Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм регуляции активности фактора транскрипции TnrA - основного регулятора азотного метаболизма Bacillus subtilis

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Механизм регуляции активности фактора транскрипции TnrA - основного регулятора азотного метаболизма Bacillus subtilis"

005531аьо

На правах рукописи

ж?

ФЕДОРОВА КСЕНИЯ ПАВЛОВНА

МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ TNRA- ОСНОВНОГО РЕГУЛЯТОРА АЗОТНОГО МЕТАБОЛИЗМА BACILLUSSUBTILIS

03.02.03 — микробиология 03.01.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

"8 АВГ 2013

Казань-2013

005531965

Работа выполнена на кафедре микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент

Кантов Айрат Рашитович

доктор биологических наук, профессор

академик АН РТ

Ильинская Ольга Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ермилова Елена Викторовна (ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет» профессор кафедры микробиологии)

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Коксин Владимир Петрович (ГАУЗ «Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями МЗ РТ» заведующий лабораторией биохимии)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится «26» сентября 2013 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: г. Казань, ул. Кремлевская, 18, главное здание, аудитория №211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского при Казанском (Приволжском) федеральном университете.

Автореферат разослан «ЗХ» июля 2013 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

¿г—— 3. И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Бактерии в ходе эволюции выработали сложные механизмы адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды и способны использовать широкий спектр источников питания. Понимание молекулярно-генетических механизмов адаптации микроорганизмов к стрессовым условиям актуально как для разработки новых принципов подавления роста патогенных бактерий, так и для повышения продуктивности промышленно значимых бактерий.

Азот является одним из важнейших макроэлементов и составляет до 10% сухого вещества клетки. В природе азот встречается в окисленной, восстановленной и молекулярной формах, но в конструктивном клеточном метаболизме азот используется только в восстановленной форме. Соли аммония, мочевина, органические соединения являются наиболее предпочтительными и легко усваиваемыми источниками азота для бактерий. Многие микроорганизмы способны потреблять и окисленные формы азота в виде нитратов и нитритов. В анаэробных условиях некоторые бактерии способны использовать нитрат в качестве конечного акцептора электронов, восстанавливая его до нитрита и газообразных форм азота (N20, NO, N2) в процессе диссимиляционной нитратредукции. В ходе ассимиляционной нитратредукции многие бактерии способны восстанавливать окисленный азот и использовать его для синтеза азотсодержащих клеточных компонентов. Этот процесс протекает с дополнительными затратами энергии, поэтому условия дефицита восстановленного азота являются неблагоприятными для роста микроорганизмов. При низком содержании восстановленного азота (ионы аммония или глутамин в концентрациях менее 2 мМ) или в присутствии только окисленных форм азота (нитраты и нитриты независимо от концентрации) в клетках бактерий запускается каскад регуляторных процессов, направленных на утилизацию азота из разнообразных азотсодержащих соединений.

В клетках Bacillus subtilis фактор транскрипции ТпгА контролирует гены, продукты которых вовлечены в процессы ассимиляции азотсодержащих соединений в условиях недостатка азота в среде: транспорт ионов аммония, ассимиляция мочевины, нитрата и нитрита и других соединений азота (Wray et al., 1996). Взаимодействуя с промоторами генов-мишеней, он активирует, или, наоборот, подавляет их транскрипцию (Yoshida et al., 2003). В отличие от других регуляторов транскрипции, фактор ТпгА не имеет сайтов для ковалентной модификации и взаимодействия с низкомолекулярными эффекторными молекулами (лигандами) (Fisher, 1999). Это свидетельствует об уникальных механизмах передачи сигнала на этот регуляторный белок, которые на сегодняшний день остаются мало изученными. Ряд работ демонстрирует, что активность фактора ТпгА контролируется путем

взаимодействия с другими белками. Белками-партнерами фактора транскрипции ТпгА являются глутаминсинтетаза (GS) и белок GlnK (Forchhammer, 2008). Гомологи белка GlnK в клетках бактерий регулируют активность белка AmtB, осуществляющего активный транспорт ионов аммония в клетки (Wray et al., 2001; Heinrich et al., 2006; Tremblay, Hallenbeck, 2009). Возможно, белки AmtB, GlnK и GS образуют систему трансдукции сигнала о доступности азота на фактор транскрипции TnrA (Wray et al., 2001; Detsch, Stulke, 2003; Heinrich et al., 2006; Tremblay, Hallenbeck, 2009; Gunka, Commichau, 2012).

Цель работы - выяснение молекулярного механизма регуляции активности фактора транскрипции TnrA у Bacillus subtilis в условиях дефицита и избытка источника восстановленного азота.

В работе решали следующие задачи:

1. Определить участие глутаминсинтетазы и белков AmtB и GlnK в регуляции активности фактора транскрипции TnrA у Bacillus subtilis в условиях дефицита и избытка восстановленного азота.

2. Выявить изменение локализации фактора транскрипции TnrA при смене условий культивирования Bacillus subtilis (от дефицита источника восстановленного азота к его избытку).

3. Исследовать влияние белка GlnK и глутаминсинтетазы на ДНК-связывающую активность фактора транскрипции TnrA в условиях in vitro.

4. Создать генетические конструкции на основе плазмиды рЕТ15Ь для гиперпродукции в клетках E.coli рекомбинантных белков TnrA с укороченным С-концевым доменом и гексагистидиновой последовательностью на N-конце белка и получить эти белки в электрофоретически гомогенном состоянии.

5. Установить сайты взаимодействия белка GlnK и глутаминсинтетазы с С-концевым доменом фактора TnrA, выявить регуляторную роль С-концевого домена в димеризации фактора транскрипции TnrA и связывании N-концевого домена с ДНК.

6. Изучить влияние фактора транскрипции TnrA на биосинтетическую активность глутаминсинтетазы при взаимодействии этих белков in vitro и внутриклеточно в штаммах Bacillus subtilis дикого типа и мутантных по белкам AmtB и GlnK.

Научная новизна

Впервые показано, что смена аффинности глутаминсинтетазы и белка GlnK к TnrA определяет локализацию фактора TnrA и регулирует его активность в зависимости от условий дефицита или избытка восстановленного азота в среде. Белок AmtB, ответственный за транспорт ионов аммония в клетку и формирующий сигнал о доступности азота в клетках многих организмов, не

участвует в передаче сигнала на фактор ТпгА у бацилл. Впервые установлено, что in vivo глутаминсинтетаза подавляет активность фактора транскрипции ТпгА не только в условиях избытка восстановленного азота, как сообщалось ранее (Wray et al., 2001), но и в условиях его недостатка. Эксперименты in vitro показали, что белок GlnK не подавляет ДНК-связывающую активность ТпгА, в то время как активная и ингибированная формы глутаминсинтетазы в разной степени снижают способность ТпгА взаимодействовать с ДНК. Впервые продемонстрировано, что С-концевая область ТпгА не участвует в димеризации белка, но контролирует ДНК-связывающую активность N-концевого домена. Установлено, что за взаимодействие с белком GlnK и глутаминсинтетазой отвечают разные участки С-концевого домена фактора транскрипции ТпгА. Впервые охарактеризован ингибирующий эффект фактора транскрипции ТпгА на ферментативную активность глутаминсинтетазы.

Практическая значимость

Полученные результаты представляют собой новый блок фундаментальных знаний о регуляции азотного метаболизма в клетках бактерий. Примеры регуляции активности факторов транскрипции путем взаимодействия с ферментом представлены на сегодняшний день единичными случаями, полученные результаты расширяют представления о способах контроля активности ДНК-связывающих белков в клетке. Учитывая значение азотного питания для жизнедеятельности микроорганизмов, полученные данные могут быть применены в биотехнологических процессах, требующих особого внимания к регуляторным механизмам микроорганизмов, связанных с культивированием генномодифицированных бактерий для продукции целевых белков и азотсодержащих метаболитов, а также в биомедицине для поиска ингибиторов азотного обмена клетки.

Связь работы с научными программами

Работа выполнена в соответствии с тематическим планом КФУ, регистрационный номер 01201259687 «Идентификация молекулярных детерминант терапевтического потенциала микробных нуклеаз». Исследования поддержаны грантами ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2008-2013 годы ГК №П1275, №16.740.11.0611, №14.740.11.1040, №14.А18.21.0185, №14.132.21.1322, грантом РФФИ 2012.1204-31472 мол_а, грантами Минобрнауки России и DAAD по программе «Михаил Ломоносов» А/10/74537, А/12/75478.

Положения, выносимые на защиту: 1. В клетках бацилл активность фактора транскрипции ТпгА зависит от количественного соотношения его комплекса с белком GlnK (активная форма белка ТпгА) и глутаминсинтетазой (неактивная форма белка ТпгА), и определяется изменением аффинности белка GlnK и глутаминсинтетазы к

фактору ТпгА в зависимости от условий дефицита или избытка восстановленного азота.

2. С-концевой домен фактора транскрипции ТпгА является регулятором активности ДНК-связывающего N-концевого домена и конкурентно взаимодействует с глутаминсинтетазой на участке Phel05 — ArgllO и белком GlnK на участке Leu75 - Рго90.

