Механизмы регуляции активности эндонуклеазы бактерий Serratia marcescens

Романова, Юлия Джафаровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы регуляции активности эндонуклеазы бактерий Serratia marcescens
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регуляции активности эндонуклеазы бактерий Serratia marcescens"

На правах рукописи

frpQ^J

003467028

Романова Юлия Джафаровна

Механизмы регуляции активности эидонуклеазы бактерий Serratia marcescens

03.00.04-биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2009

003467028

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов при кафедре микробиологии биолого-почвенного факультета Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Филимонова Мария Николаевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Зубаиров Дилявер Мирзабдуллович

доктор ветеринарных наук, профессор Алимов Азат Миргасимович

Ведущая организация: Казанский институт биохимии и биофизики

КНЦ РАН.

Защита состоится в_ч. на заседании диссертационного

совета Д.212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18,_

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н. И. Лобачевского Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина

Автореферат разослан Ученый секретарь

диссертационного совета , ^

доктор биологических наук Абрамова З.И.

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1 Актуальность проблемы. Эндонуклеаза бактерий Serratia marcescens -это одна из наиболее изученных бактериальных нуклеаз, проявляющих широкую субстратную специфичность, сведения о которой представлены в большинстве банков данных [Brenda; RSDB; Protein Data Bank; SCOP]. Известны многие физико-химические и биохимические свойства, структура, каталитически значимые аминокислотные остатки, разработаны модели механизма действия данного фермента [Nestle N. et al., 1969а, 1969b; Лещинская И. Б. и др., 1974; Филимонова М. Н. и др., 1980, 1981, 1995,1996, 1997, 1999, 2001, 2003; Biedermann К. et al., 1989; Miller М. D. et al., 1994; Friendhoff P. et al., 1994, 1996; Kolmes B. et al., 1996; Lunin V. Y. et al., 1997; Шляпников С. В. и др., 1999]. Эндонуклеаза marcescens представляет ряд эволюционно родственных и широко распространенных в мире про- и эукариот нуклеаз, различающихся физиологической ролью [Lacks S. et al., 1974, 1975; Rosenthal A. L., 1977; Low R. L. et al., 1987; Vincent R. D., 1988; Puyet A. et al., 1990; Muro-Pastor et al., 1992, 1994; Ruiz-Carrillo A. et al., 1987, 1993; Ikeda et al., 1996; Meiss G. et al., 1998; Филимонова M.H., 1999]. Эндонуклеазу производят и применяют в пчеловодстве и молекулярно-биологических исследованиях [Manual "Benzon Nuclease", 1989; Панфилова 3. И. и др., 1983; Детиненко Л.Д. и др.,1995]. Продемонстрирована перспективность использования данного фермента в качестве противовирусного препарата при лечении животных [Аликин Ю. С. и др., 1998]. Установлена противоопухолевая активность [Габдуллина Г. К., 1980]. Вместе с этим механизмы регуляции активности эндонуклеазы изучены недостаточно. Недавно были установлены особенности регуляции ДНКазной активности катионами магния, а также соединениями, содержащими катионы ртути и кобальта [Филимонова М. Н. и др., 1997, 2001, Filimonova М. et al., 2003].

практику. Таким образом, механизмы регуляции активности эндонуклеазы требуют углубленного исследования. Изложенное определяет актуальность настоящей работы, в которой представлены результаты анализа действия мононуклеотидов, различающихся природой азотистых оснований, углеводного остатка и числом фосфатных групп, ..и катионов магния на активность эндонуклеазы по отношению к субстратам, отличающимся друг от друга вторичной структурой, степенью спирачизации и полимерности.

1.2 Цель работы. Целью настоящей работы стало исследование ключевых механизмов регуляции активности эндонуклеазы Serratia ,marcescens. В соответствии с целью решали следующие задачи:

1. Определить оптимальное соотношение Mg/Рсубстрэта для гидролиза РНК.

2. Провести сравнительный анализ влияния катионов магния на конформацию высокомолекулярной ДНК, суммарной и транспортной РНК.

3. Провести кинетический анализ гидролиза высокомолекулярной ДНК, суммарной и транспортной РНК.

4. Провести оценку гидролиза ДНК и РНК при их одновременном . присутствии в среде.

5. Изучить гидролиз нуклеиновых кислот: высокомолекулярной ДНК и суммарной РНК, - в присутствии мононуклеотидов, различающихся типом азотистых оснований, углеводного остатка и числом фосфатных групп.

1.3 Научная новизна. Впервые установлено оптимальное для гидролиза РНК соотношение Mg/Ррц«. Показано, что при оптимальном для проявления активности содержании катионов магния происходит изменение вторичной структуры субстратов: высокомолекулярной ДНК - в пределах В-конформации, суммарной и транспортной РНК - в пределах ,А-конформации.

специфичность к типу гидролизуемого субстрата. Показано, что присутствие Mg2+ отражается на скорости распада фермент-субстратного комплекса с образованием продукта. Установлено, что нуклеозидмонофосфаты не влияли на активность эндонуклеазы по отношению к ДНК и подавляли активность - к РНК, ингибируя, фермент по бесконкурентному типу в случае CMP, GMP, UMP и частично конкурентному типу в случае AMP и d AMP. Выявлено, что дезоксирибонуклеозидтрифосфаты не влияли на активность эндонуклеазы ни по отношению к ДНК, ни к РНК, а СТР, GTP, UTP - только к ДНК, и, напротив, подавляли РНКазную активность. Показано, что АТР играет роль положительного эффектора в присутствии РНК и отрицательного - в присутствии ДНК, ингибируя или активируя эндонуклеазу по частично смешанному типу. Установлены механизмы регуляции активности эндонуклеазы мононуклеотидами, различающимися типом азотистых оснований, углеводного остатка и числом фосфатных групп.

1.4 Практическая значимость. Установленные механизмы регуляции эндонуклеазы повышают эффективность ее применения и способствуют ее дальнейшему продвижению в практику. Результаты определения оптимального соотношения Mg2VPpHK были использованы при разработке антимикробного препарата на основе эндонуклеазы, защищенного Патентом РФ №2337139.

1.5 Решение поставленных задач позволило сформулировать следующие основные научные положения, выдвигаемые на защиту:

• При оптимальном для проявления активности содержании Mg2t происходит изменение вторичной структуры субстратов. При этом прочность связывания эндонуклеазы с субстратом в отличие от скорости продуктивного распада фермент-субстратного комплекса, которая многократно меняется, не зависит от наличия в среде Mg2\ конформационных особенностей, степени полимерности и спирализации субстрата, что лежит в основе механизма регуляции эндонуклеазы Mg2\

• Мононуклеотиды могут служить эффекторами эндонуклеазы, регулируя ее активность, предпочтительно по отношению к РНК, по частично

конкурентному, бесконкурентному или частичному смешанному типу, что зависит от их содержания в среде и химического состава, а также содержания в среде Mg"" и представляет суть механизмов регуляции активности эндонуклеазы мононуклёотидами.1

1.6 Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на научных конференциях "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2004), "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" ! (Казань, 2004), "Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение" (Казань, 2005), "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2007), «Биология -наука 21 века», (Пущино, 2007); :

1.7 Публикация результатов^ исследований. По теме диссертации опубликовано 9 работ, в числе который 1 патент,'3 статьи, 5 тезисов.

1.8 Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 106 страницах и включает в себя: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, выводы, заключение, список литературы (131 источник, в том числе 84 иностранных). Диссертация содержит 11 таблиц и 24 иллюстрации.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы и методы исследования < ^

Работа выполнена в 2003 - 200,8 и-,, в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов при кафедре микробиологии Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина.

На начальных этапах исследование влияния нуклеозидмонофосфатов на активность эндонуклеазы проводилось при участии Игнатьевой И.В. В определении оптимальной концентрации Mg2+ для РНКазной активности эндонуклеазы участвовала Сусарова А.Н. Спектры кругового дихроизма определяли в ИОФХ им. А.Е. Арбузова КНЦ РАН под руководством профессора Нуретдинова И.А. и с помощью к.х.н. Губской В.П. Автор выражает искреннюю благодарность названным сотрудникам и студентам.

2.1.1 Материалы исследований

Объектом исследования служил гомогенный препарат эндонуклеазы S.marcescens (изоформа Sm2), предварительно выделенный и

охарактеризованный [Филимонова МН. и др., 1991; Педерсен Ю. и др., 1995].

В качестве субстратов использовали препараты суммарной РНК (НПО «Вектор», Россия) и («US Biochemical Corporation», США), транспортную РНК (тРНК) дрожжевую ("ICN", США), высокомолекулярную ДНК из молок лосося тип XIV («Sigma», США) и ДНК из эритроцитов цыплят ("Reanal", Венгрия).

В работе использовали 5'АМР, 5'СМР, 5'GMP, 5'UMP, 5'СТР, 5'GTP ("Sigma", США), 5'dAMP, 5'dTMP, 5'dGMP, 5'dCMP, 5'dATP, 5'dTTP, 5'dGTP, 5'dCTP ("ICN", США), 5'ATP, 5'UTP (" US Biochemical Corporation ", США).

2.1.2 Методы исследований

Активность эндонуклеазы определяли методом кислоторастворимых фракций или по гиперхромному эффекту в соответствии с рекомендациями [Лещинская И. Б. и др., 1974; Filimonova М. et al., 2003].

Концентрацию ДНК и РНК в усредненных нуклеотидах рассчитывали, исходя из молярного коэффициента поглощения нуклеотидного звена при 260 нм [Filimonova М. et al , 2003].

Концентрацию эндонуклеазы рассчитывали исходя из молекулярной массы [Педерсен Ю. и др., 1995] и молярного коэффициента поглощения [Филимонова М. Н. и др., 1981].

Оптимальное содержание Mg2+ для гидролиза РНК определяли методом кислоторастворимых фракций в отсутствии и присутствии в реакционной смеси 0,58; 2,9; 5,8; 11,6 мМ Mg2^. Активность в отсутствии Mg2+принимали за 100%.

Все последующие исследования проводили при соотношении ^27фосфорс>.6страта 40 : 1.

При определении кинетических параметров гидролиза ДНК, суммарной и транспортной РНК скорость гидролиза субстратов оценивали по гиперхромному эффекту, определяя прирост поглощения инкубационной смеси при 260 нм и длине оптического пути 10 мм. Гидролиз инициировали

добавлением нуклеазы до концентрации 6,3 нМ к реакционной смеси, включавшей 0,001; 0,002; 0,006 % субстрата. При проведении гидролиза в отсутствии Mg2+ в реакционную смесь добавляли 10-кратный к концентрации субстрата избыток ЭДТА для удаления следов поливалентных металлов, включая Mg2". Km и Kcat рассчитывали по методу Лайнуивера-Берка.

Субстратное предпочтение при одновременном присутствии в среде ДНК и РНК определяли, сравнивая динамику прироста поглощения при 260- нм кислоторастворимых продуктов гидролиза. РНК и ДНК, находящихся в реакционной смеси по отдельности и; вместе-(взятых в равных,долях), при соотношении нуклеаза/субстрат 4,24 — 8,47 пмоль/мг. За 100 % принимали поглощение реакционной смеси перед внесением фермента. Содержание продуктов, включающих дезоксирибозу„определяли по определяли методу Дише [Досон Р. и др., 1991], а рибозу по методу Мейбаум [Збарский И. Б. и др., 1968].

Влияние нуклеотидов на активность; нуклеазы определяли, добавляя их в реакционную смесь непосредственно перед.¡внесением фермента (или воды в контроле на субстрат) в эквимолярном к концентрации субстрата количестве и, дополнительно, увеличив концентрацию нуклеозидтрифосфатов вдвое. Для того, чтобы соотношение Mg:7Pc>6c,paia было строго выдержано к нуклеотидам перед внесением в реакционную смесь добавляли Mg2+ в эквимолярном количестве.

Ингибиторный анализ проводили, определяя кинетические параметры гидролиза субстратов в присутствии нуклеотидов.

Для определения типа ингибирования строили графики зависимости двойных обратных величин начальной скорости реакции от концентрации субстрата по методу Лайнуивера-Берка, применяя линейный регрессионный анализ из средств статистического анализа данных программы «Sigma Plot» для «Windows» (США).

Константы ингибирования для CMP, GMP и UMP рассчитывали, построив график зависимости S/V от I при ряде фиксированных концентраций субстрата по методу Корниш-Боуден, для AMP, dAMP и ATP - построив график двойных обратных величин зависимостей длин отрезков, полученных по методу

Лайнуивера-Бэрка, от концентрации ингибитора (Диксон М. и др., 1982], а также с помощью уравнений [Крупянко В. И., 2007].

Спектры кругового дихроизма (КД) определяли на приборе Jasco-J 500 А ("Japan Spectroscopic Co.", LTD, Япония) при 25" С и длине оптического пути 2 мм. Спектр каждого образца определяли в трех повторностях. Молярную эллиптичность рассчитывали общепринятым методом .

Статистический анализ данных, полученных не менее чем из 6 повторностей .эксперимента, проводили, используя подпрограмму статистического анализа графической программы «Sigma Plot» для уровня достоверности 95%. Достоверность разницы полученных значений оценивали с помощью t-теста Стьюдента из пакета статистического анализа программы «Microsoft Excel 2000».

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Исследование механизма регуляции активности эндонуклеазы

катионами Mg

Определение особенностей регуляции ДНКазной активности катионами магния и соединениями, содержащими катионы ртути и кобальта [Филимонова М. Н. и др., 1997, 2001; Filimonova М. et al., 2003], приближало к пониманию механизма регуляции активности эндонуклеазы Mg:~ в целом и свидетельствовало о необходимости получения дополнительной информации. Так, следовало выяснить, будет ли роль Mg2+ при гидролизе РЫК идентичной, повлияет ли на результат степень спирализации РНК, как присутствие в среде Mg2' отразится на интимном взаимодействии фермента и субстрата. Отвечая на эти вопросы, определяли кинетические параметры гидролиза суммарной и транспортной РНК (тРНК), и высокомолекулярной ДНК в присутствии и отсутствии Mg"", анализировали изменение конформации субстратов под действием Mg2'. Также определяли оптимальное соотношение Mg2"/фосфат рпк-

При определении оптимального содержания Mgí+ для гидролиза РНК было установлено, что в присутствии 0,58 мМ Mg2*, что соответствовало

соотношению М§2" /фосфат рНк 2:1, активность нуклеазы возрастала более чем в 3 раза по сравнению с активностью в его отсутствии. Дополнительное 5-кратное увеличение содержания вызывало возрастание активности примерно в 2

раза. Последующее увеличение содержания в 2 - 4 раза приводило к изменению активности в пределах ошибки опыта, Таким образом, оптимальной для проявления активности по отношению к РНК была концентрация М§2' 2,9 -И,6 мМ, что соответствовало соотношению концентраций Mg27фocфaтpнк (1040): 1. Полученные результаты совпадали со значениями оптимального содержания 1^2т и соотношения М§27фосфатлнк- для проявления ДНКазной активности изоформ 5ш1 и Бщ2 эндонуклеазы [Филимонова М. Н. и др., 1997].

Изменение активности по отношению к РНК, так же как и по отношению к ДНК [Филимонова М. Н. и др., 1997], сочеталось с изменением конформации субстрата под действием М^2'.,, ^

Изменение конформации субстратов под действием анализировали с помощью кругового дихроизма (КД) и адсорбционной спектрометрии. Как следовало из спектров КД, суммарная и тРНК и в отсутствии М§2+ и при его оптимальном содержании находились в А-форме. Об этом свидетельствовало наличие большой положительной полосы разностного дихроичного поглощения в области 260-265 нм и небольшой отрицательной полосы - в области 225 - 240 нм. Добавление до соотношения М§27фосфаттк 12:1 приводило к смещению в коротковолновую область центра большой положительной полосы и увеличению разностного дихроичного поглощения на 10-12%. Изменение спектров КД сочеталось с изменением УФ спектров препаратов и свидетельствовало об изменении вторичной структуры РНК, которое происходит в результате образования комплексов М§2" с фосфатными группами. Аналогично под действием было определено изменение вторичной структуры ДНК. При добавлении до соотношения Мв27фосфатДцк 12:1 в спектре КД наблюдали уменьшение на 13-14% разностного дихроичного поглощения положительной полосы с центром при 275 нм. Изменения в спектрах КД ДНК под действием М§2т свидетельствовали о том, что изменения в структуре ДНК происходили в

пределах В-конформаиии. Таким образом, исследование показало, что при добавлении до соотношения Mg:!7фocфaT||к 12:1 происходит изменение

вторичной структуры как ДНК, так и РНК. Дальнейшее увеличение этого соотношения приводило к изменению спектров КД ДНК и РНК в пределах ошибки опыта.

Кинетический анализ гидролиза ДНК и РНК, Результаты определения кинетических параметров гидролиза РНК и ДНК представлены в табл. 1.

Табл. 1 Кинетические параметры гидролиза РНК, ДНК и тРНК при К^27Рс;бараг;, 40:1 (1) и в отсутствии (2)

Субстрат Кш, мг/мл Ксаь секна 1 мМ нуклеазы

1 2 1 2

РНК 0,032 0,038 86,2 1,4

тРНК 0,035 0,048 126,7 0,07

ДНК 0,027 0,043 143,6 6,7

Как видно из табл. 1, константа Михаэлиса-Ментен имела близкие значения для всех исследованных субстратов, независимо от присутствия в среде М§2'. Это позволяет заключить, что присутствие в среде Г^* не является необходимым условием для образования комплекса эндонуклеазы с субстратом, а конформация субстрата, тип углеводного остатка и величина заряда сахаро-фосфатного остова спирали не оказывают большого влияния на прочность связывания1 фермента с субстратом. Напротив, отсутствие в среде отражалось на скорости

продуктивного распада фермент-субстратного комплекса и способствовало проявлению специфичности эндонуклеазы в отношении исследованных субстратов. В частности, в отсутствии Кса1 гидролиза тРНК была меньше Ксаг гидролиза суммарной РНК, высокомолекулярной ДНК, а также тРНК в присутствии соответственно, почти в 20- , 100- и 1000 раз. Гидролиз

высокомолекулярной ДНК, суммарной и транспортной РНК при соотношении М§27фосфатцк 40:1 характеризовался близкими значениями Кса1.

Исследование гидролиза ДНК и РНК при их одновременном присутствии в среде проводили при оптимальном содержании в среде магния, определяя динамику накопления кислоторастворимых дезоксирибо- и рибонуклеотидов. Результаты представлены на рисунке 1. Как видно из рис. 1, в присутствии альтернативного субстрата: РНК или ДНК, соответственно, -накопление продуктов гидролиза, как ДНК, так и РНК уменьшается в 2 - 3 раза,

О 200 400 600 800 1000 1200 1400 Время, с

Рис. 1 Динамика накопления продуктов гидролиза ДНК в отсутствии (Д) и присутствии (□) РНК и РНК в отсутствии (0) и присутствии (X) ДНК

что. прежде всего, можно объяснить наличием в молекуле эндонуклеазы одного и единого для этих субстратов активного центра. Картина гидролиза РНК и ДНК в присутствии альтернативного субстрата имеет много общего. В частности, в дополнение к изменению скорости накопления кислоторастворимых продуктов, в присутствии альтернативного субстрата изменяется форма кривой накопления продуктов гидролиза. Обе кривые имеют сигмоидальный характер и отличаются друг от друга участком, соответствующим поздней стадии гидролиза.

Таким образом, исследование механизма регуляции активности эндонуклеазы катионами М^ показало, что изменение вторичной структуры РНК под действием Мц2+ сочеталось с изменением РНКазной активности эндонуклеазы, что совпадало с ранее установленной [Филимонова М. Н. и др., 1997] и подтвержденной в настоящей работе тенденцией в отношении ДНК.

Полученные результаты служат подтверждением идентичности механизмов регуляции РНКазной и ДНКазной активностей и указывают на то, что ни степень полимерности, ни степень спирализашш субстрата не имеют большого влияния на исследуемый механизм. Проведенный анализ позволил сформулировать схему механизма регуляции активности эндонуклеазы катионами магния (рис. 2).

+ Мд

- Ма"

МА** I

I ЕЭ

Кт,

КсаИ,

Кт,

НО —РП

СН В

-Ю — Ря

сия

Рис. 2 Механизм регуляции активности эндонуклеазы катионами Условные обозначения: Е - фермент, ЕБ - фермент-субстратный комплекс

Как видно из рис. 2, образуя комплексы с фосфатными группами

субстрата: ДНК или РНК,- вызывает такое изменение его вторичной структуры, которое приводит к многократному возрастанию скорости продуктивного распада фермент-субстратного комплекса. В отсутствии скорость продуктивного

распада фермент-субстратного комплекса зависит от типа гидролизуемого субстрата, что свидетельствует о проявлении эндонуклеазой субстратной специфичности и указывает на необходимость с осторожностью относиться к распространенному мнению [Nestle N. et а!., 1969; Лещинская И. Б. и др., 1974; Friedhoff P. et al., 1996; Brenda; RSDB; Protein Data Bank; SCOP] о широкой специфичности данного фермента.

3.2 Влияние нуклеотидов на активность эндонуклеазы Анализ действия нуклеозидмонофосфатов на активность эндонуклеазы представлял интерес в связи с тем, что они входят в число продуктов гидролиза РНК и ДНК. Результаты анализа, представленные на рисунках 3 - 6 и в таблице 2, свидетельствовали о возможности регуляция активности эндонуклеазы продуктами реакции.

140 120 100 80 60 40 20

ril

[Ь

контроль AMP CMP

UMP dAMP d CMP d GMP d TMP

Рис. 3 Активность эндонуклеазы (%) по отношению к ДНК ( 0 ) и РНК ( К;) в присутствии 0,3 мМ нуклеозидмонофосфатов. Здесь и далее за 100 % принята активность в отсутствии нуклеотидов (контроль)

Статистический анализ данных, представленных на рис, 3, показал, что разница значений, полученных в отсутствии и присутствии эквимолярного к концентрации субстрата количества нуклеотидов, была достоверной лишь в отношении РНКазной активности. Под действием нуклеотидов РНКазная активность уменьшалась в 1,2 - 1,3 раза, без выраженного предпочтения к типу углеводного остатка и азотистого основания в составе нуклеотида. В связи с отсутствием аналогичного эффекта нуклеотидов на ДНКазную активность

дальнейшие исследования, в частности ингибиторный анализ, были ограничены РНКазной активностью эндонуклеазы.

Определение типа ингибирования не выявило принципиальной разницы между AMP и d AMP. Графическое изображение зависимости активности от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Бэрка напоминало конкурентный тип ингибирования (рис. 4). Наклон кривых зависимости активности от концентрации субстрата увеличивался в присутствии AMP или dAMP по сравнению с кривыми, полученными в отсутствии нуклеотидов. За исключением кривой, полученной в присутствии 1,2 мМ dAMP, остальные кривые пересекались вблизи оси ординат в точках, лежащих выше оси абсцисс, в области ее положительных значений. Однако кривая, полученная в присутствии 1,2 мМ dAMP, располагалась почти параллельно оси 1/S. Точка пересечения данной кривой с линией контроля была локализована почти на оси 1/V. Прямой зависимости между увеличением наклона кривых и содержанием в среде нуклеотидов не наблюдали.

Рис. 4 Зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата в присутствии (линии 2-4) и отсутствии (линия 1) AMP (А) и d AMP (Б). 1 - 0 мМ (контроль), 2 - 0,29-, 3 - 0,58-, 4- 1,2 мМ мононуклеотида

Анализ вторичных кривых, представляющих собой графики зависимости от концентрации ингибитора наклона кривых, представленных на рис.4, и отрезков, отсекаемых этими кривыми от оси ординат, выявил следующее. Первые независимо от типа ингибитора, имели форму вогнутой параболы, вторые -выпуклой параболы, что, соответственно, свидетельствовало о гиперболическом ингибировании или гиперболической активации, согласно классификации Клеланда В. В. [Cleland W. W., 1979]. Таким образом, полученные результаты позволяли заключить, что под действием AMP и d AMP происходит частичное конкурентное ингибирование, при котором AMP или dAMP, образуя комплекс с эндонуклеазой, уменьшает сродство эндонуклеазы к РНК (конкурируя с РНК за центр связывания), но не предотвращает полностью ее связывание с РНК. При этом при некоторых концентрациях ингибитора продуктивный распад тройного комплекса (фермента с субстратом и ингибитором - ESI) может протекать по альтернативному пути (EI + S = EIS = EI + Р), который быстрее обычного, в результате чего скорость ферментативной реакции возрастает.

Отсутствие принципиальной разницы между AMP и dAMP, выявленное в ходе ингибиторного анализа, согласовывалось с близостью значений констант ингибирования, представленных в табл.2, и свидетельствовало об отсутствии

Табл. 2 Константы ингибирования (мМ) РНКазной активности нуклеозидмонофосфатами, рассчитанные методами Лайнуивера-Берка (1) и Корниш-Боуден (3), а также определенные из графиков двойных обратных величин изменений наклона кривых от концентрации ингибитора (2) или из уравнения (4)

Нуклеотид 1 2 3 4

AMP - 0,0765 - 0,0859

dAMP - 0,0600 - 0,0341

CMP 0,602 - 0,0862 0,313

GMP 1,12 - 0,229 0,623

UMP 0,979 - 0,3107 1,32

влияния на картину ингибирования типа углеводного остатка в составе нуклеотидов, что позволило ограничить дальнейший анализ исследованием производных рибозы.

Определение типа ингибирования эндонуклеазы GMP, UMP, СМР выявило сходство этих нуклеотидов между собой и отличие от AMP и d AMP. Графики зависимости активности от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Бэрка при фиксированных концентрациях GMP, UMP, СМР и в их отсутствии представляли собой прямые, почти параллельные друг другу (рис.5), что соответствовало бесконкурентному типу ингибирования.

1/S, 1/мг

Рис. 5 Зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата в присутствии (линии 2-3) и отсутствии (линия l) СМР (А), GMP (Б), UMP (В). I -О мМ (контроль), 2 - 0,29 -, 3 - 0,58 мМ мононуклеотида

Определение констант ингибирования (табл. 2), независимо от метода их определения, выявило бесспорное различие между значениями AMP/d AMP и

GMP или - UMP. Близкие значения констант ингибирования были определены графическим методом или по методу Лайнуивера-Берка для GMP и UMP. Для СМР величина константы ингибирования, определенная по методу Корниш-Боуден, приближалась к константам AMP и d AMP, а при определении двумя другими методами, имела промежуточное значение между AMP/d AMP и GMP/ UMP.

Таким образом, исследование изменения активности эндонуклеазы под действием нуклеозидмонофосфатов показало, что все мононуклеотиды, образующиеся в результате гидролиза ДНК или РНК, не оказывая заметного влияния на ДНКазную активность, ингибируют РНКазную активность эндонуклеазы. Причем AMP и dAMP образуют комплекс с эндонуклеазой до образования фермент-субстратного комплекса. Напротив, GMP (dGMP), UMP(dUMP), CMP(dCMP) не способны взаимодействовать с эндонуклеазой до образования фермент-субстратного комплекса, поскольку специфический(е) центр(ы) связывания с ними, становится доступным(и) лишь при образовании фермент-субстратного комплекса. Полученная информация представляет собой основные этапы одного из ключевых механизмов регуляции активности эндонуклеазы, схематически представленного на рис. 6, - механизма регуляции ферментативной активности продуктами гидролиза ДНК и РНК.

Влияние нуклеозидтрифосфатов на активность эндонуклеазы. Отсутствие специфичности эндонуклеазы к типу углеводного остатка инициировало вопрос о специфичности данного фермента к числу фосфатных групп в составе мононуклеотидов. Для ответа на этот вопрос исследовали влияние нуклеозидтрифосфатов на активность эндонуклеазы. Результаты представлены на рисунках 7-10, из которых видно, что дезоксирибонуклеозидтрифосфаты не влияли на активность эндонуклеазы по отношению к ДНК или РНК ни в эквимолярном-, ни в удвоенном к концентрации нуклеиновых кислот количестве. СТР, GTP, UTP не влияли на активность эндонуклеазы по отношению к ДНК, и, напротив, вызывали уменьшение РНКазной активности почти в 1,5 раза. Такой же эффект оказывал АТР в эквимолярном к концентрации субстрата количестве.

AMP dAMP

Рис. 6 Механизм регуляции активности эндонуклеазы нуклеозидмонофосфатами. Условные обозначения: Е - фермент, ЕБ - фермент-субстратный комплекс

140

контроль ATP СТР GTP OTP (JATP dCTP dGTTP dTTP

Рис. 7 Активность эндонуклеазы (%) в присутствии 0,3 мМ нуклеозидтрифосфатов по отношению к ДНК ( D ) и РНК ()

Увеличение концентрации АТР в 2 раза, приводило к уменьшению ДНКазной активности почти в 1,5 раза и, напротив, к увеличению РНКазной активности более чем 2 раза.

Графическое изображение (рис.9) зависимости активности от концентрации ДНК в координатах Лайнуивера-Бэрка напоминало неконкурентный [Ленинджер

контроль ATP OTP GTP LTTP dATP dCTP dGTP dTTP

Рис. 8 Активность эндонуклеазы (%) в присутствии 0,6 мМ нуклеозидтрифосфатов по отношению к ДНК ( J ) и РНК ( Щ)

-1/S. 1/мг

Рис. 9 Зависимость начальной скорости реакции от концентрации ДНК в присутствии (линии 2-3) и отсутствии (линия I) ATP I - 0 мМ (контроль), 20,12 мМ, 3 - 0,18 мМ нуклеотида

А., 1985; Rudolph F. В., 1979] или смешанный тип ингибирования [Диксон М., идр., 1982; Корниш-Боуден Э., 1979] ДНКазной активности. Наклон кривых увеличивался с увеличением концентрации АТР. Кривые пересекались в точке, лежащей выше оси абсцисс, в области ее отрицательных значений. Анализ вторичных кривых, напоминающих гиперболу и представляющих собой графики

зависимости длины отрезка, отсекаемого от оси ординат, от концентрации АТР, позволил заключить, что смешанное (неконкурентное) ингибирование ДНКазной активности носит частичный характер [Диксон М. и др., 1982], и характеризуется константой ингибирования 0,438 мМ.

Аналогично, частичный характер носила активация эндонуклеазы АТР в отношении РНК. Как видно из рисунка 10, в присутствии АТР наклон кривых зависимости активности от концентрации РНК в координатах Лайнуивера-Берка уменьшался по сравнению с кривой в отсутствии АТР. Кривые пересекались в точках, лежащих выше оси абсцисс, в области ее положительных и отрицательных значений.

Рис. 10 Зависимость начальной скорости реакции от концентрации РНК в присутствии (линии 2-3) и отсутствии (линия 1) АТР ! - 0 мМ (контроль), 2 -0,58, 3 - 0,87 мМ нуклеотида

Вторичные графики зависимостей длины отрезка и наклона прямой ог концентрации активатора были не. линейны и свидетельствовали о случае гиперболической активации [Cleland W. W., 1979] с константой активации 0,235 мМ.

Таким образом, исследование изменения активности эндонуклеазы под действием нуклеозидтрифосфатов выявило специфичность эндонуклеазы к числу фосфатных групп в составе мононуклеотидов. В отличие от

дезоксирибонуклеозидмонофосфатов -трифосфаты не влияли на активность эндонуклеазы ни по отношению к ДНК, ни - к РНК. Напротив, АТР, в отличие от AMP/dAMP, активировал эндонуклеазу по отношению к РНК и ингибировал по отношению к ДНК по неконкуретному (смешанному) типу, при котором ингибитор обратимо взаимодействует как с ферментом, так и с фермент-субстратным комплексом, изменяя сродство фермента к субстрату, а также скорость продуктивного распада фермент-субстратного комплекса, что представлено в виде схемы на рис. 11.

си-

АТР

е-

V3 > V2 > V,

Рис. 11 Механизм регуляции активности эндонуклеазы АТР. Условные обозначения: Е - фермент, ES - фермент-субстратный комплекс, V -максимальная скорость

Выводы

1. Наличие в инкубационной среде 10-40 -кратного избытка катионов магния по отношению к содержанию фосфатных групп субстрата является оптимальным для гидролиза эндонуклеазой как ДНК, так и РНК и приводит к многократному увеличению - до сопоставимых величин - молекулярной активности фермента.

^ +

ДНК/РНК

2. Механизм регуляции активности эндонуклеазы катионами магния заключается в том, что Mg~", образуя комплексы с фосфатными группами субстрата, вызывает независимо от степени полимерности и спирализаиии субстрата такое изменение его вторичной структуры, которое приводит к многократному возрастанию скорости продуктивного распада фермент-субстратного комплекса.

3. В отсутствии Mg2' эндонуклеаза проявляет . специфичность к типу гидролизуемого субстрата, о чем свидетельствует различие каталитической константы гидролиза высокомолекулярной ДНК, суммарной и транспортной РНК, составляющей, соответственно, 6,7,1,4 и '0,07 сек на 1 мМ эндонуклеазы.

4. Прочность связывания эндонуклеазы с субстратом не зависит от информационных особенностей, степени полимерности и спирализации субстрата, а также присутствия в среде катионов магния, о чем свидетельствует идентичность ''значений • константы Михаэлиса гидролиза : высокомолекулярной ДНК, суммарной и транспортной РНК в присутствий и отсутствии Mg""V '"- И -

5. Установлено, что нуклеозидмонофосфаты не влияют на активность по отношению к ДНК и подавляют активность эндонуклеазы - к РНК, йнгибируя фермент по бесконкурентному типу в случае CMP, GMP UMP и частично конкурентному типу в случае AMP и d AMP. ■ :

6. Показано, что АТР выступает в роли положительного эффектора в присутствии РНК и отрицательного - в присутствии ДНК, ингибируя или активируя эндонуклеазу по частично смешанному типу.

Работы, опубликованные по теме диссертации

!. Шабаева Ю. Д. Сравнительный анализ субстратов в отношении активности эндонуклеазы бактерий. Serratia marcescens / Шабаева Ю. Д., Филимонова М. II. // Ученые записки КГУ. - 2005. - Т. 147, № 2. - С. 206-212. 2. Шабаева Ю. Д. Влияние мононуклеотидов на РНКазную и ДНКазную активности нуклеазы Serratia marcescens при оптимальной концентрации катионов магния / Шабаева Ю. Д., Игнатьева И. В., Филимонова М. Н. Н Ученые записки КГУ. -2006. - Т. 148, № З.-С. 138-146.

3. Романова Ю. Д. О механизме регуляции активности эндонуклеазы Serratia marcescens катионами магния / Романова Ю. Д., Губская В. П., Нуретдинов И. А., Сусарова А. А., Филимонова М. Н. // Ученые записки КГУ. - 2008. - Т. 150, № 2. -С. 176-185.

4. Шабаева Ю. Д. Антимикробный препарат / Филимонова M. Н., Ершова Е. В., Сафин Ю. И., Тойменцева А. А., Шабаева Ю. Д., Сусарова А. Н., Валеев А. Р., Угрюмова В. С., Равилов А. 3., Каримуллина И. Г., Фаткуллова А. А., Шишко А. А., Каримов М. 3. // Патент РФ № 2337139.

5. Старшинова Н. В. Биосинтез Sma nue в присутствии норсульфазола и новые свойства фермента / Старшинова Н. В., Шабаева Ю. Д., Игнатьева И. В., Сафин Ю. И., Тойменцева А. А., Филимонова M. Н. // 4-ая научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ: сб. тез. - Казань, 2004. - С. 77.

6. Шабаева Ю. Д. Исследование регуляции каталитической активности и биосинтеза бактериальной нуклеазы / Шабаева Ю. Д., Игнатьева И. В., Старшинова Н. В., Сафин Ю. И., Тойменцева А. А., Филимонова M. Н. // Научная конференция "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии": сб. тез. - Казань, 2004. - С. 105.

7. Валеев А. Р. Исследование регуляции активности нуклеазы Serratia marcescens и роста бактерий экзогенными факторами / Валеев А. Р., Ершова Е. В., Игнатьева И. В., Сафин Ю. И., Старшинова Н. В., Сусарова А. Н., Тойменцева А. А., Шабаева Ю. Д., Филимонова M. Н. // 3-я международная научная конференция "Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение": сб. тез.. - Казань, 2005. - С. 16-17.

8. Шах Махмуд Р. Биохимические свойства и биосинтез рекомбинантной эндонуклеазы Serratia marcescens / Шах Махмуд Р., Шабаева Ю. Д., Сафин Ю. И., Касимова А. А. // XLV международная научной студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс»: сб. тез. - Новосибирск, 2007. - С. 137.

9. Романова Ю.Д. Молекулярные основы широкой специфичности эндонуклеазы бактерий Serratia marcescens / Романова Ю.Д., Филимонова М.Н. // 11-й Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология наука 21 века»: сб. тез. - Пущино, 2007. - С. 157.

Отпечатана в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел: 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТРРФ, Подписано в печать 28.03.2009г. Уаи п.л 1,5 Заказ МК-6670. Тираж 70 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Романова, Юлия Джафаровна

Список сокращений.

Введение.

1 Литературный обзор.

1.1 Эндонуклеаза Serratia marcescens - уникальные свойства фермента.

1.2 Некоторые биохимические и физико-химические свойства эндонуклеазы.

1.3 Структура эндонуклеазы.

1.4 Механизм действия эндонуклеазы.

1.5 Конформационные особенности субстратов эндонуклеазы.

1.6 Взаимодействие Mg2+ и других ионов с нуклеиновыми кислотами.

2 Материалы и методы исследования.

3 Результаты исследований.

3.1 Выбор субстрата для последующих исследований.

3.2 Исследование механизма регуляции активности эндонуклеазы катионами магния.

3.2.1 Определение оптимального содержания магния для гидролиза РНК.

3.2.2 Спектральный анализ РНК и ДНК.

3.2.3 Кинетический анализ гидролиза ДНК и РНК.

3.3 Определение предпочтения субстрата при одновременном присутствии в среде ДНК и РБК.

3.4 Влияние мононуклеотидов на активность эндонуклеазы.

3.4.1 Влияние нуклеозидмонофосфатов на активность эндонуклеазы.

3.4.2 Влияние нуклеозидтрифосфатов на активность эндонуклеазы.

3.5 Обсуждение результатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы регуляции активности эндонуклеазы бактерий Serratia marcescens"

Актуальность проблемы. Эндонуклеаза бактерий Serratia marcescens — это одна из наиболее изученных бактериальных нуклеаз, проявляющих широкую субстратную специфичность, сведения о которой представлены в большинстве банков данных [Brenda; RSDB; Protein Data Bank; SCOP]. Известны многие физико-химические и биохимические свойства, структура, каталитически значимые аминокислотные остатки, разработаны модели механизма действия данного фермента [Nestle N. et al., 1969а, 1969b; Лещинская И. Б. и др., 1974; Филимонова М. Н. и др., 1980, 1981, 1995,1996, 1997, 1999, 2001, 2003; Biedermann К. et al., 1989; Miller М. D. et al., 1994; Friendhoff P. et al., 1994, 1996; Kolmes B. et al, 1996; Lunin V. Y. et al, 1997; Шляпников С. В. и др, 1999]. Эндонуклеаза S. marcescens представляет ряд эволюционно родственных и широко распространенных в мире про- и эукариот нуклеаз, различающихся физиологической ролью [Lacks S. et al, 1974, 1975; Rosenthal A. L, 1977; Low R. L. et al, 1987; Vincent R. D, 1988; Puyet A. et al, 1990; Muro-Pastor et al, 1992, 1994; Ruiz-Carrillo A. et al, 1987, 1993; Ikeda et al, 1996; Meiss G. et al, 1998; Филимонова M.H, 1999]. Эндонуклеазу производят и применяют в пчеловодстве и молекулярно-биологических исследованиях [Manual "Benzon Nuclease", 1989; Панфилова 3. И. и др, 1983; Детиненко Л.Д. и др,1995]. Продемонстрирована перспективность использования данного фермента в качестве противовирусного препарата при лечении животных [Аликин Ю. С. и др, 1998]. Установлена противоопухолевая активность [Габдуллина Г. К, 1980]. Вместе с этим механизмы регуляции активности эндонуклеазы изучены недостаточно. Недавно были установлены особенности регуляции ДНКазной активности катионами магния, а также соединениями, содержащими катионы ртути и кобальта [Филимонова М. Н. и др, 1997, 2001, Filimonova М. et al, 2003].

Недостаток информации о механизмах регуляции активности эндонуклеазы тормозит формирование объективных представлений о функционировании данного фермента вне- и внутри клетки, ограничивает эффективность и сферы его применения и, вероятно, препятствует его дальнейшему продвижению в практику. Таким образом, механизмы регуляции активности эндонуклеазы требуют углубленного исследования. Изложенное определяет актуальность настоящей работы, в которой представлены результаты анализа действия мононуклеотидов, различающихся природой азотистых оснований, углеводного остатка и числом фосфатных групп, и катионов магния на активность эндонуклеазы по отношению к субстратам, отличающимся друг от друга вторичной структурой, степенью спирализации и полимерности.

Цель работы. Целью настоящей работы стало исследование ключевых механизмов регуляции активности эндонуклеазы Serratia marcescens. В соответствии с целью решали следующие задачи:

1. Определить оптимальное соотношение Mg/Pcy6crpara для гидролиза РНК.

3. Провести кинетический анализ гидролиза высокомолекулярной ДНК, суммарной и транспортной РНК.

4. Провести оценку гидролиза ДНК и РНК при их одновременном присутствии в среде.

Научная новизна. Впервые установлено оптимальное для гидролиза РНК соотношение Mg/Ррцк- Показано, что при оптимальном для проявления активности содержании катионов магния происходит изменение вторичной структуры субстратов: высокомолекулярной ДНК - в пределах В-конформации, суммарной и транспортной РНК - в пределах А-конформации.

Установлен механизм регуляции активности эндонуклеазы катионами магния. Показано, что независимо от конформационных особенностей, степени полимерности и спирализации субстрата, прочность связывания эндонуклеазы с субстратом постоянна и не зависит от наличия в среде катионов магния. Установлено, что в отсутствии катионов магния эндонуклеаза проявляет специфичность к типу гидролизуемого субстрата. Показано, что присутствие Mg отражается на скорости распада фермент-субстратного комплекса с образованием продукта. Установлено, что нуклеозидмонофосфаты не влияют на активность эндонуклеазы по отношению к ДНК и подавляют активность - к РНК, ингибируя фермент по бесконкурентному типу в случае CMP, GMP, UMP и частично конкурентному типу в случае AMP и d AMP. Выявлено, что дезоксирибонуклеозидтрифосфаты не влияют на активность эндонуклеазы ни по отношению к ДНК, ни к РНК, а СТР, GTP, UTP - только к ДНК, и, напротив, подавляют РНКазную активность. Показано, что АТР играет роль положительного эффектора в присутствии РНК и отрицательного - в присутствии ДНК, ингибируя или активируя эндонуклеазу по частично смешанному типу. Установлены механизмы регуляции активности эндонуклеазы мононуклеотидами, различающимися типом азотистых оснований, углеводного остатка и числом фосфатных групп.

Практическая значимость. Установленные механизмы регуляции активности эндонуклеазы повышают эффективность ее применения и способствуют ее дальнейшему продвижению в практику. Результаты о I определения оптимального соотношения Mg /Ррнк были использованы при разработке антимикробного препарата на основе эндонуклеазы, защищенного Патентом РФ №2337139.

Решение поставленных задач позволило сформулировать следующие основные научные положения, выдвигаемые на защиту:

• При оптимальном для проявления активности содержании Mg2+ происходит изменение вторичной структуры субстратов. При этом прочность связывания эндонуклеазы с субстратом в отличие от скорости продуктивного распада фермент-субстратного комплекса, которая многократно меняется, не зависит от наличия в среде Mg , конформационных особенностей, степени полимерности и спирализации субстрата, что лежит в основе механизма регуляции эндонуклеазы Mg2+.

• Мононуклеотиды могут служить эффекторами эндонуклеазы, регулируя ее активность, предпочтительно по отношению к РНК, по частично конкурентному, бесконкурентному или частичному смешанному типу, что зависит от их содержания в среде и химического состава, а также содержания в среде Mg и представляет суть механизмов регуляции активности эндонуклеазы мононуклеотидами.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на научных конференциях "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2004), "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004), "Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение" (Казань, 2005), "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2007),

Биология - наука 21 века», (Пущино, 2007).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 9 работ, в числе которых 1 патент, 3 статьи, 5 тезисов.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 106 страницах и включает в себя: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, выводы, заключение, список литературы (131 источник, в том числе 84 иностранных). Диссертация содержит 11 таблиц и 24 иллюстрации.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Романова, Юлия Джафаровна

Выводы

2. Механизм регуляции активности эндонуклеазы катионами магния заключается в том, что Mg2+, образуя комплексы с фосфатными группами субстрата, вызывает независимо от степени полимерности и спирализации субстрата такое изменение его вторичной структуры, которое приводит к многократному возрастанию скорости продуктивного распада фермент-субстратного комплекса.

3. В отсутствии Mg эндонуклеаза проявляет специфичность к типу гидролизуемого субстрата, о чем свидетельствует различие каталитической константы гидролиза высокомолекулярной ДНК, суммарной и транспортной РЖ, составляющей, соответственно, 6,7, 1,4 и 0,07 сек на 1 мМ эндонуклеазы.

4. Прочность связывания эндонуклеазы с субстратом не зависит от конформационных особенностей, степени полимерности и спирализации субстрата, а также присутствия в среде катионов магния, о чем свидетельствует идентичность значений константы Михаэлиса гидролиза высокомолекулярной ДНК, суммарной и транспортной РНК в присутствии и отсутствии Mg2+.

5. Установлено, что нуклеозидмонофосфаты не влияют на активность по отношению к ДНК и подавляют активность эндонуклеазы - к РНК, ингибируя фермент по бесконкурентному типу в случае CMP, GMP UMP и частично конкурентному типу в случае AMP и d AMP.

Заключение

При решении поставленных задач были установлены ключевые механизмы регуляции эндонуклеазы: активации катионами магния; изменения активности под действием АТР; -нуклеозидмонофосфатов, представляющих собой один из вариантов продуктов гидролиза, - а также установлена субстратная специфичность эндонуклеазы и роль катионов магния в этом событии. Перечисленные результаты отличаются абсолютной новизной и носят приоритетный характер.

Схема механизма регуляции активности эндонуклеазы катионами Mg представлена на рис. 22. Суть этого механизма состоит в том, что катионы магния, образуя комплексы с фосфатными группами субстрата: ДНК или РНК,-вызывают такое изменение его вторичной структуры, которое приводит к многократному возрастанию скорости продуктивного распада фермент-субстратного комплекса. В отсутствии Mg скорость продуктивного распада фермент-субстратного комплекса зависит от типа гидролизуемого субстрата, что свидетельствует о проявлении эндонуклеазой субстратной специфичности и указывает на необходимость с оговоркой принимать распространенное мнение [Nestle N. et al., 1969; Лещинская И. Б. и др., 1974; Friedhoff P. et al., 1996; Brenda; RSDB; Protein Data Bank; SCOP] о широкой специфичности данного фермента.

Изменение активности под действием нуклеозидмонофосфатов представляет собой механизм регуляции эндонуклеазы продуктами гидролиза ДНК и РНК. Схема основных этапов этого механизма представлена на рис. 23. Согласно полученным данным, все мононуклеотиды, образующиеся в результате гидролиза ДНК или РНК, не оказывая заметного влияния на ДНКазную активность, ингибируют РНКазную активность эндонуклеазы. Причем AMP или dAMP образует комплекс с эндонуклеазой до образования фермент-субстратного комплекса, конкурируя с РНК за центр связывания, но полностью не препятствует взаимодействию фермента с субстратом, а при некоторых условиях способствует протеканию ферментативной реакции по альтернативному пути, который быстрее обычного. Напротив, GMP (dGMP), UMP(dUMP), CMP(dCMP) не способны взаимодействовать с эндонуклеазой до образования фермент-субстратного комплекса. Они бесконкурентно связываются с белковой молекулой в центре, который становится доступным лишь при образовании комплекса эндонуклеазы с РНК.

Схема регуляции ДНКазной и РНКазной активности АТР представлена на рис. 24. АТР способен взаимодействовать как с ферментом, так и с комплексом эндонуклеазы с субстратом, что изменяет сродство нуклеазы к субстрату, а также отражается на ходе продуктивного распада образовавшегося фермент-субстратного комплекса и уровне ферментативной активности. При этом связывание АТР с эндонуклеазой изменяет сродство к РНК и увеличивает РНКазную активность за счет ускорения распада тройного комплекса - АТР-фермент-субстрат, а также изменяет сродство эндонуклеазы к ДНК и уменьшает ДНКазную активность из-за замедления распада тройного комплекса.

Я"

О 0ъ Mg о I о — р—!<3

Mg о о —

Mg I

О р=0 I сня

Рис. 22 Механизм регуляции активности эндонуклеазы катионами Mg2+. Условные обозначения здесь и далее: Е - фермент, ES - фермент-субстратный комплекс V

Рис. 23 Механизм нуклеозидмонофосфатами. регуляции активности эндонуклеазы

If YY

ДНК /РНК

V > V, > V

3 2 1

Рис. 24 Механизм регуляции активности эндонуклеазы АТР. Условные обозначения: V - максимальная скорость

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Романова, Юлия Джафаровна, Казань

1. Аликин Ю. С., Серженко JI. П., Клименко В. П. Развитие технологии получения и перспективы использования эндонуклеазы Serratia marcescens // Ферменты микроорганизмов: сб. докладов 11 Всероссийской конференции. Казань, 1998. - С. 152- 163.

2. Атабеков И. Г., Бойко В. В., Волкова Т. И. Способ выращивания картофеля // 1990. А. с. № 1585328 СССР.

3. Ашмарин И. П. Молекулярная биология. JL: Изд-во Ленингр. ун-та, 1977. -368 с.

4. Балабан Н. П., Лещинская И. Б., Таняшин В. И. Действие ДНКаз на апиримидиновые ДНК // Биохимия. 1971а. - Т. 36. - № 4. - С. 727 - 731.

5. Балабан Н. П., Таняшин В. И., Лещинская И. Б. Действие ДНКаз на апуриновые ДНК//Биохимия, 19716.-Т. 36. -№ З.-С. 513-517.

6. Беляева М. И., Капранова М. И., Витол М. Я., Голубенко И. А., Лещинская И. Б. Использование нуклеиновых кислот в качестве основного источника питания бактерий // Микробиология. 1976. - Т. 45. - С. 420 - 424.

7. Благой Ю. П., Ганкин В. Л., Гладченко Г. О. Корнилова С. В., Сорокин В. А., Шкорбатов А. Г. Металлокомплексы нуклеиновых кислот в растворах. — Киев: Наук. Думка, 1991. 272 с.

8. Габдуллина Г. К. Действие нуклеазы Serratia marcescens на клетки и рост асцитной опухоли Эрлиха : автореф. дис. . канд. биол. наук-Казань, 1980. -24 с.

9. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир, 1982. - 1117 с.

10. Детиненко Л. Д., Клименко В. П., Подгорный В. Ф., Аликин Ю. С., Масычева В. И., Гробов О. Ф., Батуев Ю. М. Средство «Эндоглюкин» для профилакутики и лечения вирусных заболеваний пчел и стимуляция развития пчелиных семей // 1995. Патент РФ № 2038776.

11. Досон Р, Эллиот Д, Эллиот У, Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991.-544 с.

12. Дэвидсон Д. Биохимия нуклеиновых кислот. М.: Мир, 1976. - 412 с.

13. Иванов В.И, Минченкова JI. Е. А-форма ДНК: в поисках биологической роли // Молекулярная биология. 1994. - Т. 28. - № 6. - С. 1258 - 1271.

14. Збарский И. Б, Дебов С. С. Химия и биохимия нуклеиновых кислот М.: Медицина, 1968.-430 с.

15. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. — М.: Мир, 1990. 350 с.

16. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир, 1979. -280 с.

17. Крупянко В. И. Коррекция уравнений расчета констант двухпараметрических типов ингибирования и активации ферментов // Биохимия. 2007. - Т.60. - №3. - С. 462 - 469.

18. Ленинджер А. Основы биохимии : в 2 т. М.: Мир, 1985. - Т. 1. - 366 с.

19. Лещинская И. Б, Балабан Н. П, Егорова Г. С, Таняшин В. И, Третьяк Т. М. Получение и характеристика высокоочищенного препарата Serratia marcescens II Биохимия. 1974. - Т. 39. - №1 - С. 116 - 122.

20. Лещинская И. Б, Балабан Н. П, Таняшин В. И. Изучение расщепления Пир-3'-ф-5'-Пур связи в ДНК ДНКазами некоторых бактерий // Микробиология. 1971. - Т. XL. - вып. 5. - С. 806 - 808.

21. Лещинская И. Б, Богаутдинов 3. Ф. Нуклеазы Serratia marcescens II Микробиология. 1963. - Т. 32. - С. 412 - 415.

22. Лещинская И. Б., Таняшин В. И, Калачева Н. В, Гибадуллина А. Р. Свойства очищенной ДНКазы Serratia marcescens и характер ее действия на ДНК // Биохимия. 1967. - Т. 32. - вып. 1. - С. 93 - 97.

23. Львова Т. Н., Абросимова-Амельянчик Н. М., Татарская И.Р. Механизм образования мононуклеотидов при эндонуклеазном гидролизе // Биохимия. 1976. - Т.41. - №11. - С. 2077 - 2089.

24. Нестерова Е. Н., Чуприна В. П., Полтев В. И. Возможные В-конформации фрагментов ДНК с чередующимися пурин-пиримидиновыми последовательностями // Молекулярная биология. 1998. - Т. 32. - № 4. -С. 668 - 677.

25. Панфилова 3. И., Салганик Р. И. Получение мутантов Serratia marcescens суперпродуцентов эндонуклеазы путем воздействия нитрозометилмочевиной на синхронизированную культуру // Микробиология. 1983. - Т. 52. - С. 974 - 978.

26. Педерсен Ю., Филимонова М., Роепсторф П., Бидерманн К. Характеристика изоформ нуклеазы Serratia marcescens электроспрей масс-спектрометрией // Биохимия. 1995. - Т.60. - № 3. - С. 462 - 469.

27. Полидорова О. И., Салганик Р. И., Сенженко Л. П., Старостина В. К. Способ выделения эндонуклеазы // 1984. А. с. № 537512 СССР.

28. Порфирьева О. В., Юсупова Д. В., Особенности физиологии беспигментного штамма Serratia marcescens 24 — продуцента эндонуклеазы

29. Нуклеазы. Биологическая роль и практическое использование: сб. науч. тр.-Киев, 1985.-С. 48-51.

30. Серебров В. Ю., Василенко К. С., Холод Н. С., Киселев JI. JI. Ионы Mg2+ по-разному влияют на физические свойства тРНКРЬе и транскрипта ее гена // Молекулярная биология. 1997. - Т. 31. - вып. 5. - С. 894 - 900.

31. Сиянова Н. С., Невзорова Т. А., Неструева С. Н. Методическое руководство по биохимии: учебно-методическое руководство. Казань: КГУ, 2008.-46 с.

32. Филимонова М.Н. Эндонуклеаза бактерий Serratia marcescens в эволюционном ряду родственных нуклеодеполимераз : автореф. дис. . док. биол. наук Казань, 1999. - 47 с.

33. Филимонова М. Н., Балабан Н. П., Шарипова Ф. Р., Лещинская И. Б Получение нуклеазы Serratia marcescens в гомогенном состоянии и изучение физико-химических свойств фермента // Биохимия. 1980. - Т.45. -mi.-С. 2096-20103.

34. Филимонова М.Н., Баратова Н.П., Воспельникова Н.Д., Желтова А.О., Лещинская И.Б. Эндонуклеаза Serratia marcescens. Характеристика фермента // Биохимия. 1981. - Т. 46. - вып. 9. - С. 1660 - 1666.

35. Филимонова М. Н., Бенедик М. Дж. Нуклеаза Serratia marcescens. Отношение концентраций фермента и субстрата для проявления максимальной активности // Биохимия. 1995. - Т. 60. - вып. 9. - С. 1449 -1500.

36. Филимонова М. Н., Бенедик М. Дж., Уразов Н. Г., Лещинская И. Б. Полидисперсность нуклеаза Serratia marcescens при оптимальном значении рН // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. - Т. 35. - №. 1.-С. 20-24.

37. Филимонова М. Н., Дементьев А. А., Лещинская И. Б., Бакулина Г. Ю., Шляпников С. В. Выделение и характеристика изоформ внеклеточной нуклеазы Serratia marcescens II Биохимия. 1991. - T.56. - № 3. — С. 508 — 520.

38. Филимонова М. Н., Гарусов А. В., Сметанина Т. А., Андреева М. А., Богомольная Л. М., Лещинская И. Б. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens. Сравнительный анализ субстратной специфичности // . — 1996. -Т. 61.-вып. 10.-С. 1800- 1805.

39. Филимонова М. Н., Губская В. П., Нуретдинов И. А., Бенедик М. Дж., Богомольная Л. М., Андреева М. А., Лещинская И. Б. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens. Роль ионов Mg в механизме гидролиза // Биохимия. -1997. Т. 62. - вып. 9. - С. 1148 - 1154.

40. Филимонова М. Н., Губская В. П., Нуретдинов И. А., Бенедик М. Дж., Черепанова Н. П., Лещинская И. Б. Изучение механизма действия пара-хлоромеркуриобензоата на эндонуклеазу бактерий Serratia marcescens Н Биохимия. 2001. - Т. 66. - №3. - С. 399 - 404.

41. Филимонова М. Н., Уразов Н. Г. Эндонуклеаза Serratia marcescens. Определение димеров // Ферменты микроорганизмов : сб. ст. Казань, 1998. -С. 89-94.

42. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. М: Мир, 1980. - 582 с.

43. Arnott S. Polynucleotide secondary structures: an historical perspective. Oxford handbook of nucleic acid structure. N-Y.: Oxford University Press, 1999. - P. 1-38.

44. Baase W. A., Jonson W. C. Circular dichroism and DNA secondary structure // Nuc. Acid Res. 1979. - V. 6. - № 2. - P. 797 - 814.

45. Ball Т. K., Saurugger P. N., Benedik M. J. The extracellular nuclease gene of Serratia marcescens and its secretion from Escherichia coli // Gene. 1987. - V. 57.-P. 183- 192.

46. Benedik M. J., Strych U. Serratia marcescens and its extracellular nuclease I I FEMS microbiology letters 1998. - V. 165. - P. 1 - 13.

47. Berman II. M., Schneider B. Nucleic acid hydration. Oxford handbook of nucleic acid structure. N-Y.: Oxford University Press, 1999. - P. 295 - 312.

48. Biedermann K., Jepsen P., Riise E., Svendsen I. Purification and characterization of Serratia marcescens nuclease produced by Escherichia coli II Carlsberg Res. Commun. 1989. -V. 54. - P. 17 - 27.

49. Biedermann K., Nielsen B. R. Homogeneity analysis of a nuclease secreted by E. coli II Parm. Technol. Int. 1990. - V. 2. - P. 37-41.

50. Brenda electronic resourse. : [The comprehensive enzyme informational system] // Braunschweig: TU Braunschweig Dept. of Bioinformatics. электон. дан. - URL : http://www.brenda-enzvmes.org (дата обращения: 01.02.2009).

51. Bukin V. A., Kankiya В. I., Rentzeperis D., Marky L. A. Mg" recognizes the sequence of DNA through its hydration shell // J. Am. Chem. Soc. 1994. - V. 116.-P. 9423-9429.

52. Calladine C. R. Mechanics of sequence-dependent staking of bases in B-DNA // J. Mol. Biol. 1982. -V. 161. - P. 343- 352.

53. Chan A., Kilkuskie R., Hanlon S. Correlation between the duplex winding angle and the circular dichroism spectrum of calf thymus DNA // Biochemistry. -1979.-V. 18.-P. 84-91.

54. Chen Y. C., Shipley G. L., Ball Т. K., Benedik M. J. Regulatory mutants and transcriptional control of the Serratia marcescens extracellular nuclease gene // Mol. Microbiol. - 1992. - V. 6. - № 5. - P. 643 - 651.

55. Chiu Т. K., Dickerson R. E. 1 A crystal structures of B-DNA reveal sequence-specific binding and groove-specific bending of DNA by magnesium and calcium // J. Mol. Biol. 2000. - V. 301. - P. 915 - 945.

56. Cleland W. W. The kinetics of enzym-catalyzed reactions with two or more substrates and products. II. Inhibition: nomenclature and theory // Bioch. Biophys. Acta. 1963. -V. 67. - P. 173 - 187.

57. Cleland W. W. Steady state kinetics // Methods in enzymology / ed. by P. D. Boyer-N.-Y.: Academic Press, 1979.-V. 63, Part 1.-P. 5-41.

58. Conte M. R., Conn G. L., Brown Т., Lane A. N. Hydration of the RNA duplex r(CGCAAAWUGCG)2 determined by NMR // Nucleic Acids. Res. 1996. -V.24. - N. 19. - P. 3693 - 3699.

59. Dake E., Hofmann T. J., Mclntire S., Hudson A., Zassenhaus H. P. Purification and properties of the major nuclease from mitihondria of Saccharomyces cerevisiae 11 J. Biol. Chem. 1988. -V. 263.-N. 16. - P. 7691 -7702.

60. Dickerson R. E. Base sequence and helix structure variation in B-DNA and A-DNA//J. Mol. Biol. 1983.-V. 166.-P. 419-441.

61. Dickerson R. E, Drew H. R, Conner B. N, Wing R. M, Fratini A. V, Корка M. L. The anatomy of A-, B-, and Z-DNA // Science. 1982. - V. 216. - P. 475- 485.

62. Diekmann S. Definitions and nomenclature of nucleic-acid structure parameters// J. Mol. Biol. 1989. - V. 205. - P. 787 - 791.

63. Dove W. F, Davidson N. Cation effects on the denaturation of DNA // J. Mol. Biol. 1962. - V. 5. - P. 467 - 478.

64. Drew H. R, Travers A. A. DNA structural variations in the E. Coli tyrT protomer // Cell. 1984. - V. 37. - № 6. - P. 491 - 502.

65. Drew H. R, Wing R. M, Takano T, Broka C, Tanaka S, Itakura K, Dickerson R. E. Structure of a B-DNA dodecamer: conformation and dinamics // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - V. 78. - № 4. - P. 2179 - 2183.

66. Duguid J. G, Bloomfield V. A. Electrostatic effects on the stability of condensed DNA in the presence of divalent cations // Biophys J. 1996. - V. 70.- № 6. P. 2838-2846.

67. Eaves G.N, Jeffries C. D. Isolation and properties of an exocellular nuclease of Serratia marcescens 11 J. Bacteriol. 1963. - V. 85. - P. 273 - 278.

68. Egli M. Portmann S, Usman N. RNA hydration: a detailed look // Biochemistry.- 1996. V. 35. - № 26. - P. 8489 - 8494.

69. Ennifar E, Walter P, Dumas P. A crystallographic study of the 13 metal ions to two related RNA duplexes // Nucleic Acids. Res. 2003. - V. 31. - N. 10. - P. 2671 -2682.

70. Filimonova M, Gubskaya V, Davidov R. Metal binding induces conversion of B- to the hybrid BZ-form in natural DNA // International Journal of Biological Macromolecules. 2008. - V. 43 - P.289 - 294.

71. Filimonova M, Gubskaya V, Nuretdinov I, Leshchinskaya I. Action of hexaamminocobalt on the activity of Serratia marcescens nuclease // BioMetals.- 2003. V. 16. - P. 447 - 453.

72. Filimonova M. N., Krause К. L., Benedik M. J. Kinetic studies of the Serratia marcescens extracellular nuclease isoforms // Biochem. and Mol. Biol. Int. -1994. V.33. - №. 6. - P. 1229 - 1236.

73. Filimonova M., Gubskaya V., Davidov R., Garusov A., Nuretdinov I. Metal binding induces convertion of B-to the hybrid B-Z-form in natural DNA // Int. J. Biol. Macromolecules 2008. - V. 43. - № 3. - P. 289 - 294.

74. Foloppe N., MacKerell A. D. Intinsic conformational properties of deoxyribonucleosides: implicated role for cytosine in the equilibrium among the А, В and Z forms of DNA // Biophis. J. 1999. - V. 76. - P. 3206 - 3218.

75. Franke I., Meiss G., Pingoud A. On the advantage of being a dimer, a case study using the dimeric Serratia nuclease and the monomeric nuclease from Anabaena sp. strain PCC 7120 // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - № 2. - P. 825 - 832.

76. Franklin R. E., Gosling R. G. The structure of sodium thymonucleate fibers: I. The influence of water content // Acta Cristallogr. 1953. - V. 6. - P. 673 - 677.

77. Friedhoff P., Kolmes В., Gimadutdinow O., Wende W., Krause K., Pingoud A. Analisis of the mechanism of the Serratia nuclease using site-directed mutagenesis // Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - № 14. - P. 2632 - 2639.

78. Friendhoff P., Meiss G., Kolmes В., Pieper U., Gimadutdinow O., Urbanke K., Pingoud A. Kinetic analisis of the cleavage of natural and synthetic substrates by the Serratia nuclease II Eur. J. Biochem. 1996. - V. 241. - P. 572 - 580.

79. Gorin A. A., Zhurkin V. В., Olson W. K. B-DNA twisting correlates with base-pair morphology // J. Mol. Biol. 1995. - V. 247. - P. 34 - 48.

80. Ghosh M., Meiss G., Pingoud A., London R. E., Pedersen L. C. Structural insights into the mechanism of nuclease A, a J3f3a metal nuclease from Anaebaena II J. Biol. Chem. 2005. - V. 280. - N. 30. - P. 27990 - 27997.

81. Helm M. Post-transcriptional nucleotide modification and alternative folding of RNA // Nucleic Acids Research. 2006. - V. 34. - № 2. - P. 721 - 733.

82. Hunter C. A., Lu X. R. DNA base stacking interactions: a comparison of theoretical calculations with oligonucleotide crystal structures // J. Mol. Biol. -1997.-V. 265.-P. 603-619.

83. Ikeda S., Maeda N., Ohshima Т., Takata N. Identification and characterization of a mitochondrial endonuclease from yeast Schizosaccharomyces pombe II Biochem. Mol. Biol. Int. 1996. -V. 40. - P. 1017 - 1024.

84. Johnson B.B., Dahl K.S., Tinoco I. Jr., Ivanov V.I., Zhurkin V.B. Correlation between deoxyribonucleic acid structural parameters and calculated circular dichroism spectra // Biochem. 1981. - V. 20. - P. 73 - 78.

85. Kolmes В., Franke I., Friedhoff P., Pingoud A. Analysis of the reaction mechanism of the non-specific endonuclease of Serratia marcescens using an artificial minimal substrate 11FEBS Lett. 1996. - V. 397. - P. 343 - 346.

86. Lacks S., Greenberg В., Neuberger M. Identification of a deoxyribonuclease implicated in genetic transformation of Diplococcus pneumoniae I I J. Bacteriol. -1975.-V. 123.-P. 222-232.

87. Lacks S., Greenberg В., Neuberger M. Role of a deoxyribonuclease in the genetic transformation of Diplococcus pneumoniae И Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1974. - V. 71. - P. 2305 - 2309.

88. Low R. L., Cummings O. W., King Т. C. The bovine mitochondrial endonuclease prefers a conserved sequence in the displacement loop region of mitochondrial DNA // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262. - № 33. - P. 16164 -16170.

89. Lescrinier E., Froeyen M., Herdewijn P. Difference in conformational diversity between nucleic acids with a six-membered "sugar" unit and natural "furanose" nucleic acids // Nucleic Acids Research. 2003. - V. 31. - № 12. - P. 2975 -2989.

90. Li C. L., Hor L. I., Chang Z. F., Tsai L. C., Yang W. Z., Yuan H. S. DNA binding and cleavage by periplasmic nuclease Vvn: a novel structure with a known active site // EMBO J. 2003. - V. 22. - № 15. - P. 4014 - 4025.

91. Manual "Benzon nuclease" // Darmstadt: Merck, 1989. 1 p.

92. Meiss G., Friedhoff P., Hahn M., Gimadutdinow O., Pingoud A. Sequencepreferences in cleavage of dsDNA and ssDNA by the extracellular Serratiamarcescens endonuclease // Biochemistry. 1995. - V. 34. - P. 11979 - 11988.

93. Miller M. D, Benedik M. J., Sullivan M. C.5 Shipley N. S., Krause K. L. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of a novel nuclease from Serratia marcescens 11 J. Mol. Biol. 1991. - V. 222. - P. 27 - 30.

94. Miller M. D., Krause K. L. Identification of the Serratia endonuclease dimer: structural basis and implication for catalysis I I Protein Science. 1996. - V. 5. -P. 24-33.

95. Miller M., Tanner J., Alpaugh M., Benedik M., Krause K. 2.1 A0 structure of Serratia endonuclease suggests a mechanism for binding to double-stranded DNA//Nature Struc. Biol. 1994.-N. 1. - P. 461 - 468.

96. Muro-Pastor A. M., Flores E., Herrero A., Wolk C. P. Identification, genetic analysis and characterization of a sugar-non-specific nuclease from cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 // Mol. Biol. 1992. - V. 6. - P. 3021 -3030.

97. Muro-Pastor A. M., Kuritz Т., Flores E., Herrero A., Wolk C. P. Transfer of a genetic marker Anabaena sp. PCC 7120 to a megaplasmid of a different Anabaena strain // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - № 4. - P. 1093 - 1098.

98. Nestle M., Roberts W. An extracellular nuclease from Serratia marcescens. I. Purification and some properties of the enzyme // J. Biol. Chem. 1969a. - V. 244.-№19.-P. 5213 -5218.

99. Nestle M., Roberts W. An extracellular nuclease from Serratia marcescens. II. Specificity of the enzyme // J. Biol. Chem. 1969b. - V. 244. - № 19. - P. 5219-5225.

100. Ng H. L., Корка M. L., Dickerson R. E. The structure of a stable intermediate in the A-B DNA helix transition // Proc. Natl. Acad. Sci. USA -2000. V. 97. - P. 2035 - 2039.

101. Packer M. J., Hunter C. A. Sequence-dependent DNA structure: the role of the sugar-phosphate backbone // J. Mol. Biol. 1998. - V. 280. - P. 407 - 420.

102. Pastor N. The B- to A-DNA transition and the reorganization of solvent at the DNA surface // Biophys. J. 2005. - V. 88. - № 5. - P. 3262 - 3275.

103. Polyanichko A. M., Andrushchenko V. V., Chikhirzhina E. V., Vorob'ev V. I., Wieser H. The effect of manganese (II) on DNA structure: electronic and vibrational circular dichroism studies // Nucleic Acids. Res. 2004. - V.32. - N. 3.-P. 989-996.

104. Premilat S., Albiser G. Conformations of A-DNA and B-DNA in agreement with fiber X-ray and infrared dichroism // Nucleic Acids. Res. 1983. - V.l 1. -N. 6.-P. 1897- 1908.

105. Protein Databank in Europe electronic resourse. 11 European Bioinformatics Institute, 2006. URL : http://www.ebi.ac.uk/pdbe/ (дата обращения: 01.02.2009).

106. Rudolph F. B. Product inhibition and abortive complex formation // Methods in enzymology / ed. by D. L. Purich. N. - Y.: Academic Press, 1979. - V. 63, Part 16.-P. 411 -440.

107. Puyet A., Greenberg В., Lacks S. A. Genetic and structural characterization of End A, a membrane-bound nuclease required for transformation of Streptococcus pneumoniae // J. Mol. Biol. 1990. - V. 213. - P. 727 - 738.

108. RCSB electronic resourse. : [Protein Data Bank] // Rutgers: State University of New Jersey. электрон. дан. - URL : http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do (дата обращения: 01.02.2009).

109. Robinson H., Gao Y.-G., Shanishvili R., Joachimiak A., Wang A. H-J. Hexagidrated magnesium ions bind in the deep major groove and at the outer mouth of A-form nucleic acid duplexes // Nucleic Acids. Res. 2000. - V.28. -N. 8.-P. 1760- 1766.

110. Ruiz-Carrillo A., Cote J. Primers for mitochondrial DNA replication generated by endonuclease G //EMBO J. 1987. - V. 6. - N. 2. - P. 401 - 407.

111. Ruiz-Carrillo A., Renaud J. Endonuclease G: a (dG)n-(dC)n-specific DNase from higher eukaryotes // Science. 1993. - V. 261. - P. 765 - 769.

112. Saenger W., Hunter W. N., Kennard O. DNA conformation is determined by economics in the hydration of phosphate groups // Nature. 1986. - V. 324. - P. 385 -388.

113. Schneider В., Cohen D. M., Schleifer L., Srinivasan A. R., Olson W. K., Berman H. N. A systematic method for studying the spatial distribution of water molecules around nucleic acid bases // Biophys. J. 1993. - V. 55. - P. 2291 -2303.

114. Schneider В, Patel К, Berman H. N. Hydration of the phosphate group in double-helical DNA // Biophys. J. 1998. - V. 75. - P. 2422 - 2434.

115. SCOP electronic resourse. : [Structural classification of protein] // Cambridge: MRC Laboratory of Molecular Biology. электрон, дан. - URL : http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/index.html (дата обращения: 01.02.2009).

116. Suh Y, Jin S, Ball Т. K, Benedik M. J. Two-step secretion of the Serratia marcescens exstracellular nuclease // J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - № 13. - P. 3771 -3778.

117. Tolstorukov M. Y, Ivanov V. I, Malenkov G. G, Jernigan R. L, Zhurkin V. B. Sequence-dependent B-A transition in DNA evaluated with dimeric and trimeric scales // Biophys J. 2001. -V. 81. - № 12. - P. 3409-3421.

118. Vargason J. M, Henderson К, Ho P. S. A crystallographic map of the transition from B-DNA to A-DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001. - V. 98. -P. 7265-7270.

119. Vincent R. D, Hofmann T. J, Zassenhaus H. P. Sequence and expression of NUC 1, the gene encoding the mitochondrial nuclease in Saccharomyces cerevisiae II Nucleic Acids. Res. 1988. - V. 16. - P. 3297 - 3312.

120. Wu S. I, Lo S. K., Shao С. P, Tsai H. W, Hor L. I. Cloning and characterization of a periplasmic nuclease of Vibrio vulnificus and its role in preventing uptake of foreign DNA // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67. -P. 82-88.

121. Xu Q, Shoemaker R, Braunlin W. H. Induction of B-A transition of deoxyoligonucleotides by multivalent cations in dilute aqueous solution // Biophys J. 1993. - V. 65. - P. 4083 - 4088.

122. Yanagi K, Prive G. G, Dickerson R. E. Analysis of local helix geometry in three B-DNA decamers and 8 dodecamers // J. Mol. Biol. 1991. - V. 217. - P. 201-214.

123. Yonemura К., Matsumoto К., Maeda H. Isolation and characterization of nuclease from a clinical isolate of Serratia marcescens kums 3958 // J. Biochem. 1983. - V. 93. - P. 1287 - 1295.

Информация о работе

Романова, Юлия Джафаровна
кандидата биологических наук
Казань, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Механизмы регуляции активности эндонуклеазы бактерий Serratia marcescens - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно