Критерии оценки лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis к препаратам группы фторхинолонов культуральными методами

Исаева, Юлия Дмитриевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Критерии оценки лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis к препаратам группы фторхинолонов культуральными методами
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Критерии оценки лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis к препаратам группы фторхинолонов культуральными методами"

На правах рукописи

ИСАЕВА ЮЛИЯ ДМИТРИЕВНА

КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS К ПРЕПАРАТАМ ГРУППЫ ФТОРХИНОЛОНОВ КУЛЬТУРАЛЬНЫМИ МЕТОДАМИ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2013

31 ОКТ 2013

005536709

Работа выполнена в Государственном казенном учреждении здравоохранения города Москвы «Московский городской научно-практический Центр борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы» (ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ), Москва

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Мороз Аркадий Максович

доктор биологических наук Макарова Марина Витальевна

Официальные оппоненты:

Батуро Алла Петровна, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, заведующая лабораторией микробиологии условно-патогенных бактерий

Леви Диана Тимофеевна, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, главный эксперт Управления экспертизы противобактериальных медицинских иммунобиологических препаратов

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН), Москва

Защита состоится «21» ноября 2013 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук по адресу: 105064, г. Москва, пер. Малый Казенный, д.5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук

по адресу: 105064, г. Москва, пер. Малый Казенный, д.5а.

Автореферат разослан <</Жоктября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Яковлева Ирина Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Туберкулез представляет постоянную угрозу здоровью людей во всем мире и является причиной высокой смертности у взрослого населения. По данным ВОЗ в 2011 году зарегистрировано около 8,7 млн. новых случаев этого заболевания и 1,4 млн. - летальных исходов [ВОЗ, 2012].

Напряженная эпидемическая ситуация по туберкулезу как в мире, так и в Российской Федерации, прежде всего, связана с увеличением числа случаев заболевания, вызываемых М. tuberculosis (МБТ) с множественной и широкой лекарственной устойчивостью (МЛУ/ШЛУ) [CDC, 2006; ВОЗ, 2012].

Повышение эффективности этиотропного лечения больных туберкулезом с МЛУ/ШЛУ возбудителя может быть достигнуто за счет введения в стандартные режимы химиотерапии антибактериальных препаратов, входящих в число резервных лекарственных средств, - фторхинолонов третьего и четвертого поколений. Однако вероятность выздоровления пациентов во многом будет зависеть от своевременно назначенного адекватного лечения, от уровня и скорости формирования устойчивости МБТ к препаратам [Борисов С.Е. и др., 2011; Bryskier A. et al., 2002; Ginsburg A. et al., 2003; Conde M. et al., 2009; Devasia R. et al., 2009]. В связи с этим необходимо быстро и качественно проводить определение лекарственной чувствительности (ЛЧ) возбудителя.

В последние годы разработаны молекулярно-генетические методы, позволяющие в короткие сроки (до 48 часов) определить лекарственную чувствительность МБТ к фторхинолонам [Мороз A.M. и др., 2008; Носова Е.Ю. и др.,

2011]. Необходимо отметить, что результатом молекулярно-генетического анализа являются экспресс-данные о наличии или отсутствии устойчивости возбудителя ко всей группе фторхинолонов в целом. В то же время появились работы, в которых показано, что не все мутации, индуцирующие устойчивость МБТ к фторхинолонам, связаны с перекрестной устойчивостью [Malik S. et al.,

2012]. Кроме того, все чаще обнаруживают мутации, роль которых в возникновении лекарственной устойчивости до конца не изучена [Pantel A. et al., 2011].

Следовательно, для определения лекарственной чувствительности МБТ к препаратам группы фторхинолонов применение только молекулярно-генетических методов не может обеспечить необходимую достоверность результатов. Именно поэтому исключительно высока роль использования микробиологических методов, которые в комплексе с молекулярно-генетическими позволят получить наиболее точные и адекватные результаты для проведения больным своевременного эффективного лечения.

Чтобы определить лекарственную чувствительность возбудителя туберкулеза культуральными методами необходимо знать критическую концентрацию (КК) препарата, с помощью которой возможно разделение микобактерий на чувствительные и устойчивые [Приказ №109 МЗ РФ, 2003; Canetti G. et al., 1963; CLSI, 2011]. В настоящее время единых критических концентраций резервных препаратов, в том числе и фторхинолонов не предложено. В этой связи вопрос выбора оценочных критериев для качественного и надежного определения лекарственной чувствительности МБТ к препаратам группы фторхинолонов при использовании культуральных методов приобрел особую актуальность.

Цель работы

Определение критериев оценки лекарственной чувствительности М. tuberculosis к препаратам группы фторхинолонов культуральными методами для повышения эффективности микробиологической диагностики туберкулеза, вызванного лекарственно-устойчивым возбудителем.

Задачи исследования

1. Создание лабораторной коллекции чувствительных и устойчивых к фторхинолонам клинических штаммов М. tuberculosis, охарактеризованных культуральными и молекулярно-генетическими методами.

2. Определение критических концентраций левофлоксацина, моксифлок-сацина и гатифлоксацина для оценки лекарственной чувствительности М. tuberculosis в жидкой питательной среде Middlebrook 7Н9 с помощью автоматизированной системы Bactec MGIT 960 и на плотной среде Левенштейна-Йенсена методом абсолютных концентраций.

3. Выявление устойчивости М. tuberculosis к офлоксацину и моксифлок-сацину в жидкой среде Middlebrook 7Н9 с помощью тест-системы Sensititre Му-соТВ.

4. Сравнительное изучение лекарственной чувствительности клинических штаммов М. tuberculosis к фторхинолонам разными культуральными методами с использованием установленных оценочных критериев.

Научная новизна

Впервые с использованием единой стандартной панели штаммов М. tuberculosis установлены критические концентрации наиболее активных препаратов группы фторхинолонов для оценки лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза в жидкой Middlebrook 7Н9 и на плотной Левекштейна-Йенсена питательных средах.

Впервые установлено значение критической концентрации гатифлоксацина - 0,25 мкг/мл; обоснованы критические концентрации левофлоксацина — 1,0 мкг/мл и моксифлоксацина - 0,25 мкг/мл для оценки лекарственной чувствительности М. tuberculosis в автоматизированной системе Bactec MGIT 960.

Впервые определены значения критических концентраций левофлоксацина — 2,0 мкг/мл, моксифлоксацина и гатифлоксацина - 0,75 мкг/мл для оценки лекарственной чувствительности М. tuberculosis методом абсолютных концентраций на плотной среде Левенштейна-Йенсена.

Установлены значения минимальных ингибирующих концентраций офлоксацина - 4,0 мкг/мл и моксифлоксацина — 1,0 мкг/мл, указывающие на устойчивость М. tuberculosis к данным препаратам в тест-системе Sensititre Му-соТВ (количественный метод).

Впервые проведено сравнительное исследование лекарственной чувствительности клинических штаммов М. tuberculosis к препаратам фторхинолоново-го ряда в тест-системе Sensititre МусоТВ, системе Bactec MGIT 960 и методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена с использованием для анализа результатов установленных оценочных критериев. Выявлен высокий уровень корреляции результатов.

Практическая значимость

Для раннего выявления устойчивости М. tuberculosis целесообразно применять систему Bactec MGIT 960 или тест-систему Sensititre МусоТВ, которые, в отличие от метода абсолютных концентраций с длительностью выполнения исследования 21-28 дней, позволяют получить результат на 5-14 день от начала инкубации, а также провести быструю коррекцию химиотерапии больных туберкулезом.

С помощью установленных в тест-системе Sensititre МусоТВ минимальных ингибирующих концентраций офлоксацина и моксифлоксацина можно выявить степень относительной устойчивости к ним (низкая или высокая,) М. tuberculosis, что необходимо клиницисту для выбора препарата из группы фтор-хинолонов, корректировки дозировки и схемы лечения пациента.

Созданная лабораторная коллекция клинических штаммов М. tuberculosis, охарактеризованных микробиологическими и молекулярно-генетическими методами и обладающих различным спектром лекарственной устойчивости к препаратам фторхинолонового ряда, позволит в дальнейшем проводить сравнительные исследования лекарственной чувствительности возбудителя к вновь синтезированным препаратам данной группы, а также апробировать новые методы микробиологической диагностики туберкулеза.

Положения, выносимые на защиту

1. Для оценки лекарственной чувствительности М. tuberculosis установлены критические концентрации препаратов группы фторхинолонов. Для автоматизированной системы Bactec MGIT 960 с использованием жидкой питательной среды Middlebrook 7Н9 и метода абсолютных концентраций на плотной среде Левенштейна-Йенсена критические концентрации левофлоксацина составили 1,0 и 2,0 мкг/мл, соответственно, моксифлоксацина и гатифлоксацина -0,25 и 0,75 мкг/мл, соответственно.

2. Установленные в тест-системе Sensititre МусоТВ минимальные инги-бирующие концентрации офлоксацина - 4,0 мкг/мл и моксифлоксацина - 1,0 мкг/мл, указывают на устойчивость М. tuberculosis к этим препаратам.

3. Сравнительное изучение лекарственной чувствительности клинических штаммов М. tuberculosis в системе Bactec MGIT 960 и методом абсолютных концентраций на плотной среде Левенштейна-Иенсена при использовании установленных критических концентраций препаратов выявило высокий процент корреляции полученных результатов: для левофлоксацина — 99,0%, для моксифлоксацина - 97,1% и для гатифлоксацина - 96,1% случаев.

4. Данные, полученные в результате определения лекарственной чувствительности клинических штаммов М. tuberculosis тремя культуральными методами (в тест-системе Sensititre МусоТВ, в системе Bactec MGIT 960 и методом абсолютных концентраций на плотной среде Левенштейна-Йенсена), сопоставимы в 89,3% случаев для офлоксацина и в 94,6% — для моксифлоксацина.

Апробация работы и публикации

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ, протокол №1 от 5 марта 2013 года. Материалы диссертации доложены на: научно-практической конференции молодых ученых «Новые технологии в диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей», Москва, 2009; научно-практической конференции молодых ученых «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей», Москва, 2011; Всероссийской научно-практической конференции «Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом», Санкт-Петербург, 2011; X Московской ассамблее «Здоровье столицы», Москва, 2011; XI Московской ассамблее «Здоровье столицы», Москва, 2012; Российской научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей», Москва, 2013; V Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 2013.

Основное содержание диссертации отражено в 11 опубликованных работах, включая 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Библиография включает 164 наименования, из них 82 на русском и 82 на иностранных языках. Диссертация иллюстрирована 6 рисунками и 23 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследования

Бактериальные штаммы. В работе использован 171 клинический штамм М. tuberculosis, выделенный из различного диагностического материала (мокрота, бронхиальный смыв, бронхоальвеолярный лаваж, экссудат, резекционный материал — содержимое туберкулем и каверн), полученного от 171 больного: с подозрением на наличие туберкулезной инфекции, впервые выявленных, с подозрением на рецидив или с хроническим течением туберкулеза органов дыхания. Все больные находились на лечении в филиалах и клиниках ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ.

В качестве контроля использовали лабораторный референс-штамм М. tuberculosis H37R.V - АТСС® 25618 (American Type Culture Collection, Bethesda, Md).

Лекарственные препараты. Для проведения исследований in vitro использовали фармакопейные субстанции офлоксацина (OFX, Sigma-Aldrich, Китай), левофлоксацина (LVX, Sigma-Aldrich, Китай), моксифлоксацина хлористо-кислого (МОХ, Sequoia Research Products, Великобритания) и гатифлоксацина (GTX, Sequoia Research Products, Великобритания).

Микробиологические методы. Определение КК LVX, МОХ и GTX в системе Bactec MGIT 960 (Bactec 960, Becton Dickinson, США) с применением жидкой среды Middlebrook 7Н9 (М7Н9) проводили согласно рекомендациям С. Sanders и соавт. (2004), A. Krüüner и соавт. (2006), S. Rüsch-Gerdes и соавт.

(2006), S.-Y. G. Lin и соавт. (2009), на плотной среде Левенштейна-Йенсена (ЛИ) - согласно методическим рекомендациям В.Н. Степаншиной и соавт. (2009).

Определение ЛЧ штаммов МБТ к фторхинолонам в системе Bactec 960 проводили согласно методическим рекомендациям S. Siddiqi и соавт. (2006) по изучению ЛЧ к противотуберкулезным препаратам основного ряда и в соответствии с инструкцией; методом абсолютных концентраций на среде Л-И согласно Приказу №109 МЗ РФ (2003); методом пропорций на агаровой среде Middle-brook 7Н10 (М7Н10) в соответствии с методикой, рекомендованной институтом клинических и лабораторных стандартов США (CLSI, 2011).

Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) OFX и МОХ в обогащенной жидкой среде М7Н9 с помощью тест-системы Sensititre МусоТВ (МусоТВ, TREK Diagnostic Systems, Великобритания-США) проводили согласно L. Hall и соавт. (2011) и в соответствии с инструкцией.

Молекулярно-генетические методы. Для определения ЛЧ МБТ к фторхинолонам использовали тест-систему «ТБ-БИОЧИП-2», разработанную в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (РУ ФСР №. 2008/ 03457 от 07.10.2008). Экстракцию ДНК МБТ из культур, проведение ПЦР, электрофореза и гибридизации на биологических микрочипах для выявления мутаций в гене gyrA проводили согласно методическим рекомендациям A.M. Мороза и соавт. (2008). С помощью «ТБ-БИОЧИП-2» определяли 9 типов мутаций в QRDR области гена gyrA. В качестве референс-метода применяли се-квенирование генов gyrA и gyrB ДНК МБТ с помощью автоматического секве-натора GS Junior («Roche», Германия).

Статистическая обработка данных. Обработку результатов исследования с использованием параметрической и непараметрической статистики производили с помощью программы STATISTICA 8. При использовании установленных КК рассчитывали показатели метода определения ЛЧ: чувствительность (способность обнаружить истинную устойчивость), специфичность (способность обнаружить истинную чувствительность), эффективность (способность обнаружить истинную чувствительность/устойчивость), положительную прогности-

ческую ценность (ППЦ, вероятность наличия устойчивости, в случае если результат теста показал устойчивость) и отрицательную прогностическую ценность (ОПЦ, вероятность наличия чувствительности, в случае если результат теста показал чувствительность). При расчете характеристик методов и доли совпадений результатов вычисляли 95% доверительный интервал (ДИ). Для оценки статистической значимости различий между сопоставляемыми величинами МИК50, которая рассматривалась как медиана, использовали U-критерий Манна-Уитни. Данный метод обеспечивал проверку различия основных тенденций в полученных результатах измерения МИК. Различия считались достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для получения точных оценочных критериев было проведено более 3000 исследований с использованием 171 клинического штамма М. tuberculosis.

1. Установление оценочных критериев для определения лекарственной чувствительности М. tuberculosis

Определение критических концентраций левофлоксацина. моксифлок-сацина и гатифлоксацина. В настоящем исследовании установлены КК препаратов группы фторхинолонов - LVX, МОХ и GTX для оценки ЛЧ МБТ в автоматизированной системе Bactec 960 и классическим методом абсолютных концентраций на плотной среде Л-И.

Для выполнения поставленной задачи сформировали стандартную панель из 68 клинических штаммов МБТ, которые разделили на две группы по предположительной чувствительности/устойчивости к изучаемым фторхинолонам. К группе «условно чувствительных» отнесли 29 и к группе «условно устойчивых» — 39 штаммов МБТ. Критериями отбора штаммов в группу «условно чувствительных» являлись: 1) выделение штаммов из диагностического материала пациентов, не получавших противотуберкулезную химиотерапию, с подозрением на наличие туберкулезной инфекции или впервые выявленных больных туберкулезом легких; 2) наличие чувствительности к OFX; 3) отсутствие мутаций в генах-мишенях действия фторхинолонов. Критериями отбора штаммов в груп-

пу «условно устойчивых» являлись: 1) выделение штаммов из диагностического материала больных с подозрением на рецидив или хроническим течением туберкулеза, ранее леченых пациентов, в том числе препаратами группы фторхинолонов; 2) наличие устойчивости к OFX; 3) наличие мутаций в генах-мишенях действия фторхинолонов.

С использованием сформированной панели штаммов, определяли МИК LVX, МОХ и GTX в жидкой и на плотной питательных средах (табл. 1 и 2).

Таблица 1. Минимальные ингибирующие концентрации левофлоксацина, моксифлоксацина и гатифлоксацина для «условно чувствительных» и «условно устойчивых» к фторхинолонам штаммов М. tuberculosis в жидкой среде Middle-brook 7Н9 (Bactec MGIT 960)

МИК LVX МОХ GTX

(мкг/мл) УЧ УУ УЧ УУ УЧ УУ

абс. %* абс. %* абс. %" абс. %' абс. %* абс. %"

0,063 0 0 0 0 2 2,9 0 0 7 10,3 0 0

0,125° 3 4,4 0 0 23 33,8 0 0 22 32,4 0 0

0,25 17 25,0 0 0 4 5,9 1 1,5 0 0 1 1,5

0,5' 8 11,8 0 0 0 0 9 13,2 0 0 16 23,5

1,0 1 1,5 1 1,5 0 0 8 11,8 0 0 13 19,1

2,0 0 0 15 22,1 0 0 19 27,9 0 0 8 11,8

4,0 0 0 14 20,6 0 0 1 1,5 0 0 1 1,5

8,0 0 0 6 8,8 0 0 1 1,5 0 0 0 0

16,0 0 0 2 2,9 0 0 0 0 0 0 0 0

>32,0 0 0 1 1,5 0 0 0 0 0 0 0 0

Установленная 1,0 0,25 0,25

КК (мкг/мл) Характеристики метода определения ЛЧ при установленных КК

Чувствительность 97,4% 97,4% 97,4%

(95% ДИ: 87-99,9%) (95% ДИ: 87-99,9%) (95% ДИ: 87-99,9%)

Специфичность 100% 100% 100%

(95% ДИ: 88-100%); (95% ДИ: 88-100%); (95% ДИ: 88-100%);

Эффективность 98,5% 98,5% 98,5%

(95% ДИ: 92-100) (95% ДИ: 92-100) (95% ДИ: 92-100)

ППЦ 100% 100% 100%

(95% ДИ: 91-100%) (95% ДИ: 91-100%) (95% ДИ: 91-100%)

опц 96,7% 96,7% 96,7%

(95% ДИ: 83-99,9%) (95% ДИ: 83-99,9%) (95% ДИ: 83-99,9%)

Примечание: УЧ - «условно чувствительные» к фторхинолонам штаммы МБТ (п=29); УУ -«условно устойчивые» к фторхинолонам штаммы МБТ (п=39); ' - процент подсчитан от общего количества штаммов (п=68); 6 - МИК МОХ и GTX для контрольного штамма М. tuberculosis H37Rv; * - МИК LVX для контрольного штамма М. tuberculosis H37Rv. В скобках указан 95% доверительный интервал.

Таблица 2. Минимальные ингибирующие концентрации левофлоксацина, моксифлоксацина и гатифлоксацина для «условно чувствительных» и «условно устойчивых» к фторхинолонам штаммов М. tuberculosis на плотной среде Ле-венштейна-Йенсена

МИК (мкг/мл) LVX МОХ GTX

УЧ УУ УЧ УУ УЧ УУ

абс. %* абс. %" абс. %* абс. %* абс. %" абс. %"

0,125 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2,9 0 0

0,25° 0 0 0 0 17 25,0 0 0 20 29,4 0 0

0,5 15 22,1 0 0 12 17,6 0 0 7 10,3 1 1,5

1,0" 13 19,1 0 0 0 0 2 2,9 0 0 4 5,9

2,0 1 1,5 1 1,5 0 0 11 16,2 0 0 19 27,9

4,0 0 0 11 16,2 0 0 11 16,2 0 0 8 11,8

8,0 0 0 18 26,5 0 0 14 20,6 0 0 7 10,3

16,0 0 0 8 11,8 0 0 1 1,5 0 0 0 0

>32,0 0 0 1 1,5 0 0 0 0 0 0 0 0

Установленная КК (мкг/мл) 2,0 0,75 0,75

Характеристики метода определения ЛЧ при установленных КК

Чувствительность 97,4% (95% ДИ: 87-99,9%) 97,4% (95% ДИ: 87-99,9%) 97,4% (95% ДИ: 87-99,9%)

Специфичность 100% (95% ДИ: 88-100%); 100% (95% ДИ: 88-100%); 100% (95% ДИ: 88-100%);

Эффективность 98,5% (95% ДИ: 92-100) 98,5% (95% ДИ: 92-100) 98,5% (95% ДИ: 92-100)

ППЦ 100% (95% ДИ: 91-100%) 100% (95% ДИ: 91-100%) 100% (95% ДИ: 91-100%)

ОПЦ 96,7% (95% ДИ: 83-99,9%) 96,7% (95% ДИ: 83-99,9%) 96,7% (95% ДИ: 83-99,9%)

Примечание: см. к табл. 1.

На основании полученных МИК ЬУХ, МОХ и ОТХ графическим методом установили КК препаратов для оценки ЛЧ в системе Вааес 960 и методом абсолютных концентраций. Критической концентрацией препарата являлось значение в точке перехода графических кривых, показывающих процент МИК фторхинолонов в отношении «условно чувствительных» и «условно устойчивых» штаммов МБТ (рис. 1-3).

Рис. 1. Определение критической концентрации левофлоксацина а) б)

Рис. 2. Определение критической концентрации моксифлоксацина а) б)

Рис. 3. Определение критической концентрации гатифлоксацина

Примечание: а) - для системы Bactec MGIT 960 с применением жидкой среды Middle-brook 7Н9, б) - для метода абсолютных концентраций на плотной среде Левенштейна-Иенсена.

Критерием для выбора значения КК являлось условие, при котором полученная концентрация подавляла рост более чем 95% «условно чувствительных» и позволяла расти более чем 95% «условно устойчивых» к фторхинолонам штаммов МБТ [Степаншина В.Н. и др., 2009; Sanders С. et al., 2004; Kriiuner А.

et al., 2006; Lin G. et al., 2009; Angeby K. et al., 2010; Van Ingen J. et al., 2010]. Выбранному критерию противоречила KK МОХ - 1,0 мкг/мл, полученная с помощью графика для среды Л-Й (рис. 26), при которой выросли только 94,87% «условно устойчивых» штаммов (37 из 39, см. табл. 2), что требовало уточнения. Поэтому дополнительно провели исследование ЛЧ двух «условно устойчивых» штаммов (МИК - 1,0 мкг/мл) к концентрации МОХ 0,75 мкг/мл. В результате у одного штамма обнаружили наличие устойчивости, у другого - чувствительности к данной концентрации. Полученные данные позволили сделать заключение, что более достоверным является значение КК - 0,75 мкг/мл, которое отвечает выбранному критерию (не подавляет рост >95,0% «условно устойчивых» штаммов) и позволяет более полно выявлять штаммы с низким уровнем устойчивости. Дополнительное исследование потребовалось провести для установления точного значения КК GTX, так как граница кривых распределения МИК GTX на плотной среде Л-Й находилась в диапазоне 0,5-1,0 мкг/мл (рис. 36). Для этого исследовали ЛЧ к концентрации GTX - 0,75 мкг/мл четырех «условно устойчивых» штаммов с МИК GTX — 1,0 мкг/мл. Все штаммы проявили устойчивость к изучаемой концентрации. Следовательно, за КК, которая позволяет отделить чувствительные к GTX штаммы МБТ от штаммов с низким уровнем устойчивости, выбрали значение 0,75 мкг/мл.

Таким образом, впервые установлена КК GTX - 0,25 мкг/мл, а также обоснованы КК МОХ - 0,25 мкг/мл и LVX - 1,0 мкг/мл для оценки ЛЧ МБТ в системе Bactec 960. Также впервые установлены КК LVX - 2,0 мкг/мл, МОХ и GTX - 0,75 мкг/мл для оценки ЛЧ методом абсолютных концентраций на плотной среде Л-Й.

Полученное значение КК LVX - 1,0 мкг/мл для ускоренного определения ЛЧ в системе Bactec 960 отличалось от предлагаемых другими авторами (2,0 и 1,5 мкг/мл, см. прим. к табл. 3). Поэтому были проведены дополнительные исследования. Для этого выбрали 15 штаммов из группы «условно устойчивых», в отношении которых в системе Bactec 960 установили низкие значения МИК LVX - 2,0 мкг/мл (табл. 1) и изучили у них ЛЧ к концентрации LVX-1,5 мкг/мл.

Эти 15 штаммов также исследовали методом пропорций на агаровой среде М7Н10, с использованием для оценки результатов определения JI4 КК - 1,0 мкг/мл, предложенную С. Sanders и соавт. (2004) и CLSI (2011), и 2,0 мкг/мл, рекомендованную ВОЗ (2008). В исследование включили еще один штамм из группы «условно устойчивых» -(мутация в гене gyrB), который при использовании установленной КК LVX -1,0 мкг/мл был чувствительным. Результаты сравнительного изучения JI4 к LVX представлены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты определения лекарственной чувствительности 16 штаммов М. tuberculosis к левофлоксацину тремя культуральными методами при использовании разных критических концентраций

Количество штаммов (п= 16)

Интерпретация Bactec 960 _ МАК МП

результата Критические концентрации LVX (мкг/мл)

1,0" 1,50J1 2,0ВГ 2,0* 1,0ВД 2,0Г

Чувствительный 1 9 16 1 1 6

Устойчивый 15 7 0 15 15 10

Примечание: МАК - метод абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена; МП - метод пропорций на среде Middlebrook 7Н10;а— значения, установленные в настоящем исследовании. Значения критических концентраций рекомендуют: 6 — G. Lin и соавт., 2009; " — С. Sanders и соавт, 2004;г- ВОЗ, 2008,л- CLSI, 2011.

Сравнительное изучение JI4 МБТ к LVX тремя культуральными методами показало, что получены результаты сопоставимые в 100% (95% ДИ: 79,4%-100%) случаев при использовании для их оценки следующих КК: для системы Bactec 960 — 1,0 мкг/мл, метода абсолютных концентраций - 2,0 мкг/мл и метода пропорций - 1,0 мкг/мл.

Таким образом, доказано, что значение КК LVX - 1,0 мкг/мл для оценки JT4 МБТ в системе Bactec 960 является более достоверным.

Полученная в данной работе КК МОХ - 0,25 мкг/мл в системе Bactec 960 также отличалась от предлагаемых другими авторами (0,125 и 0,5 мкг/мл) (см. прим. к табл. 4). Для ее подтверждения провели исследования J14 методом пропорций на агаровой среде М7Н10 для 14 штаммов, у которых изучили степень несовпадения результатов определения J14 в системе Bactec 960 при использовании для их оценки разных КК. Результаты сравнительного изучения J14 к МОХ тремя культуральными методами представлены в таблице 4.

Таблица 4. Результаты определения лекарственной чувствительности 14 штаммов М. tuberculosis к моксифлоксацину тремя культуральными методами при использовании разных критических концентраций

Количество штаммов (п=14)

Интерпретация Bactec 960 МАК МП

результата Критические концентрации МОХ (мкг/мл)

0,125* 0,25"-" 0,5Г 0,75* 0,5"

Чувствительный 0 5 14 5 6

Устойчивый 14 9 0 9 8

Примечание: МАК - метод абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена; МП - метод пропорций на среде Middlebrook 7Н10; а- значения, установленные в настоящем исследовании. Значения критических концентраций рекомендуют: 6 — A. Kriiüner и соавт., 2006; " - ВОЗ, 2008;г - J. van Ingen и соавт., 2010;д - С LSI, 2011.

Исследование показало, что в 92,9% случаев (95% ДИ: 66% — 99,8%) результаты определения JI4 к МОХ сопоставимы при использовании КК - 0,25 мкг/мл в системе Bactec 960, что доказывает достоверность установленной нами КК МОХ.

Величины КК GTX для оценки JI4 МБТ в системе Bactec 960 в опубликованной литературе не имеется. Приводится только КК GTX — 1,0 мкг/мл для метода пропорций на агаровой среде М7Н10 [ВОЗ, 2008]. Сравнение проведено по результатам JI4 к GTX в системе Bactec 960, методом абсолютных концентраций на среде Jl-Й, а также методом пропорций на агаровой среде М7Н10. Учитывая то обстоятельство, что активность GTX не ниже чем МОХ, в исследование также включили концентрацию GTX - 0,5 мкг/мл для метода пропорций (по аналогии с МОХ). Результаты сравнительного изучения ЛЧ к GTX в отношении 14 штаммов, у которых ранее была изучена чувствительность к МОХ, представлены в таблице 5.

Таблица 5. Результаты лекарственной чувствительности 14 штаммов М. tuberculosis к гатифлоксацину тремя культуральными методами при использовании разных критических концентраций

Количество штаммов (п=14)

Интерпретация Bactec 960 МАК МП

результата Критические концентрации GTX (мкг/мл)

0,25* 0,75* 0,5" 1,0'

Чувствительный 5 5 5 10

Устойчивый 9 9 9 4

Примечание: МАК - метод абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена; МП - метод пропорций на среде Middlebrook 7Н10;а- значения, установленные в настоящем исследовании; 6 - значение, включенное в исследование по аналогии с критической концентрацией МОХ;' - значение, рекомендованное ВОЗ (2008).

Сравнительное изучение JI4 МБТ к GTX тремя культуральными методами показало, что при использовании концентрации 0,5 мкг/мл для метода пропорций, результаты сопоставимы в 100% случаев (95%ДИ: 77%-100%), тогда как при использовании КК - 1,0 мкг/мл - в 64,3% (95% ДИ: 35,1%-87,2%). Следовательно, применение в качестве КК GTX значения 1,0 мкг/мл для метода пропорций не позволяет в полной мере выявлять устойчивые штаммы, в то время как использование концентрации 0,5 мкг/мл дает возможность обнаружить штаммы с низким уровнем устойчивости.

Проведенная работа по определению МИК LVX, МОХ и GTX, позволила оценить степень противотуберкулезной активности трех препаратов. Для этого сравнили МИК препаратов, полученные как в жидкой М7Н9, так и на плотной Л-Й питательных средах. Статистически достоверно установили, что наибольшей противотуберкулезной активностью in vitro обладает GTX, тогда как наименьшей - LVX (р<0,05). Гатифлоксацин по противотуберкулезной активности превосходит МОХ почти в 2 раза и LVX в 2-4 раза. Проведенный анализ показал, что величина МИК препарата, полученная на плотной среде Л-И, выше в 2,5 раза, чем в жидкой М7Н9 (р<0,05). Данное обстоятельство объясняется разницей физико-химических свойств питательных сред, абсорбцией и инактивацией препаратов в средах.

Определение минимальных ингибирующих концентраций офлоксацина и моксифлоксацина, указывающих на устойчивость к данным препаратам в тест-системе Sensititre МусоТВ. Критерии для интерпретации результатов ЛЧ к OFX и МОХ в тест-системе МусоТВ (количественный метод с использованием 96-луночного планшета) определяли в отношении штаммов МБТ, входящих в состав стандартной панели (табл. 6).

Таблица 6. Минимальные ингибирующие концентрации офлоксацина и моксифлоксацина, полученные в тест-системе Sensititre МусоТВ в отношении «условно чувствительных» и «условно устойчивых» к фторхинолонам штаммов М. tuberculosis

МИК Количество штаммов (п=68)

(мкг/мл) УЧ (п=29) УУ (4=39)

OFX

<0,25 1 0

0,5 4 0

1,0 24 0

2,0* 0 1

4,0 0 19

8,0 0 14

16,0 0 4

>32,0 0 1

МОХ

<0,06 0 0

0,125 1 0

0,25 17 0

0,5* 11 2

1,0 0 12

2,0 0 15

4,0 0 9

8,0 0 1

Примечание: УЧ - «условно чувствительные» к фторхинолонам штаммы МБТ; УУ -«условно устойчивые» к фторхинолонам штаммы МБТ; * — МИК препаратов для контрольного штамма М. tuberculosis H37R.V.

Как видно из таблицы 6, 100% (29/29) «условно чувствительных» к фторхинолонам штаммов имели МИК OFX - <1,0 мкг/мл и 100% (39/39) «условно устойчивых» - >2,0 мкг/мл. Так как значение МИК OFX для контрольного штамма М. tuberculosis H37Rv составило 2,0 мкг/мл, то за критерий оценки устойчивости приняли МИК OFX — 4,0 мкг/мл. Аналогично установили, что критерием устойчивости МБТ к МОХ в тест-системе МусоТВ является МИК МОХ —1,0 мкг/мл, так как 100% (29/29) «условно чувствительных» штаммов имели МИК - <0,5 мкг/мл и 94,9% (37/39) «условно устойчивых» штаммов - >1,0 мкг/мл. Для контрольного штамма М. tuberculosis H37R.V значение МИК МОХ составило 0,5 мкг/мл.

Таким образом, в результате проведенного исследования в тест-системе МусоТВ установлены МИК OFX - 4,0 мкг/мл и МОХ - 1,0 мкг/мл, которые указывают на устойчивость МБТ.

Для определения JI4 в тест-системе МусоТВ с использованием установленных МИК препаратов, указывающих на устойчивость МБТ, получили следующие характеристики метода: чувствительность — 97,4% (95% ДИ: 8799,9%) для OFX и 94,9% (95% ДИ: 83-99,4) для МОХ, а также специфичность - 100% (95% ДИ: 88-100%) для обоих препаратов; эффективность - 98,5 % (95% ДИ: 92-100) для OFX и 97,1% (95% ДИ 91,7-99,4%) для МОХ; ППЦ -100% (95% ДИ: 91-100%) для обоих препаратов; ОПЦ - 96,7% (95% ДИ: 8399,9%) для OFX и 93,5% (95% ДИ: 91-94,6%) для МОХ.

2. Сравнительный анализ результатов определения лекарственной чувствительности клинических штаммов М. tuberculosis

Для решения задачи исследования по определению JI4 клинических штаммов МБТ анализировали результаты определения JI4 к LVX, МОХ и GTX, полученные в системе Bactec 960 и методом абсолютных концентраций на среде Л-И при использовании для их оценки установленные КК. Изучили 103 клинических штамма МБТ, из которых 55 не имели мутаций, приводящих к возникновению устойчивости к фторхинолонам и 48 имели мутации в гене gyrA. Сравнительные результаты исследования ЛЧ представлены в таблице 7.

Таблица 7. Сопоставление результатов определения лекарственной чувствительности 103 клинических штаммов М. tuberculosis к левофлоксацину, моксифлоксацину и гатифлоксацину в системе Bactec 960 и методом абсолютных концентраций

Препарат Интерпретация результата Bactec Метод абсолютных 960 конценраций Корреляция результатов

Количество штаммов (п=103) абс. %, (95% ДИ)

абс. % абс. %

LVX чув. 56 54,4 55 53,4 102 99,0 (94,7 - 99,9)

уст. 47 45,6 48 46,6

МОХ чув. 55 53,4 58 56,3 100 97,1 (91,7-99,4)

уст. 48 46,6 45 43,7

GTX чув. 57 55,3 61 59,2 99 96,1 (90,4-98,9)

уст. 46 44,7 42 40,8

Примечание: чув. - чувствительный, уст. - устойчивый.

Как видно из данных таблицы 7, имеется высокий процент корреляции результатов определения ЛЧ двумя культуральными методами: 99,0% для ЬУХ, 97,1% - МОХ и 96,1% - ОТХ, что подтверждает достоверность установленных значений КК.

Данное исследование также показало, что в 98,1% случаев наблюдали совпадение результатов чувствительности/устойчивости штаммов к ЬУХ, МОХ и ОТХ, полученных в системе Вааес 960 и в 94,2% - методом абсолютных концентраций на плотной среде Л-И. В связи с тем, что наличие чувствительности/устойчивости к ЬУХ, МОХ и ОТХ по данным культурального исследования носит перекрестный характер, то возможно, что определение ЛЧ ко всем изучаемым фторхинолонам с использованием КК не представляется необходимым. Однако для утверждения данного вопроса необходимо провести расширенное микробиологическое и молекулярно-генетическое исследование с использованием штаммов МБТ с различным спектром мутаций как в генах &угА, так и £>гВ.

На следующем этапе исследования проанализировали результаты определения ЛЧ к ОБХ и МОХ, полученные в системе Вайес 960, методом абсолютных концентраций на среде Л-И и в тест-системе МусоТВ. Изучили 56 клинических штаммов МБТ. Из общего количества штаммов 27 были без мутаций в генах-мишенях и 29 с мутацией в гене дуг А. Сравнительные результаты ЛЧ представлены в таблице 8.

Таблица 8. Сравнительные результаты определения лекарственной чувствительности 56 клинических штаммов М. tuberculosis к офлоксацину и моксифлоксацину с помощью различных культуральных методов

Препарат Интерпретация результата Количество штаммов (п=56) Корреляция результатов

Bactec 960 Метод АК на среде Л-Й Sensititre МусоТВ

абс. %, (95%ДИ)

OFX* чув. 27 22 28 50 89,3% (78,1-96,0)

уст. 29 34 28

МОХ чув. 27 30 28 53 94,6% (85,1-98,9)

уст. 29 26 28

Примечание: чув. - чувствительный, уст. — устойчивый; метод АК на среде Л-И - метод абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена; а - для оценки ЛЧ к OFX в системе Bactec 960 и методом АК на среде Л-Й использовали критическую концентрацию 2,0 мкг/мл (ВОЗ, 2008; Приказ №109 МЗ РФ, 2003).

При сравнении результатов определения ЛЧ к OFX и МОХ, полученных тремя культуральными методами, наблюдали совпадение в 89,3% и 94,6% случаев, соответственно.

В ходе сравнительного анализа пять штаммов без мутаций в генах-мишенях оказались чувствительными к OFX в тест-системе МусоТВ и Bactec 960 и устойчивыми - методом абсолютных концентраций на среде Л-И. Дополнительное изучение ЛЧ к OFX методом абсолютных концентраций при использовании КК - 3,0 мкг/мл, рекомендуемой A.B. Низовой (2009), обнаружило чувствительность данных штаммов. Можно предположить, что значение КК OFX — 2,0 мкг/мл, установленное много лет назад, в настоящее время является низким для оценки ЛЧ МБТ. В то же время следует обратить внимание, что инактивация и абсорбция антибактериальных препаратов в составе плотных сред является наибольшей. Поэтому вполне возможно, что при свертывании яичной среды Л-Й может снижаться содержание в ней препаратов, вследствие связывания препарата с белком. В исследование также был включен «условно устойчивый» к фторхинолонам штамм МБТ с мутацией в гене gyrB Arg485His, который оказался чувствительным к КК OFX— 3,0 мкг/мл. В результате изучения ЛЧ штамма МБТ с мутацией в гене gyrB Arg485His всеми используемыми в настоящей работе культуральными методами было подтверждено мнение А. Pantel и соавт. (2011) о сохранении чувствительности к фторхинолонам у штаммов МБТ, имеющих данную мутацию.

Проведенное исследование по изучению ЛЧ МБТ разными культуральными методами позволило установить, что для ускоренного выявления устойчивости возбудителя целесообразно применять систему Bactec 960 или тест-систему МусоТВ. Они в отличие от метода абсолютных концентраций, при котором анализ выполняется 21-28 дней, позволяют получить результат быстрее, на 5-14 день от начала инкубации.

ВЫВОДЫ

1. Установлены критические концентрации левофлоксацина - 2,0 мкг/мл, моксифлоксацина и гатифлоксацина - 0,75 мкг/мл для оценки лекарственной чувствительности М. tuberculosis классическим методом абсолютных концентраций на плотной среде Левенштейна-Йенсена.

2. Обоснованы критические концентрации левофлоксацина — 1,0 мкг/мл, моксифлоксацина и гатифлоксацина - 0,25 мкг/мл для ускоренной оценки лекарственной чувствительности М. tuberculosis с помощью высокоэффективной автоматизированной системы Bactec MGIT 960.

3. Определены минимальные ингибирующие концентрации офлоксацина - 4,0 мкг/мл и моксифлоксацина —1,0 мкг/мл, позволяющие выявлять устойчивость М. tuberculosis к данным лекарственным средствам в тест-системе Sensiti-tre МусоТВ.

4. Выявлен высокий уровень корреляции результатов лекарственной чувствительности клинических штаммов М. tuberculosis: к левофлоксацину в 99,0% случаев, моксифлоксацину - 97,1% и гатифлоксацину - 96,1% с помощью установленных значений критических концентраций препаратов для системы Bactec MGIT 960 и метода абсолютных концентраций на среде Левен-штейна-Йенсена.

5. Установлена корреляция лекарственной чувствительности клинических штаммов М. tuberculosis в 89,3% случаев к офлоксацину и в 94,6% - к моксифлоксацину при сравнительном анализе результатов, полученных тремя культуральными методами: в тест-системе Sensititre МусоТВ, автоматизированной системе Bactec MGIT 960 и методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена.

6. Разработанные оценочные критерии для определения лекарственной чувствительности М. tuberculosis к препаратам группы фторхинолонов и выявленная высокая степень корреляции полученных результатов для автоматизированной системы Bactec MGIT 960, тест-системы Sensititre МусоТВ и метода абсолютных концентраций на плотной среде Левенштейна-Йенсена позволяют

рекомендовать для применения любой из этих методов в микобактериологиче-ской лаборатории.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Рекомендуется использовать установленные в работе оценочные критерии для более точного определения лекарственной чувствительности М. tuberculosis к препаратам группы фторхинолонов разными культуральными методами. Установленные критические концентрации левофлоксацина, моксифлок-сацина и гатифлоксацина в системе Bactec MGIT 960 - 1,0; 0,25; 0,25 мкг/мл; для метода абсолютных концентраций на плотной среде Левенштейна-Иенсена - 2,0; 0,75 и 0,75 мкг/мл, соответственно. В тест-системе Sensititre МусоТВ выявленные минимальные ингибирующие концентрации, указывающие на устойчивость М. tuberculosis к этим препаратам, составили для офлоксацина - 4,0 мкг/мл и моксифлоксацина — 1,0 мкг/мл.

Разработанные оценочные критерии для определения лекарственной чувствительности М. tuberculosis к препаратам группы фторхинолонов рекомендуется использовать в клинике для получения лабораторного протокола культу-рального исследования ускоренными методами: в автоматизированной системе Bactec MGIT 960 и тест-системе Sensititre МусоТВ, а также при использовании классического метода абсолютных концентраций на плотной среде Левенштейна-Иенсена.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Исаева, Ю.Д. Ускоренная микробиологическая диагностика туберкулеза с помощью автоматизированной системы BACTEC™MGIT™ 960 / Ю.Д. Исаева, З.П. Абрамова, Г.Е. Фрейман, И.Р. Дорожкова // Медицинский алфавит. Лаборатория 3. - 2009. -№ 11(115).- С. 23-25.

2. Носова, Е.Ю. Молекулярно-генетические исследования во фтизиатрии / Е.Ю. Носова, М.А. Краснова, К.Ю. Галкина, A.A. Букатина, Ю.Д. Исаева // Туберкулез и болезни легких. - 2011. — №6. - С. 28-32.

3. Исаева, Ю.Д. Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis к левофлоксацину с помощью автоматизированной системы Bactec™MGIT™ 960 / Ю.Д. Исаева, A.A. Букатина, Л.Ю. Крылова, Е.Ю. Носова // Сб. материалов (тезисы докладов) XVIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 2011. — С. 268.

4. Исаева, Ю.Д. Определение критических концентраций левофлок-сацина для оценки лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis в жидкой Middlebrook 7Н9 (Bactec™MGIT™ 960) и плотной Левенштейна-Йенсена питательных средах / Ю.Д. Исаева, A.A. Букатина, Л.Ю. Крылова, Е.Ю. Носова, М.В. Макарова, A.M. Мороз // Туберкулез и болезни легких. -2012.-№12.-С. 36-42.

5. Nosova, EY. Analysis of mutations in the gyrA and gyrB genes and their association with the resistance of Mycobacterium tuberculosis to levofloxacin, moxi-floxacin and gatifloxacin / EY Nosova, AA Bukatina, YD Isaeva, MV Makarova, KY Galkina, AM Moroz // Journal of Medical Microbiology. 2013 Jan; 62(Pt 1):108-113.

6. Исаева, Ю.Д. Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам культуральными методами / Ю.Д. Исаева // Сб. тезисов Российской научно-практической конференции молодых ученых с международным участием. — М. - 2013. - С. 32-33.

7. Исаева, Ю.Д. Использование различных культуральных методов для определения лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам / Ю.Д. Исаева, М.В. Макарова, Л.Ю. Крылова, Е.Ю. Носова, A.A. Букатина // Сб. материалов V Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. — М. - 2013. - С. 176-177.

8. Исаева, Ю.Д. Сравнительное изучение определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза с помощью тест-системы Sensititre МусоТВ и других культуральных методов / Ю.Д. Исаева, Л.Ю. Крылова, М.В. Макарова, A.A. Букатина, М.Б. Гикало // Монография «Лабораторные исследования при туберкулезе». Под ред. академика РАМН, проф. В.И. Литвинова и проф. A.M. Мороза. - М.: МНПЦБТ, 2013. - С. 111 - 120.

9. Исаева, Ю.Д. Выявление Mycobacterium tuberculosis с широкой лекарственной устойчивостью / Ю.Д. Исаева, Л.Ю. Крылова, A.A. Букатина, М.В. Макарова, A.M. Мороз // Монография «Лабораторные исследования при туберкулезе». Под ред. академика РАМН, проф. В.И. Литвинова и проф. A.M. Мороза. - М.: МНПЦБТ, 2013. - С. 121 - 141.

10. Isaeva, Y. Determination of critical concentrations of moxifloxacin and gatifloxacin for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in the BACTEC MGIT 960 system / Y. Isaeva, A. Bukatina, L. Krylova, E. Nosova, M. Makarova, A. Moroz // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2013; 68 (10): 2274-2281.

11. Zimenkov DV. Detection of second-line drug resistance in Mycobacterium tuberculosis using oligonucleotide microarrays / DV Zimenkov, OV Antonova, AV Kuz'min, YD Isaeva, LY Krylova, SA Popov, AS Zasedatelev, VM Mikhailo-vich, DA Gryadunov // BMC Infectious Diseases. 2013; 13:240 - Режим доступа : http://www.biomedcentral.com/1471-2334/13/240.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

ВОЗ

ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ

ДИ КК Л-Й ЛЧ МБТ

мик

МЛУ ШЛУ Bactec 960

CDC

CLSI

GTX LVX МОХ МусоТВ M7H9 M7H10 OFX

Всемирная организация здравоохранения

Государственное казенное учреждение здравоохранения города Москвы «Московский городской научно-практический Центр борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы»

Доверительный интервал

Критическая концентрация

Левенштейна-Иенсена плотная питательная среда

Лекарственная чувствительность

Микобактерии туберкулеза

Минимальная ингибирующая концентрация

Множественная лекарственная устойчивость

Широкая лекарственная устойчивость

Автоматизированная система Bactec MGIT 960

Centers for Disease Control and Prevention (Центры no контролю и профилактике заболеваний США)

Clinical and Laboratory Standards Institute (Институт клинических и лабораторных стандартов США)

Гатифлоксацин

Левофлоксацин

Моксифлоксацин

Тест-система Sensititre МусоТВ

Жидкая среда Middlebrook 7Н9

Агаровая среда Middlebrook 7Н10

Офлоксацин

Подписано в печать: 16.10.13 Тираж: 100 экз. Заказ № 982 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспектд.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Исаева, Юлия Дмитриевна, Москва

ДЕПАРТАМЕНТ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ГОРОДА МОСКВЫ

Государственное казенное учреждение здравоохранения города Москвы МОСКОВСКИЙ ГОРОДСКОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ

На правах рукописи

04201363595

ИСАЕВА ЮЛИЯ ДМИТРИЕВНА

03.02.03 - микробиология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Мороз Аркадий Максович

доктор биологических наук Макарова Марина Витальевна

Москва - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................11

1.1. Понятие о лекарственной устойчивости М. tuberculosis................11

1.2. Принципы и методы культурального определения лекарственной чувствительности М.

tuberculosis................................................14

1.3. Определение лекарственной чувствительности М. tuberculosis к препаратам группы фторхинолонов..................... 26

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ......................32

2.1. Бактериальные штаммы..........................................................................................32

2.2. Лекарственные препараты....................................................................................33

2.3. Микробиологические методы..........................................................................33

2.4. Молекулярно-генетические методы..............................................................38

2.5. Статистическая обработка данных..............................................................38

ГЛАВА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КРИТИЧЕСКИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ЛЕВОФЛОКСАЦИНА, МОКСИФЛОКСАЦИНА И ГАТИФЛОК-САЦИНА ДЛЯ ОЦЕНКИ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ М. TUBERCULOSIS В СИСТЕМЕ ВАСТЕС MGIT 960 И МЕТОДОМ АБСОЛЮТНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ НА СРЕДЕ ЛЕ-ВЕНШТЕЙНА-ЙЕНСЕНА................................................... 40

3.1. Формирование стандартной панели клинических штаммов

М tuberculosis.......................................................... ^

3.2. Определение минимальных ингибирующих концентраций изучаемых фторхинолов............................................. ^

3.2. Установление критических концентраций изучаемых

фторхинолонов......................................................... ^

ГЛАВА 4. ТЕСТ-СИСТЕМА SENSITITRE MYCOTB ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ M.TUBERCULOSIS.............................................................................. 57

ГЛАВА 5. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ M.TUBERCULOSIS К ПРЕПАРАТАМ ГРУППЫ ФТОРХИНОЛОНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗ- 66

ЛИЧНЫХ МЕТОДОВ........................................................

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................ 72

ВЫВОДЫ........................................................................ 81

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ................................. 83

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................. 84

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВОЗ Всемирная организация здравоохранения

ГКУЗМНПЦ Государственное казенное учреждение здравоох-

борьбы ранения «Московский городской научно-практический

с туберкулезом Центр борьбы с туберкулезом Департамента здра-

дзм воохранения города Москвы»

ди Доверительный интервал

кк Критическая концентрация

л-й Левенштейна-Йенсена плотная питательная среда

ЛУ Лекарственная устойчивость

лч Лекарственная чувствительность

МВТ Микобактерии туберкулеза

мик Минимальная ингибирующая концентрация

МЛУ Множественная лекарственная устойчивость возбу-

дителя

опц Отрицательная прогностическая ценность

ппц Положительная прогностическая ценность

птп Противотуберкулезные препараты

РЕ Ростовые единицы

ШЛУ Широкая лекарственная устойчивость возбудителя

ГТ ST Clinical and Laboratory Standards Institute (Институт

клинических и лабораторных стандартов США)

Bactec 960 Автоматизированная система Bactec™MGIT™960

GTX Гатифлоксацин

LVX Левофлоксацин

МОХ Моксифлоксацин

МусоТВ Тест-система Sensititre МусоТВ

М7Н9 Жидкая среда Middlebrook 7Н9

М7Н10 Агаровая среда Middlebrook 7Н10

OFX Офлоксацин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Туберкулез представляет постоянную угрозу здоровью людей во всем мире и является причиной высокой смертности у взрослого населения. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в 2011 году зарегистрировано около 8,7 млн. новых случаев этого заболевания и 1,4 млн. - летальных [154].

Повышение эффективности этиотропного лечения больных туберкулезом с МЛУ/ШЛУ возбудителя может быть достигнуто за счет введения в стандартные режимы химиотерапии антибактериальных препаратов, входящих в число резервных лекарственных средств, - фторхинолонов третьего и четвертого поколений. Однако вероятность выздоровления пациентов во многом будет зависеть от своевременно назначенного адекватного лечения, от уровня и скорости формирования устойчивости МБТ к препаратам [5, 94, 101, 102, 108]. В связи с этим необходимо быстро и качественно проводить определение лекарственной чувствительности (ЛЧ) возбудителя.

В последние годы разработаны молекулярно-генетические методы, позволяющие в короткие сроки (до 48 часов) определить лекарственную чувствительность МБТ к фторхинолонам [34, 43, 44]. Необходимо отметить, что результатом молекулярно-генетического анализа являются экспресс-данные о наличии или отсутствии устойчивости возбудителя ко всей группе фторхинолонов в целом. В то же время появились работы, в которых показано, что не все мутации, индуцирующие устойчивость МБТ к фторхинолонам, связаны с перекрестной устойчивостью [124]. Кроме того, все чаще обнаруживают мутации, роль которых в возникновении лекарственной устойчиво-

сти до конца не изучена [130]. Следовательно, для определения лекарственной чувствительности МБТ к препаратам группы фторхинолонов применение только молекулярно-генетических методов не может обеспечить необходимую достоверность результатов. Именно поэтому исключительно высока роль использования микробиологических методов, которые в комплексе с молекулярно-генетическими позволят получить наиболее точные и адекватные результаты для проведения больным своевременного эффективного лечения.

Чтобы определить лекарственную чувствительность возбудителя туберкулеза культуральными методами необходимо знать критическую концентрацию (КК) препарата, с помощью которой возможно разделение мико-бактерий на чувствительные и устойчивые [53, 96, 100]. В настоящее время единых критических концентраций резервных препаратов, в том числе и фторхинолонов не предложено. В этой связи вопрос выбора оценочных критериев для качественного и надежного определения лекарственной чувствительности МБТ к препаратам группы фторхинолонов при использовании культуральных методов приобрел особую актуальность.

Цель работы

Задачи исследования

2. Определение критических концентраций левофлоксацина, моксифлоксацина и гатифлоксацина для оценки лекарственной чувствительности М. tuberculosis в жидкой питательной среде Middlebrook 7Н9 с помо-

щью автоматизированной системы Bactec MGIT 960 и на плотной среде Ле-венштейна-Йенсена методом абсолютных концентраций.

3. Выявление устойчивости М. tuberculosis к офлоксацину и моксифлоксацину в жидкой среде Middlebrook 7Н9 с помощью тест-системы Sensititre МусоТВ.

Научная новизна

Впервые с использованием единой стандартной панели штаммов М tuberculosis установлены критические концентрации наиболее активных препаратов группы фторхинолонов для оценки лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза в жидкой Middlebrook 7Н9 и на плотной Левен-штейна-Йенсена питательных средах.

Впервые установлено значение критической концентрации гатифлок-сацина - 0,25 мкг/мл; обоснованы критические концентрации левофлоксаци-на - 1,0 мкг/мл и моксифлоксацина - 0,25 мкг/мл для оценки лекарственной чувствительности М. tuberculosis в автоматизированной системе Bactec MGIT 960.

Впервые определены значения критических концентраций левофлок-сацина - 2,0 мкг/мл, моксифлоксацина и гатифлоксацина - 0,75 мкг/мл для оценки лекарственной чувствительности М. tuberculosis методом абсолютных концентраций на плотной среде Левенштейна-Йенсена.

Установлены значения минимальных ингибирующих концентраций офлоксацина - 4,0 мкг/мл и моксифлоксацина - 1,0 мкг/мл, указывающие на устойчивость М. tuberculosis к данным препаратам в тест-системе Sensititre МусоТВ (количественный метод).

Впервые проведено сравнительное исследование лекарственной чувствительности клинических штаммов М. tuberculosis к препаратам фторхино-лонового ряда в тест-системе Sensititre МусоТВ, системе Bactec MGIT 960 и

методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена с использованием для анализа результатов установленных оценочных критериев. Выявлен высокий уровень корреляции результатов.

Практическая значимость

С помощью установленных в тест-системе Sensititre МусоТВ минимальных ингибирующих концентраций офлоксацина и моксифлоксацина можно выявить степень относительной устойчивости к ним (низкая или высокая,) М. tuberculosis, что необходимо клиницисту для выбора препарата из группы фторхинолонов, корректировки дозировки и схемы лечения пациента.

Основные положения, выносимые на защиту:

сацина составили 1,0 и 2,0 мкг/мл, соответственно, моксифлоксацина и га-тифлоксацина - 0,25 и 0,75 мкг/мл, соответственно.

2. Установленные в тест-системе Sensititre МусоТВ минимальные ин-гибирующие концентрации офлоксацина - 4,0 мкг/мл и моксифлоксацина -1,0 мкг/мл, указывают на устойчивость М. tuberculosis к этим препаратам.

3. Сравнительное изучение лекарственной чувствительности клинических штаммов М. tuberculosis в системе Bactec MGIT 960 и методом абсолютных концентраций на плотной среде Левенштейна-Иенсена при использовании установленных критических концентраций препаратов выявило высокий процент корреляции полученных результатов: для левофлоксацина в 99,0%, для моксифлоксацина в 97,1% и для гатифлоксацина в 96,1% случаев.

Апробация диссертации и публикации

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ, протокол №1 от 5 марта 2013 года.

Материалы диссертации доложены на:

- научно-практической конференции молодых ученых «Новые технологии в диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей», Москва, 2009;

- научно-практической конференции молодых ученых «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей», Москва, 2011;

- Всероссийской научно-практической конференции «Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом», Санкт-Петербург, 2011;

- X Московской ассамблее «Здоровье столицы», Москва, 2011;

- XI Московской ассамблее «Здоровье столицы», Москва, 2012;

- Российской научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей», Москва, 2013;

- V Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 2013.

Структура и объем диссертации

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Туберкулез является сложной многоуровневой медико-биологической и социальной проблемой, привлекающей к себе внимание многочисленных исследователей [3, 7, 70, 97]. На стыке XX и XXI веков туберкулез приобрел особую актуальность благодаря целому комплексу проблем, обусловивших специфичность развития эпидемического процесса данного заболевания в условиях одновременного разнонаправленного воздействия социально-экономических и медико-биологических факторов, развития медицинской науки в условиях перманентного реформирования системы здравоохранения [4, 57, 61]. Одной из самых значимых проблем во фтизиатрии, во многом определивших развитие эпидемического процесса в последние десятилетия, является все более широкое распространение устойчивости МБТ к противотуберкулезным препаратам (ПТП) [13, 39, 55, 56, 89, 156]. Данный феномен явился объектом изучения для исследователей, которых интересовали медико-биологические аспекты [4, 57, 61], влияние МЛУ МБТ на эффективность лечения больных, а также разработка организационных мероприятий, направленных на нивелирование последствий широкого распространения МЛУ возбудителя [37, 56, 64, 70, 155].

1.1. Понятие о лекарственной устойчивости М. tuberculosis

Лекарственная устойчивость (ЛУ) - это природная или приобретенная способность возбудителя заболевания сохранять жизнедеятельность при воздействии на него лекарственного средства. Она определяется как снижение чувствительности до такой степени, что данный штамм микроорганизмов способен размножаться при воздействии на него препарата в критической или более высокой концентрации. Развитие у микроорганизмов устойчивости к используемым для борьбы с ними препаратам является одним из проявлений фундаментального биологического свойства всех живых организмов — приспособляемости к изменениям условий внешней среды [48, 56].

Развитие ЛУ является неизбежным следствием применения антибактериальных препаратов. Впервые о приобретенной ЛУ МВТ было сообщено в 1940-х годах, вскоре после открытия и использования для лечения туберкулеза стрептомицина [126, 133]. На сегодняшний день развитие ЛУ МБТ в разной степени наблюдается в отношении всех известных ПТП, применяемых в схемах лечения больных туберкулезом [37, 39, 54, 72, 164].

Согласно современной классификации, выделяют два вида ЛУ: первичную и вторичную или приобретенную. Больные, никогда ранее не получавшие ПТП более одного месяца, однако, выделяющие лекарственно-устойчивые штаммы, инфицированы ими изначально, что говорит о генети-чески-детерминированной (первичной) устойчивости микроорганизма. Приобретенная (вторичная) ЛУ к ПТП развивается в результате неадекватной терапии, в случае невыполнения больным врачебных рекомендаций или прерывания лечения [48, 56].

Устойчивость возбудителя к ПТП обусловлена возникновением одной или нескольких хромосомных мутаций в генах МБТ, которые, как правило, происходят под действием неадекватной терапии или монотерапии [48, 72, 164].

В процессе размножения МБТ устойчивость к ПТП может развиваться и спонтанно, без какого-либо влияния этих препара

Информация о работе

Исаева, Юлия Дмитриевна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Критерии оценки лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis к препаратам группы фторхинолонов культуральными методами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы