Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культивирование и оплодотворение ооцитов свиней in vitro

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Культивирование и оплодотворение ооцитов свиней in vitro"

' есероотйспяя g?¿ph 'í?>T;ÚÍ:.Ci4í .'ГАДСКОГО зкашп! иаучяо-ШЗД^ГСЕШЗКЯ ЖСПГППР ШЮЮЮВОЙСГВЛ

^^ ОД «îa прапм рукописи

? 3 .«

спшшл гллглл тгаадаккуд " пушгшфошшйв и шлощшогта!? сецшв шзкя is vitro "

Специальность: 03.00.13. - физто.согия чеяовега ;i жиеотнкх

А В Т О Р Е О К Р. А Т .

*

диссертации на соиасание ученой степони 1шндидага биологических каузс

Дубровидн, Московская область 1994 г.

Работа выпо.пнена в центра трансплантации эмбрионов с. -х животных Всеросийского научно-исследовательского института животноводства, ■ ' •

Научные руководители: академик Л. К. Эрнст; доктор биологических наук, профессор Я. И. Сергеев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,профессор R П .Кононов; кандидат биологических наук с. R Советюш.

Ведущее научное учреждение - Научно-производственный биотехнологический иентр по ишаотнсводству,Горки

Защита состоится << 7^ >> iyg/t года в час.

на заседании Специализированного совета Д 020.36.02 прл Есеро- • еийском научно-исследовательском институтз животноводства по адресу: 142012, п. Дуброзицы. Подольского района,Московской оедйсти

С диссертацией шхно ознакомиться у. бнСлиот^!« института

Автореферат разослан << ^ >> tl¿¿ít£- 1994 г.

Ученый секретарь • Специализированного совета кандидат•биологических наук

Л. 1L ЕлЫГИК

-11. ОЩЯ ХАРАКТЕРИСТИК/! РАБОТЫ

Актуальность. темы. Получение, большого количества потомков от . генетически ценных самок свиней имеет больное значение ввиду .большой хозяйственной значимости данного зпда животных, Кроме того для проведения работ по клеточной и генной инженерии,в частности для пересадки ядери генов,а тагае работ со изучению оогекеза.фод-ликулогенеза,процессов оплодотворения и-раннею эмбрионального • развитая.необходимо увеличение числа способных к оплодотворению яйцеклеток, ( З^вертяев Б. JI ,1989 ).

. При щщщрдщф способах воспроизводства, из всего огромного фонда ооцитов свинециспользуется лишь минимальная часть.общего запаса, а подавляющая доля остается в яичниках и служит.неиспользуемым резерЕорД Л?вин ■ К. Л.. 1390 ). • Эрнст Л. IL, Сергеев IL K. ¿989).

.Многообещающим,в деле интенсификации использования репродуктивных возможностей.сельскохозяйственных животных является .решение проблемы дозревания,оплодотворения.к раннего эмбрионального ■' развития. Что,позволяет использовать .значительное количество•г^не-., ративных клеток от дивотных ;у»э после того, когда данный особи закончили свой гаганенньй1 путь.( Зрист Л. К. ,1993 ).

Однаот,. существушре методы экстракорпорального оплодатворе- . ния ооцитов свиней позволяв лишь в единичных случаях получать ' нормальное .развитие зародышей (Mattioli !.i ,Bacci М. L. ,1989), В лучшем случае.после овд^дртЕорения in vitro,яйцеклетки развивают- сл.до 2-4 клеточной стадии (Nagai. Т. et а].,1908; Yoshida М ,1989).

Основной причиной .низкого уровня эмбрионального развития яйцеклеток свиней является неадекватность условий созревания и оп-j додот.ворения.." . ~ / - ■ .■;

/ , Несовершенство методов кутьтивирования и оплодотворения ооци-• tob in vitro приводит к нарушению мейоза,и процесса слияния поло-"вых клеток и в,конечном.итоге,к'деге:нерации и. гибели ооцитос. Ог-. сюда возникает необходимость глубокого изучения условий созрева-■. -ния'и'оплодотворения-вне организма,усовершенствование культураль- \ них сред и методов подготовки спермиев к оплодотворению. .

Результаты ..подобного рода исследований позволяют разработать : ' . надежный метод оплодотворения ооцитов in vitro и в конечном итоге

кых яйцеклеток.

11~'ль и задачи исследований. Целью настоящей работы ягилась оптимизация систем согревания и оплодотворения ооцитов свиней in vitro. Исходя'из чего, были поставлены следующие задачи:,

- изучить эффективность использования различных культураль-ных.сред при созревании ооцптое свиней и определение в.преимущественной кз них оптимальной продолжительности инкубации;

- изучить действие на ооциты фолликулостимулирующего к лота-, оииьирукдих гормогов;

- определить оптимальные условия опиодотворения яйцеклеток in vitrei,зключая подготовку спермиев к оллсдотзорению;

- исследовать действие на ооцчты фолликулярной жидкости свиней;

- выяснитj роль температуры транспортной преды па оплодотворение ооцитов свиней in vitro. "

Научная новизна.исследований состоит в определения ойуиы&пь—,, ных критериев культивирования и оплодотворения ооцитов свиней in vitre. Бнервые проведен сравнительный анализ влияния различных культуральных сред на экстракорпоральное созревание ооцитов: Показана концентрационная зависимость позитивного влияний фо.сликуло- „ стимулируюцего и лютеониьируюцего гормонов на рогроваиие ооцитов in vitro. Вияснено влияние температуры разбавления во время цент-, ркфуглрования на подвижность сперматозоидов после калацнтации, а, также температуры транспортиром«! ялчников на результаты оплодотворения. Изучено влияние гонадстропинов и фолликулярной жидкости на оплодотворение ооцитов in vitro.

Практическое значение работы: Показана возможность' полноценного созревания к оплодотворения ооцитов евиией вне .организма. Усовершенствованы методы культивирования и оплодотворения изолированных оодигев, которые могут быть использованы в лабораториях, занимающихся оплодотворением яйцеклеток. ' : '• .. .' - • - ,

Апробация работы. - Основные положения диссертации докладывались на 1-й йзждународной конференции ( -Харьков.. 1993 ).

, Структура диссертации и объем работы. Диссертация^состоит из введения,обзора литературы, материала.методов и результатов исследований, обсуждения, выводов к предложении. Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста,содержит-9 таблиц,1 график и б рисунков. Список литературы-включает 164. источника,в'том числе и 148 иностранных. ■ ; ' ■ -, - ... "

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАГО/Й

Б&учко-исследсвательекая работа выполнен;: в центре трансг лантаци эмбрионов селгсгохозяйственных жиштнчх Воерсоикекого научно-исслэдовательског о института яивотноводства

Материалом исследований служили ооциты из фолликулов д.г'мет-ром 3-8 ш,выделенных из яичников убитых на Подольском мясокомбинате половозрелых свилей твой массой 90 - ЮС кг. Непосредственно после вскрытия брюшной полости животного,яичники отсекали и помещали в термос с транспортной средой,в качестве которой использовали О,раствор хлористого натрия,содержащего 100мг/л канамицнн сульфата'или 50 мг/л гентамицин сульфата.

1 Для экспериментов отбирали яичники в стадии фолликулярного роста или с'развитыми желтыми телами. Патаяогические ( киетсзные и ; геморрагические'), со свелвй овуляцией и от супоросных свиней отбраковывали. '.Яичники, доставляли в лабораторию в течение 1,5-2 часов при температуре не. ниже 32°С. В лаборатории, непосредственно перед использованием их дважды промывали в свежей транспортной 'среде. Аспирировалные.ооциты переносили в чашку Петри (35 у. 10 тп) со средой РВ-1 ДМиШпгага 0.6. ,1971) .состоящей из 136,87 мМ Май .2,68 М.М КС1,1,:47.';мМ Й12Р04,0,49 мМ МеС12 х 6 Н20, 8,09 мМ'Ма2НР04 х 12 Н 0,0,85 мМ СаС1й,Бг55 мМ глюкозы,0,33 Ш Ма-пирувит,50 мкг/

мл гентамицин сульфата, 1 мл/л 1 % раствора фенолового красного и' ■ 3,000 г/л ЕЗа]где проводили их морфологическую оценку под стерео-' микросколом при 65-100 - кратном увеличении. Критерием пригодности ооцитов к культивированию считали наличие расширяющегося лучисто- , го венца,округлость формы,однородность и тонкозернистость ооплаз ■ мы,а таю® наличие однородного и плотноприлегающего к ооциту компактного кумулюса.

.. Отселекционированные,триады промытые,два раза в среде РВ - 1 и один раз в среде для .созревания, ооциты переносили в чашку Петри (35 х 10 мм) по 30-40 ооцитов в каждую, содержащую 2 мл'среды для созревания покрытой таким же количеством,предварительно автокла- ■ вированного с ней вазелинового масла. Чашки помешали в инкубатор, где происходило созревание ооцитов в присутствии Б % С0<- л воаду --

хе,90 X влажности и температуре 38,5 - 39 °С. ■ ,, '-.'л

Перенос ооцитов из одной срэды в другую проводили при т^свд?'^

- 4 --. ; ; ■.

оттянутой Пастеровской пипетки. Время работы по постановке ооцитов на согревание зависило от ¡toличес-ча' подготавливаемых к созреванию клеток и колебалось от 1 до 1,5 часов.

Для определения пригодности различных культуралышх сред для созревания ооцитов свиней in vitro использовали как комплексные, так .и простые,содерляиие BSA,среды,а именно:

- среда ТСМ 199 на основе сбалансированного солевого раствора Зрла,содержащей 1 мМ/л глуташна.Ю мМ'л НЕРЕЗ,£6,19 мМ/д NaHCO ,50 мг/л гентамицин сульфата,15% фетальной сыворотки теленка - ТСМ 199 Э; •

- ТСЫ 199 й с добавлением в нее 3,0b' мМ/л глюкозы, 2.92 мМ/д ' Са-ла:стагз и 3 мМ/л На-иирувата •• ТСМ 199 Э мод. 1;

- ТСМ 199 на основе сбалансированного солевого раствора Хен-кса,содержащей те m компоненты, что и среда ТСМ 199 Э- ТСМ 199 X;

- .модифицированный раствор йребоа-Рингера ( KRBJ ( Toyota У. et al. ,1971),содержащего 94,6 мЫ Had.4,78 мМ KCl.1,19 мМ KHgPO^,

1,19мМ fcfeS04 х 7Kgû,25,07 мМ NaHC0g,l,7î vM СаС12,5,Б6 мМ глшо-

эа,21,58 к;1.1 Ыа-лактата,0,50 мЬ" Na-пиру вата, 50 мг/л гентамицмн сульфата,1 мл/л 1 % раствора фенолового красного и 4,000 ?/л BSA;

- среда Vhittèr.'s ( Hoppe, Р. С.-,Pitta S. ,1973 ),содержащая тех хе компоненты , что и раствор ККВ.ио с введением в нес 87,72 мМ NaCl,22,62 мМ HéHCÛ3,l,S5 мМ Са-лактата, 19,82.мИ На-лакгата,

0,025 мМ Ма-пчрувата и, 1,000 г/л EGA. Созревание происходило при 5 Z С02Г> % 02 и 90 7L fi2 в воздухе. .-'.''■''•

Через 40 часов культивирования определяли стадии созревания. Среда, в которой процент ооцитов достигши' .метафази 11 был сами:,! высоким,использовалась во всех последующих экспериментах

Для определения нормы созревания в зависимости от- продолжительности культивирования ооциты инкубировали в течение 28;29;31; 33; 36; 33; 40; 44; 48 часов.-' ' ,, ' . • ...

