Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм выключения LAC-репрессора: исследование методом ковалентных сшивок

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизм выключения LAC-репрессора: исследование методом ковалентных сшивок"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ имени В.А.ЭНГЕЛЫ'АРДТА

на правах рукописи

Р Г 5 ОД

Л п Л'?т

" КАМАШЕВ Дмитрий Эдуардович

МЕХАНИЗМ ВЫКЛЮЧЕНИЯ ЬАС-РЕПРЕССОРА: ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДОМ КОВАЛЕНТНЫХСШИВОК

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардта РАН

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор, академик РАН А.Д.Мирзабсков

старший научный сотрудник К.К.Эбралидзс Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук А.СЗабедателев кандидат биологических наук М.А.Эльдаров

Ведущая организация:

Институт те- .етической и экспериментальной биофизики РАН

^ X /

Зашита диссертации состоится .........'............ 1995 г. в ...... часов

на заседании диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардта РАН по адресу 117984 г. Москва, В-ЗЭ4, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардта РАН

Автореферат разослан

1о. X

1995 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Точное узнавание белками специфических последовательностей ДНК - это предпосылка точной регуляции транскрипции. Молекулярная основа такого узнавания составляет одну из важнейших проблем молекулярной биологии. Белок 1ас-рспрессор - парадигма ДНК-узнающих белков. Он узнает и прочно связывает свою специфическую операторную последовательность в геноме Е.соИ и препятствует транскрипции генов метаболизма лактозы. Сродство 1ас-рспрсссора к своему оператору модулируется связыванием с белком индуктора, например, изопропнлтиогалактопиранозида (1РТО). Присоединение 1РТО к репрессору уменьшает константу его связывания с оператором с 1013 М'1 до Ю10 М"1, но не влияет на связывание репрсссора с неспецифическими последовательностями ДНК с константой связывания 107 М"1. Итак, индуктор способен "выключать" 1ас-репрессор, делая его неспособным узнавать свой оператор, но не влияя на неспецифическое взаимодействие репрессора с ДНК. В результате репрессор, связавшийся с индуктором, выключается и перестает блокировать транскрипцию. Механизм действия индуктора неизвестен. Поскольку репрессор может взаимодействовать с одной и той же - операторной - ДНК и специфически и, в присутствии индуктора, неспецифически, он является удобным объектом для исследования проблемы ДНК-белкового узнавания.

1^-концевой фрагмент 1ас-репрессора, содержащий остатки 1-51/59, образует структурный домен, способный связывать ДНК. Модель трехмерной структуры ДНК-связывающей части 1ас-репрессора установлена при ЯМР-исследованиях этого домена. Эта структура содержит мотив "а-спираль - поворот - а-спираль", открытый ранее при исследовании других белков. Однако, ориентация этого домена относительно оператора противоположна ориентации, установленной для всех закристаллизованных белков, например, для Х-сго - белка.

1Геяь работы.

Мы исследовали эту особенность 1ас-репрсссора, а также способ его выключения индуктором. Для этого методом ковалентных ДНК - белковых сшивок

была изучена структура комплексов рспрсссора со своим оператором в присутствии и в отсутствие индуктора и комплексы рспрсссора с неспсцифическими последовательностями ДНК. Образование сшивки некоторой аминокислотой белка в комплексе с ДНК - прямое доказательство ее сближенности с ДНК. Нашей задачей было установление аминокислот, способных сшиваться с ДНК в специфическом и неспсцифическом комплексах, и локализация мест сшивки на ДНК. Таким способом мы устанавливаем сближенные в составе ДНК - белкового комплекса аминокислоты и основания ДНК.

