Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Лизоцимная и антилизоцимная активность альгофлоры в водных биоценозах

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Лизоцимная и антилизоцимная активность альгофлоры в водных биоценозах"

РГБ ОД

4 Г пги ,.-

I 3 Лил

На правах рукописи

АЛЕХИНА Гелена Петровна

ЛИЗОЦИМНАЯ И АНтаЛИЗОЦИМНАЯ

АКТИВНОСТЬ АЛЬГОФЛОРЫ В ВОДНЫХ БИОЦЕНОЗАХ

03. 00. 07- микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ОРЕНБУРГ -1996

На правах рукописи

АЛЕХИНА Гелена Петровна

ЛИЗОЦИМНАЯ И АНТИЛИЗОЦИМНАЯ АКТИВНОСТЬ АЛЬГОФЛОРЫ В ВОДНЫХ БИОЦЕНОЗАХ

03. 00. 07- микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ОРЕНБУРГ - 1996

Работа выполнена на базе Оренбургского отдела персистенцпи микроорганизмов ИЭиГМ Уральского отделения Российский академии наук.

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РСФСР, академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор О.В.Бухарин

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор З.Г.Габидуллин.

кандидат биологических наук, доцент С.Н. Порядина.

Челябинская государственная: медицинская академия

Защита диссертации состоится "_"_1996 года

на заседании диссертационного совета К 084. 51. 02 в Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: 460834, Оренбург, ГСП, Советская, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в биб лиотеке Оренбургской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан "_" ___1996 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент

Ю. П.Семченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Водоросли являются источником разнообразных химических соединений, выделяемых в окружающую среду. Обогащая воду кислородом, необходимым для жизнедеятельности гидробионтов, водоросли активизируют процессы самоочищения водоемов, участвуя в формировании качества природных вод / Кондратьева Н.В., 1985 ; Саркевич А.И., 1986/. Однако , изучение механизмов функционирования водных биоценозов ограничивается исследованием трофических связей между гидробионтами /Кондратьев К.Я., Поздняков Д.В., 1984/, а также определением влияния биогенов на их рост и развитие I Израэль Ю.А., 1986; Сиренко Л.А.,Саркевич А.И.,Осипов Л.Ф и др, 1989/. Микроорганизмы: водоросли, бактерий, простейшие связаны между собой трофическими и конкурентными взаимоотношениями, где эколого-физиологические связи преобретают все большое значение. Одним из таких факторов, формирующих водные сообщества является система " лизоцим- антилизоцим "I Соловых Г.Н.,1995 /, которая играет определенную роль в физиологии гидробионтов, развивая популяционные и межпопуляционные связи I Немцева Н.В., 1992 /. Наличие лизоцимной активности у водорослей /Богнюк Н.В. 1985/ позволило предположить присутствие антилизоцимной активности, при наличии последней попытаться оценить роль лизоцимного и антилизоцимного факторов в формировании альгосообществ.

Цель работы : Изучить динамику и распространение лизоцимной и антилизоцимной активности водорослей открытых пресноводных водоемов различной трофности.

Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Разработать методики получения аксеничных культур водорослей и определения у них антилизоцимной активности.

2. Оценить видовой состав альгофлоры и его сезонную динамику в открытых водормах различной трофности.

3. Определить у доминирующих видов водорослей лизоцимную и антилизоцимную активность и проследить динамику ее распространения.

4. Изучить влияние абиотических / свет, I С, рН / и биотических / бактерии ,водоросли I факторов на лизоцимную и антилизоцимную активность водорослей.

Новизна исследования .Разработаны методики получения аксеничных культур и определения антилизоцимной активности у водорослей, пригодные для практического использования в физиолого-биохимических исследованиях.

Выявлена общая закономерность смены доминирующих видов для среднего течения реки Урал и его притоков с выделением вида АпЫзШ^езтив аг^ив^ как характерного для Уральского бассейна.

Впервые у сине-зеленых и некоторых зеленых водорослей выявлена антилизоцимная активность , которая наряду с лизоцимной активностью способствует функционированию водных биоценозов.

В результате исследования влияния абиотических и биотических факторов на лизоцим-антилизоцимные взаимоотношения в альгоценозах выявлены оптимальные условия физиологической активности водорослей и их участие в функциональной системе " лизоцим-антилизоцим" гидробионтов.

Практическая значимость . Функциональная система " лизоцим -антилизоцим " у водорослей может быть использована в качестве тест -маркера для ранней диагностики состояния водных биоценозов ( Способ прогнозирования состояния водных биоценозов. Патент РФ № 2052816 ).Указанная система может быть использована. для санитарно - экологического мониторинга и экологического картирования водных объектов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Наличие антилизоцимной активности у микроводорослей.

2. Лизоцимная и антилизоцимная активность водорослей может быть использована для оценки состояния пресноводных водоемов.

Апробация диссертации. Основные результаты исследования были доложены на юбилейной научной сессии " Актуальные проблемы теоретической и клинической медицины ", посвященной 50 - летию Оренбургского медицинского института ( октябрь 1994г., Оренбург ), 1 - й областной конференции молодых ученых и специалистов ( апрель 1993 г., Оренбург ), чтения памяти В.Д. Тимакова НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалея ( март 1996, Москва ), региональная конференция молодых ученых и специалистов (апрель, 1996). По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе "Способ прогнозирования состояния водных биоценозов " (Патент РФ № 2052816).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на_

страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, заключения, выводов,

списка литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована _

таблицами, _ рисунками. Библиографический указатель включа

_ источников отечественной и _ источников зарубежной

литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объем и методы исследования. Объектом исследования послужила река Урал в районе города Оренбурга и ее притоки Сакмара, Каргалка, Черная. Отбор проб осуществлялся в течение 1993 - 1995 гг. с учетом временного и пространственного мониторинга. При сборе материала учитывали температуру воды и воздуха, глубину, прозрачность, рН.

Качественные пробы планктона отбирали планктонной сеткой, количественные литровые пробы - батометром Молчанова. Затем их профильтровывали через мембранные фильтры № 0,4 фирмы " Сынпор ". Все пробы фиксировались 40% - ным раствором формалина (3-4 капли ). Определение растворенного кислорода в пробах воды проводили по методу Винклера. Биомасса водорослей рассчитывалась с использованием стереометрического метода. Индекс видового разнообразия в альгоценозе подсчитывали по формуле Шеннона и Уевери ( 1949). Оценку состояния загрязнения воды с использованием индекса видового разнообразия проводили по шкале Wilim J., Dorris Т. ( 1965 ). Индекс сапробности рассчитывали по формуле Пантле Р., Бука Г.. Эколого - санитарная классификация качества поверхностных вод суши проводилась по ЖукинскомуВ.Н.„Оксиюк О.П.Дееб Я.Я., (1976 ).

В результате получена характеристика водоемов по всем гидробиологическим показателям.

Определение экзогенного лизоцима водорослей проводили фотонефелометрическим методом Бухарина О.В. с соавт. ( 1974 ).

Полученные данные обработаны методами параметрического ( критерий Стьюдента ) и непараметрического (критерий Вилкоксона) сравнения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе проведенных исследований была разработана оригинальная методика получения аксеничных культур водорослей. Она заключалась в посеве стеклянным шпателем, приемом по-Дригальскому, водорослевой суспензии на агаровую среду, в основу которой была положена универсальная среда Пратта для культивирования водорослей, с добавлением 2 * 10'3 г/ мл водного раствора мертиолата. После 3-х суточной инкубации водоросли

6

снимались с кусочками среды стерильным инструментом и помещались в жидкие селективные питательные среды. Разработанная методика позволяет получить одновременно бактериологически и морфологически чистые культуры.

В основу определения антилизоцимной активности водорослей аналогично методике для бактерий Бухарина О.В. ( 1984 ) был положен метод отсроченного антагонизма. Аксеничную культуру водорослей концентрировали центрифугированием, отмывая ее стерильной, безбактериальной водой от культуральной жидкости. Затем стерильной Пастеровской пипеткой исследуемые культуры наносили "пятачками"на поверхность 1,5% мясопептонного агара в чашки Петри. Концентрация водорослей в "пятачках"составляла 200 - 300 клеток, в питательную среду добавляли различное количество раствора лизоцима в концентрации: 0,2 • Ю4 - 1,0 • 10"4 г/мл. После 3-х суток культивирования в термостате при температуре +25°С на "пятачки" исследуемых культур наносили слой 0,7 %-ого агара ( 4 мл ) с содержанием 0,2 • 10® КОЕ/мл взвеси суспензии суточной агаровой культуры Micrococcus lysodeikticus ( штамм 2665 ПИСК им. J1.A. Тарасевича ). После этого чашки с посевом вновь помещали в термостат с температурным режимом +37° С. О наличии АЛА судили по проявившимся зонам роста микрококка. Количественный учет осуществлялся по наибольшей концентрации лизоцима, которая инактивировалась изучаемыми водорослями.

В основу определения продуцируемого лизоцима у водорослей был положен метод определения лизоцимной активности у бактерий (УсвяцовБ.Я., 1984).Аксеничную культуру водорослей, приготовленную вышеописанным способом, наносили на поверхность застывшего 1,5 % мясопептонного агара в чашки Петри. Концентрация водорослей в "пятачках'составила 200 - 300 клеток. После 3-х суток культивирования в термостате при температуре +25°С на "пятачки" исследуемых

культур наносили слой 0,7%-ого агара ( 4 мл ) с содержанием 0,2 мл • 109 КОЕ/мл взвеси суточной агаровой культуры М. lysodeikticus. После этого чашки с посевом помещали в термостат с температурным режимом +37°С. Учет опыта проводили следующим образом: вокруг колоний лизоцимактивных культур водорослей наблюдались зоны лизиса тест-культур микрококка. Количественный учет лизоцимной активности проводили по размеру зон лизиса. Лизоцимную активность учитывали в мкг/колонию.

Разработанные методики были пригодны для использования в альгологической практике и применялись нами в дальнейшей работе для выделения доминирующих видов водорослей, изучения их видовой и сезонной динамик, а также для определения у водорослей лизоцимной и антилизоцимной активности.

При изучении видовой и сезонной динамики альгофлоры среднего течения реки Урал и некоторых его притоков была отмечена общая закономерность смены доминирующих отделов водорослей по сезонам года: в " осенне - зимний " период преобладали диатомовые, в " весенне-летний " - зеленые и сине-зеленые ( рисунок 1).

Во время наших исследований в реке Урал и его притоках было обнаружено 225 видов и разновидностей водорослей. Стабильно, независимо от времени года выделялся вид Ankistrodesmus angustus.

Не исключено, что этот вид типичен для рек Уральского бассейна, так как он стабильно выделялся и более 20 лет назад (Порядина С.Н., 1973). Стабильные виды, характерные для других водоемов - придельтовых районов Волги ( Мишустин E.H.,1971 ), рек Казахстана (Орлеанский В.К., 1968 ), были описаны ранее и используются в качестве надежных экологических маркеров соответствующих водных регионов.

Сравнение наших данных с результатами исследований Порядиной С.Н. по определению флористического состава реки Урал

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ДИНАМИКА ФИТОПЛАНКТОНА СРЕДНЕГО ТЕЧЕНИЯ РЕКИ УРАЛ

1 оооооо

-—-■ . И | - 1 | - 1 1 | --

УРАЛ САКМАРА КАРГАЛКА ЧЕРНАЯ

1000000т

си н я

I

8

ы

200000-' 100000-о

УРАЛ ЗЕЛЕНЫЕ

САКМАРА КАРГАЛКА ЧЕРНАЯ | | ДИАТОМОВЫЕ ¡¡§д СИНЕ-ЗЕЛЕНЫЕ

выявило, что систематический список стал беднее на 35 видов, 12 из которых являлись индикаторными, относящимися к О - рмезосапробам, характеризующих чистоту и стабильность водоема. Полученные данные свидетельствовали о нарастании загрязнения реки Урал и его притоков и о снижении процессов их самоочищения.