3. Биосинтетическая активность глутаминсинтетазы подавляется при ее связывании с фактором ТпгА: этот уникальный механизм является одним из основных путей регуляции активности фермента в ответ на изменение доступности источников азота для клетки.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), Международной конференции «Развитие междисциплинарных исследований: перспективные направления и вклад DAAD» (Казань, 2009), XIII европейском симпозиуме студентов-биологов «SymBioSE 2009», Международных конференциях аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009, 2011), Российской школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии» (Казань, 2010), Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010), Международных Путинских школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2010, 2011, 2013), Всероссийской научно-практической (заочной) конференции «Естественные науки и современность: проблемы и перспективы исследований» (Москва, 2011), Международной конференции молодых ученых «Молодежь в науке — 2011» (Минск, 2011), III Международной научной конференции по биологии (Тбилиси, 2011), Ежегодной международной конференции «Ассоциация общей и прикладной микробиологии» (Тюбинген, 2012), III Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 научных работ, в том числе 6 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для опубликования материалов диссертаций.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю к.б.н., доценту каф. генетики А.Р. Каюмову за постановку проблемы, помощь в обсуждении результатов и проведении экспериментов; научному руководителю д.б.н., профессору, академику АН РТ О.Н. Ильинской за внимательное отношение к работе и неоценимую помощь на всех этапах работы; профессору Карлу Форшхаммеру за научную консультацию в области регуляции азотного обмена бактерий, предоставленные штаммы и плазмиды, а

также за возможность проведения 111 IP анализа на базе университета им. Карла-Эберхарда г. Тюбингена, Германия; профессору Йоргу Штульке (университет г. Гетпшгена, Германия) за предоставленные штаммы B.subtilis.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 32 рисунка. Цитируемая литература включает 103 источника, из них 100 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы и плазмиды. Штаммы Bacillus subtilis были предоставлены профессором Йоргом Штульке: B.subtilis GP250 trpC2 атуЕ:: (nrgA-lacZ aphA3) Krrí, B.subtilis GP251 trpC2 атуЕ::(nrgA-lacZ aphA3) Kmr AglnA::cat Ctrí, B.subtilis GP253 trpC2 arnyE: : (nrgA-lacZ aphA3) Kmr AnrgBr.cat Cmr, B.subtilis GP254 trpC2 amyE::(nrgA-lacZ aphA3) Kmr AnrgAr.cat Cm, (Detsch, Stulke, 2003). Штаммы E.coli и плазмиды были предоставлены профессором Карлом Форшхаммером: E.coli XLI-Blue (recAl, endAl, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relAl, lac), E.coli BL21 (dem ompT hsdS (rB~ mB~) gal X(DE3), плазмиды - pET15b-TnrA, pDJ148-GlnK, pGP174 (Heinrich et al., 2006).

Культивирование бактерий проводили на средах LB (Sambrook et al., 1989) и синтетической минимальной среде SMM (Anagnostopolous et al., 1961), содержащей 0.05 мг/мл L-триптофана, в качестве источника углерода - 0.5% глюкозу, в качестве источника азота - 20 мМ NaN03 или 2 мМ глутамина (недостаток источника восстановленного азота). Для создания условий избытка восстановленного азота вносили 20 мМ NH4CI или 20 мМ глутамина. В среду вносили антибиотики: 100 мкг/мл ампициллина для штаммов E.coli, 10 мкг/мл хлорамфеникола или канамицина для штаммов B.subtilis.

Конструирование плазмид. Клонирование проводили с использованием ферментов фирмы «Сибэнзим» (Москва) в условиях, рекомендованных производителем. Мутантные гены írtrAG, tnrAlO, tnrA30 и tnrA43 амплифицировали с хромосомной ДНК B.subtilis 168 с использованием синтетических олигонуклеотидов TnrAN (5' GCT CGA GGA ТСС GAT GAC САС AGA AGA ТСА TTC TT 3') и ТпгАб (5' ТТА ACG GGA ТСС GTA CCG ТТА GTG AGC ATT AAG 3'), ТпгА20 (5' ТСС AGC GGA ТСС TTC CGC ACT TAC GGA ТС 3'), TnrA35 (5' TTC TTT GGA ТСС CAT АТС CTT TAA ААТ СТС TGC 3') или ТпгА43 (5' TGC CGT GGA ТСС GCC ТТА TTC ACG CTT ATT G 3'). Сайт рестрикции BamHI подчеркнут. Продукт амплификации и вектор рЕТ15Ь рестрицировали по сайтам BamHI и лигировали. Лигазной смесью трансформировали штамм E.coli XL1 Blue, как описано в (Merrick et al., 1987). Отсутствие ошибок в клонированной последовательности проверяли секвенированием в фирме «Синтол».

Гиперпродукция и очистка белков. Очистку нативного и рекомбинантных белков ТпгА с гексагистидиновой последовательностью проводили на Ni-NTA сефарозе, белков GlnK и GS со стрептавидиновой последовательностью - на стреп-тактин сефарозе (Heinrich et al., 2006).

ППР анализ ДНК-связывающей активности фактора ТпгА проводили методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) на приборе BIAcore X (Biacore AB, Швеция) с использованием сенсорного чипа SA как описано в (Федорова с соавт. 2013). ППР анализ взаимодействия ТпгА с GlnK и GS проводили с использованием чипа Ni2+-NTA как описано в (Fokina et al., 2011; Kayumov et al., 2011; Fedorova et al., 2013).

Иммуноблоттинг для идентификации белков ТпгА, GlnK и GS проводили как описано в (Heinrich et al., 2006).

Иммунопреципитацию белков-партнеров ТпгА в различных условиях роста проводили как в (Bonifacino et al., 2001).

Анализ олигомеризации белков ТпгА методом поперечных сшивок проводили в присутствии глутарового альдегида (Fokina et al., 2011).

Pull Down анализ. Для изучения белковых взаимодействий по 10 нМ каждого белка растворяли в 300 мкл буфера В (100 мМ трис-HCÍ pH 8.0, 200 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА) и инкубировали при 20°С в течение 30 мин. Далее белковую смесь наносили на колонки с Ni-NTA сефарозой (Qiagen) или со стреп-тактин сефарозой (IBA), уравновешенные 10 объемами колонки буфера В, с последующей 4-кратной промывкой 5 объемами того же буфера. Элюировали белки буфером Е (буфер В с 250 мМ имидазолом для Ni-NTA сефарозы или с 2.5 мМ дестиобиотином для стреп-тактин сефарозы) и анализировали методом иммуноблоттинга.

Определение ферментативной активности. Определение активности ß-галактозидазы проводили по расщеплению орто-нитрофенил-ß-D-галактопиранозида (Miller, 1972). Биосинтетическую активность GS определяли по скорости образования у-глутамилгидроксомата (Gawronski, Benson, 2004).

Определение концентрации ионов аммония в культуральной жидкости с помощью реактива Несслера проводили как описано в (Hart et al., 1994).

Биоинформатика. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности анализировали с помощью сервера Bioinformatics.Org (Stothard, 2000), алгоритма BLAST (Altshul et al., 1997) и ClustalW (Thompson et al., 1994). Модель вторичной структуры белка ТпгА получена с использованием сервера Phyre (Kelley, Sternberg, 2009). Третичную структуру ТпгА моделировали в программе PyMOL Molecular Graphics System. Кинетические параметры взаимодействия ТпгА с ДНК и белками GS и GlnK вычисляли в программе BIAevaluation 3.0 Software 1997 и GraphPad Prism 5. Дизайн праймеров и анализ сайтов рестрикции проводили в программе Clone Manager 6.

Математическую обработку данных проводили в программе Statgraphics Plus. Нормальность распределения оценивали по критерию Колмогорова-Смирнова. Для оценки разности средних использовали критерий Стьюдента для выборок с нормальным распределением (а=0.05) и непараметрический критерий Манна-Уитни в случае, когда выборка не описывалась законом нормального распределения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Активность и локализация фактора транскрипции ТпгА в условиях избытка или недостатка восстановленного азота Фактор транскрипции ТпгА в клетках бацилл активен при дефиците восстановленного азота или при наличии трудно усваиваемых альтернативных источников азота независимо от их концентрации в среде (Wray et al., 1996; Gunka, Commichau, 2012). При избытке восстановленного азота в клетке повышается уровень глутамина, который приводит к ингибированию глутаминсинтетазы (GS) по типу обратной связи. Ингибированная GS образует комплекс с фактором ТпгА и инактивирует его (Wray et al., 2001). В активном состоянии фактор ТпгА локализован на клеточной мембране в комплексе с белками транспорта аммония GlnK-AmtB (Heinrich et al., 2006). Возможно, белки AmtB, GlnK и GS с фактором ТпгА образуют систему сигнальной трансдукции, однако их роль в формировании и передачи сигнала доступности азота до конца не изучена. (Heinrich et al., 2006; Gunka, Commichau, 2012).