Методом ДНК-белковой сшивки мы выявилй аминокислоты 1ас-репрсссора, взаимодействующие с ДНК. Эта техника была впервые применена «ля исследования ДНК - узнающих белков. Для идентификации оснований 1ас-оператора, сшитых с 1ас-рспрсссором был разработан новый метод. В результате исследований было обнаружено, что только лизин-33 сшивается с 1ас-оператором в специфическом комплексе. В неспецифических комплексах кроме лизина-33 также и N-конец белка сшивается с ДНК. Мы установили, что в тройном комплексе индуктор-релрессор-оператор N-конеи 1ас-рспрсссора взаимодействует с краями 1ас-оператора. Сделан вывод о том. что в тройном комплексе ориентация ДНК-связываюших доменов 1ас-рспрсссора относительно оператора противоположна той ориентации, которая била ранее установлена для специфического комплекса рспрсссора с оператором и является ориентацией сго-типа. Присоединение индуктора фиксирует ДНК-связывающие домены рспрсссора в конфигурации сго-типа и таким образом нарушает поверхность узнавания. Поскольку конфигурация сго-типа хорошо подходит для взаимодействия с ДНК, такой механизм также объясняет как "выключенный" репрессор сохраняет высокую константу связывания с ДНК.

Объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (140 наименований). Работа изложена на 110 страницах машинописной текста и содержит 15 рисунков и 1 таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Картирование контактов |ас-репрессора с ДНК методом ДНК-белковой сшивки.

Для определения мест контактов lac-pcnpeccopa с ДНК мы проделали экспериментальные процедуры, детально описанные в (Mirzabelcov A.D. et al., 1989, EbraJidsc.K.K. cl al., 1988). ДНК, активированная частичной дспуринизацией, способна ковалентно связываться с N-концевой а-аминогруппой белка, Е-аминогруппой лизинов и имидазольной группой гистидинов (Nacheva,G.A. et al., 1989), расположенными вблизи места депуринизаиии. Депуринизация ДНК проводилась в две стадии - 1) метилирование диметилсульфатом в растворе 0.3 M ГЭПЕС, рН 7.4 при 25°С в течение 30 минут и удаление диметил сульфата осаждением ДНК. 2) Самопроизвольное -выщепление метилированных пуринов. Первую стадию модификации проводили так. чтобы 9% участков связывания репрессора было метилировано дважды и более, а в 30% - в точности одна модификация приходилась на участок связывания. .

Частично депуринизованная ДНК была ковалентно сшита с 1ас-репрессором при их инкубации в буфере состава 25 мМ ГЭПЕС, рН 7.4, 80 мМ NaCl. 10 мМ комплекса пиридин-боран в течение 2 ч при 37°С, продукт реакции был дополнительно восстановлен инкубацией с 10 мМ боргидрида натрия при 25°С в течение 30 мин. Исчерпывающий гидролиз ковалентных аддуктов микрококковой нуклеазой оставляет короткий олигонуклеотид, связанный с репрессором, в 5'-коиец которого был введен радиоактивный "Р. Получившийся продукт мы будем называть белком, меченным по месту сшивки (с ДНК). Затем белок был гидролизован трипсином и полученные в результате нуклеотид-пептиды были апектрофоретически разделены в полиакриламидном геле, а их положение детектировано авторадиофафически (Рис. 1, дорожки 7-6). Каждая полоса на рисунке соответствует определенному месту сшивки lac-pcnpeccopa с ДНК, а это место соответствует участку контакта между репрессором и ДНК. Мы получили нуклеотид-пепткдные карты, сшивая 1ас-репрессор с lac-оператором как в

IPTG + - + - + -

Р2

Р9

Рис. 1. Радиоавтограф геля для разделения нуклеотид-пептидов. Дорожки 1 ■ 6 - меченный по месту сшивки с частично депуринизованной ДНК lac репрсссор, гидролизованный трипсином: 1 и 2 - сшивка с поли[с!(А-Т)] в присутствии и в отсутствие IPTG соответственно; 3 и 4 - то же для сшивки с нсспеиифической ДНК длиной 49 н.п.; 5 и 6 - то же для сшивки с ДНК длиной 49 н.п., содержащей lac оператор. Дорожка 7 - меченный по месту сшивки с частично депуринизованной поли[с!(А-Т)] N-концевой фрагмент lac рспрессора (остатки 1-51/59), гидролнзованный трипсином; 8 - меченный по месту сшивки пептид, содержащий остатки 1/2-42. гидролнзованный трипсином. 9 и 10 -ссквенированныс нуклеотнд-пептиды 23-35 и 1-22 соответственно.

