Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы адаптивных сдвигов электрофоретической подвижности эритроцитов крови человека и животных

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы адаптивных сдвигов электрофоретической подвижности эритроцитов крови человека и животных"

О

• г ''

1 ЙАНКТ-ИЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

АХУНОВА АЛИНА РИМОВНА

МЕХАНИЗМЫ АДАПТИВНЫХ СДВИГОВ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ПОДВИЖНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

03.00.13. - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ - ПЕТЕРБУРГ 1998

Работа выполнена в НИИ физиологии им. A.A. Ухтомского

Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель:

доктор биологических наук, с.н.с. В.Б. Матюшичев.

Научный консультант:

кандидат биологических наук, доцент В.Г. Шамратова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, г.н.с. H.A. Емельянов доктор биологических наук, с.н.с. В.И. Морозов

Ведущая организация:

НИИ экспериментальной медицины РАМН

Защита диссертации состоится "..........." ...........1998 г. в ........ часов н

заседании диссертационного совета К 063.57.09 по защите диссертаций н соискание ученой степени кандидата биологических наук в Саню Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Саню Петербург, Университетская наб., 7/9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М. Горького Саню Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан "........." ........... 1998г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Р.И. Коваленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Явления, протекающие на границе раздела по-фхности форменных элементов и плазмы крови, могут решающим образом "¡ределятъ течение физиологических процессов, в которых участвуют клетки зови. Эти явления имеют иервостепешюе значение для состояния крови и зежде всего для ее реологических свойств.

Одним из важнейших показателей, ответственных за оптимальную мик-зреологию крови, является заряд эритроцитов, косвенно оцениваемый по их тектрофоретической подвижности (ЭФП). Уменьшение ЭФП эритроцитов )ФПЭ) сопровождается нарушением суспензионной стабильности крови, по-лшением степени агрегации эритроцитов и ухудшением микроциркуляции. В 5язи с этим поддержание ЭФГ1Э на оптимальном уровне чрезвычайно важно, :обенно в состояниях, характеризующихся напряжением регуляторных меха-язмов гомеостаза, как например при стрессе [Бароненко, Шамратова, 1992]. онятно, что изучение путей контроля ЭФПЭ крови весьма актуально.

Недавно выявлено, что обеспечение стабильного уровня ЭФПЭ в крове-эсном русле в норме, в экстремальных состояниях и при патологии достигает-I путем перераспределения долей клеток в общем пуле, выражающемся в из-енении показателей кривой распределения эритроцитов по ЭФП [Шамратова и э., 1995]. Однако тонкие механизмы такого перераспределения и регуляторные ¡енья, определяющие изменения структуры эритроцитарной популяции, оста-тся неизвестными. Динамика самой этой структуры также не изучена. С этих эзиций представляет интерес выяснение характера разнообразных адаптивных 1вигов ЭФПЭ, а также особенностей действия на ЭФПЭ веществ, оказывающее существенное влияние на состояние мембран эритроцитов (МЭ). К числу псих агентов можно отнести, в частности, строфантин - ингибитор натриевого зсоса и адреналин - важнейший атрибут стрессорной реакции. Влияние этих ;ществ на электрокинетические свойства популяций эритроцитов недостаточ-з изучено, не раскрыты и механизмы их корректирующего действия.

Цель исследования заключалась в изучении особенностей регуляции гектрокинетических свойств эритроцитов человека и животных в норме, в экс-земальных состояниях и при некоторых видах патологии.

Задачи исследования:

1. Исследовать структуру популяций эритроцитов крови по ЭФП клеток людей разного пола и возраста.

2. Изучить изменения ЭФПЭ человека и поведение эритроцитарной позиции при эмоциональном напряжении и психофизических нагрузках, а так-е при воздействии на животных различных экстремальных факторов и в усло-1ях адаптации к ним.

3. Изучить связь ЭФПЭ с кислотной резистентностью эритроцитов, их зъемом и содержанием гемоглобина (НЬ) в клетках.

4. Проанализировать поведение эритроцитов в модельных опытах с добавлением в среду инкубации адреналина и строфантина.

5. Изучить зависимость изменений скорости оседания эритроцитов (СОЭ) от их ЭФП.

Научная новизна исследования. Впервые изучены особенности структуры популяций эритроцитов по ЭФП. Выявлена половая и возрастная специфика популяций эритроцитов по ЭФП у человека. Описаны основные тенденции в изменении свойств эритроцитарной популяции по ЭФП при действии на организм человека и животных экстремальных факторов и при патологии. Прослежена их связь с изменениями объема эритроцитов и устойчивостью клеток красной крови к кислотному гемолизу. С помощью модельных опытов in vitro продемонстрирована возможная роль адреналина в наблюдаемых элекгрокине-тических эффектах. Обнаружено, что влияние на ЭФПЭ строфантина in vitro зависит от соотношения в общей популяции долей эритроцитов с различными электрокинетическими свойствами. Модулирующее действие строфантина на подвижность эритроцитов крови человека и животных может видоизменяться при патологии, экстремальных воздействиях и в ходе физиологической адаптации. Получены оригинальные данные о взаимосвязи скорости оседания эритроцитов и их подвижности. Эта связь, как оказалось, проявляется по-разному в зависимости от среднего уровня показателей и существенно выражена при патологии.

Практическая значимость работы связана с разработкой прецизионного методологического подхода к анализу эршроцитарных популяций (открывающего новые перспективы в изучении их структуры) и с выявленной в исследовании возможностью разграничения степени предъявляемой организму нагрузки на базе комплексной оценки показателей формы электрокинетических эритрограмм и учета соотношения долей клеток с различной ЭФП, а также по эффективности и направленности действия на эритроцитарную популяцию модуляторов ее биоэлектрических свойств.

Положения, выносимые на защиту.

1. Структура популяций эритроцитов человека по их электрокннетиче-ским свойствам неоднородна, имеет половые и возрастные особенности. Она изменяется при эмоциональном и психофизическом напряжении организма, а также при различных заболеваниях.

2. У половозрелых интактных крыс-самцов структура популяции эритроцитов близка к таковой у здоровых взрослых людей. Адаптация животных к экстремальным воздействиям (холод, ожог) сопровождается зависящим от ее сроков перераспределением в кровеносном русле долей клеток с высокой ЭФП и эритроцитов с пониженным электрокинетическим потенциалом (ЭКП).

3. Адреналин in vitro повышает среднюю ЭФПЭ крыс и изменяет соотношение клеток с различными электрокинетическими свойствами. Аналогичный эффект наблюдается при действии гормона на эритроциты крови, взятой у здо-

ового человека в состоянии эмоционального покоя. Реакция клеток на адрена-:ин модифицируется при изменении функционального статуса организма.

4. Строфантин in vitro оказывает модулирующее воздействие на труктуру эритроцитарной популяции, заключающееся в сбалансировании [олей клеток с различной ЭФП. Характер влияния строфантина зависит от сачального состояния эритроцитов по их электрокинетическим свойствам.

5. Характер и выраженность взаимосвязи СОЭ и ЭФПЭ зависит от реднего уровня обоих показателей.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, кспериментальной части, заключения, выводов и списка использованной итературы. Работа иллюстрирована 29 таблицами и 10 рисунками, »иблиографический указатель содержит 198 источников отечественной гитературы и 64 работы иностранных авторов.

Апробация диссертационного материала.

