм снижения уровня циклических нуклеотидов и оценить роль аденилатциклазы при индукции созревания.Научная новизна и теоретическое значение работы Впервые установлено, что после разрушения мембраны зародышевого пузырька развитие ооцитов повторно блокируется в гонаде на стадии s метафазы первого деления мейоза под действием факторов выделяемых клетками гонады.Впервые в ооцитах морских звезд, кроме G^ и G,, идентифицированы еще два типа регуляторных белков, Gq и G|j. Белок типа G ! 2 локализован в цитоплазме ооцита, a Gq связан с мембраной. Синтез а-субъединиц белков всех типов начинается на ранних стадиях оогенеза. По мере роста ооцитов меняется количественное соотношение белков G;, и G,.Доказано наличие двух механизмов гормональной регуляции аденилатциклазы в ооцитах морских звезд: а) стимулирующего аденилатциклазнуго систему варианта, характерного для эффекта медиаторов моноаминергической системы и включающего идентифицированный /3адренорецептор, С-белок и аденилатциклазу; б) ингибирующего варианта с участием 1-метиладенинового рецептора, Отбелка и аденилатциклазы.Впервые установлено, что падение уровня цАМФ при индукции созревания происходит в результате ингибирования аденилатциклазы.Механизм действия 1 -метиладенина описывается следующей схемой: рецептор <=$ G-белок Ф GOj-ГТФ-субъединица <=> аденилатциклаза i 1 ^ цАМФ-t.Впервые в ооцитах морских звезд выявлен спектриноподобный белок.Установлено, что изменения распределения актина и спектрина в процессе созревания ооцитов коррелирует со структурными перестройками ооцита, в частности, с изменением характера поверхности ооцитов и деполимеризацией цитоскелета, поддерживающего аппарат микроворсинок.Выявлена ко-локализация актина, спектрина и активированной асубъединицы G, белка, что может свидетельствовать о вовлечении этого белка в процесс перестройки актинового цитоскелета.На основании собственных и литературных данных предложена гипотетическая схема ранних событий, происходящих в ооците в момент снятия профазного блока мейоза.Практическое значение работы В связи с проблемами искусственного воспроизводства исчезающих и редких видов животных организмов информация, касающаяся механизмов гормональной регуляции роста и созревания, имеет важное прикладное значение. Известно, что система «гормон - механизм реализации его действия в клетке» возникла рано в ходе эволюции, и молекулярные механизмы ее функционирования сравнительно мало и медленно меняются, а наиболее общие из них отличаются исключительной консервативностью. В связи с этим, ооциты иглокожих могут служить модельным объектом для исследований действия разных биологически активных веществ на процесс мейоза. Познание этих процессов открывает перспективы для поиска природных факторов, контролирующих клеточный цикл и открытие новых антимитотических компонентов. Ооциты и гонады морских звезд могут служить источником для получения препаратов, обладающих антимитотическими и пролиферативными свойствами.Основные положения работы, выносимые на защиту 1. В процессе роста ооцитов морских звезд в поверхностной мембране происходит формирование функционально-активной аденилатциклазной системы двух типов- Аденилатциклаза стимулирующего типа осуществляет моноаминергическую регуляцию роста ооцитов, а аденилатциклаза ингибирующего типа принимает участие в процессе индукции созревания.2. Основные типы гетеротримерных ГТФ-связывающих регуляторных белков (G-белков) синтезируются на ранних стадиях оогенеза. Существует специфичность взаимодействия рецепторов l-метиладенина и /3адренорецепторов с G-белками.3. Развитие ооцитов морских звезд повторно блокируется в гонаде на стадии метафазы первого деления мейоза.Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Советскофинском симпозиуме по биологии развития «Сигнальные молекулы и клеточная дифференцировка» (Суздаль, 1991), на Международной конференции «Нейрофармакология на рубеже двух тысячелетий» (СанктПетербург, 1992), на Международной конференции по иглокожим (Дижон.Франция, 1993), на Международном конгрессе по репродукции беспозвоночных животных (Санта-Круз, США, 1995), на 1-ом Съезде общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003). Кроме того, результаты диссертации обсуждались на межлабораторных семинарах и отчетных годовых сессиях Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН. Публикации результатов работы По теме диссертации опубликовано 16 статей, из них 5 статей в зарубежных и 11 статей в рецензированных отечественных научных журналах.Работа выполнена в Лаборатории фармакологии Института биологии моря им. Жирмунского ДВО РАН. Все экспериментальные данные получены автором лично или при его непосредственном участии. Отдельные этапы работы выполнялись в соавторстве с сотрудниками ряда лабораторий Института биологии моря и сотрудниками Лаборатории биохимии мембранных рецепторов Института физиологии Чешской академии наук.Структура и объем работы Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, пяти глав, отражающих результаты собственных исследований, заключения и выводов. Диссертация изложена на 235 страницах машинописного текста и включает 11 таблиц и 41 рисунок.Список литературы содержит 340 источников, из них 24 отечественных и 316 иностранных.Автор выражает свою искреннюю благодарность заведующему лабораторией фармакологии Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН д.б.н. Ю.С. Хотимченко за инициацию данных исследований, моральную поддержку и всестороннюю помощь. Автор благодарит за участие в работе всех соавторов.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Ламаш, Нина Евгеньевна

199 ВЫВОДЫ Снятие профазного блока мейоза ооцнтоэ морских звезд при действии I -мстштаденнна происходит в гоиаде до нереста. Под влиянием факторов, выделяемых клетками гонады, процесс мейоза повторно блокируется на стадии мета фазы I, Метафазный блок поддерживается ингибироввинем увеличения внутриклеточного уровня рН, индуцированного 1-метиладснином,

2. В мембранах растущих н закончивших рост ооцнтвх морской звезды 4sreriiH dmiireflsis идентифицированы /З-адрснергичсскис рецепторы. В растущих ооцитах адренорецепгоры участвуют в стимулирующем влиянии медиаторов моноамннергичсской системы на активность аденняатцнклазы. В ходе роста гамет ослабевает функциональное сопряжение аденнлатцнклазы с адренорецепторами, а свойства самих рецепторов (сродство к лнгавду, селективность) не меняются

3. В ооцитах морских звезд идентифицированы регуляторные гетеротрнмерные ГТФ-связываюшие белки четырех основных классов - G[t G„ G4 и G|i. «-Субъединица G-белков каждого класса представлена одной формой, Отсутствие изоформ свидетельствует о примитивности строения системы регуляторы ых белков в ооцитах морских звезд, Белки Gh G„ Gq локализованы в плазматической мембране и принимают участие в процессе трансмембранной сигнализации.

4. В ходе роста ооцнтов изменяется количественное соотношение о субъедннни G, - и G,- белков. В растущих ооцитах количество а,-белка максимально, а в закончивших рост гаметах в большей степени экспрессируется (Х-субъединица G, -белка. Количественные изменения коррелируют со степенью значимости этих белков в регуляции определенных стадий оогенеза.

5. ЬМетиладеннновые рецепторы синтезируются в конце стадии «роста и созреваниях* гамет и в компетентных к созреванию клетках, количество рецепторов максимально. Метолом раднолнгандного анализа в ооцитах морской звезды Лиепая атигвши выявлен один класс рецепторов с константой диссоциации - 0,89 мкМ. Только в конце внутригонадного оопенеза Е-метилаленнковыЙ рецептор функционально сопряжен с б,-белком.

6, Актино-слектрнновый цнтосхелет вовлечен в процесс трансакции сигнала, модулированного 1-метнлаленином. В кортикальном слое цитоплазмы и ядерной мембране незрелых ооцнтов морской звезды Лиепая атигегинз идентифицирован спектри неподобный белок молекулярной массой 230 к Да. Этот белок солокализован с актиновым цитоскелетом. 1-Метиладеннн стимулирует процесс деполнмернзаини актина н вызывает перестройку актнно-спектрннового цнтоскелета, которая начинается в кортикальном слое на аннмальном полюсе ооцнта и распространяется к его вегетативному полюсу.

7. 1-Мстиладеннн ннгнбнрует аденилатциклазу компетентных к созреванию ооцнтов морских звезд. Механизм деистаия гормона созревания может быть представлен следующим образом: ]-метнлэденнновый рецептор ^ С.-белок ск-ГТФ субъединица ннгибированне адснилатдиклазы ■=> снижение внутриклеточного уровня цАМФ. Ингнбнрованне аденнлатцнклазного сигнального каскада способствует снятию профазного блока мейоза и необходимо для созревания ооцнтов морских звезд.

заключение

Способность оошггов морских звезд адекватно отвечать на регулиториые сигналы, модулированные медиаторами моноамннергичсской системы и t-метиладеннном. обеспечивается формированием в мембране растущих гамет гормонокомпетентной аленилатцнклазной системы. Принцип организации аленилатцнклазной системы оонитов морских звезд имеет большое структурное сходство с подобной системой как беспозвоночных так и позвоночных животных- Во-первых, бета-адренергические и 1-МеА рецепторы локализованы в мембране и имеют лиганлевязывающий домен и домен сопряженный с постреиепторными элементами (G-белкамн). Во-вторых, процесс специфического связывания гормонов, вызывает конформа1шонные изменения в структуре функционально с ним сопряженного олнгомерного G-белка, вызывая его диссоциацию с образование активной формы альфа- и бета-гамма субьединиц, Эти субъедннииы (иди одна из них) взаимодействует с каталитическим компонентом - аденнлатциклазой и регулируют ее активность, изменяя внутриклеточный уровень цАМФ, Каталитические свойства аденилатциклазы ооцитов морских звезд принципиально не отличаются от характеристик аналогичною фермента позвоночных животных, что свидетельствует о высокой степени его эволюционной консервативности (Лам&ш, 1994), Основное отличие аленилатцнклазной системы ооцитов морских звезд от аналогичной системы других животных связано с се рецепториым блоком. Выявленные нами адренорецепторы по фармакологическим характеристикам близки к /З-адренорецегтторам соматических клеток позвоночных и беспозвоночных животных (Levtizkl, 1978; Lamash el в!. 1994). Однако сродство рецепторов ооцитов морских звезд к адрснергнческим агоиистаы меньше, чем у аналогичных рецепторов соматических клеток других животных (Dickinson, Nahorski, 1981; Кузнецова, Солтнцкая, 1989; Lamash et al.t 1994), что указывает на возможные различия в структуре этих рецепторов. Включение, выявленных нами рецепторов в сигнальную цепочку катехол амины - /3-адренорецсптор -0,'белок - шнштцнклаза в растущих ооинтах подтверждают гипотезу Ю.С, Хотимченко (1989) о регуляции процесса роста ооинтов морских звезд медиаторами моноаминергнческой системы и свидетельствуют о структурной консервативности катехоламикчувствительиой адеиилатциклаз-ной системы эукариот.