Изучали активность фактора ТпгА по активности ß-галактозидазы, экспрессируемой с TnrA-зависимого промотора nrgA, в штаммах бацилл, дефектных по белкам GlnK, AmtB и GS. Белки AmtB в клетках различных организмов могут участвовать в формировании сигнала о доступности азота (Tremblay, Hallenbeck, 2009). В условиях азотного голодания в клетках, мутантыых по белку AmtB, активность ТпгА была в 9 раз выше по сравнению с исходным штаммом (рис. 1 А). В этих клетках фактор ТпгА конститутивно связан с белком GlnK (Kayumov et al., 2011), и взаимодействие с GlnK не подавляет активность фактора транскрипции ТпгА. Однако внесение избытка восстановленного азота к этим клеткам также подавляло активность ТпгА, как и в исходном штамме (рис. 1 В). При этом фактор ТпгА в клетках обоих штаммов переходил из комплекса с GlnK в комплекс с GS (рис. 2). Следовательно, AmtB не принимает участия в передаче сигнала на фактор ТпгА. Повышенную активность фактора ТпгА в клетках, мутантаых по белку AmtB, можно объяснить несколькими причинами. Во-первых, цитозольная локализация ТпгА в AmtB-мутантах, вероятно, обеспечивает большую частоту взаимодействия ТпгА с ДНК. Во-вторых, в мутантных штаммах происходят нарушения в транспорте ионов аммония (NH,»*) в клетки.

Б 30

AamtB 25 ■

u 20 ■

исходный штамм» ¡1 1 s » g 15 ■ 10 ■

Ё I < 2 5 ■

6 8 Время, ч 0 0

AglnA

Время, ч

0 0,5 1 1,5 2 Время, ч

Рис. 1. Участие белков АтГВ, С1пК и в контроле активности фактора транскрипции ТпгА в условиях лимитирования по источнику азота (А - 20 мМ нитрат натрия; Б - 2 мМ глутамин) и после внесения глутамина до концентрации 20 мМ (В, Г). К - клетки, растущие в условиях лимитирования по источнику азота (2 мМ глутамин)

недостаток избыток

восстановленного восстановленного азота азота

B.subtilis 250 (исходный штамм)

B.subtilis GP254 (AamtB)

B.subtilis GP253 (AglnK)

aTnrA

аТпгА

аТпгА

Рис. 2. Иммунопреципитация белков GS (1, 3) и GlnK (2, 4) в клетках B.subtilis 250, B.subtilis GP254 (AamtB) и B.subtilis GP253 (AglnK)

12 3 4

Ионы аммония частично диффундируют через клеточную мембрану из клетки в окружающую среду в виде свободного аммиака (NH3) (Kleiner, 1985). Замер концентраций ионов NH4+ показал, что в культуральной жидкости исходного штамма, в котором белок AmtB возвращает аммоний снова в клетку (Detsch, Stulke, 2003), концентрация ионов NH4+ была почти в 1.5 раза ниже (53±5.3 мкМ/ед. биомассы), чем в штамме с дефектом белка AmtB (73±12.5 мкМ/ед. биомассы). Таким образом, в мутантном штамме происходят потери

глутамин 20 иМ

I

восстановленного азота и образуется его дефицит в клетке, что, возможно, и ведет к повышению активности фактора ТпгА (рис. 1). Концентрация NH4+ в культуральной жидкости штамма с дефектом белка GlnK оказалась в 1.8 раза выше, чем у исходного штамма (86±18.4 мкМ/ед. биомассы). При отсутствии GlnK нарушается регуляция белка AmtB, что приводит к утечке NH4+ из клетки через открытый транспортный канал AmtB (Detsch, Stulke, 2003), и значит также наблюдается дефицит азота внутри клетки. Однако активность фактора ТпгА в этом штамме была в 2 раза ниже по сравнению с исходным (рис. 1 А). Это можно объяснить конститутивным образованием комплекса TnrA-GS в этом штамме (Kayumov et al., 2011), что подавляет активность фактора ТпгА независимо от доступности азота для клетки. В этом штамме фактор ТпгА связан с GS как в условиях недостатка источника восстановленного азота, так и в условиях его избытка (рис. 2). Внесение глутамина к GlnK-дефектным клеткам, выращенным в условиях азотного голодания, не приводило к изменениям активности ТпгА (рис. 1 В). Следовательно, GS в этом штамме подавляет активность фактора ТпгА независимо от доступности азота. Вероятно, в клетках бацилл взаимодействие фактора ТпгА с GlnK предотвращает его связывание с GS при недостатке азота и обеспечивает высокую активность фактора ТпгА. Подтверждением этого вывода является тот факт, что в клетках, мутантных по гену glnA, активность р-галактозидазы в 7 раз выше, чем в клетках исходного штамма (рис. 1 Б). Это свидетельствует, что активность фактора ТпгА в исходном штамме частично подавлена даже в условиях азотного голодания. В отсутствие GS репрессия ТпгА снимается, что приводит к высокому уровню транскрипции TnrA-зависимых генов. Ранее было показано, что GS подавляет активность ТпгА при избытке источника восстановленного азота (Wray et al., 2001). Наши данные впервые продемонстрировали, что и активная форма GS подавляет активность фактора ТпгА даже в условиях лимитирования по азоту. Эти результаты также согласуются с данными о взаимодействии активной формы GS с ТпгА в условиях in vitro (Kayumov et al., 2011).

Наблюдаемые различия в активности фактора ТпгА в мутантных и исходном штаммах могут быть обусловлены как различиями регуляции его активности, так и изменением количества белка в клетке. Установлено, что количество ТпгА во всех штаммах не отличается. Также не выявлено различий в содержании ТпгА, GlnK и GS в исходном штамме после внесения избытка глутамина, что говорит о высокой стабильности этих белков внутри клеток. Следовательно, различия в активностях фактора ТпгА в клетках обусловлены регуляцией его активности, а не изменением его количества.

Полученные данные подтверждают предположение о том, что активность фактора транскрипции ТпгА определяется сменой его белка-партнера — GlnK

или GS. Сигналом для смены локализации может быть изменение аффинности этих белков к ТпгА, вызванное ингибированием GS и снижением стабильности комплекса TnrA-GlnK. Ранее in vitro было показано, что АТФ подавляет взаимодействие ТпгА с GlnK и GS, а глутамин и АМФ, наоборот, повышают способность GS связываться с ТпгА (Kayumov et al., 2011). При повышении концентрации глутамина в среде повышается его концентрация в клетке, а также происходит изменение концентрации АТФ и АМФ (Forchhammer, 2006, 2008), что, по всей видимости, приводит в конечном итоге к изменениям аффинности GS и белка GlnK к ТпгА. Вероятно, в клетке существует равновесие между концентрациями активной и неактивной форм ТпгА (когда ТпгА находится в комплексе с GlnK или с GS, соответственно), и смещение этого равновесия определяет активность фактора ТпгА.

Исследования кинетических параметров взаимодействия GlnK и GS с ТпгА в условиях in vitro подтверждают данное предположение. В присутствии только ионов Mg2+2 мМ или ионов Mg2* 2 мМ и АТФ 2 мМ аффинность GlnK к ТпгА практически в 2 раза превышает аффинность GS (табл. 1, рис. 3). Этим можно

2 «MfM^мМ рис J JJJJp аиализ вЛШНиЯ

эффекторных молекул, АТФ, АМФ, глутамина и -ионов

GS + АМФ 2 мМ + Mg^2 мМ Mg2+ ш эффектШНОСТПЪ

взаимодействия ТпгА с GS. 1 РЕ (резонансная единица) эквивалентна одному

пикограмму вещества на квадратном миллиметре сенсорной поверхности чипа

GS+A№2MM+rjiymraH 2jnM+Mgz+2MM

— GS + Mg^MM

■ GS + АТФ 2 мМ + Mg 2 мМ

Табл. 1. Кинетические константы ка и к* и вычисленные равновесные константы диссоциации Ко для взаимодействия ТпгА с и апК

Белки Константы скорости Ко, М

k,x 105, М"1 х с"1 kj хЮ"4, с1 kd/kax 10"9

GS+ М^+2 мМ 1.37 ±0.03 7.6 ±2.4 5.55 ±2.8

GS + АТФ 2 мМ + Mg2+ 2 мМ 0.87 ±0.03 19.4 ±2.7 22.3 ±2.3

GS + АМФ 2 мМ + М^+2 мМ 1.30 ±0.09 7.2 ±3.1 5.4 ±2.8

GS + глутамин 2 мМ + мМ 1.32 ±0.18 5.08 ±2.9 3.84 ±2.2

GS + глутамин 2 мМ + АТФ 2 мМ + М^+2 мМ 1.45 ± 0.02 4.64 ±0.8 3.21 ±1.2

GlnK+ 2 мМ 6.44 ±2.1 21.3 ± 1.4 3.31 ±1.5

GlnK + АТФ 2 мМ + Mg2+ 2 мМ 2.89 ±2.0 34.7 ±1.23 12.1 ±2.2

GlnK + глутамин 2 мМ + АТФ 2 мМ + Mg^ 2 мМ 2.43 ± 0.9 31.8 ±1.23 13.1 ±1.4

объяснить коэлюцию фактора ТпгА с белком GlnK в условиях азотного голодания, когда содержание глутамина в клетке минимально (рис. 2). При концентрации глутамина 2 мМ аффинность GS к ТпгА превышает аффинность GlnK в 4 раза независимо от концентрации АТФ (табл. 1, рис. 3). Это, видимо, приводит к диссоциации комплекса TnrA-GlnK и связыванию ТпгА с GS при избытке восстановленного азота, когда содержание глутамина в клетке повышается, и объясняет коэлюцию фактора ТпгА с GS (рис. 2).