В флористическом списке изучаемых водоемов были отобраны наиболее широко распространенные виды ( 27 ), относящиеся к различным систематическим отделам с последующим выделением их в монокультуру и определением у них лизоцимной и антилизоцимной активности.

Все выделенные культуры были проверены в опытах с ацетонированным микрококком, так как именно литическая способность по отношению к ацетонированной культуре ( БухаринО.В.,ФроловБ.А., Аникин И.А., и др. 1973) дает право на подтверждение наличия мурамидазной активности исследуемых культур.

Проведена сравнительная оценка 2-х методов определения лизоцимной активности: чашечного и фотонефелометрического, которая показала, что наличие эндогенного лизоцима определяемое в гомогенате, не всегда совпадает с его экзогенной секрецией во внешнюю среду. Максимальное проявление секретируемого лизоцима наблюдалось в фазу логарифмического роста водорослей, тогда как нарастание антилизоцимной активности было отмечено в стационарную фазу из развития.

Из 27 видов у 8 выявлена способность продуцировать лизоцим в питательную среду. Из них 25% культур относились к сине-зеленым, 44% - к зеленым водорослям и 20% - к диатомовым. Однако, в качественном отношении продукция лизоцима у сине-зеленых водорослей ( 2,85 + 0,14 мкг/мл ) значительно превышала таковую у зеленых и диатомовых ( 0,3 + 0,01 мкг/мл).

Антилизоцимная активность наиболее широко была представлена среди сине-зеленых водорослей (50% изучаемых видов ) и составляла 3 + 0,2 мкг/ мл . Наиболее активными из них были Microcistis aerugenosa, Oscillatoria limosa, O. sancta, Merismopedia tenuissima. Возможно, это связано с наличием пептидогликанового полимера и необходимостью его защиты от лизоцима, выделяемого другими представителями биоценозов. Антилизоцимактивный признак также имел место у зеленых водорослей ( 33% ). Наиболее активными были Scenedesmus acuminatus, Ancistrodesmus acicularis, Pandorina morum. Наличие антилизоцимной активности у зеленых водорослей требует дальнейшего осмысления. Возможно, это может быть использовано в решении спорных вопросов таксономии этого отдела.

В ходе исследования было отмечено, что водоросли, обладающие лизоцимной и антилизоцимной активностью, были не только широко распространены в реке Урал и его притоках, но и встречались там на протяжении всего года.

Возможно, наличие лизоцимной активности обеспечивает водорослям антагонистические преимущества и возможность занять более широкую экологическую нишу в альгоценозе. Антилизоцимная активность способствует длительному переживанию в водных биоценозах, обеспечивая водоросли неспецифической защитой.

Широкое распространение лизоцимной и антилизоцимной активности в водных ценозах позволяет существенно расширить представление о биологии и физиологии микроводорослей. С практической точки зрения, полученные данные позволяют предположить наличие у водорослей функциональной системы "лизоцим - антилизоцим", которая дает возможность по-новому взглянуть на биоценотические отношения гидробионтов и может быть использована для диагностики и прогнозирования состояния водоемов. Обнаруженные свойства водорослей внесены в

разработанный " Способ прогнозирования состояния водных биоценозов"(Патент РФ № 2052816 БухаринО.В., Соловых Г.Н., Немцева Н.В., АлехинаГ.П.), что позволило уточнить показатели оценки санитарно-экологического состояния водоемов.

Этот подход, основанный на изучении качественных и количественных характеристик между организмами, обладающими лизоцимным ( ЛА) и антилизоцимным ( АЛА ) признаками, позволяет выявить ранние нарушения в состоянии водных биоценозов по показателю Л:

М1(ЛА)

Л=-, где

М2(АЛА)

М1 - количество лизоцимактивных микроорганизмов, Мг- количество антилизоцимактивных микроорганизмов В случае, если Л больше единицы, прогнозируется хорошее состояние биоценоза, если меньше, то ухудшение качества водоема .

К сожалению, разработанный метод был ориентирован в основном на бактерии не учитывая работу альгологической компоненты биоты, поэтому выбранные показатели оценки экологического благополучия требовали уточнения.

С этой целью был проведен гидробиологический мониторинг рек Уральского бассейна. По результатам исследований река Черная, получающая максимальное количество загрязнений антропогенного характера с водосборной площади, была отнесена к грязной. Вода в этом водоеме содержала незначительное количество растворенного кислорода и по гидробиологическим тестам характеризовалась как полисапробная. Анализ проведенных исследований выявил преобладание среди водорослей антилизоцимактивных форм (рисунок 2) Коеффициент соотношения количества ЛА / АЛА водорослей, обозначенный нами "Л", был меньше 1,5 (0,9 -1,3).

Реки Каргалка и Урал в точке сброса сточных вод с городских очистных сооружений характеризовались как а - р- мезосапробные и по классу качества воды были отнесены к загрязненным. В альгосообществе наблюдалось некоторое увеличение числа лизоцимактивных видов водорослей по сравнению с р. Черной. Показатель "Л" колебался в пределах 1,5 - 2,0.

Для рек Сакмара и Урал в точке открытого городского водозабора с удовлетворительной степенью чистоты воды и с Р-мезосапробным состоянием было характерно преобладание в альгоценозах лизоцимактивных видов водорослей. Показатель "Л" водорослевого биоценоза превышал 2,0 и колебался в пределах 2,4 -2,7.

Таким образом, в результате проведенных исследований были определены критерии оценки состояния альгоценозов открытых пресноводных водоемов. При показателе "Л" меньше 1,5 водоем относили к грязному, в нем преобладали процессы эвтрофирования, а состояние альгоценоза расценивалось как неблагополучное. При "Л" больше 1,5, но меньше 2,0 водоемы относили к загрязненным, в биоценоза-х отмечали сдвиг в сторону ухудшения. Увеличение показателя "Л" до значений, превышающих 2,0 соответствовало стабилизации водорослевых ценозов и удовлетворительному качеству воды.

Поэтому предложенное первоначально для оценки состояния бактериальной компоненты биоты математическое выражение в результате полученных данных принимает следующий вид: Л ¿1,5 экологическое неблагополучие 1,5 < Л 5 2,0 средняя степень экологического неблагополучия Л > 2,0 экологическое благополучие

КАРТА - СХЕМА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА РЕК УРАЛЬСКОГО БАССЕЙНА

Условные обозначения: | I- па водорослей ЦЩ- ала водорослей

Экологическими факторами, определяющими ход биологических процессов в водоеме, являются свет, температура и рН, поэтому было проведено экспериментально-натурное изучение их воздействия на функциональную систему " лизоцим - антилизоцим " водорослей.

В эксперименальных условиях на модельных водоемах объемом 1,5 дм3 было установлено, что при температуре воды от + 4°С ... +Ю°С, (зимний минимуму) лизоцимная и антилизоцимная активности не проявлялись. При температуре от +11°С ... + 20°С, антилизоцимный признак проявлялся в количестве 2 мкг/мл, а лизоцимный 0,52 + 0,03 г/мл. При "летних" температурах (+21° С ...+ 25°С) у водорослей проявлялась максимальная физиологическая активность (ЛА 0,97 + 0,05 мкг/мл, АЛА 3 ± 0,2 мкг/мл). Температурный режим +26°С ...+30°С характеризовался снижением значений лизоцимной (0,8 ± 0,04 мкг/мл) и антилизоцимной активности (2,0 + 0,1 мкг/мл).

