Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Лектины картофеля и их участие во взаимоотношениях картофеля и возбудителя фитофтороза PHYTOPHTHORA INFESTANS

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Лектины картофеля и их участие во взаимоотношениях картофеля и возбудителя фитофтороза PHYTOPHTHORA INFESTANS"

Академия Наук СССР Ордена Ленина Институт биохимии им А. Н. Баха

На правах рукописи

ШУВАЛОВА Елена Петровна

УДК 577.352.333:581.2

ЛЕКТИНЫ КАРТОФЕЛЯ И ИХ УЧАСТИЕ ВО ВЗАИМООТНОШЕНИЯХ КАРТОФЕЛЯ И ВОЗБУДИТЕЛЯ ФИТ0ФТ0Р03А PHYTOPHTHORA INFESTANS С 03.00.04. - биологическая химия )

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1991

Работа выполнена в лаборатории иммунитета растений Института биохимии им.А.Н. Баха АН СССР.

Научные руководители : доктор биологических наук, профессор

Салькова Е.Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Озерецковская 0.Л.; кандидат биологических наук Аксенова В.А.

Ведущая организация - Главный Ботанический сад АН СССР

Защита диссертации состоится Zf UC&rfl 1991г. в 10 часов на заседании специализированного совета К 002. 96.01 по присуждена ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха АН СССР С 117071,г.Москва, Ленинский проспект, д.ЗЗ, корп.2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологичесш литературы АН СССРС117071,г.Москва, Ленинский проспект,д.33,корп.:

Автореферат разослан f3 ^tfUU4 1991г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Молчанов М. И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение механизмов распознавания чтением-хозяином патогенных микроорганизмов является ключевой эблемой защиты растений от инфекционных заболеваний и необходимо я понимания природы устойчивости растений и возможности ее вышения [Метлицкий,Озерецковская,1984; Метлицкий, 1987; llow,1984]. Согласно современным представлениям характер аимоотношений растения и патогенного микроорганизма определяется зцифическим взаимодействием белковых рецепторов

гоплазматической мембраны растительной клетки и клеточно-поверх-:тных компонентов патогена [Дьяков,Терехова,1981; Etzler,1981; [low,19841. Возможно,что роль рецепторов играют лектины ,zler,19811. Участие фитолектинов во взаимоотношениях растений с стериями изучается на целом ряде систем. Например, колонизация 5овых азотфиксирующими бактериями рода Pdzobium. инициируется пзыванием лектина корневых волосков растения с ¡точно-поверхностными полисахаридами бактерий. Это приводит к ¡витию бактероидов и симбиозу [Dazzo, 1981]. При заражении :тений бактериями их связывание происходит также при посредстве ■олектина и является первым и необходимым этапом включения 1итных реакций растений [ Woods, 1979;Sequeira,1985 ].

Значительно меньше данных об участии лектинов во [имоотношениях растений и паразитарных грибов. Есть сведения о ¡зывании лектина зародышей пшеницы с клеточными стенками грибов choderma viride и Fusarium solani [Mirelman,1975] и об участии :тин-углеводного связывания при инфицировании батата штаммами ба Ceratocystis fimbriata [Uritani,19791. Анализ литературы воляет заключить, что при инфицировании растения

роорганизмами вполне вероятен межклеточный контакт партнеров

посредством лектин-углеводного взаимодействия. Такой конт является необходимым и инициирующим фактором развития их дальней! взаимоотношений. Однако, конкретных экспериментальных данных лектинах-рецепторах растительной клетки и их роли в распознава! хозяином патогенных микроорганизмов пока не имеется.

Система клубни картофеля - гриб-патоген РЛ_у£орЛгЬога т}еэи является не только практически важной,но и удобной моделью ) изучения процесса распознавания растением патогена. Известно, 1 для фитофторы характерно наличие специализированных рас, поражаю! одни сорта картофеля (совместимость) и не поражающих дру1 Снесовместимость). Устойчивость картофеля к фитофторозу основана реакции сверхчувствительности ССВЧ) - быстрой гибели растителы клетки вместе с проникшим в нее патогеном.

С помощью электронной микроскопии показано, что г фитофторозе картофеля инфекционная гифа гриба разрушает стеь растительной клетки и входит в прочный контакт с ее плазмалем* [Топц.уата,1973; Проценко,19781,что характерно как для устойчивой так и для восприимчивой комбинации раса-сорт и является необходим фактором включения реакции СВЧ хозяина.

