Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Летальные и генетические эффекты комбинированного действия излучений с различной ЛПЭ у клеток дрожжей

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Летальные и генетические эффекты комбинированного действия излучений с различной ЛПЭ у клеток дрожжей"

г Б Ой

- 3 ОПТ ''^Й'СИМСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИЦИНСКИЙ . РАДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

ПАХОМОВА Ольга Николаевна

ЛЕТАЛЬНЫЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ ИЗЛУЧЕНИЙ С РАЗЛИЧНОЙ ЛПЭ У КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ

(03.00.01 - радиобиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск - 1995

Работа выполнена в Медицинском радиологическом научно! центре РАМН.

Научный руководитель - кандидат технических наук Т.С.ЦыО

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В. Г. Петзн, доктор биологических наук Б. И. Сыйзнныс

Ведущая организация - Объединенный институт ядерны

. исследований (г. Дубна)

Защита диссертации состоится " 1995 т

в // час. на заседании диссертационного Совета Д 001.II.С в Медицинском радиолотическом научном центре РАМН (249020, I Обнинск Калужской обл., ул. Королёва, 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотек Медицинского радиологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан пЦ " г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук

В.А. Куликов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.-

Актуальность темы исследования. Проблема комбинированного действия излучений с различной ЛПЭ является одной из наименее изученных в современной радиобиологии. В работах, посвященных исследованию • этой проблемы, показано многообразие эффектов по тестам выживаемости и индукции мутаций, что в настоящий момент не позволяет сделать однозначных выводов о закономерностях действия излучений. Многообразие клеточных реакций, отчасти, обусловлено тем, что исследования выполнены в различных экспериментальных условиях, на разных клеточных системах, с привлечением разнобразных источников плотноионизирующего излучения. Помимо этого, авторы расходятся в подходе к анализу экспериментальных фактов с позиции аддитивного или с позиции независимого действия излучений, что в ряде случаев является определяющим для окончательных выводов о характере наблюдаемых закономерностей.

Основным предметом дискуссий по вопросу об особенностях комбинированного действия излучений является поблема взаимодействия повреждений, индуцированных разными видами излучений. Для анализа летальных эффектов, как правило, привлекаются данные об изменении размера плеча на кривой выживаемости. Однако, не менее интересные данные об изменении наклона кривых выживаемости не получили должного обсуждения в публикациях, несмотря на то, что это явление было показано для клеток млекопитающих и дрожжей (F.Q.H.Ngo et al., 1981; S.Suzuki, 1993; Т.С.Щб и соавт._, 1989 и др.). В предлагаемой работе мы уделяем особое внимание этому эффекту, поскольку он имеет значение, как для понимания механизмов действия излучений- разного качества, так и для практического применения комбинированного облучения в лучевой терапии.

Изучение закономерностей клеточных реакций при последовательном действии плотно- и редкоиокизирувдих излучений на одной клеточной системе с привлечением различных источников плотноиони-зируидего излучения позволяет оценить особенности -летальных и генетических эффектов при комбинированном облучении, что может найти практическое применение, . как теоретическая основа для разработки методов лучевой терапии, а такхе эти данные, могут приниматься во внимание при оценке генетической опасности такого рода воздействий. Вместе с тем, такие исследования позволяют

оценить механизмы взаимодействия излучений при смешанном их применении, что вносит вклад в разработку теоретических концепций природы синергизма и антагонизма.

Цель работы. Целью работы является изучение летальных и генетических закономерностей у диплоидных клеток дрокжей БассЬагсжусеа при последовательном облучении их плотно- и редкоионизирующим излучением и оценка влияния последовательности облучения, репарационных систем клетки, качества плотноионизирующего излучения и концентрации кислорода на эффекты комбинированного воздействия. Задачи исследования:

1. Изучить, как влияет последовательность применения плотноионизирующего излучения (а-частиц 239Рц, 0.85 МэВ быстрых нейтронов) и редкоионизируицего излучения (7-лучей о0Со, 20 МэВ электронов) на выживаемость и выход мутаций у диплоидных штаммов дрожжей.

2. Сравнить закономерности проявления летальных эффектов при использовании для комбинированного облучения а-частиц 239Ри и 0.85 МэВ быстрых нейтронов.

3. Исследовать влияние репарационных систем клеток на летальные эффекты последовательного облучения диплоидных клеток дрожжей плотно- и редкоионизирущим излучением.

4. Изучить, как эффекты последовательного гамма - нейтронного облучения зависят от концентрации кислорода.

Научная новизна. Впервые на одной клеточной системе, включающей радиочувствительные мутанты, выполнено комплексное исследование летальных и генетических закономерностей при последовательном облучении клеток плотно- и редкоионизирующим излучением, с одновременной оценкой влияния на конечный биологический эффект репарационных систем клетки и таких факторов, как последовательность применения излучений, величина дозы первого излучения, качество плотноионизирующего излучения, концентрация кислорода. Показано, что летальные эффекты комбинированного облучения клеток дрожжей дикого генотипа зависят от последовательности воздействия. При этом, дозы плотноионизирующего излучения, снижающие выживаемость до 20% и ниже, приводят к повышению радиорезистентности клеток к последующему воздействию редкоионизируицего излучения. Выраженность этого эффекта зависит от величины дозы первого плотноионизирующего излучения, качества плотноионизирующего излучения и генотипа клеток, не зависит от концентрации кислорода при

облучении. Предварительное облучение клеток изоэффективнкмп дозами редкоионизирущего излучения не влияет на чувствительность клеток к последующему воздействию плотноионизирующего излучения.

