Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЛИПАЗЫ НЕКОТОРЫХ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ЛИПАЗЫ НЕКОТОРЫХ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ"

i И Д Д Б ti И Я НАУК СССР Инотитут микробиологе*

N На правах рукописи

ЫШКАТОВА Пана Александровна -

- ■ ■ ■■ /■

ЛИПАЗЫ НЕКОТОРЫХ ITA МОТРЩАТ КЙЬШХ .БАШРИЙ .

' (специальность 03.00.07 - микробиология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой ствпвнш

i

"кандидата биологячоок»* наук

Москва - I9tíD

ф&р ¿и №(>7

Работа выполнена в Институте микробиологии АН СССР

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

К.Л.Хубян ■

Официальные оппоненты: ' д»кт«р блолвгичеоюис мук, профессор А,И.Беэ<5орвдов

доктвр б*ол»гкччоЛях наук, професовр, .;

Заслуг ив нЯ. деятель яаукшРСФСР Л.Г.Лол нов»

ведущее учреждение: кафедра микробиологии Биологического

факультета Московского государственного университета км. М.В.Ломоносова Завета состоится " " 1980г. в /&гас. мин.

на- заседании Специализированного совета Д 002.64.01 при Института микробиологи* АН СССР по адресу: 117312, г.Москва, В-312, проспект 60-летия Октября', д.7, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института .миярпйкология АН СССР,- . * >

\ Автореферат разослан '

года

Ученый ■ /■'■ ■ '■ ,

Специал; " .■' Л.Ос.^^ул»../

(гпндндчт ч лх ;,эуг: / Л.К.Оснипяая

Актуальность проблемы. Микробные липазы находят широкое применение во многих областях народного хозяйства: промыжленности, животноводстве, медицине и в препаративной биохимии.

Липолиткческие ферменты способны образовывать представители многих систематических групп микроорганизмов: плесневые грибы, дрожжи, актиномицети, ми ко плазмы и некоторые бактерии. Липазы грибов н дрожжей изучены лучше липаз бактерий, так как уже нашли широкое практическое применение. К сожалению,большинство промшден-кых препаратов липаз не обладают способностью гидролизовать твердые жиры.

Изучение липодитического расцепления твердых жиров, содержащихся в промышленных отходах, имеет большое значение в связи с проблемой очистки сточных вод и загрязнения окружащей среды.

Таким образом, расширение исследований, направленных на изыскание новых продуцентов дипаэ, а также всестороннее и тщательное изучение свойств данных ферментов представляется необходимым. В связи с этим изучение бактериальных липаз, несомненно, имеет боль-вое значение.

Дня промышленных целей наибольший интерес представляют внеклеточные ферменты, выделяемые микроорганизмами в окружающую среду, так как их дальнейшая очистка значительно проще и дешевле, чем препаратов внутриклеточных ферментов.

Однако, не меньшее значение для понимания физиологической и метаболической роли микробных липаз имеет изучение ферментов, связанных с клеткой и обеспечивающих определенные зтапы ее метаболизма. Свойства и функции многих внутриклеточных ферментов, и особенно лнпаэ еще не выяснены, а потому изучение их имеет большое теоретическое значение для понимания процессов, протекающих в микробной клетке, и дает реальную основу для их контролирования и регулирования.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изыскание активных продуцентов внеклеточных и внутриклеточных липаз среди грамотрицательных бактерий родов ревцЛотопяо и 2«ггаиа и сравнительное изучение свойств данных ферментов.

В задачи исследования входило:

1) поиск активных продуцентов экзо- и эндолипаэ;

2)' подбор оптимальных условий для биосинтеза внутриклеточных и внеклеточных липаз;

Цсзтр. С8ЛИЗ С ЭП- } ЕЮС-Г. с?Д, (зД?.51.

а;:ад. ш, я. Л. Г^лз^

- 2 - *

3) разработка методов дня выделения и очистки данных ферментов;

4) характеристика полученных препаратов липаз к сравнительное изучение их свойств.

Новизна научных исследований. С помощью ультрафиолетового облучения штамма Ра.Миогевсепв 533 получен мутант, обладающий повышенной липодитической активность» (мутант Рв.ГХиогввоепв 533-56). Подобраны оптимальные условия для биосинтеза вхзолиоазы данным мутантом. Выделена и очищена липаза Ре.Пиогввсвпв 533-56 и с помощью диск-электрофореза в полиакриламедном геле показана ее гомогенность. Определены ее молекулярный вес я аминокислотный состав. Вперзые показано, что липаза, образуемая представителен рода РееиДопопаа, является гликопротеидом.

Изучено влияние ионов металлов и ингибиторов* а также влияние температуры и величины рН на активность данной липазы. Детально изучено влияние солей желчных кислот на активность бактериальной липазы и высказано предположение, что активирование процесса липо-лиза высокими концентрациями желчнокнслых солей связано со способность!) этих соединений образовывать мкцелдярные агрегаты, обладающие особыми свойствами.

Показано, что липаза Ре.Пиогввевпв 633-56, в отличие от описанных ранее лкпаэ, Ре.и Pa.aerxigi.noea, активируется ионами магния.

Впервые изучены оптимальные условия для биосинтеза одновременно ввдо- и экзолипазы штаммом З.аагсввсвпя 345.

Предложен удобный способ для ввделения внутриклеточной ляпавьг З.яагсеесеав • 345.

Выделены и очищены екдо- и вкзолипаэы з.лагевеевп» 345, а также изучены их свойства. Впервые проведенное нами подробное изучение свойств эндолипаэы, образуемой грамотрицательноЙ бактерией (вндолипаэа , з.пагсевевпя 345), может иметь большое значение для понимания метаболической я физиологической роли данного фермента в клетке. Отмечено большее сходство в свойствах между окэо-лнпаэани Рэ.*1иог«всвпе 533-56 и 5,»агсвяс«вв 345, чем между зндолипааой и экзолипаэой Э.яагввеввпа 345.