По данным №эгие[1980] из 30 различных соединений только спей фический гаптен лектина картофеля подавлял связывание плазмалеы клеток картофеля с поверхностью инфекционной гифы гриба и при эт ингибировал реакцию СВЧ. Эти данные позволяют предположить,что ра познавание картофелем возбудителя фитофтороза и включение защити реакций хозяина происходит в результате прочного контакта плазм леммы растительной клетки с поверхностью инфекционной гифы гриб по-видимому, посредством лектин-углеводного взаимодействия.

Цель и задачи исследования. Изучить взаимодейств изолированной плазмалеммы из клеток клубней картофеля с клеточн

поверхностными метаболитами гриба Р. ш/езЬапБ и роль фитолектинов в этом взаимодействии.

Поэтому в задачу нашей работы входило:

1) выделить и охарактеризовать водорастворимый лектин картофеля;

2) из паренхимной ткани клубней картофеля получить фракции, максимально обогащенные фрагментами цитоплазматической мембраны как нативной,так и "сенсибилизированной" раневым стрессом;

3) исследовать структурно-функциональные характеристики растительной плазмалеммы и влияние на них раневого стресса, повышающего устойчивость картофеля к фитофторозу;

4) методом осмотического шока выделить клеточно-поверхностные метаболиты мицелия возбудителя фитофтороза и охарактеризовать их;

5) выявить наличие и изучить взаимодействие плазмалеммы клеток и пектина картофеля с гликоконьюгатами гриба и олигомерами 1Т-ацетил-глюкозамина С61сКАс) с помощью флуоресцентной метки, по изменению лектиновой активности препаратов под действием углеводсодержащих веществ и методом иммуноферментного анализа.

Научная новизна работы. Показано, что взаимодействие мембранного лектина картофеля с углеводными лигандами клеточных компонентов гриба как в устойчивой, так и в восприимчивой к заболеванию комбинации раса гриба - сорт картофеля определяется их специфическим связыванием. Изучение структурных и функциональных изменений в цитоплазматической мембране хозяина в условиях раневого стресса, вызывающего переход клетки из нативного состояния восприимчивости в "активное" состояние устойчивости к заболеванию показало,что такая перестройка связана с повышением проницаемости мембраны, активацией синтеза мембранных белков, увеличением "текучести" липидного матрикса и вследствие этого увеличением количества лектиновых сайтов на мембране и их доступностью.

Исследование антигенных свойств лектина с применение иммуноферментного анализа показало, что воздействие специфически углеводсодержащих компонентов гриба на лектин картофеля усиливав его антигенные свойства, что, вероятно, связано с процессам специфического узнавания при фитофторозе картофеля.

Практическое значение работы. Результаты исследовани открывают новые подходы для разработки практических методов защит картофеля от фитофтороза на основе применения экологически чисть; соединений, подобных хитозану. Научной основой таких методов може служить взаимодействие олигомеров М-ацетилглюкозамина и хитозаноЕ которые, связываясь с пектином картофеля, способствуют повышени функциональной активности ткани картофеля, активаци неспецифического механизма устойчивости растения к неблагоприятно), воздействию окружающей среды,в том числе и к инфицировав патогенными микроорганизмами.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложе> на Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Тбилис1 1987), на всесоюзном совещании "Физиолого-биохимические осно! иммунитета растений к грибным болезням для целей прикладнс селекции"СУфа,1988), на международной конференции "1п1ег1ес-11 (Тарту,1989).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных рабо1:

Структура и обьем диссертации. Диссертационная работа состо! из введения, обзора литературы, описания материалов и метод! исследования, изложения полученных результатов и их обсуждение заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена 1 страницах машинописного текста, иллюстрирована 19 рисунками и таблицами. Список литературы включает ив наименований,в т< числе £<? иностранных.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы исследования.

Объектами исследования служили клубни картофеля сорта Янтарный, хранившиеся после уборки в темноте при температуре +4°С, и две расы возбудителя фитофтороза Р. infestans - совместимая и несовместимая.

Водорастворимый лектин картофеля (STA) выделяли из клубней картофеля с использованием аффинной хроматографии на хитине и гель-фильтрации на сефадексе G-75.

Лектиновую активность препаратов определяли в реакции агглютинации нативных эритроцитов кролика в стерильных полистироловых планшетах для иммунологических реакций с круглодонными лунками. За титр агглютинирующей активности препарата принимали минимальную концентрацию белка, вызывающую заметную агглютинацию клеток.

Препарат плазмалеммы выделяли из паренхимной ткани клубней картофеля путем очистки микросомальной фракции в градиенте плотности сахарозы. Ранее было показано, что полученный таким образом препарат содержит не менее 83% везикул цитоплазматической мембраны ГКораблева и др. ,19801.

Гриб Р. infestans культивировали на овсяно-агаровой среде и жидкой картофельно-минеральной среде. Осмотический шок осуществляли при обработке мицелия раствором KCl (4,82 М) [Терехова,Дьяков,1980], после чего раствор концентрировали в вакуумном роторном испарителе и обессоливали гель-фильтрацией на сефадексе G-75.

Пришивание флуорохрома к- гликоконыогатам гриба осуществляли по методу Белдера [de Beider,1973].

Выделенный водорастворимый лектин картофеля использовали в

качестве антигена для иммунизации кролика. Иммунизацию кролике осуществляли подкожно в 6 точек вдоль спины t Гнутова,1985! Иммуноглобулиновую фракцию (IgG) осаждали из сыворотки сульфатс аммония. Аффинную очистку антител проводили на водорастворим! пектине картофеля CSTA), иммобилизованном на BrCN-сефарозе-' [Березин,19761. Коньюгаты IgG и STA с пероксидазой хрена получа] ковалентным связыванием препарата с ферментом, предварителы модифицированным периодатом натрия tДзантиев,1979].

SDS-электрофорез препаратов осуществляли в тонком сл< полиакриламидного геля СТ 10-20%; С 30%), используя систему JIsmmj [Laemrali,1973]. Гель окрашивали 0,25% раствором кумасси G-250 3,5% растворе НСЮ^.

Белки с геля переносили на нитроцеллюлозную бумагу метод) электроблоттинга. Полученную реплику обрабатывали аффин] очищенными немечеными антителами против лектина. Для проявлен! реакции связывания антиген-антитело использовали вторые антите. осла против антител кролика, меченые пероксидазой.

Взаимодействие лектина и препаратов плазмалеммы клеток клубн< картофеля с модельными олигосахаридами и гликоконьюгатами клеточн! поверхности гриба P. infestons изучали с помощью флуоресцент» метки, по изменению пектиновой активности препаратов под действи< углеводсодержащих веществ и методом иммуноферментного анализаСИФА!

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выделение и характеристика водорастворимого лектина картофеля Метод выделения водорастворимого лектина из клубней картофе. комбинировали из двух методов,имеющихся в литературе. Один из них предложеный Алленом и Ньюбергером [Allen,Neuberger,1973] дл. выделения лектина картофеля,заключается в экстракции уксусн

слотой и осаждении белков из экстракта сульфатом аммония. Из описи другого метода,разработанного Блохом [Bloch,1974] для лучения лектина из зародышей пшеницы,взяли аффинную хроматографию хитине и гель-фильтрацию на сефадексе G-50. СВ нашей работе мы пользовали сефадекс G-75, т.к. молекулярная масса лектина ртофеля намного больше, чем лектина зародышей пшеницы).

Осажденную сульфатом аммония из гомогената тканей картофеля лковую фракцию наносили на колонку с хитином. Белки элюировали ис-НС1 буферомСрН 8,0), буфером с добавлением NaCl и уксусной слотой Срис.1а). Дальнейшую очистку фракции, обладающей ктиновой активностью Сэлюат уксусной кислотой), проводили ль-фильтрацией на сефадексе G-75 Срис.1а). Все полученные фракции ализировали на лектиновую активность по агглютинации эритроцитов олика. Характеристика фракций представлена на таблице 1.

Таблица 1

Характеристика фракций,получаемых при выделении STA

Объем, Фракции мл Белок, мкг/мл Общий белок, мг Титр по агглюти-белку, нации, мкг/мл

колон к а с х и т и н о м

Исходный раствор 100 1645 164,5 100,0 1,60

Троход 148 900 133,2 81,0 0

Грис-буферная

лывка I 45 62 2,8 1,7 0

Грис-буфер + NaCl 18 250 4,5 2,7 0

Грис-буферная

лывка II 10 50 0,5 0,3 0

:н3соон 25 914 22,8 13.9 0,40

к о л о н к а с с е ф а д е к с о м G-75

1ик 1 С STA) 34 250 8,2 5,0 0,06

Тик 11 22 600 13.2 8,0 0.20

Рис.1 Выделение и очистка водорастворимого лектина картофеля, а - Аффинная хроматография препарата лектина на колонке с хитином б - Гель-фильтрация лектина на колонке с сефадексом С-75 I - абсорбция при 280нм; 2 - агглютинация (А) эритроцитов кролика при соответствующей кратности разбавления фракции; 3 - рН элюата. М - метчики, стандартные белки фирмы "Био-Ред"(США): фосфорилаза 94 кД; альбумин - 68 кД; овальбумин - 43 кД; карбоангидраза - ЗОк ингибитор трипсина - 21 кД; лизоцим - 14,3 кД.

Лектиновой активностью обладали: исходный раствор, элюат :сусной кислотой с хитина и оба пика с сефадекса. Первый пик !ладал большей гемагглютинирующей активностью СО,Обмкг/мл), чем ■орой пик (0,2мкг/мл).

SDS-электрофорез конечных продуктов в полиакриламидном геле 1казал, что первый пик содержит один белок с молекулярной массой ЮкД. Второй пик, гетерогенный, содержит четыре компонента.

Анализ полученных пиков показал, что гомогенный препарат пик) является гликопротеином, содержит 50% углеводов и 50% лков. Большая часть углеводного компонента представлена абинозой - 90%. Также обнаружена галактоза (5%), глюкоза (3%), юкозамин (1%). Белковая часть содержит больше всего оксипролина 0%),16% лизина,9% серина,9% пролина и другие аминокислоты.

Лектиновую активность препарата подавляли известные ецифические гаптены лектина картофеля - олигомеры GlcNAc. Мономер cNAc и хлорированные производные олигомеров GlcNAc не влияли на глютинирующую способность STA. Только олигомеры GlcNAc гобиоза, хитотриоза и хитотетраоза - четко подавляли глютинирующую активность лектина, при чем для полного подавления грамера GlcNAc требовалось меньше, чем три- и димера: 4, 30, и 3 мкг углевода на 1мкг белка соответственно С табл. 3).

Полученные данные полностью соответствуют литературным данным тектине картофеля [Matsumoto,1983].

Таким образом, нами выделен гомогенный пектин картофеля. Сравнительное изучение препаратов нативной и раневой плазмалеммы.

Препарат плазмалеммы из клубней картофеля выделяли по схеме, вставленной на рисунке 2. В работе использовали два типа препа-га плазмалеммы: 1- выделенный из целых клубней картофеля - как зиант плазмалеммы нативных клеток, восприимчивых к заболеванию;

Диски

Раствор ^4С-лейцина

Промывные воды

Диски отмытые

Гомогенат I

Центрифуг&т I

700д / Юмин

Осадок I

Гомогенат 2

700д

/ 1Смин

Центрифугат

20 ОООд / 15млн 80 СООс} / ЗСмин

Суспендирование

сахароза 0,87 М 1,00 М

1,32 М

Осадок 2 —-

Осадок 3

Центрифугат 3

Осадок 4

Центрифугат 4

105 ОООд^

90 млн

Нлжняя интерфаза

X

Длаллзат I

105 ОООд / ЗОмлн

—Центрифугат £

Осадок 5

Диализ против немеченого лейцина

Диализат 2

105 000с| / ЗОмин

Центрифугат б

Осадок 6 Плазмалемма

Рис. 2 Схема выделения меченого препарата плазмалеммы из клубней картофеля.

2- выделенный из нарезанных и залеченных в течение ночи дисков, как вариант раневой ткани, "активированной" , и как известно из литературы, раневые ткани картофеля обладают повышенным иммунным ответом [Furuichi,1979].

Нами установлено, что плазмалеммные микровезикулы обладают лектиновой активностью Стабл.2). Титр агглютинации нативной плазмалеммы равен 60 мкг/мл, титр раневой - 12 мкг/мл, т.е. поранение увеличивает пектиновую активность препаратов плазмалеммы в 5 раз. Лектиновую активность плазмалеммы подавляли известные гаптены лектина картофеля - олигомеры GlcNAc - и не подавляли мономер и хлорированные производные олигомеров.

Из этого следует, что плазмалемма картофеля обладает гемагглютинирующей активностью, аналогичной по свойствам с пектином картофеля. Раневая плазмалемма обладает более высокой лектиновой активностью и связывает больше специфических углеводных лигандов.

Для изучения синтеза мембранных белков мы использовали метод

1 л

радиоактивной метки. Опыты по включению С-лейцина in vivo в белки препарата плазмалеммы показали, что при поранении ткани увеличивается поглощение меченого лейцина в 3,5 раза, а включение метки в белки плазмалеммы - в 7 раз. Также происходит активация мембраносвязанного фермента - Мд -зависимой, -активируемой

АТФазы в 4 раза Стабл.2).

Под действием раневого стресса меняются свойства не только белкового, но и липидного компонента мембраны.

Изменения ЗПР-спектров спинового зонда на основе пиперидина, встроенного в нативную и раневую плазмалемму, указывают на увеличение "текучести" липидного матрикса мембраны. В связи с этим мы провели определение содержания жирных кислот в препаратах плазмалеммы. В плазма лемме были идентифицированы ■■ пальмитиновая,

стеариновая, олеиновая, линолевая, линоленовая и арахиновая кислоты. В ответ на поранение увеличивалось содержание ненасыщенных жирных кислот - линолевой и линоленовой. Индекс ненасыщенности жирных кислот в плазмалемме возрастал с 2,2 до 3,1 Стабл.2).

Раневая плазмалемма обладала в 5 раз большей лектиновой активностью и связывала в 5 раз больше хитотетраозы, чем нативная. Сопоставляя данные по активации синтеза мембранных белков и увеличению лектиновой активности можно предположить, что в ответ на поранение активируется синтез лектиновых соединений. А в результате структурных изменений мембраны может произойти увеличение доступности лектиновых сайтов.

Таблица 2

Изменение свойств плазмалеммы картофеля при раневом стрессе I-

Свойства Нативная Раневая

Поглощение ^С-лейцина Симп/мин на 1 г ткани х 10 ) Включение ^С-лейцина в белки Симп/мин на 1мг плазмалемного белка х10 ) Активность АТФазы СмкМ Фн на 1мг белка в час) Индекс ненасыщенности жирных кислот Лектиновая активность Смкг белка в 1мл) Подавление лектиновой активности Смкг углевода на мкг белка) С1сКАс СС1сМс)4

2118 8

10 2,2

60

О 7

7730

58

39 3,1

12

0

35

Таким образом, плазмалемма клеток, активированных поранение*

каней клубней картофеля, характеризующихся повышенной "тойчивостью к заболеванию, значительно отличается от плазмалеммы зтивных,"неактивированных", восприимчивых к заболеванию клеток, го различие проявляется в проницаемости мембраны, скорости синтеза эмбранных белков, текучести липидного матрикса, активности змбранного фермента С Мд^+-зависимой,СK++Na+)-активируемой АТФазы), эличестве и доступности пектиновых сайтов.

.Выделение и характеристика гликоконъюгатов мицелия Р. infestaos.

Клеточно-поверхностные метаболиты гриба получали солевым :мотическим шоком мицелия. Показано, что шоковая жидкость обладает ак индуцирующей устойчивость картофеля активностью, так и /прессорной в отношении фитофторы [Терехова,1980]. Этот метод ззволяет без разрушения целостности клетки получить именно неточно-поверхностные компоненты мягким способом с минимальным крушением их нативной структуры.

Обессоленная шоковая жидкость была разделена на сефадексе G-75 а две фракции (рис.3). Полученные препараты характеризовали по элекулярной массе, содержанию белков и углеводов, УФ- и í-спектрам, аминокислотному и углеводному составу (рис.4).

Установлено, что первый препарат имеет молекулярную массу 3000 Д, состоит на 98% из углеводов, не содержит белков; вдролизат состоит из остатков глюкозы, вероятно, соединенных -связями. Возможно, это препарат известных |3-1-3,р-1~6-глюканов риба, обладающих супрессорной активностью.

Второй препарат с молекулярной массой 2000 Д, с соотношением элки углеводы равным 2: 3. Углеводная часть содержит в основном июкозу и немного арабинозы. Аминокислотный анализ показал наряду с

мг/мл

500

300

ТОО

рут | ,—(_1_, , I , ,

D,

280'™

0,5

0,3

0,1

100

150

совместимой расы

несовместимой расы

200 мл

Рис.3 Профиль элюции с сефадекса С-75 гликоконъюгатов Р. сг^езХапБ.

1 - углеводы

2 - белки

3 - углеводы

4 - белки

набором аминокислот содержание глюкозамина, т.е. углеводной группы, специфически взаимодействующей с лектином картофеля.

Таким образом, на клеточной поверхности гриба присутствуют /3-глюканы С возможно, аналогичные известным супрессорам гриба) 1! гликопептиды, содержащие специфические для пектина картофеле углеводные лиганды.

4. Взаимодействие STA и препаратов плазмалеммы с модельным! олигосахаридами н гликоконъюгатами P.infestons.

Нами показано, что как лектин, так и препарат плазмалеммь агглютинировали проросшие цистоспоры гриба. Флуоресцеин-мечены( лектин равномерно связывался на поверхности гифы гриба. Этс взаимодействие не зависело от расы патогена. Эти данные указывают на лектин-углеводный характер связывания плазмалеммы картофеля с поверхностью гриба.

11 см~1

CL

5

f ej

i

с

О

Б

I

GlC

8

i

250 300 h m

4 Характеристика /3-глюканов и гликопептидов совместимой расы P. infestons.

спектры поглощения в УФ-свете глюкановС1) и гликопептидов С2); инфракрасные спектры глюканов Cl) и гликопептидов С2); газожидкостная хроматограмма ацетатов альдонитрилов гликопеп-тида после кислотного гидролиза;

аминокислотный состав гликопептида после кислотного гидролиза

F570 495

/

/

60

40

20

TO 50

TOO мкг

Рис. 5 Взаимодействие меченых флуоресцеином гликоконъюгатов

P. i-njesians с препаратом плаэмалеммы картофеля

1 - контроль гликоконъюгаты ,

2 - плазмалемма + гликоконъюгаты несовместимой расы,

3 - плазмалемма + гликоконъюгаты совместимой расы

Далее гликоконъюгаты гриба метили флуорохромтриазинилом по Белдеру и проводили титрование препарата плаэмалеммы мечеными глнкоконьюгатами (рнс.5). На графике видно, что более интенсивное связывание меченых гликоконъюгатов с плазмалеммой было в устойчивой комбинации раса-сорт (2), менее интенсивное - в восприимчивой (3). Графики имеют две точки перегиба, что говорит о наличии двух различных центров связывания на плазмалемме. По-видимому, это объясняется тем, что в суммарном препарате гликоконъюгатов присутствуют обе фракции : /9-глюканов и гликопептидов, которые, вероятно, взаимодействуют с различными сайтами на мембране.

Таким образом, флуоресцеин-меченые углеводсодержащие поверхностные компоненты гриба связывались с плазмалеммой картофеля как в устойчивой, так и в восприимчивой комбинации, но несколько

ггенсивнее в устойчивой.

Специфические для картофельного лектина гаптены Солигомеры сНАс) при связывании с пектином подавляют его гемагглютинирующую :тивность. При этом с увеличением длины цепи требуется меньше [игомера для полного подавления агглютинирующей активности лектина препарата плазмалеммы. Лектиновая активность раневой плазмалеммы 5 раз больше, чем нативной. И раневая плазмалемма связывала в 5 [3 больше хитотетраозы, чем нативная Стабл.З).

Далее мы рассматривали влияние метаболитов гриба на лектиновую тивность как нативной, так и раневой плазмалеммы. Гликопептиды, :еющие в своем составе специфическую для лектина углеводную уппу, подавляли гемагглютинирующую активность плазмалеммы. При ом мембраны связывали больше гликопептидов несовместимой расы, м совместимой. Раневая плазмалемма связывала больше икопептидов, чем нативная и с большим различием по отношению к сам гриба Стабл.З).

Лектин-углеводное взаимодействие происходит и в совместимой, и несовместимой комбинации. Однако, в случае устойчивости это аимодействие идет интенсивнее, чем при восприимчивости. Раневая азмалемма, моделирующая активную, устойчивую клетку, связывает льше углеводных лигандов гриба и более чувствительна в опознавании компонентов поражающей и непоражающей расы, ктин-углеводное взаимодействие необходимо для проявления реакции тойчивости хозяина.

Таким образом, при контакте плазмалеммы картофеля с верхностью патогена имеет место связывание лектиновых сайтов азмалеммы с гликопептидами клеточной поверхности гриба как в тойчивой, так и в восприимчивой комбинации.В то же

Таблица 3 Подавление лектиновой активности

Лектиновый Лиганд мкг углевода

препарат на 1 мкг белка

С1сМАс О

СИсМс^ 250

Лектин

С61сМАс)3 30

СС1сЫАс)4 4

нативная С1сНАс 0

(С1сМс). 7

Плазмалемма

ИсМс 0

раневая

С61сМс)4 35

нативная

Плазмалемма

раневая

глюканы гриба

гликопептиды

совместимой расы 8

несовместимой расы 20

глюканы гриба

совместимой

гликопептиды

расы

20

несовместимой расы 100

О

0

время, (3-глюканы гриба не взаимодействовали с лектинами плазмалеммы картофеля. Раневая плазмалемма картофеля, как мы предполагаем, имеет больше лектиновых сайтов на поверхности, чем нативная и связывает соответственно больше гликопептидов гриба. Гликопептиды устойчивой расы гриба имеют большее сродство к лектиновым сайтам плазмалеммы, чем гликопептиды восприимчивой расы. Различия в

язывании гликопептидов двух рас были значительнее в случае невой плазмалеммы, т. е. она была наиболее чувствительной в опознавании метаболитов поражающей и непоражающей расы.

Для исследования антигенных свойств лектина картофеля и ияния на них взаимодействия с гликоконъюгатами гриба мы пользовали метод твердофазного иммуноферментного анализа.

Схема "Сэндвич"-ИФА была использована для определения держания лектина в препарате плазмалеммы. Предварительно работали оптимальные условия проведения реакции антиген-антитело: нцентрации реагентов, длительность стадий анализа. В лунках аншета адсорбировали антитела, отмывали несвязавшиеся антитела, тем вносили лектин и меченые пероксидазой антитела, и строили либровочный график зависимости интенсивности пероксидазной акции от концентрации антигена С рис.6).

Далее в схему вместо антигена - водорастворимого лектина -осили препарат белков плазмалеммы и по калибровочному графику ределяли сэдержан:ш лектина в плазмалемме. Оно составило порядка от суммарных мембранных белков.

Выявление лектина в сумме белков плазмалеммы провели методом муноблоттинга. Для этого разделили БОБ-электрофорезом в лиакриламидном геле препарат белков плазмалеммы, получив при раске кумасси 8 полос. Для сравнения приведена электрофореграмма могенного лектина Срис.7). Белки с геля переносили на гроцеллюлозную бумагу методом электроблоттинга. При окраске плики мечеными антителами гомогенный лектин проявлялся одной посой, а в препарате мембран - 3 белковые полосы обладали особностьо связывать антитела. Наиболее вероятно, первая полоса элекулярная масса 100 кД) представляет собой димер лектина, эрая полоса С50 кД) - мономер лектина, не исключено, что третья

д

<fSO

- 20 -

15

Ю

0,5

О

Tt

i-1-1-1—

-по -w,o -SM -8,0 ;

lg (514, м] I

Рис. 6 Калибровочный график "Сэндвич"-ЖЕА STA о контроль, фоновое связывание метки в отсутствии антиге!

и„jSTAJJHT STA ПБП

_ U J w w.

Рис. 7 Характеристика STA и препарата белков плаэмалеммы (ПБП) картофеля

а - электрофореграмма; б - иммуноэлектроблоттинг

б

а

лоса С30 кД) - это белковая фракция лектина Сбез углеводного мпонента), обладающая антигенными свойствами лектина.

Изучение равновесных характеристик ввзаимодействия тиген-антитело проводили с использованием прямого твердофазного А. В лунках адсорбировали антитела, отмывали несвязавшиеся лекулы и вносили меченый антиген. На рисунке 8а приведены зультаты определения равновесной константы связывания гиген-антитело в системе координат В от Г, где В - концентрация язавшегося антигена, а Г- концентрация свободного антигена. В иной системе координат равновесная константа связывания ределяется как величина,обратная Г при 50%-ном насыщении активных 1 чтров антител. На рис. 86 представлена интерпретация тех же зультатов в системе координат Скэтчарда,что позволяет качественно эрактеризовать полученные нами антитела к лектину. Нелинейная зисимость кривой говорит о наличии двух популяций антител, зличающихся по аффинности. Эффективная константа связывания, нечитанная в этой системе координат составила 7x10

По этой же схеме изучали влияние взаимодействия юводсодержащих компонентов с лектином на его способность 1зываться с антителами. К адсорбированным антителам добавляли юный антиген, предварительно проинкубированный в течение 20мин с 'обиозой или гликопептидами гриба. Показано, что в результате :ого взаимодействия эффективная константа связывания возрастает на )ядок, т.е. метаболиты гриба усиливают антигенные свойства ;тина.

Результаты проведенной работы позволяют заключить, что при :ажении картофеля фитофторой на уровне контакта растительной 1змалеммы с поверхностью инфекционной гифы гриба имеет место :тин-углеводное взаимодействие. Такое взаимодействие характерно

Рис. 8 Влияние (С1сЫАс)2(1) и гликопептидов Р.сп^е^стб несовм мой расы( 2) на связывание адсорбированных с конъюгатом

гена 2ТА-ПХ( 3)

а) Зависимость концентрации связанного коныогата 2ТА-ПХ (В) от к центрации свободного коныогата ЙТА-ПХ (Р)

б) Интерпретация данных титрования активных центров сорбировании антител конъюгатом ЗТА-ПХ в координатах Скэтчарда

ак для устойчивой, так и для восприимчивой комбинации, хотя во тором случае оно слабее .

Предполагается,что лектин-углеводное взаимодействие приводит к труктурной и функциональной перестройке растительной плазмалеммы, то может явиться важным фактором в развитии реакции СВЧ.

ВЫВОДЫ

1. В составе белков плазмалеммы картофеля обнаружены соединения, бладающие пектиновой активностью, и иммунологически подобные водо-астворимому лектину картофеля.

2. На клеточной поверхности мицелия P.infestans обнаружены -глюканы, а также гликопептиды,содержащие специфические к лектину артофеля углеводные лиганды.

3.Взаимодействие плазмалеммы картофеля с гликопептидами гриба осит лектин-углеводный характер и по своим параметрам сопоставимо о связыванием ia vitro лектин-GlcNAc.Это взаимодействие характерно ак для устойчивой,так и для восприимчивой комбинации хозяин-пато-ен, хотя в последней менее интенсивно.

4.Раневая плазмалемма взаимодействует со специфическими глеводными лигандами более интенсивно,чем нативная. Раневая лазмалемма характеризуется большим количеством лектиновых сайтов и х доступностью,вследствие повышенной текучести липидного матрикса ембраны.Эти факторы,по-видимому,объясняют более активную защитную еакцию раневой ткани на инфицирование патогеном,по сравнению с ативной тканью клубней картофеля.

5. Связывание специфических углеводсодержащих компонентов с ектином картофеля усиливает его антигенные свойства,что, вероятно, нтенсифицирует процесс специфического узнавания при фитофторозе артофеля.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1 Любимова Н. В. , Лахтин В. М. , Смирнова Н. И. , Шувалова Е. П Структура и функции гликоконъюгатов клеточной поверхности мицелия Р^угорЬгЛога 1п{еБШп5. 8-я Всесоюзная конференция по химии и биохимии углеводов, Тбилиси, ноябрь 17-19, 1987, с. 167 (тезисы).

2 Любимова Н.В. , Лахтин В. М. , Шувалова Е.П. Лектин-углеводное взаимодействие при фитофторозе картофеля. Всесоюзное совещание "Физиолого-биохимические основы иммунитета растений к грибным болезням для целей прикладной селекции", Уфа, 30 марта-2 апреля 1988,с.55 (тезисы).

3 Любимова Н. В. , Лахтин В. М. , Бинюков В. И. , Шувалова Е. П. Структурно-функциональные изменения цитоплазматической мембраны растительной клетки под влиянием раневого стресса. Прикладная биохимия и микробиология. 1988,т. 24,вып. 1,с.102-109.

4. Любимова Н; В. , Лахтин В. М. , Шувалова Е. П. , Щербухин В. Д. Лектин-углеводное взаимодействие в системе картофель-возбудитель фитофтороза на уровне растительной плазмалеммы. Физиология растений. 1988,т.35,вып.5,с. 870-878.

5 Любимова Н. В. , Шувалова Е. П. , Лахтин В. М. , Давлетшина М. Л. Роль лектина во взаимодействии плазмалеммы клеток картофеля с клеточно-поверхностными метаболитами возбудителя фитофтороза. В кн.: "Изучение и применение пектинов.", Тарту, 1989,т.2,с.62-72.

6 Любимова Н. В. , Шувалова Е. П. , Щербухин В. Д. , Салькова Е. Г. Картофельные лектины и их роль в устойчивости хозяина к фитофторозу ИНТЕРЛЕК XI, 1989,с. 47. (тезисы).

7 Кашулин П. А. , Любимова Н. В. , Шувалова Е. П. , Давлетшина М. Л. , Чивкунова 0.Б., Решетникова И. В. , Мерзляк М. Н. Структурные изменения в плазмалематических мембранах клубней картофеля под влиянием гликоконъюгатов возбудителя фитофтороза. Физиология растений. 1990,т.37,вып.1, с. 153-160.

__ 8 Любимова Н. В. , Шувалова Е.П., Агафонова Н. В. .Щербухин В. Д. Иммуноферментный анализ лектина картофеля. Прикладная биохимия и микробиология, (в печати).

Заказ № 25 8/4-91 г. Объем I»5 п.л. Тираж ЮОэкз.

ЦЭМИ АН ШЛ>.