Впервые изучены закономерности индукции митотической сегрегации и митотического кроссинговера при комбинированном облучении с использованием различной последовательности и набора доз первого облучения. Показано, что индукция митотической сегрегации характеризуется только аддитивными эффектами и не зависит от последовательности облучения и величины первой дозы. Анализ данных по индукции митотического кроссинговера показал, что существуют как независимые, так и общие процессы, приводящие к митотическому кроссинговеру после индукции их альфа- и гамма- облучением. Практическая значимость работы. Результаты исследования могут быть использованы при разработке радиобиологических основ для новых методов и схем гамма - нейтронной терапии. Также они могут оказаться полезными для прогнозирования тяжести лучевых поражений или оценки генетической опасности при комбинированном облучении." Апробация работы. Результаты работы представлены в 7 печатных работах, а также доложены на VI Всесоюзном совещании по микродозиметрии (Канев, I989D и на семинаре КЕС "Молекулярные механизмы радиационного мутагенеза и карциногенэза" (Doowerth., Netherlands, 1993). Диссертация апробирована на научной конференции отдела радиационной биофизики МРНЦ РАМН 28 июня 1994 года. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения собственных исследований и выводов. Работа изложена на 149 страницах машинописного текста, иллюстрирована 34 рисунками и 10 таблицами. Библиографический указатель содержит 158 источников на русском и иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Для изучения закономерностей формирования летальных эффектов использовали диплоидные штаммы дикого генотипа XS800, M-I39B, L5, и штаммы, дефектные по репарации двойных разрывов: XS1898 (rad52-1/rad52-1), XS1988 (rad57-1/rad57-1)., ТЗ (rad54/rad54). Для учета частоты индуцированного мутагенеза был выбран штамм Т1(ПГ-154), который является компаундом по комплементирующим

аллелям гена ade2 и позволяет зарегистрировать суммарную частоту всех событий, ведущих к митотической сегрегации,и дифференцировать события рещшрокной рекомбинации (кроссинговера).

Б качестве источника а-частиц использовали г39Ри (ЛПЭ <* 130 кэВ/мкм, энергия частиц - 3.4 МэВ, мощность дозы - 25 Гр/мин). Источником быстрых нейтронов служил горизонтальный канал Б-3 реактора БР-Ю, расположеного на территории Физико - энергетического института (г. Обнинск). Средняя энергия нейтронов составляла 0.85 МэВ, ЛПЭ " 80 кэВ/мкм, мощность дозы - 1.9 - 3.8 Гр/мин, примесь 7-лучей в спектре 4.2%, средняя энергия которых близка к энергии 7-квантов боСо. Источниками редкоионизирущего излучения служили установки с б0Со: "Исследователь" и "Гамма- целл" (ЛПЭ <» 0.3 кэВ/мкм), а также линейный ускоритель электронов "ЛУЭ-25". Мощность дозы 7-квантов и электронов выбирали в зависимости от условий эксперимента и она вырьировала от 1.3 до 300 Гр/мин.

Эксперименты проводили в 3-7 повторностях по следующей схеме облучения: часть клеток облучали однократно дозой редкоионизирую-щего излучения, а затем возрастающими дозами плотноионизирующего излучения, при этом параметры полученных кривых выживаемости сравнивали с параметрами кривой плотноионизирующего излучения; другую часть клето^ облучали в обратном порядке - сначала, однократно, дозой плотноионизирующего излучения, а затем возрастающими дозами редкоионизиругацего излучения, в этом случае параметры полученных кривых сравнивали с параметрами кривой редкоионизирую-щего излучения. Время мезду облучениями составляло 60-90 минут при облучении нейтронами и 7-лучами (клетки находились при температуре тающего льда), 3-5 минут при облучении а-частицами и 7-лучами. В отдельных экспериментах, по условиям опыта, время между облучениями составляло I, 3, 5 и 20 часов. Для облучения быстрыми нейтронами брали водную суспензию клеток концентрацией Юб - Ю7кл/мл, для облучения 7-лучами - Ю6кл/мл. Ввиду малого пробега а-частиц (40 мкм в ткани), клетки облучали в монослое на поверхности водного агара. Все образцы облучали в строго определенном месте относительно пластины с гз9Ри.

Для определения летального эффекта клетки выращивали до стационарной стадии на поверхности косяков средой YEP (пептон 1%, дрожжевой экстракт 1.5%, глюкоза 2%, агар-агар 2%). Выживаемость определяли по формированию колоний на чашках со средой YEP

при 30°С на 7 день после облучения. Частоту мутаций определяли в соответствии с методикой, разработанной И.А. Захаровым (1979). Данные оценивали исходя из того, что распределение величин в каждой точке является биномиальным.

Для получения гипоксических условий герметичные флаконы с суспензией клеток Ю7кл/мл продували аргоном в течение 10 минут. Контроль гипоксических условий, а также измерение напряжения кислорода в суспензии до и после облучения делали полярографическим методом (Коваленко Е.А., 1975), используя электрод Кларка и калибровочные растворы фирмы Radiometer (Дания), показатели регистрировали с помощью ампер-вольтметра B7-2I, электрод был термостатирован при 30°С.

Для описания кривых выживаемости использовали многомишенную одноударную модель летального действия ионизирующего излучения: S(D)=1 -[1 -exp(-D/DQ)]n для однофазных кривых или S(D)=aM-(1-ехр(- D/D )П1 ¡+(1 -a)M-(1-exp(-D/Do2)n2] для двухфазных кривых. Оперировали параметрами :п1,п2 - экстраполяционные числа для первой и второй фаз кривых выживаемости; Dq1 . Do2- значения средних летальных доз для первой и второй фаз кривых выживаемости П - квазипороговая доза, характеризующая величину плеча и вычисляемая как D =in.n«Do ; а - коффициент, показывающий долю клеток, формирующих первую фазу кривой выживаемости. Оценка параметров кривых выживаемости поводилась для каждого эксперимента в отдельности и получена на основе моделирования выживаемости клеток методом Монте-Карло. Сравнение параметров моделей проводили по непараметрическому критерию Смирнова - Колмогорова (Э. Ллойд, У. Ледерман, 1989). Оптимальная модель подбиралась на основе дисперсионного анализа, с учетом коэффициента множественной корреляции и анализа остатков регрессии. Для отдельных параметров (ККУ) сравнение проводили по парному критерию Стьюдента (Э.Ллойд, У. Ледерман, 1989). Теоретические кривые были построены исходя из предположения об аддитивном действии излучений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Принято различать три типа суммарной реакции клеток на комбинированное воздействие: синергизм, аддитивность и антагонизм. Если наблюдаемые результаты не отличаются от рассчитанных по

предлагаемой гипотезе, то эффект оценивается как аддитивный. Если результаты отличаются от рассчитанных, то взаимодействие факторов оценивается как синергическое, когда наблюдаемый эффект больше расчетного, и как антагонистическое, когда эффект меньше расчетного. Однако, если облучение формирует неэкспоненциальную кривую выживаемости, то выявляется область данных, которая может трактоваться и как синергизм, и как антагонизм (в зависимости от того концепция независимости или аддитивности действия излучений используется для построения теоретической кривой). В нашей работе мы анализировали результаты, исходя из концепции аддитивного действия двух излучений, следуя определениям синергизма, антагонизма, аддитивности, рекомендованным комиссией МКРЕ (Доклад 30 МКРЕ, 1934). . '

Летальные эффекты последовательного действия альфа-частиц 239Ри, 20 МэВ электронов или гаиыа-кзантов б0Со. Эксперименты с последовательным облучением клеток штаммов дрожжей дикого типа а-части-цами и редкоионизирукщим излучением (электронами или 7-квантами) показали, что предварительное облучения клеток в дозах 100 Гр электронов или 25 Гр а-частиц и выие приводит к редукции плеча на кривой комбинированного облучения (рис. I, 2), что"согласуется с данными, опубликованными ранее другими исследователями (Р.О.Н.К^ ег а1., 1981; КЛ.МсИаНу ег а1., 1984, 1988 и др.).

Кроме того, было показано, что однократное облучение клеток плотно- или редкоионизирущим излучением в определенных дозах приводит к изменению их чувствительности к последующему воздействию излучения другого качества, что проявляется в изменении наклона, либо появлении локальных резистентных участков на кривых комбинированного облучения. Значительные модификации кривых выживаемости были получены при последовательности а-частицы + электроны (7-кванты). Облучение дозой 100 Гр а-частиц (Б=38Ж) (рис.2, кр. 4) приводило к тому, что все точки кривой комбинированного облучения оказывались в зоне антагонизма, относительно теоретической кривой, при этом наклон кривой не менялся (Б0комб./В0ел.= 0.97±0.05), а плечо было редуцировано (В комб./0 ел.= 0.48±0.25). Дальнейшее увеличение дозы а-частиц до 165 Гр и выше (Б« 12%) привело к повышению устойчивости клеток к последующему воздействию редкоионизирующего излучения, что выражалось в появлении резистентных "хвостов" (рис.3, кр.1; рис. 4, кр.1) или резистентных

Доза Л-частиц, Гр

О 200 400

Л (Х-частииы

■ 50 Гр электронов +■ СС-частииы

• 100 Гр злсктронов + {Х.частицы л 300 Гр электронов + Я-частицы □ 620 Гр электронов 4- &-частмцы В 1150 Гр электронов + СС-частицы

♦ 1750 Гр электронов+ частицы _ _ тсор. кривые

Рис. I. Кривые выживаемости диплоидных клоток дикого типа (КБвОО), облученных а-частицами и, последовательно, одной дозой электронов и возрастающими дозами а-частиц. Теоретические кривые построены в предположении аддитивного действия излучений.

Доза электронов , Гр 1000 2000

100- йс^з^сг-

О ЭЛЕКТРОНЫ

О 5 Гр ОС + электроны ® 25 Гр 01 + электроны x 100 Гр а + электроны с а 220ГР а + электроны

- _ ТСОН КРИВЫЕ

0.1

ади

Рис. 2. Кривые выживаемости диплоидных клеток дикого типа (ХБ800), облученных электронами и, последовательно, одной дозой а-частиц и возрастающими дозами электронов. Теоретические кривые построены в предположен»и аддитивного'действия излучений.

о

Доза электронов , Гр 1000 2000

г«

*

л

1- ю-

и

0

г

1ТЗ

о 1 -

56

л

ш

о.1:

0.01Н

о-о-ог

□

п \

е Ч-

о эпсктроны

О 165ГрЛ+ электроны О 240 Гр а + электроны •.300 Гр СХ+ электроны _ — тсор. кривые

х \С\2 *

Рис. 3. Кривые выживаемости диплоидных клеток дикого типа дав00), облученных электронами и, последовательно, одной дозой а-частиц и возрастающими дозами электронов. Теоретические кривые построены в предположении аддитивного действия излучений.

Доза электронов , Гр

500 1000 1500

0.01т

0.001

Рис. 4. Кривые выживаемости диплоидных клеток дикого типа (Ы139В), облученных электронами, и, последовательно, одной дозой а-частиц и возрастающими дозами электронов. Теоретические кривые построены в предположении аддитивного действия излучений.

участков на суммарной кривой выживаемости (рис.4, кр.2),часто кривые имели несколько резистентных участков и приобретали сложную осциллирующую форму (рис. 2, кр. 5,6; рис. 3, кр. 2,3). Этот эффект был показан для трех штаммов (ХБ800, М139В, 15) дикого генотипа. Эффект не был получен при обратной последовательности облучения (электроны (7-кванты) + а-частицы) при изоэффективных дозах первого облучения (рис. I, кр. 6,7).

При облучении клеток в последовательности электроны + а-частицы неинактивирующая доза 100 Гр электронов также приводила к уменьшению наклона кривой комбинированного облучения, ряд точек при этом попадал в зону антагонизма (рис. I, кр. 3). Эффект был показан в пяти экспериментах из шести, выполненных на штамме Х3800, и во всех трех экспериментах, выполненных на штамме М139В. Эта закономерность не была обнаружена при увеличении (ЗООГр) или уменьшении (50 Гр) первоначальной дозы электронов (рис. I, кр. 2, 4) , и при смене порядка облучения, когда неинактивирующая доза а-частиц (5 Гр и 25 Гр) предшествует дозам редкоионизирующего излучения (рис. 2, кр. 2,3), в этих случаях экспериментальные кривые полностью совпадают с теоретическими.

Таким образом, последовательное облучение клеток дрожжей дикого генотипа а-частицами и электронами (7-квантами) показало, что в зависимости от последовательности воздействия и величины дозы первого облучения может повышаться устойчивость клеток к второму облучению.

Летальные эффекты последовательного действия 0.85 МэВ нейтронов и 20 МэВ электронов или гамма-квантов ®°Со и их модификация кислородом. Дальнейшая работа была выполнена для того, чтобы выяснить, какие закономерности имеют место при комбинированном гамма- нейтронном облучении и как они коррелируют с теми, что описаны для последовательного облучения а-частицами и редкоионизирующим излучением.

При последовательности облучения 7-кванты + нейтроны при всех дозах первого облучения наблюдался аддитивный, либо незначительный синергический эффект. Облучение в обратной последовательности показало значительную модификацию кривой выживаемости относительно теоретической кривой, причем характер этой модификации зависел от величины дозы нейтронов (аналогично .ситуации с использованием а-частиц). Во всех четырех экспериментах с дозой

нейтронов 240 Гр, снижающей выживаемость до 20-30%, кривые комбинированного облучения имели резистентный "хвост", при этом часть кривой попадала в зону антагонизма. Доза нейтронов 480 Гр (3= 0.8-2%) приводила к формированию обычных (однофазных) кривых выживаемости, во всех шести экспериментах кривые имели меньшее плечо (в некоторых экспериментах не имели его совсем), 'а в пяти из них - меньший наклон,чем кривые гамма- облучения (табл.1), при этом все точки этих кривых лежали в зоне антагонизма.

Таблица I.

Показатели экстраполяционного числа и средней летальной дозы для клеток штамма М139В, облученных 7-квантами (электронами) и последовательно 480 Гр нейтронов, а затем 7-квантами или электронами

* Б комб.

эксп.облуч. пт(эл>) -пкомб. Во7(эл.)Гр ГГтТвлТ)

I. н+7 1.6 ± 0.2 2. Л ± 0.6 320 + 11 396* ± 4 1.24

2. н+7 II 3 I. .1 0.1 158 ± 7 251* ± 10 1.58

3. н+7 6.1 ± 1.5 I. .0 ± 0.01 190 + 8 212* + 4 1.12

4. н+э 6.5 + 1.7 I, .0 0.01 167 ± 6 253* + 10 1.51

5. н+7 9.9 + 1.7 5, .0 ± 1.2 207 + 4 217 ± 10 1.04

6. н+7 3.8 £ 0.1 I .3 ± 0.3 321 ± 12 363* ± 19 1.13

* - показатели' В ' кривых комбинированного облучения, отличающиеся от Бо кривой гамма (электроны)-облучения с рф.05.

Таким образом, при последовательном гамма-нейтронном облучении клеток дрожжей дикого генотипа, также как и при последовательном облучении этих клеток а-частицами и редкоионизируюшим излучением, было показано, что определенные добы плотноионизирующего излучения повышают резистентность клеток к последующему воздействию редкоионизирующего излучения. Однако, нейтронное облучение никогда нэ приводило к формированию осциллирующих форм кривых выживаемости, что было характерно для экспериментов с использованием а-частиц.

Для сравнительной оценки летальных эффектов комбинированного действия излучений в гипоксии и обычных газовых условиях было выполнено четыре эксперимента со следующими дозами первого

облучения: 1100 Гр электронов (Э=3-6%) и 380 Гр нейтронов (3=4-6%). Все кривые выживаемости были однофазными и хорошо описывались многомишенной одноударной моделью.

В экспериментах, где за одной дозой электронов следовали возрастающие дозы нейтронов, независимо от насыщения суспензии кислородом, эффект комбинированного действия можно охарактеризовать как аддитивный или слабый синергический (рис. 5А), при этом значения ККУ не изменялись в сравнении с нейтронным облучением (ККУ = I Л8±0.15; ККУа„ = 1.19+0.11).

Н ЭЛ«тИ

Для обратной последовательности облучения (нейтроны + электроны) при любых уровнях концентрации кислорода наблюдали антагонистический эффект, который проявлялся в уменьшении наклона кривых комбинированного облучения в сравнении с кривой облучения электронами (рис.БВ, кр.3,4,5,6). Антагонистический эффект был выражен более резко, если второе облучение проводилось в гипоксических условиях (Бон+вл./Боэл.=1.33+0.12 обычные условия; И0н+ел./Вовл. = 1.63+0.31 гипоксия).-Величина ККУ при комбинированном облучении была несколько выше, чем при облучении только электронами (ККУ8Л_= 1.68+0.17; ККУн+эл>= 2.03+0.12).

Анализируя результаты последовательного облучения клеток дрожжей нейтронами и 7-квантами, мы допускали, что одной из причин, приводящих к повышению радиорезистентности клеток дикого генотипа при последовательном нейтроны + гамма облучении может быть низкая концентрация кислорода в клетках в результате его выжигания в процессе первого (плотноионизирующего) облучения. Поэтому в ряде экспериментов было измерено напряжение кислорода непосредственно в водной суспензии клеток (до и после облучения) в условиях обычного насыщения суспензии кислородом, а также в гипоксических условиях. В результате чего оказалось, что после облучения нейтронами в дозе 380 Гр напряжение кислорода в воде и водной суспензии клеток уменьшается на 5-8Ж, что явно недостаточно для создания гипоксических условий.

Таким образом, в этой серии экспериментов с облучением клеток в гипоксических условиях, еще более четко обозначилось влияние последовательности воздействия двух излучений различного чества на конечный эффект. Более эффективным для инактивации диплоидных клеток дикого типа, облученных в гипоксических условиях, также как и для клеток облученных в обычных кислородных

Доза нейтронов , Гр

О 300 600 900

100 -

и о X ы лз

о *

3 ш

10-

0.1 -

0.01 -

0.001 ■

Доза электронов , soo юоо

н

□ нейтроны R нейтроны * л I1D0 Гр эл.+нейтр. а.(1ю0гр эл.+нсйтр.)'* - — ТЕОРЕТИЧ. кривые

$ гипоксия

о электроны

♦ электроны*

О 380 Гр нсйтр.+эл. ® ЗВО Гр нсйтр.*+э/|.

• «ЗВОГр н1йтр.+эл.)* в ЗВО Гр нейтр.+эл.*

— — теоя. кривые

* гипоксия

Рис. 5 (А, Б). Кривые выживаемости диплоидных клеток дрожжей дикого типа (И 139В), облученных нейтронами и, последовательно, одной дозой 7-квантов и возрастающими дозами нейтронов (А), а также, 7-квантами и, последовательно, одной дозой нейтронов и возрастающими дозами 7-квантов (Б) в гипоксических и обычных условиях. Теоретические кривые построены в предположении аддитивного действия излучения.

о

условиях, является последовательность, когда излучение с низкой ЛПЭ действует первым.

Влияние экспериментальных условий и других факторов на закономерности последовательного облучения клеток дрожжей дикого генотипа. Мы проверили ряд предположений, высказанных в литературе, и наши собственные, которые объясняли так или иначе причину повышения устойчивости клеток к ионизирующему излучению в процессе комбинированного облучения. Первым из них было предположение о существовании фракции, резистентность которой генетически закреплена и появилась в результате мутирования отдельных клеток в процессе облучения (Е-МоизгассМ., 1962), либо является результатом нормальной вариабельности штамма по этому признаку. Было выделено 38 клонов из резистентного "хвоста" и проверены на радиочувствительность к редкоионизирующему излучению. Ни одна из проверенных колоний не отличалась по радиочувствительности от исходной культуры. Предположение о том, что клетки, облученные высокими дозами а-частиц и нейтронов выделяют в среду вещества, являющиеся радиопротекторами (К.Тобайс, 1961), также не подтвердилось в экспериментах. Индуцированная резистентность не выявляется, если клетки облучали последовательно двумя дозами одного и того же излучения: только плотноионизирующего или только редкоионизирующего, интервал времени между дозами составлял 3 мин. и 2 часа (клетки выдерживали в дистиллированной' воде при комнатной температуре). Мы допускали, что суммарный эффект последовательного облучения может зависеть от интервала•времени между облучениями и температуры, при которой клетки выдерживаются в промежутке между облучениями. ■ Оказалось, что повышение резистентности клеток происходит одинаково хорошо., в интервале от 3 мин. до 5 часов между облучением а-частицами и 7-лучами, при комнатной температуре и при 0°С. Это. указывает на то, что способность клеток быть менее чувствительными к редкоионизирующму излучению формируется в течение более короткого интервала времени, чем это было исследовано, либо в процессе воздействия первой дозы плотноиоизирующего излучения. При этом, может иметь практическое значение тот факт, что способность клеток противостоять последующему редкоионизирующему облучению сохраняется длительное время, даже при 22 часовом интервале между облучениям кривая выживаемости имеет" резистентный "хвост", несмотря на

заметную модификацию восстановлением в непитательной среде.

Таким образом, ни одно из выше названных предположений не смогло объяснить индуциованной радиорезистентности при комбинированном облучении диплоидных клеток дрожжей дикого радиационного генотипа.

Летальные эффекты последовательного действия плотно- и редкоиони-зируадего излучений у радиочувствительных штаиыов дрожжей. Результаты наших экспериментов могут означать, что при комбинированном воздействии формируется меньшая доля потенциально- летальных повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться в пострадиационный период, чем при облучении только редкоионизи-руюцим излучением. Также возможно, что индуцированная резистентность в клетках является результатом повышения эффективности работы репарационных систем, либо индукции новой системы, поэтому одним из направлений работы стало исследование закономерностей последовательного облучения клеток плотно- и редкоионизируидим излучением у мутантов, дефектных по различным путям репарации радиационных повреждений.

Штамм ХБ1898 (га352/гай52) показал аддитивный эффект при последовательном облучении 7-квантами, а затем нейтронами, и синергический (Бокомб./Бо^ = 0.73±0.03 <1, р<0.01) при обратной (нейтроны + 7-кванты) последовательности. Облучение клеток этого штамма а-частицами и 7-квантами показало аддитивный эффект независимо от последовательности облучения. Поскольку репарация двойных разрывов ДНК у этого штамма блокирована и отсутствует ее вклад в конечный эффект, то разница в эффектах комбинированных облучений с использованием различных видов плотноиониирующего излучения, по-видимому, обусловлена разницей в характере самих радиационных повреждений, индуцированных а-частицами и нейтронами, либо разницей в их взаимодействии с повреждениями, индуцированными 7-квантами. При последовательном облучении нейтронами и 7-квантами клеток штамма ТЗ (гай54/гай54), у которого блокирована рекомбинационная репарация, эффект не зависел от величины дозы первого облучения и оценивался, как синергический при последовательности 7-кванты + нейтроны и как аддитивный при последовательности нейтроны + 7-кванты. У штамма Х31988 {гай5Т/га057), у которого частично блокирована репарация ДР и не утрачена способность к пострадиационному восстановлению, при облучении дозой электро-

нов, а затем а-частицами показан аддитивный или слабый синергиче-ский эффекты, а при смене последовательности облучения наблюдаемые эффекты походили на те, которые были зарегистрированы для штаммов дикого генотипа. Для относительно невысокой дозы первого облучения а-частицами (23Гр, Б=60%) наблюдаемый эффект оценивался как аддитивный, с ростом дозы первого облучения до 190 Гр (5=1.2%) и выше наблюдали защитный эффект, который выражался либо в уменьшении наклона кривой комбинированного облучения, либо в появлении плеча и резистентных "хвостов", при этом практически все точки кривых комбинированного облучения лежали выше т:оретической кривой, т.е. в зоне антагонизма.

Таким образом, в результате этой серии экспериментов было выяснено-, что летальные эффекты последовательного действия плотно- и редкоионизирующего излучения зависят от способности клеток восстанавливаться ог радиационных повреждений, продукты генов га/352 и гас154 участвуют в формировании эффекта индуцированной резистентности, наблюдаемого при комбинированном облучении диплоидных клеток дикого генотипа.

Мутагенный и реконбинагенный эффекты последовательного действия альфа-частиц ^Ртд и гамма-квантов б0Со. В результате проведенных исследований было сделано предположение, что индуцированная радиорезистентность, показанная при последовательном облучении клеток дрожжей дикого генотипа, может быть в значительной степени обусловлена процессами рекомбинационной репарации, потому что, во-первых, была показана связь этого эффекта со способностью клеток восстанавливаться ог радиационных повреждений, а репарация двойных разрывов ДНК в дрожжевых клетках осуществляется, в основном, по рекомбинационному механизму (А.М.ЬисЬпИс ег а1. 1977); во-вторых, этот эффект отсутствовал у штаммов, гомозиготных по мутациям го£52, гай54, с блокированной межгенной и внутригенной рекомбинацией (Т.3аек1 ег а1., (980). Поэтому следующий этап работы был выполнен для того, чтобы проследить закономерности индукции митотического кроссинговера (реципрокной митотической рекомбинации) после комбинированного облучения клеток а-частицами и 7-квантами и их связь с последовательностью облучения и величиной первой дозы. Кроме того, информация о мутагенной (митотичес-кая сегрегация) и рекомбинагенной (митотический кроссинговер) активности клеток при комбинированном облучении представляет

не-

самостоятельную ценность, поскольку отражает степень генетической опасности этого вида воздействия.

Облучение клеток штамма TI а-частицами и 7-квантами показало увеличение частоты выхода митотической сегрегации с дозой, получаемая зависимость хорошо экстраполировалась линейно- квадратичным выражением aD+bD2, коэффициенты которого представлены в таблице 2. По этому тесту а-частицы оказались в 3.0-3.3 раза более эффективны, чем 7-лучи, что согласуется с литературными данными о том, что плотноионизирующее излучение индуцирует больший выход мутаций, чем'редкоионизирующее (M.M.S.Murthy et al.,1975; M.R.Ra-Ju et al., 1971; P.Unrau, 1986; D.J.Chen et al., 1984). Комбинированное облучение не выявило каких либо отклонений от теоретически ожидаемых кривых, построенных в предоложении аддитивности действия излучений. Эффект был аддитивным независимо от последовательности облучения и величины первой дозы.

Таблица 2.

Значения коэффициентов линейно-квадратичной зависимости частоты выхода митотической сегрегации от дозы у штамма TI

Вид Значения коэффициентов

воздействия а b г

а-частицы 0.062 г 0.0057 -6.8.I0-5 ± 1.3Л0"5 0.974

7-кванты 0.020 ± 0.0015 -6.5*Ю_б 1 1.0*Ю~б 0.979

г- коэффициент множественной корреляции.

Форма кривой дозовой зависимости частоты митотического кроссинговера (МК) носила более сложный характер: сначала наблюдали рост числа кроссоверных клеток в дозовом диапазоне, соответствующем плечу на кривой выживаемости, максимум соответствовал дозам 345 Гр 7-лучей и 100 Гр а-частиц и после, этого следовало снижение эффекта. И хотя нет достоверной разницы в абсолютных значениях максимальных величин МК, но значения выхода кроссинговера, предшествующие максимуму и следующие за ним, достоверно выше у кривой облучения а-частицами, т.е. а-частицы более эффективны в отношении индукции МК, чем 7-кванты. Закономерности индукции МК при комбинированном облучении предста-

влены на рисунке 6(А,Б). Не было обнаружено специфического повышения рекомбинагенной активности при облучении в последовательности а-частицы + у-кванты, которая приводила к модификации кривых выживаемости, также не выявлено каких- либо иных закономерностей, связанных с последовательностью облучения. Однако мы не можем сделать однозначного • заключения, что система рекомбинационной репарации не участвует в формировании эффекта индуцированной резистентности, показанного выше, так как несмотря на общность молекулярных процессов, лежащих в основе митотической рекомбинации и рекомбинационной репарации, однозначная связь между ними до сих пор не установлена.

Представляет интерес эффект увеличения частоты митотического кроссинговера при комбинированном воздействии с дозами первого облучения 870 Гр 7-квантов и 250 Гр а-частиц, которые снижали выживаемость до 14-20%. Вместо ожидаемого снижения частоты кроссинговера с ростом дозы, наблюдается ее подаем, т.е. как бы включается независимая (или невостребованная) система индукции событий кроссинговера, определяемая вторым облучением, поскольку характер получаемой при этом кривой и максимальное значение частоты кроссинговера, соответствуют тому, что было получено для второго облучения. Эффект был выявлен для обоих последовательностей облучения, и, по-видимому, не он лежит в основе индуцированной резистентности клеток. Однако, это явление интересно само по себе, так как позволяет сделать предположение о существовании независимых путей, приводящих к реципрокной митотической рекомбинации после облучения клеток а- частицами или 7- квантами. В основе этой независимости может лежать как различная молекулярная структура повреждений, индуцируемых радиацией с различной ЛПЭ, так и наличие различных путей репарции этих повреждений.

Таким образом, было показано, что комбинированное облучение по суммарному показателю мутаций, индуцированных в аллелях гена ADE2, не привносит ничего нового, по сравнению с облучением а-частицами или 7-квантами в отдельности. Однако, мы не проводили более тщательного анализа мутаций, и допускаем, что за счет более разнообразной пораженности генома, как это было показано в работе И.Д.Александрова и соавт. (1989), комбинированное облучение может быть более опасным по генетическим последствиям, чем плотно- и редкоионизирующее излучение в отдельности.

3 1

я} о. ы

ш о

о 2 <-

Л (14.5 Гр) +■ » л (50 Гр) + г А (250 Гр) + «

--- £-квамты

Гр, ¡( — кванты

100

200

300

Гр, Л—частицы

0

И

■5 л

«о а

з-

а

0 1_ X

1

и и о

а 91

0J

Гр.¡{-кванты

О

100

200

300 Гр» А-частицы

Рис. 6 (А, Б). Дозовая зависимость частоты митотического кроссинговера для диплоидных клеток дрожжей дикого генотипа (Г1), облученных 7-квантами и а-частицами, а также,, последовательно, одной дозой а-частиц, а затем различными дозами 7-квантов (А), либо одной дозой 7-квантов, а затем различными дозами а-частиц (Б). * - достоверное отличие от точек кривой облучения 7-квантами (р^ 0.05).

ВЫВОДЫ

1. Однократное воздействие альфа-частиц 239Ри или быстрых нейтронов на диплоидные клетки дрожжей, в дозах, сштаающих выживаемость до 15-1« повышает резистентность клеток к последующему воздействию излучений с низкой ЛПЭ. Характер модификашш кривых выживаемости при этом зависит от величины дозы первого шютноионизирующего излучения и отличается для альфа-частиц и быстрых нейтронов.

2. Однократное воздействие редкоионизирувщих излучений в дозах, сшиаюкдах выживаемость до 15-1% не модифицирует чувствительность клеток к последующему воздействию тонизирующего излучения с высокой . ЛПЭ. Индуцированная резистентность не обнаруживается, если последовательное облучение проводится с использованием только редко- или только плотноионизируищего излучений.

3. Способнось клеток повышать резистентность к редкоионизирующему излучению возникает во время облучения нлотноионизирующюл излучением или в первые несколько минут (0-5 мин.) после него и сохраняется в клетках длительное время, по крайней мэре, в течение 5 часов.

4. Повышение радиорезистентности при последовательном воздействии ИИ с разной плотностью ионизации происходит при участии репарационных систем клетки.

5. Индуцированная резистентность не зависит от кислородных условий облучения и обнаружена, если клетки облучаются в гшоксических и в аэробных условиях.

6. Генетические эффекты последовательного облучения клеток дрожжей дикого генотипа не зависят от последовательности применения альфа-частиц и гамма-квантов.

7. Не обнаружено повышения рекомбинагенной активности клеток при последовательном облучении их плотно-, а затем редкоионизирущим излучением.

8. Механизмы формирования митотического кроссинговера имеют как общие, так и независимые пути, индуцируемые альфа-частицами и гамма-квантами.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Цыб Т.е., Кабакова Н.М., Пахомова О.Н. Реакция клеток дрожжей Saccharomjcea на комбинированное воздействие ионизирующих излучений с различной ЛПЭ // I Всесоюзный радиобиологический съезд: Тезисы докладов. - Пущино, 1989.- Т. 4.- C.II0I4-I0I6.

2. Цыб Т.е., Гуляев В.А., Кабакова Н.М., Пахомова О.Н. Особенности гибели дрожжей Socchoromycea cerevlalœ при последовательном воздействии 20 МэВ электронов и быстрых (0.85 МэВ) реакторных нейтронов (на клеточном и субклеточном уровнях)// Материалы VI Всесоюзного совещания по микродозиметрии: Тезисы докладов. Москва, 1989.- С.159-160.

3. Цыб Т.О., Кабакова Н.М., Пахомова О.Н. Летальные эффекты последовательного действия быстрых (0.85 МэВ) нейтронов и 20 МэВ электронов на дрожжевые клетки // В сб.: Нейтроны и тяжелые заряженные частицы в биологии и медицине.- Обнинск, 1989.-С. 64-67.

4. Пахомова О.Н., Цыб Т.С., Филимонов А.С. Мутагенный эффект комбинированного облучения альфа-частицами 239Pu и гамма-лучами б0Со клеток дрожжей Socchoromycea по тесту индукции митотического кроссинговера// Радиобиологический съезд: Тезисы докладов. -Киев, 1993.- Т.2.- С.776-777.

5. Цыб Т.е., Пахомова О.Н., Филимонов А.С. Модификация радиочувствительности диплоидных клеток дрожжей Socchoromycea cerevlalœ малыми дозами 'ионизирующих излучений с различной ЛПЭ при комбинированном облучении// Радиобиологический съезд: Тезисы докладов. - Киев, 1993.- Т.З.- C.I088- 1089.

6. Pakhomoya O.N., Tsyb T.S. Mutagenous effect and the mitotic crossing-over Induction In yeasts under combined exposure to alpha-particles and gamma-rays// In: Molecular mechanisms In radiation mutagenesis and carcinogenesis.CEC.- 1994.- P.203- 207.

7. Tsyb T.S., Pakhomova O.N. low dose Is the modified factor by combined effects of radiation with different LET at eucarlotlc cells// In: 2nd Internat. Conference "Radiobiological consequences of nuclear accidents", 25-26 October, 1994, Abstracts. -Moscow - 1994. - V.2. - P.287.

Формат 60*9Q 1/16, Бумага офсетная. Печать офсстная. .

Уч.-изд. л 10 Тирах 400 31.3. Зах. № ici

Отпечатано 9 типографии государственного предприятия " Вининг" 249020, г. Обиинсх Калужской обл., ул. Курчатова, 21