Положения диссертации доложены на конференциях "Современные ¡спекты поликлинической терапии" (Уфа, 1994) и "Экологогигиеническая сарактеристика объектов окружающей среды в районах промышленных 1ентров" (Уфа, 1995). По материалам диссертации опубликовано 5 печатных >абот.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ*

Исследования проводились на крови беспородных белых крыс-самцов п=167) с исходным весом 150-200 г, а также крови клинически здоровых лиц доноры крови, студенты, спортсмены, дети, п=448), больных келезодефицитной анемией (п=71), с заболеваниями почек (n=51) и онкологических больных (п=48).

В качестве нагрузок на животных использовали внутрижелудочное ¡ведение тиреоидина, хроническое охлаждение и термический ожог. Ожоги у фыс вызывали погружением наркотизированных животных с предварительно шбритой на спине шерстью на 5с в кипящую воду спиной вниз. Ступенчатая адаптация крыс к холоду достигалась ежесуточным их охлаждением в течение 5 недель при -4°С. Первоначальная экспозиция животных составила 15 мин, в дальнейшем длительность сеанса ежесуточно возрастала на 10 мин. Тиреоидин вводили одноразово (контроль) или на протяжении всего срока адаптации 2 эаза в неделю перед сеансом охлаждения, внутрижелудочно в дозе 100 мг/100 г пассы животного. Адреналин и строфантин в опытах in vitro вносились в среду эазведения в концентрации 10"5 М.

Экспериментальный материал получен на кафедре морфологии и физиологии человека и животных БашГУ шд руководством доц. Шамратовой В.Г. Пользуясь случаем, выражаю благодарность за предоставление ошаического материала проф. Ф.С. Галееву и к.м.н. И.В. Кудрявцевой.

В образцах цельной крови определяли ЭФГ1Э, количество эритроцитов, содержание НЬ, гематокрит, среднее содержание НЬ в эритроците, среднюю концентрацию НЬ в эритроците, объем эритроцитов, а также их кислотную резистентность.

Анализ ЭФПЭ проводили на автоматической установке "Pajrmoquant-2" при 25°С. Для регистрации ЭФПЭ 0,02 мл крови разбавляли в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,4) в соотношении 1:200. Результаты сканирования 150-300 клеток каждой аликвоты вводили в ЭВМ для расчета индивидуальных и суммарных характеристик распределения ЭФПЭ. Для более полного аналитического описания эритроцитарной популяции нами использовались, кроме средних показателей, коэффициенты асимметрии (As) и эксцесса (Ех). Анализ формы гистограммы по выраженности её асимметрии и эксцесса использовался нами с целью выделения в общей популяции клеток красной крови отдельных субпопуляций и оценки их доли в общей совокупности эритроцитов.

Определение других гематологических показателей проводилось на количественном, автоматическом гематологическом анализаторе Coûter. Кислотная резистентность эритроцитов определялась по методу, разработанному И.И. Гительзоном и И.А. Тереховым (1960).

Статистическую обработку полученных результатов проводили на IBM методами корреляционного и множественного регрессионного анализа с использованием стандартных пакетов программ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Анализ структуры популяций эритроцитов ио ЭФП 1.1. Анализ структуры популяций эритроцитов по ЭФП у человека в норме, при психофизическом напряжении в при патологии

Для дифференциального описания эритроцитарных популяций широко используется анализ гистограмм распределения эритроцитов по их диаметру и площади. Успешно применяется для решения практических и теоретических задач метод кислотных эритрограмм.

Более полно охарактеризовать состояние эритроцитарной популяции, оценить особенности распределения эритроцитов по различным морфологическим и функциональным параметрам [Леонова, 1987] и электрокинетическим свойствам [Шамратова и др., 19 89; Шамратова и др., 1995] не только качественно, но и количественно позволяет использование коэффициентов As и Ех. Нами применена новая методология такого анализа, резко повышающая эффективность исследования структуры популяций эритроцитов в совокупностях людей и животных. В качестве основного критерия разграничения мы выбрали критический уровень As для рассматриваемой индивидуальной пробы. Выделенные варианты формы распределения ЭФПЭ обозначены нами как

"отрицательный", тип 1 (А£<-0.2), "нейтральный", тип 2 (Аз от -0.2 до 0.2) и "положительный", тип 3 (Ав>0.2).

Проведенные исследования показали, что соотношение различных типов распределений эритроцитов по ЭФП у человека имеет как половые, так и возрастные особенности (табл.1). В частности, среди женщин в отличие от мужчин, заметно преобладание типов распределения ЭФПЭ с наличием субпопуляций эритроцитов с более высоким, чем среднепопуляционный, поверхностным потенциалом ("отрицательный", тип 1). Встречающиеся пробы крови с повышенной и средней ЭФП клеток для них примерно равны, тогда как среди мужчин более половины общей совокупности характеризуется нормальным распределением эритроцитов крови по ЭФП. При этом относительная доля проб крови с преимущественно пониженной подвижностью эритроцитов у мужчин и женщин практически равны.

Анализ более ограниченной выборки, проведённый в идентичных условиях сопоставления, показал, что разница типов долей клеток с разной ЭФП отражается и на валовом показателе: средняя ЭФПЭ у девушек 17-18 лет оказалась достоверно (на 3.7%) выше, чем у их ровесников - юношей.

Таблица 1

Соотношение частоты встречаемости различных типов форм распределения

ЭФПЭ (в %, р ± Шр)

Группа Возраст Инте рвал варьирования Аз

1 2 3

мужчины (п=50) женщины (п=95) мальчики (п=21) девочки (п=18) 17-35 лет 17-35 лет 4-13 лет 4-13 лет 26,7 ± 6,3** 55,0 ± 7,0** 19,3 ±5,6 42,7 ± 5,0* 41,3 ± 5,0 15,0 ±3,7 65,5 ± 10,4 20,7 ± 8,8 13,8 ±7,5 33,3 ±11,1* 47,5 ±11,8 19,2 ±9,3

*- отмечено достоверное отличие показателя по полу при р <0,05

**- отмечено достоверное отличие показателя по возрасту при р <0,05

У мальчиков, особенно 4-6-летнего возраста, в противоположность картине, отмеченной для взрослых, частота встречаемости субпопуляций клеток с повышенной ЭФПЭ значительно выше, чем у девочек. Тем не менее у девочек, как и у девушек 17-19 лет, средняя ЭФПЭ достоверно выше, чем у мальчиков того же возраста (1,04 ± 0,01 - у девочек, 0,99 ± 0,01 - у мальчиков).

Проведенные исследования показали, что структура эритроцитарных популяций по ЭФП у здоровых людей изменяется с возрастом: уменьшается доля клеток с повышенной подвижностью и увеличивается - с пониженной подвижностью. У жетции эта тенденция выражена слабее, чем у мужчин. В отличие от детей, у взрослых популяции эритроцитов характеризуются меньшей однородностью клеток по ЭФП. Достоверной связи средних ЭФПЭ с возрастом людей старше 19 лет нами не обнаружено. Анализ средних ЭФПЭ по различным воз-

растньш группам показал отсутствие значимых онтогенетических изменений этого показателя. У взрослых он устанавливается на достаточно стабильном уровне, близком к рассчитанному нами у девочек. Этот уровень колеблется в различных выборках о г 1,03 ± 0,02 до 1,07 ± 0,01 и не зависит от пола. Интересно, что такая же каргина обнаружена и в отношении кислотной резистентности эритроцитов. Так, показано, что в старших возрастных группах половые различия по эритрограмме лежат на границах достоверности [Леонова, 1987].