Таким образом, в зависимости от доступности восстановленного азота аффинность GS и белка GlnK к фактору ТпгА в клетках меняется, и соотношение белков GlnK : GS ингибированная : GS активная определяет, с каким белком будет преимущественно взаимодействовать ТпгА. В условиях азотного голодания, когда большая часть молекул GS находится в активном состоянии, фактор ТпгА предпочтительнее взаимодействует с белком GlnK и проявляет свою максимальную ДНК-связывающую активность. В условиях избытка восстановленного азота (глутамина или ионов аммония) больше молекул ТпгА связывается с ингибированной GS, что приводит к снижению активности этого фактора транскрипции.

2 Идентификация домена сигнальной трансдукции фактора транскрипции ТпгА

Результаты проведенных экспериментов позволили сделать вывод, что активность фактора ТпгА зависит от соотношения комплексов TnrA-GlnK и TnrA-GS. Однако влияние взаимодействия ТпгА с GlnK и GS на ДНК-связывающую активность фактора транскрипции остается малоизученным.

Белки семейства MerR, к которым относится фактор транскрипции ТпгА, активны в димерной форме и имеют два функциональных домена (Hobman, 2007): N-концевой домен взаимодействует с ДНК, С-концевой воспринимает регуляторный сигнал и контролирует ДНК-связывающую активность белка. Несмотря на высокую гомологию N-концевого домена с другими белками семейства MerR (Fisher, Wray, 2006, 2008), С-концевой домен ТпгА значительно короче и имеет отличную структуру (Wray, Fisher, 2007). Известно, что GS связывается с С-концом ТпгА и подавляет его активность, в активном состоянии ТпгА связан с белком GlnK, однако молекулярные механизмы взаимодействия этих белков изучены недостаточно (Heinrich et al., 2006). Вероятно, С-концевой домен взаимодействует как с GS, так и с белком GlnK, и, по-видимому, участвует в сигнальной трансдукции (Wray, Fisher, 2007). Также остается неизвестным сайт димеризации фактора ТпгА. Белки семейства MerR димеризуются по С-концевой а-спирали, однако удаление гомологичного домена фактора ТпгА не нарушает его димеризацию (Wray, Fisher, 2007). Сравнительный анализ аминокислотной последовательности белков ТпгА из

различных видов бацилл выявил аминокислоты, потенциально участвующие в димеризации (рис. 4, 5 А). Идентифицированные аминокислоты образуют несколько вероятных участков взаимодействия мономеров ТпгА. Вероятно, олигомеризация белка ТпгА происходит в его центральной части.

В. subtilis jgiAj^REg^OTAEILK¡^RKg^QMLKNg|PQVRKÍ^LE^DgAHFRYKNR 110

В.vallismortis DIANKREDGVQTAEILKDMRKKEQMVKNDPQVRKKMLEGQLNAHFRYKNR 110

В.atrophaeus DIANKREDGVQTAEILKDMRKKEQALKNDPQVRKKMLEGQLNAHFKYRNR 110

В.amyloliquefaciens DIANKREDGVQTAEILKDMRKKEQALKNDPQLRKKMLEGQLNAHFKYKNR 110

В.licheniformis EIANKREDGVQTAEILKDMRKKEQRLKNDQQLRKKMLEGQLNAHFKYKNR 110

B.aerophilus DIANKREDGVQTAEILKDMKKKEQALKSG-QYKKKMLEGQINAHFRYKNR 109

В.pumilus DIANKREDGVQTAEILKDMKKKEQALKSG-QYKKKMLEGQINAHFRYKNR 109

B.halodurans DIANKMEDGMQTFEI----RKMEQKQLRKKEVRDRMLRGQLNAAFNLRK- 100

B.clausii DIANKMEDGMQTFEI----RKMEQKALRKQEVRERMLRGQLNAAFNIRK- 100

B.selenitireducens DIANKMEDGMQTFEI----RKQEMK---KSDVRDKMLRGQLNAAFKMRK- 99

B.coagulans DIANKREEGIQTAEIRK—EYMKEKKYNERTMREQVIRGQLNAYFRTRE- 106

В.megaterium DIADRIEEGVQTSEIRTELAKKDEARKMK-EVKNQMLQGQLNAHFKRKL- 108

Рис. 4. Множественное выравнивание С-концевых доменов белков ТпгА разных видов бацилл: * - полная идентичность; : - консервативные замены; . -полуконсервативные замены. Потенциальные аминокислоты, участвующие в димеризации белка ТпгА выделены

д -Г—Г)а-спираль 3 >-£)а-спираль 4 '—а-спираль 5

7I I I н

Ос1Ы64 07ЙК82 Б39 К95 вЭ9И102

^ ТпгА

4 5 ЗДСТИКУБГАРУЕКЬМРХАМКИЕРСУОТАЕIЬКРМЯККЕОМЬКЫРРОУИКК-МЬЕй£ 1.ЫАН ГЯУКИИ 110

tt- ТпгА20

ТпгАб

45 SRGTRKYSFADVERLMDIANKREDGVQTAEILKDMRKKSQMLKKDPQVRKKV'!^EGQ :,NAH 104

TnrA20

45 SRGTRKYSFÄDVERLMDIANKREDGVQTAEII.KDMRKKEOMLKNDP 90

ТпгА35

45 SRGTRKYSFADVERLMDIANKREDGVOTAEI 75

ТпгА43

45 SRGTRKYSFADVERIMDIAMKRE 67

Рис. 5. Предполагаемая вторичная структура фактора транскрипции ТпгА, (А) и делеции С-конца белка ТпгА на 6, 20, 35 и 43 аминокислоты (Б). Стрелками указаны аминокислоты, предположительно участвующие в димеризации белка. Красным обозначены аминокислоты, необходимые для взаимодействия с GS

На основе экспрессионного вектора рЕТ15Ь были созданы плазмиды pET15-TnrA6, pET15-TnrA20, рЕТ15-ТпгА35 и рЕТ15-ТпгА43 для продукции рекомбинантных белков ТпгА с делециями С-концевого домена на 6, 20, 35 и 43 аминокислоты (ТпгАб, ТпгА20, ТпгА35, ТпгА43) (рис. 5 Б). С помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA сефарозе были получены высокоочищенные фракции белков (рис. 6 А). Все рекомбинантные белки с делециями С-конца были способны к олигомеризации (рис. 6 Б). Следовательно, 8 из 10 предполагаемых аминокислот (D68, G69, D78, К82, D89, К95, G99, N102) не являются критичными для димеризации (рис. 4). Моделирование третичной структуры и возможной димеризации белка ТпгА43

показало, что взаимодействие двух противоположно направленных а-спиралеи (а-спираль-3, рис. 5 А), скорее всего происходит по остаткам аспарагиновой кислоты 61 и аспарагина 64.

5 ^

70 55

35 25

1С

70 55 40 35 25

I *<*»

V 1; *

4х

10

I х

Рис. 6. Электрофорез очищенных белков ТпгА \vt-Hise, ТпгАб-Шз6, ТпгА20-Шз6, ТпгА35-Шэ6 и ТпгА43-Шзб в 15% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (А). Анализ димеризации мутантных белков ТпгА методом поперечных сшивок (Б). К - белок ТпгА \vt-Hise в отсутствие глутарового агента. 1х, 2х, 4х - белки в моно-, ди- и тетрамерной формах

Для выяснения роли С-концевого домена фактора ТпгА в контроле ДНК-связывающей активности И-конца, мы исследовали взаимодействие с ДНК мутантных белков ТпгА методом ППР. Все белки связывались с ДНК (рис. 7), при этом аффинность белков к ДНК возрастала с увеличением делении С-концевого домена, однако стабильность комплекса ТпгА-ДНК снижалась (табл. 2).

Табл. 2. Кинетические константы ка и к ¡1 и вычисленные равновесные константы диссоциации Кв для взаимодействия ТпгА с ДНК

50 100

Время, с

Рис. 7. ППР анализ взаимодействия белков ТпгА с промотором ТпгА-зависимого гена п/^А.

Эффективность связывания белков с ДНК показана в резонансных единицах

Белки Константы скорости Кс, М

ка х 104, М"1 х с-1 к<1 х 10"3, с"1 кд/ках 10"8

ТпгА 2.8 ±0.61 1.4 ±0.06 5.0 ±0.96

ТпгАб 4.2 ± 0.2 1.7 ±0.06 4.1 ±0.26

ТпгА20 8.1 ±2.5 2.8 ±0.01 3.5 ±0.6

ТпгА35 13 ±0.81 4.4 ±0.01 3.4 ±0.55

ТпгА43 15 ± 1.5 5.0 ±0.01 3.4 ±0.42

А GS-ST

TnrA-His„

GlnK-ST

IW*

TnrA-His(

1 и i и

Рис. 8. Pull Down анализ взаимодействия нашивного и мутантных белков ТпгА с GS (А) и GlnK (Б). I— фракции элюции белковых комплексов, полученных на Ni-NTA сефарозе, II - фракции элюции белковых комплексов, полученных на стреп-тактин сефарозе

Таким образом, С-концевой домен контролирует ДНК-связывающую активность белка и необходим для стабилизации комплекса ТпгА-ДНК.

Также нам удалось определить участки С-концевого домена, взаимодействующие с белками GlnK и GS (рис. 8). Так, 6 аминокислот с С-конца необходимы для связывания ТпгА с GS. Вероятно, фенилаланин F105 выполняет ключевую роль в этом связывании (рис. 2). При этом для полного подавления TnrA-GlnK взаимодействия необходима делеция 35-ти аминокислот с С-конца. Следовательно, участок между аминокислотами L75 и Р90 необходим для взаимодействия фактора ТпгА с белком GlnK.