Кроме алренореиепторов а мембранах ооцитов морских звезд присутствуют 1-МеА рецепторы (УозМкши е1 а!., 1988; Тайепита е( аЗ., 1992), Синтез этих рецепторных белков начинается в конце периода роста н созревания гамет, но только К концу внутригонадного оогенеза они сопрягаются с регуляторным ГТФ-саязы вающим ннгибнториым белком (О,) н аленилатциклазой.

В ооцитах морских звезд синтезируются четыре основных типа регуляторных П"Ф-связывающих белков. Иммунореактивность альфа субъединиц выявленных О-белков к антителам, полученным к специфическим аминокислотным последовательностям соответствующих типов О-белков позвоночных животных, свидетельствует о высокой степени сходства ГТФ-связывающнх белков у далеких друг от друга а филогенетическом плане групп животных. Характерной чертой О-белков ооцитов морских звезд является отсутствие нзоформ о-субьединнц. Для сравнения, у позвоночных животных выявлено около 27 а-субьеднниц, включая несколько сплайенрованных вариантов. Появление новых субьеднннц и различных молекулярных нх вариантов способствует совершенствованию и расширению функции системы ГТФ-связыааюшнх белков, Отсутствие нзоформ свидетельствует о примитивности системы этих белков у морских звезд и, возможно у всех представителей Иглокожих,

Результаты "экспериментов на растущих и закончивших рост ооцнтах показали, что чувствительность к гормону созревания приобретается ооцнтом только перед нерестом. К этому времени в мембране ооцитов накапливается определенное количество соответствующих рецепторных белков, способных взаимодействовать с регуляторным G,-белком, количество которого также увеличивается по мерс роста ооцнта, Определенные изменения происходят в архитектуре плазматической мембраны Связывание рецепторов клеточной поверхности с 1-МеА приводит к перестройке комплекса плазматическая мембрана - актнно-спектриновый цнтоскелст на аиималыюм полюсе ооцнта и в дальнейшем процесс распространяется в область вегетативного полюса {Ламат. Елнсейкина, 2006), Такой же характер носит распространение кальциевой волны, генерируемой 1-МеА (Saniella et al-, 2003). Перечисленные факты свидетельствуют о неравномерности распределения рецепторов в мембране ооцитов или о большей чувствительности рецепторов, находящихся на аиималыюм полюсе ооцнта.

У морских зве:»Д не выявлена цикличность в образовании гонадостимулирующего нейропелтида н биосинтез 1-МеА в фолликулярных клетках начинается задолго до наступления нереста (Mita, Nakamura, 1994). Мы полагаем, 470 сопряжение 1-МеА рецептора и 0,-бслка только в конце внутрнгонадного оогенеза может быть одной из стратегий, регулирующих своевременное вступление ооцитов в деления мейоэа.

Такн.ч образом, накопление функциональных единиц, входящих в состав трансмембранных систем развивающегося ооцнта происходит на ранних стадиях оогенеза, Формирование гормонокомпстентного комплекса происходит позже, через изменение синтеза рецепторного компонента и уровня экспрессии G-белков определенного типа. На примере переключения механизмов регуляции аденнлатцнклазы в процессе роста ооцитов морских звезд мы видим, что в ходе оогенеза действует принцип использования уже созданных ранее молекулярных компонентов (аденидатпнклаэы, и G,-белков) для образования систем с новой функцией.

Снятие профазиого блока мейоза, вызванное 1-МеА происходит в гонаде Предположение о влиянии клеток гонады на процесс индукции созревания ооцитов морских звезд привело к открытию повторной остановки делений мейоза на стадии метафазы I. В отличие от моллюсков и других беспозвоночных (Guerrier ei al,r 1996; Krantic, Rivaillcr, 1996), y которых обнаружен метафазный блок мейоза, у морских звезд этот блок снимается не оплодотворением, а отменой ингнбнрующсго влияния факторов, выделяемых клетками гонады. Такой механизм регуляции созревания ооинтов обеспечивает синхронизацию процесса созревания и функциональную однородность популяции ооннтов на протяжении всего периода нереста, который длится несколько часов.

Учитывая полученные нами данные, процесс созревания ооцнтов у морских звезд может быть представлен следующим образом, Лол воздействием факторов внешней среды (колебания температуры, солености и та) происходит резкое и кратковременное повышение концентрации гонадостнмудирующей субстанции (ГСС) в нервных терминалах, пронизывающих стенки гонады (Kanatani, Shirai, 1971). Это повышение превышает некий пороговый уровень и воспринимается фолликулярными клетками как сигнал к секреции !-МсА (Mita, Naramura, 1996), Гормон созревания выделяется из отростков фолликулярных клеток в области их контакта с плазматической мембраной на анималыюм полюсе ооцита, и связывается с соответствующим рецептором (Yoshikuni et al„ 1988; Tadenuma et al., 1992; Ламаш, Елисейкина, 2006). Результатом этого взаимодействия является снятие профазного блока мейоза и возобновление делений мейоза. Под воздействием неизвестных факторов, выделяемых клетками гонады, мейотичсские деления повторно блокируется на стадии метафаэз I. 1-МеА стимулирует вымет гамет, возможно за счет добавочной секреции гормона клетками стенки гонады (Schuetz, 2000). В морской воле вне гонады, завершаются первое и второе деления мейоза. Ооцнты могут быть оплодотворены сразу же после вымета, но процесс снятия второго блока мейоза не завис1гг от оплодотворения.

Экспериментальные данные представленные в диссертации позволили дополнить существующую схему гормонального снятия профазного блока мейоза y морских звезд. Опираясь на имеющиеся в литературе данные по механизмам регуляции профазного блока мейоза н результаты собственных исследований, мы построили гипотетическую схему процессов происходящих в оопите морских заезд после взаимодействия 1-МеА с рецепторами, то есть при переходе G2/M клеточного цикла (см. рис. 46),

Конечной целью действия 1-МеА является активация фактора созревания (МИФ), который находится в цитоплазме в неактивном состоянии. Основным компонентом МИФ является комплекс каталитического компонента - Cdc2 с ре»улятроным компонентом -цикл ином Б. Активация этого комплекса может происходить при дсфосфорилированни Cdc2 субьединицы (Coleman, Dunphy, 1994; Lew, Kombluth, 1996; O'Farrcll, 2001). Киказы семейства Weel/Mytl осуществляют ннгибиторнос фосфорилированне по треонину 14 и тирозину 15, а фосфатаза Cdc25C активирующее дефосфорнлирование этих аминокислот. Для вступления в M-фазу необходимо инактивнровать Weel/Myil и активировать фосфатазу. Между активностями протсинкиназ и фосфатаэ существует равновесие, смешение которого приводит к определенному клеточному ответу. Таким образом, регуляторное действие 1-МеА направлено на смещение равновесия в сторону формирования активного МИФ.

Трансакция сигнала, генерируемого мейоз-индуцирующнм гормоном, реализуется через рецептор серпантинного типа, сопряженный с гетеротримериым G,-белком. При активации рецептора гормоном на а,-СЕ G-белка, происходит обмен связанного ГДФ на ГТФ, в результате гетсротример диссоциирует на а, -СЕ и ру гетеродимер- Свободные а,- и Ру -СЕ имеют разные внутриклеточные мнщенн и активируют несколько независимых сигнальных механизмов. Мишенью для Ру-СЕ является ФИ-З-К, катализирующая процесс образования 3-фосфоинознтндов. Фосфонназнтнды, В свою очередь, прямо или опосредованно активируют серни-треониновую кип азу Akt/PKB. Эта кнназа фосфорилирует и ингибнрует Weel/Mytl кнназу (Okumura et а]., 2002), что приводит к смешению равновесия в сторону1 формирования активного МИФ (рис. 46), Одной из мншсисЙ активной а,-СЕ является аденнлатциклазны й ферментный каскад (на рис. 46, выделен красны*! цветом). В незрел ых ооцитах активность аденилатинклазы направлена на формирование и, возможно, поддержание профазного блока мейоза за счет ингибирования Cdc25 фосфатазы цАМФ-зависнмой протеинкииаэой (ПКА) ( Mcijer, Mordret, 1994; Kishimoto, 1998 Duckworth et al., 2002). При действии 1-MeA ар-белковая еубъедикнцз может прямо, нлн при участии актнно-спектрнновопо цнтоскелета, ннгнбировать аденилатцнклазу (Karascva et al., 1996; Ламаш, Елисейкнна, 2006), снижать внутриклеточную концентрацию цАМФ и ингибнровать цАМФ-зависнмую протеннкнназу (ПКА), Даже кратковременной отмены ннгнбнрующего влияния ПКЛ на Cdc25 фосфагазу достаточно, для смешения равновесия в сторону активирующего дефос формирования МИФ. Активный комплекс Cdc2'UUtTHH В через механизм «положительной обратной связи» при участии киназы Plkl ингибнрует Weel/Myll кнназу (Okano-Uchida et al., 2003),

Наличие механизма обратных связей позволяет регулировать активность циклим Б - cdkl комплекса подобно переключателю, как это происходит в бнетабнльных системах (Fenrell, 2002). Такая система существует в двух устойчивых состояниях и переход га одного в другое происходит в ответ на стимул определенной силы, тогда как незначительный стимул итерируется, Снижение уровня цАМФ. вызванное ингибированнем аленилатпнклазного каскада при действии гормона созревания, не достаточно для смешения равновесия в сторону формирования активного МИФ. Решающее значение для возобновления делений мейоза имеет стимуляция сигнальной цепочки, запускаемой через комплекс /$у-субъединиц G,-белка (на рис. 46 выделен зеленым цветом), Мы полагаем, что роль аденнлатцнклазы в снятии профазного блока мейоза заключается в устранении ингнбирутощего влияния Г1КА на фосфзтазу и, возможно, другие белковые субстраты

Принципы организации процесса снятия профазного блока мейоза у животных разных филогенетических групп имеют много общего. Во-первых, несмотря на разную химическую природу (амины у морских звезд и моллюсков; стероидные гормоны у позвоночных животных; особый белок у нематод), мейоз-индупирующне агенты действуют на уровне плазматической мембраны. Во-вторых, в процессе сигнализации, так или иначе, задействованы теротримерные С-беш. У амфибий и мышей инактивации О,-белка достаточно для снятия профазного блока мейоза, а у рыб, морских звезд и некоторых видов моллюсков О,-белох принимает участие в процессе индукции созревания. В-третьих, одни и те же вторичные мессенджеры -циклические нуклеотнлы, ноны кальция и продукты фосфоннознтольного обмена вовлечены в процесс возобновления делений мейоза. При действии гормона созревания активируется нескольких независимых сигнальных путей- Одни нз этих путей ведут непосредственно к формированию МИФ, а другие регулируют активность внутриклеточных ферментных систем, создающих условия для активации МИФ и обеспечивающих формирование структур, необходимых для благоприятного протекания более поздних событий, происходящих в период оплодотворения и раннего эмбриогенеза, Безусловно, все сигнальные механизмы находятся и тесном взаимодействии друг с другом. Эти взаимоотношения в сигнальной транедукцни требуют специального рассмотрения.