Таким образом, с возрастом происходит нивелирование различий валового ЭКП между муж-чинами и женщинами, но сохраняются отличия в структуре популяции. Причём изменения качественного состава эритроцитов с возрастом отчётливей проявляются у представителей мужского пола.

При психоэмоциональном напряжении организма и некоторых заболеваниях нами обнаружены существенные изменения в соотношении различных типов форм распределения эритроцитов по ЭФП. В этих случаях преобладает единая тенденция, выражающаяся в уменьшении доли клеток с повышенным ЭКП и увеличении - с пониженным потенциалом. При патологии наряду с перераспределением субпонуляций эритроцитов по ЭФП возрастает однородность распределения и вероятность появления эритроцитов с любыми значениями подвижности становится примерно одинаковой. Интересно, что у больных, в отличие от здоровых лиц, стираются половые особенности состава популяций эритроцитов, а также средних ЭФПЭ.

1.2. Анализ структуры популяций эритроцитов по ЭФП у крыс в норме и при экстремальных воздействиях

В табл.2 приведены данные, показывающие соотношение частоты встречаемости трёх типов форм распределения ЭФПЭ у половозрелых белых крыс-самцов. Видно, что у интактных крыс сохраняется соотношение, близкое к описанному нами у человека: то есть примерно 1/3 часть клеток относится к популяциям с "отрицательным" типом распределения, 1/4 - имеют "положительный" тип, остальные приходятся на распределения, близкие к нормальным. Аналогичные данные по группам экспериментальных животных свидетельствуют о перераспределении отдельных субпопуляций эритроцитов в общем пуле при воздействиях на них различных факторов. Так, при адаптации к действию холода в кровеносном русле крыс накапливаются клетки с более высокой ЭФП, чем средний уровень показателя, и уменьшается встречаемость клеток с пониженным ЭКП. Наиболее резкие изменения элекгрокинетических свойств эритроцитов наблюдаются при ожоговом повреждении тканей крыс, когда уменьшается средний уровень ЭФПЭ (14-е сутки) или возрастает доля клеток с пониженной подвижностью (3-й сутки).

Таблица 2

Соотношение частоты встречаемости различных типов форм распределения ЭФПЭ у белых крыс (в %, р±шр)

Группа п Интервал варьирования As

крыс 1 2 3

интактные 133 33,8 ± 4,1 42,0 ± 4,3 24Д ± 3,7

на 3-е сутки после ожоговой травмы 10 40,0 ± 15,4 33,3 ± 14,9 26,7 ± 14,0

на 14-е сутки после ожоговой травмы 10 20,0 ± 12,6 60,0 ± 15,5 20,0 ± 15,5

кратковременно адаптированные к холоду 29 52,0 ± 9,3* 41,0 ± 9,1 7,0 ± 4,7*

долговременно адаптированные к холоду 34 62,0 ± 8,3* 33,0 ± 8,1 5,0 ± 3,7*

*- отмечено достоверное отличие от контроля при р<0,05

2. Механизмы регуляции электрокинетических свойсгв эритроцитов адреналином 2.1. Влияние адреналина на ЭФПЭ в опытах in vitro

Опыты показали, что адреналин, внесенный в среду разведения в дозах 1СГ4 - 10^ М, увеличивает подвижность эритроцитов крыс в электрическом поле и (или) изменяет соотношение субпопуляций эритроцитов с различными электрокинетическими свойствами. Характерной особенностью действия адреналина in vitro является увеличение разнородности популяции клеток по ЭФП. Можно предположить, что наблюдаемые нами in vitro электрогенные эффекты гормона реализуются через мобилизацию собственных энергетических ресурсов эритроцитов.

Аналогичные данные получены нами в опытах на образцах крови здоровых людей (юношей - спортсменов, девушек - студенток), пребывающих в со-стояшт относительного физического и эмоционального покоя. Вместе с тем реакция ЭФПЭ на действие in vitro адреналина модифицируется при изменении функционального состояния организма: после выполнения физической нагрузки спортсменами и при сдаче студентами экзаменов. В частности, распределения ЭФПЭ, имеющие в исходных пробах островершинный вид, трансформируются в плосковершинные или двувершинные, и наоборот. При этом обращает на себя внимание факт изменения среднего уровня ЭФПЭ (Мх или Me) и увеличение разнородности эритроцитов у спортсменов после физического перенапряжения и студенток при сдаче экзамена. Очевидно, действие гормона in vitro зависит от исходного состояния электроповерхностных процессов в эритроцитах, меняющегося при переходе организма в иной функциональный статус.

2.2. Изучение механизмов изменений ЭФПЭ при эмоциональных нагрузках

Разумеется, экстраполяция полученных в наших опытах результатов ж условия in vivo, как и интерпретация фактов, требуют осторожности. Проведенные эксперименты позволяют лишь предполагать, что, поскольку адреналш способен влиять на ЭФПЭ in vitro, он влияет на это свойство эритроцитов и i кровотоке. В организме человека участие гормона в регуляции электрокинетических свойств эритроцитов при стрессе может осуществляться не только чере: местные, но и через системные механизмы.

В этой связи нами изучены другие показателя красной крови при эмоцио нальном стрессе у студентов. Как вытекает из табл.3, средний объем эритроци тов (ОЭ) достоверно возрастает уже перед экзаменами и остается повышеннь» после устранения стрессирующего фактора.

Таблица.

Характеристики эритроцитов крови студентов во время сдачи экзаменов

Группа студентов п Объём эритроцитов, JJ Средняя концентрация HI в эритроците г/л

М±т AS ± IIlAs Ex ± шЕх

контроль 16 96,5 ± 1,1 1,17 ±0,04 1,39 ±0,07 303 ±7

до экзамена 16 98,3 ± 1,0* 1,33 ±0,07 1,70 ±0,21 281 ±4*

после экзамена 16 98,4 ± 1,0* 1,39 ±0,07* 1,77 ±0,17* 271 ±3*

* достоверно отличается от контроля (р<0,05).

Перед экзаменами несколько возрастает однородность основной субпоп) ляции клеток (увеличение Ех распределения) и усиливается асимметричност распределения, выражающаяся в увеличении хвоста гистограммы распределс ния по ОЭ. После сдачи экзаменов наметившиеся тенденции становятся оч£ видными.

Можно полагать, что обнаруженные изменения обусловлены прежде все го "омоложением" эршрона вследствие активации эритропоэза. На это указь: вают результаты измерений кислотной резистентности эритроцитов, проведег ных нами на пробах крови тех же студентов. Перед экзаменами в кровеносно русле студентов циркулируют наряду с клетками, имеющими обычную стг бильность, высокоустойчивые молодые формы эритроцитов, а также клетки пониженной резистентностью. После сдачи экзаменов возрастная разнокачес' венность эритрона сохраняется, хотя и приобретает новые черты, указывают» на более заметное накопление в циркуляции доли функционально старых эри' роцитов.

Уменьшение средней концентрации НЬ в эритроцитах студентов (табл..' свидетельствует о том, что выбрасываемые при стрессе "молодые" клетки, 041

видно, не являются полноценными. В ходе сдачи экзамена этот процесс усугубляется, о чем можно судить по накоплению в сосудистом русле макроцитов и уменьшению общей и средней в отдельном эритроците концентрации НЬ. Одновременно в крови студентов после экзамена увеличивается относительная доля слабоустойчивых клеток. Есть основания связать наблюдаемые явления с эффектами адреналина, реализующимися на системном уровне. Так, согласно данным литературы [Троицкий, 1967; Бароненко, Шамратова, 1988], качественные и количественные изменения в структуре эритрона под влиянием гормона могут быть опосредованы через активацию кроветворения, мобилизацию кровяного депо и т.д.