Таким образом, С-концевая область ТпгА является доменом сигнальной трансдукции, необходима для взаимодействия с белками-регуляторами и контролирует ДНК-связывающую активность N-концевого домена (рис. 7 и 8). Ранее было показано, что делеция С-конца белка ТпгА на 7 или 20 аминокислот приводит к конститутивной экспрессии TnrA-регулируемых генов, а удаление 34- аминокислот приводит к возникновению фенотипа, мутантного по этому белку (Shin et al., 2000). Следовательно, при удалении 7 или 20 аминокислот GS утрачивает способность подавлять активность фактора ТпгА, который остается в комплексе с GlnK и обеспечивает конститутивную экспрессию генов ТпгА -регулона. Очевидно, взаимодействие ТпгА с GS и GlnK происходит по разным неперекрывающимся участкам. Скорее всего, ТпгА способен одновременно взаимодействовать только с одним белком-партнером. Возможность конкурентного связывания ТпгА с белком GlnK и GS мы исследовали методом ППР (рис. 9). С увеличением концентрации GlnK в смеси, эффективность связывания GS с ТпгА заметно снижалась (рис. 9 А). Следовательно, GlnK способен препятствовать связыванию GS с ТпгА (рис. 9 А). Однако, в присутствии ингибиторов GS - глутамина (20 мМ) и АМФ (10 мМ) (рис. 9 Б), GS в два раза эффективнее связывалась с ТпгА, и наличие GlnK практически не

17

влияло на эффективность этого взаимодействия (рис. 9 Б). Эти данные свидетельствуют, что повышение аффинности ингибированной ОБ к фактору ТпгА может определять переход ТпгА из комплекса с С1пК в комплекс с ОБ при внесении избытка восстановленного азота к клеткам, растущим в условиях азотного голодания (табл. 1, рис. 2).

Время, с Время, с

Рис. 9. ППР анализ влияния СНпК на формирование комплекса ТпгА с активной (А) и ингибированной СБ (Б). Концентрация ОБ во всех тестируемых пробах составляла 200 нМ

Ранее сообщалось, что связывание только с ингибированной ОБ снижает активность ТпгА (\Vray е1 а1., 2001). ППР анализ показал, что присутствие ингибированной ОЭ подавляет ДНК-связывающую активность ТпгА в три раза (рис. 10 А, табл. 3). При этом и активная форма ОБ также снижала аффинность ТпгА к ДНК почти в 1.5 раза (рис. 10 А, табл. 3). Возрастание Кп в присутствии как ингибированной, так и активной ОБ свидетельствует о дестабилизации комплекса ТпгА-ДНК (табл. 3). Присутствие белка С1пК, напротив, увеличивает стабильность взаимодействия фактора ТпгА с ДНК в 3 раза (табл. 3).

Время, с Время, с

Рис. 10. ППР анализ влияния активной и ингибированной СБ (А) и белка С1пК (Б) на ДНК-связывающую активность фактора транскрипции ТпгА

Табл. 3. Кинетические константы ка и к^ и вычисленные равновесные константы диссоциации Ку

Белки Константы скорости KD,M

ka х 104, М"1 х с"1 ka xlO"3, с"1 kd/kaX 10"8

ТпгА wt 6.7 ± 0.32 2.2 ±0.17 3.2 ±0.56

ТпгА wt + GS 5.1 ±0.23 3.7 ±0.24 7.2 ± 0.45

ТпгА wt + GS инг. 3.8 ±0.52 4.4 ±0.31 11.6 ±0.62

ТпгА wt + GlnK 7.2 ±0.38 0.8 ±0.24 1.1 ±0.27

Полученные результаты согласуются с данными об активности фактора ТпгА in vivo. При недостатке восстановленного азота в клетках, мутантных по белкам AmtB и GS, где ТпгА связан с GlnK, активность ТпгА выше, чем в клетках исходного штамма (рис. 1 А, Б). В отсутствие белка GlnK, ТпгА конститутивно связан с активной GS и имеет активность ниже, чем в клетках дикого типа. Возможно, в условиях азотного голодания белок GlnK связывается с участком ТпгА между L75 и Р90 и блокирует участки взаимодействия с GS, предотвращая тем самым подавление активности ТпгА со стороны крупной додекамерной молекулы GS. Напротив, избыток восстановленного азота приводит к подавлению активности GS и повышению ее аффинности к ТпгА. GS связывает фактор ТпгА и подавляет его ДНК-связывающую активность.

3 Участие фактора транскрипции ТпгА в регуляции активности

глутаминсинтетазы в клетках Bacillus subtilis

В отличие от других бактерий, в клетках В.subtilis активность GS

контролируется путем подавления конечным продуктом, глутамином (Deuel, Prusiner, 1974). Уникальность GS бацилл заключается в том, что помимо

ферментативной функции, GS контролирует экспрессию генов азотного обмена (Wray et al., 2001; Fisher et al., 2008). Этот фермент активирует фактор транскрипции GlnR и подавляет активность ТпгА, образуя с ними белковые комплексы. Ранее было установлено, что ТпгА связывается с GS вблизи глутамат-связывающего сайта (Fisher et al., 2002), что должно влиять на биосинтетическую активность GS. Чтобы проверить это предположение, исследовали влияние фактора ТпгА на биосинтетическую активность GS в условиях in vitro и in vivo.

ТпгА ингибировал ферментативную активность GS, и при соотношении одна молекула додекамера GS к 24 молекулам димерных ТпгА остаточная активность фермента составляла 50%, тогда как мутантный белок ТпгАб, не связывающий GS, не оказывал ингибирующего эффекта (рис. 11). Более того, полноценный белок ТпгА усиливает эффект основных ингибиторов GS: АМФ и глутамина. В присутствии ТпгА в пять раз меньше глутамина и в два раза меньше АМФ необходимо для подавления активности GS на 50% (рис. 11 Б, В).

ТпгАб

1:12 1:24 сотношение GS:TnrA

Рис. 11. Влияние белков ТпгА Ш (я) и ТпгАб (•) на активность СБ (А). Влияние ТпгА (а) и ТпгАб (о) на активность СБ в присутствии АМФ (Б) и глутамина (В) при соотношении белков С5:ТпгА-1:24. Концентрация АМФ, при которой наблюдается снижение активности С5 на 50% (ИКзо) ИК50=470.3 мкМ, в присутствии ТпгА и»/ ИК50=224.5 мкМ, в присутствии ТпгАб ИК5о=42б.4 мкМ. Концентрация глутамина, при которой активность СБ снижается на 50%: ИК50=1651 мкМ, в присутствии ТпгА м! ИК5о=320.1 мкМ, в присутствии ТпгАб ИК50=1329 мкМ

А АМФ □ АМФ + ТпгА wt О АМФ + ТпгАб

В

глутамин □ глутамин+ о глутамин TnrAwt + ТпгАб

lg(HKso)

lg |АМФ (мкМ)]

• 2 18(ИКМ)3

lg [глутамин (мкМ)1

Также эффект подавления GS фактором ТпгА наблюдали in vivo (рис. 12). В клетках, мутантных по GlnK, ТпгА находится в комплексе с GS (Kayumov et al., 2011) (рис. 2). В условиях недостатка источника восстановленного азота активность GS в этом штамме была в два раза ниже, чем в клетках дикого типа (рис. 12, точка 0), несмотря на условия сильного дефицита азота, вызванные нарушением транспорта NH4+. Следовательно, связывание ТпгА с GS подавляет биосинтетическую активность фермента на 50%. Напротив, при отсутствии AmtB, когда ТпгА находится в стабильном комплексе с GlnK, активность GS была выше, чем в клетках исходного штамма (рис. 12, точка 0). С другой стороны, причиной повышенной активности GS в этих клетках может быть нарушенный транспорт NH4+.

В ответ на внесение глутамина активность GS в клетках, мутантных по GlnK, подавлялась всего на 20% в отличие от 60-70% ингибирования в клетках исходного типа. Данные о подавляющем эффекте белка ТпгА, взаимодействующего с GS, на активность фермента, согласуются с данными иммунопреципитации (рис. 2).

Рис. 12. Участие фактора транскрипции ТпгА в регуляции биосинтетической активности GS в клетках B.subtilis 250 (о), B.subtilis GP253 (А) и B.subtilis GP254 (а). Клетки выращивали на среде SMM с нитратом в качестве источника азота. В поздней экспоненциальной фазе роста, к клеткам вносили глутамин до конечной концентрации 20 мМ. Через 60 мин культивирования клетки отмывали и переносили в среду с нитратом

В ответ на внесение глутамина активность GS в клетках, мутантных по GlnK, подавлялась всего на 20% в отличие от 60-70% ингибирования в клетках исходного типа, в которых ТпгА связывался с GS (рис. 2). После переноса клеток обратно в условия азотного голодания, в клетках исходного штамма активность GS возрастала до начальных значений, что объясняется освобождением GS из комплекса GS-TnrA. В клетках, мутантных по белку GlnK, существенных изменений активности GS при смене доступности азота не происходило (рис. 12), вероятно, из-за конститутивного взаимодействия ТпгА с GS (рис. 2).

Таким образом, репрессия активности GS фактором транскрипции ТпгА представляет собой дополнительный способ регуляции ферментативной активности GS и служит механизмом быстрого ингибирования GS в ответ на резкую смену источника азота в среде. В условиях недостатка предпочтительного источника азота одной из возможных функций GlnK-TnrA взаимодействия является защита ферментативной активности GS от ингибирующего взаимодействия с фактором ТпгА.

ВЫВОДЫ:

1. Установлено, что глутаминсинтетаза принимает участие в подавлении активности фактора транскрипции ТпгА в условиях как избытка, так и недостатка источника восстановленного азота. Взаимодействие с белком GlnK обеспечивает высокую активность фактора ТпгА и предотвращает связывание ТпгА с глутаминсинтетазой. Транспортер ионов аммония белок AmtB не участвует в передаче сигнала на фактор ТпгА.

2. Переход фактора ТпгА из мембраносвязанного состояния в цитоплазматическое определяется сменой аффинности к нему белка GlnK и

глутаминсинтетазы, и регулирует активность фактора ТпгА в условиях недостатка и избытка источника восстановленного азота.

3. Белок GlnK не подавляет ДНК-связывающую активность фактора транскрипции ТпгА, в то время как глутаминсинтетаза снижает способность фактора ТпгА взаимодействовать с ДНК. При этом ингибированная глутаминсинтетаза снижает ДНК-связывающую активность фактора ТпгА в два раза эффективнее, чем активный фермент.

4. На основе плазмиды рЕТ15Ь созданы генетические конструкции для гиперпродукции рекомбинантных белков ТпгА с укороченным С-концевым доменом на 6, 20, 35 и 43 аминокислоты, и соответствующие белки получены в электрофоретически гомогенном состоянии.

5. Близкорасположенные, неперекрывающиеся участки С-концевого домена фактора транскрипции ТпгА отвечают за взаимодействие с белком GlnK и глутаминсинтетазой. С-концевой домен не участвует в димеризации, но контролирует ДНК-связывающую активность белка и необходим для стабилизации комплекса ТпгА-ДНК.

6. Фактор транскрипции ТпгА примерно в два раза подавляет биосинтетическую активность глутаминсинтетазы в условиях in vitro и в клетках Bacillus subtilis. В отсутствие белка GlnK фактор ТпгА конститутивно связывается с глутаминсинтетазой и подавляет ее активность in vivo.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Fedorova К., Kayumov A., Woyda К., Ilinskaja О., Forchhammer К. Transcription factor ТпгА inhibits the biosynthetic activity of glutamine synthetase in Bacillus subtilis II FEBS Lett. - 2013. - V. 587. - P. 1293-1298. - (перечень ВАК), автора-0.25 пл.

2. Федорова К.П., Шарафутдинов И.С., Турбина Е.Ю., Богачев М.И., Ильинская О.Н., Каюмов А.Р. С-концевой домен фактора транскрипции ТпгА из Bacillus subtilis контролирует активность ДНК-связывающего домена, но не участвует в димеризации белка // Молекулярная биология. - 2013. - Т. 47. - №

2. - С. 331-337. - (перечень ВАК), автора - 0.3 пл.

3. Федорова К.П., Тарасов Н.В., Халитова A.B., Ильинская О.Н., Барабанщиков Б .И., Каюмов А.Р. Влияние белков AmtB, GlnK и глутаминсинтетазы на активность фактора транскрипции ТпгА в клетках Bacillus subtilis II Цитология. - 2012. - T. 54. -№ 12. - С. 898-901. - (перечень ВАК), автора- 0.06 пл.

4. Каюмов А.Р., Халитова A.B., Федорова К.П., Шмакова JI.A., Михайлова Е.О., Ильинская О.Н. Влияние глутаминсинтетазы на активность фактора транскрипции ТпгА в клетках Bacillus subtilisH Вестник Казанского технологического университета. — 2012. — № 21. - С. 111—114. — (перечень ВАК), автора - 0.03 пл.

5. Kayumov A., Heinrich A., Fedorova K., Ilinskaya O., Forchhammer K. Interaction of the general transcription factor TnrA with the PII-like protein GlnK and glutamine synthetase in Bacillus subtilis II FEBS Journal. - 2011. -V. 278. - P. 1779-1789.-(переченьВАК), автора-0.1 пл.

6. Каюмов А.Р., Федорова К.П., Ильинская О.Н., Шарипова М.Р. Содержание и локализация регуляторных белков TnrA и GlnK в клетках Bacillus subtilis в условиях азотного голодания // Молекулярная биология. - 2010. - Т. 44. - № 4. - С. 743-745. - (перечень ВАК), автора - 0.06 пл.

7. Каюмов А.Р. Взаимодействие фактора транскрипции TnrA с белком GlnK и глутаминсинтетазой в клетках Bacillus subtilis / А.Р. Каюмов, К.П. Федорова, М.Р. Шарипова, К. Форшхаммер / Материалы докладов IV Российского симпозиума «Белки и пептиды». Казань: 2009. - С. 200.

8. Федорова К.П. Регуляторные белки TnrA, GlnK, GS Bacillus subtilis в условиях азотного голодания / Федорова К.П., Каюмов А.Р. // Материалы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Москва: 2009. - С. 14.

9. Fedorova К.Р. The regulatory proteins TnrA, GlnK, GS in Bacillus subtilis under conditions of nitrogen starvation / Fedorova K.P., Kayumov A.R., Sharipova M.R., Forchhammer K. // The materials of the XIV international conference devoted to 20th anniversary of partnership between Kazan State University and Lustus-Liebig Giessen University. Kazan: 2009. - P. 24-25.

10. Kayumov A.R. Inactivation of the general transcription factor TnrA in Bacillus subtilis by proteolysis / Kayumov A.R., Fedorova K.P., Sharipova M.R., K. Forchhammer // The materials of the XIV international conference devoted to 20th anniversary of partnership between Kazan State University and Lustus-Liebig Giessen University. Kazan: 2009. - P. 32-33.

11. Fedorova K.P. The response of regulatory proteins TnrA, GlnK, GS in Bacillus subtilis to nitrogen starvation / Fedorova K.P., Kayumov A.R., Sharipova M.R., Forchhammer K. // Abstracts of the 13th annual Symposium for Biology Students of Europe «SymBioSE 2009» «Biology: Expansion of Borders». Kazan: 2009. - P. 51.

12. Каюмов А.Р. Регуляция активности фактора транскрипции TnrA в клетках Bacillus subtilis путем протеолиза и взаимодействия с белками GlnK и GS / Каюмов А.Р., Федорова К.П. // Труды Томского Государственного Университета. Томск: 2010. - Т. 275. - С. 357-359.

13. Федорова К.П. Влияние С-концевого домена фактора транскрипции TnrA на его взаимодействие с белком BsGlnK / Федорова К.П., Каюмов А.Р. // Труды Томского Государственного Университета. Томск: 2010. - Т. 275. - С. 421-423.

14. Федорова К.П. Взаимодействие in vitro фактора транскрипции TnrA Bacillus subtilis с белком BsGlnK / Федорова К.П., Каюмов А.Р., Шарипова М.Р.

// Материалы докладов 14-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых Биология наука XXI века. Пущино: 2010. - Т. 2 - С. 191-192.

15. Федорова К.П. Влияние С-концевого домена фактора транскрипции ТпгА на его взаимодействие с белком BsGlnK / Федорова К.П., Каюмов А.Р. // Тезисы докладов российской школы молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии. Казань: 2010. - С. 62.

16. Каюмов А.Р. Взаимодействие фактора транскрипции ТпгА с белками GlnK и GS в клетках Bacillus subtilis / Каюмов А.Р., Федорова К.П. // Тезисы докладов российской школы молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии. Казань: 2010. - С. 27.

17. Федорова К.П. Поведение белков ТпгА, GlnK, GS в клетках Bacillus subtilis в условиях азотного голодания / Федорова К.П., Каюмов А.Р. // Материалы V всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». Саратов: 2010. - С. 81.

18. Федорова К.П. Механизм защиты фактора ТпгА от протеолиза путем взаимодействия с белком GlnK и глутаминсинтетазой / Федорова К.П., Каюмов А.Р., Ильинская О.Н. // Международная конференция молодых ученых «Молодежь в науке - 2011». Минск: 2011. - С. 180-183.

19. Федорова К.П. Взаимодействие фактора транкрипции ТпгА в клетках Bacillus subtilis с белком GlnK и глутаминсинтетазой в условиях недостатка и избытка азота / Федорова К.П., Каюмов А.Р., Ильинская О.Н. // Естественные науки и современность: проблемы и перспективы исследований. Материалы VI Всероссийской научно-практической (заочной) конференции. НИИРРР, Москва: 2011. - С. 61-65.

20. Федорова К.П. Взаимодействие фактора транскрипции ТпгА с регуляторным белком GlnK и Глутаминсинтетазой / Федорова К.П., Каюмов А.Р. // Материалы XVIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов». Москва: 2011. — С. 197-198.

21. Федорова К.П. С-концевой домен фактора транскрипции ТпгА необходим для взаимодействия с глутаминсинтетазой и белком GlnK / Федорова К.П., Каюмов А.Р., Ильинская О.Н., Тарасов Н.В., Шарафутдинов И.С. // Материалы докладов 15-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых Биология наука XXI века. Пущино: 2011. - С. 63

22. Федорова К.П. Изменение активности фактора транскрипции ТпгА при связывании с GS и белком GlnK / Федорова К.П., Тарасов Н.В., Каюмов А.Р. // Конференция «Физико-математические и естественные науки». Москва: 2011. -С. 39-41.

23. Fedorova К. The C-terminal region of transcription factor TnrA is required for interaction with glutamine synthetase and GlnK protein / Fedorova K., Tarasov N. // III Annual International Scientific conference in Biology. Tbilisi: 2011. - P. 65-66.

24. Fedorova К. The interaction of transcription factor TnrA with glutamine synthetase and PII-like protein GlnK / Fedorova K., Kayumov A., Forchhammer К. // Annual Conference of the VAAM. Tuebingen: 2012. - P. 204-205.

25. Fedorova K. The interaction between transcription factor TnrA, GlnK and glutamine synthetase in Bacillus subtilis / Fedorova K., Forchhammer K. // Materialen zum wissenschaftlichen Seminar der Stipendiaten der Programme «Michail Lomonosov II» und «Immanuil Kant II» 2011/2012. Moskau: 2012. - P. 34-37.

26. Федорова К.П. Взаимная регуляция активности глутаминсинтетазы и фактора транскрипции TnrA путем их взаимодействия в клетках Bacillus subtilis / Федорова К.П., Ильинская О.Н., Каюмов А.Р. // Материалы докладов II международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Казань: 2012. - С. 165-166.

27. Тарасов Н.В. Влияние АТФ на процесс диссоциации TnrA из комплекса белков TnrA-GlnK в условиях отсутствия источников азота / Тарасов Н.В., Федорова К.П., Каюмов А.Р. // Материалы докладов II международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Казань: 2012. - С. 91-92.

28. Федорова К.П. Глутаминсинтетаза - корегулятор активности фактора транскрипции TnrA в клетках Bacillus subtilis / Федорова К.П., Каюмов А.Р., Ильинская О.Н. // Материалы докладов Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века». Пущино: 2013 - С. 236-237.

29. Шарафутдинов И.С. С-концевой домен фактора транскрипции TnrA из Bacillus subtilis контролирует активность ДНК-связывающего домена, но не участвует в димеризации белка / Шарафутдинов И.С., Федорова К.П., Каюмов А.Р. // Материалы докладов Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века». Пущино: 2013 - С. 242-243.

30. Тарасов Н.В. Влияние белков AmtB GlnK и глутаминсинтетазы на активность фактора транскрипции TnrA в клетках Bacillus subtilis 1 Тарасов Н.В., Халитова A.B., Федорова К.П., Каюмов А.Р. // Материалы докладов Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века». Пущино: 2013 - С. 230-231.

E-mail автора: kpfedorova@gmail.com

Просьба высылать отзывы на автореферат по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание КФУ, отдел аттестации научно-педагогических кадров, ученому секретарю диссертационного совета Д 212.081.08 д.б.н., проф. Абрамовой З.И., факс: (843)238-76-01. E-mail: ziabramova@mail.ru

Подписано в печать 25.07.2013. Форм. бум. 60x84 1/16. Печ. л. 1,5. Тираж 120. Заказ №2507/3. Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии «Вестфалика» (ИП Колесов В.Н.) 420111, г. Казань, ул. Московская, 22. Тел.: 292-98-92 e-mail: westfalika@inbox.ni

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федорова, Ксения Павловна, Казань

Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение

высшего профессионального образования КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

04201361315 уДК 579.22:579.852.11:577.112.7:577.322.23

ФЕДОРОВА КСЕНИЯ ПАВЛОВНА

МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ

TNRA - ОСНОВНОГО РЕГУЛЯТОРА АЗОТНОГО МЕТАБОЛИЗМА BACILLUS SUBTILIS

03.02.03 - микробиология 03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент А.Р. Каюмов доктор биологических наук, профессор, академик АН РТ О.Н. Ильинская

Казань - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ................................................................................. 4

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................;......................... 9

1.1 Азотный обмен в клетках бактерий.............................................. 9

1.2 Белки азотного обмена Bacillus subtilis.......................................... 11

1.2.1 Нитрат- и нитритредуктазы................................................ 11

1.2.2 Глутаматсинтаза и глутаминсинтетаза.................................. 12

1.2.3 Белки AmtB и GlnK......................................................... 18

1.2.4 Фактор транскрипции ТпгА............................................... 19

1.3 Регуляция генов белков азотного метаболизма с участием факторов

транскрипции TnrA, GlnR, CodY, GltC................................................ 22

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................. 28

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................... 29

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................................. 48

3.1 Активность и локализация фактора транскрипции ТпгА в условиях избытка или недостатка восстановленного азота.................................... 48

3.1.1 Активность фактора транскрипции ТпгА в штаммах, мутантных

по белкам GS, GlnK и AmtB....................................................... 48

3.1.2 Исследование локализации фактора транскрипции ТпгА в зависимости от доступности азота................................................ 54

3.2 Идентификация домена сигнальной трансдукции фактора транскрипции ТпгА........................................................................................... 59

3.2.1 Получение факторов транскрипции ТпгА с делециями С-концевого домена.................................................................... 59

3.2.2 Изучение влияния С-концевого домена фактора транскрипции ТпгА на активность ДНК-связывающего домена............................. 69

3.2.3 Определение участков С-концевого домена ТпгА, ответственных

за взаимодействие с регуляторными белками GS и GlnK................... 75

3.2.4 Влияние эффекторных молекул на взаимодействие ТпгА с GlnK и

GS....................................................................................... 79

3.2.5 Исследование конкурентного взаимодействия GlnK и GS с ТпгА

в условиях in vitro.................................................................... 82

3.2.6 Изучение влияния белков GlnK и GS на ДНК-связывающую активность фактора транскрипции ТпгА в условиях in vitro................ 84

3.3 Участие фактора транскрипции ТпгА в регуляции активности глутаминсинтетазы в клетках Bacillus subtilis.................................... 87

3.3.1 Исследование влияния фактора транскрипции ТпгА на активность GS в условиях in vitro................................................ 87

3.3.2 Изучение участия фактора транскрипции ТпгА в регуляции активности GS в условиях in vivo................................................ 90

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.................................................. 93

4.1 Активность и локализация фактора транскрипции ТпгА в условиях избытка или недостатка восстановленного азота............................ 93

4.2 Идентификация домена сигнальной трансдукции фактора транскрипции ТпгА.................................................................. 99

4.3 Участие фактора транскрипции ТпгА в регуляции активности глутаминсинтетазы в клетках Bacillus subtilis................................. 105

ВЫВОДЫ................................................................................. 108

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................ 109

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ............................... 112

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Бактерии в ходе эволюции выработали сложные механизмы адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды и способны использовать широкий спектр источников питания. Общие принципы регуляции метаболизма клеток универсальны, поэтому большинство биохимических процессов, задействованных в процессах реализации генетической информации и поддержания клеточного гомеостаза высоко консервативны. Понимание молекулярно-генетических механизмов адаптации микроорганизмов к стрессовым условиям актуально как для разработки новых принципов подавления роста и размножения патогенных бактерий, так и для повышения продуктивности и жизнеспособности промышленно значимых бактерий.

Азот является одним из важнейших макроэлементов, участвующих в построении клеток живых организмов и составляет до 10% сухого вещества клетки. В природных экосистемах азот встречается в окисленной, восстановленной и молекулярной формах, но в конструктивном клеточном метаболизме азот используется только в восстановленной форме в виде аминогрупп. Соли аммония, мочевина, органические соединения (аминокислоты или пептиды) являются наиболее предпочтительными и легко усваиваемыми источниками азота для клеток. Однако многие микроорганизмы способны потреблять и окисленные формы азота в виде нитратов и нитритов. В анаэробных условиях некоторые микроорганизмы способны использовать нитрат в качестве конечного акцептора электронов, восстанавливая его до нитрита и газообразных форм азота (N20, N0, N2) в процессе диссимиляционной нитратредукции. Наряду с большинством растений многие бактерии используют окисленный азот для синтеза азотсодержащих клеточных компонентов. Этот процесс протекает как в аэробных, так и в анаэробных условиях, сопровождается затратами клеточной энергии и получил название ассимиляционной нитратредукции.

Условия дефицита источника восстановленного азота являются неблагоприятными для роста и развития микроорганизмов. При низком

содержании восстановленного азота в среде (например, ионы аммония или глутамин в концентрациях менее 2 мМ) или в присутствии только окисленных форм азота (нитраты и нитриты независимо от концентрации) в клетках бактерий запускается каскад регуляторных процессов, направленных на утилизацию азота из различных соединений.

В клетках Bacillus subtilis фактор транскрипции ТпгА контролирует гены, продукты которых вовлечены в процессы ассимиляции различных азотсодержащих соединений в условиях недостатка азота в среде: транспорт ионов аммония, ассимиляция мочевины, нитрата и нитрита и других соединений азота (Wray et al., 1996, Yoshida et al., 2003). Взаимодействуя с промоторной областью генов-мишеней (TnrA-регулона), он активирует, или, наоборот, подавляет их транскрипцию в ответ на изменение условий окружающей среды (Yoshida et al., 2003). В отличие от других регуляторов транскрипции, фактор ТпгА не подвержен ковалентной модификации и не имеет сайтов для взаимодействия с низкомолекулярными эффекторными молекулами (лигандами) (Fisher, 1999). Это свидетельствует об уникальных механизмах передачи сигнала на этот регуляторный белок, которые на сегодняшний день остаются мало изученными. Ряд работ демонстрирует, что активность фактора ТпгА контролируется путем взаимодействия с другими белками. Белками-партнерами фактора транскрипции ТпгА являются глутаминсинтетаза (GS) и белок GlnK. Гомологи белка GlnK в клетках многих бактерий регулируют активность белка AmtB, который осуществляет активный транспорт ионов аммония в клетки (Wray et al., 2001, Heinrich et al., 2006, Tremblay, Hallenbeck, 2009). Возможно, белки AmtB, GlnK и GS образуют молекулярную систему трансдукции сигнала о доступности азота на фактор транскрипции ТпгА (Wray et al., 2001, Detsch, Stulke, 2003, Heinrich et al., 2006, Tremblay, Hallenbeck, 2009, Gunka, Commichau, 2012).

Цель работы - выяснение молекулярного механизма регуляции активности фактора транскрипции ТпгА у Bacillus subtilis в условиях дефицита и избытка источника восстановленного азота.

В работе решали следующие задачи:

1. Определить участие глутаминсинтетазы и белков AmtB и GlnK в регуляции активности фактора транскрипции ТпгА у Bacillus subtilis в условиях дефицита и избытка восстановленного азота.

2. Выявить изменение локализации фактора транскрипции ТпгА при смене условий культивирования Bacillus subtilis (от дефицита источника восстановленного азота к его избытку).

3. Исследовать влияние белка GlnK и глутаминсинтетазы на ДНК-связывающую активность фактора транскрипции ТпгА в условиях in vitro.

4. Создать генетические конструкции на основе плазмиды рЕТ15Ь для гиперпродукции в клетках E.coli рекомбинантных белков ТпгА с укороченным С-концевым доменом и гексагистидиновой последовательностью на N-конце белка и получить эти белки в электрофоретически гомогенном состоянии.

5. Установить сайты взаимодействия белка GlnK и глутаминсинтетазы с С-концевым доменом фактора ТпгА, выявить регуляторную роль С-концевого домена в димеризации фактора транскрипции ТпгА и связывании N-концевого домена с ДНК.

6. Изучить влияние фактора транскрипции ТпгА на биосинтетическую активность глутаминсинтетазы при взаимодействии этих белков in vitro и внутриклеточно в штаммах Bacillus subtilis дикого типа и мутантных по белкам AmtB и GlnK.

Научная новизна

Впервые показано, что смена аффинности глутаминсинтетазы и белка GlnK к ТпгА определяет локализацию фактора ТпгА и регулирует его активность в зависимости от условий дефицита или избытка восстановленного азота в среде. Белок AmtB, ответственный за транспорт ионов аммония в клетку и формирующий сигнал о доступности азота в клетках многих организмов, не участвует в передаче сигнала на фактор ТпгА у бацилл. Впервые установлено, что in vivo глутаминсинтетаза подавляет активность фактора транскрипции ТпгА не только в условиях избытка восстановленного азота, как сообщалось ранее (Wray

et al., 2001), но и в условиях его недостатка. Эксперименты in vitro показали, что белок GlnK не подавляет ДНК-связывающую активность ТпгА, в то время как активная и ингибированная формы глутаминсинтетазы в разной степени снижают способность ТпгА взаимодействовать с ДНК. Впервые продемонстрировано, что С-концевая область ТпгА не участвует в димеризации белка, но контролирует ДНК-связывающую активность N-концевого домена. Установлено, что за взаимодействие с белком GlnK и глутаминсинтетазой отвечают разные участки С-концевого домена фактора транскрипции ТпгА. Впервые охарактеризован ингибирующий эффект фактора транскрипции ТпгА на ферментативную активность глутаминсинтетазы.

Практическая значимость

Полученные результаты представляют собой новый блок фундаментальных знаний о регуляции азотного метаболизма в клетках бактерий. Примеры регуляции активности факторов транскрипции путем взаимодействия с ферментом представлены на сегодняшний день единичными случаями, полученные результаты расширяют представления о способах контроля активности ДНК-связывающих белков в клетке. Учитывая значение азотного питания для жизнедеятельности микроорганизмов, полученные данные могут быть применены в биотехнологических процессах, требующих особого внимания к регуляторным механизмам микроорганизмов, связанных с культивированием генномодифицированных бактерий для продукции целевых белков и азотсодержащих метаболитов, а также в биомедицине для поиска ингибиторов азотного обмена клетки.

На защиту выносятся следующие положения:

1. В клетках бацилл активность фактора транскрипции ТпгА зависит от количественного соотношения его комплекса с белком GlnK (активная форма белка ТпгА) и глутаминсинтетазой (неактивная форма белка ТпгА) и определяется изменением аффинности белка GlnK и глутаминсинтетазы к

фактору TnrA в зависимости от условий дефицита или избытка восстановленного азота.

2. С-концевой домен фактора TnrA является регулятором активности ДНК-связывающего N-концевого домена и конкурентно взаимодействует с глутаминсинтетазой на участке Phel05 - Arg 110 и белком GlnK на участке Leu75 - Рго90.

3. Биосинтетическая активность глутаминсинтетазы подавляется при ее связывании с фактором TnrA: этот уникальный механизм является одним из основных путей регуляции активности фермента в ответ на изменение доступности источников азота для клетки.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), Международной конференции «Развитие междисциплинарных исследований: перспективные направления и вклад DAAD» (Казань, 2009), XIII европейском симпозиуме студентов-биологов «SymBioSE 2009», Международных конференциях аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009, 2011), Российской школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии» (Казань, 2010), Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010), Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2010, 2011, 2013), Всероссийской научно-практической (заочной) конференции «Естественные науки и современность: проблемы и перспективы исследований» (Москва, 2011), Международной конференции молодых ученых «Молодежь в науке - 2011» (Минск, 2011), III Международной научной конференции по биологии (Тбилиси, 2011), Ежегодной международной конференции «Ассоциация общей и прикладной микробиологии» (Тюбинген, 2012), III Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012).

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Азотный обмен в клетках бактерий

Бактерии выработали сложные механизмы адаптации, которые позволяют им использовать широкий ассортимент источников энергии и таких жизненно необходимых элементов как углерод, азот, фосфор и сера. Азот необходим бактериям для синтеза аминокислот (белков), пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, а также некоторых витаминов. В качестве источников азота микроорганизмы способны усваивать различные вещества, отличающиеся как по концентрации в окружающей среде, так и по степени доступности для ассимиляции, например, возможность транспорта в клетку, энергетические затраты на усвоение и включение в метаболизм.

В природе атомы минерального азота существуют в различной степени окисления: от И54" (N03", нитраты) до (>ПНЦ+, ионы аммония). Поскольку азот во всех живых организмах содержится в восстановленной форме, все атомы азота с большей степенью окисления, чем К3', должны быть восстановлены. Степень усвояемости минеральных соединений азота бактериями определяется возможностью их превращения в аммонийный азот, так как он является предпочтительным источником восстановленного азота для включения в высокомолекулярные азотсодержащие органические соединения. Соответственно, ионы аммония, мочевина и многие органические вещества (например, пептиды, аминокислоты, нуклеотиды), в которых азот находится уже в восстановленном виде, представляют собой легко усваиваемые и предпочтительные источники азота для клеток. Недостаток источников восстановленного азота неблагоприятно сказывается на росте и развитии микроорганизмов и запускает каскады регуляторных процессов, направленных на ассимиляцию альтернативных источников азота (БопешЬет, 2007). Несмотря на то, что многие микроорганизмы могут использовать и окисленные формы азота в виде нитратов и нитритов, их ассимиляция требует высоких энергетических затрат. Поэтому их потребление бактериями в качестве источников азота, несмотря на концентрацию в среде, создает условия дефицита азота для клеток.

У бактерий возможны два разнонаправленных процесса: ассимиляция (связывание минеральных форм азота в органический материал) и диссимиляция (выделения газообразных форм азота). К ассимиляционным процессам относят связывание минеральных форм азота (N2, NO3", NCV, NH/) в ходе азотфиксации, ассимиляционной нитратредукции и ассимиляции аммиака. К диссимиляционным процессам относят денитрификацию или «нитратное дыхание» - восстановление NO3" через NCVflO газообразной закиси азота (N2O) и азота (N2).

В условиях недостатка восстановленного минерального азота, клетки Bacillus subtilis способны продуцировать целый ряд экзоферментов (протеазы, нуклеазы, уреазы и пр.). Секреция в среду протеаз позволяет бациллам расщеплять белки до низкомолекулярных пептидов и аминокислот и, тем самым, утилизировать белковый азот (Каюмов с соавт., 2009). При участии внеклеточных нуклеаз (ДНКаз и РНКаз) клетки ассимилируют нуклеиновые кислоты и их производные — пуриновые и пиримидиновые основания. Утилизация мочевины и мочевой кислоты происходит при участии фермента группы амид аз - уреазы. Если синтез экзоферментов не решает проблем голодания, клетки бацилл включают программы приобретения генетической компетентности, спорообразования и образования антибиотиков (субтилин, сурфактин, бацилломицин, бацилизин, фенгицин) (Fabret et al., 1999, Sonenshein, 2000).

Бактерии В. subtilis не способны утилизировать газообразный азот (N2), восстанавливая его до ионов аммония в процессе азотфиксации. В отличие от E.coli, неспособных ассимилировать �