1 Gs-бежж 1 ы 1 AU : M 1 11АМФ J —> j TOA j

0,-CE

1-МгА 1-McA G.-ÍKJIL*

JVIKLnrUJ>

X. X пи;

Weei.'Myl

1

1 Ah РОД

Рис, 46 Схема I 'МеА индуцированного созревания ооцнтов морских звезд (подробности а тексте) Зеленым цветом отмечен нугь активирующий фактор согревания (МИФ), красным цветом выделен пуп. ннгибирующий активацию МИФ.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Ламаш, Нина Евгеньевна, Владивосток

1. Айзенштадт, TS. Цитология оогснеза t Т.Б. Айзенштадт. М.: Наука, I9&4. - 247 с.

2. Гинзбург, А С Блокирование полиспермии при оплодотворении кии осетровых рыб н роль кортикальных гранул в этом процессе I A.C. Гинзбург // Журн, Общ. Биологин. * i960. Т. 21. - С. 4 19-429

3. Гннзбург, A.C. Оплодотворение у рыб и проблема полиспермии / A.C. Гинзбург. М; Наука, 1968. - 358 с.

4. Гнезднлова, С М. Сезонные изменения половой железы Stronguipcenfrotus nudits / С.М. Гнезднлова // Биологические и медицинские исследования на Дальнем Востоке.- Владивосток: ДВНЦ АН СССР. 1971.-С. 118-121.

5. Дзюба, С.М. Особенности овогенеза глубоководного морского ежа Pourtuicsia fteptkneri i С.М. Дзюба // Биология моря. ■ 1978. № 6. - С. 7678.

6. Карасева, Е М. Роль циклических нуклеотнлов в регуляции созревания ооиитов голотурии, вызванном дитнотрейтолом / Е М. Карасева, М-А, Ващенко, П.М. Жаддн Н Онтогенез. 1995. - Т. 26, X? 3. - С, 248-253,

7. Касьянов, В.Л. Репродуктивная стратегия морских двустворчатых моллюсков и иглокожих / В.Л. Касьянов. J1.: Наука, 1989. - 179 с.

8. Размножение иглокожих и двустворчатых моллюсков / В.Л. Касьянов, Л, А Медведева, Ю.М- Яковлев, СЛ. Яковлев, М.: Наука, 1980. - 216 с,

9. Ламаш, Н Е. Идентификация и выделение ОТР-связывающего регуляторного белка из плазматических мембран ооиитов морской звезды Asterias aniurensis / Н.Е. Ламаш Н Изв. АН. Сер. Биол, 2001. - № \. - С. 121-124.

10. Ламаш, H.H. Исследование количественной динамики Г-актина при созревании ооинтов морской звезды Asterias amurensts / HJL Ламаш, М,Г, Елнсейкнна //Онтогенез, 2006, - Т. 37, №4, - С- 273-278.

11. Лзмаш, H.E, Перестройка актнно-спектрннового цитоскелета при созревании оошггов морской звезды t Н.Е, Ламаш, М.Г. Елисейкина // Биология моря, 2006. - № 2. - С. 134-138,

12. Ламаш, Н.Е, Регуляция активности аленилатинклазной системы ооинтов морской звезды Asterias amurensis t Н.Е, Ламаш, О.И. Шевцова // Биология моря. 1998. - Т. 24, № 6, - С, 388-393,

13. Миронов, А,А- Методы электронной микроскопии в биологии и медицине / A.A. Миронов, Я-Ю, Комнссарчик, В.А. Миронов. М.: Наука, 1994.-400 е.

14. Мотавкни, П.А, Гистофизиология нервной системы и регуляция размножения у двустворчатых моллюсков / П.А. Мотавкни, A.A. Ввракснн М.г Наука, 1983.-208 с.

15. Мотавкни, П.А. Пептидергнческая и моиоаминергнческая иннервация гонады голотурии Cucumariajaponica ! П.А. Мотавкни, Г.П. Воронова, Ю.С Хотнмченко // Арх. Анатомии, гистологии и эмбриологии. 1988. - Т. 44, № 3. - С. 78-85.

16. Ткачу к, В.А. Молекулярные механизмы сопряжения G-белков с мембранными рецепторами и системами вторичных посредников / В.А. Ткачук, А.Е. Авакян // Российский Фнзнол. Жури. 2003. - Т. 89, № t2. - С. 1478-1490.

17. Ткачук, В,А Выделение, очистка и характеристика рсгуляторных свойств аденнлатцнклазы сердца кролика / В,А, Ткачук, Г,Н. Бапденков П Биохимия. 1978. - № 43. - С, 1097-1110.

18. Хотимчеико, Ю-С Иннервация гонады иглокожих I Ю.С. Хотимчеико, НИ. Деридович, Г.Л- Воронова It Биология моря- - 1988, - № 3- - С. 51-58.

19. Хотимчеико, Ю.С, Биология размножения и регуляция гамстогенеэа и нереста у иглокожих S Ю.С. Хотимчеико, НИ. Деридович, П Л. Мотавкик. -М,: Наука, 1993. 167 с.

20. Чинь, X. Особенности оогенеза цыпленка / X Чинь, Е.Р. Гаги некая, ЕМ. Калинина//Онтогенез, -1979- Т. Ю--С, 340-349.

21. Adams, I.R, Sexually dimorphic development of mouse primordial germ cells: switching from oogenesis to spermatogenesis /I.R. Adams, A. McLaren // Development. -2002- V. 129. - P.ll55-1164,

22. Alberts, A ,S, Diaphanous-related Formi homology proteins / A-S. Alberts If Сшт. Biol. 2002. - V. 12. - P, 796-797.

23. Aliworth, A.E, Differential regulation of G protein subunit expression in mouse oocytes, eggs, and early embryos / A,E. Aliworth, J.D. Hildebrandt, C.A. Ziomek // Dev. Biol. 1990. - V. 142. - P. 129-137.

24. Andersen, CB. Protein kinase B/Akt induces resumption of meiosis In Xenopus oocytes / C B. Andersen, R.A. Roth., M. Conti It J. Biol, Chem. 1998. -V.273.-P. 18 705-18 708.

25. Atwood, D.G. Ultrastructure of the gonadal wall of the sea cucumber Lcptosynapta clarki (Echinodermata: Holtrthuroidea) / D.G. Atwood // Ztschr. Zel Iforsch. 1973.-B. 141.-S. 319-330.

26. Amounts and modulation of actin mRNAs in mouse oocytes and embryos I fL Bachvarova et al, H Development. 1989 - V. 106 . - P 561-565.

27. Baldwin, J.M. Structure and function of receptors coupled to G proteins / JM Baldwin//Curr.Opin. Cell Biol. 1994. - V. 6. - P. 180-190.

28. The classical progesterone receptor mediates Xenopus oocyte maturation through a nongenomic mechanism / M Bayaa et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V 97 - P. 12607-12612.

29. Berg, L,K. Cortical granul of the sea urchin translocate early in oocyte maturation / L.K. Berg, GM Wessel It Development. 3997, - V, 124. - P. 1845-1850,

30. Berry, S. Maternal messenger RNA-synthesis, and control of translation in lepidopteran oocytes / S. Berry, W, «.astern, M. Swinlchurst H Regul, Insect Reprod. II, Zinkovy. Abstr. Praga, 1978. - P. 2.

31. Bimbaumer, L. Receptor-to-effector signaling through G proteins: roles for beta gamma dimmers as well alpha subunits / L. Bimbaumer // Cell. 1992, - V. 71.-P. 1069-1072.

32. Progesterone receptor contains a praline-rieh motif that directly interacts with SH3 domains and activates c-Src family tyrosine kinases / V, Boonyaratankomkit et al, it MoL Celt. 2001, - V. 8. - P. 269-280,

33. Boyle, j.A. Sea urchin oocytes possess elaborate cortical arrays of microfilaments, microtubules, and intermediate filaments / J.A. Boyle, S.G. Ernst H Dev. Biol. 1989. - V. 134. - P. 72-84.

34. Browne, C.L. Oocyte-foliicle cell gup junctions in Xcrtopus laevis and the effects of gonadotropin on the permeability / C.L. Browne, H.S. Wiley, J. Dumont U Science. 1979, - V.203.- P. 182-183.

35. Byskov, A.G. Role of meiosis activating sterol, MAS, in induced oocyte maturation / A G. Byskov, C.Y. Andersen, L. Leonardscn // Mol. Celt Endocrinol. 2002. - V, 187. - P. 189-196.

36. Chemical structure of sterols that activate oocyte tnciosis / A-G.Byskov ct al. // Nature, 1995, - V, 374, - P. 559-562,

37. Cant ley, L.C. The phosphoinositide 3-kinase pathway / L.C, Cantley U Science. 2002 - V. 296, - P 1655-1657

38. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions arc required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meioik competence / MJ. Carabatsos « al. ii Dev. Biol, 2000, - V. 226. - P. 167-179.

39. Fractionation of the beta-subunit common to guanine nucleotidebinding regulatory proteins with the cytoskeleion / K.E. Carlson et al. // Mol. Pharmacol. 1986, -V. 30 - P. 463*468

40. Spatiotemporal dynamics of intracel lular Ca2+ osci llations the growth and meiotic maturation of mouse oocytes / J. Carrol l ct al. // Development, 1994. -V. 120.-P. 3507-3517,

41. Speedy/Ringo proteins! A. Cheng et al. )1 Cell Cycle.- 2005,- V. 4, P 155-165,

42. Chiba, K. Development of calcium release mechanisms during starfish oocyte maturation / K. Chiba, R.T. Kado. L.A. Jaffe it Dev. Biol. i 990. - V. 140.-P, 300-306.

43. A periodic network of G protein py subunit coexisting with cytokeratin filament in starfish oocytes / K- Chiba ct al. H J. Cell Biol. -1995. V. 169. - P. 415-420.

44. Role of cyclic nucleotide signaling in oocyte maturation / M. Conti et al. H Mol, Cell Endocrinol. 2002. - V. 187. - P. 153-159.

45. Dale, B. Oocyte activation in invertebrates and human / B, Dale // Zygote. -1994 -V.2.-P.373-377.

46. Davis. B.I. Electrophoresis in the separation of biological maeromolecules / B l. Davis U Ann. NY. Acad. Sei. 1964. - V. 121. - P.404.

47. Dekel, N. Regulation of oocyte maturation. Hoim. Contr, hypothalamo-pituitary-gonadal axis / N. Dckcl U Proceedings of i Annual Meeting of the international Foundation of Biochemical Endocrinology Rehovoi, 1984. New York. - P. 325-326.

48. Chromatin-mediatcd cortical granule redistribution is responsible for the formation of the cortical granule-free domainin mouse eggs / M. Deng et al. // Dev. Biol. 2003. - V. 257. - P, 166-176.

49. Protein kinase C-dcpendcnt and independent activation of Na+/H+ exchanger by G alpha 12 class of G proteins / N, Dhanasekaran et al. U J. Biol. Chem, - 1994, - V. 269. - P, 11 802-11 806.

50. Dibrov, P. Comparative molecular analysis of Na+ZH+excbangers: a unified model for Na+/H+ antiport? / P. Dibrov, L. Flieget ft FEBS Lett 1998. - V. 424.-P. 1-5.

51. Guidance of primordial germ cell migration by the chcmokinc SDF-1 ! M, Doiisidou et al, //Cell, 2002, - V. 111. - P. 647-659.

52. Dorec, M. Site of action of 1 -methyl adenine in inducing oocyte maturation in starfish / M Doree, P. Guerrier // Exp. Cell Res. 1975. - V. 96. - P. 296-300.

53. Doree, M. Hormonal control of meiosis. In vitro induced release of calcium ions from the plasma membrane in starfish oocytes / M. Doree, M Moreau, P. Guerrier // Exp. Cell Res. 1978. - V. 115. - P. 251-260.

54. Downs, S.M The influence of glucose, cumulus cell, and metabolic coupling on ATP levels and meiotic control in the isolated mouse oocyte /S.M, Dovwt&lf Dev. Biol. 1995. - V. 167. - P. 502-512.

55. Downs, S.M. Modulation of meiotic arrest in mouse oocytes by guanyl nucleotides and modifiers of G-proteins / S.M. Downs, R, Buccione, J.J. Eppig //J, Exp, Zool. 1992. - V, 262. - P 391-404.

56. Downs, S.M. Protein kinase C and meiotic regulation in isolated mouse oocytes / S.M. Downs, J. Cottom, M- Hunzicker-Dunn H Mol. Reprad. Dev. -2001-V. 58.-P. 101-115,

57. Dunphy, W.G. The decision 10 enter mitosis / W.G. Dunphy it Trends in Cell Biol. * 1994. V. 4. ■ P. 202-207.

58. Mos is not required for the initiation of meiotic maturation in Xenopus oocytes / A. Dupre ct al. // Embo J. 2002. - V. 21. ■ P. 4026-4036.

59. Dworkin, M B. Functions of materna! mRNA in early development / M.B. Dworkin, E. Dworkin-Rastl it Mol. Reprod. Develop, ■ 1990. V. 26. ■ P. 261297,

60. Dworkin-Rastl, E. Multiple ubiquitin mRNAs during Xenopus laevis development contain tandem repeats of 75 amino acid coding sequence / E. Dworkin-Rastl, A. Shrotkowski, M.B. Dworkin //Cell. 1984 - V- 39. - P. 321325.

61. Eisen, A. Calcium transients during early development in single starfish (Asterias forbosi) oocytes / A. Eisen, G.T. Reynolds // J. Cell Biol- -1984. V. 99 -P 1878-1882.

62. Eppig, J-J. Mammalian oocyte growth and development in vitro / J,J. Eppigr M, O'Brien, K. Wigglcsworth // Mol. Reprod. Dev. 1996. - V. 44 - P. 260-273.

63. Eppig, J J. The mammalian oocyte orchestrates the rate of ovarian follicular development / J.J. Eppig, K. Wi&glesworth, F.L. Péndola // Proc, Natl. Acad. Sei. USA. 2002. - V. 99. - P. 2890-2894.

64. A novel p34(edc2)-binding and activating protein that is necessary and sufficient to trigger G(2)/M progression in Xenopus oocytes / L Ferby et al. U Genes Dev. 1999. - V. 13 - P. 2177-2189.

65. Ferrell, j.E,, Jr. Xenopus oocyte maturation: new lessons from a good egg / J.E. Ferrell, Jr. // Bioessays. 1999. - V. 21. - P. 833-842,

66. Ferrell, J.E., Jr. Self-perpetuating states in signal transduction: positive feedback, double-negative feedback and b¡stability / J.E. Ferrell, Jr. it Curr Opin, Cell Biol 2002. - V. 14. - p. 140-8.

67. Regulation and characterization of the Na+/l-l+exchangcr IL. Flicgel ct al. // Biochem, Cell. Bio., 1998. - V. 76. - P. 735-741.

68. Fortune, J.tf, Production of androgen and estradiol-17bcta by Xenopus ovarian treated with gonadotropins in vitro / J.E. Fortune, P.C. Tsang // Gen. Comp. Endocrinol. 1981. - V. 43. - P. 234-242.

69. Xenopus homolog of mos protooncogene transforms mammalian fibroblasts and induces maturation of Xenopus oocytes f R.S. Freeman ct al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 5805-5809.

70. Galas, S. A nuclear factor required for specific translation of cyclin B may control the liming of first meiotic cleavage in starfish oocytes / S. Galas, D.M Barakat, A- Picard // Mol. Biol. Cell. 1993. - V 4 - P. 1295-1306,

71. Stimulation of Xenopus oocyte maturation by inhibition of the G-pntein as subunit, a component of the plasma membrane and yolk platelet membranes / C.J. Gallo el al. Uh Cell Biol. -1995 V. 130. - P 275-284.

72. Does the guanine nucleotide regulator)' protein Ni mediate progesterone inhibition of Xenopus oocyte adenylate cyclase? / M. Goodhardt ct aJ. // Embo J. 1984. - V. 3. - P. 2653-2657,

73. Grainger, J.L. Transient synthesis of a specific set of protein during the rapid c leavage phase of sea urchin development / J.L. Grainger, A ,von Brunn, M.M. Winkler H Dev. Biol- 1986 - V, 114,-P 403-415.

74. Greenbcrg, C.S, Rapid single-step membrane protein assay / C,S. Greenberg, PR.GaddockHClin Chem. 1982, - V. 28.N7.-P. 725-726.

75. Greengard, P, Pbosphorylated proteins as physiological effectors / P. Greengard // Science. 1978, - V, (99, - P, 146-152,

76. Physiology of mciosis-acUvaimg sterol; endogenous formation and mode of action t C Grondahl ei al. II Hum. Reprod. 2003. - V. 18. - P. 122-129.

77. Mciosis-activaiing stcroi-mediated resumption of meiosis i n mouse oocytes in vitro is influenced by protein synthesis inhibition and cholera toxin / C. Grondahl et al. H Biol. Reprod, 2000, - V. 62, - P. 775-780.

78. Gudermann, T. Diversity and selectivity of rescptor-G protein interaction / T. Gudermann, F. Kalkbrenner, G, Schultz // Annu Rev Pharmacol Toxicol. -1996, V. 36. - P. 429-459.

79. Reception and transduction of the serotonin signal responsible for oocyte meiosis reinitiation in bivalves / P. Guerrier ct al. /1 Invert Reprod. Develop. -1996 -V,30,-P. 39-45.

80. A Gbctagamma stimulated adcnylyl cyclase is involved in Xenopus laevis oocyte maturation / L Guzman et al. tt Cell Physiol 2005. - V, 202, - P. 223229.

81. Induction of Xenopus oocyt meiotic maturation by MAP kinase / O. Haccard et al. U Dev. Biol. 1995. - V. 168. - P. 677-682,

82. Hake. L.E. CPEB is a specificity factor that mediates cytoplasmic polyadenylation during Xenopus oocyte maturation / L.E, Hake, J.D. Richter // Cell, 1997. - V. 79. - P, 617-627,

83. Han, J.K. Reducing PIP2 hydrolysis, Ins(1,4,5)P3 receptor availability, or caScium gradients pTOgestercme-stimulated Xenopus oocyte maturation I J.K, Han. S.K. Lee H Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. - V, 217. - P. 931939.

84. Hanounc, J, Regulation and role of adcnylyl cyclase isoforms / J. Hanoune, N. Defer U Annu. Rev, Pharmacol- Toxicol. 2001. - V. 41. - P. 145-174,

85. Hashimoto, N. Induction and inhibition of me'totk maturation in follicle-inclosed mouse oocytes by forskolin / N, Hashimoto, T. Kishimoto, Y. Nagahama // Dev. Growth. DifF. 1985. - V, 27. - P. 709-716.

86. Activation of meiotic maturation in rat oocytes after treatment with follicular fluid meiosis-activating sterol in vitro and ex vivo / C. Hegete-Hartung et al. It Biol. Reprod. 2001. - V. 64. - P. 418-424,

87. Heil-Chapdelainc, R.A. Characterization of changes in F-actin during maturation of starfish oocytes / R.A. Heil-Chapdelainc, J J. Otto // Dev. Biol. -1996,-V. 177. P. 204-216.

88. Differentiation of a calscquestrin-containing endoplasmic reticulum diring sea urchin oogenesis / J.H, Henson et at. // Dev. Biot. 1990, - V. 142. - P, 255269.

89. New B-type cyclin synthesis is required between meiosis I and El during Xenopus oocyte maturation / H. Hocheggeret al. I I Development, 2001. - V. 128.-P. 3795-3807.

90. Ul. Holland, N .D. The fine structure of the ovary of the feather star, S'emastcr rubiginosa / N.D. Holland //Tissue Cell. 1971 - V. 3 - P 161-175.

91. Holland. N,D, Gonadal development during the annual reproductive cycle of Comanfhus japonica (Echinodcrmata' Crirvoidea} / N.D. Holland, J,C, Grimmer, H. Kuboto// Ibid. 1975, - V. 148. - P. 219-242.

92. Holland, N.D Fluctuations in the volume of non-germinal cell populations during the annual reproductive cycle of Comanthus japonica (Echinodermata.

93. Crínoidea) / N.D. Holland. H. Kubola ti Annot. Zool. Jap 1975. - V. 48. ■ P 83-89.

94. Hunt, T. The requirements for protein synthesis and degradation, and the control of destruction of cuclins A and B in the meiotic and mtiolic cycles of the clam embryo/ T. Hunt, F.C- Luca, J.V Ruderman // J. Cell Biol- 1992. - V.116,-P. 707-724.

95. Hyman, L-E. Translation inactivation of ribosomal protein mRNAs during Xenopus oocyte maturation / L.E. Hyman, W M, Wormington // Genes, Dev. -1988.-V. 2. -P. 598-605.

96. Ishikawa, K. Induction and inhidition of amphibian (Rara pipiens) oocyte maturation by protease inhibitor (TPCK) < IC. Ishikawa, A. W. Schuetz, S-K. Francisco // Gamete Res 1989 - V. 22. - P 339-354.

97. Molecular characterization of the starfi sh inositol 1,4,5-trisphosphate receptor and its role during oocyte maturation and fértil ization / H- Jwasaki et al. II}. Biol. Chem, 2002. - V. 277. - P. 2763-2772.

98. Jacobowitz, O Pliorbol ester-induced stimulation and hospliorylation of adenylyl cyclase 2 /O. Jacobowitz, R, Iyengar // Proc Natl Acad Sci USA. -1994 V. 91. -P. 10 630-10 634.

99. JalTe, L.A. Oocyte maturationin starfish is mediated by the Jiy-subunit complex of a G protein i L.A, Jaffe, C.J-Gallo, R.H Lee // J, Cell Biol, -1993- -V. 121.-P. 755-783.

100. Jaffe, L.A. Structural changes in the endoplasmic reticulum of starfish oocvyte during meiotic maturation and fertilization ¡ L.A. Jaffe, M. Tcrasaki // Dev. Biol, -1994 V 164. - P, 579-587,

101. Evolution of predetermined germ cells in vertebrate embryos: implications for macroevolution t A.D. Johnson et al. // Evol. Dev. 2003. - V, 5. - P. 414431.

102. A volatile inhibitor immobilizes sea urchin sperm in semen by depressing the intracellular pH /GH. Johnson et al. // Dev Biol 1983. - V, 98 - P. 493501.

103. Kanatani, H. Hormones in Echinoderms / H, Kanatani // Hormones and evolution. NY.: Acad. Press. 1979. - V I, - P. 273-308,

104. Kanatani, H. Induction of spawning and oocyte maturation by I-methyladenine in starfish / H Kanatani U Exp. Cell Res, 1969. - V- 57. - P 333-337.

105. Kanatani, H. Oocyte growth and maturation in starfish / H. Kanatani // "Biology of Fertilization" (C.B. Mclz, Monroy A„ Ed.). Orlando; Academic Press, 1985 -V, l.-P. 119-140.

106. Kanatani, H. Site of action of 1 -methy ¡adenine in inducing oocyte maturation in starfish / H. Kanatani, Y. Hiramoto // Exp. Cell Res. -1970, V. 96.-P. 296-300.

107. Kanatani, H. Chemical structural requirements for induction of oocyte maturation and spawning in starfishes / H, Kanatani, H. Shirai // Dev. Growth Differ -1971.-V. 13.-P. 53-64.

108. Kanatani, H. In vitro production of meiosis inducing substance by nerve extract in overy of starfish / H. Kanatani. H. Shirai // Mature. 1967. - V. 216. -P 284-286,

109. Kanatani, H. Isolation and identification of meiosis substance in starfish Astoria* amuremis / H- Kanatani, H. Shirai, K- Nakanishi. T. Kurokawa if Nature, 1969. - V. 221. - P. 273-274.

110. Karaseva, E,M- l-Meihyladenine inhibits adenylate cyclase ill starfish oocytes! E M. Kar&seva, N-E- Lamash, Yu.S- Khotimchenko // Invert, Reprod. Develop, 1996. - V, 30. - P. 153-158.

111. Kehlenbach, R,H. XL alpha s is a new type of G protein / R.H Kehlenbach. J, Matthey, W.B. Huttner // Nature. ■ 1994. V. 372. - P, 804-809.

112. Kikuyama, M. Change in intracellular calcium ions upon maturation in starfish oocytes IM. Kikuyama, Y. Hiramoto // Develop. Growth. Differ. -1991 -V.33.-P.633-638.

113. The distribution and requirements ot' microtubules and microfilaments in bovine oocytes during in vitro maturation / N.H. Kim et al, // Zygote. 2000. -V. 8. - P. 25-32.

114. King, R.C- The ccll cycle and cell differentiation in the Prosophila ovary / R.C. King a Results and problems in cell difleremiauon. 1975 - V, 7. - P. 85109

115. Kishimoto, T. Activation of MPF at meiosis reinitiation in starfish oocytes ( T, Kishimoto // Dev. Biol 1999. - V. 214, - P. I-8.

116. Selectivity in signal transduction determined by gamma subunits of hetcrotrimeric G proteins / C Klcuss et al. // Science. 1993. - V. 259. - P. 832834,

117. Knaul, H A zebrafich homologue of the chemokine receptor Cxcr4 is a germ-cell guidance receptor / H. Knaul, C- Wer®, R. Geisler, C, Nusslein-Volhard//Nature -2003,-V.421,-P.279-282.

118. Krantic, S. Meiosis reinitiation in molluscan oocytes: a model to stady the transduction of extracellular signals / S. Krantic, P. Rivailler // Invert. Reprod. Develop. 1996 - V, 30. - P. 55-69.

119. Kuwabara, P.E. The multifaected C. elegans major sperm prolein: an ephrin signaling antagonist in oocyte maturation / P.E. Kuwabara // Gen. Dev. 2003, -V. 17.-P. 155-161.

120. MPF from starfish oocytes at first meiotic metaphase is a heterodimer containing one molecule of cdc2 and one molecule of cyclin B / J.C. Labbe et al. U Embo J. 1989. - V. 8. - P. 3053-3058.

121. LaFleur, G.J. Sea urchin ovoperoxidase: oocyte-specific member of a heme-dependent peroxidase superfamity that functions in the block to polyspermy /

122. G J. LaFleur, Jr., Y. Horiuchs, G M. Wesse! II Mcch. Dev. !99«. -V. 70, - P. 77-89.

123. The N terminus domain of type VI adenylyt cyclase mediates its inhibition by protein kinase / H.L. Lai et al, // C. Mol, Pharmacol -1999. V. 56. - P. 644-650.

124. Laidlaw, M, Cortical granule biogenesis is active throughout oogenesis in the sea urchins / M. Laidlaw, G.M. Wessel // Development. -1994. V, 120. - P. 1325-1333.

125. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during of the head of bacteriophage T4/ U.K, Laemmli// Nature.-1970- V. 227.- N 5259.- P. 680.

126. The human thyrotropin rcccptor: a hcptahelical receptor capablc of stimulating members of all four G protein families. /K.t. Laugwfatet al. H Proc, Nat, Acad. Sei. USA. 1996. - V. 93. - P. 116-120.

127. Formin-2, polyploidy, hypofertil ity and position i ng of the meiotic spindle in mouse oocytes /B. Leader et al. // Nat. Cell Biol- 2002. -V. 4. - P. 921-928.

128. Lee, S.J. Prolein kinase C-rclated kinase 2 phosphorylates the protein synthesis initiation factor eIF4E in starfish oocytes l S J. Lee, G. Stupleton, J.H, Greene, M B. Hille H Dev. Biol. 2000 - V. 228. - P 166-180.

129. Speedy: a novel cell cycle regulator or the G2/M transition / J.L. Lenormand el al, // Embo J. 1999. - V. 18.-P. 1869-1877.

130. Lew, D.J. Formin'acnn filament bundles / DJ. Lew // Nat. Cell Biol. 2002. - V, 4. - P. 29-30,

131. Lichtarge, O. Evolutionary conserved G- alphabctagamma binding surfaces support a model of the proicin-rccepior complex / O. Lichiargc, H.R- Bourne, F.E. Cohen // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 19%. - V. 93. - P- 7507-7511.

132. Lippincott-Schwartjt, J. Cell biology: ripping up the nuclear envelope / J, Lippincolt-Schwaitz // Nature. 2002. - V. 416. - P. 31-32,

133. Lohka, M J. Purification of maturation-promoting factor, an intracellular regulator of early mitotic events / M J. Lohka, MR. Hayes, J.L, Mailer // Proc. Nail, Acad. Sei USA. 1988. - V, 85. - P. 3009-3013.

134. Protein measurement with ihc Folin phenol reageni / O.H- Lowry et aL // J, Biol. Chem. 195L - V. 193 - P. 265-275.

135. Selective modul ation of genom i c and nongenomic androgen responses by androgen receptor ligands / L.B. Lutz el al, U Mol. Endocrinol 2003. - V, 17, N6.-P. 1106-1116.

136. Mabuchi, J.A. Spudich ft J. Biochem -1980.- V. 87.- P 785-802.

137. Maller, J.L. Interaction of steroids with cyclic nucleotide system in amphibian oocyte /J.L. Mailer// Adv. Cyclic. Nucleotide Res. -1983. V, 15.-P. 295-336.

138. Malier, J.L. MPF and cell cycle control / J.L. Mailer // Adv. Second Messenger Phosphoprotein Res. 1990. - V. 24. - P, 323-328.

139. Mailer, J.L. Regulation of amphibian oocyte maturation / J.L. Malter // Cell Differ 1985. - V. 16. - P. 211-220,

140. Mailer. J.L. The elusive progesterone receptor in Xenopus oocytes i J.L, Malier // Prac Natt. Acad. Sei. USA. 2001. - V. 98. - P. 8-10.

141. Maro, 8. Polar body formation: new rules for asymmetric divisions / B. Maro, M H. Verihac // Nat. Cell Biol. 2O02. - V 4, - P. 281-283.

142. Mani ndale, M.Q, Translaiional changcs induced by I -mcthyladcninc in enucleate starfish oocytes / M.Q. Martindale, B.P- Brandhorst // Dev. Biol. -1984.-V. 101,-P. 512-515.

143. Masuda, R. Studies on the annual reproductive cycle of the sea urchin and the acid phosphatase activity of relictova / R. Masuda, J.C. Dan // Biol. Bull. -1977. -V. 153- P. 557-590.