Практическое значение работы. Исследование субстратной специфичности липазы Ри,?1цогве<звп» 533-56 показало, что она способна гндролизоБать широкий спектр растительных масел и синтетических триглицеридов, в том числе твердые синтетические триглкцериды и

природные жиры, что представляет несомненный интерес в связи с проблемой очистки сточных вод и загрязнения окружающей среды. Проведенное совместно с Институтом микробиологии им. А.КирхенштеЙна АН Дата,ССР iг.Рига) и Баусккм комбинатом Латв.ССР апробирование полученного нами препарата липазы Pa.fluoreeeene 533-56 показало возможность использования данного препарата дна очистки сточных вод молочных заводов.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на научном семинаре молодых специалистов }ШИ All СССР, на УД конференции молодых ученых» г.Рига, 1977 г.; на II Республиканской конференции молодых ученых-микробиологов, г.Ташкент» 1978 г.; на Всесоюзном совещании по ферментам микроорганизмов, г,Минск, 1978 г.; на Всесоюзном симпозиуме "Регуляция биохимических процессов у микроорганизмов", г.Цущино-на-Оке, 1973 г.; на II Всесоюзной конференции "Биосинтез и метаболизм липидов у микроорганизмов", г.Москва, 1979 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, находится в печати I работа.

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы Ш глава), описания объектов и методов исследования (глава Ш), изложения полученных результатов (глава 1У), их обсуждения (глава У), выводов (У1 глава), содержит 155 страниц машинописного текста» 41 рисунок, 23 таблицы и список литературы, из 296 наименований (из них 207зарубежные),

ЭКСГЕРИЫШТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

I. Объекты и методы исследований.

Объектами исследования служили бактериальные культуры, относящиеся к родам P&audooonae (30 штаммов) и Serratia (з.ваг-eeeoene 345 и S.maiueecena 348). Детальные исследования проводили С культурами ре,fluorescein 533-56 и З.тагсввсев® 345.

При проверке на л«политическую активность культивирование штаммов рода Peeudomonae проводили в зрленмеПеровских колбах объемом 100 ыл с 20 мл ШБ, на качалке (180 об/мин) при 20° в течение 24, 4tJ и 72 часов.

Для, подбора среды, оптимальной для образования липазы, испытывали среды различного состава (23 среды), включая полупинтети-ческие, я также среды, богатые сложными органическими нещ**стнами.

Иаибольшая активность Рв.Пиомновп» 533-56 была выявлена на среде следующего состава (Í); соевая муха. - 2,0, мочевина - 0,1, Х8ИР04 -0,2, lg304.7B20 - ОД.

При научении лютолвтической активности представителей рода S«rratla микроорганизмы выращивали в колбах объемом 750 мл со 150 ил среды на качалке (180 об/мин) оря £8° в течение 24, 48 и 72 чае. Еыян испытаны ШТБ ц среда, содержащие отвар соевой цукл, мочевину« дрожжевой экстрап, крахмал н минеральные компоненты.

Дня повшения лкполитической активности культуры Fe.flúores-533 после длительного хранения использовали ультрафиолетовое облучение и инкубацию данной культуры в стерильной почве. Яипояитичбсхув актявяость определяли по модифицированное методу Ота и Ямад& (Ota, Tenada, 1966).

При работе с представителями рода Peeudomoaae . хипояиткче-скуг активность выражали в микромолях олеиновой кислоты, освобождавшейся за I час в результате гидролиза субстрата I ил культу-рвльноЙ жидкости (в случав ферментного препарата - в пересчете на I нг белка). При изучении экзо- и эндолилаэ , S.marceeceae 345 активность »кэолнпазы выражали в микромолях олеиновой кислоты, освобождающейся за I час при гидролизе субстрата .1 мл яультуральной жидкости (о учетом количества биомассы, содержащейся в I мл куль-гуральяой жидкости). Л политическую активность клеток З.яагсе»« свпв 345 выражали в микромолях с-еиновой кислоты, освобождагщей-ся за I час в результате гидролиза субстрата метками, содержащийся в I мл культуральной жидкости. Активность ферментных препаратов липаз также выражали в микромолях олеиновой кислоты в пересчете на I мг белка. Белок определяли на спектрофотометре ОФ-16 по методу Угдаелла и Хил л a (Waddell, mu, .1956), по методу Гарт-ри ( Hartreв, 1972). и Лоури < tawry et.al., 1951 ). Для извлечения эндолипаэы з.вигвввееа» 345 к клеточной суспензии <2 г клеток в 10 мл 0,05М фосфатного буфера рН 7,0) добавляли холево-кислый натрий в концентрации 0,0?. Инкубации проводили в течение 30 мин. при 37°. При фракционировании белков пользовались следующими приемами: высаливанием белков сульфатом аммония, фракционированием органическими растворителями, гель-фильтрацией через сефа-де кем. Диск-электрофорез в пол и акриланидном геле проводили на приборе фирмы " Re anal ■ (Венгрия) в 7£-ном геле при píl 8,9. Для проявления липолитической активности столбики геля накладывали на

агар, содержащий 0,25? оливкового масла и ввде уливал и в течение I часа при 45° (Heering, 1971).

Молекулярный вес липазы Ре.fluorsее«п* 533-56 определяли методом гель-фильтрации на колонке (1,2x75 см) с сефадексом б -200. Дня построения калибровочной кривой использовали белки с известным молекулярным весом. Экстракции лшшдов из очищенного препарата липазы Рв,Пиог»асвпв 533-56 проводили по методу Елайя и Дайэра (Blye, Dyer, 1959). Экстрагированные вещества громато-графировали в тонкой слое сшшкагеля в системе дня нейтральных ли-пидов (гексан: эфир: уксусная кислота а 65:15:1,5) и для фосфоли-пидав (хлороформ:метанол : вода « 65:25:4). Обнаружение пятен проводили в парах йода, а также использовали различные цветные реакции, характерные для фосфолипидов, Дня определения углеводов в очищенном препарате липазы Ре.fluoréеевое 533-56 использовали метод Дюбуа (Duboue et,al,, 1956), Аминокислотный состав липазы опре- ' делали в автоматическом аминокислотном анализаторе L KB-4I0I (Швеция) после 24-часового гидролиза препарата étfiCl в запаянной ампуле при 110°.

П. Результаты исследований и их обсуждение.

I). Поиск активных продуцентов.липазы среди представителей родов Рeeudomonae и Serratia и подбор условий культивирования, обеспечивающих наибольшее накопление фермента

Первый этап исследований был направлен на отбор среди представителей рода Pseudomonas штамма с высокой л«политической активностью. С этой цель» нами было проверено 30 штаммов, относящихся к роду Peeudoetonae, и отобрано 10 штаммов, обладающих л«политической активностью.

Наибольшей активностью из отобранных культур обладал штамм Pstfluareeeeue 533 (по каталогу ВОД B-II5I). Для повыпения ли-политической активности данный штамм подвергали различным дозам ультрафиолетового облучения. Был получен ряд мутантов, из которых наиболее активным оказался мутант Ре.fluoré ее enв 533-56 при дозе облучения, равной 3100 эрг/мм^. Диполитическая активность дни ного мутанта более, чем в 1,5 раза превышала активность исходного штамма.

Одчако рдОота со штаммом Ре. fluoreacea« 533-tirf осиожня-лась тем, что при росте на твердых средах и, в частности, на U.IA,

данная культура, как и исходный штамм, диссоциировала на колонии двух типов: слизистые, блестящие» пигментообразупцие колонии ( 3 -форма) и шероховатые, тусклые, не образущи6 фгаюресцеина ( А -форма). Изменения происходили только в одной направлении: от

8 -форм к В -фермам. Обратного перехода не наблюдалось. Кроме того, для данной культуры отмечена связь морфологической иэмен-чи-вости с биосинтеткческой способность!). Так, если клетки колоний

3 -формы при росте на жидкой среде активно синтезировали липазу, то в »форма данной культуры была практически неактивна. При длительном хранении и пересевах штамма Pe.flnoreeoene 533-56 накопление колоний К -формы приводило к "вырождению* исходной активной линии, поэтому в процессе работы с данной культурой постоянно г. ро водился отбор высокоактивных колоний 3 -формы, хорошо образовывавших пигмент, так как была обнаружена корреляция синтеза липазы и фляоресцеина. Как правило, колонии 8 -формы, плохо образую-щив пигмент, или утратившие эту способность, были малоактивны или неактивны.

Дня повышения липолитической активности культуры Pa.fluoms-евпа 533-56 мы воспользовались одним из широко известных в микробиологической практике приемом, а именно: проинкубировали данную культуру в стерильной почве. Данный метод оказался достаточно эффективным. Было получею несколько высокоактивных пигментообразую-щих линий, причем в некоторых случях активность более, чем в 2 раза, превышала активность исходной культуры. Вполне возможно, что большое влияние при этом на культуру оказывает комплекс сложных органических веществ, содержащихся в почве, и в первую очередь, вещества липидного пула почв.

Hap:,jy с липолитической активностью бактерий рода Feendo-аопал нами изучалась липолитическая активность двух штаммов З.паг«еэв*п8 (345 и 348). Шло показано, что оба штамма синтезируют как внеклеточную так и внутриклеточную липазы (табл.1). Кроме того, ДЛЯ культурн S.ronrceeeena 345 нами также показана связь интенсивности nurvгнтообразования и липолитической активности. Так, при 37° данный гатамч в процессе роста не образовывал пигмента, активность его при этом была очень низкой. У апигментннх мутантов, гтолучрнннх с помощис ультрафиолетового облучения культуры г.лarceтяо* 345, спнтм липазы такус понижен по сравнению с исходны« штампом.

При подЯдрч п;1т>1тнт!ьлоП среды, способствувщчй образованию ли-

ПАЗЫ некоторыми представителями родов Peeadoaona« и Serratia нами било показано, что состав среды играет йолыпую роль в процес-

Таблица I

Л«политическая активность (mcU олеиновой кислоты/ иг сухоЯ биомассы*час). 3.щягсвоо»п.э 345 и 3»marceoc«no 348 при выращивании на различных средах

t Serratia * Serratia

{ шагоевсепа 345 j вагсевсвпо 348

''Р®*® | время культивирования Wao)

| 24 j 48 j 72 i " j 49 j 72

»I клетки культураяьная жидкость 0,35 2,16 0,63 2,20 0,44 3,91 2,90 21,90 8,64 22,60 7,70 13,20

» г клетки 19, до 9,39 4,33 3,40 3,12 3,09

Культур&льная жидкость 51,90 39,20 21,60 18,00 14,50 5,00

» 3 клетки 3,61 , 2,11 1*73 2,23 1,95 1,73

культур&льная ЖИДКОСТЬ 24,40 4,71 0 0 14,70 17,20

се биосинтеза липазы. Бее испытанные штаммы обнаружили наибольшую «политическую активность на средах, богатых сложными органически ми-веществами н, в первую очередь, на средах, содержащих соевую муку. (Рис. I, 2; таблица I).

Известно, что добавки в среду для культивирования некоторых биологически активных веществ повывают л«политическую активность. Так, в литературе неоднократно сообщалось о влиянии солей желчных кислот на микроорганизмы, в частности, на липоли?ическую актив' кость грибов, дрожжей и бактерий.

Нами изучалось влияние добавок к среде дли культивирования штаммов З.шагеввпепв 3-1Ь и натриевн* солей жглчшл ингч>ч в различны* концентрациях.

Синелось, что в присутствии в среде желчнокиевих сол**Й н<1

Ряс Л, Л ((политическая активность Рис.2. Л «политическая ах-

(мкМ олеин.к-ты/*и.час/Pe.flaor«»- тивносгь ЫкЯ олеин.к-тц/ cene 533« мутантов Pe* flnore ее ene мл. час/ Ре. fluor* во еа> 533-5Й я 533-5в, Pe.fraçl , выращен- 533-56 ва равных средах, ных на полусинтетической среде (А) и I - на среде с соевой му-среде сложного органического состава, кой; 2 - на ШБ; 3 - на по-содержащей соевую цуку (Б). I - Ре, лусшгтетиче с ко й среде, fluoreeoen» 533-5(5, 2 - Ре.fluoresce»* 53Э-5в, 3 « Ре, fitter« scene 533, 4 - Pe.fragl

блсдалось, как правило, снижение уровне общей лилолитической активности (активность клеток + активность культу рал ьной жидкости) S.m*TC6ge*na 345 и 348, причем действие данных солей, л о-видимому, очень сложно и зависит как от химического строения используемой соли, так и от индивидуальных особенностей микроорганизма. Исключение составляет таурохолевокислый натрий, при добавлении которого к среде наблюдалось повеление лилолитической активности. Но~видкыс«у,8 данном случае тауроходат натрия активирует не биосинтез липазы, а ее выделение из клеток, нарушая проницаемость клеточной оболочки. Холат и гликохолат натрия, оказывал аналогичное действие, в то же время являются, вероятно. Солее токсичными вещестеами.