присутствии, так и в отсутствие индуктора, то же было сделано и для иеспсцнфичсскнх последовательностей ДНК. На рис. 1 можно видеть. что карты нсспсцифнчсских комплексов (дорожки 1-5 на рнс.1) весьма сходны между собой (все содержат нуклеотид-пелтиды Р1 - Р5), в то время как карта специфического комплекса (Рис. 1, дорожка б) существенно отличается от них: основным по интенсивности является здесь нуклеотид-пептид Р9.

2. Прямая идентификация пептидов, сшитых с ДНК.

Для того, чтобы установить первичную структуру сшитых пептидов 'прямым методом, мы получили' нуклеотид-пептиды в количествах, достаточных для определения их аминокислотных последовательностей. Мы провели такую препаративную сшивку Л-концевого фрагмента 1ас-репрессора. Был использован именно 1Ч-К01ШС1ЮЙ фрагмент репрессора для того, чтобы избежать высоких концентраций белка и возможной агрегации. В качестве "модельной" ДНК был использован предварительно 'депуринизованный обработкой 70% муравьиной кислотой при 70°С в течение 30 минут синтетический тринуклеотид сКрТрбрТр). После инкубации 8 мг И-концевого фрагмента 1ас-репрессора с 4 мг полностью дспуринизованного тринуклеотида в растворе, содержащем 50% ацетонитрила, 20 мМ ГЭПЕС, рН 7.4 и 10 мМ пнршшн-боранного комплекса, в течение 2 ч при 37°С, продукт реакции был дополнительно восстановлен инкубацией с 10 мМ боргидрида натрия при 25°С в течение 30 мин. Белок был осажден добавлением трихлоруксусной кислоты до 20% и центрифугированием. Осадок был дважды промыт эфиром и растворен в буффере состава: 100 мМ МШСОз, рН 8.0, 0.2% Тритон Х-100, 5 мМ дитиотрентол. Белок был гилролизован трипсином 1:25 (весовое отношение) при 37°С в течение б ч. и высушен под вакуумом. Пептиды были вновь растворены и разделены посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке РашзП ОРБЗ в градиенте ацетонитрила 0-80% с 50 мМ Трис-трифторуксусной кислотой, рН 7.0. Детекция велась при двух длинах волн -210 им и 260 им, что позволяет отличать нуклеотид-пептиды, которые имеют существенно большую экстинцию при 260 нм, чем пептиды. Фракции собирали, высушивали под вакуумом, обрабатывали щелочной фосфатазой из Е.соИ и вновь

хроматографирошиш при тех же условиях. Фракции, соответствующие пикам, выходящим при большей концентрации ацетонитрила, чем в ходе первой хроматографии, собирали, переводили в раствор 0.1ЧЬ трифторуксусной кислоты и подвергали дараиании по Эдману. После дефосфорилироваиия при большей концентрации ацетонитрила элюнруются только нуклеотид-пептиды, очевидно, что пептиды элкжруются при той же концентрации, что и в процессе первой хроматографии.

В результате были идентифицированы два нуклеотид-пептила - основных продукта проведенной сшивки и последующего гидролиза трипсином. Первый -7KPVTLYDVAEYAGVSYQTVSR (пептид 1-22' lac-pcnpeccopa (Farabaugh.P.J., 1978)). второй - VVNQASHVSA7TR (пептид 23-35). Именно места сшивки, помеченые знаком вопроса, - Met-1 в первом пептиде и Lys-ЗЗ - во втором, характерно не обнаруживаются вследствие их ковалентной модификации при сшивке с тринуклеотидом. Эти секвснированные нуклеотид-пептиды после 32Р-мечения их нуклеотидных частей имеют одинаковую подвижность при электрофорезе в полиакриламидном геле с нуклеотид-пептидами Р2 и Р9 соответственно (Рис. 1, дорожки 10 и 9).

3. Идентификация остальных нуклеотнд пептидов.

Меченный по месту сшивки с ДНК 1ас-рспрессор при трипсиновом гидролизе распадается на следующие нуклеотид-пептиды: PI, Р2, РЗ, Р4. Р5. Р6, Р8 и Р9 (Рис.1. дорожка !). Меченный по месту сшивки с ДНК N-конисвой фрагмент lac-pcnpeccopa (остатки 1-51/59) дает почти все те же нуклеотид-пептиды (дорожка 7. Рис. 1), что подтверждает данные о том, что именно N-концевой фрагмент !ас-репрессора взаимодействует с ДНК (Ogata,R.T. and Gilbert,W.. 1978 . Klcina,L.G. and MillcrJ.H., 1990), причем характер взаимодействия существенно не меняется, когда он отделен от кора белка.

"Минорные" нуклеотид-пептиды были идентифицированы косвенными методами. Первое: если меченный по месту сшивки 1ас-рспрсссор обработать бромиианои в 70% муравьиной кислоте (для гидролиза полипептидной цепи с С-конца от остатка метионмна) и разделить получающиеся пептиды посредством гель-

электрофореза, то наиболее короткий из пептидов будет более .подвижным, чем N-концевой фрагмент lac-pen рессора. Этот пептид был вымьгг из геля, пшролизоваи трипсином и полученные нуклеотид-пептиды были разделены злсктрофоретически в лалиакрнламидном геле и авторадиографированы (Рис. 1, дорожка 8). Ими оказались нуклеотид-пептиды PI, Р2, РЗ, Р4 и Р5. Это однозначно указывает на то, что исходный полипептид содержал аминокислоты 1/2-42 1ас-рспрессора (метионинами являются 1-я, 42-я, 98-я и т.д. аминокислоты lac-penpeccopa). а нуклеотид-пептиды PI - Р5 локализованы в пределах 1/2-42-й аминокислот lac-penpeccopa.

Второе. После обработки нуклеотид-пептидов эндопротеазой Glu-C (ферментативная реакция гидролиза полипептидной цепи с С-конца остатков глугами новой и аспарагиновой кислот) и последующего электрофореза в полиахриламшшом геле при рН 8.6 нуклеотид-пептид Р9 не меняет своей электрофорстической подвижности, а нуклеотид-пептиды PI, Р2 и Р7 меняют свою подвижность (Рис. 2), также как и нуклеотид-пептиды РЗ и Р4. Отсюда следует, что что нуклеотид-пептид Р9 не содержит кислых остатков a PI, Р2. РЗ, Р4 и Р7 -содержат их.

Полученные результаты позволяют идентифицировать сшитые аминокислоты в большей части нуклеотид-пептидов с учетом известной аминокислотной последовательности N-конца репрессора: 1-MKPVTLYDVA EYAGVSYQTV SRVVNQASHV SAKTREKVEA AMAELDYIPN RVANNLAGK-59 (Farabaugh.P.J.. 1978). Во фрагменте белка 1/2-42, полученном гидролизом по мстионинам. после его гидролиза трипсином (с С-кониа от аминокислот Apr и Лиз) возможно появление лишь двух нуклеотид-пептидов: 1/2-22 и 23-35. Здесь мы учли, что трипсин не может гнл ревизовать пептидную связь с С-конца от сшитого лизина. Из этих пептидов только пептид 1/2-22 содержит кислые аминокислоты (Асп-8 и Глу-11), следовательно, нуклеотид-пептиды Р1, РЗ и Р4 сшиты через N-конец белка или через лизин-2, поскольку только эти аминокислоты пептида 1-22 способны ковалентно связываться с депуринизованной ДНК. Нуклеотид пептид Р2 сшит через N-конец белка и нуклеотид-пептид Р9 - через лизин 33.

к

Р2 Р1 Р7 Р9

в1и-С - + - + - +1- +

1 2 3 4 5 6 7 8

►

*

Рис. 2. Радиоавтограф геля для разделения нуклеотид-пептидов, гидролизованных и нсгидролизовашплх эидопротсазой 01и-С (обозначено как "+" и "-" соответственно).