Однако, температура оказывает влияние, не только на функциональные характеристики, но и на сезонные изменения количественного соотношения альгофлоры ( рисунок 3 ). Количество лизоцимактивных водорослей на изучаемых реках в "осенне-зимний" период по сравнению с "весенне-летним" снижалось в среднем в 1,5 раза, а численность антилизоцимактивных водорослей - в . 1,1 раза, при сохранении стабильных значений коэффициента "Л".

Таким образом, количественные и качественные показатели в ли-зоцимном сообществе в летний период достигали максимальных значений, обеспечивая текущие процессы самоочищения водоемов.

При лабораторных изучениях влияния различных значений рН на искусственные водоемы было отмечено, что при контрольно пограничном значении рН - 5.0,. когда состояние экосистемы характеризуется как критическое, численность и видовой состав биоценоза еще не претерпел значительных изменений, но способность проявлять лизо -

5

СЕЗОННАЯ ДИНАМИКА ЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ ВОДОРОСЛЕЙ

ВЕСНА-ЛЕТ! "ОСЕНЬ-ЗИМА"

УРАЛ

РАЛ САКМАРА КАРГАЛКА ЧЕРНАЯ

СЕЗОННАЯ ДИНАМИКА АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ ВОДОРОСЛЕЙ

в 5

Урал Урал Сакмара КаргалкаЧерная •В/3 сброс

цимкую и антилизоцимную активность у водоросли уже отсутствует (рисунок 4). Этот факт может являться наиболее ранним показателем наступающих глубоких и необратимых изменений в сообществе. Значение рН от 6,2 до 8,0 являются оптимальными для жизнедеятельности водорослей в условиях открытых водоемов. При рН от 8,4 и более происходит активизация антилизоцимактивных водорослей и отсутствие лизоцимной активности, что может служить диагностическим признаком сдвига рН в водоемах и начинающихся необратимых изменений в них.

Изучение влияния различных значений рН на соотношение ЛА/АЛА водорослей показало, что при рН от 8,0-8,3 на реках Каргал-ка, Черная, Урал (сброс) показатель "Л" был равен 0,9 - 1,7, что соответствовало средней и высокой степени экологического неблагополучия. В реках Сакмара и Урал ( точка"водозабор") со значениями рН 7,2 - 7,6 показатель "Л" был равен 2,3-2,5, что соответствовало их благополучному состоянию.

При исследовании влиянии света на проявления лизоцимной и антилизоцимной активности было выявлено, что максимальное проявление признаков (ЛА 2,85 + 0,03 мкг/мл, АЛА 3 + 0,15 мкг/мл) отмечалось в темновую фазу. Возможно, подобная закономерность связана с тем, что на свету в процессе фотосинтеза у альгофлоры происходит автоингибирование метаболизма продуктами восстановления кислорода, которое отмечено рядом исследователей ( Дубинин А.В. , Герасименко ЯМ., Венецкая С.Л., и др. 1992), В темновую фазу у водорослей осуществляется расход энергии на процессы метаболического синтеза, одним из которых, вероятно, является продукция лизоцимного и антилизоцимного фактора.

В ходе проведенных исследований было выявлено оптимальное соотношение лимитирующих факторов (рН от 6,2-8,0,10 С от+22°С...

Рисунок 4.

>-» к

ОС V

л н

ДИНАМИКА ЛИЗОЦИМНОЙ И АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ ВОДОРОСЛЕЙ ПРИ РАЗЛИЧНОМ рН

О £

8Л в!а

значения рН

коп-воПА воппосп.

кпп-ипАПА пплппгх!

ПА ппичмак

АПА ппи1иаг

...+25°С и темнота), обеспечивающих нормальное существование исследуемых культур водорослей. Это было использовано в работе при культивировании и определении физиологических характеристик водорослей.