144. Masut, Y. Oocyte maturation / Y. Masut, HJ, Clarke // Int, Rev, Cytol. -1979.-V.57.-P. 185-282.

145. Matova, N. Comparative aspects of animal oogenesis / N. Matova, L. Cooley // Dev. Biol. 2001. - V. 231 - P 291-320.

146. Matzuk. M.M. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation / M.M. Matzuk. K.H. Burns, M.M. Viveiros, J.J. Eppig H Science, 2002. - V. 296, - P, 2178-2180,

147. McLaren. A Primordial germ cells in mouse / A, McLaren // Dev. Biol. -2003. V. 262, - P 1-15.

148. McLaren, A, How is the mouse germ-cell lineage established? / A. McLaren, K-A. Lawson I I Different 2005. - V. 73, № 9-10,-P. 435-437.

149. Mehlmann, L.M. Meiotic arrest in the mouse follicle maintained by a Gs protein in the oocyte / L.M, Mehlmann. T.L. Jones, L.A. Jaffe // Science. 2002. - V. 297.-P. 1343-1345.

150. Reorganization of the endoplasmic reticulum during mciolic maturation of the mouse oocyte / L.M. Mehlmann, M- Terasaki, L.A. JalTc, D. Kline H Dev. Biol. 1995. - V. 170. - P. 607-615.

151. Starfish oocyte maturation: evidence for a cyclic AMP-dcpendent inhibtWMy pathway / L. Meijcr el at. ft Dev. Biol. 1989. - V. 133. - P. 58-66.

152. Meijer, L. Mordret G. Starfish oocyte maturation: from prophase to metaphase / L. Meijer, G. Mordret //Dev. Biol. 994. - V. 5. - P. 365-171.

153. Meijer, L. Starfgish oocyte maturation: 1-methyladenine triggers a drop of cAMP concentration related lo the hormone-dependent period / L. Meijer, P. Zaruiskie // Dev. Biol. 1987. - V. 121. - P. 306-315.

154. Meijer, L. Maturation and fertilization in Starfish oocytes / L Meijer, P-Guerrier// fin, Rev. Cytol. -1984. -V. 86. P. 129-195.

155. A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation / M. A. Miller ei at-// Science. 2001, - V. 291. - P. 2 ¡44-2147.

156. An Eph reccptor sperm-sensing control mechanism for oocyte meiotic maturation in Caenorhabditis elegans / M.A. Miller ct al. // Genes Dev. 2003, -V. 17. - P. 187-200.

157. Mita, M. 1 -Metbyladeninc production by ovarian follicle cells responsible for spawning in the starfish Asterina pectinifera / M. Mila // Invert Rep. Dev. -1993. V.24, №3. - P. 237-242.

158. Mita, M. Mcthylation during 1 -methyladcmnc production by starfish ovarian follicle cells / M Mita II Comp, Biochem, Physiol. 1991. - V. 99B - P. 459462,

159. Mita, M. 1 nil uence of gonad-stimulating substance on ovarian 1meihyladen ine levels responsible for germinal vesicle breakdown and spawningin the starfish Asterina pectinifera /M. Mita, M. Nakamura/7 J. Exp. Zoo., -1994. Ki 269. - P, 140-145.

160. Changes in the levels of adenine-related compounds in starfish ovarian follicle cells following treatment with gonad-stimutating substance / M. Mita, 1. Yasumasu., Y. Nagahama, M. Sancyoshi // Dev. Growth. Differ. 1996a. - V, 38.-P. 413-418.

161. Mita, M. 1-Methyladeninc production from ATP by starfish ovarian follicle cells/ M. Mita, M, Yoshikuni, Y, Nagahama .//Biochem, Biophys. Acta. -1999 -V. 1428,-P, 13-20.

162. Interaction of N3 -substituted adenines with 1 -methyladenine receptors of starfish oocytes in induction of maturation / M, Mita et at. U Comp. Biochem. Physiol. Pan B. 2001. - N130. - P.427-434.

163. Miyazaki, S. Fast polyspermy block and activation potential. Electrophysiological bases for thetr changes during oocyte maturation of a starfish / S. Miyazaki // Dev. Biol 1979. - V.70. - P. 341-354.

164. Moor, R.M. Protein requirement for germinal vesicle breakdown in ovine oocytes / R,M, Moor, l.M. Crosby /1 J. Embryol. Exp, Morphol. 1986. - V. 94. - P. 207-220.

165. Homione-i riduced release of intracellul ar calsium triggers metosis in strafish oocytes / M Moreau, P Guerrier, M. Doree, C.C. Ashley // Nature. 1978. - V. 272. - P. 251-253.

166. Morgan, D.Q. Cyclin-depcndent kinases: engines, clocks, and microprocessors / D.O. Morgan // Annu. Rev. Cell Dev. Biol, 1997. - V. 13. -P. 261-291.

167. Morila, Y. Oocyte apoptosis; like sand through an hourglass / Y Morita, J.L. Tilly U Dev. BioL 1999. - V- 213- -P. 1-17.

168. Regulation of oocyte maturation in Fish / Y. Nagahama, M. Yoshikuni. M, Yamoshita. M. Tanaka// Molecular endocrinology of fish (N-M. Sherwood and H. C.L., Eds ). San Diego: Academic Press. - 1994. - V. XIII. - P. 393-439.

169. Is cAMP decrease essential for resumption of meiosis in mouse oocytes? I E, Nagyova, J. Kalous, P. Sutovsky, J. Motlik//Reprod. Nutr. Dev. -1993. V 33. -P. 419-428.

170. Ncavcs, W В. IntcrccHular bridges between follicle cells and oocyte in the lizard, Anolis carolinensis / W,B, Ncaves // Anat, Rec. 1979. - V. 170, - P. 281301.

171. Nemoto, SI. Nature of the 1 -methiladeninc-requiring phase in maturation of starfish oocytes / S.L Nemoto /I Dev. Growth Differ. 1982. - V. 24. - P. 429442.

172. Nemoto, S.I. Changes in the cGMP levels on meiosis reinitiation of starfish oocytes / S.I. Nemoto, K, Ishida // Exp. Cell Res -1983 V 145. - P. 226-230.

173. Nigg, E.A, Cycl in-dependent protein kinases: key regulators of the eukaryotic cell cycle / E.A. Nigg// Bioessays, 1995. - V, 17, - P. 471-480,

174. Nigg, E-A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints / E,A. Nigg И Nar. Rev. Mol. Cell Biol. 2001. - V. 2. - P 21-32.

175. Noh, S J. Inhibition of the adenylate cyclase and activation of the phosphatidyl inositol pathway in oocytes through expression of scrotonine receptors does not induced oocyte maturation / SJ, Noh, J.K. Han // j, Exp, Zool. 1998. - V. 280 - P. 45-56.

176. Nurnberg, B. Receptors and G proteins as primary components of transmembrane signal transduction. Part 2. G proteins: structure and function / B, Nurnberg, T. Gudermann, G. Schuliz //J- Mai Med 1995. - V. 73. - P. 123132.

177. Micrionjection of aniiscnsc c-moc oligonucleotides prevents meiosis II in the matunng mouse egg / S.J, O'Kccfe, H, Wolfes, A.A. Kiessling, G.M-Cooper// Proc. Natl. Acad, Sei. USA. 1989. - V, 86. - P. 7038-7042.

178. G proteins of the GI2 family are activated via thromboxane A2 and thrombin receptors in human platelets / S. Ofiermanns, K.I. Laugwitz, K Spicher, G, Schultz // Proc, Nat, Acad, Sci, USA. 1996. - V. 91. - P. 504-508.

179. Akt inhibits Mytl in the signaling pathway that leads to meiotic G2/M-phase transition/E. Okumura etal.//Natl. Cell Biol, 2002.-V.4.-P. 111-116,

180. Developmental expression of D-gatactoside-binding lectin in sea urchin (Anthocidariscrasslspina) eggs / Y. Ozeki et al. // Exp. Cell Res. 1995. - V. 216. P. 318-324.

181. Nuclear actin filaments and their topological changes in frog oocytes / V.N. Parfenov et al. // Exp. Cell Res. 1995. - V, 217. - P.385-394.

182. Catcium/calmodulin-depcndenC phosphorylation and activation of human Cdcd25-C at the G2/M phase transition in HeLa cells / R. Patet et al, // J. Biol, Chcm. -1999. V. 274. - P. 7958-7968.

183. Molecular biological approaches to unravel adenylylcyclase signaling and function / T.B. Patcl et al, // Gene. 2001. - V. 269. - P. 13-25.

184. Patent, D. H, Gonadal histology of the basket star, Gorgonocephatus eucnemis i D,H. Patent //Thalassia Jugosl, 976. - V 12. - P, 269-276.

185. Patrick, T,D, Preparation and characterization of eel l-free protein synthesis systems from oocytes and eggs of Xenopus laevis / T.D, Patrick, C.E, Lewer, V.M. Pain ff Development 1989. - V. 106. - P. 1-9.

186. Patrizio, M. Opposite regulation of adcnylyl cyclase by protein kinase C in astrocyte and microglia cultures / M, Patrizio, N, Slepko, G. Levi //J Ncurochcm. 1997, - V. 69. - P. 1267-1277.

187. Paynton, B.V. Polyadcnylation and deadcnylation of maternal mRNAs during oocyte growth and maturation in the mouse / B.V. Paynton, R. Bachvarova // Mol. Reprod- Dev. 1994. - V. 37. - P. 172-180.

188. Pines. J. Four-dimensional control of the cell cycle / J. Pines II Nat. Cell Biol.- 1999.- V. I.-P. 73-79.

189. Down-regulation of membrane granulose cell gap junction is correlated with irreversible commitment to resume meiosis in golden Syrian hamster oocytes / C. Racowsky et at, // Eur. J, Celt Biot. 1989. - V, 49. - P. 244-251.

190. Rando, OJ. Searching for a function for nuclear actin / OJ. Rando, K, Zhao, G.R. Crabtrce // Trends Cell Biol, 2000. - V. 10. - P. 92-97,

191. Raz, E, Primordial germ cell development in zebrafish / E. Rax // Semin. Celt Dev. Biol 2002, - V. 13. - P 489-495.

192. Richter, J.D. Reversible inhibition of translation by Xenopm oocytc-specific proteins / J.D. Richter, L.D. Smith if Nature, -1984. V. 309. - P. 378-380.

193. GiU levels regulate Xenopos lacvis oocyte maturation / X. Romo, M.V.1.linnchs, L. Guzman, J. Olate // Mol. Reprod. Dev. 2002. - V. 63- - P 104109.

194. Rosenthal, E. Translationally mediated changes in patterns of protein synthesis during maturation of starfish oocytes ) E. Rosenthal, BP. Brandhorst. J.V Ruderman // Dev. Biol. 1982. - V- 91. - P 215-220.

195. Rosenthal, E. Selective translation of mRNA controls the pattern of synthesis during early development of the surf clam. Spi.su la solidissima / E. Rosenthal, T. Hunt, J.V, Ruderman U Cell. 1980. - V. 20. - P 487-496.

196. Rosenthal, E. Scquence-specific adenylation and deadenylations accompany changes in the translation of maternal messenger RNA after fertilisation of Spisula oocytes ! E. Rosenthal, T, Tansey. J.V, Ruderman Hi, Mol. Biol. 1983. -V, 166-P. 309-327.

197. Sterols afTecting meiosis: novel chemical synheses and the biological activity and spectral properties of the synthetic sterols / B. Ruan et al H L. Lipid Res. 1998. - V. 39. - P 2005-2020.

198. Rvabova, L.V. Influence of cytochalasin B on oocyte maturation in Xenopus laevis ! L.V. Ryabova, M.I. Bctina, S.G- Vassetzky H Cell Differ. 1986. - V. 19. - P. 89-96.

199. Sadler, K.S. Components of the signaling Pathway Linking the 1 -methyladenine receptor to MPF activation and maturation in starfish oocytes ! K-S. Sadler, J.V Rudennan // Dev. Biol. -1998. V. 197, - P. 25-38.

200. Function of c-mos proto-oncogene product in mciolic maturation in Xenopus oocytes / N. Sagata el a!, it Nature. 1988. - V. 335. - P. 519-525.

201. Saitou, M. A molecular programme for the specification of germ cell fate in mice / M. Saitou. S.C. Barton, M.A. Surani 11 Nature. 2002. - V.4I8. - P. 293300.

202. Separate activation of the cytoplasmic and nuclear calcium pools in maturing starfish oocytes > L, Santella,, L. DeRjso, G, GragnanieHo, K. Kyozuka // Biochem Biophys. Res. Commun. 1998a, - V. 252. - P 1-4.

203. Calcium, protease action, and the regulation of the cell cycle / L. Santella, K, Kyozuka, L. De Riso, E. Carafoli II Cell Calcium. 199Bb. - V. 23. - P. 123-130.

204. Nicotinic acid adenine d¡nucleotide phosphate-induced Ca(2+) release. Interactions among distinct Ca(2+) mobilizing mechanisms in starfish oocytes / L Santelia el al l! 1. Biol, Chem. 2000a, - V. 275. - P 8301-8306.

205. Breakdown of cytoskeletal proteins during meiosis of starfish oocytes and proteolysis induced by catpain / L, Saniella et al. // Exp. Cell Res. 2000b. -V.259, - P. 117-126.

206. Santelia, L. Association of calmodulin with nuclear structures in starfish oocytes and its role in the resumption of meiosis / L. Santelia. K. Kyozuka It Eur- J. Biochcm 1997. - V. 246. - P. 602-610.

207. Santelia, L. Reinitiation of meiosis in starfish oocytes requires an increase in nuclear Ca2" /1. Santelia. K, Kyozuka U Biochem. Biophys. Res. Commun. -1994 -V. 203 P. 674-680.

208. Schatten, G. The ccntrosome and its mode of inheritance: the reduction of the ccntrosome during gametogenesis and its restoration during fertilization / G Schatten // Dev Biol. 1994 - V. 165. - P. 299-335.

209. Schauen. G Cyioskeletal alterations and nuclear architectural changes during mammal ¡an fertilization / G. Schatten. H- Schatten H Curr, Top- Dev. Biol. -1987, V. 23. - P. 23-54.

210. Schoenmakers, H J.N. The variation of 3(S-hydroxysterotd dehydrogenase activity of the ovarias and pyloric caeca of the starfish Asterias rubens during the annua) reproduction cycle I H.J.N. Schoenmakers ft i. Comp. Physiol. -1980.-V, ¡38. P. 27-30.

211. Schroeder, T-E. Snoods: a periodic network containing cytokeratin in the cortex of starfish oocytes I Т.Е. Schroeder, J.J. Otto (I Devel. Biol, -1991. V, 144. - P. 240-247.

212. Schnieder, Т.Е. Morphological changes during maturation of starfish oocytes: surface ultrastructure and cortical actin / Т.Е. Schroetter. S.A. Strieker H Dev. Biol. -1983. V. 98(2). - P. 373-384.

213. Schuetz, A, W. Extrafollicular mediation of oocyte maturation by radial nerve factor in starfish Pisas ¡er ochraceus / A.W. Schuetz// Zygote, 2000. - V, 8. - P. 359-368.

214. Schultz, R.M, Molecular basis of mammalian egg activation / R.M. Schultz, G,S. Kopf // Cuit. Top. Dcv Biol. 1995. - V. 30. - P. 21-62.

215. Scydoux. G. The germline in С elegans: origins, prolifeiation, and silencing / G. Scydoux, T, Schedl tf Int. Rev. Cytol. 2001. - V, 203. - P. 139-185.

216. The 3'-untranslated regions of c-mos and cyclin mRNAs stimulate translation by regulating cytoplasmic polyadenylation / MIX Sheets et а. И Genes Dev. 1994. - V. 8. - P, 926-938.

217. Sheets, M.D. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation / M.D. Sheets, M. Wu. M. Wickens И Nature. -1995.-V. 374,-P. 511-516.

218. A chromatin remodeling complex involved in transcription and DNA processing / X. Shen. G. Mi2uguchi, A. Hamiche, C. Wu // Nature. 2000. - V. 406. - P. 541-544.

219. Regulation of Xenopus oocyte meiosis arrest by G protein ßy subunits / Y. Sheng ct al. // Curt. Biol. 2001. - V, 11. - P. 405-411.

220. Shilling, F. Pertussis toxin inhibits I -methyladenine-induced maturation in starfish oocytes / F. Shilling, K. Chiba, M. Hoshi // Dev. Biol. 1989. - V. 133. -P. 605-608.

221. Smiley, S. A review of echinoderm oogenesis / S. Smiley // J. Electron, Microsc. Tech, 1990. - V. 16. - P. 93-114

222. Smiley, S. Ovulation and Elte fine structure of the Stichopus catifornicus (Echinodermata: Holoiithurotdea) fecund ovarian tubules / S. Smiley, R.A. Clancy // Biol. Bull. 1985. - V. 169 - P 342-364.

223. Smith, L.D. The interaction of steroids with Rana pipiens oocytes in the induction of maturation / L.D. Smith, R.E. Ecker// Dev. Biol. 1971. - V. 25. -P. 232-247.

224. The sea urchin profiiin gene is specifically expressed in mesenchyme cells during gastrulaliofi / L.C. Smith, M.G. Harrington, RJ. Britten, E.H. Davidson // Dev. Biol. -1994. V. 164. - P, 463-474.

225. Speaker, M.G. Cyclic nucleotide fluctuations during steroid induced metotic maturation of frog oocytes / M.G. Speaker, F.R. Butcher U Nature, ■ 1977. V. 267. - P. 248-249.

226. Spatially restricted activity of a Drosophtta lipid phosphatase guides migrating germ cells / M. Star/.-Gaiano, N.K. Cho, A. Forbes, R. Lchmann // Development. 200L - V. 128. - P. 983-991

227. Stebbins-Boaz, B. Multiple sequence elements and a maternal mPNA product control cdk2 RNA polyadcnylation and translation during early Xenopus development/ B. Stebbins-Boax, ID- Richter // Mol. Cell. Biol. 1994. - V. 141.-P. 5870-5880.

228. Slow as molasses is required for polarized membrane growth and germ cell migration in Drosophiiai J,A, Stein. H.T. Broihier, L.A. Moore, R. Lchmann H Development 2002. - V. 129. - P. 3925-3934.

229. Siein, P, Transgenic RNAi in mouse oocytes: a simple and fast approach to study gene function / P. Stein, P. Svoboda, R.M. Schultz// Dev. Biol. 2003. -V. 256. - P. 188-194.

230. Identification of cyk. a cyclin B2 kinase as novel calcium/calmodylindependent protein kinase II and its role during Xenopus laevis oocyte maturation /1. Stevens et al. // Exp. Cell Biol 1999. - V. 252. - P. 303-318.

231. Stith, B.J, Induction of meiotic maturation in Xenopus oocytes by 12-0-tetradecanovlphorbol 13-acetat / B.J. Stith, J.L. Mailer U Exp, Cell Res. 1987. -V. 169. - P. 514-523.

232. Structure and function of G protein-coupled receptors I C.D, Strader et al, // Annu. Rev. Biochem. 1994. - V. 63. - P. 101-132.

233. Strieker, S. The cytoskcleton and nuclear disassembly during germinal vesicle breakdown in starfish oocytes /S. Strieker, G. Schatten H Dev. Growth Differ -1991-V. 33. -P. 163-171.

234. Strieker, SA. Time-lapse con focal imaging of calcium dynamics in strafish embryos / S.A. Strieker // Dev. Biol. 1995. - V. 170. - P. 496-518.

235. Stryer, L. G proteins: A family of signal transducers / L. Stryer, MR. Bourne // Attnu. Rev. Cell Biol- 1986. - № 2. - C. 391-419.

236. Su, Y,Q, Evidence that multifunctional calcium/cat moduli n-depondent protein kinase II (CaM KII) participates in the roejotic maturation of mouse oocytes / Y.Q. Su, J,J Eppig // Mo! Reprod Dev 2002. - V. 61 - P. 560-569.

237. Sunahara, R K, Complexsity and diversity of mammalian adenylate cyclases (R K Sunahara, C.W, Dessauer, A,G. Oilman it Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1996 - V. 36. - P. 461-480.

238. Susan, J.M. Cloning and characterization of alphaP integrin in embryos of the sea urchin Strongylocenirotuspurpuratus / J.M Susan, M L, Just, W.J, Lennarz // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. - V, 272, - P, 929-935.

239. Swenson, K.L The clam embryo protein cyelin A induees entry into M phase and the resumption of meiosis in Xcnopus oocytes / K.I. Swenson, K.M. Farrell, J.V. Ruderman // Cell. 1986. - V. 47. - P. 861 -S 70

240. The starfish egg mRNA responsible for meiosis reinitiation encodes cyclin / K- Tachibana, M. Ishiuro, T- Uchida, T. Kishimoto // Dev, Biol. -1990, V. 140. - P. 241-252.

241. Taieb, R. On cyclins, Oocytes, and eggs / K. Taieb, C. Thibier, C. Jessus // Mol. Reprod, Dev. 1997. - V. 48. - P. 397-411

242. Takamura, K. Primordial germ cells originate from the endodermal strand cells in the ascidian Ciona iMestinalis / K. Takamura, M. Fujimura, Y. Yamaguchi U Dev. Genes Evol. 2002. - V, 212. - P 1148.

243. Takizawa, C.G. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-Bl-Cdkl and Cdc25C / C.G. Takizawa, D O. Morgan //Curr. Opin. Cell Biol. 2000. - V . 12. - P. 658-665.

244. Tamura, M. Reproductive maternal ccntrosomes are cast off into polar bodies during maturation division in starfish oocytes / M. Tamura, S. Nemoto // Exp. Cell Res. -2001 V. 269 - P. 130-139.

245. Vanadate stimulation ofadenylyl cyclase: an index of tyrosine kinase vascular effects /CM, Tan et al. //Clin. Phannacol. Ther 1999, - V 66. - P 275-281

246. Tang, W-J, Type specific regulation of adenylate cyclase by 0 protein 0y subunite t W-J. Tang. A G, Giltnan ft Science 1991 - V. 254. - P. 1500-1503.

247. Taussig, R. Inhibition of adenylate cyclase by G^/ R, Taussig, J, Iniguez-Liuhi, A. Gilman // Science. 1993. - V. 261. - P. 218-221.

248. Terasaki, M. Redistribution of cytoplasmic components during germinal vesicle breakdown in starfish oocytes / M. Terasaki it J. Cell Seien. 1994. - V. 107.-P. 1797-1805,

249. Terasaki, M, Changes in organization of the endoplasmic reticulum during Xenopus oocyte maturation and activation / M. Terasaki, L.L, Runft, A.R. Hand //Mol. Biol. Cell-2001,-V, 12.-P 1103-1116.

250. Toole, B. Uptake and cellular localization of JH-1-methyl adenine and adenine in the starfish gonad and oocytes / B. Toole, A.W. Schuetz, E. Boy Ian // Gen. Comp. Endocrinol. 1974. - V. 22. - P 199-208.

251. Toshimori, K- Gap junctions between microvilli of an oocyte and follicle cells of the teleost / K, Toshimori, F Yasuzumi // Ztschr- Mikrosk^anat Forsch. . 1979 -Bd. 93,-P. 458-464.

252. Tosti, E. Fertilization and acti nation currents in bovine oocytes / F„ Tosti, R. Boni, A, Cuomo // Reproduction. 2002. - V. 124. - P. 835-846,

253. Is meiosis activating sterol (MAS) an obligatory mediator of meiotic resumption in mammals / A, Tsafiiri, X- Cao, K.M. Vaknin, M. Popliker H Mol. Cell Endocrinol- 2002, - V. 187, - P, 197-204,

254. Microinjectcd progesterone reinitiates meiotic maturation ofX&topua latrvis oocytes / J. Tso, C. Thibier, O. Mulner. R. Ozon H Proc. Natl. Acad. Sci, USA- -1982, V, 79. - P. 5552-5556.

255. Nonequi valence of maternal ccnlrosomes'ccntrioles in starfish oocytes: selective casting-off of reproductive centrioles into polar bodies / Y. Uetake, K.H Kato, S. Washitani-Nemoto, S.S. Nemoto // Dev Biol, 2002. - V, 247 - P 149-64.

256. Varnumr S.M. Maturation specific deadenylation inXenopta oocytes requires nuclear and cytoplasmic factors 1 S,M. Vamum, C.A, Humey* W.M. Wormington tf Dev Biol. -1992. V. 153, - P. 283-290.

257. Venezky, D,L, Accumulation of histone repeat transcripts in the sea urchin egg pronucleus/ D.L, Venezky, L.M. Angercr, R.C Angercr it Cell. -1981. V 24.-P. 385-391.

258. Voronina, E. Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation IE. Voronina, W.F. ManiufT, G.M. Weasel ft Dev. Biol. 2003. - V. 256. - P 115-126,

259. Voronina, E. Apoptosis in the sea urchin oocytes, eggs, and early embryos / E. Voronina, G.M. Wessel It Mo). Reprod, Dev ■ 2001. V. 60. - P 553-561,

260. Voronina, E. The regulation of oocyte maturation / E, Voronina, G.M, Wesscl tt Curr. Top. Dev. Biol. 2003, - V. 58. - P 53-110,

261. Voronina, E- Regulatory contribution of heteritrimeric G-protcin to oocyte maturation in the sea urchin eggs / E. Voronina, G.M. Wessel // Mech. Dev. -2004 -V. 121.-P. 247-259.

262. Waldmann, R. Multifunctional Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase made Ca2+ independent for functional studies f R. Waldmann, P.l. Hanson, H. Schulman // Biochemistry'. 1990. - V, 29. - P. 1679-1684.

263. Walker, C.W. Studies on the reproductive system of sea stars. 1 The morphology ang histology of the gonad Asterias vulgaris t C.W. Walker // Biol. Bull 1974. - V. 147. - P. 661-677

264. Walker, C.W. Nutrition of gametes I C.W, Walker // Echinoderm nutrition. Rotterdam: Balkema, 1982, - P. 449-468,

265. Walker, M.M. Reproductive periodicity in Evechinu chloroticus in the Hauraki Gulf / M M. Walker II New Zealand. J, Mar Freshwat. Res 1982. - V. 16. P. 19-25,

266. Wang. J. A G protein-coupled receptor kinase induccds Xenopus oocytc maturation IJ Wang. X J. Liu It I Biol. Chem, 2003. - V. 278, - P. . 5 80915814.

267. Wassarman, P.M. Oogenesis: synthetic events in cite devrloping mammalian egg / P.M. Wassarman H "Mechanism and control of animal fertilization" (J.F. Hartmann, Ed.). New York: Academic Press, 1983 . - P. 1-54.

268. Wasscrman, WJ, The regulation of Xenopus laevis oocytc maturation / W.J. Wasserman. M.J Penna, J.G. Houle it In "Gamctogencsis and early embryo", -Alan R. Liss, 1986. P. 111-130,

269. Watson, A.J, A fifth member of the mammalian G-protcin beta-subunit family. Expression in drain and activation of the beta 2 isotipe of phospholipase

270. CI AJ Watson, A. Kali, Ml. Simon II J. Bio). Chem. 1994. - V. 22. - P. 22150-22 156,

271. A molecular analysis of hyaline a substrate for cell adhesion in the hyaline layer of the sea urchin embryo I G.M. Wessel et al. It Dev. Biol. -1998. - V, 193.-P. 115-126.

272. SFE1, a constituent of the fertilization envelope in the sea urchin is made by oocytes and contains low-density lipoprotein-receptor-like repeats / G.M. Wessel et al. // Biol. Reprod. 2000a. - V. 63. - P. 1706-1712,

273. Direct molecular interaction of a conserved yolk granule protein in sea urchins / G.M Wessel et at. It Dev. Growth Differ 2000b. - V. 42. - P. 507517.

274. Wessel, G.M. Cortical granule translocation is microfilament mediated and linked to meiotic maturation in the sea urchin oocyte / G.M. Wessel, S.D. Conner. L. Berg II Development. 2002. - V. 129. * P. 4315-4325.

275. Whitaker, M, Calcium and mitosis / M- Whitaker, M.G. Larman U Semin. Cell Biol 2001. - V. 12. - P. 53-58.

276. Woodruff, R.I, Polarized intercellular bridges in ovarian follicles of the cecropia moth / R.I. Woodruff, W Telfer// J. Cell Biot. -1973 V, 58. ■ P 172-188.

277. Stage-specific and differed ial expression of gap junctions in the mouse ovary, connexin-spccific role in the follicular regulation / C.S. Wright et al // Reproduction. 2001. - V. 121. - P- 77-88.

278. Wylic, C. Germ celts / C. Wylie// Cell. 1999. - V. 96. - P. 165-174.

279. Maturation-associated increase in !P(3) receptor type: role in conferring increased IP(3) sensitivity and Ca(2+) oscillatory behavior in mouse eggs / Z. Xu, C.J. Williams, G.S Kopf, R.M SchuJtz// Dev. Biol. 2003, - V, 254. - P. 163-171.

280. Yamashita, M, In vitro maturation of the brittle-star Amphipholti kochii oocytes induced by cyclic AMP / M. Yamashila// Zool. Sci -1986- V, 3. - P, 467-477.

281. Yamashita, M, Molecular mechanisms of meiotic maturation and arrest in fish and amphibian oocytes / M, Yamashita // Semin, Cell Dev. Biol- 1998, -V, 9. - P, 569-579,

282. Yan. K, Differential ability to form the G protein betagamma complex among members of the beta and gamma subunit families / K. Yan, V. Kalyanaraman, N. Gautam Hi. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 7141-7146.

283. Yew, N- Meiotic initiation by the mos protein in Xcnopus / N. Yew, M.L, Meffini, G.F, Vande Woudc II Nature. 1992. - V. 355, - P. 649-652.

284. Characterization ofl-methyladenine binding in starfish oocyte cortices / M-Yoshikuni et al, U Proc. Nail. Acad. Sci. USA- 1988a - V. 85. - P, 1874-1877.

285. Synergistic action of disutfide-rcducing agents on 1 mcthyladenine-i nduced oocyte maturation in starfish 1M. Yoshikuni et al. // Dev. Biol. - 1988b. - V. 128.-P. 236-239.

286. Yuce, O. Postmeiotic unfertilized starfish eggs die by apoptosis / О, Yuce, К С Sadler// Dev. Bio). 2001, - V. 237 - P 29-44,

287. Rapid and pbosphoinosiial-dfcpcndent binding of «he SWI/SNF-like BAP complex to chromatin after T lymphocyte receptor signaling t K. Zhao et al. // Cell -1998.-V. 95 P 625-636.

288. Zhu, Y. Identification, classification, and partial characterization of genes humans and other vertebrates homologous to a fish membrane progesterone receptor i Y. Zhu. J. Bond, P. Thomas It Proc, Nail. Acad. Sd. USA. 2000a. -V. 100.-P. 2237-2242.

289. Cloning, expression, and characterization of a membrane progestin receptor and evidence it is an intermediary in meiotic maturation of fish oocytes / Y, Zhu, C D. Rice, M. Pang, P. rhomas // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2000b. - V. 100. - P. 2231-2236,

290. Zimmermann, G. Protein kinase C alters the responsiveness of adenylyl cyclases to G protein alpha and betagamma subuníts t G, Zimmermann, R, Taussig t! J. Biol, Chem. 1996. - V. 271. - P. 27 161-27 166.