• *

Таким образом, в специфическом комплексе в результате описаииой процедуры ДНК-белковой сшивки с ДНК ковалентно связывается только лизин-ЗЗ 1ас-рспрсссора. В псспсиифичсском комплексе с ДНК сшивается в основном N-консц 1ас-рспрсссора. Именно сшивка через первые две аминокислоты 1ас-рспрсссора формирует более 90Ъ интенсивности (как следует из измерений относительной радиоактивности) нуклеотид-пептидных карт псспецифнчсскнх комплексов, в том числе и тройного комплекса шшуктор-репрессор-опсратор.

4. Локализация нуклеотидных пар 1ас-оператора, сшитых с N-коицом 1ас-репрессора.

Для идентификации мест ДНК, сшитых с N-концом lac-penpeccopa, lac-рспрессор был сшит с 5'- 32Р - меченным совершенно симметричным 1ас-оператором, длиной 20 пар нуклеотидов (Sadler.J.R., et al., 1983 , Simons.A., et al., 1984) в присутствии IPTG. Смесь разделяли электрофорсгичсски в геле, содержащем мочевину и додецилсульфат натрия (Рис. ЗА). Радиоактивные полосы (обозначенные Г1 - гЗ) были вырезаны, вымьггы из геля и обработаны трипсином. Появившиеся в результате ДНК-пептиды били разделены электрофорсгичсски в геле, содержащем мочевину (Рис. ЗВ) и, после авторадиографии, вырезаны и вымыты из геля. Поскольку в комплексе 1ас-репрсссора с оператором в присутствии индуктора более 90% всех сшивок происходит через N-конец рспрессора, пептидная часть всех ДНК-пептидов -это аминокислоты 1 - 22 рспрессора.

ДНК-пептиды были обработаны 70% муравьиной кислотой и 2% дифениламином (реакция "А+Р) и нанесены на 20% полиакриламидный гель, содержащий мочевину (Рис. 4). Идея такого метода идентификации мест сшивки состоит в том, что лестница полос должна обрываться в месте сшивки ДНК (и выше) из-за того, что сшитый пептид тормозит расщепленную ДНК, если расщепление произошло между местом сшивки и З'-кониом ДНК (Рис. 4А). Первый отсутствующий пурин в точности соответствует месту сшивки в этом ДНК-пептиде. На рис. 4В представлен результат такого эксперимента - лестница полос обрывается на А15 в дорожках 1,2 и 3; на А18 в дорожке 4 и не обрывается в дорожке 5. Мы делаем вывод, что с N-коицом lac-penpeccopa оказались сшиты пурины А15 и А18.

• •

1 2

В

05-

гз.

XI ■

п

а—

04— 03—, 02— 01—*»

Рис. 3. Очистка ДНК-пептидов. Панель А. Диск-гель-элсктрофорез (10% акрипамид, 8М мочевина). Дорожка 1 -1ас-репрсссор, сшитый с меченным по 5'-концу идеальным 1ас-опсратором длиной 20 н.п.; 2 - 1ас-рспрессор сшитый с идеальным 1ас-опсратором, обработанный микрококковой нуклеазой и 32Р - меченный по месту сшивки. Панель В. Отмеченные па панелс А полосы (г1 - гЗ) были вырезаны, гидролизованы трипсином и нанесены соответственно дорожки 1-3 полиакриламидного геля, содержащего Трис-борат, рН 8.6 и 8М мочевину. Стрелка указывает положение идеального 1ас-опсратора; 01 - 05 - положения ДНК-пептидов, использованных для дальнейшего анализа.

- (О-

А

В

3'

1 2 3 4 5

Рис. 4. Идентификация мест сшивки 1ас-опсратора с 1ас-репрессором. Панель А. Последовательность идеального 1ас-оператора длиной 20 н.п. Нумерация начинается с точки старта транскрипции. Вертикальные линии ■указывают фрагменты ДНК, появляющиеся при "А+в - реакции", если рспрессор сшит в положении 15.