Изучение взаимоотношений между различными видами организмов, связанных общностью условий существования, является основной задачей экологии. Наличие функциональной системы " лизоцим - ан-тилизоцим " у гидробионтов определило ход исследований, направленных на изучение взаимодействий, складывающихся внутри альго-ценоза, а также между водорослями и бактериями.

В лабораторных условиях на искусственном водоеме был проведен эксперимент по наблюдению временной сукцессии водорослевого ценоза. В колбе объемом 2 дм3 была оставлена вода природных водоемов при температуре +22°С и обычном световом режиме. Флористический состав в экспериментальном водоеме соответствовал открытому (131 вид и разновидность водорослей). Контрольные заборы проводили в течении года через каждые 2 месяца.

В экспериментальном водоеме наблюдалось постепенное обеднение флористического состава альгокультур. В первые 4 месяца из опытного водоема исчезло 30 видов, затем падение численности было более стремительным, через 6 месяцев в колбе осталось уже 75 видов, через 10 месяцев -18. Эти изменения, возможно, объясняются отсутствием поступления биогенных элементов и других химических веществ, обеспечивающих нормальное существование водоемов. В конечном итоге в опытном водоеме осталось 4 вида водорослей. Особый интерес представляло то, что Aphanizomenon flos-aquae, и Pediastrum boruanum обладали лизоцимной активностью, a Scenedesmus acuminatus и Oscillatoria limosa - антилизоцимной активностью. Возможно, наличие у водорослей лизоцимной и антилизоцимной

активности и объясняет способность длительного совместного выживания альгокультур в экспериментальном водоеме, являясь одним из механизмов формирования альгоценозов. Вероятно, это объясняет наличие у космополитичной флоры лизоцимного и антилизоцимного признаков.

При изучении взаимоотношений в рамках системы "лизоцим -антилизоцим" было проведено экспериментальное сокультивирование водорослей и бактерий. Для опыта был взят лизоцимактивный штамм водорослей Scenedesmus quadricauda ( JIA - 0,3 мкг/мл) и Е. coli К12 J53 tr • 22-110 ( АЛА - 6 мкг/мл) - генноинженерный штамм бактерий с встроенной плазмидой, несущей антилизоцимактивный признак. Сокультивирование проводилось в колбе объемом 2дм3 в течение месяца при обычном световом режиме и температуре +22°С. Контрольные пробы для определения качественных и количественных характеристик отбирались на 1-е, 3-й, 7-е, 14-е , 28-е и 30-е сутки ( рисунок 5 ). Максимальная лизоцимная активность водорослей (6 мкг/мл) наблюдалась на 3-й сутки опыта, затем началось постепенное снижение ее значений до 2-3 мкг/мл с исчезновением признака к 30 суткам эксперимента. Ан-тилизоцимная активность Е. coli достигла максимальных значений на 14-е сутки (6 мкг/мл), с изменением показателей к завершению опыта до 4 мкг/мл. Вероятно, падение лизоцимной активности водорослей связано с деградирующей функцией антилизоцимной активности бактерий.

Таким образом, при сокультивировании бактерий и водорослей в рамках функциональной системы "лизоцим-антилизоцим" наблюдалось истощение лизоцима водорослей антшшзоцимным фактором бактерий. При изучении взаимоотношений бактерий и водорослей в открытых водоемах были проанализированы данные, полученные в ходе наших исследований.

дни

На реке Урал (в точке открытого водозабора) и на реке Сакмаре, отнесенных нами к чистой зоне наблюдалось значительное превосходство лизоцимактивных штаммов водорослей и бактерий как в "осенне-зимний", так и в "весенне-летний" периоды .

В точках, отнесенных к грязной зоне река Черная и река Урал (в точке сброса с городских очистных сооружений) в бактериальном ценозе преобладали антилизоцимактивные штаммы. У водорослей лизо-цимактивные культуры по численности незначительно превышали антилизоцимактивные.