Преобразование возрастной структуры эритрона, несомненно, способно внести свой вклад в наблюдаемую картину поведения ЭФПЭ, если учесть, что молодые формы эритроцитов обладают более высоким, а старые - низким ЭКП [Мирошников и др. ,1986]. Действительно, нами отмечено повышение подвижности эритроцитов (Ме распределения) у студентов перед экзаменами и ее снижение после сдачи экзамена.

3. Изучение реакции ЭФПЭ крови человека и животных на воздействие

строфантином

3.1. Реакция ЭФПЭ крови у человека в норме, в состояшш стресса и при

патологии

Эршроцитарная мембрана осуществляет координацию работы клетки в зависимости от физических и химических сигналов, поступающих к ней в организме. Существенная роль в ответной реакции клетки на эти сигналы принадлежит ионным каналам. В эритроцитах активный транспорт ионов осуществляется К+ - АТФазой. Важным инструментом исследования активности Иа+, К+ - АТФазы является использование в модельных опытах уабаина (строфантина). Учитывая, что заряд эритроцитов, ионный баланс в них и активность ионного транспорта тесно взаимосвязаны, мы в своей работе попытались изучить закономерности реакции клеток красной крови на строфантин и оценить границы его модулирующего воздействия на ЭКП эритроцитов человека и животных.

Оказалось, что не существует корреляции между уровнем Аб до и после внесения строфантина в пробы крови людей. Вместе с тем выявилась достаточно выраженная отрицательная корреляция между исходным уровнем Ав и ДАя (г= -0.71, р<0.01). Иными словами, чем более положителен данный коэффициент в исходном состоянии, тем значительнее является его сдвиг в сторону отрицательных значений и наоборот. Исходные значения Ав задают прежде всего направленность и (менее определенно) величину происходящих изменений, а сам ингибитор вызывает наиболее радикальные изменения формы кривой распределения именно при ее резких отклонениях от симметричной (нормальной,

гауссовой), то есть, при существенном преобладании клеток с чрезмерно низким или высоким (по отношению к среднему уровню) поверхностным зарядом. Уточнить и дополнить сведения, полученные при суммарном анализе массива, позволило разграничение всего диапазона варьирования As на три поддиапазона, интервала. Выяснилось, что примерно половина проб крови исходно имеет форму распределения ЭФПЭ, близкую к нормальной, 32% характеризуется сдвигом моды распределения в область относительно высоких и 22% - в область относительно низких значений ЭФПЭ. Внесение строфантина in vitro вызывало в пробах крови, относящихся к крайним ("отрицательному" и "положительному") классам, перераспределение долей эритроцитов с разным зарядом в сторону "нормализации" - смещение моды распределения из крайнего левого или правого положешш в "нейтральную" область, симметризацию его формы. При этом модули средних уровней сдвига As в крайних классах практически идентичны. Обращает на себя внимание то, что в "нейтральном" интервале данный кардиостероид практически не влияет на величину As, не вызывает его перемещений за границы диапазона симметричности. Иными словами, строфантин, по-видимому, выравнивал доли эритроцитов с ЭКП выше или ниже среднего по популяции уровня лишь в том случае, если имело место существенное преобладание клеток с повышенным или пониженным уровнем их ЭФП.

Эго предположение было проверено корреляционным анализом рассматриваемых показателей по каждому из выделенных интервалов. Исходные и конечные значения As не коррелировали ни в одном из них. Между же значениями As и AAs, напротив, была обнаружена отчётливая линейная корреляция, но только в крайних - "отрицательном" и "положительном" интервалах: г = -0,55 и г = -0.79 (р<0,01) соответственно. В "нейтральном" классе значимых корреляций этих параметров выявлено не было.

Оценка ситуации в различных подгруппах (в диапазоне норма - стресс -патология) показала, что контроль по форме распределения практически воспроизводит картину, описанную для всей выборки в целом: 33% проб попадают в "отрицательный" интервал, 53% - в нейтральный и 14% - в "положительный". При эмоциональном стрессе у студентов на экзамене наблюдается деформация этого распределения: доля проб в "отрицательном" интервале As возрастает до 46%, в "положительном" снижается до 8% и несколько уменьшается в "нейтральном".

Заметный эффект от введения строфантина наблюдался у онкобольных, когда в присутствии ингибитора возрастал и средний уровень ЭФПЭ. При почечной патологии строфантин, как и в описанных выше ситуациях, обеспечивал условия для установления относительного равенства долей клеток с повышенным и погашенным зарядом, что внешне выражалось в сдвиге As в сторону противоположных по знаку значений.

Полученный нами материал показывает, что строфантин in vitro оказывает на ЭКП эритроцитов модулирующее действие, выражающееся в трансформации

резко асимметричных распределений эритроцитов по ЭФПЭ в относительно симметричные. В результате клетки с ЭКП выше и ниже среднепопуляционного уровня встречаются примерно в равной степени, а основная их масса имеет подвижность, незначительно отличающуюся от такового. Можно полагать, что субпопуляции эритроцитов с повышенной ЭФПЭ представлены в основном эритроцитами с высоким уровнем энергообмена. Вопрос о характере механизма наблюдаемого in vitro повышения ЭФП в субпопуляциях эритроцитов с исходно пониженным уровнем ЭКП в присутствии строфантина остается дискуссионным. Можно допустить, что к этому причастиы С а2' - зависимые К+ - каналы.

3.2. Влияние строфантина на ЭФПЭ крови крыс

Изучение закономерностей реакции на ингибитор натриевого насоса эритроцитов крови интактных белых крыс показало, что среднее значение As составило до введения строфантина -0,01 ± 0,04 и -0,14 ± 0,04 после его воздействия (AAs=-0,13 ± 0,05). По принципу, описанному для эритроцитов человека, было произведено деление всего массива данных на классы (табл.4).

Как видно из табл.4, соотношение субпопуляций эритроцитов у крыс существенно не отличается от наблюдаемого у человека. Внесение in vitro строфантина вызывает некоторый сдвиг вершины суммарной кривой распределения в область высоких ЭФПЭ. Обращает на себя внимание факт, что по отдельным классам конечный результат воздействия строфантина неоднозначен: в первом, "отрицательном" классе As распределения сохраняется на достоверно превышающем критический (по модулю) уровне, во втором - гистограмма остаётся относительно симметричной, в третьем - трансформируется в симметричную. Следовательно, влияние кардиостероида проявляется в отношении субпопуляций эритроцитов с пониженной ЭФП, но практически не сказывается на состоянии субпопуляции клеток с увеличенной ЭФП. При этом корреляция между исходным уровнем As и величиной индивидуальных сдвигов показателя (AAs) в целом по выборке составила г= -0.65, р<0.01, а по отдельным классам, соответственно: г= -0.37, р<0.05; г= -0.28, р<0.05; г= -0.81, р<0.01.

Таблица 4

Средние величины As ЭФПЭ до и после внесения строфантина

у интактных крыс

Условия опыта Интервал варьирования As

1 2 3

п=45 п=56 п=32

до строфантина -0.45 ± 0,03 -0.01 ± 0,02 0.59 ± 0,04

после строфантина -0.31 ±0,03* -0.09 ± 0,02* 0.00 ±0,04*

AAs 0.14 ±0,03 -0.08 ± 0,02 -0.59 ± 0,04

*- отмечено достоверное отличие от показателя до внесения строфантина при р<0,05

Таким образом, у интакгных крыс наиболее отчётливо действие строфантина проявляется в случае, когда в крови превалируют субпопуляции эритроцитов с пониженным ЭКП. Возможно, причиной различной эффективности строфантина по отношению к эритроцитам человека и крыс со сниженной ЭФП является неодинаковая проницаемость МЗ для ионов [Орлов и др., 1988].

Аналогичный анализ проведён нами по данным электрофоретических исследований крови белых крыс, подвергнутых ступенчатой адаптации к холодо-вой нагрузке. Известно, что при адаптации организма к холоду, являющемуся одним из ведущих и длительно действующих на животный организм экстремальных факторов внешней среды, происходит перестройка тотального энергообмена и активности Ыа+-насоса [Медведев, 1983, 1985; Медведев, Замой, 1984]. При кратковременной адаптации к холоду животных (2 недели) наблюдалась картина, принципиально сходная с описанной нами у человека: строфантин ш укго выравнивал доли эритроцитов с поверхностным потенциалом, значительно отличающимся от среднегруппового уровня, практически не затрагивая субпопуляции с гауссовским распределением клеток. Это подтверждает анализ корреляций между исходным уровнем Аэ и ААб: в целом по выборке г = -0.82 (р<0.01), в "отрицательном" и "положительном" классах соответственно г = -0.59, р<0.05 и г = -0.81, р<0.01.

Изучение суммарной величины Аь распределений ЭФПЭ (-0,40 ± 0,06 и -0,21 ± 0,06, соответственно до и после внесения строфантина), а также соотношения классов с различной Аб у животных, подвергнутых длительному охлаждению (6 недель), показало, что в крови резко увеличивается доля клеток с более высокой, чем в среднем по выборке ЭФП (около 65%). Субпопуляции, характеризующиеся превалированием клеток с пониженным потенциалом, становятся единичными. После внесения в пробы крови строфантина доля субпопуляций эритроцитов с увеличенной ЭФП, хотя и остаётся высокой, достоверно уменьшается.

Корреляционный анализ показал, что исходная величина Аб распределения определяет направленность и величину её сдвигов после внесения строфантина (ДАя): г = -0.62, р<0.01. Однако анализ этих взаимосвязей по интервалам значений Аз выявил их достоверность лишь в первом, "отрицательном" диапазоне (г = -0.78, р<0.01). Одновременно здесь обнаруживается и корреляция между исходным и конечным уровнем Аб (г = -0.43, р<0.05). Таким образом, действие ингибитора натриевого насоса тем эффективнее, чем более выраженным является преобладание в крови субпопуляций с повышенной ЭФПЭ. Это указывает, очевидно, на активацию функций натриевых насосов в МЭ. Подобное заключение хорошо согласуется с уже высказанным предположением о связи увеличения пула клеток, чувствительных к действию строфантина, с омоложением эригроцитарной популяции [Бароненко, Шамратова, 1992].

Уровень средней ЭФПЭ находился на верхней границе нормы вплоть до 30-х суток холодовой адаптации. Однако к концу срока эксперимента (то есть

на 6 неделе адаптации) ЭФПЭ крыс достоверно снижалась, при этом отмечались наиболее резкие изменения в структуре эритроцитарной популяции.

Известно, что важнейшими факторами, обеспечивающими адаптацию организма к низкой температуре, являются тиреоидные гормоны [Теппермен Дж., Тенпермен X., 1989]. Учитывая это, следующим этапом нашей экспериментальной работы явилось изучение поведения эритроцитарной популяции при хроническом охлаждении животных (в течение 6 недель), сочетающемся с введением в организм тиреоидина.

Средняя по этой группе As ЭФПЭ составила 0,51 ± 0,11 до и -0,11 ± 0,05 после внесения in vitro строфантина. В целом реакция клеток на строфантин по отдельным интервалам соответствует наблюдаемой в вышерассмотренной группе длительно адаптированных животных. Однако само соотношение частоты встречаемости различных типов распределений, а также средняя по группе As в исходных пробах имеют существенные отличия. Они заключаются в увеличении доли субпопуляций эритроцитов с положительной асимметрией распределения и, соответственно, результируются положительно-асимметричным распределением суммарной выборки. Причем эти субпопуляции эритроцитов наиболее активно реагируют на экзогенный строфантин (в отличие от аналогичной группы без внесения гормона),что подтвердил проведенный корреляционный анализ.

В том, что наблюдаемые эффекты связаны с действием высоких концентраций тиреоидина, убеждает анализ показателей ЭФПЭ, полученных через час после одноразового введения гормона интактным крысам. Тиреоидин in vivo в целом увеличивает ЭФП клеток (в среднем на 6,4%) и перераспределяет в общем пуле клетки с различной ЭФП. При этом, судя по значению коэффициента As (0.20 ± 0.06), преобладающими в сосудистом русле являются клетки, имеющие более низкий, чем средний по популяции, потенциал.

4. Изучение связи электрокинетических свойств эритроцитов крови со скоростью их оседания

Алализ связей между параметрами ЭФПЭ и,СОЭ проводился как на суммарной выборке, составленной из показателей здоровых и больных доноров, так и раздельно в группе контроля и в совокупности но каждому виду патологии. При проведении корреляционного анализа по всему массиву данных не удалось обнаружить достоверных линейных связей показателей во всех вариантах исследования. Следует заметить, что отсутствие корреляции СОЭ с потенциалом отмечалось ранее у различных животных (Смирнов и др., 1990). Однако изучение зависимости средней ЭФПЭ от вариаций СОЭ методом регрессионного анализа в суммарной выборке показало, что возрастание СОЭ от 4,5 до 10 мм/ч сочетается с увеличением ЭФПЭ. При дальнейшем повышении СОЭ отмечается постепенное снижение подвижности эритроцитов, переходящее в стабилизацию показателя.

Корреляционный анализ, проведешшй по данным отдельно взятых интервалов (соответствующих наиболее заметному взаимодействию рассматриваемых параметров по полученной кривой), показал, что наиболее тесно СОЭ и ЭФПЭ связаны в интервале колебаний СОЭ, соответствующем 14-24 мм/ч (г=-0,46, р<0,05). Зависимость описывается уравнением линейной регрессии: Мх = 0,91-0,01 х СОЭ.

Проведенные исследования выявили, что только в небольших диапазонах варьирования СОЭ изменения показателя сочетаются с распределениями ЭФПЭ, заметно отличающимися от нормального. Наиболее асимметричные распределения приходятся на значения СОЭ около 9,5 мм/ч. В этом случае в крови преобладают клетки с повышенной ЭФП. Самым высоким значениям СОЭ (выше 38 мм/ч), наоборот, соответствуют распределения с положительной асимметрией. Сопоставление полученных кривых показывает, что наиболее высокий уровень средней ЭФПЭ и наиболее трансформированный профиль гистограмм ЭФПЭ приходятся на один и тот же интервал СОЭ. Он укладывается в границы физиологической нормы. Дальнейшее увеличение СОЭ или же его уменьшение сопряжено с уменьшением средней ЭФПЭ и доли клеток с повышенным ЭКП. Очевидно, изменения среднего уровня подвижности эритроцитов при колебаниях СОЭ в физиологических границах обусловлены в первую очередь перераспределением в сосудистом русле долей клеток с различной ЭФП.