и отличий от п.шагсввевпя 345 изучаемый иеыи штамм Ре. fluor««nm# ÍÍ33- fj'i вид ел ял липазу в период логарифмической фазы рлпта, когда чи'.мо жиг-ьгк клеток было максимальным, липолитическая

активность ори этом в клетках не обнаруживалась пи на одной ва стадий роста культуры. У культуры з.шагсевоепв 345 через 5 часов после посева л ел олитиче с кая активность обнаруживалась в клетках, а только яа 19-оы часу культивирования отмечено появле-т Ш1В липазы и в культуральной жидкости. Максимальное накопление липазы как в клетках, так и в культуральной жидкости, наблюдалось с стационарной фазе роста культуры. С переходом культуры в фазу отмирания активность клеток и культуральной жидкости уменьшалась. Интересно было выделить внутриклеточную и внеклеточную липазы, образуемые культурой з.ааговваепв 345, и провоста сравнительное изучение их свойств.

2) Выделение внутриклеточной липазы Stmareesaaea 315

Как указывалось выше, бактериальные эндолипазы в сравнении о зкэолипазами практически ва иэучани, в связи о большими трудностями их извлечения из клеток.

Для выделения эндолииазы из клеток 3.шагевееenв 345 нами были использованы ультразвук и пресс типа 1ренч-1ьюза. Поскольку при разрушении с помощью данных методов происходила заметная инактивация липазы, мы решили испробовать более мягкий способ воздействия, используя вещества, нарушающие клеточную проницаемость и способствующий выходу ферментов, связанных с клеткой. Такими веществами, в частности, являются соли желчных кислот (Hol4a«orth, Goleroan, 1976). В работе были использованы натриевые соли холевой, тауроходовой, деэоксихолевой и глвкохолавой хиолот в концентрациях от 0,2 до 2,0Í,

Рис.3 Влияние холлтп натрия на выход в сугюриптшт зидо-липазы З.магаеаеена 315,

Лилолитинеекая активность су-пернагента (1) и юнгок (2} выражена в мкУ олеин.к-ты/мг оух.биомассы-час; билок ('>) -мг/ыл,

Нн рвс.З придапвлвны значения липолатическьй пкгяыысти и супернотанта ив клеткчх, а так»и содержание йсляа при лнку^аиив клеток S.mircítíi^srin ,') lii присутствии юлата натрия. (Ниэплыиий

выход.внутриклеточной липазы наблодалоя при ивкубированки клеток S,maroвво ene 345 с холатом натрия в концентрация O.BÍ в течение 30 минут при 37°: лжполитичеокая активность в суцерватанте возрастала почти в 9 раз, а в платках - резко падала. Данный метод, впервые примененный нами для извлечения внутриклеточной липазы з.паговвоепе 345, оказался простым, удобным s эффектявным.

Соглаоао литературным данным, работы по изучению свойств йндоллпаз грамотрицательвих бактерий практически не проводились, В связи о этим нами была проделана работа по выделение и очиотке эндолипазы З.шагсеэовпв 345 с целы» изучения свойств данного фермента. Народу о выделением и изучением свойств внутриклеточной липазы з.шаговоеene 345 несомненный интерес представляло выделение и исследование свойств внеклеточной липазы данного микроорганизма. Поскольку полученный о помощью ультрафиолетового облучения мутант Ре.fluor*eeeoe 533-56 являлоя достаточно активным продуцентом внеклеточной липазы, то сравнительное изучение свойств данной липазы и экзо- к эндолипаз З.иаговаовпя 345 безусловно представлялось интересным.

3) Выделение, очистка в сравнительное изучение свойств препаратов липаз Pe.fluoreaoene 533-56 и з.иагеве-евпв 345

III ■ i 114 Г- ■■ I ■ I 1 »hhii ни i mi Ml II I

. Для получения ферментных пр'ааратов Pe.fluor«воene 533-56 и з.яагеввоепв 345 использовали осаждение нуклеиновых кислот, осаждение белков сульфатом аммония в органическим растворителем, ультрафильтрацио через мембранный фильтр УАМ-200 в гель-фильтрацию через сефадекс в -£00.

В i 1эультатв проделанной работы нам удалось получить очищенный более, чем в 30 раз, препарат липазы Pe.fino«асenа 533-56, а также препараты экзолипазы и эндолипаэы 3 „ваге eso ем 345, очищенные почти в 90 и 200 раз (расчет по белку) соответственно.

Ка рис.4 представлены профиля эдюцив изучаемых ферментных препаратов с колонки о •-гефддексом с -Ü00. Как видно из рисунка, активные Фракции после голь-фильтрации для всех трех липаз совпадали только с первым белковым пиком, который выходил сразу за свободным объемом колонки.

Некоторые сдойотрз^ляпгши Рз,fluoréясana ^33^53

Диск-электрофорез в полнакриламидаом геле показал наличге

белок

ДА

зт 1

гт

• цхо

• 15«»

1000 <4

-4—>

В белок

л

И

»

Ч3 О* Ч<

«1 30 50 70 ¡0

РвО.4

« ЛО 50 ТО номера фракций

Гель-фвльтрапш через колонку с сефадексом о -2С0 липазы Рв.Пиогвесепв 533-56 (А), экзолипаэы (Б) а эндолипазы (В) э.тагсвяоепв 345. I - диполитическая активность (мкЫ олеиа.к-ты/мг белка-час); 2 - белок (мг/мл).

одного электрофоретическв подвижного белка (вг 0,27) в очищенном препарате липазы Рв.Пиогваоена 533-56, что указывает на возможную гомогенность данного препарата. Молекулярный вес липазы, определенный методом гель-фильтрации через сефадекс а -200, оказался равным 320000 (рис.5).

V (мл) Рис.5 Определение молекулярного ве-

са липазы Ра.Пиогееоепв 533-56 методом гель-фвльтрации через сефадекс

.1 о -200.

<

I - лазоцим, 2 - сыьороточнчй альбумин, 3 - глюкоэооксидаза, 4 - £ -гди-козидаза, 5 - фикозритрин, 6 - лвплэц М.в. Ре,Г1иогеваепв 533-56, 7 - урепза

Полученный нами препарат липазы Рв,Ииогеэс»ив Ь33-5б содержал почти 25-26;8 углеводов, т.е. данная липаза ивлялясь глико-протеадом, что сради липаз. образуемых представителями рода Реем йошопае, показано впервые. Ни липиды, ни фосфолипиды в иреиграть липазы обнаружены но бшш,

Щш определении нмижжиолотного соетаьа окнзилось, что дьи-н.иъ липа 1(1 характеризуется значитамным содержанием аданииа, ы>-линп, 'ас!и.»1(>гинок,1) геологи, ло(!иини и ({¿и'шшланшш, т.о. провы> ЦвСИ-'НШО омшюкиелгт. С ив ценил но яцти. кй'ЛГИ и с и у

составу липаз грамотри'ца тельных бактерий в литературе практически отсутствуют.

Влияние оЦ. Активность изучаемых препаратов липаз зависела от рН реакционной смеси, прячем оптимальные значения pfl для внеклеточных липаз Ре, fluor« во «па 533-66 в S.mare«ae«D* 345 находились в области нейтральных значений (рН 7,0-7,5), а вндо-липазы з.юагоевсвпв 345 - в области более низких значений (рЯ 6,0-6,3). Интересно отметить, что оптимальные значения pli изучаемых вами ферментных препаратов с увеличением степени очистка смешались в область-более пазках значений.

рлияние температуры. При изучении зависимости скорости гидролиза оливкового масла от температуры было обнаружено, что оптимальной температурой проведения реакции для экзолипази rat fluor»»о®ne 533-56 и эндолшшзы S.msrseeeette 345 являлась 45°, а экзояипаэв З.аагсеэочп» 345 была наиболее активна при температуре реакционной смеси 40°. При сравнении темцературннх оптимуме в препаратов липаз Ра.Г1иоу»вевпв 533-56 В 3,»атсеаа*ав 345 различной степени очистки отмечено, что термоустойчивость лкпаэ снижалась. Как видно вз рис.6, оптимум действия неочищенной липазы (лиофилизиревпнвая культуральная жидкость) и частично очищенного $«рментило препарата Pe.n«or»ec«te 533-56 находился при 55°, даке при 65° активность данных препаратов еще достаточно шссгаз. Однако температурный ечтимум для препарата, получен-ноi-o после гель-хроматогра^ии, приводился ужа на 45°. Кроме того, ферментнне препараты совершало не активны при 70°, в то время как неочищенная ляппза еще Сохраняет активность.

Рис.6 Влияние температуры на скорость гидролиза оливкового масле Ферментными препаратами липазы Ре. fluoreeean» 533-56 разной степени очистки (лкполитическэя активность выражена в мкмоль олеиновой квслота /мг бвлкя*чос).

1 - очищенный препарат липазы;

2 - частично очищенный $ер««}цтпай препарат; 3 - липаза культуряльпой жидкости.

ЛА

Результаты изучения влиялия температуры и длительности пре-инкубациа буферных растворов изучаемых липаз ори разных температурах свидетельствуют о сложном влиянии данного фактора ва фермент. Так, инактивация »кэолгааэы З.шагсессвпв 345 происходила в две отадли; первая стадия быстрая, активность сшажалаоь ва 21-22*, а ва второй стадии - оставалась неизменной в довольно широком интервале температур (рис.7). При температурах выше 55°

Рис.7 Влияние температуры преин-кубацки на стабильность препарата акэоляпаэы 3,тага«ев«па 345 (ли-полвтическая активность выражена в % по отношению к исходной активности, принятой за 100%). I - раствор фермента выдерживалв 30 мин . при разных температурах; 2— раст-<0 ты чоп то гй вор фермера выдерживали 60 мин- '

температура, С0- при разных тешшратурзх.

наблюдался резки! спад активнооти. Характер влияния температуры преинкубация на гядолжпаэу з.таге*во«пе 345 в общих чертах аналогичен , но следует отметить, что препарат эндолепаэн, выдержанный в течение часа при 65°, полностыэ инакт-вяровалоя, в то время как »кзолипяза в данных условиях еще сохраняла 20? активности. Интересно, что выдерживание яри невысоких тегоературах (до 30°) раотрора липазы Рв.Пиогевевп* 533-56 приводило к некоторому снижению активности фермента, но после 30-минутной инкубации при -45° липолитическая активность Ра.Ппогмочпе 533-56 возрастала на 43* по сравнение с исходной, что, по-видимому, вызвано активацией молекул липазы (рис.8). Следует отметить, ч*о оптимум дейот-

*

Рис.8 Влияние температуры преинку-бация на стабильность липазы Ра. £1иогеео«па 533-56 (липолитическая активность выражена в мкМ олеин.к-т№' мг белжа-час). I - раствор фермента выдерживали 30 мин при раэннхтемпе-ратурах; 2 - расгрор фермента вндэр-р'с н> <«з 5(1 «о 70 живали 60 мин при разных темпэряту-трмпоротуря, С° рпх.

ьия данной дидази, как указывалось выше, также находился при 45°. После 30-шшутной инкубации при 55° препарат полноеты» инактивировался.

Влияние ионо-в металлов. Наш изучалось влияние ново» двухвалентных металлов не активность препаратов липаз Ре.fluor« <w#na 533-56 2 З.тагевэс»па 345.

Все полученные нами препараты липаз активировались ионами нагнил. Так, зкзолияаэа 3»вакееоепа 34S - на 100%, в несколько меньшей степени (50$) - липаза Fa.fluoreacena 533-56, причем 'оптимальная концентрация ионов магния для обеих липаз была l'IO^M (рио.9 АБ). Для эндоладазы активируыций эффект ионов магния (I4íf) отмечался только при концентрации I-IO^M, а о увеличением концентрации иояов магния в реакционной смеси наЗлцда-лось снижение активности данной липазы по сравнению о контролем (ряс,9 В). В несколько меньшей степени по сравнен»» с активацией ионами магния энзолипаза з.тагсеееапе 345 активировалась также ионами кальция в концентрация I-IQ"3^ и конами марганца в той же концентраций. Интересно, что иоаь кальция в концентрации I-ICT^U практически не влияли на липазу Рв.Ниогввоепа 533-56 в эндола-пазу 3, вито в во ею в 345.

концентрация, U

Рис.9 Влияние иоппн металлов на липолитич^скую активность аре-планов акэолииизм Pe.fl йоге sa ens 533-SO (А), экзолиппэи (G) и ВИД'-'Л ИНН ÏU (В) S.»arc«noena 3(5 {ЛИПОЛИТИЧвСКВЯ ЗКТИЬНПСТЬ Ш-paiütta в t по отношению к »ктипш>сти a контроле, принятой за KM), I - магний, i; - кпльиий,.3 - маргашт, 4 - никель, ') - 1ШНК, G - жслеэп, 7 - мкдь, В - ртуть.

Ионы тяжелых металлов оказывали, как правило, янгибирутацяе действие на липазы изучаемых микроорганизмов. Отмечена высокая чувствительность ферментов к йонам цинка, свинце, железа, кадмия и, особенно, меди и ртутя.

Влияние ингибиторов. При исследовании влияния ингибиторов на изучаемые нами ферменты были обнаружены существенные различия в свойствах экзо- и эндолипаэ.

Наибольший процент торможения гидролиза оливкового масла -изучаемыми препаратами липаз бш получен при добавлении в реакционную систему ЭДТА, которая связывает преимущественно яонн матки и кальция. Другие хелатобразущие агенты (А,«1-дипиридил, о-фе-нантролив) не оказывали влияния, на активность препаратов экзоля-' паз Р*.С1иогвйеепв 533-56 в З.ваговеовпа 345, В ТО время как активность эндолидаэн з.шагсеасвпв 345 заметно снижалась в их. присутствии.

Изучаемые нами ферментные препараты липаз проявили высокую чувствительность к ингибиторам, действующим на сульфгидрильные группы, в частности, к йодацетату и ионам ртути, йодацетат, не влиявдий на активность экэолипаэ Ре.*1«огвесепв 533-56 и з.н*г-овво*пв 345, снижал активность зядолиаазы з.пагоееееао 345. Ингибирующее дейотвие таких меркаптядобразующях реагентов, как арсенит и п -хлорыеркурийбензоат, более выражено при действии на экэолвпазу з.паге«еовпа 345 по сравнению с экдоляпззой данного микроорганизма.

Влияние жедчнокдслых содей. Характер влияния *елчпокислых солей на активность изучаема препаратов липаз в общих чертах одинаков; в низких концентрациях соли желт- тх кислот (0,01; 0,05; 0,1£) оказывают, как правило, ингибирующее действие, а в более высоких концентрациях (0,5; 1,0 и 2,0%) данные соединения-повышают скорость гидролиза оливкового масла препаратами изучаемых липаз (рис.10). Тот факт, что в нйзких концентрациях соли желчных кислот тормозят процесс липолиэа, объясняется, вероятно, тем, что соли желчных кислот в водных растворах в концентрации' шлпе так называемой критической концентрации мицалл^Зразованяя (ККМ) самопроизвольно ассоциируют в мяцеллярные агрегаты различии* размеров л форм». Такие мицеллярныэ растворы обладает особыми свойстрлчи. Так, они спосг^бны солюбилизировать пзрастгоримые в годя липо^клмш? веяества. Кроме того, мицоллярные растяоры

Рис.10 Влияяиз желчнокислых солей не липодитинаскую активность препаратов экзолипязы 1а,Г1иогееовпе 533-6(1 (Л)« экзо-дипазы (Ь) и эндолипаэы (В) 3,ваговво«оа 345 (липоли-тическая активность выражена в % по отвошеашо к активности в контроле, принятой за 100?), I - деэоксихолат натрия, 2 - холат натрия, 3 - таурохо-лат натрия, 4 - гликохолат ватрия.

солей желчных кислот могут образовывать смешанные мицеллы с жир-вымя кислотами и моногляцеридама, являющийся продуктами лкподи-за. Способствуя таким образом диффузии продуктов реакции с поверхности раздела фаз, соли желчных кислот опосредованно активируют процесс лидолиза. Не искличеко также. что желчнокислыа соли уменьшают поверхностное натяжение на границе раздела фаз масло-, вода и тем самым создают условия для лучшего соприкосновения водорастворимой липазы о субстратом, усиливая адсорбцию фермента аа поверхности раздела фаз.

При низких концентрациях соли желчных кислот существуют в виде истинных или молекулярных растворов, не обладании* свойствами ми целлоны* растворов. Этим моя но объяснить тот факт, что активация процесса липолиза спллми желчных кислот наблюдается только после достижение определенной концентрации гелчнокислой соли.

Й£ВЙ-ДЬ2В.РЛМа различных субстратов. Для изучения способности препаратов лииаз Рв.Пиогееевпв 533-56 и З.азгсевсвпв 315 кг>та~ ли*)Е;;о|4ать гидролиз различных субстратов нами был испытан ряд ра^тателишк масел (оливковое, соевое, кукурузное, льняное, горчичное, подсилнвчнов, 1ло11ковоя), а также синтитаческио триглице 1-нпы ылсишой, капроновой, ■ лаусииовой, ннристиноиой и стеариновой гвс»от. Ними били испробованы та кил различини эчульгиторн: '¿'I и

IOi-ные растворы d оливин илового спирта, гуммиарабика, желатины ж тритона X-IOQ. Эмульсии готовит с помощьо ультразвукового дезинтегратора. В табл.2 представлены данные по гидролизу растительных масел препаратами ляпаэ. Оказалось, что лшоли тича с кая активность препаратов в значительной «ере зависят от природы используемого субстрата, а также от свойств эмульсия» определяемых эмульгатором и его концентрацией. При этом не'всегда о увеличением концентрации эмульгатора улучшаетоя качество эмульсии, а, следовательно, повышается лилолитическая активность* Поэтому прж отборе и изучении микроорганизмов, обладающих ляполитическоВ ак-. тивностью, необходимо для каждого жоследуемого субстрата подбирать наиболее пригодный эмульгатор в оптимальной концентрации.

Интересно, ЧТО вкзолипаэы Fa.fluor*вс«пв 533-56 в З.маг-ееяселв 345 наиболее активно гидродиэовали соевое маоло, а вв-долипаза - подсолнечное. Кроме того, вндолипаза по сравнению о , вкэоляпаэой S. шаге »ее en в 345 хуже гидродизовала кукурузное, соевое, льняное, горчвчное и, особенно, хлопковое мдсла. Лучший эмульгаторами для растительных масел, как показано вами, являются тритон Ï-IOO л гуммиарабик.

Лешаза Ре. fluor« ее впа 533-56 наиболее активно гидродизовала трилаурин среди испытанных синтетических твердых триглвцери-дов, а наиболее медленно - тристеарин (табл.З). Медленный гидролиз данного субстрата был отмечен и для экзол-пазы з.яахеееееп* 345. По сравнению с данными лшмземи гндоляпазэ э.ввгсеесепв 345 гидроляэовала синтетические твердые тряглицериды значительно быстрее. Так, например, тристеарин гидролизовался ею в 4-5 раз бнетрее по сравнения с 'акзолииазами Pe.flnoreecene 533-56 а 3.яагсево«пв 345.

Полученные данные представляй" большой интерес в связи о тем, что субстратнея спашфгчность бактериальных внутриклеточных лппаэ практически но изучена. Кроне того, имеющиеся в литературе данные по использовании твердых жиров я синтетических тр иглице-ридов, содержании наешцешшв жирные кислоты с длинной цепь», в качестве субстратов лялаз крайне разрозненны и малочисленны. Это, отчасти, объясняется тем, что дяя выявления лвнолнтичесяой активности необходимо приготовить эмульсию субстрата достаточно высокой степени дисперсности» поэтому отрицательный результат часто ножет бнгь следствием плохо'приготовленной гмульеви и яе

Таблица 2

Активность липаз ' Р». fluoreacena 533-56 0 8,»arce во ene 345 на различных растительных маслах

Субстрат ; Эмульгатор * А") : б**) : в">

2$ поливиниловый спирт 100 100 100

оливковое 2$ гуммиарабик - 129 167

масло 2$ желатина - 20 III

2$ тритон Х-100 - 100 14

2% поливиниловый сперт ¿а 94 56

кукурузное 10$ гуммиарабик 237 ИЗ

масло '2% желатина - 65 117

2$ тритон 2-100 - 54 17

2$ поливиниловый спирт 26 63 4

подсолнечное 10$ гуммиарабик - ПЭ 79

масло 10$ желатина - 90 5

10$ тритон Х-100 90 137 241

2% поливиниловый спирт - 113 6

соевое 10$ гуммиарабик 94 47 15

масло 10$ тритон Х-100 97 258 158

2$ тритон Х-100 - 479 236

10$ поливиниловый спирт - 232 85

льняное -2$ гуммиарабик 66 293 147

масло 10$ желатина - 75 36

2% тритон Х-100 ei 79 286

2$ поливиниловый спирт 23 23 30

горчичное 2$ гуммиарабик - 61 47

масло 10$ желатина - 80 44

10$ тритон Х-100 40 119 126

хлопковое масло 10$ тритон Х-100 184 57

ддя удобства сравнения лмюлитическую активность на оливковом масла, амульгированиом в '¿$-ном раствора поливинилового спирта, приняли за 1СШ.

А - intTiiBHDCTb акзолипазн Pe.fluoreeeena 533-56; Б - активность экчолипаэн 3,mape«ecene 345; В - активность энполвияаы з.»агс«вс«»в 345»

Знак - определение по природ.1 л vi,

Таблица 3

Активность лилаэ ** Рв.Пиогввовпв 533-66 и з.пягвяввапв 345 на различных синтетических -тригдяцэридах

Субстрат * Эмульгатор : : Б")

оливковое масло 2% поливиниловый спирт 326 630 780

2% поливиниловый спирт - 481 1740

трибутнрян 10% гуммиарабик $6 1541 2240

10% желатина — 203 2220

2% тритон Х-100 не 1470 1400

2% поливиниловый спирт - 129 1100

трвкапрош. 10% гуммиарабик - 1065 1220

2% желатина 71 518 . 860

10% тритон л-100 , 59 790 1340 '

10% поливиниловый спирт 200 . 73 273

трилаурвя 10% гуммиарабик - 220 707

105 желатина 207 689

10% поливиниловый спирт - 52 102

тримириотив 10% гуммиарабик - 208 698

10% желатина — 181 675

2% тритон 1-100 Х23 315 675

10% поливиниловый спирт 37 44 174 ■

трястеарин 10% гуммиарабик - 53 109

10% желатина 28 38 90

2% тритон 1-100 7 58

*) лиаолитяческая активность выражена в мкМ жирной кяолоты/мг белка-чао.

А - активность йкзолипазы Рв.Пиогееоепв 533-56! Б - активность окэолипазы з.пегоееевов 345; В - активность эндолиттазн з.пвговевепв 345.

Знак - определение не проводилось.

ьоегдз свидетельствует о тон, что тот или ивой микроорганизм не монет использовать испытываемого твердого субстрата.

Помимо синтетических твердых трнглицервдов, содержащих насыщенные жирные кислоты, в качестве субстрата дол препарата липазы Ра.Пиогввсеая 533-56 был испытан молочный кар (сливочное масло в оливки). Интересно, что препарат липазы активнее гидролизовал сливочное масло, эмульгированное в Ю^-ном растворе тритона 2-100 по сравнении с оливковым маслом.и испытанными твердыми синтети-^схши триглииеридами. Жир, содержащийся в сливках, также хорошо гидролиэовалея данным препаратом, особенно при использовании в качестве эмульгатора тритона £-100,

Как показали предварительные исследования, проведенные совместно о Институтом микробиологии им. А.КярхенштеЙна АН Датв.ССР (г.Рига) и Баускш комбинатом Латв.ССР, препарат лялазы Pe.fO.uo-гввовов 633-56 может быть использован для очистки сточных вод молочных заводов.

Изучение лмлолитического растепления твердых жиров приобретает в настоящее время большое значение в связи с проблемой очистки сточных вод и загрязнения окружающей среды. Способность полученных нами ферментных препаратов расщеплять наряду с растительными маслами также твердые синтетические я природные три-глицвряды представляет в связи с этим несомненный интерес.

Анализируя полученные данше, можно отметить, что между вк-аолипазами Рв.Г1иог«вс®па 533-56 и З.шагеевсвпв 345 выявлено большее сходство по ряду свойств (оптимум действия рН, влияние ионов металлов и хелатобразуоди реагентов, желчнакислых солей, большая специфичность к гидролизу триглицеридов ненасыщенных кислот), чем между экзо- и зндолипазой З.яагоевоепа 345,

ВЫВОДЫ

I, Исследовано 30 штаммов, относящихся К роду РееиЛошопав^ о целы) подбора активного продуцента липазы. С помощью ультрафиолетового облучения отобранного продуцента липазы ра.пивгве-««п» 533 был получен мутант, обладавший повышенной липолити-ческой активностью (мутант Ра,пиог«яс«пв 533-56). Подобраны оптимальные условии культивирования исходного штемма и получен-паю мутипта.

'¿, Нацелено и очии.уня экэодииазя Ре, Пиогевсепе 533-56.

Диск-злектрофорез в полиакрилашцшоы теле показал на возможную гомогенность препарата лияази. Определены молекулярный вео липазы (320000) и ее аминокислотный состав. Показано, что липаза F«. fluor«eoena 533-56 является гликопротеидом, что среди липаз, образуемых представителями рода Pseudomonas, обнаружено впервые.

3. Изучено влияние условий культивирования на биосинтез липазы штаммами 3,магеeocene 345 ж 348. Показана способность обоих штаммов в биосинтезу внутриклеточной к внеклеточной лвпаэ.

4. Исследованы различные методы выделения липазы из клеток з.м&хоежсвпа 345. Впервые показано, что наибольший выход внутриклеточной липазы наблюдался при инкубация клеточной суспензия з.иагоееовпе 345 о холатом натрия в концентрации 0,8^ в течение 30 минут при 37°.

5. Впервые выделена и очищена вндолипаза s.ma»eea«&« 345. Выделена и очищена также экзолипаза, образуемая данной культурой.

S. Изучены свойства липаз Pe.tt-uoreaaen« 533-56 к з.иаг- * оееоев* 345: влияние вонов металлов, некоторых ингибиторов и солей желчных кислот, действие температуры в pH. Отмечено большее сходотво в свойствах между екзолипазами Pa.fluor*eo«n« 533-56 и з.ввгеваивв» 345, чем между вкзолипазой в эндолипазой З.ивг-ееасепе 345.

7. Показана способность исследованных препаратов липаз гид-ролизовать различные растительные масла И синтетические тригля-цериды, состоящие из короткоцепочечных насыщенных жирных кислот, а также твердые триглицеридн, содержащие насыщенные жирные кислоты с длинной цепью, что может иметь большое практическое значение в связи с проблемой очистки оточных вод в загрязнения окружающей средн.

Материалы диссертации изложены в Следующих работах:

1. Северина Л.О., Башкатова H.A. "Влияние желчных кислот в их солей на лллолитЕческую активность микроорганизмов". Изв. высш.школы. Бяол.науки, 1975, 9, 91-99.

2. H.A.Башкатова, Л.О.Северина, Е,Л.Рубан. "Влияние солей желчных кислот на липолитическую активность некоторых бактерий". Изв. АН СССР, сер. бкологич., 1976, 2, 464-467.

3. Башкатова H.A., Л.О.Северкна. "Влрянив желчных кислот и кх солей на синтез и активность липаз некоторых бактерий".

В ed.: "Проблемы микробиологи ж вирусолог». 7-я конф. молодых ученых. Тезисы докладов", 1977. Изд. "Зиаатнв", Рига, III-112,

4, Башкатова H.A.. Северина Л.О. "Экзолидазы некоторых видов Ра«и<Цдеаае", Микробиология, 1978 , 4£, 2, 234-£40.

6. Башкатова H.A., Северина Л.О. "Выделение ферментного преаара-TQ липазы Fe#udo»on»e Пиогввввп» 533-56 л его характеристика". Прямадв.биохим. и микробиол,, 1976, ¿4, 6, 858-665.

6* Башкатова H.A., Северина Л.О. "Биосинтез и некоторые свойот-ва екзолшшзы Pseudomonas fluor» во» па 533-56", В об.; "2-я республиканская яаучно-теореткчеокая конференция молодых ученшс-микробкодогов. Тезисы докладов", 1978. Изд. "ФАН" . Узб.ССР, Ташкент, 37-38,

7. Северина £.0., Башкатова H.A. "Выделение и некоторые свойства липазы PMudosonaa fluor« ее* а в 533-56". В сб.; "Второе всесоюзное совещание по ферментам микроорганизмов. Тезисы докладов", 1978, ч.1. Минск, 177,

а. Башкатова H.A., Северина Л.О. "Влияние условий культивирования на биосинтез липазы двумя штаммами Serratia »агсево»п»«. Микробиология, 1979, £8, 5, 626-832.

9. Северина Л.О., Башкатова H.A. "Выделение и свойотва липазы Paaudoeona» fluor» eoeaa 533-56", Биохимия, 1979, 44. I, I16-124.

10. Северина Л.О», Башкатова U.A. "Выделение внутриклеточной липазы 3»rratta ■ar黫o»oa 345". Микробиология, 1979, 48, б, 994-998.

П. Северина Л.О., Башкатова H.A. "Внутриклеточная липаза serrait» »aroaaean* 345". В сб.; "2-я Всесоюзная конференция "Бвосинтэз и метаболизм лшидов у микроорганизмов. Тезисы докладов", 1979, Москва, 124-126.

12. Башкатова H.A. "Изучение внеклеточной триглицервдгвдролаэн Sarrati* магванаав 345, расщеЕшдалей эфиры насыщенных я ненасыщенных жирных кислот". В сб.; "Симпозиум молодых ученых-микробиологов. Тезисы докладов", 1979, Изд. "Зинатне", Рига, 11-12..

13. Северина Л.О., Башкатова H.A. "Выделение и свойства экзоли-ti33U Serratia asrceecene 345". Прикладн.биохим. и микро-био!.. 1900. 1, Т.:-79.

14. Башкатова H.A., Северяне Д.О. "Выделение и характеристика внутркклаточной лхааэн Serratia «are*воans 345". Прикладя. бяохим, к ижкро<5иол., 1980, 1 3% sis - эм ;

T-tfTttfo^QT Ц M. KCl ^M.t ¿HWi 1ДИ-1 Ф^рчмт ШхгЧ/Ш

1 ил<>г f>*j mt ЦЛГХНПЛ f>, \AffD гонь^нгякЛ о,