Механизмы действия оксида азота на мембраны нервных клеток

Браже, Надежда Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы действия оксида азота на мембраны нервных клеток
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы действия оксида азота на мембраны нервных клеток"

На правах рукописи

БРАЖЕ Надежда Александровна

МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ОКСИДА АЗОТА НА МЕМБРАНЫ НЕРВНЫХ МЕТОК

03.00.02 — Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

гаоота выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета им М. В. Ломоносова

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Георгий Владимирович Максимов

доктор биологических наук, профессор

Андрей Александрович Каменский

доктор биологических наук, профессор

Анатолий Николаевич Саприн

Ведущая организация-

Биологический факультет Мордовского государственного университета

им. Н П. Огарева (г. Саранск)

Защита состоится " " 2006 г. в /У ч. мин на

заседании Диссертационного совета Д 501.001 96 при кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета им. М.В Ломоносова по адресу. 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория «Новая»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета

им. М В.Ломоносова.

Автореферат разослан " /3 " № 2006.

I [^У^А-х^г

Ученый секретарь Диссертационного совета 1 ^

доктор биологических наук, профессор Т. Е Кренделева

¿oe>6 А

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы

Оксид азота (II) (N0) является важной регуляторной внутри-и межклеточной сигнальной молекулой в нервной системе. Характерной особенностью N0 является взаимодействие с различными молекулами и влияние на многочисленные процессы, протекающие на плазматической мембране и в цитоплазме клеток. Действие N0 осуществляется по двум механизмам: опосредованно через активацию растворимой гуанилатциклазы и синтез ц-ГМФ, а также при непосредственном взаимодействии N0 с тиолами, отрицательно заряженными группами белков и липидов, гемопорфиринами, аминами, ароматическими соединениями и железо-серными (РегЭг) кластерами [Garhwaite et al., 1988; Stamler et al., 1992; Wykes et al., 2002]. В зависимости от условий (концентрации и длительное ги действия N0, отдела нервной системы, типа клеток и содержания глутатиона) N0 обладает как регуляторным, так и токсическим действиями [Гурин, 1997; Каменский и Савельева, 2002; Jacobson et al., 2005; Hsu et al., 2005]. Влияние NO на клетки связывают, в первую очередь, с изменениями электрофизиологической активности и энергообеспечения нейронов за счет взаимодействия N0 с белками плазматической и митохондриальной мембран [Vidwans et al., 1999; Moneada & Bolanos, 2006]. Показано, что изменение электрофизиологической активности нейронов под влиянием N0 связано с его действием на ионные каналы и рецепторы плазматической мембраны. Известно, что N0 активирует Ка+-каналы постоянного тока, вызывая деполяризацию нейронов, а с другой стороны, инактивирует NMDA-рецепторы глутамата, уменьшая вход Са2+ в нейроны и препятствуя деполяризации постсинаптической мембраны [Lei et al., 1992; Ahern et al., 2000]. При этом, недостаточно исследовано влияние N0 на потенциалзависимые К+-каналы нейронов, играющие основную роль в формировании мембранного потенциала и участвующие в проведении нервного импульса, а также действие N0 на интегральные свойства клеточных мембран (микровязкость и поверхностный заряд), связанные с активностью мембранных белков.

Известно, что N0 реагирует с т у^ЦГ Ь'Ац'ии^л""™^")И

6ИВЛИОТЕКАНЛа

С.-Петербург

ОЭ 200

кластерами в комплексах 1-1У дыхательной цепи и аконитазе цикла Кребса митохондрий, выделенных из нейронов и глиальных клеток, и приводит к ингибированию этих ферментных комплексов [Егестзка е! а1., 1995; Во1апов et а!., 1997]. Однако, влияние N0 на энергетическое состояние митохондрий в изолированных нейронах и препаратах с сохраненными межклеточными связями практически не исследовано.

N0, образующийся при повышенной нейрональной активности и гипоксии, выходит в кровеносное русло, связывается с гемоглобином и переносится в другие ткани [Китига et а!, 1994; Лапша и др., 2003; Ра11ег et а1., 2004]. Предполагается, что N0 усиливает кислородоснабжение тканей без увеличения просвета сосудов [Ковака е! а1., 1996], при этом механизм действия N0 на кислород-связывающие свойства гемоглобина и эффективность выделения Ог в тканях остается мало изученным.

В настоящее время проводится недостаточно комплексных исследований для выяснения механизмов действия N0 на функционирование нейронов в полунативной системе. При этом, подобные исследования важны в связи с тем, что N0 оказывает влияние на совокупность взаимосвязанных процессов, протекающих на плазматической мембране и в цитоплазме нейронов: активность потенциалозависимых каналов, количество мембра-носвязанных ионов и вязкость мембраны, энергетическое состояние митохондрий и свойства внутриклеточных мембран.

1.2. Цели исследования

Цель работы заключалась в сравнительном исследовании действия оксида азота на электрическую активность, состояние плазматической мембраны, внутриклеточных органоидов и цитоплазмы нервных клеток и эффективность переноса Ог гемоглобином эритроцитов.

Для осуществления данной цели были поставлены следующие задачи:

1. исследовать действие оксида азота на возбудимость нервных клеток, активность потенциалзависимых К+-каналов и содержание Са2+, связанного на плазматической мембране идентифицированных нейронов, немиелиновых и миелиновых нервных волокон;

2. исследовать действие N0 на процессы, определяющие энергообеспечение нейронов: изменение потенциала внутренней митохондриаль-

ной мембраны и его распределение по клетке и соотношение концентраций ФАД+/ФАД Н2 в митохондриях, а также вязкость мембраны цитосом;

3. исследовать влияние N0 на регулярные флуктуации показателя преломления в примембранной и цитоплазматической областях нейронов и установить природу этих изменений;

4. изучить действие N0 и условий, приводящих к повышенному синтезу N0 в нервных клетках, на кислород-связывающие свойства гемоглобина.

1.3. Научная новизна работы

Впервые проведено комплексное исследование действия оксида азота на функционирующие нейроны и нервные волокна в препарате с сохраненными межклеточными связями. Показано, что N0 вызывает активацию потенциалзависимых К+-каналов, обусловленную прямым действием N0 на канал, а также уменьшение количества мембраносвязанного Са2+, зависящее от активности К+-каналов и типа плазматической мембраны. Обнаружено, что N0 влияет на процессы энергообеспечения нейрона: приводит к деполяризации митохондрий, уменьшению соотношения концентраций ФАД+/ФАД Нг в митохондриях, а также вызывает изменение вязкости мембраны цитосом, связанное с перераспределением цитоплазматического Са2+.

Впервые выявлены регулярные изменения показателя преломления цитоплазмы и плазматической мембраны нейрона, которые при действии N0 исчезают в примембранной области на частоте 1 Гц и амплитуда которых увеличивается в примембранной и цитоплазматической областях на частоте 15-26 Гц. Установлено, что флуктуации показателя преломления в примембранной области с частотой 1 Гц связаны с изменением мембранного потенциала.

Впервые показано, что повышение содержания N0 в крови (при активации синтеза N0 в мозге и действии доноров N0) приводит к уменьшению сродства гемоглобина к кислороду.

1.4. Научно-практическая ценность работы

Полученные данные вносят существенный вклад в понимание мехаг низмов комплексного действия оксида азота в нервной системе. Результаты работы, демонстрирующие, что действие N0 на нейрон сопровождается изменением свойств плазматической мембраны (возбудимости, активности Ку-каналов, вязкости мембраны и количества мембраносвязанного Са2+) и внутриклеточных мембран (энергетического состояния митохондрий и вязкости мембраны цитосом), являются существенными при разработке новых лекарств—доноров N0.

Анализ динамики показателя преломления в примембранной области нейронов позволяет получить информацию об изменении мембранного потенциала, что может быть использовано при исследовании электрофизиологической активности клеток.

Полученные данные о действии N0 на кислород-связывающие свойства гемоглобина показывают, что сосудорасширяющие препараты, действие которых связано с выделением N0, оказывают влияние на гемоглобин эритроцитов и уменьшают его сродство к Ог, что необходимо учитывать при разработке и применении новых лекарственных NO-содержащих соединений.

1.5. Апробация работы

Результаты работы были представлены на конференции «Биотехнология на рубеже тысячелетий» (Саранск, 2001 г.), международной конференции молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2002 г.), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004 г.), 4-ом форуме Федерации Европейских обществ нейронаук (Лиссабон, 2004 г.), 5-ой международной конференции по биологической физике (Гетеборг, 2004 г.), 5-ой международной конференции по клинической гемореологии (Чонгквингч 2005 г.), 25-ой Европейской конференции «Dynamic Days» (Берлин, 2005 г.), 6-ом симпозиуме «Neural Coding» (Марбург, 2005 г.), 20-ом Съезде Международного и Европейского обществ нейрохимии (Инсбрук, 2005 г.), 15-ом и 5-ом Объединенном Конгрессе Международного союза фундаментальной и прикладной биофизики и Ассоциации европейских биофизических обществ (Монпелье, 2005 г.), 1-ой конференции BioSim (Пальма-де-Майорка, 2005 г), 5-ом форуме Федерации Европейских обществ нейронаук (Вена, 2006 г.), секции «Биофи-

зика» Московского общества испытателей природы и научных семинарах кафедры биофизики биологического факультета МГУ и физического факультета Датского технического университета.

1.6. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 17 работ, из них 6 статей в отечественных и зарубежных журналах.

1.7. Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована рисунками и 3 таблицами. Список литературы включает /&Z источника.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования служили идентифицированные пейсмек-керные нейроны (Ретциус (11г)-клетки) в составе сегментальных ганглиев медицинской пиявки Hirudo medicinalis, ганглии окологлоточного нервного кольца прудовика Lymnaea stagnalis, изолированные Rz-нейроны пиявки и мотонейроны педального ганглия прудовика, седалищные нервы и изолированные нервные волокна травяной лягушки Rana temporaria Нервные клетки медицинской пиявки и обыкновенного прудовика являются удобными объектами для изучения механизмов действия N0, поскольку в них, как и в нейронах млекопитающих, N0 участвует в регуляции экзоцитоза медиаторов и нейропептидов, синаптической передаче и распространении нервного импульса [Moroz et al., 1993; Salzet et al., 1998; Дьяконова, 2002]. В экспериментах по исследованию действия N0 на свойства гемопорфирина гемоглобина и вязкость плазматической мембраны эритроцитов использовали кровь и эритроцитарную массу беспородных кролика и крысы. Церебральную ишемию у крыс вызывали, создавая одномоментную полную окклюзию общих сонных артерий, постишемическую реперфузию — путем последующего освобождения артерий [Приезжев и др., 2004].

В работе использовали следующие методы:

— Активность одиночных потенциалзависимых К+-каналов (Ку) нейронов исследовали методом пэтч-клямп в конфигурации « inside-out » [Казаченко и Гелетюк, 1982];

— Возбудимость нервов исследовали с помощью монополярного внеклеточного отведения потенциала [Тасаки, 1957];

— Содержание мембраносвязанного Са2+ (Са^ ) в нейронах и нервных волокнах, а также изменение потенциала внутренней митохондриальной мембраны (ДФШ) изучали методом флуоресцентной микроскопии с использованием зондов хлортетрациклина (ХТЦ) [Caswell к Hutchison, 1971]) и родамина 123 (Rh 123) [Toescu к Verkhratsky, 2000]). Соотношение количеств окисленных/восстановленных флавопротеинов (ФАД+/ФАДН2) нейронов оценивали по сигналу автофлуоресценции [Reinert et al., 2004];

— ЗБ-структуру распределения ДФт в нейронах исследовали методом лаг зерной сканирующей конфокальной микроскопии с использованием зонда Rh 123 [Rintoul et al., 2006];

— Микроспектрометрическое исследование нейронов осуществляли с помощью микроскопа Leitz MPV-2, оснащенного дифракционным монохро-матором и системой Ocean Optics USB 2000;

— Вязкость плазматической мембраны нервных волокон и мембран ци-тосом нейронов, а также кислород-связывающие свойства гемоглобина и содержание комплексов гемоглобин-NO изучали методом комбинационного рассеяния (КР) [Maxwell к Caughey, 1976; Соловьев и др., 1985; Maksimov et al., 1990; Максимов и др. 2000];

— Распределение показателя преломления в нейронах и регулярные изменения показателя преломления в примембранной области и цитоплазме исследовали методом лазерной интерференционной микроскопии [Andreev, et al., 2003]. Анализ динамики показателя преломления проводили методами вейвлет- и двойного вейвлет-преобразования [Sosnovtseva et al., 2004];

— Вязкость плазматической мембраны эритрбцитов исследовали методом электронного парамагнитного резонанса с использованием спиновых зондов 5-и 16-доксилстеариновых кислот [Максимов и др., 2005];

— Концентрации NO, образующегося при распаде доноров, определяли при помощи NO-селективного электрода ISO-NOPMC и анализатора Apollo 4000 Free Radical Analyzer (WRI, USA) [Chang, 2004].

В качестве доноров оксида азота использовали нитропруссид на-

трия (НП), ^2[Ре(С1^)5Ш]-2Н20, и спермин-1ЧОШат (спермин/Ш), СюНгб^бОг, [НгаЫе et а!., 1993; Массагопе et а!., 1996]. В водном растворе НП и спермин/^ТО выделяют N0, при этом оксид азота, образующийся из НП, может превращаться в ион нитрозония (1Ч0+), что не наблюдается для спермин/КО [Ьит et а1., 2005; УИмгапв а1., 1999]. Было показано, что из НП при концентрациях 10~6-10-3 моль/л образуется (2,6 — 44,4) х Ю-8 моль/л N0, из спермин/МО при концентрациях 10~5-10~3 моль/л — (5,7 - 70) х Ю-8 моль/л N0. Указанные концентрации N0 оставались постоянными в течение эксперимента и соответствовали установленным концентрациям N0 в нервной системе пиявки [Ьеаке et а!., 1995]. В качестве контроля на действие N0 использовали феррицианид натрия, ^зРе(СМ)б, и сульфо-МСЖОат натрия, N2058^2- В экспериментах по исследованию действия N0 на свойства гемоглобина использовали нитропруссид натрия, хМедиципский препарат изокет (действующее вещество — изосорбид динитрат, СвНв^Ов) и тетранитрозильный комплекс железа ТНКЖ (Маарег^ОзМШ^ННгО).

Статистическую обработку данных проводили с использованием 1;-теста Стьюдента. Данные представлены как среднее±стандартная ошибка среднего. Различия считались значимыми при р<0,05.

3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование действия N0 на свойства плазматической мембраны нейронов и нервных волокон

Плазматическая мембрана нервных клеток содержит большое число молекул-мишеней для N0, изменение свойств которых может приводить к изменению функционирования клеток [\/1сЬуап8 et а1., 1999; АЬегп а!., 2000]. В первой серии экспериментов исследовали действие N0 на активность быстрых Ку-каналов изолированных Нг-нейронов и содержание мем-браносвязанного Са2+ в Иг-нейронах в составе ганглия с сохраненными межклеточными связями, а также возбудимость, микровязкость и количество мембраносвязанного Са2+ нервных волокон.

В ходе исследования было показано, что N0 активирует Куканалы Яг-нейронов через 1-4 мин после внесения НП (Ю-4 моль/л) (п=7). Наблюдалось увеличение вероятности нахождения канала в открытом состоянии

и, соответственно, уменьшение вероятности закрытого состояния (рис. 1). Действие N0 на канал проявлялось до 10-12-ой минут после внесения

Рис. 1. Изменение вероятности нахождения Куканала в открытом (Л) и закрытом (о) состояниях при действии нитропруссида натрия. Внесение НП и замена раствора указаны стрелками вниз и вверх соответственно По оси ординат—вероятность состояния; по оси абсцисс —время, мин. * р<0,05.

НП, после чего активность Ку-канала стабилизировалась. Замена раствора приводила к неполному восстановлению активности канала. Действие НП может быть связано с прямым действием ГТО+ на Ку-канал — нитро-зилированием ЭН-групп канала. Кроме того, N0+ может взаимодействовать с отрицательно-заряженными группами на мембране и опосредованно влиять на ионные каналы. Активация Ку-каналов может приводить к гиперполяризации мембраны и уменьшению возбудимости нервных клеток Действительно, было установлено, что инкубация нерва в растворе НП приводит к уменьшению амплитуды и скорости проведения ПД нерва в зависимости от концентрации N0 (при каждой концентрации НП число экспериментов п=7) (рис. 2). Через 7 мин инкубации уменьшение амплитуды ПД наблюдалось при всех используемых.концентрациях НП, а через 15 мин этот эффект был более выраженным для меньших концентраций донора (10~6 и 10~5 моль/л). После 60 мин инкубации происходило восстановление амплитуды ПД при концентрациях НП Ю-6 и Ю-5 моль/л и падение амплитуды ПД при концентрациях Ю-4 и 10~3 моль/л (рис. 2. А). Скорость проведения ПД уменьшалась только при концентрациях Ю-4 и Ю-3 моль/л на 60-ой мин инкубации (рис. 2. Б) Падение скорости проведения ПД связано с разрыхлением миелина и уменьшением межперехватных

Рис. 2. Зависимость амплитуды потенциала действия (А) и скорости проведения ПД (Б) нерва от времени инкубации в растворе нитропруссида натрия о, □ и Ш — концентрации НП 10_6, Ю-5, Ю-4 и Ю-3 моль/л, соответственно НП внесен после 0 мин. По оси ординат — амплитуда ПД, % (А) и скорость проведения ПД, % (В); по оси абсцисс — время, мин * р<0,05

участков. Происходящее при этом обнажение паранодальных участков может приводить к активации дополнительных К+-каналов аксонов, гиперполяризации мембраны и еще большему падению амплитуды ПД [Waxman & Ritchie, 1993]. По всей видимости, этим вызвано уменьшение амплитуды ПД, происходящее на 60-ой мин инкубации при концентрациях НП 1СГ4 и Ю-3 моль/л (рис. 2. А). Обнаружено, что НП (Ю-3 моль/л) вызывает уменьшение содержания Са2+, связанного на плазматической мембране Rz-нейрона, а спермин/NO (10~3 моль/л) не влияет на количество Са^ (НП: 77±2,4% от контрольного уровня, п=9; спермин/NO: 99±1.4%, п=9) (рис. 3. А). Наблюдаемое изменение развивается за время t=17,3±2,9 мин с выходом на стационарный уровень Предполагается, что действующим веществом является форма NO+, образующаяся из НП, но не спермин/NO. Уменьшение содержания Са^вг может быть вызвано изменением трансмембранного потенциала из-за действия N0 на ионные каналы и/или со взаимодействием N0+ с отрицательно-заряженными группами на поверхности мембраны, связывающими Са2+. Для того, чтобы проверить, связано ли уменьшение количества Са^ с NO-зависимой активацией Kv-каналов, перед внесением НП в камеру был добавлен блокатор быстрых К4-каналов 4-аминопиридин (4-АП, Ю-3 моль/л). Последующее внесение НП вызывало более быстрое и сильное уменьшение содержание Са^, чем в отсутствие 4-АП (60±4%, t—10,7±1,8 мин, п=9) (рис. 3. А). По всей видимости, N0 действует на несколько мембранных процессов, по-разному влияющих на

10 16 20 25 30 Время, мин

с± 1.2

£ 1.0

о 0.8

0.6

о 0.4

0.2

^»ЧК^У * м им «м

20 30 40 Время, мин

Рис. 3. А: Изменение содержания Са2+, связанного на плазматической мембране Иг-нейрона при действии нитропруссида натрия (кривая 1) и спермин/МО (кривая 3). Кривая 2—действие НП на фоне предварительно внесенного 4-аминопиридина. Б Изменение содержания Са2+, связанного на плазматической мембране миелинового (кривая 4) и немиелинового (кривая 5) нервных волокон при действии НП Внесение доноров отмечено стрелками По оси ординат — интенсивность флуоресценции ХТЦ, отн. ед.; по оси абсцисс — время, мин.

количество Са^. Ингибирование одного из них — ГТО-зависимой активации Ку-каналов — усиливает проявление других процессов, приводящих к уменьшению количества Са2*. Исходя из этого следует, что действие N0 на уровень Са2+ должно зависеть от типа плазматической мембраны. Действительно, было показано, что кинетики уменьшения количества мембра-носвязанного Са2+ отличаются для нейронов и нервных волокон (рис. 3) В случае немиелиновых волокон внесение НП (Ю-3 моль/л) приводило к более выраженному изменению содержания Са^ (71,9±2,1 %, 1;=9,8±0,9 мин, п—6), чем в случае миелиновых волокон (89±1%, 1=13,7±3,3 мин, п=6) (рис. 3. Б). Кроме того, для миелиновых волокон наблюдалось полное самопроизвольное восстановление количества Са2^ . По-видимому, менее выраженное действие N0 на миелиновые волокна связано с особой компактной структурой миелина, которая препятствует десорбции Са2+, нарушающей взаимодействие между слоями миелина. НП не приводил к изменению количества Са2^ нейронов и нервных волокон при предварительном внесении в камеру оксигемоглобина (Гб-02) (1СГ4 моль/л), удаляющего N0 из реакционной среды.

1*Ю-индуцированная активация Ку-каналов, а также перераспределение Са2+, связанного на плазматической мембране могут приводить к изменению вязкости мембраны. В следующей серии экспериментов исследовали действие N0 на микровязкость плазматической мембраны аксонов

7000 . 6000 ® 5000 А

5 4000 ^ 3000 О. 2000 1

1000 0

800 1000 1200 1400 1600 1800 Частотный сдвиг, см-1

Контроль НП

20 мин 40 мин

Рис. 4. А. Спектр резонансного комбинационного рассеяния нерва По оси ординат — интенсивность РКР, усл. ед.; по оси абсцисс — частотный сдвиг, см-1 В Изменение микровязкости плазматической мембраны аксонов нерва при действии нитропруссида натрия. По оси ординат—отношение интенсивностей Т^еДпсо пиков РКР-спектра нерва, %, в контроле, при 20 и 40 мин инкубации в растворе НП. * р<0,05

нерва. Известно, что в плазматической мембране нервного волокна содержатся С4о-каротиноиды, конформация которых зависит от вязкости микроокружения, мембранного потенциала и количества Са^ [Максимов и др , 1986; Макзипоу ^ а!., 1990]. На рис. 4. А приведен спектр резонансного комбинационного рассеяния (РКР) нерва лягушки, соответствующий РКР-спектру С4о-каротииоидов. Полосы с положением максимумов 1526 и 1160 см-1 соответствуют колебаниям -С=С- и ^С-С= связей, соответственно, полоса 1008 см-1 — колебанию метилыюго радикала -СН3. Величина отношения 1152б/1пб0 линейно зависит от вязкости липидпого окружения и, таким образом, является показателем микровязкости мембраны [МакБтоу et а1., 1990; Максимов и др., 1996]. Было показано, что инкубация нерва в растворе НП (5 х Ю-4 моль/л) приводит к обратимому увеличению отношения 1тб/1ибо (рис. 4. Б), что свидетельствует об увеличении микровязкости мембраны (п—8). Ранее было показано, что такой же эффект на вязкость оказывают уменьшение числа ЭН-групп и десорбция с мембраны ионов Са2*1' [Маквппоу. et а1, 1990, Максимов и др., 1996]. Таким образом, Б-нитрозилирование белков плазматической мембраны аксона и миелина, вызывающее образование дисульфидных связей, а также уменьшение количества Са^з могут приводить к увеличению вязкости мембраны аксона.

3.2. Исследование действия NO на функциональное состояние митохондрий и цитосом

Митохондрии являются наиболее важной внутриклеточной мишенью N0 [Moneada and Bolanos, 2006]. Изменение их функционального состояния может приводить как к кратковременным, так и длительным изменениям клеточной активности. В данной серии экспериментов исследовали действие N0 на потенциал внутренней митохондриальной мембраны и соотношение количеств ФАД+/ФАД H<¿ в Rz-нейроне в препарате с сохраненными межклеточными связями.

Было показано, что НП (Ю-3 моль/л) (кривая 1) и спермин/NO (10~~5 моль/л) (кривая 2) вызывают деполяризацию митохондрий (увеличение интенсивности флуоресценции Rh 123 (I/Io(Rhl23)) соответствует уменьшению АФШ) (рис. 5. А). При действии НП деполяризация митохондрий начинается через 12,2±1,1 мин после внесения НП и через 28,4±5 мин после внесения донора достигает стационарного значения (I/Io(Rhl23)=143±8,5 %, п=8). Спермин/NO приводил к более быст-

Рис. 5. А: Изменение потенциала внутренней мембраны митохондрий Иг-нейрона при действии нитропруссида натрия (кривая 1) и спермин/МО (кривая 2). Кривая 3 —действие НП при инкубации ганглия в растворе циклоспорина А. Внесение доноров N0 обозначено стрелкой Б: Профили распределения потенциала внутренней митохондриальной мембраны по выделенной линии в Лг-клетке в контроле, через 2 и 7 мин после внесения спермин/ГТО (черная, темно- и светло-серая кривые, соответственно) По оси ординат—интенсивность флуоресценции родамина 123; по оси абсцисс — А: время, мин, Б: профиль клетки, мкм.