Натурные исследования, проведенные на реке Урал и его притоках показали, что функциональные системы "лизоцим-антилизоцим" водорослей и бактерий в открытых водоемах существуют самостоятельно друг от друга. Возможно, данные системы конкурируют между собой за жизненные ресурсы - биогенные элементы, свет, 1°С, рН и т.д. Выявленная закономерность, вероятно, объясняет взаимоотношения, складывающиеся внутри альгобактериального ценоза.

Таким образом, с одной стороны было подтверждено наличие у водорослей функциональной системы "лизоцим-антилизоцим", а с другой показано ее участие в формировании альгоценозов и альгобак-териальных сообществ.

Проведенное исследование позволило выявить два основных момента: во-первых, обнаружена функциональная система "лизоцим-антилизоцим" у водорослей и определено ее возможное участие в формировании альгоценозов и альгобактериальных сообществ. Во-вторых, при изучении регулирующего воздействия абиотических и биотических факторов на функциональную систему "лизоцим-антилизоцим" альгобактериальных сообществ разработана система оценки, позволяющая определить состояние водоема и прогнозировать процессы самоочищения в нем.

выводы

1. Разработан новый метод выделения аксеничных культур водорослей, обеспечивающий дальнейшее изучение их физиологических и биологических свойств.

2. При изучении сезонной динамики альгофлоры выявлено доминирование диатомовых в "осенне-зимний" период, зеленых и сине-зеленых водорослей в "весенне-летний" период. Вид Ankistrodesmus angustus определен как характерный для рек Уральского бассейна

3. Обнаружена независимая экзогенная и эндогенная продукция лизоцима у водорослей. Впервые у альгофлоры выявлена антилизо-цимная активность, которая была присуща сине-зеленым и некоторым видам зеленых водорослей.

4. Изучена закономерность динамики лизоцимактивных и анти-лизоцимактивных водорослей на различных фазах развития популяции. Максимальное проявление секретируемого лизоцима наблюдалось в фазу логарифмического роста водорослей, тогда как нарастание антилизоцимной активности было отмечено в стационарную фазу их развития.

5. При исследовании регуляции лизоцимной и антилизоцимной активности водорослей абиотическими факторами (свет, температура и pH) установлена максимальная выраженность признаков в темноте при температуре + 21°С ... +25°С и pH 6,2-7,4. В водорослевых биоценозах при защелачивании воды обнаружено преобладание антилизоцимных форм над лизоцимными. При высоком закислении (pH 4,5) наблюдалось отсутствие форм с этими признаками.

6. Изучение сокультивирования S. quadricauda и Е. coli выявило деградирующую способность антилизоцимного фактора бактерий в отношении лизоцима водорослей.

7. На основе выявленной функциональной системы "лизоцим-антилизоцим" микроорганизмов был разработан "Способ прогнозирования состояния водных биоценозов" позволяющий уточнить оценку состояния гидроценозов,

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Способ прогнозирования состояния водных биоценозов. // Патент РФ № 2052816 (соавт. О.В.Бухарин, Г.Н. Соловых, Н.В.Немцева).

2. Микробиологический метод диагностики состояния водных биоценозов. // Информационный листок ВВЦ "Экология 1994" (соавт. О.В.Бухарин, Г.Н. Соловых, Н.В.Немцева).

3. Ускоренный метод определения лизоцимной и антилизоцим-ной активности у водных микроорганизмов для гидробиологического мониторинга. И "Молодые ученые - здравоохранению". Материалы XII итоговой конференции молодых медиков, посвященной 50-летию института. Оренбург, 1994. - С.59-60 (соавт.Н.В. Немцева).

4. Метод выделения и учета антилизоцимных бактерий, из воды природных водоемов. // "Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины". Сборник научных трудов ученых Оренбургского мединститута т. XXIX. - Оренбург, 1994.- С.88-91 (соавт. Г.Н. Соловых, Н.В. Немцева).

5. Антилизоцимный признак в микробиологической характеристике речных альгобактериальных сообществ.// Журн. микробиол. эпидемиол., иммунобиол.,-1996. №3.-С.20-23 (соавт. Н.В.Немцева).