Изучение контрольной выборки показало отсутствие зависимости между СОЭ и средней ЭФПЭ. В то же время изменение формы распределения эритроцитов по ЭФП ощутимо сказывается на величине СОЭ. Увеличение коэффициента асимметрии сочетается сначала с постепенным, а затем с резким снижением СОЭ. Таким образом, у здоровых людей преобладание в кровеносном русле эритроцитов с повышенным ЭКП (отрицательная асимметрия распределения) соответствует высокому (в пределах клинической нормы) уровню СОЭ. Распределениям, близким к нормальным, а также имеющим увеличенную долю эритроцитов с уменьшенной ЭФП, соответствуют относительно низкие значения СОЭ. Наиболее выраженное накопление в циркуляции клеток с пониженной подвижностью отмечается у лиц , имеющих крайне низкую скорость оседания клеток (2-3 мм/ч).

У больных с почечной патологией (хронический пиелонефрит, гломеру-лонефрит) статистически достоверным является изменение СОЭ по мере возрастания среднего уровня ЭФПЭ. Однако заметно эта связь выражена только при низких значениях подвижности эритроцитов: чем ниже у больных пациентов подвижность эритроцитов в электрическом поле (начиная с уровня ЭФПЭ 0.77x10"8 м2/ус), тем быстрее они оседают. Причем значениям СОЭ до 15 и выше 50 мм/ч соответствуют наиболее асимметричные распределения: при низких скоростях оседания преобладают доли клеток с повышенной подвижностью (отрицательная Аб), при высоких - с пониженной ЭФП (положительная Аз). В

фомежутке между этими границами колебания коэффициента асимметрии троисходят на уровне, близком к нулю.

У больных раком желудка нами выявлена отрицательная корреляция ме-кду уровнем СОЭ и медианой распределения (г=-0,44, р<0,05).

Таким образом, в норме (контрольная группа) связь между изменением :реднего уровня ЭФПЭ и величиной СОЭ не обнаруживается. Однако имеющая место зависимость СОЭ от характера распределения клеток по электрокинети-тсским свойствам убеждает в том, что в отдельных популяциях эритроцитов изменения подвижности и скорости оседания эритроцитов скоординированы. Более отчетливо взаимообусловленность изменений этих показателей проявлялся в суммарной выборке здоровых и больных людей, а также в отдельно рассмотренной группе больных пациентов. При этом сам характер взаимовлияния СОЭ и ЭФПЭ неоднозначен: близкие к норме значения СОЭ сочетаются с высокой ЭФПЭ; относительно низкие и высокие уровни СОЭ, т.е. выходящие за пределы физиологической нормы, с уменьшением подвижности эритроцитов. Механизмы, определяющие такие взаимоотношения при снижении и повышении СОЭ, по всей видимости, являются различными и, как было показало выше, зависят от функционального состояния самих эритроцитов, а также влияния внешних по отношению к клеткам красной крови факторов.

ВЫВОДЫ

1. Предложена методология количественной оценки степени гетерогенности эритроцитарных популяций, связанная с введением понятия критического уровня асимметрии и расширяющая возможности исследования структуры совокупностей клеток.

2. Структура популяций эритроцитов человека по их электрокинетическим свойствам характеризуется половой и возрастной спецификой. При болезнях почек и при онкопатологии у взрослых людей наблюдаются изменения структуры эритроцитарной популяции по элекгрофоретической подвижности: происходят нозоспецифические сдвиги соотношения долей клеток с пониженной и повышенной подвижностью.

3. Эмоциональный стресс у студентов и психоэмоциональное напряжете у спортсменов вызывает существенное перераспределение в общем пуле субпопуляций эритроцитов по элекгрофоретической подвижности без заметного изменения средних показателей.

4. При эмоциональном напряжении у студентов, вызванном сдачей экзаменов, уменьшается содержание НЬ в крови и средняя концентрация НЬ в эритроците, но увеличивается объем клеток. Изменение элекгрофоретической подвижности эритроцитов и их объема сочетается с перераспределением клеток по их устойчивости к кислотному гемолизу.

5. Взаимосвязи колебании скорости оседания эритроцитов и их электро-форетической подвижности проявляются по-разному в зависимости от среднего уровня этих показателей, а также характера распределения эритроцитов но электрофоретической подвижности. В частности, за пределами физиологических значений скорости оседания клеток любые сдвиги этого показателя сопровождаются уменьшением электрофоретической подвижности эритроцитов крови людей. Увеличение скорости оседания эритроцитов по мере снижения подвижности клеток в электрическом поле отмечается только при существенном ее уменьшении.

6. У половозрелых крыс-самцов при адаптации к ожоговой травме и к действию холодовой нагрузки в кровеносном русле накапливаются клетки с высокой электрофоретической подвижностью и уменьшается встречаемость эритроцитов с пониженным электрокинетическим потенциалом.

7. Влияние на элекгрофоретическую подвижность эритроцитов адреналина in vitro предопределяется исходным средним уровнем элекгрокинетиче-ского потенциала клеток красной крови крыс и людей и особенностями распределения эритроцитов по электрофоретической подвижности. Характер реакции клеток на гормон зависит также от функционального статуса организма донора

В. Строфантин in vitro оказывает модулирующее действие на структуру эритроцитарной популяции. Направленность влияния строфантина зависит от исходного среднего значения электрокинетического потенциала пула эритроцитов и формы их распределения в совокупности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шамратова В.Г., Галеев Ф.С., Ахунова А.Р. Изучение показателей красной крови на разных этапах оперативного лечения//Современные аспекты поликлинической терапии (тезисы научно-практической конференции, посвященной 70-летнему юбилею поликлиники №1 г. Уфы). Уфа. 1994. С.86

2. Шамратова В.Г., Герчиков А.Я., Герчикова И.А., Ахунова А.Р. Использование нафтохинона - юглона в качестве ингибитора перекисного окисления липи-дов клеточных мембран//Актуальные вопросы экологии республики Башкортостан (Сборник тезисов межвузовской конференции). Уфа. 1995. С.57-58

3. Мапошичев В.Б., Шамратова В.Г., Ахунова А.Р. Электрофоретическая подвижность эритроцитов крови крыс при адаптации организма к воздействию низкой температуры/Щитология. 1996. Т.38. №11. С.1171-1173

4. Маттошичев В.Б., Шамратова В.Г., Ахунова А.Р., Герчиков А.Я. Электрофоретическая подвижность и окислительный статус эритроцитов крови крыс при ожоге//Цитология. 1997. Т.39. №2/3. С.177-180

5. Мапошичев В.Б., Шамратова В.Г., Ахунова А.Р. Соотнесенность электрофоретической подвижности эритроцитов крови человека с уровнем гемоглобина в норме и при почечной патологии//Физиология человека. 1997. Т.23. №4. С.110-112

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ахунова, Алина Римовна, Санкт-Петербург

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Ахунова Алина Римовна

МЕХАНИЗМЫ АДАПТИВНЫХ СДВИГОВ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ПОДВИЖНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

03.00.13 - физиология человека и животных

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

$,%$>( Научный руководитель:

оЖ /

доктор биологических наук, с.н.с. В.Б. Матюшичев

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ..............................................................4

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1.1. Использование дифференциального подхода к анализу структуры эритроцитарных популяций............................................................................9

1.2. Электрокинетические свойства клеток крови.............................................16

1.3. Влияние на ЭФПЭ патологических процессов, стресса и экстремальных состояний..................................................................................................26

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 38

2.1. Объект и методы исследования...................................................................38

2.1.1. Условия экспериментов на животных...................................................38

2.1.1.1. Воздействие термического ожога.....................................................38

2.1.1.2. Воздействие холода...........................................................................38

2.1.1.3. Воздействие тиреоидина...................................................................39

2.1.2. Характеристика групп здоровых доноров.............................................39

2.1.3. Характеристика групп больных.............................................................41

2.1.3.1. Больные с железо дефицитной анемией...........................................41

2.1.3.2. Онкологические больные..................................................................41

2.1.3.3. Больные с почечной патологией.......................................................42

2.1.4. Определение ЭФПЭ................................................................................ 42

2.1.5. Определение стандартных гематологических показателей..................44

2.1.6. Статистическая обработка результатов измерения ЭФП и объема эритроцитов..............................................................................................46

2.1.7. Метод оценки кислотной резистентности эритроцитов.......................48

2.1.8. Условия проведения опытов in vitro по изучению электрокинетических эффектов адреналина и строфантина......................................................49

2.2. Результаты исследований и их обсуждение................................................50

2.2.1. Анализ структуры популяций эритроцитов по ЭФП............................50

2.2.1.1. Анализ структуры популяций эритроцитов по ЭФП у человека в норме, при психофизическом напряжении и при патологии...........50

2.2.1.2. Анализ структуры популяций эритроцитов по ЭФП у крыс в норме и при экстремальных воздействиях...................................................65

2.2.2. Механизмы регуляции электрокинетических свойств эритроцитов адреналином.............................................................................................69

2.2.2.1. Влияние адреналина на ЭФПЭ в опытах in vitro.............................69

2.2.2.2. Изучение механизмов изменений ЭФПЭ при эмоциональных и физических нагрузках.........................................................................78

2.2.3. Изучение реакции ЭФПЭ крови человека и животных на воздействие строфантином...........................................................................................91

2.2.3.1. Реакция ЭФПЭ крови у человека в норме, в состоянии стресса и при патологии.................................................................................................91

2.2.3.2. Влияние строфантина на ЭФПЭ крови крыс.................................103

2.2.4. Изучение связи электрокинетических свойств эритроцитов крови со скоростью их оседания...................................................................................121

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ..............................................................................................131

4. ВЫВОДЫ.........................................................................................................136

5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

138

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ДЭС - двойной электрический слой

ЖДА - железодефицитная анемия

ИБС - ишемическая болезнь сердца

МП - мембранный потенциал

МЭ - мембрана эритроцита

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

ТМП - трансмембранный потенциал

ПОЛ - перекисное окисление липидов

Х/ФЛ - холестерин/ фосфолипиды

ЭКП - электрокинетический потенциал

ЭФП - электрофоретическая подвижность

ЭФПЭ - электрофоретическая подвижность эритроцитов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Явления, протекающие на границе раздела поверхности форменных элементов и плазмы крови, могут решающим образом определять течение физиологических процессов, в которых участвуют клетки крови. Эти явления имеют первостепенное значение для состояния крови и прежде всего для ее реологических свойств.

Одним из важнейших показателей, ответственных за оптимальную микрореологию крови, является заряд эритроцитов, косвенно оцениваемый по их электрофоретической подвижности (ЭФП). Уменьшение ЭФП эритроцитов (ЭФПЭ) сопровождается нарушением суспензионной стабильности крови, повышением степени агрегации эритроцитов и ухудшением микроциркуляции. В связи с этим поддержание ЭФПЭ на оптимальном уровне чрезвычайно важно, особенно в состояниях, характеризующихся напряжением регуляторных механизмов гомеостаза, как например при стрессе [10, 11, 13, 14, 20]. Понятно, что изучение путей контроля ЭФПЭ крови весьма актуально.

Недавно выявлено, что обеспечение стабильного уровня ЭФПЭ в кровеносном русле в норме, в экстремальных состояниях и при патологии достигается путем перераспределения долей клеток в общем пуле, выражающемся в изменении показателей кривой распределения эритроцитов по ЭФП [101, 104, 185]. Однако тонкие механизмы такого перераспределения и регуляторные звенья, определяющие изменения структуры эритроцитарной популяции, остаются неизвестными. Динамика самой этой структуры также не изучена. С этих позиций представляет интерес выяснение характера разнообразных адаптивных сдвигов ЭФПЭ, а также особенностей действия на ЭФПЭ веществ, оказывающих существенное влияние на состояние мембран эритроцитов (МЭ). К числу таких агентов можно отнести, в частности, строфантин - ингибитор натриевого насоса и адреналин - важнейший атрибут стрессорной реакции. Влияние этих веществ на электрокинетические свойства

популяций эритроцитов недостаточно изучено, не раскрыты и механизмы их корректирующего действия.

Цель работы заключалась в изучении особенностей регуляции электрокинетических свойств эритроцитов человека и животных в норме, в экстремальных состояниях и при некоторых видах патологии.

Задачи исследования:

1. Исследовать структуру популяций эритроцитов крови по ЭФП клеток у людей разного пола и возраста.

2. Изучить изменения ЭФПЭ человека и поведение эритроцитарной популяции при эмоциональном напряжении и психофизических нагрузках, а также при воздействии на животных различных экстремальных факторов и в условиях адаптации к ним.

3. Изучить связь ЭФПЭ с кислотной резистентностью эритроцитов, их объемом и содержанием гемоглобина (НЬ) в клетках.

4. Проанализировать поведение эритроцитов в модельных опытах с добавлением в среду инкубации адреналина и строфантина.

5. Изучить зависимость изменений скорости оседания эритроцитов (СОЭ) от их ЭФП.

Научная новизна исследования. Впервые изучены особенности структуры популяций эритроцитов по ЭФП. Выявлена половая и возрастная специфика популяций эритроцитов по ЭФП у человека. Описаны основные тенденции в изменении свойств эритроцитарной популяции по ЭФП при действии на организм человека и животных экстремальных факторов и при патологии. Прослежена их связь с изменениями объема эритроцитов и устойчивостью клеток красной крови к кислотному гемолизу. Показано, что влияние адреналина in vitro на электрокинетические свойства эритроцитов зависит от исходного уровня ЭФП и начального состояния эритроцитарной популяции, изменяющихся при эмоциональном и психофизическом напряжении

организма. Обнаружено, что влияние на ЭФПЭ строфантина in vitro зависит от соотношения в общей популяции долей эритроцитов с различными электрокинетическими свойствами. Модулирующее действие строфантина на подвижность эритроцитов крови человека и животных может видоизменяться при патологии, экстремальных воздействиях и в ходе физиологической адаптации. Получены оригинальные данные о взаимосвязи скорости оседания эритроцитов и их подвижности. Эта связь, как оказалось, проявляется по-разному в зависимости от среднего уровня показателей и существенно выражена при патологии.

Практическая значимость работы связана с разработкой прецизионного методологического подхода к анализу эритроцитарных популяций (открывающего новые перспективы в изучении их структуры) и с выявленной в исследовании возможностью разграничения степени предъявляемой организму нагрузки на базе комплексной оценки показателей формы электрокинетических эритрограмм и учета соотношения долей клеток с различной ЭФП, а также по эффективности и направленности действия на эритроцитарную популяцию модуляторов ее биоэлектрических свойств.

Положения, выносимые на защиту.

1. Структура популяций эритроцитов человека по их электрокинетическим свойствам неоднородна, имеет половые и возрастные особенности. Она изменяется при эмоциональном и психофизическом напряжении организма, а также при различных заболеваниях.

2. У половозрелых интактных крыс-самцов структура популяции эритроцитов близка к таковой у здоровых взрослых людей. Адаптация животных к экстремальным воздействиям (холод, ожог) сопровождается зависящим от ее сроков перераспределением в кровеносном русле долей клеток с высокой ЭФП и эритроцитов с пониженным электрокинетическим потенциалом (ЭКП).

3. Адреналин in vitro повышает среднюю ЭФПЭ крыс и изменяет соотношение клеток с различными электрокинетическими свойствами. Аналогичный эффект наблюдается при действии гормона на эритроциты крови, взятой у здорового человека в состоянии эмоционального покоя. Реакция клеток на адреналин модифицируется при изменении функционального статуса организма.

4. Строфантин in vitro оказывает модулирующее воздействие на структуру эритроцитарной популяции, заключающееся в сбалансировании долей клеток с различной ЭФП. Характер влияния строфантина зависит от начального состояния эритроцитов по их электрокинетическим свойствам.

5. Характер и выраженность взаимосвязи СОЭ и ЭФПЭ зависит от среднего уровня обоих показателей.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Использование дифференциального подхода к анализу структуры

эритроцитарных популяций

Как известно, эритроциты в кровеносном русле представлены не однородной популяцией, а совокупностью клеток, характеризующейся определённой закономерностью статистического распределения их важнейших параметров. При этом соотношение эритроцитов, различающихся по тому или иному признаку, определяется свойствами самих клеток, состоянием эритропоэтической функции и компонентами плазмы крови, а также зависит от влияния внешних факторов и наличия патологических процессов в организме.

Дифференциальный подход к изучению эритроцитарной популяции используется в исследованиях достаточно давно. В 50-60 гг. И.И. Гительзон и И.А. Терсков разработали метод кислотных эритрограмм, описывающий популяцию эритроцитов по их стойкости к кислотному гемолитику [43]. Такая эритрограмма отражает прежде всего возрастную динамику эритрона, т.е. соотношение клеток с различным биологическим (физиологическим) возрастом. Возрастная гетерогенность эритроцитарной популяции, связанная с одновременной циркуляцией в периферической крови как молодых, так и зрелых клеток, а также стареющих эритроцитов, может служить биохимической характеристикой состояния эритрона. Известно, что с возрастом уменьшается функциональная активность клеток, изменяется химический состав и источники энергии [112]. В частности, по мере старения эритроцитов изменяется соотношение пентозофосфатного и гликолитического пути обмена глюкозы [192]. Для молодых клеток характерно преимущественное (75%) окисление глюкозы по апотомическому пути. Старые эритроциты, напротив, 89% глюкозы метаболизируют по пути гликолиза. Одновременно в них образуется и накапливается метгемоглобин [42]. С возрастом преобразуется липидный

состав эритроцитарных мембран, увеличивается их микровязкость и нарушаются транспортные и ферментативные функции [112].

При старении эритроцитов модифицируются поверхностные структуры гликокаликса мембран, в частности снижается количество сиаловых кислот. Показано, что у стареющих эритроцитов на мембране появляются антигенные детерминанты, выступающие в качестве модуляторов иммунного ответа. Предполагается, что это может быть обусловлено накоплением в крови аномальных субстанций [139]. Старение эритроцитов ускоряется вследствие неспецифической сорбции эритроцитами компонентов плазмы [65]. То есть, анализ возрастной динамики эритроцитарной популяции позволяет говорить об особенностях распределения в кровеносном русле эритроцитов, отражающих не только свойства самих клеток, но и биохимический состав окружающей их плазмы [190].

Активизация эритропоэза, независимо от причин, его вызывающих, сопровождается увеличением числа наиболее кислотоустойчивых клеток. Напротив, снижение интенсивности продукции или повышенный распад эритроцитов в организме приводит к уменьшению средней кислотной стойкости клеток в популяции [190]. При воздействии на организм стрессорных факторов структура эритроцитарной популяции изменяется как вследствие ускорения выхода в кровь недозревших клеток из костного мозга, так и усиления процесса функционального старения эритроцитов [43, 171, 190]. Так, показано преобразование эритроцитарной популяции по стойкости клеток к гемолитику при введении в организм животных адреналина [166], а также при иммобилизационном стрессе [75]. В последнем случае изменение формы распределения сочетается с выраженным ретикулоцитозом.

Параметры кислотных эритрограмм характеризуются возрастной спецификой, причем в онтогенезе наиболее заметные изменения в структуре эритроцитарной популяции отмечаются в детском возрасте и практически не

выявляются у взрослых [63]. Различия эритрограмм у мужчин и женщин связаны, по мнению И.Л. Голенды и соавт., с какими-то особенностями МЭ или регуляторных влияний на процесс эритропоэза [45].

Популяция эритроцитов, различающихся по стойкости мембран к действию гемолитиков, формируется при участии соответствующих систем регуляции [46]. У лиц с преобладанием адренергической регуляции увеличение степени гетерогенности эритроцитов в сосудистом русле происходит в результате возрастания доли старых фракций [46]. Изменение структуры эритроцитарной популяции при разном соотношении холинергических и адренергических влияний в организме свидетельствуют о наличии вегетативного контроля за ее состоянием [46].

Получить информацию о распределении эритроцитов в популяции позволяет также изучение осмотической резистентности клеток, основанное на регистрации степени гемолиза эритроцитов при непрерывном изменении осмотичности среды. Так, показано, что эритрограммы клеток по осмотической резистентности становятся асимметричными при мышечной дистрофии, что связано с относительным уменьшением доли более старых клеток и увеличением числа молодых клеток [177].

Для дифференциального описания эритроцитарных популяций широко используется и исследование эритроцитов по диаметру - метод так называемых "эритроцитометрических кривых Прайс - Джонса". Анализ таких кривых, а также гистограмм распределения эритроцитов по площади (т.е. кривых Прайс -Джонса, выраженных не в линейных размерах, а в площадях клеток), свидетельствует о высокой однородности эритроцитарной популяции (Ех=5,5) взрослого человека, тогда как у детей отмечается достаточно выраженное разнообразие клеток [89]. Форма гистограммы служит важным признаком специфических заболеваний [22]. По мнению авторов работы [22], аномальная гистограмма дает более полную количественную информацию, чем изучение

мазков периферической крови. В частности, наличие двух пиков указывает на присутствие двух популяций эритроцитов, одна из которых представлена клетками с измененными размерами.

Изменение характера распределения эритроцитов по размерам может свидетельствовать о нарушениях в системе красной крови. Так, судя по форме гистограмм, при микроцитозе происходит сдвиг кривой влево и нарастание положительной асимметрии гистограмм; при макроанизоцитозе - смещение вершины кривой вправо и увеличение разнородности популяции. Смешанный анизоцитоз сопровождается уплощением кривой и увеличением дисперсии, отражая увеличение гетерогенности клеток по размерам [26]. Анализ эритроцитометрических кривых при анемиях различного происхождения [50] показывает, что при пернициозной анемии наблюдается сдвиг гистограммы вправо, расширение и уплощение кривой. При врожденной гемолитической анемии эритрограмма также расширяется и уплощается и приобретает выраженную отрицатель