рой деполяризации митохондрий ^=18±2 мин, 1/10(ЯЫ23)=134±9,3 %, п=8). Феррицианид натрия (Ю-3 моль/л) и сульфо^ОЫОат натрия (Ю-5 моль/л), являющиеся контролем для НП и спермин/^О, соответственно, не оказывали влияния на 1/10(КЬ123). Инкубация ганглиев в рас-

творе ингибитора неселективной митохондриальной поры циклоспорина А (2х10~6 моль/л) предотвращала деполяризацию митохондрий, вызванную НП (рис. 5, кривая 3). Это свидетельствует о том, что уменьшение ДФт связано с ингибированием под действием N0 комплексов дыхательной цепи и последующим образованием неселективной поры во внутренней митохондриальной мембране. Известно, что деполяризация митохондрий, вызванная нейромедиатором глутаматом, приводит к перераспределению митохондрий в нейронах [Шп1;ои1 et а1., 2003]. С помощью конфокальной микроскопии мы исследовали распределение ДФт митохондрий в изолированных Лг-нейронах при действии спермин/ГЮ (Ю-3 моль/л). На рис. 5. Б представлены профили распределения интенсивности флуоресценции Ш1 123 в нейроне до и после внесения спермин/МО. В контроле в Лг-нейроне существует негомогенное распределение 1(Ш1 123), связанное с существованием определенной структуры в расположении митохондрий и наличием участков с их скоплением. Было получено, что спермин/МО через 2 мин после внесения приводит к увеличению интенсивности флуоресценции Ш1 123 и более однородному распределению ДФт в Бя-нейроне. Наблюдаемый эффект может быть связан с тем, что при деполяризации митохондрий происходит нарушение митохондриальной сети и распределение митохондрий становится более гомогенным Через 7 мин наблюдается восстановление суммарной флуоресценции зонда, однако структура распределения ДФт восстанавливается неполностью.

3 0 6

10 20 30 40 Время, мин.

130

120 110

°&100 <о

~~<о 80

70 60 50 40

Контроль НП НП

20-40 мин 60 мин

Рис. 6. А Изменение соотношения концентраций окисленных/восстановленных флавопротеи-нов в митохондриях Яг-нейрона при действии нитропруссида натрия (кривая 1) и спермин/МО (кривая 2) Внесение доноров N0 отмечено стрелкой; по оси ординат — интенсивность автофлуоресценции, отн ед , по оси абсцисс — время, мин. Б Изменение микровязкости мембраны цитосом мотонейронов при действии НП. * р<0,05

Для того, чтобы подробнее изучить влияние N0 на дыхательную цепь митохондрий, было исследовано действие N0 на соотношение концентраций окисленных/восстановленных флавопротеинов в митохондриях Иг-нейронов Было показано, что автофлуоресценция Иг-нейронов, соответствующая соотношению количеств ФАД4 /ФАДНг, зависит от функционального состояния сукцинат-дегидрогеназы (комплекса II дыхательной цепи) и обратимо увеличивается при действии конкурентного ингибитора малоната натрия. Обнаружено, что НП и спермин/ГТО при концентрации Ю-3 моль/л приводят к уменьшению соотношения ФАД+/ФАД Н2 (относительное изменение интенсивности автофлуоресценции Иг-клеток составило 79,3±4,8%, п=7 для НП и 83,8±3,9%, п=7 для спермин/Ш) (рис. 6. А). Феррицианид натрия и сульфо-1Ч01ЧОат натрия не влияли на соотношение концентраций окисленных/восстановленных флавопротеинов в митохондриях. Внесение НП при параллельной инкубации ганглия в растворе малоната натрия практически не изменяло интенсивность автофлуоресценции нейронов, свидетельствуя о том, что уменьшение соотношения ФАД+/ФАДНг при действии N0 связано с изменением функционального состояния сукцинат-дегидрогеназы. Накопление ФАДН2 в сукцинат-дегидрогеназе при действии N0 связано с тем, что N0 ингибирует перенос электронов в дыхательной цепи митохондрий на одной или нескольких стадиях: комплекс II —> убихинон —► комплекс III —> комплекс IV. Восстановление автофлуоресценции при действии доноров N0 связано с увеличением соотношения ФАД+/ФАДНг. Это может быть вызвано: (1) восстановлением переноса электронов от сукцинат-дегидрогеназы на убихинон или (2) инактивацией РегБг-содержащей аконитазы и ингибированием цикла Кребса.

Деполяризация митохондрий и образование неселективной поры могут приводить к выходу в цитоплазму мито^ондриального Са2+. Методом РКР исследовали состояние цитосом — особых органоидов, содержащих в мембране С4о-каротиноиды и предположительно участвующих в перераспределении Са2+ [Петруняка, 1976]. Инкубация ганглиев в растворе НП (5 х Ю-4 моль/л) приводила к обратимому падению отношения 1152б/1цб0! что говорит об уменьшении микровязкости цитосомальной мембраны (п=10) (рис. 6. Б). Предполагается, что уменьшение вязкости мембраны цитосом связано с сорбцией на их поверхность цитоплазматического

Са2+, концентрация которого увеличивается при падении ДФЮ.

3.3. Действие N0 на оптические свойства нейронов

Известно, что изменения мембранного потенциала, формы клетки, положение и объем органоидов, в частности, митохондрий, влияют на оптические свойства нейронов (светорассеяние и показатель преломления(ПП)) [Hill к Keynes, 1949; Cohen et al., 1968; Haller et al., 2001]. Мы исследовали действие NO на распределение и изменения показателя преломления в примембранной и цитоплазматической областях нейронов как интегральную клеточную характеристику, зависящую от процессов, протекающих на плазматической мембране, в примембранной и цитоплазматической областях. Было установлено, что в состоянии покоя в примембранной области Rz-нейронов происходят изменения ПП с частотами 0,1, 0,2-0,4, 1 и 2-3 Гц и отсутствуют изменения ПП в области 6-30 Гц (рис 7. А, В). В области

Рис. 7. Усредненные по времени спектры мощности изменений показателя преломления в примембранной области Ли-нейрона в контроле (А и В) и через 10 мин после внесения нитро-пруссида натрия (В и Г). По оси ординат — ^ мощности частоты; по оси абсцисс — частота, Гц' А, Б-0-6 Гц; В, Г-6-30 Гц

цитоплазмы происходят низкоамплитудные изменения ПП в низкочастотной области (рис. 8. А) и более выраженные флуктуации ПП с частотой 25-26 Гц (рис. 8. В). Амплитуда и частота ритмов 1, 2-3 и 25-26 Гц были нестационарны и периодически изменялись с течением времени Внесение НП (10~3 моль/л) приводило к подавлению низких частот в примембран-

ной области и появлению частоты 1-2 Гц в области цитоплазмы (рис. 7. Б и 8. Б) При этом в обеих исследуемых областях появлялись частоты от 15 до 26 Гц (рис. 7. Г и 8. Г). Для того, чтобы установить связь выделенных

Рис. 8. Усредненные по времени спектры мощности изменений показателя преломления в цитоплазматической области Rz-нейрона в контроле (А и В) и через 10 мин после внесения нитропруссида натрия (Б и Г)

ритмов с мембранным потенциалом, проводили вейвлет-анализ регулярных изменений амплитуды и частоты ритмов 1, 2-3 и 15-26 Гц (метод двойного вейвлет-анализа). Было показано, что изменение ПП с частотой 1 Гц связано с изменением мембранного потенциала. На рис. 9 приводятся распределения главных максимумов спектров амплитудной модуляции ритма 1 Гц при К+-деполяризации (А) и действии валиномицина (Б). В контроле мощность частоты 1 Гц изменяется с частотами 0,1-0,32 Гц, а при К+-деполяризации (30 х Ю-3 моль/л KCl) распределение сдвигается в область более низких частот с увеличением глубины модуляции. Внесение валиномицина (Ю-6 моль/л), вызывающего гиперполяризацию мембраны, приводит к смещению распределения в более высокочастотную область. Важно, что модуляции других частот (2-3, 15-30 Гц) не изменялись при аналогичных воздействиях (KCl и валиномицин) и, следовательно, указанные частоты флуктуаций ПП непосредственно не связаны с изменениями мембранного потенциала. Полученные данные о природе ритма 1 Гц соответствуют результатам авторов [Schutt et al., 2000], установивших, что в изолированных нейронах беспозвоночных существуют спонтанные изме-

0.10 0.20 0.30 0.40 Частота модуляции, Гц

Рис. 9. Распределение главных максимумов амплитудной модуляции ритма 1 Гц изменений показателя преломления в примембранной области нейрона при калиевой деполяризации (А) и действии валиномицина (В) Серые точки — контроль, черные точки — воздействие (КС1 (А) или валиномицин (Б)) По оси ординат — глубина модуляции, отн. ед.; по оси абсцисс — частота модуляции, Гц.

нения мембранного потенциала с частотой 1 Гц. Таким образом, изменение мощности ритма 1 Гц при действии NO (рис. 7 и 8) связано с NO-индуцированным изменением мембранного потенциала. Предполагается, что появление частот 15-26 Гц в примембранной и цитоплазматической областях связано с изменением транспорта органоидов, в первую очередь, митохондрий, и их перераспределением в клетке. Это соответствует результатам исследований светорассеяния нейронов, в которых показали, что везикулярный транспорт вызывает регулярные изменения светорассеяния с частотами от 8 до 40 Гц [Cohen, 1969], а также данным о действии NO на транспорт митохондрий в нейронах [Rintoul et al., 2006].

3.4. Действие NO на кислород-связывающие свойства гемоглобина

Известно, что увеличение нейрональной активности, гипоксия и ишемия мозга приводят к активации синтеза NO в нейронах и астроцитах [Wiencken & Casagrande, 1999; Gibson et al., 2005; Moro et al., 2005]. Образующийся NO может диффундировать в кровеносное русло и связываться с гемоглобином (Гб) в эритроцитах [Kumura et al., 1994, Han et al., 2003]. По-

казано, что Гб выступает в качестве переносчика N0 [НоЫэв et а1., 2002], однако не рассматривается влияние N0 на кислород-связывающие свойства Гб, в то время как они определяют эффективность переноса и выделения С>2 в тканях, особенно важные для функционирования нервной системы. В связи с этим в следующей серии экспериментов было изучено действие N0 на конформацию гемопорфирина гемоглобина и его Ог-связывающие свойства. На рис 10 приведен спектр комбинационного рассеяния цельной крови кролика после внесения изокета. Полосы с положением максиму-

1200 1300 1400 1500 1600 1700 Частотный сдвиг, см"1

Рис. 10. Спектр комбинационного рассеяния цельной крови кролика после внесения изокета

мов 1355 и 1564 см-1 соответствуют колебаниям связей гемопорфирина в дезоксигемоглобине (д-Гб), полосы 1375 и 1588 см-1 — колебаниям связей гемопорфирина в океигемоглобине [Соловьев и др., 1985]. Соотношения интенсивностей Ii35">/Ii56<i и I1375/lises характеризуют конформацию гемопорфирина в д-Гб и его способность связывать Ог и конформацию гемопорфирина в Г6-О2 и его способность выделять Ог, соответственно В экспериментах с 2,3-дифосфоглицератом (п=5) и при изменении рН среды (п=5) было показано, что изменение отношения (I1355/T1564)/(I1375/I1588) качественно отражает изменение сродства Гб к Ог Полосы с положением максимумов 1626 и 1668 см-1 соответствуют колебаниям связи N—О в комплексах r6(Fe2+-NO) в случае гексакоординированного атома железа (комплексы Гб-NO (I)) и пентакоординированного атома железа (комплексы Гб-NO (II)). соответственно [Maxwell к Caughey, 1976]. При присоединении

N0 к Гб с образованием комплекса И, происходящем при низком парциальном давлении О2 (рОг), связь между Fe2+ и гистидином глобина разрывается, что приводит к переходу молекулы Гб в Т-конформацию и облегчению выделения молекул Ог, связанных на других субъединицах [Yonetani et al., 1998; Hobbs et al., 2002]. Обнаружено, что внутривенное введение кролику доноров N0 изокета (п=5) и ТНКЖ (п=5), а также внесение изокета в кровь in vitro (п=5) приводят к увеличению содержания комплексов Гб-NO (I и И) и падению отношения (Ii355/Ii564)/(Ii375/Ii588), свидетельствующему об уменьшении сродства Гб к Ог (рис. 11). При внесении НП (10~3 моль/л)

300

250

vP о4

200

О 150 Z

100 50

Рис, 11. Содержания комплексов гемоглобин-NO с гексаги пеятакоординированным атомом железа (А и Б, соответственно) и сродство гемоглобина к Ог (В) в контроле (столбики 1), при внесении изокета в кровь кролика «п vitro (столбики 2) и внутривенном введении кролику доноров NO изокета (столбики 3) и ТНКЖ (столбики 4) По оси ординат — исследуемая характеристика; по оси абсцисс — исследуемые экспериментальные группы * р<0,05

в кровь крысы in vitro (п=6) также наблюдалось уменьшение сродства Гб к Ог (рис. 12. А). Кроме того, было установлено, что в условиях, сопровождающихся повышенным синтезом NO в нервных клетках — при двухчасовой церебральной ишемии (п=10) и последующем восстановлении кровотока при постишемической реперфузии (п=7) у крыс—сродство Гб к Ог уменьшается (рис. 12. Б). По всей видимости, изменение сродства Гб к кислороду связано с прямым действием NO на гемоглобин и образованием комплексов Гб-NO. Ранее авторами [Kosaka et al., 1996; Han et al., 2003] обсуждалась роль NO в увеличении кислородоснабжения тканей при изменении свойств

Рис. 12. А Сродство гемоглобина к Ог в контроле (столбик 1) и при внесении НП в пробу с кровью крысы (столбик 2) Б: Сродство гемоглобина к Ог у ложвооперированных крыс (столбик 3), крыс при двухчасовой церебральной ишемии (столбик 4) и 30-мин постишемической реперфузии (столбик 5) * р<0,05

Гб. N0 диффундирует в эритроциты и связывается с Гб. При низком рОо в крови происходит образование комплексов Гб-NO Н-го типа, стабилизирующих Гб в Т-конформации, что облегчает выделение 02, а также усиливает взаимодействие Гб с мембраной. Комплексы Гб-NO 1-го типа могут переходить в комплексы П-го типа, а также являются «депо» для N0. Важно, что даже при микромолярных концентрациях Гб-NO происходит усиление выделения 02 из эритроцитов [Kosaka et al., 1996]. В легочных капиллярах с высоким р02 происходит обратный переход Гб-NO (II) в комплексы Гб-NO (I), не влияющие на 02-связывающие свойства Гб [Fago et al., 2003]

3.5. Заключение

В ходе проведенного исследования было показано, что N0 влияет на различные компартменты нейрона и вызывает совокупность взаимосвязанных процессов, изменяющих электрофизиологическую активность, свойства плазматической и внутриклеточных мембран, функциональное состояние митохондрий и оптические свойства клетки (рис. 13). Было показано, что N0 активирует потенциалзависимые К+-каналы, понижает возбудимость аксонов и вызывает уменьшение содержания мембраносвязанного Са2+ с кинетикой, зависящей от типа плазматической мембраны и активности ионных каналов. В свою очередь, изменение количества Са2+, связанно-

Рис. 13. Схема действия оксида азота на нервные клетки. N0 поступает в нейроны от соседних нейронов, астроцитов (А) или гемоглобина эритроцитов (Э) В нейронах N0 активирует Ку каналы (1) и вызывает уменьшение количества Са24", связанного на плазматической мембране (2), а также приводит к увеличению вязкости плазматической мембраны за счет образования Б-Б связей между белками (3) N0 ингибирует дыхательную цепь митохондрий (НУ —комплексы двпсательной цепи) (4), что вызывает выход митохондриального Са2+ (5) и сорбцию Са2+ на поверхность цитосом (6). Повышение концентрации Са2+ в цитоплазме также может вызывать выход Са2+ из эндоплазматического ретикулума (7) N О-индуцированные процессы сопровождаются изменением флуктуаций показателя преломления (8) N0 влияет на сродство Гб к Ог (9) и увеличивает поступление О2 в нервные клетки (10).

го на плазматической мембране, может изменять трансмембранный потенциал и таким образом влиять на активность ионных каналов. Кроме того, N0 приводит к увеличению вязкости плазматической мембраны аксонов, что связано с нитрозилированием тиоловых групп белков мембраны аксона и миелина с последующим образованием дисульфидных связей. Появление дополнительных Б-Э связей между белками аксона и миелина увеличивает вязкость белковой и липидной частей мембраны. Изменение свойств плазматической мембраны нейронов сопровождается ГТО-индуцированньтми на-

рушением электронного транспорта в дыхательной цепи и деполяризацией митохондрий, уменьшением соотношения содержаний ФАД+/ФАДНг в сукцинат-дегидрогеназе и образованием неселективной митохондриальной поры. По-видимому, падение ДФт стимулирует выход Са2+ из митохондрий и вызывает Са2+-индуцируемый выход Са2+ из эндоплазматического ретикулума, перераспределение цитоплазматического Са2+ и сорбцию избыточного Са2+ на поверхность цитосом, что приводит к изменению вязкости их мембран. Кроме того, деполяризация митохондрий вызывает их перераспределение в телах и отростках нейронов. Действие N0 на кооперативные процессы, протекающие на плазматической мембране и в цитоплазме нейронов, приводит к изменению локальных флуктуаций показателя преломления с частотами 1 Гц и 15-26 Гц, что связано с изменениями мембранного потенциала и внутриклеточного транспорта органоидов.

Таким образом, оксид азота обладает комплексным действием на нейроны и влияет на их функционирование, изменяя свойства плазматической мембраны, а также энергетическое состояние митохондрий. Кроме того, N0 может регулировать дыхательную цепь митохондрий и активность нервных клеток за счет локального увеличения рСЬ в тканях в результате уменьшения сродства Гб к Ог и увеличения эффективности выделения Ог из эритроцитов.

4. ВЫВОДЫ

1. N0 приводит к активации потенциалзависимых К+-каналов нейронов и снижению возбудимости нервных волокон;

2. N0 вызывает уменьшение содержания мембраносвязанного Са2+ нейронов и нервных волокон, а также обратимое увеличение вязкости плазматической мембраны аксонов;

3. N0 приводит к деполяризации внутренней мембраны митохондрий, связанной с образованием неселективной поры, и обратимому уменьшению соотношения количеств окисленных/восстановленных фла-вопротеинов, вызванному изменением функционального состояния сукцинат-дегидрогеназы. Уменьшение потенциала внутренней мито-хондриальной мембраны различно по клетке, что связано с расположением митохондрий;

4. N0 приводит к уменьшению вязкости мембраны цитосом, связанному с перераспределением цитоплазматического Са2+;

5. Действие N0 на нейроны сопровождается изменениями флуктуаций показателя преломления в примембранной и цитоплазматической областях с частотами 1 и 15-26 Гц, связанными с изменениями мембранного потенциала, распределения и транспорта органоидов;

6. Доноры N0, а также условия, приводящие к повышенному синтезу N0 в нейронах и глиальных клетках, приводят к увеличению содержания в крови комплексов гемоглобин-ЫО и уменьшению сродства гемоглобина к СЬ;

7. Влияние N0 на нервные клетки заключается в действии на возбудимость нейронов, свойства плазматической мембраны, функциональное состояние митохондрий, а также в модуляции локальной концентрации Ог в нервной ткани при МО-опосредованном изменении сродства гемоглобина к кислороду.

5. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Браже А. Р. Ульянова Н. А. (Браже), Бриндикова Т. А., Реутов В. П., Максимов Г. В. Действие нитрита натрия на функционирование нервного волокна Rana temporaria.// Сборник тезисов конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий». — Саранск, 2001. — С. 171.

2. Ульянова Н. А. (Браже), Браже А. Р, Максимов Г. В., Колье О. Р. Исследование действия нитропруссида натрия на электрофизиологические характеристики седалищного нерва Rana temporaria.// Доклады МОИП. Общая биология 2001.— Московское общество испытателей природы, М., 2002.-С. 13-15.

3. Ульянова H.A. (Браже). Исследование действия оксида азота (II) на функционирование нервного волокна.// Материалы международной научной конференции «Ломоносов».— Москва, 2002.— С. 57.

4. Максимов Г. В., Чатерджи Ш, Казакова Т. А., Ерохова JI.A., Ульянова Н. А. (Браже), Браже А. Р., Колье О. Р. Клеточные аспекты действия нейромедиаторов// Тезисы докладов III съезда биофизиков России.-Воронеж, 2004.-Т. 2, VI.45, С. 542.

5. Ulyanova N. A. (Brazhe), Churin A.A., Maksimov G.V. Nitric oxide influence on the nerve cells membranes in various neuroglial systems// FENS Forum 2004 Abstracts. - Lisbon, 2004.-V. 2, A185.6.

6. Ульянова H.A. (Браже), Чурин A.A., Максимов Г. В., Рубин А. Б. Исследование действия оксида азота на вязкость мембран нервных клеток // Биофизика.-2005.-Т. 50, С. 289-296.

7. Ерохова Л. А. , Браже H.A., Максимов Г. В. , Рубин А. Б. Исследование конформационных изменений каротиноидов в нейронах при действии нейромедиаторов // Доклады АН РФ (Биофизика и биохимия).-2005.-Т. 402, С. 233-235.

8. Лунева О. Г., Браже Н. А., Фадюкова О. Е., Ахалая М. Я., Байжума-нов А А , Паршина Е. Ю., Демидова А.Е., Кошелев В. Б., Макси-

мов Г. В. Изменение вязкости плазматической мембраны и конфор-мации гемопорфирина гемоглобина эритроцитов при ишемии и ре-перфузии. // Доклады АН РФ (Биофизика и биохимия).— 2005. — Т. 405, С. 465-468.

9. Brazhe N. A., Erokhova L. A., Churin A. A., Maksimov G. V. Investigation of different-scale membrane processes under nitric oxide influence // Journal of Biological Physics.-2005.-V. 31, P. 533-546.

10. Sosnovtseva O.V., Pavlov A.N., Brazhe N. A., Brazhe A. R., Erokhova L. A., Maksimov G.V., Mosekilde E. Interference microscopy under double-wavelet analysis- a novel approach to studying cell dynamics. // Physical Review Letters.— 2005.—V. 94, 218103-1-4.

11. Fadyukova O.E., Tyurina E.Y., Luneva O. G., Brazhe N. A.. Akhalaya M. Y., Baizhumanov A. A., Demidova A.E., Maksimov G. V., Priezzhev A. V., Koshelev V. B. Alterations in erythrocytes during cerebral ischemia and reperfusion in rats. // Biorheology. Proceedings of 12th International Congress of Biorheology and bth International Conference on Clinical Hemorheology. — Chongqing, 2005. —V. 42, P. 8, S 7-3.

12. Brazhe N. A.. Brazhe A. R., Erokhova L. A., Maksimov G.V., Pavlov A. N., Sosnovtseva O.V., Mosekilde E. Study of non-linear interactions of neuronal processes: the application of interference microscopy and double-wavelet analysis. // XXV Dynamics Days Europe 2005, Book of abstracts, Europhysics Conference Series. — Berlin, 2005. — V. 29 E, P. 252-253.

13. Brazhe N. A.. Maximov G.V. Modulation of membrane properties as a mechanism of nitric oxide signalling in neurons. // Journal of Neurochemistry, Proceedings of 20й Biennual ISN-ESN Meeting.— Innsbruck, 2005.-V. 94, Supp. 2, P. 64-65.

14. Brazhe N. A., Maximov G. V. The complex response of neurons to nitric oxide: from channel to the whole cell level. // European Biophysics Journal with Biophysics Letters, Proceedings of lbth IUPAB & 5th EBSA International Biophysics Congress. — Montpellier, 2005. —V. 34, P. 641

15. Brazhe A.R., Brazhe N.A.. Erokhova L.A., Maksimov G.V., Sosnovtseva O.V., Mosekilde E., Pavlov A.N. Multiscale interacting processes in cells: wavelet tools in biophysics research. — ls< BioSim Conference. Book of abstracts. — Palma de Mallorca, 2005). — PL

16. Brazhe A. R., Brazhe N. A., Erokhova L.A., Yusipovich A. I., Maksimov G. V. A novel approach to studying of neuronal dynamics and ccll visualization: interference microscopy and data analysis. — FENS FORUM 2006 Astracts. -Vienna, 2006.-V. 3, A153.1.

17. Brazhe N. A.. Maksimov G.V. Membrane mechanism of nitric oxide influence on the nerve cells function. — FENS FORUM 2006 Astracts. — Vienna, 2006.-V. 3, A150.2.

Принято к исполнению 12/09/2006 Исполнено 13/09/2006

Заказ № 615 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш,, 36 (495)975-78-56

www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Браже, Надежда Александровна

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Свойства оксида азота и его источники в организме.

1.1.1 Синтез N0 в организме.

1.1.2 Физико-химические свойства оксида азота.

1.2 Функции оксида азота в нервной системе.

1.2.1 Роль N0 в регуляции электрофизиологической активности нейронов и синаптической передаче.

1.2.2 Роль N0 в регуляции внутриклеточных процессов.

1.2.3 Роль N0 в регуляции межклеточных взаимодействий.

1.2.4 Нейрозащитные и нейродеструктивные свойства N0.

1.2.5 Роль N0 в нервной системе беспозвоночных животных

1.3 Роль N0 в регуляции переноса кислорода эритроцитами.

1.3.1 Действие N0 на сосуды.

1.3.2 Взаимодействие N0 с гемоглобином эритроцитов.

2 ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Приготовление препаратов. Растворы и реактивы.

3.1.1 Приготовление препаратов нервной системы пиявки.

3.1.2 Приготовление препаратов нервной системы прудовика.

3.1.3 Приготовление препаратов миелиновых нервных волокон.

3.1.4 Доноры оксида азота.

3.1.5 Создание церебральной ишемии и постишемической реперфузии у крыс

3.2 Регистрация активности одиночных ионных каналов.

3.3 Регистрация электрофизиологических характеристик нервных волокон

3.4 Микрофлуориметрические исследования свойств нейронов

3.4.1 Регистрация изменений количества Са2+, связанного на плазматической мембране и во внутриклеточных компартментах.

3.4.2 Регистрация изменений потенциала внутренней мембраны митохондрий нейронов.

3.4.3 Регистрация изменений содержания окисленных флавопротеинов в нейронах

3.4.4 Математическая обработка результатов флуоресцентных исследований

3.5 Метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии

3.6 Регистрация спектров поглощения нейронов.

3.7 Метод спектроскопии комбинационного рассеяния.

3.7.1 Применение спектроскопии РКР для исследования микровязкости клеточных мембран.

3.7.2 Применение спектроскопии КР для исследования конформации гемо-порфирина гемоглобина и СЬ-связывающих свойств гемоглобина

3.8 Метод лазерной интерференционной микроскопии и вейвлет-анализ.

3.8.1 Применение лазерной интерференционной микроскопии для исследования интегральных свойств плазматической мембраны и цитоплазмы нейронов.

3.8.2 Анализ динамики локальных значений показателя преломления нейронов

3.9 Метод электронного парамагнитного резонанса.

4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Влияние оксида азота на свойства плазматической мембраны нейронов и нервных волокон

4.1.1 Действие N0 на активность потенциалзависимых К+-каналов нейронов

4.1.2 Действие N0 на электрофизиологические характеристики нервных волокон

4.1.3 Перераспределение Са2+, связанного на плазматической мембране нейронов и нервных волокон при действии N0.

4.1.4 Действие N0 на микровязкость плазматической мембраны нервных волокон

4.2 Действие оксида азота на функциональное состояние внутриклеточных органоидов нейронов.

4.2.1 Влияние N0 на потенциал внутренней мембраны митохондрий нейронов и содержание окисленных/восстановленных флавопротеинов.

4.2.2 Локальные изменения потенциала внутренней мембраны митохондрий нейронов при действии N0.

4.2.3 Изменение содержания Са2+, связанного во внутриклеточных компартментах, и вязкости мембраны цитосом нейронов при действии N

4.3 Действие оксида азота на оптические свойства нейронов.

4.3.1 Влияние N0 на изменения показателя преломления нейронов в примем-бранной области.

4.3.2 Влияние N0 на локальные изменения показателя преломления нейронов в области цитоплазмы.

4.3 3 Анализ характерных частот динамики показателя преломления нейронов

4.4 Действие оксида азота на свойства эритроцитов.

4.4.1 Влияние доноров N0 на кислород-связывающие свойства гемоглобина и микровязкость плазматической мембраны эритроцитов.

4.4.2 Изменение кислород-связывающих свойств гемоглобина и вязкости плазматической мембраны эритроцитов при церебральной ишемии и по-стишемической реперфузии у крыс.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы действия оксида азота на мембраны нервных клеток"

Показано, что изменение электрической активности нейронов под влиянием N0 связано с его действием на ионные каналы и рецепторы плазматической мембраны. Известно, что N0 активирует Ка+-каналы постоянного тока, вызывая деполяризацию нейронов, а с другой стороны, инактивирует NMDA-рецепторы глутамата, уменьшая вход Са2+ в нейроны и ингибируя синаптическую передачу [11, 12]. При этом, недостаточно исследовано влияние N0 на потенциалзависимые К+-каналы нейронов, играющие основную роль в формировании мембранного потенциала и участвующие в проведении нервного импульса, а также действие N0 на интегральные свойства клеточных мембран (микровязкость и поверхностный заряд), связанные с активностью мембранных белков. В митохондриях N0 реагирует с тиоловыми группами и железо-серными кластерами в комплексах I-IV дыхательной цепи и аконитазе цикла Кребса, что приводит к ингибированию этих ферментных комплексов [13, 14]. Однако, влияние N0 на энергетическое состояние митохондрий в изолированных нейронах и препаратах с сохраненными межклеточными связями практически не исследовано.

N0, образующийся при повышенной нейрональной активности и гипоксии, выходит в кровеносное русло, связывается с гемоглобином и переносится в другие ткани [15, 16]. Предполагается, что N0 усиливает кислородоснабжение тканей без увеличения просвета сосудов [17], при этом механизм действия N0 на кислород-связывающие свойства гемоглобина и эффективность выделения Ог в тканях остается мало изученным.

Большинство исследований механизмов действия N0 проводится на выделенных мембранных фрагментах и изолированных нейронах и сосредоточено на одном или нескольких процессах. Однако, поскольку N0 влияет на совокупность взаимосвязанных процессов, протекающих на плазматической мембране и в цитоплазме нейронов, необходим комплексный подход, заключающийся в изучении влияния N0 на разные клеточные компартменты и структуры в нативной системе.

В связи с этим, в представленной работе было изучено действие N0 на интегральные свойства плазматической мембраны (активность потенциалзависимых каналов, количество мембраносвязанных ионов и вязкость мембраны), влияющие на электрическую активность нейронов, функционирование митохондрий, определяющее энергообеспечение клеток, и свойства внутриклеточных мембран. Исследования были выполнены на препаратах с сохраненными межклеточными связями, а также на изолированных нейронах и нервных волокнах.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Браже, Надежда Александровна

6. ВЫВОДЫ

1. NO приводит к активации потенциалзависимых К+-каналов нейронов и снижению возбудимости нервных волокон;

3. N0 приводит к деполяризации внутренней мембраны митохондрий, связанной с образованием неселективной поры, и обратимому уменьшению соотношения количеств окисленных/восстановленных флавопротеинов, вызванному изменением функционального состояния сукцинат-дегидрогеназы. Уменьшение потенциала внутренней митохондриальной мембраны различно по клетке, что связано с расположением митохондрий;

6. Доноры N0, а также условия, приводящие к повышенному синтезу N0 в нейронах и глиальных клетках, приводят к увеличению содержания в крови комплексов гемоглобин-NO и уменьшению сродства гемоглобина к 02;

7. Влияние N0 на нервные клетки заключается в действии на возбудимость нейронов, свойства плазматической мембраны, функциональное состояние митохондрий, а также в модуляции локальной концентрации 02 в нервной ткани при NO-опосредованном изменении сродства гемоглобина к кислороду.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе проведенного исследования было показано, что оксид азота влияет на различные компартменты нейрона и вызывает совокупность процессов, изменяющих электрофизиологическую активность, свойства плазматической и внутриклеточных мембран, функциональное состояние митохондрий и оптические свойства нейрона (рис. 5.1). Было показано, что в нейронах N0 активирует потенциалзависимые К+-каналы и вызывает уменьшение содержания мембраносвязанного Са2+ с кинетикой, зависящей от активности ионных каналов. В свою очередь, изменение количества связанного Са2+ плазматической мембраны может изменять трансмембранный потенциал и таким образом влиять на активность ионных каналов. Изменение свойств плазматической мембраны нейронов сопровождается N0-индуцированной деполяризацией митохондрий, образованием неселективной митохондриаль-ной поры и уменьшением соотношения концентраций окисленных/восстановленных флаво-протеинов митохондрий. Уменьшение соотношения ФАД+/ФАДНг отражает ингибирование сукцинат-дегидрогеназы, вызванное нарушением переноса электронов в дыхательной цепи митохондрий хотя бы на одной из стадий: комплекс II —> убихипоп —> комплекс III —> комплекс IV. Падение ДФт может вызвать выход Са2+ из митохондрий, перераспределение цитоплазматического Са2+ и Са2+-индуцированный выход Са2+ из эндоплазматического ретикулума. Сорбция избыточного Са2+ на поверхность цитосом приводит к увеличению вязкости их мембран. Кроме того, NO-индуцированное уменьшение потенциала внутренней ми-тохондриальной мембраны вызывает перераспределение митохондрий в нейронах. Действие N0 на кооперативные процессы, протекающие на плазматической мембране и в цитоплазме нейронов, приводит к изменению локальных флуктуаций показателя преломления на частотах 1 Гц и 15-26 Гц, что связано с изменениями мембранного потенциала и внутриклеточного транспорта органоидов. В зависимости от концентрации и длительности действия N0, ингибирование комплексов дыхательной цепи митохондрий может обладать регуляторным или патологическим значением, регулируя активность электронного транспорта в ЭТЦ митохондрий в норме и ингибируя образование АТФ и вызывая выход митохондриального Са2+ при патологиях.

Действуя на нервные волокна, N0 уменьшает их возбудимость и скорость проведения ПД, а также приводит к увеличению вязкости плазматической мембраны аксонов, что связано с нитрозилированием тиоловых групп белков мембраны аксона и миелина с последующим образованием дисульфидных связей. Появление дополнительных S-S связей между белками

2/ 41

Kv-канал

Изменение локальных 8 флуктуаций ПП

Рис. 5.1. Схема действия оксида азота на нервные клетки. N0 поступает в нейроны от соседних нейронов, астроцитоа (А) или гемоглобина эритроцитов (Э). В нейронах N0 активирует Кv-каналы (1) и вызывает уменьшение количества Ca2f, связанного на плазматической мембране (2), а также приводит к увеличению вязкости плазматической мембраны за счет- образования S-S связен между белками (3). N0 ингибирует дыхательную цепь митохондрий (I—IV — комплексы дыхательной цепи) (4), что вызывает выход митохондриального Са2+ (5) и сорбцию Са2* на поверхность цитосом (6). Повышение концентрации Са2+ в цитоплазме также может вызывать выход Са2~ из эндоплазма-тического ретикулума (7). NO-индуцированные процессы сопровождаются изменением флуктуаций показателя преломления (8). N0 влияет на сродство Гб к СХ> (9) и увеличивает поступление 02 в нервные клетки (10). аксона и миелина увеличивает вязкость белковой и липидной частей мембраны. Уменьшение амплитуды ПД может быть вызвано NO-индуцированной активацией К+-каналов и гиперполяризацией мембраны аксона, а падение скорости проведения ПД —с уменьшением количества связанного Са2+ в миелине и нарушением его структуры. Мы предполагаем, что N0 может участвовать в регуляции взаимодействий аксона, Шванновской клетке и миелина (рис. 5.2). N0 активирует Ку-каналы аксона, приводя к гиперполяризации его плазматической мембраны и уменьшению амплитуды ПД. Кроме этого, N0 может активировать Ку-каналы Шванновской клетки и, таким образом, ускорять поглощение К+ из пространства между аксоном и миелином. С другой стороны, NO-индуцированная активация растворимой гуанилат-циклазы Шванновской клетки и последующее увеличение концентрации ц-ГМФ увеличивает выход Са2+ из Шванновской клетки и уменьшает проводимость ее мембраны по К+ [102]. N0 влияет на структуру миелина, вызывая его разрыхление за счет ингибирования фосфорилирования основного белка миелина [107], а также из-за уменьшения содержания связанного в миелине Са2+. N0 приводит к увеличению вязкости плазматической мембраны аксонов, что, по всей видимости, связано с нитрозилированием тиоловых групп белков мембраны аксона и миелина с последующим образованием дисульфидных связей между белками плазматической мембраны аксона и миелина. Кроме того, уменьшение числа свободных тиоловых групп может быть дополнительной причиной падения возбудимости нервных волокон.

N0 может регулировать активность нервных клеток не только за счет изменения их электрофизиологической активности, внутриклеточных процессов и функционального состояния митохондрий, но и за счет локального изменения рОг в результате регуляции сродства Гб к Ог. При повышенной электрической активности нейронов, а также в условиях гипоксии происходит локальное понижение содержания О2 в нервной ткани, что сопровождается активацией синтеза N0 в нейронах и клетках глии. N0 диффундирует в нейроны без NO-синтазной активности, а также в кровеносное русло. N0 проникает в эритроциты и взаимодействует, в первую очередь, с мембраносвязанным и примембранным Гб. Образующиеся комплексы Гб-NO с пентакоординированным Fe2+ переходят в Т-конформацию, что вызывает уменьшение сродства Гб к Ог и облегчает выделение Ог в кровь.

Связывание N0 с образованием комплексов Гб-NO с гексакоординированным Fe2+ (комплексов I) не изменяет конформацию Гб, однако позднее может осуществиться переход комплекс I —> комплекс И, в результате чего произойдет облегченное выделение О2. Уменьшение сродства Гб к О2 приводит к улучшению выделения Ог из эритроцитов и локальному увеличению содержания Ог в нервной ткани. Поступление Ог в нейроны и астроциты изменяет функциональное состояние митохондрий и уменьшает активность NO-синтаз, в результате чего снижается концентрация N0 в тканях и крови.

Регуляция аксогаиальлых отношений

Рис. 5.2. Схема действия N'0 на миелиновое нервное волокно. N0 влияет на активность К v-канал о в аксонов н Шванновской клетки, приводит к перераспределенюо мембракос вязанного Са2' и уменьшает число свободных SII-групп с образованием SNO-групп и S-S связей, что приводит к увеличению вязкости плазматической мембраны аксона и изменению электрофнзио логических характеристик.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Браже, Надежда Александровна, Москва

1. Garthwaite J., Charles S.L., Chess-Williams R. Endothelium-derived relaxing factor release on activation of NMDA receptors suggests role as intercellular messenger in the brain // Nature. - 1988. - Vol. 336. - Pp. 385-388.

2. Stamler J.S., Smgel D.J., Loscalzo J. Biochemistry of nitric oxide and its redox-activated forms // Science. 1992.- Vol. 258.- Pp. 1898-1902.

3. Wykes V., Bellamy T.C., Garthwaite J. Kinetics of nitric oxide-cyclic GMP signalling in CNS cells and its possible regulation by cyclic GMP // J. Neurochem.— 2002.— Vol. 83.— Pp. 37-47.

4. Гурин А.В. Функциональная роль оксида азота в нервной системе // Усп. Физиол. Наук. 1997.- Т. 28.- С. 53-60.

5. Каменский А.А., Савельева К.В. Оксид азота и поведение. — М.- Изд. НЦССХ им. А Н. Бакулева РАМН, 2002.

6. Induction of mitochondrial oxidative stress in astrocytes by nitric oxide precedes disruption of energy metabolism / J. Jacobson, M.R. Duchen, J. Hothersall, J.B. Clark, S.J. Heales // J. Neurochem. 2005. - Vol. 95. - Pp. 388-395.

7. Analysis of the neuroprotective effects of various nitric oxide donor compounds in murine mixed cortical cell culture / A.S. Vidwans, S. Kim, D.O. Coffin, D.A. Wink, S.J. Hewett // J. Neurochem. 1999. - Vol. 72. - Pp. 1843-1852.

8. Moncada S., Bolanos J.P. Nitric oxide, cell bioenergetics and neurodegeneration //J. Neurochem.- 2006.- Vol. 97.- Pp. 1676-1689.

9. Accelerated reaction of nitric oxide with 02 within the hydrophobic interior of biological membranes / X. Liu, M.J. Miller, M.S. Joshi, D.D. Thomas, J.R. Lancaster, Jr // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998. Vol. 95. - Pp. 2175-2179.

10. Effect of nitric oxide production on the redox modulatory site of the NMDA receptor-channel complex / S.Z. Lei, Z.H. Pan, S.K. Aggarwal, H.S. Chen, J. Hartman, N.J. Sucher, S.A. Lip-ton // Neuron. — 1992. — no. 8. — Pp. 1087-1099.

11. Induction of persistent sodium current by exogenous and endogenous nitric oxide / G.P. Ah-ern, S.-F. Hsu, V.A. Klyachko, M.B. Jackson // J. Biol. Chem.— 2000.- Vol. 275.-Pp. 28810-28815.

12. Erecmska M., Nelson D., Vanderkooi J.M. Effects of NO-generating compounds on synaptosomal energy metabolism // J. Neurochem.— 1995.— Vol. 65.— Pp. 2699-2705.

13. Nitric oxide-mediated mitochondrial damage in the brain: mechanisms and implications for neurodegenerative diseases / J.P. Bolanos, A. Almeida, V. Stewart, S. Peuchen, J.M. Land, J.B. Clark, S.J. Heales // J. Neurochem.- 1997.- Vol. 68.- Pp. 2227-2240.

14. Nitrosyl hemoglobin production during reperfusion after focal cerebral ischemia in rats / E. Kumura, T. Yoshimine, S. Tanaka, T. Hayakawa, T. Shiga, H. Kosaka // Neurosci. Lett. — 1994.-Vol. 177.-Pp. 165-167.

15. Лапша В.И., Бочарова В.Н., Гурии В.Н. Изменение активности NO-синтазы, ферментов энергетического метаболизма и ультраструктуры нейронов коры головного мозга в моделе кратковременной ишемии // Морфология. — 2003. — Т. 123.— С. 32-36.

16. Kosaka Н., Seiyama A. Physiological role of nitric oxide as an enhancer of oxygen transfer from erythrocytes to tissues // Biochem. Biophys. Res. Commun.— 1996.— Vol. 218.— Pp. 749-752.

17. Palmer R.M., Ferrige A.G., Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor // Nature. — 1987. — Vol. 327. — Pp. 524526.

18. Purchgott R.F. Introduction to EDRF research // J. Cardiovasc. Pharmacol— 1993. — Vol. 22.-Pp. Sl-2.

19. Moncada S., Higgs E.A. The L-Arginine — nitric oxide pathway // N. Engl. J. Med.— 1993.- Vol. 329.- Pp. 2002-2012.

20. Murad F. Regulation of cytosolic guanylyl cyclase by nitric oxide: the NO-cyclic GMP signal transduction system // Adv. Pharmacol. — 1994. — Vol. 26. — Pp. 19-33.

21. Alderton W.K., Cooper C.E., Knowles R.G. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition // Biochem. J. — 2001. Vol. 357. - Pp. 593-615.

22. Ca2+/calmodulin-regulated nitric oxide synthases / H.H. Schmidt, J.S. Pollock, M. Nakane, U. Forstermann, F. Murad // Cell Calcium. — 1992. — Vol. 13. — Pp. 6-7.

23. Knowles R.G., Moncada S. Nitric oxide synthases in mammals // Biochem. J.— 1994.— Vol. 298. Pp. 249-258.

24. Endothelial nitric oxide synthase localized to hippocampal pyramidal cells: implications for synaptic plasticity / J.L. Dinerman, T.M. Dawson, M.J. Schell, A. Snowman, S.H. Snyder // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1994. Vol. 91. - Pp. 4214-4218.

25. Wiencken A.E., Casagrande V.A. Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in astrocytes: another source of nitric oxide in neocortex // Glia. — 1999. — Vol. 26. — Pp. 280-290.

26. Chronic myocardial hypoxia increases nitric oxide synthase and decreases caveolin-3 / Y. Shi, Jr.K.A. Pritchard, P. Holman, P. Rafiee, O.W. Griffith, B. Kalyanaraman, J.E Baker // Free Radic. Biol. Med. 2000. - Vol. 29. - Pp. 695-703.

27. Nitric oxide-mediated inhibition of the mitochondrial respiratory chain in cultured astrocytes / J.P. Bolanos, S. Peuchen, S.J.R. Heales, J.M. Land, J.B. Clark // J. Neurochem-istry. — 1994.- Vol. 63.- Pp. 910-916.

28. Chenais В., Morjani H., Drapier J.C. Impact of endogenous nitric oxide on microglial cell energy metabolism and labile iron pool //J. Neurochem. — 2002. — Vol. 81. — Pp. 615-623.

29. N-w-hydroxy-L-argimne is an intermidiate in the biosynthesis of nitric oxide from L-arginine / D.J. Stuehr, N.S. Kwon, J.F. Nathan, O.W. Griffith, P.L. Feldman, J. Wiseman //J. Biol. Chem. 1991. - Vol. 266. - Pp. 6259-6263.

30. No NO from NO synthase / H. Schmidt, H. Hofmann, U. Schindler, D.D. Shutenko, Z.S. Cunningham, M. Feelisch // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93. - Pp. 14492-12297.

31. Peroxynitite, a cloaked oxidant formed by nitric oxide and superoxide / W.H. Koppenol, J.J. Moreno, W.A. Pryor, H. Ischiropoulos, J.S. Beckman // Chem. Res. Toxicol. — 1992.— no. 5. Pp. 834-842.

32. Xia Y., Zweler J.L. Direct measurement of nitric oxide generation from nitric oxide synthase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94.- Pp. 12705-12710.

33. Dawson V.L., Dawson T.M., London E.D. Nitric oxide mediates glutamate neurotoxicity in primary cortical culture // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. — Vol. 88. - Pp. 6368-6371.

34. Giulwi C. Functional implications of nitric oxide produced by mitochondria in mitochondrial metabolism // Biochem. J. — 1998.- Vol. 332.- Pp. 673-679.

35. Elfermg S.L., Sarkela T.M., Giulivi C. Biochemistry of mitochondrial nitric-oxide synthase // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277.- Pp. 38079-38086.

36. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих / В.П. Реутов, Е.Г. Сорокина, В.Е. Охотин, Н.С. Косицын. — М.: Наука, 1997.

37. Mirvish S.S. Role of N-nitroso compounds (NOC) and N-nitrosation in etiology of gastric, esophageal, nasopharyngeal and bladder cancer and contribution to cancer of known exposures to NOC. // Cancer Lett. 1995. - Vol. 93. - Pp. 17-48.

38. Nitric oxide directly activates calcium-dependent potassium channels in vascular smooth muscle / V.M. Bolotina, S. Najibi, J.J. Palacino, P.G. Pagano, R.A. Cohen // Nature.— 1994. Vol. 368. - Pp. 850-853.

39. Pawloski J.R. Export by red blood cells of nitric oxide bioactivity // Nature. — 2001. — Vol. 409. Pp. 622-626.

40. Cooper C.E. Nitric oxide and iron proteins // Biochim. Biophys. Acta. — 1999. — Vol. 1411. — Pp. 290-309.

41. Sharpe M.A., Robb S.J., Clark J.B. Nitric oxide and Fenton/Haber-Weiss chemistry: nitric oxide is a potent antioxidant at physiological concentrations //J. Neurochem.— 2003.— Vol. 87. Pp. 386-94.

42. Nitric oxide produced by activated astrocytes rapidly and reversibly inhibits cellular respiration / G.C. Brown, J.P. Bolanos, S.J. Heales, J.B. Clark // Neurosci. Lett. — 1995. — Vol. 193.- Pp. 201-204.

43. Goretski J., Hollocher Т. C. Catalysis of nitrosyl transfer by denitrifying bacteria is facilitated by nitric oxide. // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1991.— Vol. 175, no. 3.— Pp. 901905.

44. Nitric-oxide induced blockade of nmda receptors / O. Manzoni, L. Prezeau, P. Marin, S. De-shager, J. Bockaert, L. Fagni // Neuron 1992. — no. 8. — Pp. 653-662.

45. Северина И.С., Бусыгина О.Г., Пятакова Н.В. ОБЗОР: Карнозин как регулятор растворимой гуанилатциклазы // Биохимия. — 2000.— Т. 65.— С. 921-928.

46. Activation of the cardiac calcium release channel (Ryanodine Receptor) by poly-S-nitrosylation / Le Xu, J.P. Eu, G. Meissner, J.S. Stamler // Science. — 1998. — Vol. 279.— Pp. 234-237.

47. Nikitovic D., Holmgren A. S-nitrosoglutathione is cleaved by the thioredoxin system with liberation of glutathione and redox regulating nitric oxide // J. Biol.Chem.— 1996.— Vol. 271.-Pp. 19180-19185.

48. Dimmeler S., Lottspeich F., Brune B. Nitric oxide causes adp-ribosylation and inhibition of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase // J. Biol.Chem. — 1992.— Vol. 267.— Pp. 16771-16774.

49. Спектроскопия порфиринов: Колебательные состояния / К.Н. Соловьев, JI.JI. Гладков, А.С. Старухин, С.Ф. Шкирман. — Минск: Наука и техника, 1985.

50. Кэри П. Применение спектроскопии КР и РКР в биохимии. — М.: Мир, 1985.

51. First obsevation of photoinduced nitrosyl linkage isomers of iron nitrosyl porphyrins / L. Cheng, I. Novozhilova, C. Kim, A. Kovalevsky, K.A. Bagley, Ph. Coppens, G.B. Richter-Addo // J. Am. Chem. Soc. 2000. - Vol. 122.- Pp. 7142-7143.

52. Guanylate cyclase from bovine lung. Evidence that enzyme activation by phenylhydrazine is mediated by iron-phenyl hemoprotein complexe / L.J. Ignarro, K.S. Wood, B. Ballot, M.S. Wolin // J. Biol. Chem.- 1984.- Vol. 259.- Pp. 5923-5931.

53. Doyle M.P., Hoekstra J. W. Oxidation of nitrogen oxides by bound dioxygen in hemopro-teins // J. Inorg. Biochem.— 1981. — Vol. 14.- Pp. 351-358.

54. Mechanism of NO-induced oxidation of myoglobin and hemoglobin / R.F. Eich, T. Li, D.D. Lemon, D.H. Doherty, S.R. Curry, J.F. Aitken, A.J. Mathews, K.A. Johnson, R.D. Smith, G.N. Phillips, Jr, J.S. Olson // Biochemistry. — 1996.- Vol. 35.- Pp. 69766983.

55. Maxwell J. C., Caughey W.S. An infrared study of NO bonding to heme В and hemoglobin A. Evidence for inositol hexaphosphate induced cleavage of proximal histidine to iron bonds // Biochemistry. 1976. — Vol. 15, no. 2. — Pp. 388-96.

56. Biochemical characterization of human S-nitrosohemoglobin. effects on oxygen binding and transnitrosation / R.P. Patel, N. Hogg, N.Y. Spencer, B. Kalyanaraman, S. Matalon, V.M. Darley-Usmar // J. Biol. Chem.- 1999.- Vol. 27415487-92.- Pp. 15487-15492.

57. NO-hemoglobin may be a light-sensitive source of nitric oxide both in solution and in red blood cells / Y. Vladimirov, G. Borisenko, N. Boriskina, K. Kazarinov, A. Osipov // Pho-tochem. and Photobiol. — 2000. Vol. 59.- Pp. 115-122.

58. Ванин А.Ф. и Налбандян P.M. Свободные радикалы нового типа в дрожжевых клетках // Биофизика. — 1966. — Т. 10.- С. 167-168.

59. The mechanisms of S-nitrosothiol decomposition catalyzed by iron / A.F. Vanin, A.A. Papina, V.A. Serezhenkov, W.H. Koppenol // Nitric oxide. — 2004. T. 10. - C. 60-73.

60. Ванин А.Ф. Динитрозильные комплексы железа эндогенные сигнальные агенты в клетках и тканях животных и человека (Гипотеза) // Биофизика.— 2004.— Т. 49.— С. 581-586.

61. Храпова Н.В., Маленкова И.В., Ванин А.Ф. S-нитрозотиолы и динитрозотиольные комплексы железа как источники оксида азота в организмах животных // Биофизика. — 1995.-Т. 40.-С. 117-121.

62. Huie R.E., Padmaja S. The reaction of NO with superoxide // Free. Radic. Res. Commun. — 1993. Vol. 18. - Pp. 195-199.

63. Nitric oxide as a potential pathological mechanism in demyelination: its differential effects on primary glial cells in vitro / B. Mitrovic, L.J. Ignarro, S. Montestruque, A. Smoll, J.E. Merrill // Neuroscience. — 1994.- Vol. 61, no. 3. — Pp. 575-585.

64. Nitric oxide, mitochondria and neurological disease / S.J. Heales, J.P. Bolanos, V.C. Stewart, P.S. Brookes, J.M. Land, J.B. Clark // Biochim. Biophys. Acta. — 1999. — Vol. 1410. -Pp. 215-228.

65. Nitric oxide regulation of superoxide and peroxynitrite-dependent lipid peroxidation / H. Rubbo, R. Radi, M. Trujillo, R. Telleri, B. Kalyanaraman, S. Barnes, M. Kirk, B.A. Freeman // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269. - Pp. 26066-26075.

66. Nitric oxide acts directly in the presynaptic neuron to produce long-term potentiation in cultured hippocampal neurons / O. Arancio, M. Kiebler, V. Lee, C.J. Lev-Ram, R.Y. Trien, E.R. Kandel, R.D. Hawkins // Cell- 1996.- Vol. 87.- Pp. 1025-1035.

67. Proteins and lipids define the diffusional field of nitric oxide. / D.M. Porterfield, J.D. Laskin, S.K. Jung, R.P. Malchow, B. Billack, P.J. Smith, D.E. Heck // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. — 2001. — Vol. 281, no. 4.- Pp. L904-L912.

68. Haemoglobin: NO transporter, NO inactivator or NOne of the above? / A.J. Hobbs, M.T. Gladwin, R.P Patel, D.L.H. Williams, A.R. Butler // TRENDS in Pharmacological Science. 2002. - Vol. 23. - Pp. 406-411.

69. Mahnski Т., Taha Z. Nitric oxide release measured in situ by a porphyrinic-based microsen-sor // Nature. 1992. - Vol. 358. - Pp. 676-678.

70. Chang X. Real time and in vivo monitoring of nitric oxide by electrocehmical sensors — from dream to reality // Frontiers in Bioscience. — 2004.— Vol. 9.— Pp. 3434-3446.

71. Park J.H., Straub V.A., O'Shea M. Anterograde signaling by nitric oxide: characterization and in vitro reconstitution of an identified nitrergic synapse //J. Neurosci. — 1998. — Vol. 18. Pp. 5463-5476.

72. Electron paramagnetic resonance (EPR) detection of nitric oxide produced during forebrain ischemia of the rat / T. Tominaga, S. Sato, T. Ohnishi, S.T. Ohnishi //J. Cereb. Blood Flow Metab. 1994. - Vol. 14. - Pp. 715-22.

73. Mitchell K.M., Michaelis E.K. Multimembrane carbon fiber electrodes for physiological measurements of nitric oxide // Electroanalysis. — 1998.— Vol. 10.— Pp. 81-88.

74. Cherian L., Goodman J. C., Robertson C.S. Brain nitric oxide changes after controlled cortical injury in rat // J. Neurophysol 2000. - Vol. 83. — Pp. 2171-2178.

75. Reactivity studies of the Fe(III) and Fe(II)NO forms of human neuroglobin reveal a potential role against oxidative stress / S. Herold, A. Fago, R.E. Weber, S. Dewilde, L. Moens // J. Biol. Chem. — 2004. — Vol. 279.- Pp. 22841-22847.

76. Nitric oxide modulation of the spontaneous firing of rat medial vestibular nuclear neurons / H.W. Kim, J.S. Park, H.S. Jeong, M.J. Jang, B.C. Kim, M.K. Kim, K.H. Cho, T.S. Kim, S.W. Park // J. Pharmacol. Sci. 2004. - Vol. 96. - Pp. 224-8.

77. Bolotina V. Nitric oxide and ion channels // Contemporary cardiology, vol.4: nitric oxide and the cardiovascular system / Ed. by J. Loscalzo, J.A. Vita. — Totowa, NJ: Humana Press Inc., 2000. Pp. 85-103.

78. Klyachko V.A., Ahem G.P., Jackson M.B. cGMP-mediated facilitation in nerve terminals by enhancement of the spike afterhyperpolarization // Neuron. — 2001. — Vol. 31. — Pp. 1015— 1025.

79. Izumi Y., Zorumski C.F. Nitric oxide and long-term synaptic depression in rat hippocampus // NeuroReport. 1993.- Vol. 4.- Pp. 1131-1134.

80. Nitric oxide modulates synaptic vesicle docking/fusion reactions / M.K. MefFert, N.C. Cala-cos, R. Scheller, H. Schulman // Neuron. 1996. - Vol. 16. — Pp. 1229-1236.

81. Pan Z.-H., Segal M.M., Lipton S. Nitric oxide-related species inhibit evoked neurotransmission but enchance spontaneous miniature synaptic currents in central neuronal cultures // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - no. 93.- Pp. 15423-15428.

82. West A. R., Galloway M.P. Inhibition of glutamate reuptake potentiates endogenous nitric oxide-facilitated dopamine efflux in the rat striatum: an in vivo microdialysis study // Neurosci. Lett. — 1997.- Vol. 230.- Pp. 21-24.

83. Lmdgren C.A., Laird M. V. Nitroprusside inhibits neurotransmitter realise at the frog neuromuscular junction // NeuroReport. — 1994. — Vol. 5.— Pp. 2205-2208.

84. Brorson J.R., Schumaker P.Т., Zhung H. Nitric oxide acutly inhibits neuronal energy production // J. Neurosci. — 1999.- no. 19.- Pp. 147-158.

85. Chance B. The energy-linked reaction of calcium with mitochondria // J. Biol. Chem.— 1965. Vol. 240. - Pp. 2729-2748.

86. Anatomic and disease specificity of NADH CoQl reductase (complex I) deficiency in Parkinson's disease / A.H. Schapira, V.M. Mann, J.M. Cooper, D. Dexter, S.E. Daniel, P. Jenner, J.B. Clark, C.D. Marsden // J. Neurochem.- 1990.- Vol. 55.- Pp. 2142-2145.

87. Brorson J.R., Sulit R.A., Zhang H. Nitric oxide disrupts Ca2+ homeostasis in hippocampal neurons // J. Neurochem. — 1997. — Vol. 68. — Pp. 95-105.

88. Nitric oxide promotes intracellular calcium release from mitochondria in striatal neurons / T.F.W. Horn, G Wolf, S. Duffy, S. Weiss, G. Keilhoff, B.A. MacVicar // FASEB J. 2002. -Vol. 16.-Pp. 1611-1622.

89. Ройтбак А.И. Глия и ее роль в нервной деятельности. — С.-Пб.: Наука, 1993.

90. Carmignoto G. Reciprocal communication system between astrocytes and neurons // Prog. Neurobiol. 2000. - Vol. 62. - Pp. 561-581.

91. Glaum S.R., Holzwarth J. A., Miller R.J. Glutamate receptors activate Ca2+ mobilization and Ca2+ influx into astrocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1990. — Vol. 97. Pp. 34543458.

92. S. Duffy, MacVicar B.A. In vitro ishemia promotes calcium influx and inracellular calcium release in hippocampal astrocytes / / J. Neurosci. — 1996.— no. 1,— Pp. 71-81.

93. Jensen A.M., Chiu S.Y. Differential intracellular responses to glutamate in type 1 and 2 cultured brain astrocytes //J. Neurosci. — 1991.— no. 11.— Pp. 1674-1684.

94. Regulation of myelin basic protein phosphorylation by mitogen-activated protein kinase during increased action potential firing in the hippocampus / C.M. Atkins, M. Yon, N.P. Groome, J.D. Sweatt // J. Neurochem.- 1999.- Vol. 73.- Pp. 1090-1097.

95. Harukuni I., Traystman R.J., Kirsch J.R. Effect of AR-R 17477, a potent neuronal nitric oxide synthase inhibitor, on infarction volume resulting from permanent focal ishemia in rats // Cnc. Care. Med.- 1999.- Vol. 27.- Pp. 2508-2511.

96. Effects of L-NAME and 7-NI on NOS activity and behavioral outcome after traumatic brain injury in the rat / K. Wada, K. Chatzipanteli, R. Busto, W.D. Dietrich j j J. Neurotrauma. — 1999.- Vol. 16.- Pp. 203-212.

97. An unique model for the analysis of neuronal nitric oxide signaling: the leech CNS / L.D. Leake, M.P. Davis, D. Chen, L.L. Moroz // Acta Biol. Hung.— 1995.— Vol. 46.— Pp. 135-143.

98. Moroz L.L., Park J.H., Winlow W. Nitric oxide activates buccal motor patterns in Lymnaea stagnahs // Neuroreport. — 1993. — Vol. 4. — Pp. 643-646.

99. Дьяконова T.JI. NO-зависимая глутаматная регуляция активности серотонинергической системы виноградной улитки Helix lucorum // Ж. Эвол. Биохим. Физиол.— 2002.— Т. 38.-С. 156-162.

100. Molecular characterization of NOS in a mollusc: expression in a giant modulatory neuron. / S.A. Korneev, M.R. Piper, J. Picot, R. Phillips, E.I. Korneeva, M. O'Shea // J Neurobiol.— 1998.- Vol. 35, no. 1. Pp. 65-76.

101. Blood flow regulation by S-nitrosohemoglobin in the physiological oxygen gradient / J.S. Stamler, L. Jia, P.J. Eu, T.J. McMahon, I.T. Demchenko, J. Bonaventura, K. Gen-ert, C.A. Piantodosi // Science. 1997. - Vol. 276.- Pp. 2034-2037.

102. Electron paramagnetic resonance and oxygen binding studies of alpha-Nitrosyl hemoglobin. A novel oxygen carrier having no-assisted allosteric functions / T. Yonetani, A. Tsuneshige, Y. Zhou, X. Chen // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273.- P. 2032320333.

103. Ishikawa Т., Hume J.R., Keef K.D. Regulation of Ca2+-channels by cAMP and cGMP in vascular smooth muscle cells // Circ. Res. — 1993. — Vol. 73. — Pp. 1128-1137.

104. Modulation of cerebral vascular tone by activated glia: involvement of nitric oxide / M. Chis-ari, S. Salomone, F. Laureanti, A. Copani, M.A. Sortino // J. Neurochem.— 2005.— Vol. 91.- Pp. 1171-1179.

105. Nitric oxide in the human respiratory cycle / T.J. McMahon, R.E. Moon, B.P. Luschinger, M.S. Carraway, A.E. Stone, B.W. Stolp, A.J. Gow, J.R. Pawloski, P. Watke, D.J. Singel, C.A. Piantadosi, J.S. Stamler // Nat. Med. 2002. - Vol. 8.- Pp. 711-717.

106. Modulation of nitric oxide bioavailability by erythrocytes / K.T. Huang, Т.Н. Han, D.R. Hy-duke, M.W. Vaughn, H. Van Herle, T.W. Hein, C. Zhang, L. Kuo, J.C. Liao // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. — 2001.— Vol. 98.- Pp. 11771-11776.

107. Gow A. J., Stamler J.S. Reactions between nitric oxide and haemoglobin under physiological conditions // Nature. 1998.- Vol. 391.- Pp. 169-173.

108. Regulation of nitric oxide consumption by hypoxic red blood cells / Т.Н. Han, E. Qamirani, A.G. Nelson, D.R. Hyduke, G. Chaudhuri, L. Kuo, J.C. Liao // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2003. - Vol. 98. - Pp. 12504-12509.

109. Gow A.J. Nitric oxide, hemoglobin and hypoxic vasodilation // American Journal of Respiratory cell and molecular biology. — 2005. — Vol. 32. — Pp. 479-482.

110. L.L. Moroz., Radbourne S., Winlow W. The use of NO-sensitive microelectrodes for direct detection of nitric oxide (NO) production in molluscs // Acta Biol Hung. — 1995. — Vol. 46. — Pp. 155-167.

111. Анатомия беспозвоночных. Лабораторные животные / А.Д. Ноздрачев, E.JI. Поляков, В.П. Лапицкий, B.C. Осипов, Н.И. Фомичев. — Спб: Лань, 1999.

112. New nitric oxide-releasing zwitterions derived from polyamines / J.A. Hrabie, J.R. Klose, D.A. Wink, L.K. Keefer // J. Org. Chem. 1993. - Vol. 58.- Pp. 1472-1476.

113. Nitric oxide-donor compounds inhibit lipoxygenase activity / M. Macarrone, M.T. Corasan-iti, P. Guerrieri, G. Nistico, A.F. Agro // Biochem. Biophys. Res. Commun.— 1996. — Vol. 219.-Pp. 128-133.

114. Boullerne A.L., Nedelkoska L., Benjamins J.A. Sinergism of nitric oxide and iron in killing the transformed murine oligodendrocyte cell line N 20.1 // J. Neurochem. — 1999. — no. 72. — Pp. 1050-1060.

115. Уменьшение деформируемости эритроцитов у крыс при церебральной ишемии / А.В. Приезжев, Тюрина А.Ю., О.Е. Фадюкова, В.Б. Кошелев // Вюлл. эксп. биол. и мед. 2004. - Т. 137. - С. 352-355.

116. Казаченко В.Н., Гелетюк В. И. Одиночные ионные каналы в нейронах моллюска Lymnaea stagnalis. — М.: Тез. докл. I Всесоюзн. биофиз. съезда, 1982.— С. 51-52.

117. Казаченко В.Н., Гелетюк В.И. Одиночный потенциалзависимый калиевый канал в нейронах моллюска Limnaea stagnalis // Биофизика. — 1983. — № 28. — С. 270-273.

118. Pronase. acutely modifies high voltage-activated calcium currents and cell properties of Lymnaea neurons / P.M. Hermann, K. Lukowiak, W.C. Wildering, A.G. Bulloch // Eur J Neurosci. 1997. - Vol. 9, no. 12. — Pp. 2624-2633.

119. Тасаки И. Проведение нервного импульса. — М.: ИЛ, 1957.

120. Caswell А.Н., Hutchinson J.D. Vizualization of membrane bound cations by a fluorescent tehnique // Biochem. Biophys. Res. Comm. — 1971.— Vol. 42.— Pp. 43-49.

121. Smolen J.E., Weissman G. The effects of various stimuli and calcium antagonists on the fluorescence response of chlorotetracycline-loaded human neutrophils // Biochem. Biophys. Acta.- 1982.- Vol. 720.- Pp. 172-180.

122. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. — М.: Наука, 1980.

123. Toescu Е.С., Verkhratsky A. Assessment of mitochondrial polarization status in living cells based on analysis of the spatial heterogeneity of rhodamine 123 fluorescence staining // Pflugers Arch. — 2000. — Vol. 440. — Pp. 941-947.

124. R.S. Balaban, L.J. Mandel. Optical methods for the study of metabolism in intact cells // Noninvasive Techniques in Cell Biology / Ed. by J.K. Foskett, S. Grinstein.— New York: Wiley-Liss, 1990. Pp. 213-236.

125. Duchen M.R., Biscoe T.J. Mitochondrial function in tyre i cells isolated from rabbit arterial chemoreceptors // J. Physiol — 1992. — Vol. 450. — Pp. 13-31.

126. Kunz W.S. Spectral properties of fluorescent flavoproteins of isolated rat liver mitochondria // FEBS Lett. 1986. - Vol. 195. - Pp. 92-96.

127. Hall C., Kamm H. The purification and some properties of electron transfer flavoprotein and general fatty acyl coenzyme a dehydrogenase from pig liver mitochondria // J. Biol. Chem. 1975. - Vol. 250. - Pp. 3476-3486.

128. In vivo microscopy using the tandem scanning microscope / M. Petran, M. Hadravsky, Benes J., A. Boyde // Ann. N.Y. Acad. Set. — 1986.- Vol. 483. — Pp. 440-447.

129. Synaptic dynamism measured over minutes to months: age-dependent decline in an autonomic ganglion / W.B. Gan, E. Kwon, G. Feng, J.R. Sanes, J.W. Lichtman // Nat. Neurosci.— 2003. Vol. 6. - Pp. 956-960.

130. Nitric oxide inhibits mitochondrial movement in forebrain neurons associated with disruption of mitochondrial membrane potential. / G.L. Rintoul, V.J. Bennett, N.A. Papaconstandinou, I.J. Reynolds // J Neurochem.— 2006. — Vol. 97, no. 3.- Pp. 800-806.

131. Карнаухов B.H., Розанов С.И., В.А. Своренъ. Спектрофотометрические исследования живых нервных клеток надглоточного узла большого прудовика // Биофизика. — 1966.- Т. 11.- С. 1085-1088.

132. Карнаухов В.Н., Розанов С.И., В.А. Своренъ. Живая клетка как объект биофизических исследований // Биофизика живой клетки. 1.— Пущино, 1971.— С. 113-118.

133. Петруняка В.В. Выделение каротиноидсодержащих субклеточных структур из нервной ткани моллюска // Цитология. — 1976.— Т. 18.— С. 1185-1187.

134. Szalontai В., Вадугпка С., Horvath L.I. Changes in the Raman spectrum of frog sciatic nerve during action potential propagation // Biochem. Biophys. Res. Commun.— 1977.— Vol. 76. Pp. 660-665.

135. Исследование нервов при проведении и блоке возбуждения с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния / Г.В. Максимов, Б.О. Тилов, Ю.В. Лихачев, А.А. Чурин, Рубин А.Б. // ДАН СССР. 1982. - Т. 262. - С. 1272-1274.

136. Максимов Г.В. Механизмы перераспределения и транспорта Са2+ при ритмическом возбуждении миелинового нерва. — М.: Докт. дисс., 1997.

137. Исследование вязкости возбудимых мембран с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния / Г.В. Максимов, Ч.Н. Раденович, Ю.Е. Борисова, М.К. Еремич // Биофизика. — 1996. Т. 41. — С. 400-406.

138. Raman spectroscopy of the «potential sensor» of potential-dependent channels / G.V. Maksi-mov, A.A. Churin, V.Z. Paschenko, A.B. Rubin // Gen. Physiol. Biophys. — 1990. — no. 9. — Pp. 353-360.

139. Исследование изменений конформации порфирина гемоглобина при первичной гипер-тензии / Г.В. Максимов, Н.В Максимова, А.А. Чурин, С.Н. Орлов, А.Б. Рубин // Биохимия. 2000. - Т. 66. - С. 365-370.

140. Ленинджер А. Основы биохимии. — М.: Мир, 1985.

141. Hill D.K., Keynes R.D. Opacity changes in stimulated nerve // J. Physiol. (London).— 1949.- Vol. 108.- Pp. 278-281.

142. Cohen L. В., Keynes R. D., Hille B. Light scattering and birefringence changes during nerve activity // Nature. 1968.- Vol. 218.- Pp. 438-441.

143. Noninvasive detection of changes in membrane potential in cultured neurons by light scattering / R.A. Stepnoski, A. LaPorta, F. Raccuia-Behling, J.E. Blonder, R.E. Slusher, D. Kle-infeld // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1991.- Vol. 88.- Pp. 9382-9386.

144. Haller M., Mironov S.L., Richter D.W. Intrinsic optic sygnals in respiratory brain stem regions of mice: neurotransmitters, neuromodulators, and metabolic stress // J. Neurophys-ioL— 2001.— Vol. 86.- Pp. 412-421.

145. Functional optical coherence tomography for detecting neural activity through scattering changes / M. Lazebnik, D.L. Marks, K.L. Potgieter, R. Gillete, S.A. Boppart // Optics Lett. 2003. - Vol. 28. - Pp. 1218-1220.

146. Andreev V.A., Indukaev K.V. The problem of subrayleigh resolution in interference microscopy // Journal of Russian Laser Research. — 2003. — Vol. 24. — Pp. 220-236.

147. Brandon D., Kaplan W.D. Microstructural Characterization of Materials. — Chichester, West Sussex, UK: JohnWiley&Sons Ltd., 1999.

148. Grossmann A., Morlet J. Decomposition of hardy functions into square integrable wavelets of constant shape 11 S.I.A.M. J. Math. Anal. 1984. — Vol. 15. — Pp. 723-736.

149. A double-wavelet approach to study frequency and amplitude modulation in renal autoregu-lation / O.V. Sosnovtseva, A.N. Pavlov, E. Mosekilde, N.-H. Holstein-Rathlou, D.J. Marsh // Phys. Rev. E. 2004. - Vol. 70. - Pp. 031915-1-8.

150. Schreier-Muccillo S., Marsh О. Monitoring the permeability profile of lipid membranes with spin probes // Arch. Biochem. and Biophys.— 1976. — Vol. 172. — Pp. 1-11.

151. Nitric oxide activates multiple potassium channels in canine colonic smooth muscle / S.D. Koh, J.D. Campbell, A. Carl, K.M. Sanders // J. Physiol- 1995.- Vol. 489.-Pp. 735-743.

152. Гелетюк В.И., Казаченко В.Н. Кластерная организация ионных каналов. — М.: Наука, 1990.

153. Hille В. Ionnic channels of exitable membranes. — Washington: University of Washington,1992.

154. Angstadt J.D. Persistent inward currents in cultured retzius cells of the medicinal leech // J. Сотр. Physiol. A.— 1999.- Vol. 184.- Pp. 49-61.

155. Роль SH-групп мембранных белков в регуляции связывания оуабаина и бунгаротокси-на в нерве краба / Г.В. Максимов, Г.Т. Мусуралиева, Е.А. Свердлова, О.Р. Колье // Биофизика. — 1989. Т. 34. - С. 693-695.

156. Waxman S.G., Ritchie J.M. Molecular dissection of the myelinated axon // Ann. Neuro.l. —1993.- Vol. 33.- Pp. 121-136.

157. Максимов Г.В., Орлов C.H. Транспорт ионов кальция при функционировании нервного волокна: механизмы и регуляция. — М.: Изд-во Московского университета, 1994.

158. Влияние белок-липидных взаимодействий в возбудимых мембранах на конформацию С^-каротиноидов / Г.В. Максимов, Г.Т. Мусуралиева, А.А. Чурин, В.З. Пащенко // Биофизика. 1989. - Т. 34. - С. 420-424.

159. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons / G.L. Rintoul, A.J. Filiano, J.B. Brocard, G.J. Kress, I.J. Reynolds // J. Neurosci. — 2003. — Vol. 23.- Pp. 7881-7888.

160. Ligon L.A., Steward O. Movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons // J. Сотр. Neurol.— 2000. — Vol. 427.— Pp. 340-350.

161. Peixoto N., Ramirez F.J. HeWx aspersa identified neurons on multielectrode-array: electrical stimulation and recording // Eur. J. Neurosci. — 2000.— Vol. 12.— P. 155.

162. Szucs A., Molnar G., S-Rozsa K. Periodic and oscillatory firing patterns in identified nerve cells of /ymnaea stagnalis L. // Acta Biol. Hung. — 1999. — Vol. 50. — Pp. 269-278.

163. Landowne D., Cohen L.B. Changes in light scattering during synaptic activity in the electric organ of the skate, raia erinacea // Biol. Bull. — 1969. — Vol. 137.— Pp. 407-408.

164. Mitochondrial organization and motility probed by two-photon microscopy in cultured mouse brainstem neurons / M. Muller, S.L. Mironov, M.V. Ivannikov, J. Schmidt, D.W. Richter // Experimental Cell Research.— 2005. — Vol. 303. — Pp. 114-127.

165. Landowne D., Larsen J.В., Taylor К. T. Colchicine alters the nerve birefringence response // Science. 1983. - Vol. 220. - Pp. 953-954.

166. Froehner S.C. Regulation of ion channel distribution at synapses // Annu. Rev. Neurosci. — 1993.- Vol. 16.- Pp. 347-368.

167. Gibson C.L., Coughlan T.C., Murphy S.P. Glial nitric oxide and ischemia // Gha. — 2005. — Vol. 50.-Pp. 417-426.

168. Mitochondrial respiratory chain and free radical generation in stroke / M.A. Moro, A. Almeida, J.P. Bolanos, I. Lizasoain // Free Radic. Biol. Med. — 2005. Vol. 39. — Pp. 1291-1304.

169. Direct proof of nitric oxide formation from a nitrovasodilator metabolised by erythrocytes / H. Kosaka, S. Tanaka, T. Yoshii, E. Kumura, A. Seiyama, T. Shiga // Biochem. Biophys. Res. Commun.— 1994.- Vol. 204.- Pp. 1055-1060.

170. Выражаю сердечную благодарность научному руководителю Максимову Георгию Владимировичу, благодаря чьим мудрым советам, знаниям, помощи, поддержке и вниманию эта работа оказалась возможной.

171. Выражаю признательность заведующему кафедры биофизики биологического факультета МГУ Рубину Андрею Борисовичу за оказанную поддержку и внимание к моей работе.

Информация о работе

Браже, Надежда Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.02

Диссертация

Механизмы действия оксида азота на мембраны нервных клеток - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Механизмы действия оксида азота на мембраны нервных клеток ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы действия оксида азота на мембраны нервных клеток"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Браже, Надежда Александровна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы действия оксида азота на мембраны нервных клеток"

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Браже, Надежда Александровна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Браже, Надежда Александровна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы действия оксида азота на мембраны нервных клеток
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика