Культивирование клеток кожи, предназначенных для заместительной терапии, на полимерных плёнках

Швед, Юлия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Культивирование клеток кожи, предназначенных для заместительной терапии, на полимерных плёнках
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Культивирование клеток кожи, предназначенных для заместительной терапии, на полимерных плёнках"

на правах рукописи

00344832Б

ШВЕД Юлия Александровна

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК КОЖИ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ, НА ПОЛИМЕРНЫХ ПЛЁНКАХ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 ОПТ да

Санкт-Петербург 2008

003448326

Работа выполнена в Отделе клеточных культур Института цитологии РАН и на кафедре химии высокомолекулярных соединений химического факультета Санкт-Петербургского государственного университета

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологических наук, профессор

Пинаев Георгий Петрович Институт цитологии РАН

доктор химических наук, профессор Билибин Александр Юрьевич Химический факультет Санкт-Петербургского государственного университета

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Харазова Алла Давидовна Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета

доктор химических наук, профессор

Власов Геннадий Петрович

Институт высокомолекулярных соединений РАН

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биоорганической химии

им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова

Защита состоится "31" октября 2008 г. в 12 часов на заседании диссертационного совет Д 002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу. 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., Д 4

е-та|1:се11Ыо@таП.су15рЬ гея! ги сайт: http://www.cvtspb.rssi ги

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан " " сентября 2008 г.

Ученый секретарь диссертацис кандидат биологических наук

Ученый секретарь диссертационного совета Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Разработка технологий лечения повреждённых органов и тканей путём введения в организм пациента стволовых или дифференцированных клеток является перспективным направлением современной регенеративной медицины Восстановление целостности повреждённой ткани требует создания нормального микроокружения для культивируемых и трансплантируемых клеток, способствующего их размножению, дифференцировке и восстановлению с их помощью структуры и функции поврежденной ткани В организме создание такого микроокружения обеспечивают белки внеклеточного матрикса. Эти белки и в частности коллаген, используют при культивировании клеток и при создании клеточных продуктов для дальнейшей трансплантации в поврежденные ткани пациента. При переносе культивируемых клеток на раны возникают, однако, проблемы нарушения их пространственной организации и функциональных свойств. Они связаны, прежде всего, с неизбежным повреждением подготовленных клеток в результате их ферментативной обработки при отделении клеточных пластов от поверхности сосудов, в которых их культивируют, что приводит к недостаточной механической прочности клеточных ассоциаций и частичной утере поверхностных рецепторов.

В настоящее время сформировалась новая междисциплинарная область науки -тканевая инженерия, которая включает в себя принципы и методы, как инженерии, химии, физики, так и клеточной биологии (Langer R at al., 1993). В основе тканевой инженерии лежит введение клеток в биорезорбируемые полимерные матрицы и дальнейшее образование сложных клеточных композиций, подобных ткани или органу, для дальнейшей трансплантации их пациенту взамен поврежденных или утраченных (Lanza R.P. at al, 2004). Использование таких матриц позволяет обеспечить сохранение исходного состояния межклеточных контактов и поверхностных рецепторов клетки при создании клеточных продуктов и их трансплантации (Amulya К. At al, 1999) В зависимости от практических задач к таким полимерам предъявляется ряд требований, а именно, нетоксичность, биосовместимость, простота изготовления полимерных изделий и их достаточная механическая прочность, а также способность полимера резорбироваться в процессе восстановления структуры ткани (Oakes B.W., 2004). Размножение и рост клеток на полимерных матрицах с разной пространственной организацией может обеспечивать формирование структурной основы дифференцирующихся тканей.

Одним из приоритетных направлений тканевой инженерии является восстановление структурной целостности кожных покровов, повреждённых в результате ожогов, трофических язв и воздействий другого рода (Ramos-e-Silva М., at al, 2002). Для этой цели выращенный m vitro клеточный пласт эпителиальных клеток - кератиноцитов должен быть перенесен на поражённый участок кожи Несмотря на широкий спектр существующих матриц на основе биодеградируемых синтетических полимеров, предназначенных для культивирования различных типов клеток, обладающих повышенной чувствительностью к субстрату, например кератиноцитов, разработанные ранее матрицы по своему составу и свойствам не подходят для этой цели (Morrison G., 1999). В то же время трансплантация клеток кожи уже в настоящее время имеет клиническое применение и поэтому создание подобных матриц является важной задачей не только с точки зрения фундаментальных исследований взаимодействия клеток с полимером, но и для вполне реального практического применения полученных композиций в клинике.

Полимерные матрицы, позволяющие культивировать на них кератиноциты человека с образованием многослойного клеточного пласта, при совместном переносе их в область повреждения позволят исключить процедуру обработки клеток, выращиваемых по известным технологиям, протеолитическими ферментами и ускорить процесс заживления ран.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлся поиск оптимальных условий для культивирования клеток кожи на биодеградируемых полимерных плёнках, сформированных на основе поли(В,Ь-лактида) для заместительной клеточной терапии.

В процессе исследования были решены следующие задачи:

1. Подобраны оптимальные условия для культивирования клеток кожи на полилактидных плёнках.

2. Разработаны условия нанесения коллагена на поверхность полимерных плёнок и исследовано взаимодействие клеток с различными его структурными формами (молекулярной и фибриллярной)

3. Проведена модификация поверхности полимерных плёнок введением аминогрупп и оценка их влияния на степень распластанности клеток.

4. Отработаны условия формирования пористых плёнок для свободного доступа к клеткам питательных веществ и отвода продуктов метаболизма.

5. Определена скорость деградации плёнок в условиях культивирования клеток и после имплантации их в организм лабораторных животных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимальными для культивирования клеток кожи являются плёнки, прикреплённые к поверхности покровного стекла. Сформированные полимерные плёнки после инкубирования их в питательной среде остаются достаточно прочными в течение 3 недель, и на них может быть получен многослойный пласт кератиноцитов для последующей трансплантации.

2. Сформированные полилактидные пленки толщиной 5 мкм позволяют проводить прижизненное наблюдение за поведением клеток.

3. Предложенные способы модификации полилактидной плёнки разными структурными формами коллагена позволяют улучшить взаимодействие клеток с ее поверхностью. Показано, что поведение кератиноцитов зависит от структуры коллагена и равномерности его распределения на поверхности пленки.

4. Степень адгезии и распластанности клеток на полилактидных плёнках повышается при обработке поверхности пленок лизином.

5. Путём смешения поли(Б,Ь-лактида) и полиэтиленгликоля с последующим вымыванием последнего могут быть получены гидрофилизованные пленки полилактида с пористой морфологией поверхности.

Научная новизна. Для формирования многослойного пласта кератиноцитов впервые были использованы плёнки на основе аморфного поли(0,Ь-лактида), прикреплённые к поверхности покровного стекла. Такой способ позволяет отделить плёнку вместе со сформированным на ней многослойным клеточным пластом от подложки и перенести на рану.

Показано, что решающим фактором, влияющим на прикрепление и распластывание кератиноцитов при модификации полилактидной матрицы коллагеном, является структура белка. Фибриллярная структура коллагена способствует пролиферации кератиноцитов. Впервые разработаны условия, при которых образование фибрилл коллагена происходит при нанесении белка, находящегося в молекулярной форме, на поверхность полилактидной плёнки, что позволяет достичь равномерного распределения фибрилл коллагена на поверхности.

Впервые для модификации полимерной матрицы был использован лизин. Показано, что такая обработка также способствует распластыванию кератиноцитов на ее поверхности

Теоретическое и практическое значение работы. Сформированный клеточный продукт, состоящий из выращенного на биодеградируемой полилактидной матрице многослойного пласта кератиноцитов, может быть использован для трансплантации на повреждённый участок кожного покрова.

Предложенные методы модификации поверхности полилактидной матрицы, предназначенной для культивирования кератиноцитов, могут быть использованы и для других полимеров медико-биологического назначения. В частности, разработанные методы модификации могут быть применены в процессе разработки трёхмерных пористых полимерных матриц. Такие матрицы позволят создать в искусственных условиях для культивирования клеток микроокружение, максимально приближённое к условиям их существования в организме.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 16 тезисов. Результаты исследования представлены на 3-й научной сессии УНЦХ (Санкт-Петербург, 27, 28 ноября, 2004), международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия», (Санкт-Петербург, 25-27 октября 2004 г.), С.-Петербургской конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 1-3 февраля 2005 г.), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005» (Москва, 12-15 апреля 2005 г), 9-ой Международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2005 г.), Всероссийская конференция молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 14-16 апреля, 2005), European Polymer Congress (Moscow, June 27-29, 2005), International conference "New polymer systems for biotechnological and biomedical applications" (Yerevan. Republic Armenia. July 12-14, 2005, October 1-4, 2007), International symposium"Biomaterials" (Hamburg October 1- 4, 2006), Международная конференция "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург 17-19 октября, 2006), 3rd World Congress on Regenerative Medicine (Leipzig, Germany October 17-22, 2007), V конференция молодых учёных с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 19-22 мая, 2008).

Структура и объем работы. Работа изложена на 163 страницах и включает список литературы, который содержит 207 наименований.

Во введении обоснована актуальность проблемы использования биодеградируемых полимеров для культивирования клеток и сформулированы основные цели исследования. Первая глава содержит обзор современных представлений о различных классах полимеров, используемых для медико-биологических целей. Описаны различные подходы к созданию полимерных матриц, предназначенных для культивирования клеток, а также подробно изложены методы модификации полимерных матриц. Рассмотрено строение кожи и возможные способы её восстановления при повреждениях. Во второй главе описаны основные объекты и методы исследования. Третья глава содержит экспериментальные результаты. В четвертой главе проведено обсуждение результатов и изложены основные выводы работы. Работа заканчивается списком цитируемой литературы.

Содержание работы

1. Выделение, культивирование и анализ состояния клеток кожи

Нормальные кератиноциты и фибробласты человека были получены из кожи здоровых взрослых доноров, подвергшихся косметической операции. Выделение кератиноцитов проводили путем последовательной ферментативной обработки фрагментов ткани раствором диспазы для отделения эпидермиса от дермы и коллагеназой для выделения базальных кератиноцитов (Hodges et al, 1973). Фибробласты были получены путем спонтанной миграции клеток из целых фрагментов кожи в процессе культивирования.