Панель В. ДНК-псгггиды 01 -05, выделенные из предыдущего геля (Рис. ЗВ), обработанные 2% дифениламином и 70% муравьиной кислотой - "А+в -реакция".

Дорожки ] - 5 содержат соответственно ДНК-пептиды 05 -01.

5. Две конфигурации 1ас-репрессора.

Трехмерную структуру ДНК-связываюшсго домена 1ас-рспрессора изучали методом ЯМР (Кар1ет Я.. е1 а1., 1985, Zшderwcg.E.R.P., с1 а1., 1985 ,Вос!спз,К., « а!., 1987 , 1,атспсЬ5.1Ш..Ш, с1 а!.. 1989 , ¿с У^Х, с( а1„ 1989, ЬатспсЬз.Я. е1 а!., 1990. Кар1етД„ е1 а1„ 1990, СЬирппа,У.Р„ й а1„ 1993) и генетическими методами ([хЖпиг^.М., е1 а1., 1987, ЬсИпиг^.М., с! а!.. 1988, ЮзЬеге-М'оИсс.В., е1 а1., 1991). Было обнаружено, что Ы-конец 1ас-репрессора располагается вблизи оси симметрии второго порядка 1ас-оператора, но не вступает в прямой контакт с ДНК (Рис.5А). Это согласуется с нашим наблюдением, что в специфическом комплексе изо всех возможных лизинов, гиегтидинов и ос-аминогрупп 1ас-репрессора только Лиз-33, но не И-консц репрессора, может быть сшит с ДНК.

Однако в неспецифнческом комплексе кроме этого лизина с ДНК образует непосредственный контакт К-конец репрессора, несущий две положительно заряженные группы. соответствует известному факту, что в неспецифнческом комплексе 1ас-репрессора с ДНК образуется больше ионных пар, чем в специфическом комплексе соператором (УШиоп.Р.А., с1 а1., 1986).

Сближенность • >!-конца репрессора с ДНК является отличительной особенностью всех исследованных неспецифических комплексов, но он не сближен с оператором в специфическом комплексе. Ьас-репрессор должен иметь возможность быть по крайней мере в двух формах, в зависимости от того, связан он с индуктором или нет. При этом, как мы обнаружили, при связывании индуктора ¡Ч-консц репрессора взаимодействует и со специфической, и с неспецифичсской ДНК. Поэтому факт этого взаимодействия свидетельствует о том, что репрсссор имеет "неспецифическую" форму. Поскольку иуклеотид-пептщщые карты комплексов с неспецифичсской ДНК одинаковы в присутствии и в отсутствие индуктора, мы делаем вывод о том, что и в комплексе с неспецифичсской ДНК без индуктора, репрсссор имеет эту "неспецифическую" форму. Итак, во всех нспецифических комплексах с ДНК (с константами связывания 107 - 1010 М-1) репрсссор имеет неспецифическую форму, независимо от наличия индуктора. Отсюда следует, что именно взаимодействие с оператором приводит к изменению конфигурации репрессора на специфическую. При этом связывание с репрессором

я

индуктора препятствует этому изменению, стабилизируя "неспецифичсскую" форму репрсссора. Это - механизм выключения репрсссора под действием индуктора.

б. ДНК-связывающие домены 1ас-репрессора ориентированы по-разному в зависимости от наличия индуктора.

В тройном комплексе индуктор-репрессор-опсратор М-конец репрессора сшиваются с адснинами 15 и 18, то есть по краям ]ас-оператора. Этот факт является весьма неожиданным, так как модель специфического комплекса белка с оператором предполагает расположение И-конца 1ас-репрессора вблизи оси симметрии 1ас-оператора (Вос1еп5,К., л а1., 1987 , ЬашепсЬзД.МЛ.К, е! а1., 1989 , ¿с У^,.!., ее а1„ 1989, ЬашспсЬзД. « а1„ 1990, Кар^пД., с1 а1., 1990) (Рис. 5). На первый взгляд, это сближение М-конца белка с краями 1ас-опсратора можно объяснить тем, что первая а-спираль 1ас-репрессора меняет свое расположение относительно узнающей спирали белка, достигая края оператора. Это объяснение представляется нам, однако, маловероятным. Согласно данным ЯМР-исследований как свободного ДНК-связывающсго домена 1ас-репрсссора (Zuiderweg,E.R.P., е( а1„ 1985), так и его комплекса с 1ас-оператором (de Vlieg,J., с! а1., 1989), все три его а-спиралн жестко ориентированы друг относительно друга за счет большого числа контактов между неполярными остатками этих спиралей, образующих гидрофобный кор структуры ДНК-связываюшего домена !ас-репрессора.

Поэтому мы объясняем обнаруженное в наших экспериментах сближение Ы-конца репрессора с краями 1ас-оператора в тройном комплексе индуктор-репрессор-оператор совершенно по-новому. ДНК-связывающие домены репрессора ориентированы по-разному относительно одной и той же - операторной - ДНК в зависимости от наличия индуктора. Если индуктор связан с 1ас-рспрсссором, ДНК-ейязывающие домены репрессора имеют ориентацию относительно оператора, противоположную установленной ранее для специфического комплекса репрессора с оператором (Рис. 5). Переход между двумя структурами может происходить вследствие изменения взаимного расположения субъединиц репрсссора или вследствие вращения ДНК-связываюших доменов белка относительно остальной части молекулы.

А

ААТТСЮАССССТСАСААТТ

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Ш

е-э

«—и-/

«Г*!

Г

■ ё

20 19 18 17 16 15 14 13 12 И 10 9 8 7 6 5 4 3 2 I ТТААСАСТСССОАСЮТТАА

В

+ 1РТС

.ААТТОЮАССОСТС0С АЩТ Т 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Щ

е-э

ш

Ш

20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

т т[а|а с[а1стсосоаототтаа

Рис. 5. Модель, иллюстрирующая как 1ас-рслрессор определяет ориентацию двух своих мотивов "спираль - поворот - спираль" друг относительно друга и относительно идеального 1ас-оператора. ЯЕСНЕЫХ - узнающая спираль рспрсссора (остатки 17 - 25), НЕ1ЛХ-1 - первая спираль (остатки 6 - 13). Панель А. Расположение ДНК-узнающих мотивов в специфическом комплексе, установленное ЯМР-исследованиями и по геисгическим данным. Рисунок построен на основе приведенных в (К1$1сге-^/о1ке,В., « а!.. 1991 и Ко1к)юС,Р., е! а!.. 1992). ^

- й-

Панель В. Предлагаемое нами расположение ДНК-узнающих. мотивов в тройном комплексе нндуктор-рспрсссор-опсратор. Ориентация мотивов является обратной по сравнению со специфическим комплексом. М-консцы |ас-репрсссора взаимодействуют с ДНК на участках, выделенных штриховкой. Отмечены аденины, с которыми оказался сшитым М-консц белка.

Таким образом, 1ас-рспрессор в зависимости от условий реализует две противоположные ориентации узнающей спирали относительно lac- оператора. Эти ориентации иазваины в (Kaptein.R., et al., 1990) ориентациями 1ас-типа (реализуется 1ас-репрсссором в специфическом комплексе) и сго-типа (противоположная ориентация, ранее не предполагавшаяся у 1ас-репрессора). В специфическом комплексе репрессора с оператором узнающая спираль и весь ДНК-связываюший домен в целом имеют ориентацию 1ас-типа, как это следует из данных ЯМР комплекса домена с ДНК (Boelens.R., et al.. 1987,. Lamerichs.R.M.J.N, et al.. 1989, Laracrichs.R. et al., 1990, Kaptein.R., et al.. 1990), генетических исследований (Kisters-Woike.B. et al., 1991), исследований методом сшивки (Allen.T.D., et al., 1991) и методом специфического расщепления ДНК (Shin,J.A, et al., 1991). Полученная на основании наших исследований модель предполагает, что такую ориентацию вызывает взаимодействие 1ас-репрессора с оператором, если индуктора в среде нет, то есть если связанный с репрессором индуктор не препятствует этому. Характерной особенностью такой ориентации является сближенность N-концов симметричных ДНК-связывающих доменов рспрсссора ("голова к голове") на расстояние 1 - 3 нуклеотидыс пары. Во всех неспецифических комплексах с ДНК ориентация ДНК-связывающих доменов репрессора противоположна ориентации 1ас-типа. Особенностью этой ориентации является удаленность N-концов симметричных ДНК-связываюших доменов репрессора на расстояние 9-15 нухлеотидых пар. Действие индуктора состоит в стабилизации этой противоположной ориентации (cto-типа) ДНК-связывающих доменов 1ас-репрсссора относительно оператора и друг относительно друга. В этом случае комплекс нндуктор-рспрсссор-опсратор, естественно, не будет специфическим, так как

аминокислотные остатки белка не смогут образовать специфические контакты с основаниями оператора в этой, инвертированной, ориентации. Фиксируя такую ориентацию, индуктор "выключает" репрессор. Способность рспрсссора связывать ДНК сильно, хотя и неспсцифически, должна при этом сохраняться, так как мотив "спираль-поворот-спираль" сго-бслка прекрасно подходит для связывания ДНК.

выводы

I. С использованием метода ДНК-белковых сшивок определены места контактов lac репрессора с операторной н с неспецнфнческон ДНК в присутствии и в отсутствии индуктора. Обнаружено, что карты контактов весьма сходны для всех неспецифнческих комплексов, а карта контактов специфического комплекса существенно отличается от них.

II. Идентифицирована большая часть нуклеотид-пептидов, составляющих такие карты, все они локализованы в ДНК - связывающем домене репрессора.

III. Показано, что в специфическом комплексе 1ас-репрессора с 1ас-оператором только Лиз-33 образует сшивку с ДНК, тогда как во всех неспецифических комплексах также N- концевая а-амнногруппа и, возможно, Лиз-2 образуют сшивку с ДНК. При этом сшивка через Лиз-33 составляет в не- специфических комплексах не более 5% всей интенсивности сшивки.

IV. Разработан метод локализации на ДНК мест ее сшивки с белком.

V. Для тройного комплекса индуктор- 1ас-репрессор- оператор установлены места контактов N-конца репрессора с оператором - это аденины 15 и 18 идеального lac оператора.

VI. Сделан вывод о том, что именно взаимодействие с оператором приводит к такой ориентации ДНК-связывающих доменов репрессора, которая обнаружена методом ЯМР. В присутствии индуктора эта ориентация противоположна. Индуктор стабилизирует эту инвертированную ориентацию, препятствуя ее изменению при связывании белка с оператором, - такова структурная основа выключения репрессора под действием индуктора.

Основные результаты опубликованы в следующих статьях:

1. КамашевД., Эбралидзе.К., Есипова.Н.Г. и Мирзабеков.А.Д. Электростатические взаимодействия и различия в специфическом и иеспсиифическом взаимодействиях lac-pcnpcccopa с ДНК. // • Биофизика (1994). т. 39. с. 1101-1103.

2. КамашевД., Эбралидзе.К.. Есипова,Н.Г. и Мирзабеков.А.Д. Исследование 1ас-репрсссора, связанного с ДНК, методом ковалентной ДНК-белковой сшивки. // - Докл. акад. наук, 1995, т. 344, с.

3. КамашевД., Эбралидзе.К., Есипова,Н.Г. и Мирзабсков.А.Д.

Ориентация ДНК-связываюших доменов 1ас-рспрессора зависит от присутствия индуктора. Исследование методом ДНК-белковой сшивки. // - Молекулярная биология (1995). т.29, с. 950-960.

4. Kamashev.D.. EsipovaJ>J.G., Ebralidse.K., and Mirzabckov,A.D. Mechanism of lac repressor switch-off: Orientation of the lac repressor DNA-binding domain is reversed upon inducer binding. // FEBS Lett. (1995) submitted.