Чтобы, улучшить условия культивирования в исходную среду добавляли 1;5; 10; 15; 20 мкг/мл йСГ и ЛГ. Контролем служила среда бег? гормонов (ТСМ 109 S мод. I). v.; , - .. ■

. . Цитогенетические исследования проводили по методике Frog1у ; A. CISSOI. После культивирования ооциты'с помощь» Пастеровской пипетки оголяли и группами инкубировали в 0,7 У. растворе хлористого калия приблизительно 5 минут. Затем переносили 10-15 ооцитов в капле раствора хлористого калия на.предметное стекло и накрывали

покровным стеклом,имеющего на 1фаю каплю смеси парафина и ьазели-. на (1:1). Фиксировали в растворе уксуса и этилового спирта (3:1) в течении 12 часов. Перед окрашиванием 1 Z орсешюм предметное стекло помешали на 30 кинут в этиловый спирт. Исследование стадии созревания проводили под фазовсконтрастным микроскрпом при 400-6С0 кратном увеличении.

Классификацию стадии созревания проводили по критериям,пред-дозазнных Hunter R. Н. F. и Polge С. ( 1966 ). В отличии от критерии оценки этих авторов в данной работе прометафаза I относилась к стадии зародышевого пузырька " визнкулярная стадия ", так как в' предварительных пробах на случайной выборке установлено,что используемые яйцеклетки к началу культивирования находятся на стадии зародышевого пузырька.

Для экспериментов по оплодотворения ооцитов in vitro испох -■ •зовзлась только свежеполученная на пункте по искусственному осеменению, экспериментального хозяйства " Кленово-Чегодаево " сперма хряков. Сперму доставляли в лабораторию в термосе,без предварите -

льного разбавления и хранили при температуре 16 °С в те-генио 10 -20 часов по методике Cheng W.T.K. (1985).

.Подготовку спермы к оплодотворению осуществляли по схеме, предложенной Наптапо S. и Toyoda Y. (1986).Для этого приблизительно.10 мл спер!:обогатой фракции спермы центрифугировали при 500 g в течение 10 шшут. После удаления еупернатанта осадок дважды продавали посредством центрифугирования в 5 мл РВЗ, содержащего 3 иг/ sui ßSA.npi! 500 g в течение 10 минут. Промытые сперматозоиды затем

разбавляли в среде для преинкубации до 2 х108 клеток/мл и инкубировали в пробирках (1,8 мл,Nunc),по 1 мл в каждой, при 37°С. Через 4 часа пробирки извлекали из инкубатора и доводили концентрацию

сперматозоидов до 2 х 107 клеток/мл, добавляя среду для преиккуба-ции.

Для 1сапацйтации спермы применяли ту же среду, что и при созревании ооцитов,но без гормонов с pH равной 7,8 .Концентрацию водородных ионов уравновешивали,добавляя по каплям 7,5 % раствор NaHCOg.

Непосредственно перед использованием и после преинкубации определяли концентрацию и подвижность сперматозоидов в каждом образце по общепринятой методике.

Концентрацию спермы определяли в счетной камс-ре ГоряеЕа по обпкп-

- б -

ринятой мотилике.

Для определения температуры разбявления ео время подготовки спермы к калацитацни на подвижность сперматозоидов послепреинку-баци раствор Дюльбеки,содержащего 3 мг/мл БЗА.охлоздали до температуры. хранения спермы (16 °0); оставляли в штативе при комнаткой температуре ( 25°0 ) и помещали в инкубатор с температурой лреин-

кубации ( 37°С ). После 4 часов инкубации определяли подвижность спермиеь.

Для оплодотворения кэдаые 40-45' ооцитов. после 44 часов культивирования переносили ь чашку Петри с 2 мл среды,покрытой таким да? .количеством парафинового наела.

Оплодотворение ооцитов проводили в растворе аналогичному по своему составу среде для соари«зания.не содержащий гормоны к с добавлением Е нее вместо 35 X,í2 X фетальней сыворотки теленка.

Суспензию сперматозоидов, полученную после разбавления до 2 л

^сперматозоидов/мл, в количестве 100 мл переносили в культурам-ные чашей,с находящимися а них ооциташ. При этом финальная концентрация сперматозоидов составляла'5 з: 105 /мл.

ОокультиЕировачио проводили ь инкубаторе при 38,5-39,0" С, Г> X С% в воздухе и 60 X вламяоети. Черэа 6-8 часов ооциты дважды промывали посредством осторожного пилетироьанид в среде последующей инкубации с целью удаления клеток кумулюса и лияних скоплений сперматозоидов. Диаметр рабочего конца Иастерогской пинетки при этом равнялся примерно 15 мкм. После промыЕки кадд^е 10-j£ яйцек-' леток помещали в чаши с 400 млл среды ВУОО-2,покрытой таким мэ количеством парафинового масла. Реким инкубации был таглм же как. при сскультивировакии. Через 36 часов определяли количество оплодотворенных яйцеклеток. Оплодотворенными считали яйцеклетки, в которых через 44 часа с момента контакта со сперматозоидами ( 9 часов сокулгтивироваьия и Sfi часов последующей иикуб.ы-ии ) происходило с^но митотическое деление.

Среда ВМОС-2 состояла из 119,03 ы.М NaCl,4,78 мЫ KCl.1.71 mW CaClg,t,lQ »4M КН2Р04,1,19 mM b£S04 X 7H2G,25.07 vM NaHC03. 0,316 мМ Ha - пир/вата,25,СЮ Ш tía - лактага, 10 IU/'мл пеницилика G, fO мкг/мл сраятомицик сульфата и 1.000 г/л BSA.

Чтобы повысить процент оплодотворенных яйцеклеток в среду для созревания добавляли гшюфиг-'арные гоналотропини. В ходе иселе-

дрваний было использовано три варианта опытов. В первом случае, к среде для созревания добавляли 10 мкг/мл ФСГ.во втором - 5 мкг/мл ЛГ и в третьем - 10 мкг/мл ФСГ и 5 мкг/мл ЛГ. Контролем служила среда ТОМ 199 3 мод. 1,без гормонов.

Для исследования влияния фолликулярной жидкости ка оплодотворение ооцитов в среду для созреванг-я добавляли 5 мкг/мл ЛГ.10 мкг/мл ФСГ и 10 % частично очищенной фолликулярной жидкости ерк-ней. Контролем служила среда не содержащая фолликулярной жидкости. Данная среда использовалась и в этопериментах по исследованию влияния температуры транспортировки яичников на результаты оплодотворения ооцитов.

Фолликулярную жидкость получали из фолликулов диаметром 2-5 мм. Центрифугировали при I'SOQ g в течение 15 минут1 при комнатной температуре с целью удаления клеток кумулюса и гранулезы. Суперна-

тант фильтровали и хранили в аликвотах при - 20 °С до использования .

Дая определения влияния температуры транспортировки яичников на оплодотворение ооцитов их доставляли в лабораторию а течение 2 -4 часов в вышеуказанной транспортной среде при температуре 4;10;

20; 38°С.

4°С в течение 10 дней. Перёд использованием все среды эквилябриро-вали в течение 1 часа. РН среды при этом находилось в пределах 7,2 -7,4. • . . . .

Статистическую обработку результатов исследований осуществляли с помощью "критерия Пирсона К Хи-квадрат (Лакин К. 1 ,1990). . Работа с экспериментальным материалом проходила в стерильном

боксе под ламинаром. Температура помещения, была не ниже 25°С.

3. Результаты исследований и их обсуждение _ " ; -3.1. Норма созревания ооцитов свиней в различных культуральных средах • - -/;•'

Известно, что з значительной мере степень реинициации мейоза зависит от правильности подбора питательных сред. При постановке на созревании!n vitro ооциты I порядка находятся на стадии дияло-тены.в процессе культивирования они должны достигнуть стадии ме-тафазы или анафазы второго деления мейоза. . v„ ; :

* Однако,неадекватность условий инициации мейоза in vitro«гх-

- в -

ловиям внутри организма,в конечном итоге,приводит к частичной дегенерации и/или неполноценному з вершению ядерного и цитоплазма -тического созревания ооцита.

Б связи с этим в наших экспериментах исследовали влияние различных культуральных сред на созревание ооцитов свиней вне организма.

Анализ результатов данных экспериментов показал,что через 40 часов культивирования наибольшее количество (74 из 108) ооцитов достигает метафаэы второго деления мейоза в среде ТСМ 199 Э мод. I (табл. 1).

Таблица 1

Созревание ооцитов после 40 часов культивирования в различных питательных средах

Использ.__стадия созревания___

Среда ооцитов ЗП метафаза I ,анафаза1+ метафаза II

телофаза!

ТСМ 199 Э 108 1-1, ,0 31-22,7 6-5,5 70-64,8

ТСМ 199 мод. I 103 - 27-25,0 7-6,5 74-68,5

ТСМ 199 X 107 5-4, ,8 52-46,5 5-4,7 45-42,0

KRB 108 10-9, ,3 65-00,2 6-5,5 27-25,0

Whitten's 108 9-8, ,3 28-25.9 9-8,4 62-57,4

ххх Достоверно Ниже,чем в среде ТСМ 199 Э мод. I ( Р > 0,001 )

Модификация среды ТСМ 199 З.то есть добавление к ней 3,05 м,У глккозы,2,92 мМ Са-лактата и 1 мМ Ка-пирувата,не является существенным для реинициации ыейоза при созревании ооцитов свиней in vif.ro,так как процент созревших в среде, ТСМ 199 Э мод. 1 выге ( на 3,7 Z),чем в ТСМ 199'3,но его величина статистически не достоверна.

В противоположность этому, выбор сбалансированного буферного раствора, который помимо снабжения клеток необходимыми ионами,важен тага© для■поддержания осмотического баланса,является одним из условий полноценного созревания in vitro. Показано,что норма созревания в среде ТСМ 199 на солевом растворе Зрла без энергетических добавок ( ТСМ 199 Э ) составила 64,8 7. В среде на сбалансированном солевом растгоре Хенкса с добавлением в'нее 2,2 г/л.НаНС03

(ТСМ 199 Т ооциты также достигают метафазы второго деления мэйо-

■ - g -

за,однако количество таких ооцитов на 22,8 X меньше ( Р > 0,01 ), чем в среде на бикарбонатном буфере, и составляет 42 X.

О возможности использования простых по составу сред говорит относительно высокая доля созревших ооцитов, наблюдаемая в среде Whitten's. Она составила 57,4 %,чтс на 11,1 % пике, чем при использовании ТСМ 199 Э и лишь ка 7,4 %, чем в среде ТЫС 199 мод. I. Примечательным является то,что процент достигших метафазы H ооцитов был в Whitten's среде выше на 15,4 "X, чем в ТСМ 199 X.

В отличии от среды Whitten's норма соэргвания в KRB составила лишь 25 %. При этом наблюдался характерный для условий in vitro блок на метафззе J.

Таким образом,преимущественной средой для созревания ооцитов свиней является ТСМ 199 Э мод. 1,хотя разница- между нормой созревания в данной среде и в среде ТСМ 199 Э не существенны.

3.2. Влияние продолжительности культивирования на созревание

ооцитов свиней з среде ТСМ 199 Э мод. I.

Еременной фактор является одним из условий полноценного созревания ооцитов свиней in vitro. При недостаточной продолжительности культивирования они fie успевают перейти из более ранних стадий мейоза в поздние,то есть достигнуть метафаэы II. Созревшие ке яйцеклетки практичесю! сразу вступают в фазу старения,параллельно с чем снижается их оплодотворявшаяся способность.

В данном эксперименте исследовали норму созревания ооцитов свиней in vitro- в зависимости от продолжительности культивирования.

К 36 часам после постановки на культивирование мэтзфазы II достигло лишь 34 % ооцитов (табл. Р.). В последующем,отмечается тенденция к ускорению процесса созревания.

Так,при увеличении продолжительности культивирования с 36 до 38 часов и с 38 до 40 часов количество созревших ооцитов увеличивается на 16.% и на 25 %,соответственно. Через 44 часа культивирования норма созревания■составила 65,4 %,что на 2,9 % выше,чем через 40 часов. Причем на зародышевой стадии не наблюдалось ни одного ооцита. Последующее культивирование еще в течение 4 часов ( 48 часов ) не способствует процессу созревания.

Таким образом, проведенные нами исследования ¡югвол.-шг сделать вывод,что при использовании s качестве среды для созрев-шил ,

О

тем Ш на растворе Зрла и содержащей 2.92 мМ Са-лактата,1 мМ .Ма-пирувзта,3,05 мМ глюкозы и 15 ,1 фетапыюй сыворотки теленка продолжительность инкубации долкна составлять 40 -44 часа.

Таблица 2

Созревание ооцитов в среде ТСМ 199 Э мид. I в зависимости от продолл^телыюсти культигировакия

Время Использовано Стадия созревания. п - %.

культивиро- ооцитов анаф. 1 +

вания , ч ЗГ1 метаф. I телоф. 1 метаф. 11

28 30 - 22-73.3 4-13,3 4-13,3

29. 30 1- ■3,4 20-66,6 3-10,0 6-20,0

31 45 1- •2,2 28-62,2 6-13,3 10-22,2

33 40 1- •2,5 £1-52,5 5-12,5 13-32,5

35 53 - 30-56,6 5- 9,4 18-34,0

38 60 - 27-45,0 3- 5,0 30-50,0

40 56 2- -3.6 16-28,6 3- 5,3 35-62,5

44 • 52 - . 15-28.8 3- 5,8 34-65j4 •

4В 39 ' '2- -5,2 11-28,2 - 26-66,6

3. 3. Влияние гонадотропинов на созревание оцитов свиней in vitro •

В процессе культивирования определенная часть ооцитов дегенерирует. Причины дегенерации ооцитов в культуральных средах.видимо, связаны с недостаточной сбалансированностью по своему состаяу питательных сред, нехваткой в них, в первую очередь, гормональных веществ. Совершенствование культуральных сред предполагает выяснение роли отдельных компонентов,входящих в их состав.а таю® определение оптимальных концентраций различных добавок.

Результаты последних исследований показали.что хотя мейоз при экстракорпоральном созревании доходит до метафазы Н без каких - либо гормонов в среде созревания, добавление гонадотропинов ускоряет мейотическое созревание и увеличивает количество ооцитов достигших метафазы П.

В наших экспериментах исследовали влияние различных доз фол-ликулостимудирующего и лютеонизирующего гормонов на созревание

- и -

ооцитов свиней-in vitro. Результаты цитоморфологической оценки созревших, в культуре ооцитов представлены в таблицах 3 и 4.

Таблицу 3

Влияние различных концентраций ССГ на созревание ооцитов свиней

Концепт- Использ.__.'.стадия созревания n - X

рация, ооцитов ЗП метаф. I амаф. 1 + метаф. П Р _МКГ/МЛ_____телоф. i________

- 75 - 23-30,74 5- 6, .ее 47-62,СО

1 С 7 2-3,1 16-23.90 •1- 5, ,90 45-07,20 >0,05

5 53 - 11-19,00 3- ■5, ,20 44-75,60 >0,05

10 60 1-1,7 5- 9,40 2- •3 j ,30 52-80,60 <0.05

15 47 3-6,4 5-10,00 2- 4, ?0 37-78,70 >0,05

20 70 10-14,3 14-20,00 4- 5 ,70 42-50,00 -

Данные таблицы 3 показывают, что фолликулостимулирун-оди1! гормон в концентрации от i до 15 мкг/мл ускорял созревание ооцитов от стадии зародышевого пузырька до метафазы второго деления мейо-за, за счет большей скорости перехода в более зрелые стадии.

Так,в контроле на мэтафгзе ] через 44 часа культивирования находилось 30,74 % ооцитов. Добавление к среде созревания 1; 5 и 10 мкг/мл <ССГ снижало этот уровень на 6,84 %; 11,74 X и 22,34 X, соответственно. Увеличение концентрации ФСГ приводило к обратному действию. В концентрации 15 мкг/мл количество блоков на метафазе I увеличивалось,по сравнению с 10 мкг/мл,на 2,2 X, а в концентрации 20 мкг/мл - на 11,6 2.

Наибольшая норма созревания ( 86,6 X ) отмечена при концентрации 10 мкг/мл,что на 24 X, больше, чем в контроле ( Р < 0.05 ). Повышение [концентрации ФСГ до 15'- 20 мкг/мл приводит к снижению нормы созревания, в основном за счет его ингибируюдаго влияния на инициацию мейоза Так,при добавлении к среде культивирования 15 мкг/мл процент созревших ооцитов был. хотя и больше,чем е контроле на 16,1 7. ( Р >0,05 ),ко на стадии зародышевого пузырька осталось 6,4 % ооцитов. При 20 мкг/мл действие ФСГ выражено сильнее и процент ооцитов,невозобнэвивиих мейоз,составил 14,3, что почти в 2,5 раза больше,чем при добавлении 15 мкг/мл.

Введение в среду культивирования лютеонизирующего гормона во всех концентрациях,ускоряло созревание ооцитов ín vi tro,снижая их

количество на метафазе I. Если в контроле через 44-часа культивировании процент ооцитов неразвившихся далее метафазы I составил 33,8,то введение 1; 5; 10; 15 и 20 мкг/мл ЛГ приводит к снижению данного уровня на 11,8; 18,2; 17,1; 19,5 и 15.0 X, соответственно (табл. 4).

ЛГ, ташке как и 2СГ,увеличивает количественное соотношение созревших ооцитов. При добавлении к среде культивирования 1; 5; 10; 15 и 20 мкг/мл ЛГ через 44 часа инкубации на метафазе II находи -лось 73,4; 80,0; 77,7; 79,6 и 75,5 %,что на 11,6;18,2; 15,9; 17,8 и 13,7 соответственно,больше,чем в' контроле ( 61,8 % ).Надо отметить, что достоверная разница наблюдалась лишь при концентрации 6; 10 и 15 мкг/мл. Наибольшая норма созревания отмечена при добавлении в 'среду культивирования 5 мкг/мл.

Таблица 4

Влияние различных доз ЛГ на экстракорпоральное созревание ооцитов свиней

Концент- йспольз.__стадия .созревания.

рация, мкг/мл ооцитов 5П метаф. I анаф. 1 + телоф. I метаф. II Р

- 68 - 21-33,8 3-4,4- 42-61,8

1 64 - ' 14-22,0 3-4,6 47-73,6 >0,05

5 . 64 -. 10-15,6 2-3,1 52-80,0 <0,05

10 72 1-1,4 12-16,7 3-4,2 56-77,7 <0,05

15 49 7-14,3 3-6,1 39-79,6 <0,05

20 53 . - .10-18,8 3-5,7 40-75,5 >0,05

Таким образом,нами установлено,что при экстракорпоральном созревании ооциты свиней имеют тенденцию к мейотическому созревании даже при отсутствии гормонов. Введение в среду культивирования. СКТ и ЛГ способствует ускорению мейотического созревания и данный эффект носит дозозависимый характер. Оптимальной концентрацией'2СГ оказалась 10 мкг/мл и ЛГ - 5 мкг/мл.

3. 5. Ельяние температуры 'разбавления во время подготовки спермы к капацитнции на подвидаость сперматозоидов после ка-пацитации.

, <

Успех оплодотворения in vitro во многом вавчсмт от подготов-

¡си сперматозоидов к каиадитации. Предъиикубациониая работа со спермой предполагает удаление с поверхности сперматозоидов агентов семенальной плазмы,отрицательно влиягаих на их подвижность. Основным приемом при этом является разбавление спермы в физиологическом или буферном растворах с последующим центрифугированием и повторной ресуспензией осадка.

Известно,что двиданиэ сперматозоидов и их оплодотворяются способность зависит от температуры окружающей среды. Особенно чувствительна к перепаду температур саежеполученная сперма.

В данном эксперименте исследовали влияние температур разбавления ао время подготовки спермы к капацитации на подвижность сперматозоидов после преинкубации. Результаты опыта представлены г таблице 5. ■

Таблица 5

Влияние температуры разбавления на подвижность сперматозоидов после 4 часов инкубации

Температура разбавления Подвижность сперматозоидов,X

16°С 50 - 60

25°С 70-80

37°С 50-60

Как видно из таблицы 5, при разбавлении раствором .Дюльбека с

температурой 25°С подв:етюсть сперматозоидов через 4 часа инкубации составило 70 - 80, %. Использование разбавителя, охлажденного до

температуры хранения (16°СКприводило к снижению активности сперматозоидов на 20 - 30 %,которая составляла 50 - 60

Сходный результат наблюдали и после разбавления раствором

Дюльбека при 37°С,то есть температуре последующей инкубации.

Таким образом,проведенные нами исследования позволяют сделать вывод,что при работе со спермой,а именно во время подготовки ее к капацитации,все операции по удалению с поверхности сперматозоидов компонентов семенальной плазмы можно проводить при комнатной температуре (температуре"в боксе).

3.6. Влияние добавления к среде для созревания фолликулости-мулирующего и летеониаирумцего гормонов па оплодотворение' ооцитов свиней in vitro

В условиях внефолликулярного культивирования яйцеклеток в синтетических питательных средах удается получать до 85,1% ооцк-тов,достигших метафазы II.

В наших исследованиях норма созревания без какой-либо со-культуры составило 68,5 Z. Однако,как показывают данные литературы, а тагоне результаты собственных исследований,при оплодотворении таких ооцитов дробления не лроисхЬдит. Причиной нарушений в оплодотворении, по-видимому, является то,что синтетические среды способствуют созреванию нуклеарных компонентов,но не обеспечивает нормального развития цитоплазмы. ■

Гонадотропные гормоны играют ведущую роль в инициации мейоза и, как показали результаты собственных исследований, дозозависимо ускоряют процесс созревания. Однако,в настоящее время, нет единого мнения относительно влияния гонадотропипов на формирование в оо-. цитах предпосылок для успешного оплодотворения. В связи с этим мы исследовали влияние обогащения среды для созревания ооцитов гипо-фиэарными гонадотропинаш.а именно 2СГ и ЛГ. Результаты эксперимента представлены в таблице 6.

Таблица 6

Влияние включения в среду для созревания гонадотропинов на оплодотворение ооцитов свиней in vitro

Варианты : Использовз- : : Количество : X . : Р

опыта но ооцитов 2-клет. вибрионов - дрсблеяия

Контроль 75 г ; '.'"Г :■

81 10 12,3 >0,05

ЛГ 78 ■ ■•;■ , - -14- ■ - 17,9 >0,05.

ФЗГнЛР 87 . 20 22.9

Анализ таблицы 6 показал, что при созревании в среде без какой-либо сокультуры или гормонов не происходит, необходимая для;: , нормального оплодотворения, внутриклеточная дифференцировка, так . ... как ни один, из поставленных на культивирование ооилтов.не развивайся „с 2-клеточной в стадии. '•-.-": :-'->.

Добавление к среде созревания гипофизарньи гонадотропиноя способствовало цитоплазыатическсму созреванию. Причем,в случае внесения JIT процент оплодотворения бил на 5,6 7. больше, чем при использовании одного <КГ.

Наибольший процент дробления ( 22-,9 Z ) получен в третьем варианте,то есть когда созревание еоцитов происходило и лрисутст-эни обоих гормонов,что на 10,6 Z ( Р > 0,05 ) больше.чем в первом варианте п на 5 %,чем ао втором ( Р > 0,05 ).

Таким образом, проведенные нами исследования позволяют сделать вывод, что обогащение среды для созревания нюлликулостимули--рупцим п латеонизирукэдш гормонами в концентрациях 10 мкг/мл и b от/мл»соответственно,является необходимым условием не только для решшциации ¿«еГоза.но и для полноценного опложлпсренпгг ооцитоь г.пе организма. 3 связи с этим и л необходимо включать в исследуемых концентрациях в среду для согревания.

3. 7. Влияние фолликулярной лилкости на оплодотворение ооци-

тов саииея vitro.

3 процессе созревания ооцитов,наряду с нуклеарными изменениями происходят специфические внутриклеточные диф.|>?рекчировки, придающие яйцеклетке способность к нормальному оплодотворению.

Как «оказывают данные литературы,п условиях in vitro ли:чь у незначительного количества ооцитив,наряду с созрезанием ядрч прч-::сходит и созревание цитоплазмы. Гонадотропичы,<гак показывает данные собственных экспериментов,улучшают данный показатель. Однако, процент получаемых 2-клетсчных эмбрионов остается низким.

Известно,что процессы созр^в^ния регулируюточ яамшми и ла лука) не совсем понятными взаимодействиями медду гормонами гипофл га,половыми стероидами и вырабатываемы:: н самих фоллькул-а факторами. К последним,н первую очередь,относится фолликулярная жидкость.

Большинство экспериментаторов занимается {«.'»з.кедовашкм инги-бируюиего ьлияния Фолликулярной .*илкости i'-i гжстг.акорпо|>нлг.ное созревание ооцитоя сьиней.не замечая положительного положительно го ее влияния на приобретение способности к оплолот^ореним.

Однако, На J i.o К. и др. {593.3) сепПцтг, что добапленв* фолликулярной кидкости с среду созревания увеличивает процент яйцеклеток С с$0|ЛЮРОВЧХКЗ!мся мулокчм И рС И у КЛР У С О !>1. С i 1И ь" р Г;С V О М i' npli rsTOM

- 16 -

были гонадотропииы. •

Учитывая это сообщение,мы исследовали влияние фолликулярной кидкости на оплодотворение ооцитов свиней вне организма. Полненные даинае представлены в таблице 7.

Таблица 7

Влияние добавления в среду для созревания 10 % фолликулярной жидкости на оплодотворение ооцитов свиней

Варианты : Использо- : Количество : % : Р

опыта вано ооцитов 2-клет. эмбрионов дробления

Контрольная 143 28 20,3

Опытная 146 46- 31,5 < 0,1!)

Анализ результатов ( табл. 7) показал,что от общего количества оплодотворенных ооцитов"через 44 часа с момента контакта ооцитов со сперматозоидами в контрольной группе двуклеточной стадии дробления достигло 20,3% яйцеклеток. Процент дробившихся эмбрионов возрастал,если в среду для созревания ооцитов добавляли частично очищенную фолликулярную жидкость. При этом процент оплодотворения составил 31,5,что на 11,2 7. больше,чем в контроле.

Таким образом,проведенные нами исследования позволяют сделать вывод,что при экстракорпоральном созревании помимо включения в среду для созревания 10 ыкг/мл ЗСГ и 5 мкг/мл ЛГ нужно вводить 10 % частично очищзнной фолликулярной жидкости свиней.

3.8. Влияние температуры транспортировки яичников свиней "на оллодотворяемоть фолликулярных оощггов.

Известно,что в изолированном- органе происходят определенные прогеолитическне процессы и .накапливается токсические вещества, которые,в свою очередь,оказывакгг отрицательное влияние на состоя-, нка ооцитов в фоллккулаг яичника, Данное обстоятельство южзт привести к тому, что при последующей культивировании'возможно замедление процесса инициации иеиоза и появление признаков асинхрон-

- • - IT -

поста.

■ Определенное влияние на созревание ооцитов in vitro могу? оказывать температурные условия при достоБке яичников в лабораторий Одншсо.одноэначногомкешга по данному вопросу, в настоящее вре-гч,нет. Поэтому в данном эксперименте исследовали влияние температуры транспортировки яичников в лабораторию на оплодотворение пйцзклеток in vitro.

Результаты исследований приведены в таблице 8.

Таблица С

Влияние температуры транспортировки яичников на оплодотворение ооцитов свиней вне организма

Температура .; • С Использовано ооцитов : . 1Еоличество : 2-¡слет, эмбрионов Z дробления Р

4 103 9 а,7 >0,001

10 07 13 ■ 13,4 >0,001

20 112 41 36,6 -

23 ' 1СЗ 32 33,0 >0,05

Кослэ оплологпартт!пя.еоэрзагах вне организма,ооцитов процент ошяздотвсрзипя,то есл "лчество яйцеклеток, в которых после 44 часта кудмпзирогплпл произошло одно митотическое деление,при

'^тературэ £0°С составил 36,6 Z,что на 3,6 % ( Р •> 0,05 ) боль -

гз. чем при сЗс0, Ври уешерзтурз транспортной среды ниже 20°С наб--.-.лдссь резкое сннмение процента оплодотворившихся яйцеклеток.

.'rvc.upii lCPC ;®j;:j4Dcteo 2- ¡сг.етсчных эмбрионов Сило на 23,2 Z

Уэльсе, чем при 2С°С,а при Л°С ~ га 27,9 % ( Р? 0,001 ).

Тазсзи образом, установлено. что температура транспортировки п'ичн.чкоз с:е.31гвает существенное влияние на степень оплодотворения

сощтгсз 3n vitro. Оптимальной является температура 20 °С, если вся процедура о? получения яичников до аспирации ооцитов длиться не . Солее 4 часов

ВЫ ВО д ы

1. 'Различные культуралыше среды в разной степени пригодны для созревания ооиитов свиней in vitro. Более подходящей является .среда ТСМ 1 (39 на сбалансированном солевом растворе Зрла, содержа-

■ ■• • V- ' - ie - -V , ■ -

щл' 1мМ глутамина,10 мМ ilEPES,2,92 (аУ Са-лагаата,3,05 мМ глюкозы, . 1 мМ Ма-пирувата, 50 мг/л генташцин сульфата и 15 X фетальной сыворотки теленка. В данной среде культивирование должно продолжаться че менее 44 часов. ' Л. ;

2. Добавление гипофизаркых гонадотропинов улучшает процесс мейоза. Оптимальной концентрацией йСГ 'является 10 мкг/ыл и ЛГ - 5 . мкг/мл. Цитоплазматичесгое созревание невозможно в среде без гормонов. Ооцитц, оплодотворяются 'лишь в ,их присутствие. Результаты on-j • лодотворения ооцитов улу>,.. .-.ются при одновременно« включении ССГ к

■ хг. , , ' .... ф . ■ ,' - ...г - v

'• .. ' ¿. Температура траиспортиой среды- является существенным уело-;;''

./вивм при■ оплодотворении ооцитов "in vitro и должна составлять 20°С. ■ \4. При. подготовке спермы к капацитации важно учитывать температуру разбавителя. Вся процедуру подготовки спермы,'к преинкубащи.

1' • ■: : -/"•■ ' - - ' ■ , ■' ' о ■ ■ - - •

■ молдо. „проводить при комнатной температуре ( 20- 2ЬиС ).

'5. Добавление к среде для созревания 10 % частично очищенной 'фолликулярной -щдкостй свиней .из '.фолликуловдиаметром 2-5 мм спо-; собствуэт увеличению процента оплодотворенных яйцеклеток п куль-туг«. .... '-.л . .. / , ■'.:[' ."<■■; • - •''' '

ДР Е д'л Ой ЕН И Я , -,-'.

В научных исследованиях рекомендуется для оптимизации уело- ^ вий культивирования ооцитов в замкнутой;;ii) .yitro системе вводить , •в питательную среду для созреваний 1 гипо^йзарные. гонадотропины и фолликулярную жидкость свиней и использоват^;' тешературный режим

при транспортировке яичников, в лабораториюпри подготовке спермы хряка к капацитации температура разбавителя должна оставлять 20-25 С. . ■ .

ОПИСОК РАБОТ

Сингина Г. Н. Влияние различных культуральных сред на созревание ооцитов свиней //1-я Международная научная конференция "Мило-вановские чтения",апрель 1993 - г.Харьков • . - .