Фибробластоы культивировали в среде DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium), a кератиноциты - в смеси сред DMEM и F12 (3:1) с добавлением 10 % эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота в СС^-инкубаторе при температуре 37 °С.. Питательную среду меняли через каждые 3 суток

Влияние поверхности на процесс взаимодействия клеток с подложкой оценивали по степени адгезии и распластывания клеток на субстрате с помощью инвертированного микроскопа и методом сканирующей электронной микроскопии. Морфологию и поведение распластанных клеток анализировали, наблюдая за характером пространственной организации окрашенных Родамин-фаллоидином структур актинового цитоскелета, методом лазерной конфокальной иммуннофлуоресцентной микроскопии.

2. Синтез поли(0,Ь-лактида)

Поскольку полимерная плёнка, предназначенная для культивирования и трансплантации кератиноцитов, должна резорбироваться в течение 1 мес, для формирования плёнок был использован аморфный поли(В,Ь-лактид). По предварительно оптимизированной известной методике (Kricheldorf et al, 1999) на основе циклического димера молочной кислоты - лактида в присутствии катализатора - лактата цинка был синтезирован поли(В,Ь-лактид) с молекулярной массой 150000.

3. Формирование полилактидных плёнок и исследование скорости их деградации в условиях культивирования клеток

Полилактидные плёнки были получены методом полива из раствора в хлористом метилене. После испарения растворителя плёнки отделялись от фторопластовой подложки. В зависимости от концентрации полилактида толщина полученных плёнок составила 20, 30, 50 и 100 мкм.

Одним из требований, предъявляемых к полилактидным плёнкам, предназначенным для культивирования кератиноцитов и последующей их трансплантации на рану, является их достаточная прочность после формирования клеточного пласта (3 нед) (Rheinwald, 1980). Поэтому полученные плёнки, толщиной 20 и 100 мкм, выдерживали в течение мес в питательной среде в присутствии и отсутствие сыворотки, а также в чистом фосфатном буфере. Скорость деградации полилактидных плёнок оценивали по убыли массы плёнок после каждых 10 сут инкубирования. В качестве контроля были выбраны плёнки, инкубированные в водной среде.

Наименьшая убыль массы пленок наблюдается в питательной среде. Вероятно, это связано с частичной сорбцией компонентов питательной среды на поверхность полилактидной плёнки

В течение 3 нед все плёнки сохраняли необходимую для переноса клеточных пластов прочность, а по истечении 1 мес становились хрупкими и ломкими.

Было отмечено, что даже после 1 сут выдерживания плёнок в любой жидкой среде они становились мутными и рельефными. Так как для проведения прижизненного наблюдения под инвертированным микроскопом за процессами прикрепления, распластывания и размножения клеток на исследуемой поверхности, необходимым свойством плёнок является их прозрачность, использование таких плёнок для этой цели было невозможным. В процессе исследования также было отмечено, что чем толще плёнка, тем быстрее она мутнеет. Поэтому возникла необходимость получения тонких не мутнеющих полилактидных плёнок.

Тонкие плёнки, толщиной 5 мкм, были получены при нанесении раствора на покровное стекло, прикреплённое к подложке, вращающейся со скоростью 3000 об/мин. Путём подбора концентрации и объёма раствора удалось получить тонкие, не мутнеющие в жидкой среде и не деформирующиеся в течение 3 нед полилактидные плёнки. Дальнейшие исследования проводили на плёнках полученных таким способом и прикреплённых к покровному стеклу.

4. Оценка скорости деградации пленки и токсичности образуемых продуктов

¡n vivo

Для исследования скорости резорбции и возможного токсического влияния продуктов деградации полиф,Ь-лактида) на окружающие ткани плёнки толщиной 20 мкм, после предварительной стерилизации, трансплантировали под кожу крысам. По истечении 1, 2 и 3 нед содержания полилактидных плёнок в организме проводили гистологические исследования биоптатов. Присутствие поли(0,Ь-лактида) в тканях наблюдали после 1 и 2 нед. После 3 нед плёнка полностью резорбировалась в организме, причём патогенного влияния продуктов деградации полилактида на окружающие ткани обнаружено не было.

Плёнка толщиной 5 мкм, трансплантированная под кожу крысам, также полностью резорбировалась уже после 1 нед.

5. Влияние условий получения полимерных плёнок на свойства их поверхности

В качестве субстрата, для нанесения раствора поли(В,Ь-лактида), были использованы покровные стекла с гидрофильной (необработанной) и гидрофобной (силиконизированной) поверхностью Равномерное распределение полилактида на стеклах обоих типов наблюдали при использовании хлористого метилена в качестве растворителя. При нанесении полилактида, растворенного в более полярном и хорошо удерживающем воду растворителе - ацетоне, на гидрофобную поверхность стекла полимер распределялся неравномерно, а при нанесении на гидрофильную - равномерно (Швед Ю.А. и др., 2006). Гидрофильность поверхности пленок определяли по значениям угла смачивания, измеренного с помощью метода пластинок Вильгельми (Адамсон, 1979). Наименьшим углом смачивания, те. наиболее гидрофильной поверхностью, обладали пленки, полученные из ацетона на необработанном стекле. Значения углов смачивания для пленок из хлористого метилена были несколько выше (таблица).

Угол

Образцы смачивания 0

Покровное стекло 62±4"

Гидрофобизированное покровное стекло 104±4°

Покровное стекло, покрытое ПЛ из раствора в ацетоне 78±4°

Гидрофобизированное покровное стекло, покрытое ПЛ из раствора в ацетоне 88±4°

Покровное стекло, покрытое ПЛ из раствора в хлористом метилене 84±4°

Гидрофобизированное покровное стекло, покрытое ПЛ из раствора в хлористом метилене 82±4°

Следующий этап работы состоял в исследовании влияния условий формирования плёнок из поли(0,Ь-лакгида) на адгезию и пролиферацию клеток. В качестве контрольной поверхности использовали покровные стекла. Несмотря на то, что разрабатываемая полилактидная плёнка предназначалась для культивирования кератиноцитов, первоначально было проведено исследование поведения на поверхности полилактидной плёнки дермальных фибробластов, менее требовательных к условиям культивирования, в частности, к свойствам субстрата.

При культивировании фибробластов на полимерных матрицах, полученных из разных растворителей, негативного влияния ни полимера, ни растворителей на жизнеспособность клеток обнаружено не было.

Способность фибробластов прикрепляться к исследованным субстратам зависела от степени гидрофильное™ поверхности полилактидных плёнок, определяемой по углу смачивания. Количество фибробластов, адгезировавших к полилактидной плёнке, полученной из раствора в ацетоне, было выше, но незначительно, по сравнению с количеством клеток, прикрепленных к полимерным плёнкам, полученным из раствора в хлористом метилене (рис.1).

Рис. 1 Зависимость прикрепления фибробластов к полимерной плёнке от способа её получения через 20, 40 или 90 мин после нанесения

К - контроль (гидрофильное покровное стекло), А-Фл - плёнка из ПЛ, полученная из раствора в ацетоне на гидрофильном стекле, А-Фб - плёнка из ПЛ, полученная из раствора в ацегоне на гидрофобном стекле; Х-Фл - плёнка из ПЛ, полученная из раствора в хлористом метилене на гидрофильном стекле; Х-Фб - плёнка из ПЛ, полученная из раствора в хлористом метилене на гидрофобном стекле.

При нанесении на поверхность полилактидных плёнок кератиноцитов - клеток, более требовательных к субстрату, чем фибробласты, оказалось, что они не прикреплялись к пленкам, полученных из раствора, как в хлористом метилене, так и в ацетоне. Таким образом, незначительное повышение гидрофильное™ пленок за счет

использования ацетона в качестве растворителя, явилось недостаточным для адгезии кератиноцитов к поверхности полимерной матрицы. Из этих результатов следовала необходимость проведения дополнительной модификации поверхности полилактидной пленки.

В последующих исследованиях были использованы пленки, полученные из раствора в хлористом метилене. Такой выбор был обусловлен следующими причинами: трудностью поддерживать на определенном уровне содержание воды в пленках, полученных из растворов полимера в ацетоне, более равномерным распределением полимера в пленках из хлористого метилена и сравнительно низкой температурой кипения хлористого метилена, что позволяет полностью удалить этот растворитель из пленки.

6. Исследование взаимодействия клеток кожи с различными структурными формами коллагена, нанесённого на поверхность полилактидной плёнки

Для повышения биосовместимости поверхности полилактидных плёнок их модифицировали коллагеном I типа Являясь основным белком внеклеточного матрикса, коллаген часто используется в качестве субстрата при культивировании клеток данного типа.

Коллаген получали путем кислой экстракции из сухожилий крысиных хвостов. Выделенный таким образом коллаген в молекулярной форме наносили общепринятым способом на поверхность полилактидной плёнки из 0 1 М раствора уксусной кислоты. Количественное содержание коллагена в растворе определяли методом Лоури.

Для того чтобы установить максимальное количество коллагена, способного распределиться на исследуемой поверхности, были проведены теоретические расчёты количественного содержания коллагена на единице площади поверхности при условии ее полного покрытия коллагеном. Молекула коллагена представляет собой жёсткий стержень, поэтому число возможных конформаций молекулы и расположение ее на поверхности матрицы ограничено (рис.2).

и ш

' // -¿г* Рис. 2 Возможные типы взаимодействия молекулы коллагена с

~ плоской поверхностью.

Исходя из предположения, что молекула взаимодействует с поверхностью по всей своей длине, была рассчитана сорбционная ёмкость, которая составила 0.13 мкг/см2. Экспериментально полученная первоначально величина сорбционной ёмкости полилактидной плёнки после инкубирования ее в растворе коллагена с концентрацией 0.02 мг/мл составила всего лишь 0.08 мкг/см2 (рис. 3), из чего следовало, что на практике коллаген не покрывает всей поверхности пленки.

Рис. 3 Зависимость количества коллагена (мкг/см") на поверхности плёнок от времени и условий нанесения белка; при выдерживании плёнок в растворе коллагена с концентрацией: а - 0.02 мг/мл; б - 0.05 мг/мл.

Для увеличения сорбционной ёмкости поверхности полилактидной матрицы были использованы два подхода. Первый заключался в проведении предварительного щелочного гидролиза поверхности пленки, а второй в увеличении концентрации наносимого раствора белка. От первого подхода пришлось отказаться. Несмотря на то, что за счёт электростатических взаимодействий количество сорбированного коллагена на полилактидной поверхности действительно увеличивается, даже кратковременная обработка щелочным раствором низкой концентрации приводила к частичному гидролизу полимера и, соответственно, к ухудшению механических свойств полилактидной матрицы. При увеличении концентрации наносимого раствора коллагена, удалось получить величину сорбционной ёмкости - 0.4 мкг/см2, даже превышающую теоретически рассчитанную. Для того, чтобы в дальнейшем обеспечить максимальное покрытие поверхности, модификацию полилактидной плёнки проводили путём нанесения раствора коллагена с большей концентрацией равной 0,1 мг/мл. Для исследования влияния модификации плёнок коллагеновым покрытием на них в течение 1 нед культивировали кератиноциты. Морфология клеток на исследуемых субстратах была охарактеризована методом сканирующей электронной микроскопии (на рис.4 а и б -разные увеличения).

¡■ря

(а)

(в)

Действительно, нанесение коллагена способствовало увеличению количества прикрепившихся клеток и степени их распластанное™. При этом, однако, клетки располагаются на поверхности пленки неравномерно.

Очевидно, что такое прикрепление кератиноцитов к поверхности может зависеть от равномерности распределения коллагена на поверхности. С целью получения равномерно

(б) лши

Рис. 4 Сканирующая электронная микроскопия кератиноцитов кожи человека после 1 нед культивирования.

а, б - кератиноциты на

полимерной пленке; в, г - кератиноциты на такой же пленке, покрытой коллагеном.

(I)

покрытых коллагеном поверхностей полилактидной пленки было проверено несколько способов нанесения коллагена.

Вместо общепринятого способа нанесения коллагена на поверхность, а именно, выдерживания плёнок в растворе коллагена с концентрацией 0.1 мг/мл в течение 30 мин с последующей промывкой раствором фосфатного буфера (способ 1), использовали другой способ, при котором на поверхность плёнки равномерно наносился фиксированный объём раствора коллагена с концентрацией 0.1 мг/мл и плёнки высушивали при комнатной температуре в течение 1 сут - способ 2 (по аналогии со способом 1). В обоих случаях исследуемая поверхности была покрыта коллагеном в молекулярной форме. Второй способ позволяет получить более равномерным распределением коллагена на поверхности. Трёхкратное нанесение раствора коллагена способом 1, чередующееся с промыванием раствором фосфатного буфера, также способствует равномерному распределению коллагена на поверхности полилактидной плёнки - способ 3 (Швед Ю.А. и др., 2007)

Поскольку в организме коллаген находится в фибриллярной форме, целесообразно было модифицировать поверхность, предназначенную для культивирования клеток, фибриллярным коллагеном. Увеличение концентрации раствора коллагена до 2 мг/мл, а также перевод его в нейтральную среду способствуют формированию фибрилл. Нейтрализацию кислоты проводили добавлением раствора гидрофосфата натрия и наносили раствор коллагена на поверхность полимера. После этого плёнки с нанесённым коллагеном выдерживали в атмосфере аммиака. В этом случае образование фибрилл коллагена завершается уже непосредственно на поверхности плёнки. Такой способ позволил получить равномерное распределение коллагеновых фибрилл на поверхности -способ 4.

Структуру нанесённого коллагена и его распределение на поверхности полилактидной плёнки оценивали методом иммуннофлуоресцентной микроскопии после окраски препаратов специфическими антителами на коллаген (рис.5) и с помощью метода атомно-силовой микроскопии (рис. 6).

(а) I ИН (б)

ШШШш' -у 'ш^ ЩШшА

Рис. 5 Различия в распределение коллагена при нанесении его на полилактидную пленку разными способами: а-коллаген, нанесённый способом 1, б- коллаген, нанесённый способом 2, в. д - коллаген, нанесённый способом 4, г- трёхкратное нанесение способом I Об.: х60 (а, б, в, г) или хЮО (д).

Рис. 6 Атомно-силовая микроскопия коллагенового покрытия полилактидной пленки..

а— нанесение фибриллярного коллагена;

б-трёхкратное нанесение молекулярного коллагена.

При культивировании кератиноцитов было показано, что структура коллагена оказывает влияние на распределение клеток на поверхности. При модификации пленки молекулярным коллагеном выявляются только одиночные клетки разной степени распластанности и обладающие хорошо развитым цитоскелетом, характерным для дифференцированных кератиноцитов. На поверхности же, модифицированной фибриллярным коллагеном, вдоль фибрилл располагаются вытянутые цепочки округлых клеток. Цитоскелет в них распределяется циркулярными тяжами на периферии под клеточной мембраной. Такое распределение цитоскелета характерно в большей степени для стволовых и транзиторных клеток. Дифференцированные же кератиноциты прикрепляются к фибриллярному коллагену в значительно меньшей степени. Из полученных данных следует, что покрытие пленки фибриллярным коллагеном в большей мере способствует размножению и росту популяции базальных кератиноцитов.

7. Культивирование кератиноцитов на пористых плёнках, приготовленных па основе смеси поли(Э,Ь-лактида) и полиэтиленгликоля

Для свободного доступа питательных веществ, к трансплантированным в рану клеткам и отвода продуктов их метаболизма матрица, предназначенная для культивирования клеток, должна быть пористой. Размер пор для свободной циркуляции жидкой среды должен составлять менее 10 мкм. Для формирования таких плёнок в данной работе был использован метод, основанный на фазовом разделении двух несовместимых полимеров с последующим удалением одного из них селективным растворением.

Образцы синтезированного поли(В,Ь-лактида) с молекулярной массой 150000, смешивали с полиэтиленгликолем (ПЭГ) с молекулярной массой 6000 и 15000. В качестве растворителя был использован хлористый метилен.

Содержание ПЭГ в смеси составляло 10 и 30 %. Для контроля скорости растворения ПЭГ и выхода его из смеси первоначально был использован метод, основанный на измерении массы плёнки до и после выдерживания в воде. Этот способ является общепринятым при исследовании таких систем, как кристаллический поли(Ь,Ь-лактид)/ПЭГ. Однако при использовании, синтезированного нами, аморфного поли(Б,Ь-лактида) оказалось, что относительная потеря массы плёнок до и после инкубации в воде превышает первоначально введённое количество ПЭГ. Поэтому параллельно измерению относительной потери массы проводили независимое определение количественного содержания вышедшего из смеси и растворённого в воде ПЭГ. Способность ПЭГ образовывать окрашенные комплексы с йодом и хлоридом бария позволила провести фотоколориметрическое определение количества растворённого в воде ПЭГ. Оказалось,

что значения относительной потери массы плёнки превышают количество ПЭГ, растворённого в воде (рис. 7).

Рис. 7. Зависимость изменения массы плёнок от времени выдерживания их в воде.

—_ убыль массы пленки после взвешивания (ПЛ/ ПЭГ (6000)); —- фотометрическое определение ПЭГ в растворе (ПЛ/ ПЛ (6000)); —Ж— . убыль массы плёнки после взвешивания (Г1Л/ ПЭГ (15000)); —т— фотометрическое определение ПЭГ в растворе (ПЛ/ ПЭГ (15000)). а - 10 % ПЭГ, б-30 %ПЭГ.

Полученные результаты объясняются способностью смеси аморфного полиф,Ь-лактида) и ПЭГ образовывать двухфазную систему. Причём каждая фаза имеет минорное содержание второго компонента. В процессе растворения ПЭГ в воде вместе с ним в водную среду уходит частично растворённый в нём полиф.Ь-лактид). Оставшаяся фаза поли(0,Ь-лактид) содержит минорное количество ПЭГ, что и было подтверждено данными ПМР-спектроскопии.

В процессе исследования было показано, что с увеличением молекулярной массы ПЭГ, снижается его выход из матрицы. Размер и распределение пор на поверхности исследуемых матриц исследовали с помощью метода сканирующей электронной микроскопии (рис.8). При использовании ПЭГ с молекулярной массой 6000 были получены плёнки с размером пор, не превышающем 5 мкм.

Рис. 8 Анализ структуры полимерных образцов методом сканирующей электронной микроскопии. а-Плёнка на основе смеси ПЛ/ПЭГ(6000)-Ю %; б-Плёнка на основе смеси ПЛ/ПЭГ (6000)- 30 %; в-Плёнка на основе смеси ПЛ/ПЭГ( 15000)-10 %; [•-Плёнка на основе смесиШ1/ПЭГ( 15000)- 30 %; д —Боковой срез образца б.

Для исследования токсического влияния остаточного содержания ПЭГ на клетки на полученных матрицах культивировали керагиноциты. Несмотря на то, что клетки на исследуемых матрицах не погибали, их пролиферативная активность уступала контролю

(покровное стекло, покрытое коллагеном). Поэтому была проведена дополнительная обработка поверхности раствором коллагена.

Взаимодействие с подложкой и рост кератиноцитов на пористых пленках, модифицированных коллагеном, были сопоставимы с контролем (рис. 9).

Рис. 9 Характер роста первичных кератиноцтов ; человека в течение 9 сут на полимерных подложках, 1 покрытых раствором коллагена (наблюдение под | световым микроскопом): а - Контроль - покровное стекло, покрытое коллагеном б - Плёнка на основе смеси ПЛ/ПЭГ (6000) - 10 %; в - Плёнка на основе смеси ПЛ/ПЭГ (6000)-30 %; г - Плёнка на основе смеси 11Л/ПЭГ( 15000)-10 % д -Плёнка на основе смеси ПЛ/ПЭГ (15000)-30 %.

8. Влияние аминогрупп, нанесенных на поверхность полилактидной пленки, на организацию актинового цитоскелета кератиноцитов

Внесение чужеродного белка, в частности коллагена, в организм человека может вызывать отрицательную иммунную реакцию. Поэтому в некоторых случаях целесообразно использовать и другие методы модификации поверхности полимерной матрицы.

Для этой цели нами впервые была проведена обработка поверхности полилактидной плёнки раствором лизина. Взаимодействие лизина с поверхностью полилактидной плёнки может происходить за счёт физической сорбции, образования водородных связей аминогрупп лизина со сложноэфирными группами полилакгида, реакции аминолиза с разрывом сложноэфирной связи полилактида. Одна из двух аминогрупп лизина связывается с поверхностью, а вторая остаётся свободной, что обеспечивает слабый положительный заряд поверхности плёнки. Поскольку клетка имеет отрицательный заряд, то за счёт электростатического взаимодействия увеличивается количество прикрепившихся к модифицированной поверхности полилактидной плёнки клеток.

Содержание аминогрупп на поверхности полилактидной плёнки контролировали нингидриновым методом. Для этих целей полилактидные плёнки после обработки раствором лизина при нагревании (55 °С) гидролизовали в течение 24 ч при 120 °С в растворе 6М соляной кислоты в запаянных ампулах. Показано, что наибольшее количество лизина связывается с поверхностью полилактидной плёнки в присутствии метанола (рис.10).

Рис. 10 Количество лизина на поверхности плёнок после обработки в различных условиях

!жя ятт _ вода,

• . вода . изопропиловый спирт = 1:1,

—А—- вода : этиловый спирт = 1:1,

▼ - вода : метиловый спирт = 1:1.

Степень распластанное™ кератиноцптов, нанесенных на модифицированную пленку коррелирует с количеством лизина на ее поверхности (рис. 11).

Рис. 11 Организация актинового цитоскелета кератиноцптов на модифицированных и

немодифицированном полимерных плёнках.

а - полилактидные плёнки без обработки,

обработка плёнок раствором лизина: б - в воде, в - в смеси вода : изопропиловый спирт = 1:1, г -в смеси вода : этиловый спирт = 1:1, д -в смеси вода : метиловый спирт=1:1.

Таким образом, поставленные задачи были выполнены. Получена модифицированная полилактпдная плёнка, способствующая прикреплению и размножению кератиноцитов, которая в дальнейшем после доказательства её эффективности при заживлении ран на лабораторных животных может быть использована в клинике для лечения повреждения кожного покрова.

ВЫВОДЫ

1. Разработанные нами биодеградируемые полимерные плёнки на основе полилактида позволяют культивировать на них кератиноциты человека и получать многослойные пласты клеток для последующей трансплантации без предварительной ферментативной обработки.

2. Биосовместимость полученных пленок, способствующая прикреплению и росту клеток, достигается путем модификации их поверхности коллагеном I типа или лизином.

3. .Структура и распределение коллагена на поверхности пленок зависит от условий его нанесения и влияет на поведение взаимодействующих с ним клеток. Наилучшие

распределение кератиноцитов по поверхности пленки, их рост, морфология и пространственная организация цитоскелета достигаются при нанесении коллагена в фибриллярной форме.

4 Путём смешивания полилактида с полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ), и удалением последнего из готовой матрицы можно получить пористые плёнки, которые улучшают взаимодействие клеток с окружающей средой при их культивировании и после переноса пласта на рану.

5. Разработанные полилактидные пленки в условиях культуры и при внесении в экспериментальные раны лабораторных животных являются не токсичными и обладают удовлетворительной скоростью резорбции, и, следовательно, могут быть использованы в технологиях клеточной заместительной терапии.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Швед Ю А.. Кухарева JI.B., Зорин И.М., Соловьев А.Ю., Блинова М.П., Билибин А.Ю , Пинаев Г.П «Культивирование фибробластов кожи человека на полимерной полилактидной подложке». Цитология, 2006, т.48, № 2, с. 161-168.

2. Швед Ю А.. Кухарева JI.B., Зорин И М., Блинова М.И., Билибин А.Ю., Пинаев Г.П. Взаимодействие культивируемых клеток кожи с разными структурными формами коллагена, нанесённого на полилактидную матрицу Цитология, 2007, т.49, № 1, с.32-39.

3. Швед Ю. А.. Кухарева JI. В., Зорина Н. А , Зорин И. М, Пинаев Г. П, Билибин А. Ю., Деградация полилактидных плёнок в условиях кульивирования клеток: оценка влияния компонентов среды.// Труды III научной сессии УНЦХ СПбГУ. Санкт-Петербург, 27-28 ноября, 2004, стр 351.

4. Швед Ю. А.. Зорин И. М., Кухарева JI. В..Блинова М. И., Билибин А. Ю. Пинаев Г. П. Разработка резорбируемых полилактидных плёнок в качестве субстрата для культивирования клеток человека. // Симпозиум «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия», С.-Петербург, 25-27 октября 2004 г., стр. 949

5. Швед Ю.А.. Кухарева JI.B, Соловьев А Ю., Зорин И.М., Пинаев Г.П., Билибин А.Ю. Нанесение коллагена на поверхность полилактидных пленок. Материалы С.-Петербургской конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах», 1-3 февраля 2005 г., с.110..

6. Швед Ю.А.. Кухарева JI.B., Зорин И.М., Пинаев Г.П., Билибин А.Ю. Сорбция коллагена на поверхности пористых пленок на основе смеси полилактида и полиэтиленгликоля.// Материалы XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005», Москва, 12-15 апреля 2005 г., с. 493-494.

7. Швед Ю.А.. Кухарева Л.В., Пинаев Г.П., Билибин А.Ю.. Влияние коллагенового покрытия на поведение кожных фибробластов и кератиноцитов человека на поверхности полилактида. // Материалы 9-ой Международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», 18-22 апреля 2005 г., Пущино, с. 176.

8. Shved JuA.. Zorin I.M., Makarov V I., Pinaev G.P., Bilibin A.Ju. Keratinocytes and fibroblast cultivation on polylactide-polyethylenglycol copolymer and blend films of skin. European Polymer Congress, Moscow, June, 2005, c.4106.

9. Shved Ju A, Zorin I.M., Pinaev G.P., Bilibin A.Ju. Keratinocytes and fibroblasts cultivation on the degradable polylactide films for substitutive cell therapy of skin. // International conference "New polymer systems for biotechnological and biomedical applications" (доклад). Jerevan. Republic Armenia. July 12-14, 2005, p. 17-22.

10. Швед Ю.А. Разработка резорбируемой полимерной подложки для культивирования кератиноцитов человека. // Всероссийская конференция молодых исследователей «Физиология и медицина» 14-16 апреля 2005, Санкт-Петербург .стр 137

11. Shved Yu A., Kukhareva LV., Zorin I.M., Pinaev G.P., Bilibin A.Yu. Enhance cell affinity to poly(d,l-lactide) films by treatment with fibrillar collagen "Biomaterials" 1- 4 Oct, 2006, Hamburg, p. 93

12. Bilibin A.Yu., Sved Yu.A., Zorin I.M., Pinaev G.P. Poly-D,L-Lactide Films for cell cultivation - influence of the surface modification on cell adhesion. "Biomaterials" 1- 4 Oct, 2006, Hamburg, p. 8

13. Швед Ю.А, Кухарева JI.B., Блинова М.И., Билибин А.Ю., Пинаев Г.П. Влияние различных форм коллагеновых субстратов, прикрепленных к полимерной подложке, на рост клеток кожи в культуре» (доклад). // Международная конференция "Биология клетки в культуре" Санкт-Петербург, 17-19 октября, 2006.

14. Shved Yu А. , Blinova М. I., Khureva L. V., Pinaev G. P.,Bilibin A. Yu. Development on polymer matrix for cultivation of skin cells British-Russian workshop in association with the European Commission "Stem cells: policy, research, and innovations. European Union - Russian Federation perspectives". Moscow, Marchl5, 2007, p.13.

15. Швед Ю A. Пинаев Г. П, Билибин А. Ю. Культивирование клеток кожи на полилактидных матрицах. // IV Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 12-16 марта, 2007, с. 53-54

16. Shved Ju.A . Pinaev G.P., Bilibin A.Ju. Keratinocytes and fibroblasts cultivation on the degradable polylactide films for substitutive cell therapy of skin. // International conference "New polymer systems for biotechnological and biomedical applications" (доклад) Yerevan. Republic Armenia. Oct 1- 4, 2007, p. 17-22.

17. Sved Yu.A, Kukhareva L.V., Zorin I.M., Pinaev G.P., Bilibin A.Yu. Enhance cell affinity to poly(d,l-lactide) films by treatment with fibrillar collagen. // "3rd World Congress on Regenerative Medicine" Oct 17- 22, 2007, Leipzig, p. 93

18. Швед Ю.А , Кухарева JI. В., Блинова М. П., Билибин А. Ю., Пинаев Г. П. Создание биодеградируемой полимерной плёнки, предназначенной для культивирования клеток кожи. // V конференция молодых учёных с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» 19-22 мая, 2008, Москва, стр. 479

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Адамсон А. Физическая химия поверхностей, Москва, 1979, 569 стр.

Amitlya К. Saxena А. К., Benvenuto М„ MarJer J, Joseph P. Vacanti J P. Skeletal Muscle Tissue Engineering Using Isolated Myoblasts on Synthetic Biodegradable Polymers: Preliminary Studies // Tissue Engineering 1999. V. 5. №6. P.525 - 531.

Hodges G. M., Livingston D. C., Franks L. M The localization of trypsin in cultured mammalian cellsWJ.Cell Sci. 1973. V.12. P.887-902

Kricheldorf, H. R.; Kreiser-Saunders, /.; Damrau, D.-0.\ Resorbable initiators for polymerizations of lactonesMacromol. Sypm. 1999, 144,269

Longer R, Vacanti J. P. Tissue engineering // Science. 1993. V. 260. P. 920-926.

Lanza R.P., Longer R., Chick W.L. Principles of Tissue Engineering // Academic Press: SanDiero. 2004. p. 1020.

Morrison G. Advances in the skin trade // Mechanical. Eng. 1999 V. 121. P. 40-43.

Oakes B. W. Orthopaedic tissue engineering: from labora tory to the clinic // Med. J. Aust. 2004. V. 180 P. 35-38.

Ramos-e-Silva M, Ribeiro de Castro M. New Dressings, Including Tissue-Engineered Living Skin // Clinics in Dermatology. 2002. V. 20. P. 715-723.

Rheinwald J G Serial cultivation of normal epidermal keratinocytes // Meth.Cell Biol. 1980. V.21A. P. 229-254.

Швед Ю.А., Кухарева JI.В., Зорин И.М., Соловьев А.Ю. , Блинова М.И, Бшибин А.Ю., Пинаев Г.П Культивирование фибробластов кожи человека на полимерной полилактидной подложке // Цитология, 2006, т.48, № 2, с. 161-168.

Швед Ю.А., Кухарева Л.В., Зорин И.М, Блинова МИ., Билибин А.Ю, Пинаев Г.П. Взаимодействие культивируемых клеток кожи с разными структурными формами коллагена, нанесённого на полилактидную матрицу // Цитология, 2007, т.49, № 1, с.32-39.

Лицензия ЛР № 020593 от 07 08.97

Подписано в печать 26 09.2008 Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ л. 1,0. Уч -изд л 1,0. Тираж 100. Заказ 3448Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.(812)550-40-14 Тел/факс: (812) 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Швед, Юлия Александровна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Биоматериаловедение — междисциплинарный подход к изучению полимеров.

1.2 Полимеры медико-биологического назначения.

1. 3 Тканевая инженерия.

1.3.1 Принципы и методы тканевой инженерии.

1.3.2 Основные требования к полимерам в тканевой инженерии.

1. 3. 3 Синтетические биодеградируемые полимеры.

1. 4 Строение кожи и способы лечения повреждений кожного покрова.

1.4.1 Строение кожного покрова.

1. 4. 2 Строение коллагена и его свойства.

1. 4. 3 Подготовка клеточного продукта для трансплантаций.

1.4.4 Формирование полимерных матриц для культивирования клеток.

1. 5 Взаимодействие клеток с полимерной поверхностью скаффолда.

1. 6 Модификация полимерного субстрата.

1.6.1 Физические способы модификации.

1.6.2 Химические способы модификации полимерной поверхности.

Глава 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Приготовление материалов и реагентов.

2.1.1 Синтез поли( В,Ь-лактида).

2.1.2 Формирование плёнок методом полива из раствора.

2.1.3 Получение тонких полимерных плёнок.

2.1.4 Гидрофобизация покровных стёкол.

2.1.5 Получение пористых плёнок из смеси полилактида (ПЛ) и полиэтиленгликоля (ПЭГ).

2.1.6 Получение коллагена.

2.2 Модификация поверхности полилактидных пленок.

2.2.1 Нанесение коллагена на полимерный субстрат.

2.2.2 Модификация полилактидных плёнок лизином.

2.3 Методы исследования.

2.3.1 Измерение гидрофильно-гидрофобных характеристик поверхности полимерной плёнки методом пластинок Вильгельми.

2.3.2 Оценка количества растворённого ПЭГ по потере массы.

2.3.3 Определение концентрации полиэтиленгликоля в водных растворах.

2.3.4 Определение оксипролина в коллагене.

2.3.5 Определение концентрации коллагена.

2.3.6 Выявление структуры коллагена.

2. 3.7 Нингидриновый метод анализа.

2. 3. 8 Ядерный магнитный резонанс.

2. 3. 9 Сканирующая электронная микроскопия.

2. 4 Выделение клеток кожи и анализ их поведения на исследуемых субстратах

2.4.1 Выделение и культивирование первичных фибробластов.

2.4.2 Выделение и культивирование первичных кератиноцитов.

2.4.3. Оценка состояния клеток на полимерных плёнках.

2.4.4 Адгезия фибробластов.

2.4.5 Анализ структуры актинового цитоскелета.

Глава 3. Результаты.

3.1. Синтез поли(Б,Ь-лактида).

3.2. Получение полимерных плёнок из полилактида разными способами.

3.2.1 Плёнки, полученные методом полива из раствора.

3.2.2. Полимерные плёнки, полученные на покровном стекле.

3.3. Влияние условий получения полимерных плёнок на взаимодействие фибробластов с полимерной поверхностью полилактидной плёнки.

3.4. Исследование деградации полилактидных плёнок in vitro.

3.5. Исследование деградации полилактидных плёнок in vivo.

3.6. Модификация полилактидной плёнки.

3.6. 1. Нанесение коллагена на полилактидную матрицу.

3.6.2 Влияние покрытия полимерных пленок коллагеном на поведение культивируемых кератиноцитов.

3.7. Формирование пористых плёнок на основе смеси полилактида и полиэтил енгликоля.

3.7.1 Исследование скорости растворения ПЭГ.

3.7.2 Культивирование кератиноцитов на плёнках, приготовленных на основе смеси ПЛ и ПЭГ.

3.7.3 Модификация коллагеном пористых плёнок и культивирование на них кератиноцитов.

3.8. Модификация полилактидных плёнок раствором лизина.

Глава 4. Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Культивирование клеток кожи, предназначенных для заместительной терапии, на полимерных плёнках"

Разработка технологий лечения повреждённых органов и тканей методами заместительной клеточной терапии является перспективным направлением современной регенеративной медицины. В основе этого метода лечения лежит введение в организм пациента стволовых или дифференцированных клеток, которые замещают утраченные. Для этой цели используют культивируемые клетки, которые выделяют из костного мозга и тканей самого пациента или здоровых доноров.

Актуальность работы. Восстановление целостности повреждённой ткани требует создания нормального микроокружения для трансплантируемых клеток, способствующего их размножению, дифференцировке и созданию нормальных структур тканей. В организме создание такого микроокружения обеспечивают белки внеклеточного матрикса. Эти белки и в частности коллаген, используют, поэтому, при культивировании клеток и при создании клеточных композиций для дальнейшей трансплантации в поврежденные ткани пациента. При переносе клеток из культуральных сосудов в раны возникают, однако, проблемы сохранения их пространственной организации и функциональных свойств. Они связаны, прежде всего, с недостаточной механической прочностью клеточных ассоциаций и с неизбежным повреждением клеток в результате ферментативной обработки при отделении клеточных пластов от поверхности сосудов, в которых их культивируют.

Размножение и рост клеток на полимерных матрицах, обладающих достаточной механической прочностью и имеющих определённую пространственную архитектуру, может способствовать формированию структурной основы дифференцирующихся тканей. Поэтому в последнее время при создании клеточных продуктов, необходимо использовать полимеры, для обеспечения сохранения исходного состояния межклеточных контактов и поверхностных рецепторов клеток. В зависимости от практических задач к таким полимерам предъявляется ряд требований, в том числе, биосовместимость и способность рассасываться в процессе восстановлении структуры ткани. Таким образом, в настоящее время сформировалась новая междисциплинарная область науки — тканевая инженерия, которая включает в себя принципы и методы инженерии, химии, физики и клеточной биологии. В основе тканевой инженерии лежит культивирование клеток на искусственных полимерных матрицах.

Одним из приоритетных направлений тканевой инженерии является восстановление структурной целостности повреждённых кожных покровов, возникающих в результате ожогов, трофических язв и другого рода повреждений. Культивирование кератиноцитов на полимерных матрицах и последующая трансплантация сформировавшегося клеточного пласта вместе с такой матрицей в организм позволяет исключить процедуру обработки клеток протеолитическими ферментами. Перенесённая в организм биодеградируемая полимерная матрица со временем рассасывается, а клетки способствуют восстановлению кожных покровов.

Целью работы являлся поиск оптимальных условий для культивирования клеток кожи на биодеградируемых полимерных плёнках, сформированных на основе поли(0,Ь-лактида) для заместительной клеточной терапии.

В процессе исследования были решены следующие задачи:

1. Подобраны оптимальные условия для культивирования клеток кожи на полил актидных плёнках.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Швед, Юлия Александровна

Выводы

3. .Структура и распределение коллагена на поверхности пленок зависит от условий его нанесения и влияет на поведение взаимодействующих с ним клеток. Наилучшие распределение кератиноцитов по поверхности пленки, их рост, морфология и пространственная организация цитоскелета достигаются при нанесении коллагена в фибриллярной форме.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Швед, Юлия Александровна, Санкт-Петербург

1. Абаев Ю.К. Абаев, В.Е. Капуцкий, Адарченко А.А. Новый перевязочный материал для лечения гнойных ран // Здравоохранение. 1995. №11.

2. Алъбертис Б. и др. "Молекулярная биология клетки". Т. 1, 2. Мир, 1994 г.

3. Барабанов В. П., Осипов О. П., Санников С. Г., Торсуев Д. М. Исследование смачивания фторополимеров И Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. 2002. № 6, с/ 47-50

4. Билибин А.Ю., Зорин И.М. Деструкция полимеров, ее роль в природе и современных медицинских технологиях // Успехи химии. 2006. № 75. стр. 151165.

5. Вагнер Е.А. Углеродный материал нового поколения в эндопротезировании костей и суставов. Пермь: Изд-во Пермс. ун-та. 1993. 64 с.

6. Искаков Р. М., Батырбеков Е. О., Сулейменов И. Э., Бектуров Е. А., Жубанов Б. А. Полимерные биоматериалы Алматы. 2005

7. Жеребцов Н.А., Попова Т.Н., Артюхов В.Г. Биохимия: Учебник / Воронеж: Изд. Вор. гос. ун. 2002. 696 с.

8. Живетин В. В., Осипов Б. П., Осипова Н. Н. Льняное сырье в изделиях медицинского и санитарно-гигиенического назначения // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д. И.Менделеева). 2002, т. XLVI, №2

9. Капуцкий В.Е., Адарченко А.А., Собенчук О.П., Красшьников И.П. Изучение антимикробных свойств целлюлозы и других полимерных материалов, модифицированных хлоргексидином // Антибиотики и химиотерапия. 1991. №3.

10. Макаров К.А., Штейнгард М.З. Сополимеры в стоматологии // М.: Медицина. 1982. 247 с.

11. Михаилов И.Н. Структура и функции эпидермиса// М.: Медицина. 1979.

12. Никитин В. И., Перский Е. Э.б Утевская Л. А. Возрастная и эволюционная биохимия коллагеновыз структур. Киев: Наукова думка. 1977. 279 стр.

13. Привес М. Г., Лысенков Н. К. Анатомия человека С-Пб: «Гиппократ», 1999. 704 с.

14. Пхакадзе Г.А. Биодеструктируемые полимеры. Киев: Наукова Думка. 1990. 160 с.

15. Смирнова Т.А., Юркштович Т.Л., Герасимович Г.Н., Капуцкий Ф.Н. Современные препараты на основе производных целлюлозы в клинической практике//Медицина. 1996. V. 5. С. 39-43.

16. Спичкина О. Г., Калмыкова Н. В., Кухарева Л. В., Воронкина И. В., Блинова М. И., Пинаев Г. П. Выделение популяции базальных кератиноцитов человека путём их селективной адгезии к белкам внеклеточного матрикса // Цитология 2006. т. 48. №10. стр. 841-847

17. Фаллер Дж.М., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки. М.:Изд-во Бином, 2003.

18. Физическая химия: Учебник для вузов. М.: Химия. 2000. 320с.

19. ХэмА., КормакД. Гистология. М.: Мир. 1983.С. 191.

20. Шапиро М.С. Цианакрилатные клеи в травмотологии и ортопедии // М.: Медицина. 1976. 102 с.

21. Швед Ю.А., Кухарева Л.В., Зорин И.М., Соловьев А.Ю. , Блинова М.И., Билибин А.Ю., Пинаев Г.П. Культивирование фибробластов кожи человека на полимерной полилактидной подложке // Цитология. 2006. т.48. № 2. с.161-168.

22. Швед Ю.А., Кухарева Л.В., Зорин И.М., Блинова М.И., Билибин А.Ю., Пинаев Г.П. Взаимодействие культивируемых клеток кожи с разными структурными формами коллагена, нанесённого на полилактидную матрицу // Цитология, 2007, т.49, № 1, с.32-39.

23. Штилъман М. И. Полимеры медико-биологического назначения // М.: Академкнига. 2006. 400 с.

24. Aldwinckle T.J., Ahkong Q.F., Bangham A.D., Fisher D., Lucy J.A. Effects of poly(ethylene glycol) on liposomes and erythrocytes. Permeability changes and membrane fusion //Biochim. Biophys. Acta. 1982. V. 689. P. 548-560.

25. Amiji, M; Park, K. Prevention of protein adsorption and platelet adhesion on surfaces by PEO/PPO/PEO triblock copolymers. Biomaterials. 1992;13(10):682-692.

26. Amulya K. Saxena A. K., Benvenuto M., Marler J., Joseph P. Vacanti J. P. Skeletal Muscle Tissue Engineering Using Isolated Myoblasts on Synthetic Biodegradable Polymers: Preliminary Studies // Tissue Engineering 1999. V. 5. №6. P.525 531.

27. Andrade J.D., Hlady V. Protein adsorption and materials biocom-patibility: a tutorial review and suggested hypotheses // Adv. Polym. Sci. 1986. V. 79. P. 1-63.

28. Ashammakhi N., Rokkanen P. Absorbable polyglycolide devices in trauma and bone surgery//Biomaterials. 1997. V. 18. P. 3-9.

29. Barrera D., Zylstra E., Lansbury P., Langer R. Copolymerization and degradation of poly(lactide acid) // Macromolecules. 1995. V. 28. P. 425 -432

30. Behravesh E., Yasko A.W., Engle P.S., Mikos A.G. Synthetic biodegradable polymers for orthopaedic applications // Clin Orthop. 1999 V. 36. P. 118-185.

31. Bell E., Ehrlich H. P., Buttle D. Nakatsuji T. Living tissue formed in vitro and accepted as a skin equivalent tissue of full thickness // Science. 1981. V. 211. P. 1052-1054

32. Belkas J.S., Munro C.A., Shoichet M.S., Johnston M., Midha R. Long-term in vivo biomechanical properties and biocompatibility of poly(2- hydroxyethyl methacrylate-co-methyl methacrylate) nerve conduits // Biomaterials. 2005. V. 26. P. 1741-1749.

33. Bero M., JKasperczyk, ZJJedlinski. Coordination polymerization of lactides// Makromol Chem. 1990. V. 191. P. P. 2287- 2296.

34. Bertrand P., Jonas, A., Laschewsky, Legras R. XJltrathin polymer coatings by complexation // Macromol. Rapid Commun. 2000,. V. 21. P. 319-348.

35. Brady J.M., Outright D.E., Miller R.A. Resorption rate, route, route of elimination, and ultrastructure of the implant site of polylactic acid in the abdominal wall of the rat//J. Biomed. Mater. Res. 1973. V. 7. P. 155-166.

36. Brach del Prever E.M., Costa L., Crova M., Dallera A., Gallinaro P., Camino G. Luda M.P. Unacceptable biodegradation of UHMWPE in vivo // Biomaterials. 1996. V.17. P.873-878.

37. Branham G.H., Thomas J.R. Skin grafts // Otolaryngol. Clin. North. Am. 1990. V. V. 23. P. 889-897.

38. Briesewitz R., Epstein M. R., Marcantonio E. E. Expression of native and truncated forms of the human integrin alpha 1 subunit // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 2989-2996.

39. Buck, C., Horwitz A.F. Cell surface receptors for extracellular matrix molecules //Annu. Rev. Cell Biol. 1987. V. 3. P. 179-205.

40. Analysis of the Integrin Subunit 10, a 1-associated Collagen Binding Integrin Expressed on Chondrocytes // J. Biol. Chem. 1998 V. 273. P. 20383-20389.

41. Carver N., Leigh I.M. Keratinocyte grafts and skin equivalents // Int. J. Dermatol. 1991. V. 30. P.540-551.

42. Chabot F., Vert M., ChapeUe S. Configuration structures of lactic acid stereocopolymers as determined by 13C-1 H-NMRJ. // Polymer. 1983. V. 24. P. 5359.

43. Chujo. K., Kobayashi. H., Suzuki. J., Tokuhara S. Physical and chemical characteristics of polyglycolide//Makromol. Chem. 1967. V. 100

44. Cima L.G., Vacanti, J.P., Vacanti, C., Tissue engineering by cell transplantation using degradable polymer substrates // J. Biomech. Eng. 1991. V. 113. P. 143.

45. Clyde G., Hardwick C. Extracellular Matrix Contraction by Choroidal Fibroblasts:Inhibition by Staurosporine // Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1994. V. 35. №2.

46. Dai N.T., Williamson M.R., Khammo N., Adams E,F., Coombes A,G., Composite cell support membranes based on collagen and polycaprolactone for tissue engineering of skin // Biomaterials. 2004. V. 25. P. 4263-4271

47. Decher G., Hong, J.-D. //Ber. Bunsen-Ges. 1991. V. 95. P. 1430. Decher G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites Science. 1997. V. 227. P. 1232-1237

48. Deschler D.G., Hayden R.E. Head and neck reconstruction // Neuroimag Clin N Am. 1996. V. 6. P. 505-514.

49. Dubois Ph., Jacobs C., Jerome R., Teyssie Ph. Macromolecular engineering of polylactones and polylactides. 4. Mechanism and kinetics of lactide homopolymerization by aluminum isopropoxide // Macromolecules. 1991. V. 24. P. 2266-2270.

50. Duvernoy V. A., Malm Т., Ramstrom J. A biodegradable patch used as a pericardial substitute after cardiac surgey: 6- and 24-month evaluation with CT // Thorac. Cardiovasc. Surg. 1995. Y.43. №5. P. 271-274

51. Ellis D.L., Yannas I. V. Recent advances in tissue synthesis in vivo by use of collagen-glycosaminoglycan copolymers // Biomaterials. 1996. V. 17. P. 291—299.

52. Evans G.R.D., Brandt K, Widmer S. In vivo evaluation of poly(L-lactic acid) porous conduits for peripheral nerve regeneration I I Biomaterials 1999. V. 20. P. 1109-1115.

53. Finley J. IV., Friedman M. Chemical methods for available lysine // Cereal Sci. 1973. V. 50. P. 101-105.

54. Freedlander E. New forms of skin grafting: from the laboratory to the clinic I I HospMed. 1998. V.59. P. 484-487.

55. Gan D., Lu S., Cao W. W. Formation of nanoporous poly(aryl amide ether) (PAAE) films by selective removal of poly(ethylene glycol) (PEG) from PEG/PAAE composite films // European Polymer Journal. 2004. V. 40.№11.P.2481-2486.

56. Garric X., Molus J.-P., Garreau H., Guilhou J.-J. Vert M. Human skin cell cultures onto PLA50 (PDLLA) bioresorbable polymers : Influence of chemical and morphological surface modifications // J. Biomed. Mat. Res. 2005. V. 72. P. 180-189.

57. Gogolewski S., Pennings A.J. An artificial skin based on biodegradable mixtures of polylactides and polyurethanes for full-thickness skin wound covering // Makromol. Chern. Rapid. Commun. 1983. V. 4. P. 675-680

58. Gonsalves К. E., Jin S., Baraton M. Synthesis and surface characterization offunctionalized polylactide copolymer microparticles // Biomaterials. 1998. V. 19. P. 1501-1505.

59. Gopferich A. Mechanisms of polymer degradation and erosion // Biomaterials. 1996. V. 17. P. 103-114

60. Groth Т., Altankov G., Kolsz K. Adhesion ofhuman peripheral blood lymphocytes is dependent on surface of wettabilty and protein preadsorption // Biomaterials. 1994. V. 15. P. 423-^28.

61. Gugala Z., Gogolewski S. Protein adsorption, attachment, growth and activity of primary rat osteoblasts on polylactide membranes with defined surface characteristics //Biomaterials. 2004 V. 25. P. 2341-51.

62. Halpem B. D., Tong Y.-C. In: Encycl. of Polymer Sci. and Eng // Willey: New-York. 1986. V.9. P.486-508.

63. Han D. K., Hubbell J. A. Lactide-based poly(ethylene glycol) polymer networks for scaffolds in tissue engineering //Macromolecules. 1996. V. 29. P. 5233— 5235.

64. Hansbrough J.F., Morgan J., Greenleaf G., Parikh M, Nolte C., Wilkins L. Evaluation of Transplanted Tissue-Engineered Oral Mucosa Equivalents in Severe Combined Immunodeficient Mice I I J. Burn. Care Rehabil. 1994. V. 4. P. 15-20.

65. Hentze H.-P., Antonietti M. New polymers for molecular biotechnology // Reviews in Molecular Biotechnology. 2002. V. 90. P. 27-35.

66. Herold D.A., Keil K., Brims D.E. Oxidation of polyethylene glycols by alcohol dehydrogenase //Biochem. Pharmacol. 1989. V. 38. P. 73-76.

67. Hoffmann A.S. Biologically functional materials. In: Ratner BD, Hoffman AS, Schoen FJ, Lemons JE, editors // Biomaterials science: an introduction to materials in Medicine 1996. New York: Academic Press. 1996. p. 124-30.

68. Hollahan J.R., Stafford B.B., Falb R.D., Payne S.T. Attachment of amino groups to polymers surfaces by radiofrequency plasmas // J. Appl. Polym. Sci. 1969. V. 13. P. 807-816.

69. Hong Y., Gao C.Y., Xie Y., Gong Y.H., Shen J.C. Collagen-coated polylactide microspheres as chondrocyte microcarriers // Biomaterials. 2005. V. 26. P. 63056313.

70. Hua Y., Hua Y.S., Topolkciraev V., Hiltnera A., Baera E. Aging of poly(lactide)/poly(ethylene glycol) blends // Polymer. 2003 V. 44. P. 5711-5720.

71. Huang J., Lisowski M.S., Runt J., HallE.S., KenR.T., BuehlerN., LinJ.S. Crystallization and Microstructure of Poly(L-lactide-co-meso-lactide) Copolymers // Macromolecules. 1998 V. 31. P. 2593-2599.

72. Ни Y., Rogunova M., Topolkaraev V., Hiltner A., Baer E. Poly(lactide) with low stereoregularity// Polymer. 2004. V. 44. P. 5701-5710.

73. Hutmacher D. W. Polymeric scaffolds in tissue engineering, bone and cartilage // Biomaterials. 2000. V. 21. P. 2529-2543.

74. Jacobson B.S, Branton D. Plasma membrane: rapid isolation and exposure of the cytoplasmic surface by use of positively charged beads // Science 1977. V. 195. P. 302-304.

75. J eon S.I., Andrade J.D. Protein-surface interactions in the presence of polyethylene oxide II. Effect of protein size // J. Colloid. Interface. Sci. 1991. V. 142. P. 159-166.

76. Jin S., Gonsalves K.E. Synthesis of functionalized polylactide and it graft copolymers with polyethylene glycol) // Polymer. 1998. V. 39. P. 5155-5162

77. Kadler К E., Holmes D. F., Trotter J. A., Chapman J. A. Collagen fibril formation // Biochem. J.l 996 V. 316. P. 1-1 1.

78. Karp J.M., Shoichet M.S., Davies J.E. Bone formation on two dimensional poly(D,L-lactide-co-glycolyde) (PLGA) films and three-dimensional PLGA tissue engineering scaffolds in vitro // J. Biomed Mater Res. 2003. V.64. №2. P. 388-396.

79. Kawai, K; Suzuki, S; Tabata, Y; Ikada, Y; Nishimura, Y. Accelerated tissue regeneration through incorporation of basic fibroblast growth factor-impregnated gelatin microspheres into artificial dermis // Biomaterials. 2000;21:489-499

80. Khang G., Choee J.-H., Rhee J.M., Lee H.B. Interaction of different types of cells on physicochemically treated poly(L-lactide-co-glycolide) surfaces // J. Appl. Polym. Sci. 2002. V. 85. P. 1253-1262.

81. KimS-S., GwakS-J., Cha Yong Choi, Kim B-S. Skin regeneration using keratinocytes and dermal fibroblasts cultured on biodegradable microspherical polymer scaffolds // Journal of biomedical materials research. 2005. V. 75B. №2. p. 369-377.

82. Kishida A., Iwata H., Tamada Y., Ikada Y. Cell behaviour on polymer surfaces grafted with non-ionic and ionic monomers //Biomaterials. 1991. V. 12. P. 786-792.

83. Kiss E.l, Vargha-Butler E.I. Novel method to characterize the hydrolytic decomposition of biopolymer surfaces // Colloids and Surfaces B. 1999. V. 15. №3. P. 181-193.

84. Kricheldorf H. R. Syntheses and application of polylactides // Chemosphere. 2001. V.43.P. 49-54.

85. Kricheldorf H.R., Krieiser-Saunders I., Boettcher C. Polylactones: 31. Sn(II)octoate-initiated polymerization of L-lactide: a mechanistic study // Polymer. 1995. V. 36. P. 1253- 1259.

86. J.T., Carlsson J., Lin J.N., Caldwell K.D. Chemical modification of surface active poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide) triblock copolymers // Bioconjugate. Chem. 1996. V. 7. P. 592-599.

87. S.M., Garreau II, Vert M. Structure-property relationships in the case of the degradation of massive aliphatic poly-(o-hydroxy acids) in aqueous media. Part 1: poly-(DL-lactic acid) //J. Mater. Sci. 1990. V. 1. P. 123-130.

88. S., Vert M. Biodegradation of aliphatic polyesters. In: Gilead GSD, editor. Biodegradable polymers, principles and application. London: Chapman and Hall. 2003. p 43-87

89. Ma Z.W., Gao C.Y., Ji J., Shen J.C. Protein immobilization on the surface of poly(l-lactic acid) films for improvement of cellular interactions // Eur Polym. J. 2002.V. 38. P. 2279.

90. Martin O., Averous L. Poly(lactic acid): plasticization and properties of biodegradable multiphase systems I I Polymer. 2001. V. 42. P. 6209 6215.

91. Maruguchi Т., Maruguchi Y., Suzuki S., Matsuda K., Toda K., Isshiki N. An experimental study of novel bioartificial materials applied to glycotechnology for tissue engineering //Plast. Reconstr. Surg. 1994. V. 3. P. 93-98.

92. Matsuzaka K., Walboomers F. Effect of microgrooved poly-l-lactic (PLA) surfaces on proliferation, cytoskeletal organization, and mineralized matrix formation of rat bone marrow cells // Clin. Oral Impl. Res. 2000. V. 11. P. 325-333.

93. Mercier 1., Lechaire J.P., Desmouliere A., Gaill F., Aumailley M. Interactions of human skin fibroblasts with monomeric or fibrillar collagens induce different organization of cytoskeleton // Exp. Cell Res. 1996. V. 225. P. 245- 256.

94. Middleton J.C., Tipton A.J. Synthetic biodegradable polymers as medical devices // Med. Plastics Biomater. Mag. 1998. V. 3. P. 30-35

95. Middleton J.C., Tipton A.J. Synthetic Biodegradable Polymers as Orthopedic Devices // Biomaterials. 2000. V. 21. P. 2335-2346.

96. Moisted K. Treatment outcome in cleft lipand palate: issues and perspectives // Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 1999. V. 10. P. 225-239.

97. Mooney D.J., Powell С., Piana J., Rutherford B. Engineering dental pulp-like tissue in vitro // Biotechnol. Prog. 1996. V. 12. P. 865-868.

98. Morrison G. Advances in the skin trade // Mechanical. Eng. 1999 V. 121. P. 40-43.

99. Nakane K., Hata Y, Morita K., Ogihara Т., Ogata N. Porous Poly(L-lactic acid)/Poly(ethylene glycol) Blend Films Journal of Applied Polymer // Science. 2004. V. 94. P. 965-970.

100. Neumann Т., Hauschka S.D., Sanders J.E. Tissue engineering of skeletal muscle using polymer fiber arrays // Tissue Eng. 2003. V. 9. P. 995-1003.

101. Nieuwenhuis J. Synthesis of Polylactides, Polyglycolides and their Copolymers // Clin. Mater. 1992. V. 10. P. 59-67.

102. Nimni M.E., Harkness R.D. Molecular structures and functions of collagens I I In: Nimni M.E. Collagen: V. I. Biochemistry. 1988. CRC Press. Boca Raton. P. 1-79.

103. Nijenhuis A.J., Grijpma D. W. , Pennings A.J. Lewis acid catalyzed polymerization of L-lactide. Kinetics and mechanism of the bulk polymerization // Macromolecules. 1992. V. 25. P. 6419-6424.

104. Nijenhuis A., Colstee E., Grijpma D.W., Pennings A.J. Synthesis of polylactides, polyglycolides and their copolymers // Polymer 1996. V. 37. P. 58495867.

105. Oakes B. W. Orthopaedic tissue engineering: from labora tory to the clinic // Med. J. Aust. 2004. V. 180. P. 35-38.

106. Okihara Т., Tsuji M., Kawaguchi A., Katayama K.-I., Tsuji H., Hyon S.-H., Ikada Y. Crystal structure of stereocomplex of poly(i--lactide) and poly(D-lactide) // J Macromol Sci Phys. 1991. V. B30. P. 119-140.

107. Ophof Ricardo, Maltha Jaap C., Kuijpers-Jagtman Anne-Marie, Von Den Hoff Johannes W. Evaluation of a Collagen-Glycosaminoglycan Dermal Substitute in the Dog Palate // Tissue Engineering. 2007, November 1, 13(11)

108. Otsuka H., Nagasaki Y., Kataoka K. Surface characterization of functionalizedpolylactid e through the coating with heterobifunctional poly(ethylene glycol)/polylactide block copolymers // Biomacromolecules. 2000. V. 1. P. 39-48.

109. Papadopoulos G.K., Ouzounis C., Eliopoulos E. RGD sequences in several receptor proteins: novel cell adhesion function of receptors? // Int. J. Biol. Macromol. 1998. V.22. P. 51-57.

110. Pashkuleva I., Marques A.P. Surface modification of starch based blends using potassium permanganate-nitric acid system and its effect on the adhesion and proliferation of osteoblast-like cells // J. Mater. Sci. Mater. Med. 2005 V. 16. P. 8192.

111. Penczec S., Duda A., Szymanski R., Biela T. What we have learned in general from cyclic esters polymerization // Macromol. Symp. 2000. V. 153. P. 1-15.

112. Peters M.C., Mooney D.J. Synthetic extracellular matrices for cell transplantation //Mater. Sci. 1997. V. 250. P. 43.

113. Phillips T.J. Biologic skin substitutes // J. Dermatol. Surg. Oncol. 1993. V. 19. P. 794-800.

114. Pomahac В., Svensjo Т., Yao F., Brown H., Eriksson E. Tissue engineering of skin//Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 1998. V. 9. P. 333-344.

115. Prockop D.J., Kivirikko K.I. Collagens: molecular biology, diseases, and potentials for therapy//Annu. Rev. Biochem. 1995. V. 64. P. 403-434.

116. Quirk R. A., Chan W. C., Davies M.C., Tendler S. J.B., Shakesheff К. M. Poly(L-lysine)-GRGDS as a biomimetic surface modifier for poly(lactic acid) // Biomaterials. 2001 V. 22. P. 865-872.

117. Quirk R.A., Davies M.C., Tendler S.J.B., Shakeshen K.M. Surface engineering of poly(lactic acid) by entrapment of modifying species // Macromolecules. 2000 V. 33. P. 258-60.

118. Ramos-e-Silva M., Ribeiro de Castro M. New Dressings, Including Tissue-Engineered Living Skin // Clinics in Dermatology. 2002. V. 20. P. 715-723.

119. Ray J.A., Doddi N., Regula D., Williams J.A., Melveger A. Polydioxanone (PDS), a novel monofilament synthetic absorbable suture Surg. Gynecol. & Obstet. 1981. V. 153. P. 497-507.

120. Reed A.M., Gilding D.K. Biodegradable polymers for use surgery-poly(glycolic)/polylactic acid) homeo and copolymers 2. In-vitro degradation // Polymer. 1981. V. 22. P. 494- 504

121. Rheinwald J.G. Serial cultivation of normal human epidermal keratinocytes // Methods in Cell Biology. 1980. V. 21. P. 229 -254.

122. Richter A. W., Akerblom E. Antibodies against polyethylene glycol produced in animals //Int. Arch. Allergy. Appl. Immunol. 1983. V. 70. P. 124.

123. Robert M., Dusser I., Muriel M.P., Noel-Hudson M.S., Aubery M., Wepierre J. Barrier function of reconstructed epidermis at the airliquid interface: influence of dermal cells and extracellular components // Skin Pharmacol. 1997.V. 10. P. 247-260.

124. SaadB., Hirt T.D., Welti M., Uhlschmid G.K., Neuenschwander P., Suter U.W. Development of degradable polyesterurethanes for medical application: in vitro and in vivo evaluations // J. Biomed. Mater. Res. 1997. V. 36. P. 65-74.

125. Salgado A.J., Figueiredo J.E., Coutinho O.P., Reis R.L. Biological response to pre-mineralized starch based scaffolds for bone tissue engineering // J Mater Sci Mater Med. 2005. V. 16. P. 267-275

126. Sato N. Phosphorelay-regulated degradation of the yeast Ssklp response regulator by the ubiquitin-proteasome system // Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. P. 66626671.

127. Schwach G., Coudane J., Engel R., Vert M. Ring opening polymerization of D,L-lactide in the presence of zinc metal and zinc lactate // Polymer international 1999. V. 46 P. 177-182

128. Schwach G., Coudane J., Engel R., Vert M. Influence of polymerization conditions on the hydrolytic degradation poly(D,L-lactide) polymerized in the presence of stannous octoate or zinc metal //Biomaterials. 2002. V. 23. P. 993-1002.

129. Scotchford C.A., CasconeM.G., Downes S., GiustiP. Osteoblast attachement to bioartificial polymers//Biomaterials. 1998. V. 19. P. 1.

130. Sefton M.V., Woodhouse K.A. Tissue engineering // J. Cutan. Med. Surg. 1998. V. 3. P. 1-23.

131. Sethi, K.K; Yannas, I. V; Mudera, V; Eastwood, M; McFarland, C; Brown, R.A. Evidence for sequential utilization of fibronectin, vitronectin, and collagen during fibroblast-mediated collagen contraction // Wound Repair Regen. 2002;10:397-408

132. Shelton R.M., Rasmussen A.C., Davies J.E. Protein adsorption at the interface between charged polymer substrate and migrating osteoblasts 11 Biomaterials. 1988. V. 9. P. 24-29.

133. Shin H.-N., Fang J.-F., Chen J.-H. Reduction in experimental peridural adhesion with adhesion with the use of crosslinked hyaluronate /collagen membrane // J. Biomed. Mater. Res. 2004. V.71B. №2. P. 421-428

134. Sims G. E., Snape Т. J. A method for the estimation of polyethylene glycol in plasma protein fractions I I Anal. Biochem. 1980. V. 107. P. 60-63.

135. Singer I.I., Kawka D. W., Scott S., Mumford R.A., Lark, M. W. The fibonectin cell attachment sequence Arg-Gly-Asp-Ser promotes folcal contact formation during early fibroblast attachment and spreading // J. Cell Biol. 1987. V. 104. P. 573-584.

136. Sittinger M., Lukanoff В., Burmester G.R., Dautzenberg H. Encapsulation of artificial tissues in polyelectrolyte complexes: preliminary studies // Biomaterials. 1996. V. 17. P. 1049-1051.

137. Sittinger M., Bujia J., Rotter N., Reitzel D., Minuth W.W., Burmester G.R. Tissue engineering and autologous transplant formation: practical approaches with resorbable biomaterials and new cell culture techniques // Biomaterials. 1996. V.17. P. 237-242.

138. Sodergard A., Stolt M. Properties of lactic acid based polymers and their, correlation with composition // Prog Polym Sci. 2002. V. 27. P. 1123-1163.

139. Spassky N. Ring-opening polymerization // Rapra Rev Rep. 1995. V. 8 1. P. 129

140. Strom C.S., Michalopoulos G. Collagen as a substrate for cell growth and differentiation //Methods Enzymology. 1982. V. 82. P. 544 555.

141. Sudesh K, Abe H., Doi Y. Synthesis, structure and properties of. polyhydroxyalkanoates: biological polyesters // Progr. Polymer Sci. 2000. V. 25. P. 1503 -1555.

142. Suh H., Hwang Y.S., Lee J.E., Han C.D., Park J. C. Behavior of osteoblasts on a type I atelocollagen grafted ozone oxidized poly(l-lactic acid) membrane // Biomaterials. 2001. V. 22. P. 219.

143. Szycher M. Biostability of polyurethane elastomers // J. Biomater. Appl., 1988, V. 3. № 2. P.297-402.

144. Takada Y., Heinler M. E. The primary structure of the VLA-2/collagen receptor alpha 2 subunit (platelet GPIa): homology to other integrins and the presence of a possible collagen-binding domain. // J. Cell Biol. 1989. V. 109. P. 397-407.

145. Tang Z. G., Black R. A., Curran J. M., Hunt J. A., Rhodes N. P. and Williams D. F. Surface properties and biocompatibility of solvent-cast polyi -caprolactone. films // Biomaterials V. 25, Issue 19, 2004, P. 4741-4748.

146. Tetsuji Y., Yoshiyuki Т., Yoshiharu K. Surface modification of poly(l-lactic acid) film with bioactive materials by a novel direct alkaline treatment process // Jpn. J. Polym. Sci. Technol. 1998. V. 55. P. 328.

147. Tirrell M., Kokkoli E., Biesalski M. The role of surface science in bioengineered materials. // Surface Science. 2002. V. 500. P. 61 83.

148. Ueda M., Ebata K., Kaneda T. In vitro fabrication of bioartiflcial mucosa for reconstruction of oral mucosa: basic research and clinical application // Ann. Plast. Surg. 1991. V. 27. P. 540-549.

149. Ulbrich R., Golbik R., Schellenberger A. Protein, adsorption and leakage in carrier-enzyme systems //Biotechnol. Bioeng. 1991 V. 37. P. 280

150. Veis A., George A. Fundamentals of interstitial collagen self-assembly // Extracellular Matrix Assembly and Function. Academic Press: San Diego. 1994. P. 15-45.

151. Veiling Т., Risteli J., Wennerberg K., Mosher D. F., Johansson S. Polymerization of Type I and III Collagens Is Dependent On Fibronectin and Enhanced By Integrins alpha 11 beta 1 and alpha 2beta 1 // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 37377-37381.

152. Vert M., Li S. M., Garreau H. Attempts to map the structure and degradation characteristics of aliphatic polyesters derived from lactic and glycolic acids // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 1994. V. 6. P. 639 649.

153. Viola J., Lai В., Grad O. Abt. Report on The Emergence of Tissue Engineering as a Research Fields //4.0 Development of the Fields. 1987. 2002 -2003.

154. Wijdeveld M.G., Grupping E.M., Kuijpers-Jagtman A.M., Maltha J.C. Growth of the maxilla after soft tissue palatal surgery at different ages in beagle dogs: a longitudinal radiographic study // J. Oral. Maxillofac. Surg. 1988. V. 46. P. 204-20.

155. Wijdeveld M.G., Maltha J.C., Grupping E.M., De Jonge J., Kuijpers- Jagtman A.M. A histological study of tissue response to simulated cleft palate surgery at different ages in beagle dogs // Arch. Oral. Biol. 1991. V. 36. P. 837-843.

156. White D. J., Puranen S., Johnson M. S., Heino J. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004. V. 36. P. 1405-1410.

157. Wong W. H., Mooney D. J. Synthesis and properties of biodegradable polymers used as synthetic matrices for tissue engineering // Synthetic Biodegradable Polymer Scaffolds. Boston. 1997. P. 51-84.

158. Wright К. A., Nadire К. В., Busto P., Tiibo R., McPherson J. M., Wentworth B. M. Collagen and its use in the treatment of full-thickness bum injury // Burns. 1998. V. 24. P. 7-17.

159. Yang J., Bei J.Z., Wang S.G. Improving cell affinity of poly(d,llactide) film modified by anhydrous ammonia plasma treatment // Polym. Adv. Technol. 2002. V. 13. P. 220-226.

160. Yang J.M, Chen HL, You J W, Hwang J C. Effect of P(/LA-co-SCL) on the compatibility and crystallization behavior of PCL/PLLA blends// Polym. J. 1997. V. 29. P. 657-668

161. Yang J., Bei J., Wang S. Design of high-speed data transmission system based on fiber channel // Polym. Adv. Technol. 2002. V. 13. P. 220-224.

162. Yang J., Bei J.Z., Wang S.G. Improving cell affinity of poly(d,llactide) film modified by anhydrous ammonia plasma treatment // Polym. Adv. Technol. 2002. V. 13. P. 220-226.

163. Ying P., Yu Y., Jin G., Tao Z. Competitive protein adsorption studied with atomic force microscopy and imaging ellipsometry // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2003. V. 32. №1. P. 1-10.

164. Younes. H., Cohn D. Phase Separation in Poly(ethylene glycol)/Poly(lactic acid) Blends//Eur. Polym. Mater. 1988. V. 24. P. 765-773.

165. Yui N., Dijkstra P. J., Feijen J. Stereo block copolymers of l- and D-lactides // Makromol Chem. 1990. V. 191. P. 481-488.

166. Zacchi V., Soranzo C., Cmrtivo R., Radice M., Brim P., Abatangelo G. In vitro engineering of human skin-like tissue // J. Biomed. Mater. Res. 1998. V. 40. P. 187194.

167. Zalipsky S. Functionalizedpoly(ethyle ne glycol) for preparation of biological relevant conjugates //Bioconjugate. Chem. 1995. V. 6. P. 150-165.

168. Zdrahala R.J., Zdrahala I.J. Biomedical applications of polyurethanes: a review of past promises, present realities, and a vibrant future // J Biomater. Appl. 1999. V. 14. P. 67-90.

169. Zhu H., Ji J., TanQ., Barbosa M. A., Shen J. Surface Engineering of Poly(DL-lactide) via Electrostatic Self-Assembly of Extracellular Matrix-like Molecules // Вiomacromolecules. 2003. V. 4. P. 378-38

170. Zinn M., Witholt B. Occurrence, synthesis and medical application of bacterial polyhydroxyalkanoate //Adv. Drug. Delivery Rev. 2001. V. 53. P. 5-21.

171. Zoppi R.A., Contant S., Duek E.A.R., Marques F.R., Wada M.L.F., Nunes S.P. Porous poly(L-lactide) films obtained by immersion precipitation process: morphology, phase separation and culture of VERO cells //Polymer. 1999. V. 40. P. 3275-3289.

Информация о работе

Швед, Юлия Александровна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2008
ВАК 03.00.25

Диссертация

Культивирование клеток кожи, предназначенных для заместительной терапии, на полимерных плёнках - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы