Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кристаллизация и структурные исследования компонентов бокового "L12-выступа" большой рибосомной субчастицы

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Кристаллизация и структурные исследования компонентов бокового "L12-выступа" большой рибосомной субчастицы"

На правах рукописи

КРАВЧЕНКО ОЛЕСЯ ВАСИЛЬЕВНА

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ И СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ КОМПОНЕНТОВ БОКОВОГО «Ы2-ВЫСТУПА» БОЛЬШОЙ РИБОСОМНОЙ СУБЧАСТИЦЫ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 [.¡АР 2011

Пущино-2011

4840656

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте белка РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Никонов Станислав Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Озолинь Ольга Николаевна

кандидат биологических наук Солонин Александр Сергеевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится «19» мая 2011 года в 14°° часов на заседании совета Д 002.038.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г.Пущино Московской области, ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке ПНЦ РАН

Автореферат разослан «ДЦ> ЦО^алА 201

1 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

'■1

//У^у

Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Во всех исследованных организмах большая рибосомная субчастица содержит функционально важный боковой выступ, называемый в бактериях Ь7/Ы2-выступ, в археях - LI 2-выступ и в эукариотах - Р1/Р2-выступ. Этот боковой выступ вовлечен в образование ГТФазного центра рибосомы и играет важную роль во взаимодействии рибосомы с факторами трансляции и в контроле точности трансляции. Изолированные рибосомные белки L10 и LI2, входящие в состав бактериального выступа, образуют в растворе стабильный комплекс, который через белок L10 связывается с большой рибосомной РНК в районе спирали 42 (нумерация по 23S рРНК Escherichia coli). Белки LIO и L12, входящие в состав L12-BbicTyna архейной рибосомы, похожи на эукариотические белки РО и Р1/Р2 и существенно отличаются от своих бактериальных аналогов. Так, архейный L10 и эукариотический РО существенно длиннее бактериального белка L10. Замечательно, что архейный комплекс L10-L12 и даже эукариотический комплекс Р0-Р1/Р2 могут in vitro замещать комплекс L10-L7/L12 в 50S субчастице рибосомы Е. coli, причем, получившиеся гибридные рибосомы способны связывать архейные и эукариотические факторы элонгации, но теряют способность связывать бактериальные факторы. Пространственная структура данного бокового выступа представляет большой интерес, но до сих пор определение её наталкивается на большие трудности. Структура рибосомной 50S субчастицы из археи Haloarcula marismortui была определена около десяти лет тому назад с разрешением 2.4 Ä, но L12-BbiCTyn в этой модели отсутствовал полностью. Позднее только структура N-концевого домена белка L10 была локализована в этой модели 50S субчастицы на уровне низкого разрешения. Кроме того, остается до сих пор невыясненным вопрос о стехиометрии комплекса белков рибосомного L12-BbicTyna. Ранее бактериальный комплекс L10-L12 описывался как пентамерный. Однако в последнее время появились работы, в которых рассматривается возможность образования гептамерного комплекса в рибосомах термофильных бактерий и архей. Наша работа, направленная на определение структуры компонентов И2-выступа архейных рибосом и на определение стехиометрии бактериальных и архейных комплексов L10-L12, является весьма актуальной и вносит весомый вклад в исследования функционально-важного выступа рибосомы.

Цель работы

Цель данной работы - кристаллизация и исследование структуры РНК-связывающего N-концевого фрагмента белка L10 из Methanococcus jannaschii, а также исследование стехиометрии комплекса L10-L12 из бактерий и архей.

Научная новизна

Впервые получены кристаллы длинного (2/3 от длины целого белка) РНК-связывающего N-концевого фрагмента белка L10 из археи М. jannaschii, и определена пространственная структура

1

этого фрагмента. Оказалось, что исследуемый фрагмент рибосомного белка L10 состоит из двух глобулярных доменов, причем, второй домен является вставкой в первый домен. Второй домен полностью соответствует специфическому участку последовательности, который отсутствует в бактериальном белке, но характерен для архейных и эукариотических белков LIO (РО). Пространственная структура этого домена определена впервые. Встраивание определенной нами структуры двухдоменного фрагмента архейного рибосомного белка LIO (РО) в модель большой субчастицы архейной рибосомы позволяет прояснить структуру основания L12-BbicTyna архейной и эукариотической рибосомы. Более того, встраивание определенной нами структуры в модель бактериальной рибосомы в комплексе с фактором элонгации G показало, что второй домен архейного гомолога белка L10 подходит очень близко к G-домену фактора элонгации и, скорее всего, мешает его взаимодействию с рибосомой. Этот результат наглядно демонстрирует, каким образом специфический домен архейного гомолога белка L10 может мешать взаимодействию бактериальных факторов элонгации с архейными и эукариотическими рибосомами. Таким образом, полученные нами результаты создают базу для понимания структурных основ функционирования L12-BbicTyna в архейных и эукариотических рибосомах. По результатам данной работы была опубликована статья в журнале Journal of Molecular Biology (2010г). Один из рисунков, иллюстрирующих результаты проделанной работы, был выбран для обложки номера Journal of Molecular Biology. Это говорит о признании важности полученных нами результатов.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на*/ О О страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работу иллюстрируют S''рисунков и таблиц. Библиография включаетнаименований.

Апробация работы и публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, 8 тезисов. Одна пространственная структура депонирована в банк белковых структур PDB. Результаты данной работы неоднократно докладывались на российских и международных конференциях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Кристаллизация и структурные исследования N-конневого фрагмента рибосомного белка НО из Methanococcus iannaschii

Ген рибосомного белка L10 был ранее клонирован из гипертермофильной археи М. jannaschii (MjaLlO) в Медицинском Институте г. Инсбрука (Австрия) Щербаковым Д.В. Полученная плазмида была любезно предоставлена нам для наработки, выделения, очистки и кристаллизации рибосомного белка L10. В процессе выделения белкового препарата выяснилось, что в изолированном состоянии белок L10 в растворе подвергается протеолизу, и одна треть

полипептидной цепи разваливается на мелкие фрагменты, которые не обнаруживаются на электрофореграммах (рис 1). В то же время, оставшийся крупный фрагмент белка (две третьих полипептидной цепи) оказался очень стабильным. Данный фрагмент формировал комплекс со специфическим 95нт фрагментом М]а238 рРНК в молярном соотношении 1:1, но не связывал рибосомный белок Ы2.

Рис. 1. Стабильный N-концевой фрагмент рибосомного белка L10 из М. jannaschii. (MjaLlONTF): а) электрофоретический анализ N-концевого фрагмента рибосомного белка MjaLlO (15 % ПААГ в присутствии SDS); б) проверка функциональной активности MjaLlONTF (10% ПААГ, неденатурирующие условия).

Исходя из этих данных, можно было предположить, что нами выделен длинный N-концевой фрагмент белка L10 из М. jannaschii (MjaLlO NTF). Были получены кристаллы данного фрагмента. Кристаллы оказались низкого качества, но это могло быть следствием гетерогенности продукта естественного протеолиза. Поэтому, для наработки и выделения стандартного и гомогенного препарата белка и улучшения качества кристаллов, было принято решение создать экспрессионный вектор, несущий ген N-концевого фрагмента белка L10 из М. jannaschii.

Для установления точного положения фрагмента в аминокислотной последовательности белка была определена последовательность нескольких остатков с его N-конца и методом масс-спектрометрии измерена его молекулярная масса, которая оказалась равной 23.137 кДа. Выяснилось, что препарат протеолитического фрагмента не гомогенен: в нем содержится два варианта белка, отличающихся по аминокислотной последовательности присутствием или отсутствием валина на N-конце (VAPWKI и APWKI). Таким образом, от целого рибосомного белка L10 с N-конца отщепляются либо 8, либо 9 аминокислотных остатков (рис. 2). Исходя из этих данных, можно было определить С-концевой остаток фрагмента белка.

Первым N-концевым аминокислотным остатком фрагмента после метионина мы выбрали аланин (рис. 2). Далее с помощью программы "Gene Runner" были подобраны две аминокислотные последовательности белка, соответствующие молекулярной массе фрагмента (23.137 кДа), которые мы обозначили как MjaLlONTFl (23.190 кДа) и MjaL10NTF2 (23.077 кДа). Эти аминокислотные последовательности отличаются только наличием или отсутствием изолейцина в положении 221 на С-конце.

MjaLlO METKVKAHVA PWKIEEVKTL KGLIKSKPW AIVDMMDVPA PQLQEIRDKI RDKVKLEMSR 60 'II

MjaLlO NTLIIRALKE AAEELNNPKL AELANYVERG AAILVTDMNP FKLYKLLEEN KSPAPVRGGQ 120

MjaLlO IAPCDIKVEK GSTGMPPGPF LGELKSVGIP AAIEKGKIAI KEDKVWKKG EWSPKLAAV 180

i

MjaLlO LDRLGIKPIK VGLNILAVYE DGIIYTPDVL KVDEEKLLAD IQAAYQNAFN LAFNTAYPAK 240

MjaLlO EVLPFLIQKA FINARALSVE TAFVTKETAG DILAKAQAQA LALASKLPDE ALDEDIKAKL 300

MjaLlO SSVEVSAAPA AEEEKEEEKK EEEKKEEDTG AAGLALLF 338

Рис. 2. N-концевая аминокислотная последовательность MjaLlONTF. На первичной структуре MjaLlO показана N-концевая аминокислотная последовательность первого (I) и второго (II) варианта MjaLlONTF. Стрелкой обозначено место разрыва цепи белка L10 с С-конца.

Анализ аминокислотной последовательности показал, что наш фрагмент включает в себя N-концевую часть белка, в которую входит вставка, специфичная для архей и эукариот (рис. 3). Мы предположили, что именно эта вставка может соответствовать структуре, определяющей способность архейного комплекса L10-L12 выбирать между бактериальными и архейными факторами элонгации. Это существенно подогрело наш интерес к определению структуры данного фрагмента.

бактериальный L10

РНК-связывэкнций

N-domain

1.12-свяэывающий

I N-doMM C-domam

архейный L10 (РО)

эукариотический РО

специфическая вставка в белках архей и эукариот

полнораэмерный L10 из М. Jannaschü (338 а.о) N-domtin

рекомбинантный N-концевой фрагмент рибосомного белка L10 из М. jannaschil

N-domi¡n ilueflion N-domiin

Рис. 3. Анализ аминокислотных последовательностей рибосомного белка LIO из бактерий, архей и эукариот: а) схема последовательностей полипептидных цепей рибосомных белков L10 (РО); б) кристаллизуемый фрагмент рибосомного белка MjaLlO.

На основании полученных данных были клонированы фрагменты гена белка М]аЫ0: М]аЬ10ЫТП и М]аЫ(ЖТР2. Для того чтобы получить максимальный выход рекомбинатных белков и избежать возможного встраивания лизина вместо аргинина в аминокислотную последовательность рекомбинатного белка из-за разницы в наборе используемых кодонов между

M. jannaschii и E.coli, наработка N-концевых фрагментов рибосомного белка L10 из М. jannaschii производилась в клетках штамма-суперпродуцента Е. coli BL21(DE3), ^трансформированных плазмидой pUBS520. Данная плазмида кодирует дополнительные тРНК для кодонов AGA и AGG, редко встречающихся в Е. coli. Экспрессию генов индуцировали добавлением ИПТГ. Была разработана схема выделения белков MjaLlONTFl и MjaL10NTF2 из биомассы штамма-суперпродуцелта. Общая схема выделения и очистки представлена на рис. 4.

Поскольку оптимальная температура роста археи М. jannaschii составляет 85-;-880С, то белки из данного организма могут сохранять свою нативную структуру при повышенных температурах. Поэтому из белкового препарата с помощью прогрева и последующего центрифугирования можно удалить большую часть денатурированных термолабильных белков Е. coli. Белковый препарат прогревали при различных температурах (45°С, 50°С, 55°С, 60°С, 65°С, 70°С, 75°С, 80°С) для того, чтобы найти оптимальную температуру прогрева. Для дальнейшей очистки препарата с помощью прогрева была выбрана температура равная 75°С.

Далее для очистки белка применяли методы колоночной хроматографии, подбор которых определялся данными об аминокислотном составе, изоэлектрической точке и молекулярной массе белка. Учитывая большое содержание гидрофобных групп в аминокислотной последовательности MjaLlONTF (86/213 а.о.), в качестве первого этапа хроматографической очистки была выбрана гидрофобная хроматография на колонке с носителем Butyl-Sepharose. Кроме того, как правило, выделение белка из штамма-суперпродуцента осложняется его неспецифическим взаимодействием с нуклеиновыми кислотами в клеточном экстракте. В растворах с высокой ионной силой возможно разрушение таких ассоциатов. Использование гидрофобной хроматографии позволяет связать белок с носителем при высоких концентрациях солей. После гидрофобной хроматографии на колонке с носителем Butyl-Sepharose в качестве второго этапа хроматографической очистки была выбрана хроматография на колонке с аффинным сорбентом Heparine-Sepharose, который избирательно связывает РНК-связывающие белки. Фракции, содержащие белок MjaLlONTFl, были проанализированы на спектрофотометре. Анализ показал незначительное поглощение при длине волны 260 нм и отношение А28о/А2бо=1.8, что свидетельствует об отсутствии в белковом препарате примесей РНК. Для окончательного освобождения от примесных белков и возможных агрегатов использовали гель-фильтрацию на колонке с носителем Superdex G75. После заключительного этапа хроматографической очистки были получены препараты MjaLlONTFl и MjaL10NTF2 с чистотой, пригодной для кристаллизации. Итоговая чистота препаратов представлена на рис. 4.

Для кристаллизации белков MjaLlONTFl и MjaL10NTF2 использовали метод диффузии паров в висящей капле. Для начала белковые препараты были раскапаны в условиях, в которых уже появлялись кристаллы полученного в результате естественного протеолиза N-концевого

фрагмента белка LIO, отражающие рентгеновские лучи только в зоне низкого разрешения. Однако, в этих условиях получить кристаллы белков MjaLlONTFl и MjaL10NTF2 не удалось.

MjaLIO MjaL10 (NTF1 (NTF2

Прогрев белкового препарата при 75°С

Осаждение термолабильных белков низкоскоростным центрифугированием

с носителями butyl-sepharose, heparine-sepharose, superdex G75

Рис. 4. Схема выделения и итоговая чистота препаратов MjaLlONTFl и MjaLiONTF2 (15% ПААГ в присутствии ДСН).

Чтобы стимулировать появление кристаллов, мы пробовали варьировать концентрацию белка и осадителя и использовать различные добавки. Только при добавлении в капли с препаратами фрагментов MjaLlONTFl или MjaL10NTF2 цетилтриметиламмоний бромида (СТАВ), использующегося для предотвращения агрегации белков, появились мелкие игольчатые кристаллы. Поэтому к препаратам MjaLlONTFl и MjaL10NTF2 был добавлен СТАВ до концентрации 1 мМ и продолжен поиск новых условий кристаллизации, используя коммерческий набор растворов для кристаллизации (Molecular Dimensios Limited Clear Strategy Screen 1 Conditions). Через несколько дней в одной из капель появились маленькие кристаллы белка MjaLlONTFl. Далее в тех же самых условиях нам удалось получить уже одиночные крупные кристаллы белка MjaLlONTFl (рис. 5а).

Выделение и кристаллизация селеномет ионинового производного белка MjaLlONTFl

В аминокислотной последовательности MjaLlONTFl присутствуют 6 метионинов, что достаточно для того, чтобы при замене их на селенометионины получить хороший аномальный сигнал на рентгенограмме, и решить структуру с помощью метода многоволнового аномального рассеяния. Для этого использовали ауксотрофный по метионину штамм Е. coli B834(DE3)/pUBS520, который трансформировали плазмидой рЕТПс, содержащей ген фрагмента MjaLlONTFl. Клетки выращивали на минимальной среде, в которой метионин был заменен на селенометионин.

Выделение и хроматографическая очистка селенометионинового производного N-концевого фрагмента белка L10 осуществлялись по разработанной ранее методике для немодифицированного белка. К полученному белковому препарату добавили СТАВ до конечной концентрации 1 мМ и приступили к кристаллизации в условиях, найденных для немодифицированного белка. Через 1-1.5 недели были получены крупные одиночные кристаллы данного белка (рис. 56).

Рис. 5 Кристаллы N-концевого фрагмента белка MjaLlO (а) и его селенометионинового варианта (б).

Пространственная структура MjaLlONTF

На синхротроне MAX II (г. Лунд, Швеция) были собраны наборы дифракционных данных от кристаллов немодифицированного N-концевого фрагмента белка MjaLlO, а также от кристаллов его селенометионинового производного. Обработка экспериментальных данных проводилась в программе XDS. Характеристика наборов дифракционных данных представлена в таблице 1. В асимметричной части ячейки кристалла содержится две молекулы белка.

Пространственная структура MjaLlONTF была решена методом многоволнового аномального рассеивания с использованием программного комплекса Phénix и уточнена до значений R-фактора = 18% и Яг„е-фактора = 23% в программе Refmac относительно набора данных, собранных от кристаллов немодифицированного белка, с разрешением 1.6Â. Статистика уточнения представлена в таблице 1. Полученная модель удовлетворяет всем стереохимическим и рентгеноструктурным критериям. Атомные координаты модели депонированы в банк белковых структур. Ей был присвоен код PDB ID 3JSY.

MjaLlONTF содержит 212 (10-221) аминокислотных остатков и состоит из двух доменов. Общая укладка полипептидной цепи, а также распределение элементов вторичной структуры по аминокислотной последовательности представлены на рис. 6. N- и С-концы данного фрагмента белка расположены в первом домене. Первый домен включает аминокислотные остатки 10-111 и 192-221. Таким образом, мы можем заключить, что второй домен (115-188) является вставкой в

первый. Два домена соединяются шарнирным участком, который состоит из двух противоположно направленных р-тяжей (Р4 и Р10).

Таблица 1. Статистика обработки дифракционных данных и уточнения структуры фрагмента М]аЫ0ШТ1.

Статистика обработки дифракционных данных

native data SeMet

Длина волны (Â) 0.90778 0.97911 (peak) 0.97924 (edge) 0.96862 (remote)

Пространственная группа Р2,2,2,

Параметры ячейки

а (А) 57.00 56. 91 56.75 56.46

Ь(А) 70.08 69.09 69.24 68.98

с (А) 97.96 98.46 98.12 97.63

Зона разрешения, А 20.00-1.60 (1.70-1.60) 25.00-2.12 (2.18-2.12) 25.00-3.12 (3.20-3.12) 25.00-3.70 (3.80-3.70)

Общее количество рефлексов 230884 (34853) 102898 (6727) 27211 (2197) 17645 (1069)

Число уникальных рефлексов 50801 (7327) 40450 (2710) 10130 (843) 6460 (440)

полнота, % 92.5 (85.0) 95.1 (85.5) 76.2 (84.6) 82,2 (77.3)

избыточность 4.7 (4.7) 2.5 (2.4) 2.7 (2.6) 2,7 (2.4)

I/o 21.6(4.5) 10.1 (3.6) 15.5(4.3) 15.4 (5.5)

5.6 (38.0) 10.9 (37.7) 8.3 (34.7) 7.8 (21.5)

Статистика уточнения

диапазон разрешения (А) 15.00-1.60(1.64-1.60)

Количество уникальных рефлексов 49365

R-фактор (%) 18.2 (22.5)

К^. -фактор (%) 23.3 (30.9)

Среднеквадратичное отклонение от стандартных значений длина связей (А) 0.003

величина углов (°) 0.929

Средний температурный фактор атомов модели (А2) 29.39

PDB ГО 3JSY

а3начения в скобках указаны для зоны высокого разрешения

Первый домен [УЦаЫОШТ содержит пяти-тяжевой антипараллельный р-лист, с двух сторон от которого расположено по три а-спирали (а1-31-а2-Р2-аЗ-а4-РЗ-а5-Р11-Р12-а8). Второй домен состоит из трех-тяжевого (Р6-Р7-Р8) и двух-тяжевого (р5 и р9) антипараллельных р-листов, расположенных под прямым углом друг относительно друга. Две а-спирали расположены между ними. Схема соединения элементов вторичной структуры для второго домена - р5-рб-а6-р7-р8-р9-а7. Плотные контакты между первым и вторым доменом отсутствуют. Кроме того, домены могут двигаться друг относительно друга, вращаясь вокруг линии, соединяющей С„-атомы А114 и 1189, расположенные в районе перетяжки между двумя доменами. Две молекулы в асимметричной части ячейки как раз демонстрируют это движение (рис. 7).

Tma MLTRQQKELIVK EMSEIFKKTS LILFADFLGF TVADLTELRS RLREKYGDGA RFRWKNTLL

Hma KTETIPEWKQEEVD AIVEMIESYE SVGWNIAGI PSRQLQDMRR DLHG----TA ELRVSRNTLL

Mja MAPWKIEEVK TLKGLIKSKP WAIVDMMDV PAPQLQEIRD KIRD----KV KLRMSRNTLI 64

nl pl e2 P2 o3

Tma NLALKNAE-------YEGYE EFLKGPTAVL YVTEGDPVEA VKIIYNFYKD К---------

Hma ERALDDVDD-----GLEDLN GYITGQVGLI GTD-DNPFSL FQELEASKTP APIGAGEVAP

Mja IR LKEAAEE LNNPKLAELA NYVERGAAIL VTD-MNPFKL YKLLEENKSP APVRGGQIAP 123

P3 o5 ß5

Tma ------------------------------------------------------------

Hma NDIVIPEGDT GVDPGPFVGE LQSVGADARI QEGSIQVLSD STVLDTGEEV SQELSNVLNE

Mja CDIKVEKGST GMPPGPFLGE LKSVGIPAAI EKGKXAIKED KWVKKGEW SPKLAAVLDR 183

P« P' pe P9 S1-

Tma -----KADLS RLKGGFLE К KFTAEEVENI AKLPS

Hma LGIEPKEVGL DLRAVFADGV LFEPEELELD IDEYRSDI

Mja lgikpikvgl NILAVYEDGI IYTPDVLKVD EEKLLADI 221

рю Pll ßl2 a8

Рис. 6. Общая структура MjaLlONTF: а) стерео изображение ленточной модели MjaLIONTF; a-спирали и ß-тяжи пронумерованы; б) выравнивание аминокислотной последовательнотей MjaLIONTF (Mja), N-концевого фрагмента LIO из Т. maritima (Tma), и N-концевого домена L10 из Н. marismortui (Hma). Элементы вторичной структуры MjaLIONTF представлены графически: a-спирали показаны в виде прямоугольников, ß-тяжи - в виде стрелок. Аминокислотные остатки, принадлежащие первому домену, заключены в серую рамку. На рисунке используется нумерация MjaLiO.

Среднеквадратичное отклонение в положениях С„-атомов при наложении этих двух молекул друг на друга составило 2,775Ä, 1,114Á и 0.393Á в целом MjaLIONTF, его первом домене и его втором домене, соответственно. Наложение первых доменов этих молекул демонстрирует смещение вершин второго домена (155 а.о.) на 12, 83Á.

MjaLIONTF molecufe I MjaLIONTF molecule 2

Рис. 7. Наложение двух молекул белка MjaLIONTF, находящихся в асимметричной части элементарной ячейки, по первому домену. Черным цветом обозначена одна молекула, серым - другая.

Сравнение структуры первого домена MjaLIONTF со структурами РНК-связывающих доменов в НО из Thermotosa maritima ("Г mu LIO) и LID из Н. marismortui (HimiLIO)

а)

б)

в)

Рис. 8. Сравнение пространственных структур РНК-связывающих доменов рибосомного белка LIO (а) из бактерии Т. maritima, (б) из археи Н. marismortui и (в) из археи М. jannaschii.

Общая укладка полипептидной цепи первого домена MjaLIONTF подобна общей укладке РНК-связывающего домена бактериального белка TmaLlO, структура которого была определена в комплексе с тремя димерами N-концевых фрагментов белка L7/L12 (рис. 8а). N- и С-концы обоих молекул занимают близкие положения. Однако, наложение данных доменов по ß-листам демонстрирует существенный сдвиг а-спиралей и петель в этих молекулах. Важно отметить, что второй домен MjaLIONTF (вставка в N-домен) отсутствует в бактериях. Основываясь на

выравнивании аминокислотных последовательностей белка L10 из различных организмов (рис. 3, 6), мы можем предположить, что второй домен присутствует только в археях и эукариотах. Структура первого домена MjaLIONTF близка к структуре РНК-связывающего домена L10NTD, определенной в составе 50S субчастицы из Н. marismortui (r.m.s.d.= 1,856Á для 81 а.о.). Однако структура второго домена HmaLlO не была определена (рис. 86). Кроме того, авторами была допущена ошибка при проведении полипептидной цепи HmaLlONTD: вместо аминокислотной последовательности, соответствующей С-концу первого домена (192-212 а.о.), они вставили последовательность, соответствующую междоменной шарнирной части и N-концевой части второго домена. Авторы, просто, не заметили, что эта специфическая последовательность, соответствует второму домену в архейном белке L10, который является вставкой в первый домен.

Сравнение структуры MiaLlOIVTF со структурой рибосомного белка РО из Pyrococcus horikoshii в комплексе N-кониевыми доменами белка L12

Одновременно с нами структурой архейного белка L10 занималась японская группа. Они смогли закристаллизовать этот белок из архебактерии Р. horikoshii в комплексе с N-концевыми димерами белка Р1 (аналога белка L12). Японской группой еще раз было показано, что структуры РНК-связывающего домена бактериального L10 и его архейного гомолога очень близки, однако, им не удалось определить структуру второго домена этого архейного белка, и они решили, что он неупорядочен. На самом деле, этот участок является вполне упорядоченным, но довольно подвижным, что и послужило причиной неудачи с определением его структуры.

Рис. 9. Сравнение пространственных структур белка LIO (РО) из Р.horikoshii и из MJannaschii: а) пространственная структура РО из Р. horikoshii в комплексе N-концевыми доменами белка L12; б) наложение структуры MjaL 10NTF на структуру белка L10 (РО) из Р. horikoshii в комплексе N-концевыми доменами белка L12.

а)

б)

На рисунке 96 показано наложение структуры MjaLlONTF на структуру белка LIO (РО) из Р. horíkoshii в комплексе N-концевыми доменами белка L12 по РНК-связывающему домену.

Встраивание структуры MjaLlONTF в модели архейной и бактериальной рибосомы

Благодаря тому, что самая последняя модель архейной 50S субчастицы содержит L10NTD, мы смогли встроить в эту модель обе молекулы MjaLlONTF, локализованные в асимметричной части элементарной ячейки (рис. 10).

¿V- '.. 5S rRNA

а)

domainll

Рис. 10. Встраивание структуры MjaLlONTF в модель архейной 50S рибосомной субчастицы Н. marismortui\d) наложение модели MjaLlONTF на модель Нша 50S рибосомной субчастицы. 23S рРНК и 5S rRNA показаны как серая и розовая поверхности, соответственно. Рибосомные белки Hma 50S субчастицы показаны коричневым цветом, тогда как MjaLlONTF - голубым; б) стерео изображение фрагмента 50S рибосомной субчастицы Н. marismortui, содержащего MjaLlONTF и белки L6 и Lll. Hma23S рРНК показана в сером цвете, белки HmaL6 nHmaLll в коричневом цвете, HmaLlONTD - в лиловом, одна из двух молекул MjaLlONTF (расположенных в асимметрической части элементарной ячейки кристалла) - в желтом, а вторая копия - в цвете морской волны. N- и С-концы MjaLlONTF и домены I и II MjaLlONTF подписаны. Возможное направление движения домена 11 указано стрелкой.

Моделирование показало, что MjaLlONTF, вероятно, может взаимодействовать с 23S рРНК

посредством обоих доменов. Хвост N-концевой a-спирали MjaLlONTF располагается вдоль

12

малого желобка спирали 42 23S рРНК. MjaLlONTF взаимодействует с 23S рРНК посредством N-конца спирали al и петель pl-a2, Р2-аЗ, а4-|33. MjaLlONTF и рибосомный белок L11 связывают 23SpPHK в непосредственной близости друг от друга. Первый домен MjaLlONTF и С-концевой домен белка Ll 1 контактируют друг с другом. Второй домен MjaLlONTF расположен на внешней стороне тела рибосомы между С-концевым доменом белка L6, N-концевым доменом белка Ll 1 и районом Н42-Н44 23S рРНК. Структурные различия двух молекул MjaLlONTF, расположенных в асимметрической части кристалла, указывают на возможное направление движения домена II в рибосоме. Рисунок 106 показывает, что этот домен может двигаться по линии, соединяющей центры рибосомных белков L6 и Ll 1, и мог бы образовывать водородные связи с нуклеотидами спирали 44 23S рРНК. Поверхность домена II, особенно его верхушка с плоским гидрофобным пятном и участком р-листа, доступна для взаимодействия с другими компонентами системы трансляции, возможно, с трансляционными факторами. Это позволяет предположить, что данный домен может быть вовлечен в связывание архейных или эукариотических факторов элонгации. Японская группа получила делегированный мутант архейного белка Р0 (гомолога L10) без вставки, соответствующей домену И. Они вставили такой белок в гибридную рибосому и показали, что отсутствие данного участка в архейном белке Р0 (L10) отрицательно влияет на связывание фактора элонгации 2 и на эффективность ГТФазной реакции. Мы предположили также, что данный участок белка Р0 (L10) может оказывать противодействие связыванию бактериальных факторов элонгации к гибридной рибосоме. Чтобы проверить это предположение, нами было проведено встраивание структуры MjaLlONTF в модель комплекса бактериальной рибосомы с фактором элонгации G (рис. 11).

Рис. 11. Встраивание модели MjaLlONTF в модель комплекса бактериальной 70S рибосомы с фактором элонгации G (EF-G). 23S рРНК показана в виде поверхности серого цвета. L12-выступ, EF-G и белок Ll 1 показаны как светло-сиреневые, красные и голубые тяжи, соответственно. MjaLlONTF в цвете морской волны. Домены I и II MjaL 10NTF подписаны.

Как уже упоминалось, гибридные рибосомы Е. coli, в которых комплекс белков L10-L7/L12 заменен на соответствующие архейные белки перестают взаимодействовать с бактериальными факторами. Важно отметить, что в гибридной рибосоме не только белки L10-L7/L12, но и белок LI 1 был заменен на его архейный гомолог. Здесь мы можем видеть причину такой замены.

Из рисунка 11 видно, что домен II MjaLlONTF действительно может мешать связыванию EF-G, т.к. подходит очень близко к домену V (638-640 а.о) и G-домену (155-156) этого фактора, расположенного на рибосоме. Более того, оказалось, что второй домен MjaLlONTF пересекается с бактериальным белком L11, их совместное размещение в районе рибосомного L12-BbiCTyna стерически невозможно. В архейной рибосоме эти два белка не пересекаются. Это объясняет, почему для конструирования гибридной рибосомы приходится заменять на архейные гомологи не только комплекс белков L10-L12, но и белок L11, а также, почему такая гибридная рибосома становится доступной для эукариотических и архейных факторов элонгации, но не для их прокариотических аналогов.

Исследование стехиометрии архейного комплекса L10-L12 (Р0-Р1)

Нами были проведены эксперименты по установлению стехиометрии белков в комплексе L10-L12 (Р0-Р1) из архей рода Methanococcus.

Молекулярные массы изолированных белков LIO (Р0) и L12 (Р1) отличаются почти в четыре раза (Mr(MjaL10)=37.3Kfla, Мг(М1:Ш0)=36.5кДа, Mr(L 12)= 10.ЗкДа). Если предположить, что данные белки формируют комплексы в соотношении 1:4, то при электрофорезе этих комплексов в присутствии SDS мы должны наблюдать на электрофореграмме равные по интенсивности полосы для белков LIO (Р0) и L12 (Р1). Это мы визуально и наблюдаем для обоих комплексов (рис. 12а). Данная электрофореграмма была обработана в программе OptiQuant, которая подтвердила, что интенсивности пятен для белков L10(P0) и L12(P1) практически совпадают.

1 2

а)

L10

L12

б)

1.40Е+00 1.20Е+00 1.00Е+00 8.00Е-01 6.00Е-01 4,OOE-Ol 2.00Е-01 0.00Е+00 ••—

76 кДа

100000 200000 300000 400000

Молекулярная масса (М), Да

Рис. 12. Исследование стехиометрии архейного комплекса Ы0-Ы2(Р0-Р1): а) электрофоретический анализ (15% ПААГ, 8Э8) состава комплексов М]аЫ0-М1ЫЛ2 (1) и МЛЫ0-М1ЬЫ2 (2); б) определение молекулярной массы комплекса Ы0-Ы2 из М. ¡ЬегтоШИо{горЫст методом равновесного ультрацентрифугирования.

Для определения молекулярной массы комплекса L10-L12 из М. thermolithotrophicus был использован метод аналитического ультрацентрифугирования. По данным этого метода молекулярная масса данного комплекса составила около 76 кДа, что соответствует молекулярной массе комплекса, которая может получиться при молярном соотношении белков 1 к 4, то есть пентамерному комплексу (рис. 126).

Электрофорез в неденатурирующих условиях показал, что при смешивании индивидуальных рибосомных белков MjaLIO (или MthLlO) с MthLI2 при молярном соотношении 1:4 и 1:6 формируется гомогенный комплекс L10-L12 (Рис.13). Однако, при смешивании белков L10 и L12 в соотношении 1:4 на электрофореграмме видна только полоса комплекса (рис. LЗгХ тогда как в образцах, полученных при смешивании препаратов индивидуальных белков в молярном соотношении 1:6, помимо комплекса L10-L12, присутствует свободный рибосомпый белок L12 (рис. 13з). Исходя из этих данных, можно заключить, что изолированные архейные рибосомные белки L10 и L12 образуют в растворе пентамерный комплекс.

1 2 3 4 5

Рис. 13. Анализ комплекса L10-L12 методом электрофореза в неденатурирующих условиях (10% ПААГ (19:1), ТВ буфер рН=7.5, ЮтМ MgCl2). 1 - MthL12; 2 — гибридный комплекс MjaL10-MthLI2 в молярном соотношении 1:4; 3 - MjaL10-MthL12 в молярном соотношении 1:6; 4 - гомологический комплекс MthL10-MthL12 в молярном соотношении 1:4; 5-MthL10-MthL12 в молярном соотношении 1:6.

Таким образом, все использованные нами методы по определению стехиометрии архейного комплекса L10-L12 дали одинаковый результат: соотношение белков L10 и L12 равно 1:4, что свидетельствует в пользу формирования в растворе их пентамерного комплекса.

Исследования по формированию комплекса между изолированными рибосомными белками РО (L10) и PI (L12) in vitro проводились также в Японии, но только для белков из рибосом термофильной археи P. horikoshii. Рибосомный белок РО (L10) они смешивали с рибосомным белком PI (LI2) в молярном соотношении 1:6 и исследовали полученный препарат методом электрофореза в неденатурирующих условиях. Электрофоретический анализ показал, что при смешивании изолированных белков РО и Р1 в молярном соотношении 1:6 образуется комплекс POPI, а также остается свободный белок Р1. Данный результат согласуется с нашим результатом,

полученным для комплексов L10-L12 из архей рода Methanococcus, и может свидетельствовать в пользу формирования пентамерного комплекса Р0-Р1 из P. horikoshii. Однако в своей работе японская группа не делает каких-либо выводов о стехиометрии комплекса Р0-Р1 из археи Р. horikoshii. Позже методом масс-спектрометрии ими было проведено исследование стехиометрии комплекса Р0-Р1 из археи P. horikoshii, полученного путем смешивания индивидуальных рибосомных белков РО и Pl. Молекулярная масса данного комплекса составила 106 кДа, что соответствует образованию гептамерного комплекса. Были проведены также исследования функциональной роли трех димеров белка Р1 в архейном Р1-выступе. Эти исследования показали, что гибридные рибосомы Е. coli, несущие архейный белок РО с делецией 79 аминокислотных остатков с С-конца (т. е. способен связывать только 2 димера белка Р1), показывают высокую ГТФазную и полифенилаланил-синтетазную активность. Она составляет 90-95% от активности рибосом, несущих полноразмерный белок РО (связывает 3 димера белка Р1). Таким образом, доступность пентамерного и гептамерного комплексов Р0-Р1 для факторов трансляции является сравнимой. Предполагается, что третий димер белка Р1 в археях не играет существенной функциональной роли (по крайней мере, при температуре 37°С). Возможно, присутствие третьего димера важно при температуре близкой к оптимальной температуре роста P. horikoshii (95°С).

Интересно отметить, что при исследовании группой Кэрол Робинсон стехиометрии комплекса Р0-Р1 из архей in situ на рибосомах методом масс-спектрометрии было обнаружено сосуществование двух совокупностей рибосом в мезофильных археях, содержащих гептамерный и пентамерный комплекс Р0-Р1. Показано, что отношение количества рибосом с пентамерным комплексом к количеству рибосом с гептамерным комплексом изменяется в процессе роста клеток. На начальной стадии клеточного роста доминируют рибосомы с пентамерным комплексом Р0-Р1, тогда как количество рибосом с гептамерным комплексом увеличивается со временем.

Исследование стехиометрии бактериального комплекса L10-LI2

Нами также были проведены исследования стехиометрии комплекса L10-L12 из термофильной бактерии В. stearothermophiliis (Bst). Эти исследования представляют интерес, поскольку в аминокислотной последовательности С-концевой части белка L10 присутствует вставка, состоящая из 8 аминокислотных остатков, с которой, как предполагают, в рибосомах термофильных бактерий взаимодействует третий димер белка L12.

Очищенные рибосомные белки BstLIO и Bst L12 были смешаны в молярном соотношении 1:4, 1:6 и 1:18 и пропущены через гель-фильтрационную колонку Superdex-200 10/30, уравновешенную буфером 100 шМ Tris-HCl (рН 8.0), 250 mM NaCl, ImM DTT (рис 14). Данная колонка позволяет разделять белковые препараты по размеру.

Рис. 14. Гель-фильтрация для бактериального комплекса L10-L12. Фиолетовая линия - свободный белок BstL12, желтая линия - свободный белок BstLIO, зеленая линия - BstL10-BstL12 в молярном соотношении 1:4, красная линия — BstL10-BstL12 в молярном соотношении 1:6, синяя линия - BstL10-BstL12 в молярном соотношении 1:18.

При смешивании индивидуальных рибосомных белков BstLIO с BstL12 в молярном соотношении 1:4 на хроматограмме наблюдается только один пик, соответствующий комплексу BstL10-BstL12 (зеленая линия). В то же время, при смешивании данных белков в молярном соотношении 1:6 на хроматограмме присутствуют два пика, соответствующие комплексу BstLlO-BstL12 и свободному белку L12 (красная линия). Важно отметить, что при смешивании индивидуальных белков BstLIO и BstL12 в молярном соотношении 1:18 образуется комплекс BstL10-BstL12 такого же молекулярного веса, что и комплекс, образованный при смешивании данных белков в молярном соотношении 1:4 и 1:6. То есть добавление заведомо избыточного количества рибосомного белка L12 к белку L10 не приводит к изменению стехиометрии комплекса. Таким образом, можно сделать вывод, что в растворе комплекс L10-L12 из термофильной бактерии В. stearothermophilus является пентамерным, несмотря на наличие дополнительной аминокислотной последовательности в С-концевой части белка L10. Стоит отметить, что исследования стехиометрии бактериальных комплексов L10-L12 in situ на рибосомах методом масс-спектрометрии в лаборатории Кэрол Робинсон также показали, что комплекс L10-L12 в рибосомах В. stearothermophilus является пентамерным, несмотря на то, что это термофильная бактерия (оптимальная температура роста 55СС), что согласуется с нашим результатом. Однако масс-спектрометрические исследования комплексов L10-L12 в рибосомах из бактерий с более высокой оптимальной температурой роста показали присутствие исключительно гептамерного комплекса. Предполагают, что гептамерный комплекс присутствует на рибосомах только тех термофильных бактерий, оптимальная температура роста которых выше 55°С.

Таким образом, полученные нами результаты позволяют сделать вывод, что наиболее стабильная форма комплекса данных рибосомных белков из В. stearothermophilus и термофильных архей рода Methanococcus - пентамер. Гептамерные комплексы этих рибосомных белков из термофильных бактерий и архей, вероятно менее стабильны, но могут существовать на рибосоме (по данным масс-спектрометрии).

Основные результаты и выводы

1. Клонирован и экспрессирован N-концевой РНК-связывающий фрагмент гена белка L10 из Methanococcus jannaschii (MjaLlONTF), разработана методика получения белка в препаративном количестве с чистотой, пригодной для кристаллизации.

2. Получены кристаллы немодицированного N-концевого фрагмента белка MjaLlO и его селенометионинового производного.

3. Определена пространственная структура MjaLlONTF с разрешением 1.6 Â. Исследуемый фрагмент рибосомного белка L10 состоит из двух глобулярных доменов, причем, второй домен, структура которого была определена впервые, является вставкой в первый. Показано, что второй домен полностью соответствует специфическому участку аминокислотной последовательности, который отсутствует в бактериальном белке, но характерен для архейных и эукариотических белков L10 (PO).

4. Полученная модель N-концевого фрагмента белка L10 (PO) встроена в модель большой субчастицы архейной рибосомы, что позволило прояснить структуру основания PI-выступа архейной и эукариотической рибосом.

5. Показано, каким образом специфический второй домен архейного белка L10 (PO) может мешать взаимодействию бактериальных факторов элонгации с архейными и эукариотическими рибосомами.

6. Исследована стехиометрия комплекса L10-L12 (Р0-Р1) из гипертермофильных архей рода Methanococcus и термофильной бактерии В. stearothermophilus. Показано, что в растворе данный комплекс является пентамерным.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1) Kravchenko, О., Mitroshin, I., Nikonov, S., Piendl, W., Garber, M. (2010) Structure of a two-domain N-terminal fragment of ribosomal protein L10 from Methanococcus jannaschii reveals a specific piece of the archaeal ribosomal stalk. J.MoLBiol., 399(2),214-220.

2) Kravchenko. O.V. Kislitsin. Yu.A, Popov. A.N, Nikonov. S.V, Kuranova. I.P (2008) Three-dimensional structures of L-asparaginase from Erwinia carotovora complexed with aspartate and glutamate. Acta Cryst., D64, 248-256.

3) Кислицын, Ю.А., Кравченко. O.B.. Никонов C.B., Куранова И.П. (2006) Пространственная структура L-аспарагиназы Erwinia carotovora. Кристаллография, 51(5), 863-869.

4) Kravchenko. P.. Mitroshin, 1., Nikulin, A.D., Piendl, W., Garber, M., Nikonov, S. (2010) N-terminal fragment of ribosomal protein L10 from Methanococcus jannaschii. PDB ID 3JSY.

5) Кравченко О.. Суховей H., Донцова M. Никонова Е., Никонов С., Щербаков Д., Пиндл В. Гарбер М.Б. Выделение и кристаллизация компонентов бокового L12-BbiCTyna большой

рибосомной субчастицы из архей рода Methanococcus. IV Съезд российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11-15 мая 2008г. Тезисы, с. 82.

6) Кравченко О.В., Суховей Н.Л., Митрошин И.В., Донцова М.В., Никонова Е.Ю., Никонов C.B., Щербаков Д.В., Пиндл В., Гарбер М.Б. Выделение и кристаллизация компонентов L12-выступа 50S субчастицы архейной рибосомы. 12-я международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 10-14 ноября 2008 г. Тезисы, с. 36.

7) Кравченко О.В.. Митрошин И.В., Никулин А.Д., Никонов C.B., Щербаков Д.В., Пиндл В., Гарбер М.Б. L10-L12 боковой выступ архейной рибосомы: кристаллизация и структурные исследования РНК-связывающего N-концевого фрагмента белка L10. 13-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 28 сентября-2 октября 2008 г. Тезисы, с. 26.

8) Кравченко О., Митрошин И., Лазопуло А., Лазопуло С., Никулин А., Пиндл В., Гарбер М., Никонов С. Пространственная структура РНК-связывающего N-концевого фрагмента белка L10 из Methanococcus jannaschii. VII Национальная конференция рентгеновское, синхротронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов нано-био-инфо-когнитивные технологии. Москва, 16-21 ноября 2009 г.Тезисы, с.35.

9) Кравченко О.В., Митрошин И.В., Никулин А.Д., Пиндл В., Гарбер М.Б., Никонов C.B. РНК-связывающий N-концевой фрагмент белка L10 из Methanococcus jannaschii. XXII зимняя молодежная научная школа. "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии, Москва, 8-11 февраля 2010 г. Тезисы, с. 5.

10) Митрошин И.В., Кравченко О.В., Щербаков Д.В., Пиндл В., Никонов C.B., Гарбер М.Б. Получение и кристаллизация комплекса N-концевого фрагмента белка L10 со специфическим фрагментом 23S рРНК. 14-я международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2010 г. Тезисы, том 2, с. 158.

11) О.В. Кравченко, И.В. Митрошин, В. Пиндл, C.B. Никонов, М.Б. Гарбер. Кристаллографическая модель двухдоменного N-концевого фрагмента архейного рибосомного белка PO(LIO) позволяет прояснить структуру основания «Р1-выступа» большой субчастицы архейной рибосомы. Ежегодная научная конференция Института белка РАН, 8-9 июня 2010г., Тезисы, с. 10.

12) Митрошин И.В., Кравченко О.В., Пиндл В., Никонов C.B., Гарбер М.Б. Боковой L12-выступ архейной рибосомы: кристаллизация комплекса N-концевого фрагмента белка L10 со специфическим фрагментом 23 S рРНК. III Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010», Нижний Новгород 2010г. Тезисы,

С.102.

Заказ № 139/02/2011 Подписано в печать 21.02.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 mvw.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кравченко, Олеся Васильевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Рибосомные белки бактериального L7/L12-выступа

1.1.1. Белок L7/L

1.1.2. Белок L

1.2. Рибосомные белки эукариотического Р1 /Р2-выступа

1.3. Рибосомные белки архейного LI 2-выступа

1.4. Комплекс L10-L12 и его стехиометрия 26 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы

2.1.1. Химические материалы

2.1.1.1. Реактивы и ферменты

2.1.1.2. Буферы

2.1.1.3. Питательные среды

2.1.2. Биологические материалы

2.1.2.1. Бактериальные штаммы

2.1.2.2. Плазмиды

2.1.3. Принадлежности

2.1.4. Приборы

2.2. Методы 38 2.2.1. Методы генной инженерии

2.2.1.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.2.1.2. Полимеразная цепная реакция

2.2.1.3. Обработка фрагментов ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами рестрикции

2.2.1.4. Очистка фрагментов ДНК

2.2.1.5. Лигирование фрагментов ДНК

2.2.1.6. Получение компетентных клеток Е. coli

2.2.1.7. Трансформация компетентных клеток Е. coli плазмидной ДНК

2.2.1.8. Анализ клонов методом ПЦР

2.2.1.9. Выделение плазмидной ДНК из небольших объемов культуры

2.2.1.10. Экспрессия рекомбинантного гена белков белков MjaLlONTFl, MjaL10NTF2, MjaLlO, MthLlO, MthL10-L

2.2.1.11. Экспрессия рекомбинантного гена белка MthL

2.2.1.12. Экспрессия гена белка MjaLlONTF 1 для получения белка с заменой метионинов на селенометионины

2.2.2. Биохимические методы при работе с белками

2.2.2.1. Выделение MjaLlONTFl и MjaL10NTF2, MthL12, MjaLlO, MthLlO, MthL10-MthL12, MjaL10-MthL

2.2.2.2. Методы хроматографической очистки белков MjaLlONTFl и MjaL10NTF

2.2.2.2.1. Гидрофобная хроматография на колонке Butyl-Sepharose FF

2.2.2.2.2. Аффинная хроматография на колонке с сорбентом Heparine-Sepharose

2.2.2.2.3. Гель-фильтрация на колонке Superdex G

2.2.2.3. Методы хроматографической очистки MthL

2.2.2.3.1. Гидрофобная хроматография на колонке Butyl-Sepharose FF

2.2.2.3.2. Ионообменная хроматография на колонке с сорбентом Q-Sepharose

2.2.2.3.3. Ионообменная хроматография на колонке с сорбентом CM-Sepharose

2.2.2.3.4. Гель-фильтрация на колонке Superdex G

2.2.2.4. Методы хроматографической очистки MthLlO и MjaLlO

2.2.2.4.1. Гидрофобная хроматография на колонке Butyl-Sepharose FF

2.2.2.4.2. Ионообменная хроматография на колонке с сорбентом Q-Sepharose

2.2.2.4.3. Гель-фильтрация на колонке Superdex G

2.2.2.5. Методы хроматографической очистки MthL10-MthL12, MjaL10-MthL

2.2.2.5.1. Гидрофобная хроматография на колонке Butyl-Sepharose FF

2.2.2.5.2. Аффинная хроматография на колонке с сорбентом Heparine-Sepharose

2.2.2.5.3. Ионообменная хроматография на колонке с сорбентом Q-Sepharose

2.2.2.5.4. Гель-фильтрация на колонке Superdex

2.2.2.6. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях

2.2.2.7. Электрофорез в ПААГ в неденатурирующих условиях

2.2.2.8. Формирование комплекса L10-L12 из изолированных белков 48'

2.2.2.9. Аналитическое ультрацентрифугирование

2.2.3. Биохимические методы при работе с РНК

2.2.3.1. Получение РНК-белковых комплексов

2.2.3.2. Электрофорез РНК, РНК-белковых и белок-белковых комплексов в ПААГ в неденатурирующих условиях

2.2.4. Кристаллизация белков

2.2.5. Кристаллографичекие методы. 49 2.2.5.1. Съемка и обработка дифракционных данных

2.2.5.2. Анализ содержания ячейки

2.2.5.3. Решение проблемы фаз

2.2.5.4. Уточнение структуры

2.2.5.5. Проверка стереохимии 56 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Кристаллизация и структурные исследования N-концевого фрагмента рибосомного белка MjaLl

3.1.1. Получение стабильного фрагмента белка L10 из М. jannaschii

3.1.2. Определение аминокислотной последовательности MjaLl0NTF

3.1.3. Создание генетических конструкций генов белков MjaLlONTFl и MjaL10NTF

3.1.4. Выделение белков MjaLlONTFl и MjaLl0NTF

3.1.5. Хроматографическая очистка белка Mj aL 1ONTF

3.1.6. Хроматографическая очистка белка MjaL 10NTF

3.1.7. Кристаллизация белков Mja LIO NTF 1 и Mja LIO NTF

3.1.8. Выделение и кристаллизация селенометионинового производного белка MjaL 1 ONTF

3.1.9. Пространственная структура MjaLlONTF

3.1.10. Сравнение структуры первого домена MjaLlONTF со структурами РНК-связывающих доменов в TmaLl 0 и HmaL

3.1.11. Сравнение структуры MjaLlONTF со структурой Р0 из Р. horikoshii в комплексе N-концевыми доменами белка L

3.1.12. Встраивание структуры MjaLlONTF в модели архейной и бактериальной рибосомы

3.2. Исследование стехиометрии комплекса L10-L

3.2.1. Архейный комплекс L10-L

3.2.2. Бактериальный комплекс L10-L12 88 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 91 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 92 БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ а.о. - аминокислотные остатки

БСА - бычий сывороточный альбумин

БФС - бромфеноловый синий

ГТФ - гуанозин-5'-трифосфат дАТФ - дезоксиаденозин-5'-трифосфат дГТФ — дезоксигуанозин-5'-трифосфат

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСН - додецилсульфат натрия

ДТТ — дитиотрейтол дТТФ - дезокситимидин-5'-трифосфат дЦТФ - дезоксицитидин-5'-трифосфат

ИПТГ — изопропил-р-Б-тиогалактозид мРНК — матричная рибонуклеиновая кислота нт - нуклеотид

ПААГ — полиакриламидный гель

ПСА - персульфат аммония рРНК - рибосомная рибонуклеиновая кислота трис - трис(гидроксиметил)аминометан

ТХУ - трихлоруксусная кислота

Ас - ацетат

СТАВ - цетилтриметиламмоний бромид CTD - С-концевой домен NTD - N-концевой домен NTF - N-концевой фрагмент

Pipes - пиперазин-1Ч,№-бис-(2-этансульфоновая кислота) PMSF - фенилметилсульфонилфторид SA - сульфат аммония

Se-Met Mja LIO NTF 1 - селенометиониновые производные белка MjaLlONTFl

SRL - сарцин-рициновая петля

ТЕМЕД - ^Н№,№-тетраметилэтилендиамин

Mja - M.jannaschii

Mth - M. thermolithotrophicus

MjaLlONTF — N-концевой фрагмент рибосомного белка LIO из M. jannaschii

Введение Диссертация по биологии, на тему "Кристаллизация и структурные исследования компонентов бокового "L12-выступа" большой рибосомной субчастицы"

Во всех исследованных организмах большая рибосомная субчастица содержит функционально важный боковой выступ, называемый в бактериях Ь7/Ы2-выступ, в археях - Ы2-выступ и в эукариотах - Р1/Р2-выступ. Этот боковой выступ вовлечен в образование. ГТФазного центра рибосомы и играет важную роль во взаимодействии рибосомы с факторами трансляции и в контроле точности трансляции (Diaconu et al., 2005). Изолированные рибосомные белки L10 и LI2, входящие в состав бактериального выступа, образуют в растворе стабильный комплекс, который через белок L10 связывается с большой рибосомной РНК в районе спирали 42 (нумерация по 23 S рРНК Escherichia coli). Белки LIO и LI2, входящие в состав L12-BbicTyna архейной рибосомы, похожи на эукариотические белки Р0 и Р1/Р2 и существенно отличаются от своих бактериальных аналогов. Так, архейный L10 и эукариотический Р0 существенно длиннее бактериального белка L10. Замечательно, что архейный комплекс L10-L12 и даже эукариотический комплекс Р0-Р1/Р2 могут in vitro замещать комплекс L10-L7/L12 в 50S субчастице рибосомы Е. coli, причем, получившиеся гибридные рибосомы способны связывать архейные и эукариотические факторы элонгации, но теряют способность связывать бактериальные факторы (Nomura et al., 2006). Пространственная структура данного бокового выступа представляет большой интерес, но до сих пор определение её наталкивается на большие трудности. Структура рибосомной 50S субчастицы, из археи Haloarcula marismortui была определена около десяти лет тому назад с разрешением 2.4 Á (Ban et al., 2000), но L12-BbicTyn в этой модели отсутствовал полностью. Позднее только структура N-концевого домена белка L10 была локализована в, этой модели 50S субчастицы на уровне низкого разрешения (Kavran & Steitz, 2007). Совсем недавно этот РНК-связывающий домен белка L10 был визуализован на карте электронной плотности бактериальной 70S рибосомы, сокристаллизованной с фактором элонгации EF-G (Gao et al., 2009). Поэтому в настоящее время большой интерес представляет собой определение пространственных структур изолированных компонентов L12-BbicTyna.

Кроме того, остается до сих пор невыясненным вопрос о стехиометрии комплекса белков рибосомного L12-BbiCTyna. Ранее комплекс L10-L12 описывался как пентамерный, состоящий из одной копии белка L10 и двух димеров белка LI2. Однако несколько лет назад была определена пространственная структура белка L10 из термофильной бактерии Thermotoga maritima в комплексе с тримя димерами N-концевых доменов белка LI2 (L12NTD) (Diaconu et al., 2005). Было выдвинуто предположение, что число молекул белка L12 в комплексе определяется длиной С-концевой a-спирали белка L10. В С-концевой части рибосомного белка L10 из термофильных бактерий' (но не из мезофильных) присутствует дополнительная аминокислотная последовательность, с которой, как предполагается, взаимодействует третий димер белка LI 2. Подобная последовательность была найдена также в аналоге белка L10 (рибосомный белок РО) из архей. Методом масс-спектрометрии! было показано наличие третьего димера белка L12 в L12-BbiCTyne рибосом двух термофильных бактерий (Ilag et al., 2005) и третьего димера белка РО в PI-выступе рибосом гипертермофильной археи Pyrococcus horikoshii (Maki et al., 2007). В 2009 году японской группой была определена пространственная структура комплекса белка Р0 из Р. horikoshii с N-концевыми доменами белка PI (Naganuma et al., 2010). Этот комплекс оказался гептамерным. В то же время, по данным масс-спектрометрии в эукариотических рибосомах комплекс Р0-Р1/Р2 всегда является пентамерным.

Цель данной диссертационной работы - кристаллизация и исследование структуры РНК-связывающего N-концевого фрагмента белка L10 из Methanococcus jannaschii, а также исследование стехиометрии комплекса L10-L12 из бактерий и архей. Наша работа является весьма актуальной и вносит весомый вклад в исследования функционально-важного выступа рибосомы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Обзор литературы посвящен рибосомным белкам, формирующим боковойг L12-BbiCTyn рибосомы бактерий, архей и эукариот. В рамках данной диссертационной работы впервые получены кристаллы длинного РНК-связывающего N-концевого фрагмента белка ЫО из археи М. jannaschii, и определена его пространственная структура. Оказалось, что исследуемый фрагмент рибосомного белка L10 состоит из двух глобулярных доменов; причем, второй домен является вставкой в первый домен и является* специфическим для архей и эукариот. Пространственная структура второго домена определена впервые. Встраивание определенной нами структуры в модель большой субчастицы архейной рибосомы позволяет прояснить структуру основания L12-BbicTyna архейной и эукариотической рибосомы. Кроме того, показано каким образом специфический домен архейного гомолога белка L10 может мешать взаимодействию бактериальных факторов элонгации с архейными и эукариотическими рибосомами. Исследования стехиометрии комплексов, образуемых в растворе изолированными рибосомными белками L10 и L12 из гипертермофильных архей рода Methanococcus и термофильной бактерии Bacillus stearothermophiliis, показали, что эти белки образуют стабильный пентамерный комплекс. Таким образом, полученные нами результаты создают базу для понимания структурных основ функционирования L12-BbicTyna в архейных и эукариотических рибосомах.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кравченко, Олеся Васильевна

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Клонирован и экспрессирован фрагмент гена белка MjaLlO, соответствующий РНК-связывающему N-концевому фрагменту MjaLlO. Разработана методика получения MjaLlONTF в препаративном количестве с чистотой, пригодной для кристаллизации.

2. Получены кристаллы немодицированного N-концевого фрагмента белка MjaLlO и его селенометионинового производного.

3. Определена пространственная структура MjaLlONTF с разрешением 1.6 À. Исследуемый фрагмент рибосомного белка L10 состоит из двух глобулярных доменов, причем, второй домен, структура которого была определена впервые, является вставкой в первый. Показано, что второй домен полностью соответствует специфическому участку аминокислотной последовательности, который отсутствует в бактериальном белке, но характерен для архейных и эукариотических белков LIO(PO).

4. Полученная модель N-концевого фрагмента белка LIO(PO) встроена в модель большой субчастицы архейной рибосомы, что позволило прояснить структуру основания Р1 -выступа архейной и эукариотической рибосом.

5. Показано, каким образом специфический второй домен архейного белка LIO(PO) может мешать взаимодействию бактериальных факторов элонгации с архейными и эукариотическими рибосомами.

6. Исследована стехиометрия комплекса L10-L12 (Р0-Р1) из гипертермофильных архей рода Methanococcus и термофильной бактерии В. stearothermophilus. Показано, что в растворе данные комплексы является пентамерным.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кравченко, Олеся Васильевна, Пущино

1. Бландел Т., Джонсон JI. (1979). Кристаллография белка, Мир, Москва, с.620.

2. Спирин А.С. (1986). Молекулярная биология. Структура рибосомы и биосинтез белка. М.: Высшая школа.

3. Сердюк, И.Н., Евсеева, O.Hi (2006). Новые возможности аналитического ультрацентрифугирования для анализа гидродинамических свойств белков. Успехи биологической химии, 46, 349-372.

4. Adams, P. D., Grosse-Kunstleve, R. W., Hung, L. -W., Ioerger, Т. R., McCoy, A. J., Moriarty, N. W. et al. (2002). PHENIX: building new software for automated crystallographic structure determination. Acta Crystallogr. D58, 1948-1954.

5. Bailey-Serres, J., Vangala, S., Szick, K., Lee, C.K. (1997). Acidic phosphoprotein complex of the 60S ribosomal subunit of Maize Seedling Roots. Plant Physiology, 114,1293-1305.

6. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P.B., Steitz, T.A. (2000). The complete atomicistructure of the large ribosomal subunit at 2.4A resolution. Science, 289, 905-920.

7. Beauclerk, A.A., Cundliffe, E., Dijk, J. (1984). The binding site for ribosomal protein complex L8 within 23 S ribosomal RNA of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry, 259, 6559-6563.

8. Bocharov E., Sobol A., Pavlov K., Korzhnev D., Jaravine V., Gudkov A., Arseniev A. (2004). From structure and dynamics of protein L7/L12 to molecular switching in ribosome. J. Biol. Chem. 279, 17697-17706.

9. Briinger A.T. (1992) The Free R Value: a Novel Statistical Quantity for Assessing the Accuracy of Crystal Structures. Nature, 355, 472-474.

10. Casiano, C., and Traut, R.R. (1991). Protein topography of Sulfolobus solfataricus ribosomes by cross-linking with 2-iminothiolane. The Journal of Biological Chemistry, 266, 21578-21583.

11. Casiano, C.A., and Traut, R.R. (1994). Stoichiometry of Sulfolobus ribosomal protein L12e in 50S subunits determined by quantification of immunoblots. Biochemical and Biophysical Research Communications, 203, 1140-1145.

12. Christensen, T., Johnsen, M., Fiil, N.P., Friesen, J.D. (1984). RNA secondary structure and translation inhibition: Analysis of mutants in the rplJ leader. EMBO Journal, 3, 1609-1612.

13. Collaborative Computational Project, Number 4.(1994). The CCP4 suite: programs for protein crystallography.Acta Crystallogr. D 50, 760-763.

14. Davies, D., and Segal, D. (1971). Protein crystallization: microtechniques involving vapor diffusion. Methods Enzymol., 22, 266-269.

15. Diaconu, M., Kothe, U., Schliinzen, F., Fischer, N., Harms, J.M., Tonevitsky, Stark, IT, Rodnina, M.V., Wahl, M.C. (2005). Structural basis for the function of the ribosomal L7/L12 stalk in factor, binding and GTPase activation. Cell, 121, 991-1004;

16. Dijk, J., Garrett, R.A. and Muller, R. (1979). Studies on the binding of the ribosomal protein complex L7/12-L10 and protein LI 1 to,the 5'-one third of 23S RNA: a functional centre of the 50S subunit. Nucleic Acids Research, 6,21 \1-2129.

17. Drenth J. (1999) Principles of Protein X-ray Crystallography, Springer Verlous Publishing, p. 305.

18. Emsley, P. & Cowtan, K. (2004). Coot: model-building tools for molecular.graphics. Acta Crystallogr. D60, 2126-2132.

19. Francisco-Velilla, R., Remacha, M. (2010). In vivo formation of a stable pentameric (P2a/Plp)-P0-( Pla/P2J3) ribosomal stalk complex in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 27(9), 693-704.

20. Gao, Y., Selmer, M., Dunham, C., Weixlbaumer, A., Kelley, A. & Ramakrishnan, V. (2009). The structure of the ribosome with elongation factor G trapped in posttranslocational state. Science, 326, 694-699.

21. Gordiyenko, Y., Videler, H. Zhou, M., McKay, A.R., Fucini, P., Biegel, E., Muller, V., Robinson, C.V. (2010). Mol Cell Proteomics, 9, 1774-1783.

22. Griaznova, О., Traut, R.R. (2000). Deletion of C-terminal residues of Escherichia coli ribosomal protein L10 causes the loss of binding of one L7/L12 dimer: ribosomes with one L7/L12 dimer are active. Biochemistry, 39,4075-4081.

23. Grela, P., Sawa-Makarska, J., Gordiyenko, Y., Robinson, C.V., Grankowski, N., Tchorzewski, M. (2008). Structural properties of the human acidic ribosomal P proteins forming the P1-P2 heterocomplex. J. Biochem., 143, 169-177.

24. Grela, P., Krokowski, D., Gordienko, Y., Krowarsch, D., Robinson, C, Otlewski, J., Grankowski, N., Tchorzewski, M. (2010). Biophysical properties of the eukaryotic ribosomal stalk. Biochemistry, 49, 924-933.

25. Gudkov, A.T. (1997). The L7/L12 ribosomal domain of the ribosome: structural and functional studies. FEBS Letters, 407, 253-256.

26. Gudkov, A.T., Bubunenko, G.M. (1989). Conformational changes in ribosomes upon interaction with elongation factors. Biochimie, 71, 779-785.

27. Gudkov, A.T., Gongadze, G.M. (1984). The L7/L12 proteins change their conformation upon interaction of EF-G with ribosomes. FEBS Letters, \16, 32-35.

28. Gudkov, A.T., Tumanova, L.G., Venyaminov, S.Y., Khechinashvilli, N.N. (1978). Stoichiometry and properties of the complex between ribosomal proteins L12 and L10 in solution. FEBS Letters, 93,215-218.

29. Hagiya A., et al. (2005). A mode of assembly of P0, Pi, and P2 proteins at the GTPase-associated center in animal ribosome. In vitro analyses with P0 truncation mutants. J. Biol. Chem., 280, 39193-39199.

30. W.A. Hendrickson, J.L. Smith, R.P. Phizackerley, E.A. Merritt (1988). Crystallographic structure analysis of lamprey hemoglobin from anomalous dispersion of synchrotron radiation. Proteins 4, pp. 77-88.

31. Hooft, R. W. W., Vriend, G., Sander, C. & Abola, E. E. (1996). Errors in protein structures. Nature, 381,272.

32. Huang, C., Mandava, C.S., Sanyal, S. (2010). The ribosomal stalk plays a key role in IF2-mediated association of the ribosomal subunits. JMB, 399 (1), 145-153.

33. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene, 96, 23-28.

34. Johnsen, M:, Christensen, T., Dennis, P.P., Fiil, N.P. (1982). Autogenous control: ribosomal protein L10-L12 complex binds to the leader sequence of its mRNA. EMBO Journal, 1, 999-1004.

35. Jose, M.P., Santana-Roman, H., Remacha, M., Ballesta, J.P., Zinker, S. (1995). Eukaryotic acidic phosphoproteins interact with the ribosome through their amino-terminal domain. Biochemistry, 34, 7941-7948.

36. Kabsch, W. (1993). Automatic processing of rotationdiffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants. J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800.

37. Kavran, J. & Steitz, T. (2007). Structure of the base ofthe L7/L12 stalk of the Haloarcula marismortui large ribosomal subunit: analysis of LI 1 movements. J. Mol.Biol. 371,1047-1059.

38. Korostelev, A., Trakhanov, S., Laurberg, M. & Noller, H. F. (2006). Crystal structure of a 70S ribosome-tRNA complex reveals functional interactions and rearrangements. Cell, 126, 1065-1077.

39. Kothe, U., Wieden, H.J., Mohr, D., Rodnina, M.V. (2004). Interaction of helix D of elongation factor Tu with helices 4 and 5 of protein L7/L12 on the ribosome. Journal of Molecular Biology, 336, 1011-1021.

40. Laemmli, U. (1970). Cleveage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

41. Laskowski, R. A., MacArthur, M. W., Moss, D. S. & Thornton, J. M. (1993). PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures./. Appl. Crystallogr. 26,283-291.

42. Leijonmarck, M., and Liljas, A. (1987). Structure of the C-terminal domain of the ribosomal protein L7/L12 from Escherichia coli at 1.7 A. Journal of Molecular Biology, 195, 555-580.

43. Liljas A, Gudkov T (1987) The structure and dynamics of ribosomal protein L12. Biochimie. 69, 1043-1047.

44. Liao, D., and Dennis, P.J. (1994). Molecular phylogenies based on ribosomal protein LI 1, LI, L10 and LI 2 sequences. Journal of Molecular Evolution, 38, 405-419.

45. Metthews B.W. (1968) Solvent content of protein crystals. J. Mol. Biol., 33, 491-497.

46. Miyoshi, T., Nomura, T., Uchiumi, T. (2009). Engineering and characterization of the ribosomal L10/L12 stalk complex: a structural element responsible for high turnover of the EF-G-dependent GTPase. The Journal of Biological Chemistry, 284, 85-92.

47. Moller, W., Maassen, J.A. (1986). Structure, Function and Genetics of Ribosomes (Hardesty, B., Kramer, G., eds) Springer-Verlag New York Inc., New York.

48. Murshudov, G. N., Vagin, A. A. & Dodson, E. J. (1997). Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr. D53,240-255.

49. Naganuma, T., Shiogama, K., Uchiumi, T. (2007). The N-terminal regions of eukaryotic acidic phosphoproteins PI and P2 are crucial for heterodimerization and assembly into the ribosomal GTPase-associated center. Genes to Cells, 12, 501-510.

50. Naganuma, T., Nomura, N., Yao, M., Mochizuki, M., Uchiumi, T. & Tanaka, I (2010). Structural basis for translation factors recruitment to the eukaryotic/archaeal ribosomes. J. Biol. Chem. 285,4747-4756.

51. Olson, H.M., Sommer, A., Tewari, D.S., Traut, R.R., and Glitz, D.G. (1986). Localization of two epitopes of protein L7/L12 to both the body and stalk of the large ribosomal subunit. The Journal of Biological Chemistry, 261, 6924-6932.

52. Petersen, C. (1990). Escherichia coli ribosomal protein L10 is rapidly degraded when synthesized in excess of ribosomal protein L7/L12. Journal of Bacteriology, 172,431-436.

53. Pettersson, I. and Liljas, A. (1979). The stoichiometry and reconstitution of a stable protein complex from Escherichia coli ribosomes. FEBS Letters, 98, 139-144.

54. Rich, B.E., and Steitz, J.A. (1987). Human acidic ribosomal phosphoproteins P0, PI and P2: analysis of cDNA clones, in vitro synthesis, and assembly. Molecular and Cellular Biology, 7,4065-4074.

55. Rosendahl, G., Douthwaite, S. (1993). Ribosomal proteins Lll and L10*(L12)4 and the antibiotic thiostrepton interact with overlapping regions of the 23 S r RNA backbone in the ribosomal GTPase centre. Journal of Molecular Biology, 234, 1013-1020.

56. Santos, C., and Ballesta, J.P. (1995). The highly conserved protein P0 carboxyl end is essential for ribosome activity only in the absence of proteins PI and P2. Journal of Biological Chemistry, 270,20608-20614.

57. Santos, C, Rodriguez-Gabriel, MA, Remacha, M & Ballesta, JP (2004). Ribosomal P0 protein domain involved in selectivity of antifungal sordarin derivatives. Antimicrob. Agents Chemother. 48,2930-2936.

58. Shcherbacov, D., Dontsova, M., Tribus, M., Garber, M., and Piendl, W. (2006). Stability of the "LI2 stalk" in ribosomes from mesophilic and (hyper)thermophilic Archaea and Bacteria. Nucleic Acids Research, 34, 5800-5814.

59. Spierer, P., Wang, C.C., Marsh, T.L., Zimmermann, R.A. (1979). Cooperative interactions among protein and RNA components of the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry, 6, 1669-1682.

60. Studier, F., Rosenberg, A., Dunn, J., Dubendorff, J. (1990). Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Jounal Methods in Enzimology, 185, 60-89.

61. Taylor, D., Devkota, B., Huang, A., Topf, M., Narayanan, E., Sali, A., Harvey, S., Frank, J. (2009). Comprehensive molecular structure of the eukaryotic ribosome. Structure, 17 (12), 15911604.

62. Tchorzewski, M., Krokowski, D., Boguszewska, A., Lilijas, A., Grankowski, N. (2003). Structural characterization of yeast acidic ribosomal P proteins forming the P1A-P2B heterocomplex. Biochemistry, 42, 3399-3408.

63. Terhorst, C., Moller, W., Laursen, R., Wittmann-Liebold,. B. (1972). Amino acid sequence of a 50S ribosomal protein involved in both EF-G and EF-Tu dependent GTP-hydrolysis. FEBS Letters, 28, 325-328.

64. Uchiumi, T., Honma, S., Endo, Y., Hachimori, A. (2002). Ribosomal proteins at the stalk region modulate functional rRNA structures in the GTPase center. Journal of Biological Chemistry, 277,41401-41409.

65. Wahl, M.C., and Moller, W. (2002). Structure and function of the acidic ribosomal stalk proteins. Current protein and peptide science, 3, 93-106.

66. Wahl, M.C., Huber, R., Marinkovic, S., Weyher-Stingl, E., Ehlert, S. (2000a). Structural investigations of the highly flexible recombinant ribosomal protein L12 from Thermotoga maritima. Biological Chemistry, 381, 221-229.

67. Wahl, M.C., Bourenkov, G.P., Bartunik, H.D., Huber, R. (2000b). Flexibility, conformational diversity and two dimerization modes in complexes of ribosomal protein LI2. EMBO Journal, 19, 174-186.

68. Wool, I.G, Gluck, A, Endo, Y. (1992). Ribotoxin recognition of ribosomal RNA and a proposal for the mechanism of translocation. Trends in Biochemical Sciences, 17, 266-138.1. БЛАГОДАРНОСТИ

69. Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю Станиславу Владимировичу Никонову за четкое руководство, помощь, поддержку, ценные советы и рекомендации в процессе выполнения и оформления диссертационной работы.

70. Спасибо всем сотрудникам группы структурных исследований рибосомных белков и лаборатории структурных исследовай аппарата трансляции за внимание и помощь в работе, а так же за доброжелательную атмосферу.

71. Спасибо родителям, мужу и доче за понимание и всестороннюю помощь.