Контаминированность объектов ветеринарного надзора возбудителем листериоза и биологические свойства выделенных культур листерий

Алимов, Марат Азатович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Контаминированность объектов ветеринарного надзора возбудителем листериоза и биологические свойства выделенных культур листерий
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Контаминированность объектов ветеринарного надзора возбудителем листериоза и биологические свойства выделенных культур листерий"

На правах рукописи

АЛИМОВ МАРАТ АЗАТОВИЧ

Контаминированность объектов ветеринарного надзора возбудителем листериоза и биологические свойства выделенных культур л истерий

03.00.07 - микробиология

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2004

Работа выполнена в ФГНУ "Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт (г. Казань)".

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук Т.Х. Фаизов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В.П. Коксин ;

доктор ветеринарных наук, профессор Х.Н. Макаев

Ведущее учреждение: Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия.

Защита состоится « » _2004г. в Ю ~ часов

на заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте (420075, Татарстан, г.Казань, Научный городок-2, ВНИВИ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИВИ.

Автореферат разослан « »

2004 г-

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник

о^Тс/ти^^^И. Степанов

1. Общая характеристика работы.

1.1. Актуальность проблемы. С начала систематического изучения возбудителя листериоза (Е. Murray, 1926) прошло почти 80 лет. За этот период достигнуты значительные успехи в изучении листериоза и его возбудителя. Однако до настоящего времени эта инфекция привлекает большое внимание ветеринарных и медицинских специалистов, что вызвано широкой распространенностью л истерий в природе, увеличением количества вспышек листе-риоза среди людей, высоким уровнем летальности при генерализированных формах инфекции, бессимптомным листерионосительством, стертым течением, значительными экономическими потерями, вызванными заболеванием и падежом сельскохозяйственных животных, затратами на проведение противо-листериозных профилактических и лечебных мероприятий (М. Rivera-Alsina et al., 1983; S. Ortel, 1989; И.А. Бакулов с соавт., 1994; И .А. Бакулов, В.М. Котля-ров, 1999; Г.М. Маненкова с соавт., 2000; В.В. Красовский с соавт., 2000; Л.В. Родина с соавт., 2003).

Начиная с 80-х годов прошлого века в результате многолетних эпидемических вспышек и спорадических случаев листериоза среди людей в ряде высокоразвитых стран (США, Великобритания, Канада, Франция, Швейцария), возникших после употребления готовых пищевых продуктов, данное заболевание стали рассматривать как пищевую инфекцию (В. Gellin, С. Broome et al., 1991; J. Farber, P. Peterkin, 1991; И.А. Бакулов с соавт., 1991; И.С. Тартаков-ский с соавт., 1994).

Поэтому разработка и внедрение в лабораторную практику высокочувствительных и экспресс-методов индикации листерий остается актуальной проблемой. В этом аспекте большой интерес представляет полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая по данным отдельных авторов (S. Kholer et al., 1990; С .А. Ермолаева с соавт., 1994; A. Bubert et al., 1997; М. Monzano et al, 1997; В.В. Красовский с соавт., 2000; И.С. Тартаковский с соавт., 2001) обладает высокой чувствительностью и эффективностью. Однако ПЦР пока еще не получила практического применения из-за недостаточной ее апробации в лабораторной практике в сравнительном аспекте. Поэтому систематические исследования контаминированности объектов ветеринарного надзора листерия-ми и изучение биологических свойств циркулирующих штаммов листерий стали насущной проблемой, решение которой может способствовать установлению эпизоотического и эпидемического значения контаминированных лис-териями объектов и проведению целенаправленных мероприятий по недопущению возникновения листериоза среди людей и сельскохозяйственных животных.

Сравнительное изучение бактериологического метода и ПЦР для обнаружения листерий в объектах ветеринарного надзора позволит дать объективную оценку их эффективности и роли последней в лабораторной практике.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

1.2. Цель и задачи исследований/ Целью настоящей работы явилось определение контаминированности объектов ветеринарного надзора возбудителем листериоза бактериологическим методом и ПЦР, а также изучение биологических свойств выделенных культур.

Для достижения данной цели были выдвинуты следующие задачи:

1. Оптимизировать полимеразную цепную реакцию для анализа объектов ветеринарного надзора и определить ее эффективность для индикации листерий.

2. Сравнительно оценить эффективность различных питательных сред для выделения возбудителя листериоза.

3. Определить сроки выживания листерий в мясных и молочных продуктах.

4. Установить контаминированность Listeria monocytogenes различных объектов бактериологическими исследованиями и полимеразной цепной реакцией.

5.-Изучить основные биологические свойства выделенных культур лис-

терий.

1.3. Научная новизна. Впервые широкомасштабными систематическими исследованиями бактериологическим методом и полимеразной цепной реакцией установлена степень контаминированности различных объектов внешней среды, кормов, пищевых продуктов, сырья растительного и животного происхождения возбудителем листериоза. Изучением биологических свойств 32 выделенных культур Listeria monocytogenes показано, что на территории Республики Татарстан, Московской области и г. Москвы циркулируют патогенные листерий преимущественно I серогруппы, ас импортными мясными продуктами и полуфабрикатами попадают представители II серогруппы (12,2% от общего количества выделенных культур).

Оптимизированы методика подготовки проб и режим проведения ПЦР для обнаружения ДНК листерий в различных объектах ветеринарного и медико-санитарного надзора.

Установлено, что сроки выживания листерий в контаминированных продуктах (молоко, кефир, мясо) варьируют в широком диапазоне в зависимости от объекта и температурного режима хранения.

1.4. Практическая значимость. Для первичного выделения листерий из различных объектов рекомендуется синтетическая элективная питательная среда, которую можно использовать в жидкой и плотной формах, что повышает эффективность обнаружения возбудителя листериоза.

процессе переработки продукции растениеводства и животноводства, а при подготовке пищи соблюдать режим термической обработки.

Для предупреждения возникновения листериоза среди людей и животных в результате потребления контаминированных его возбудителем продуктов и кормов целесообразно систематическое исследование объектов ветеринарного надзора на наличие в них листерий, для чего эффективно и наиболее удобно использование полимеразной цепной реакции согласно разработанных нами методических рекомендаций, утвержденных директором ВНИВИ 12 сентября 2000 г. и 19 августа 2002 г.

1.5. Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на: Юбилейной научной конференции, посвященной 50-летию Центра военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ (Екатеринбург, 1999); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИТИБП (Щелково, 2000); Международной научной конференции, посвященной 70-летию образования зооинженерного факультета КГАВМ (Казань, 2000); Научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2001, 2002 г.г.); IV Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" (Москва, 2002); Международной научной конференции "Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине" (Москва, 2003) и ежегодных научных отчетных сессиях ВНИВИ 1999-2003 г.г.

1.6. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

1.7. Основные положения, выносимые на защиту:

- Результаты анализа контаминированности возбудителем листериоза различных объектов ветеринарного надзора и эффективность бактериологического метода и ПЦР для их выявления;

- Биологические свойства выделенных культур листерий и экспериментальное обоснование биологической опасности контаминированных ими объектов;

- Выживаемость листерий в мясе и молочных продуктах при различных режихмах хранения.

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Работа изложена на 152 страницах, содержит 17 таблиц и 7 рисунков. Список использованной литературы включает 246 источников, в том числе - 155 иностранных.

2. Собственные исследования.

2.1. Материалы и методы. В работе использовали отдельные штаммы Listeria monocytogenes (А-исходный, АУФ, 9-128, 9-129, 9-130 и 9-72) и Salmonella choleraesuis ТС-177, находящиеся во ВНИВИ и изоляты, выделенные из разных источников.

Культуры штаммов L. monocytogenes хранили в лаборатории на полужидком мясо-пептонном агаре (0,2%) при 4°С. Пересевы производили через каждые 4 месяца.

Для выделения Listeria monocytogenes из исследуемых объектов производили посевы в жидкие и плотные питательные среды, а также синтетическую элективную среду в жидком и плотном вариантах, разработанную А.М. Алимовым с соавт. (1980). В некоторых случаях в качестве элективной среды применяли Оксфорд агар с селективными добавками, а также использовали метод "холодного" обогащения. Для этого посевы с объектов инкубировали при 4°С в течение 30 суток.

Отбор проб и бактериологические исследования продуктов и кормов животного и растительного происхождения проводили согласно ГОСТов и СаНиП.

Отдельные пробы параллельно исследовали полимеразной цепной реакцией.

Выделенные культуры идентифицировали с учетом морфологии колоний и клеток, по их подвижности, культурально-биохимических свойств, агг-лютинабельности со специфической поливалентной и групповыми сыворотками, а также биопробой на лабораторных животных, которые проводили согласно общепринятых методов.

Для определения патогенности выделенных культур производили заражение белых мышей или ставили конъюнктивальную пробу на морских свинках.

Полимеразную цепную реакцию для обнаружения листерий ставили с праймерами, синтезированными НПФ "Литех", по нашей заявке.

В работе испытали следующие праймеры: А - Mar 1 5' - GGGCTTTATCCATAAAATA - 3' Маг 2 5' - TTGGAAGAACCTTGATTA - 3'

Последовательности этих праймеров были описаны М. Manzano с соавт. (1997). Праймеры Маг 1 и Маг 2 комплиментарны участку гена iap L. monocytogenes в позициях 635 до 653 п.н. и от 1069 до 1085 пар нуклеотидов (п.н.). Они амплифицировали фрагмент ДНК с длиной 453 п.н. Б - L1 5* - GCATCTGCATTCAATAAAGA - 3' L2 5' - TGTCACTGCATCTCCGTGGT- 3'

Мишенью для этих праймеров (L1 и L2) является ген Ыу А, продукт которого листериолизин играет важную роль в вирулентности L. monocytogenes. Последовательности этих праймеров описаны Н. Deneer, J. Boychuk (1991).

Данная пара праймеров амплифицирует участок гена Ыу А, длиной 174 пар нуклеотидных оснований. Кроме того, в работе использовали и набор для ПЦР-анализа, изготовленный ЦНИИЭ МЗ РФ. Амплификацию проводили в амплификаторе "Терцик" (Россия).

Для определения морфологии микробных клеток мазки готовили из 1624 часовых агаровых культур и окрашивали по Граму.

При определении сроков выживания листерий в мясе и молочных продуктах производили искусственное контаминирование проб с культурами листерий. Контаминированные пробы выдерживали при 2..4°С и -20°С. По истечении определенного промежутка времени их подвергали бактериологическим исследованиям для выделения листерий.

Полученный в ходе экспериментов цифровой материал подвергали статистической обработке с определением: критерия достоверности по таблице Стьюдента (И.П. Рокицкий, 1974).

2.2. Результаты собственных исследований.

2.2.1. Оптимизация ПЦР для анализа проб из объектов ветеринарного надзора. Для успешного применения ПЦР важное значение имеют чувствительность и воспроизводимость метода. Поэтому в опытах сравнивали чувствительность и воспроизводимость ПЦР с использованием праймеров Marl-Маг2, L1-L2 и набора для ПЦР анализа, изготовленного ЦНИНЭ МЗ РФ. В этих экспериментах использовали культуры известных штаммов листерий.

Набор для ПЦР анализа, изготовленный ЦНИНЭ Минздрава РФ, согласно прилагаемой рекомендации при наличии ДНК листерий должен амплифи-цировать фрагмент с длиной 280 пар нуклеотидов. Однако при многократном повторении опытов по амплификации выделенных из разных штаммов листе-рий хромосомальной ДНК специфический ампликон не регистрировался. Специфический ампликон не выявлялся и при использовании прилагаемого в наборе положительного контроля. Поэтому в дальнейших исследованиях не удалось использовать данный набор.

С использованием праймеров Marl и Маг2 установили, что ПЦР достаточно специфична и обеспечивает выявление ДНК листерий при анализах чистых культур. Однако при проведении ПЦР с этими праймерами биологических субстратов (мышечная ткань), искусственно контаминированных л истериями, в отдельных пробах, особенно при малой концентрации этих микробов, регистрировались отрицательные результаты. При проведении ПЦР с праймерами L1 и L2 во всех случаях с искусственно контаминированных листериями объектах были получены положительные результаты. В связи с этим свой выбор остановили на ПЦР с праймерами L1 и L2.

В результате предварительных экспериментов был оптимизирован режим ПЦР для детекции ДНК генома листерий. Основные опыты по обнаружению листерий в объектах ветеринарного надзора проводили по описанной ниже методике.

Для проведения ПЦР собирали в 0,5 мл пробирку эппендорф реакционную смесь следующего состава: 3 мкл 10 х ПЦР-буфер, по 3 мкл дезоксинук-леотидфосфатов (d ATP, d CTP, d GTO, d TTP), no 25 пМоль каждого прайме-pa, 3 мкл исследуемой пробы ДНК, 0,5 мкл Tag-полимеразы и до 30 мкл деио-низированной воды.

Режим амплификации: Первый цикл - денатурация при 94°С в течение 4 мин, отжиг праймеров при 55°С в течение 1 мин, синтез олигонуклеотидов при 72°С в течение 2,5 мин. Затем денатурация при температуре 94°С в течение 1 мин, отжиг праймеров при 57°С в течение 1 мин и синтез олигонуклеотидов при 72°С - 1,5 мин. Данный режим выдерживался при 30 последующих циклах. В отдельных случаях (при слабых полосах амплификата) проводили повторную амплификацию. Для этого 5 мкл первичного амплификата вносили в новую реакционную смесь и амплифицировали еще 20-25 циклов в том же режиме.

Амплификаты анализировали гель-электрофорезом в 1,2% агарозном геле, содержащем этидий бромид при силе тока 10 В/см в течение 1-1,5 часов.

По окончании электрофореза пластины геля просматривали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Результаты отдельных опытов документировали фотографированием.

Результаты опыта по определению чувствительности ПЦР по описанному режиму с праймерами L1 и L2 показали, что наименьшее количество ДНК, давшая положительную реакцию, соответствует эквиваленту генома 10 бактериальных клеток.

Следовательно, полученные данные свидетельствуют о достаточно высокой чувствительности и специфичности ПЦР, проводимой по разработанному нами режиму. Поэтому данная методика нами использовалась при исследовании различных объектов медико-санитарного и ветеринарного надзора.

При индикации листерий методом ПЦР важное значение имеет подготовка проб к анализу. Для этого разные авторы использовали различные подходы, которые значительно варьировали в зависимости от объекта исследования. Нами разработаны и успешно апробированы следующие процедуры подготовки проб для ПЦР: Пробы жидких объектов (вода, молоко, растительное масло и др.) в объеме не менее 100 см3 центрифугировали при 5000 g в течение 5-10 мин. При постановке ПЦР без предварительного обогащения полученный осадок ресуспендировали в 200 мкл ТЕ-буфера и переносили в пробирки эппендорфа. Затем к этой суспензии добавляли 5 мкл 10 н раствора гидроокиси натрия. Содержимое пробирок смешивали, переворачивая несколько раз в течение 3-5 сек. Затем смесь нейтрализовали добавлением 50 мкл 2М трис-HCl буфера, рН 7,4 и центрифугрировали при 5000 g в течение 10 мин. После центрифугирования надосадочную жидкость, предположительно содержащую ДНК листерий, переносили в сухие пробирки эппендорфа и использовали для проведения ПЦР или при необходимости проводили процедуру выделения ДНК. При этом к жидкости добавляли смесь хлороформа с

изоамиловым спиртом (24:1), тщательно перемешивали и центрифугировали при 1000 g в течение 5-10 мин. Верхнюю фазу осторожно отсасывали и переносили в чистую пробирку. ДНК осаждали добавлением равного объема холодного этанола (96%). Полученный осадок слегка подсушивали на воздухе и растворяли в деоинизированной воде.

Исследуемые пробы почвы, навоза, кормов (мясо-костная мука, силос, сенаж, трава) и зерновых продуктов (зерносмеси, корма) в количестве не менее 100 г помещали в колбы и заливали тремя объемами физиологического раствора хлористого натрия и шуттелировали в течение 15 мин. Затем оставляли, чтобы отстаивалось. Жидкую часть фильтровали через широкопористые быстрофильтрующие бумажные фильтры. Фильтраты центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин. Полученные осадки подвергали дальнейшей обработке, как было описано ранее (осадки от жидких проб).

При исследовании образцов мяса, сыра, патологического материала пробы измельчали ножницами или ножом и гомогенизировали в тканевом гомоге-незаторе. В отдельных случаях производили растирание этих проб в ступке с кварцевым песком. После гомогенизации пробы заливали физиологическим раствором хлористого натрия в соотношении 1:5. Тщательно перемешивали и переносили в центрифужные пробирки. Для удаления обломков тканей суспензию центрифугировали при 1000 g в течение 3-5 мин. Надосадочную жидкость вновь центрифугировали при 4000 g в течение 10-15 мин. Из полученного осадка выделяли ДНК также как описано ранее (осадки от жидких проб).

Из подготовленных таким образом проб по 3 мкл отбирали для амплификации в ПЦР.

Образцы сливочного масла размельчали в замороженном состоянии и смешивали в соотношении 1:2 с физиологическим раствором при температуре 4-5°С и шуттелировали при 4°С в течение 10 мин. Затем центрифугировали при 1000 g в течение 3-5 мин, а надосадочную жидкость использовали для выделения ДНК. Для этого из жидкой фазы предполагаемые микроорганизмы осаждали центрифугированием при 4000 g в течение 10-15 мин. Полученный осадок использовали для выделения ДНК и последующего анализа в ПЦР.

Параллельно с ПЦР эти пробы исследовали бактериологически. Для этого из подготовленных образцов производили посевы на МПБ, МПА, содержащих 1% глюкозы, синтетическую жидкую и плотную среды. В отдельных случаях пробы исследовали методом "холодного" обогащения, выдерживая посевы в холодильнике при 4°С до 30 дней, а также постановкой биопробы на белых мышах с последующими бактериологическими исследованиями.

При апробации разработанного метода для анализов брали пробы молока и кусочки мяса, которых контаминировали тест-культурой. В качестве тест-культуры использовали суспензию односуточной агаровой культуры листерий. Для этого в пробы молока объемом 20 см вносили по 1 мл суспензии листерий, содержащих соответственно 2000 и 200 м.к. по оптическому стандарту мутности. Кусочки мяса (говядина) с массой 10 г контаминировали суспензией лис-

терий путем инъекции из шприца в несколько точек. Для инфицирования кусочков мяса готовили суспензию л истерий с концентрацией 1000 и 10000 м.к. в 1 см3. В качестве контроля брали неинфицированные пробы молока и мяса, а также суспензию сальмонелл.

В таблице 1 показаны результаты исследований проб молока и мяса кон-таминированных различными микроорганизмами, а также пробы, не содержащие бактерии.

Таблица 1. Результаты обнаружения листерий ПЦР

№ п/п Название пробы Результат

1. Мясо, контаминированное листериями (100 м.к. на 1г) специфичный фрагмент

2. Мясо, контаминированное листериями (Ю00 м.к. на 1г) специфичный фрагмент

3. Мясо, неинфицированное микробами фрагмент отсутствует

4. Мясо, контаминированное сальмонеллами фрагмент отсутствует

5. Молоко, неинфицированное микробами фрагмент отсутствует

6. Молоко, контаминированное листериями (10 м.к. на 1мл) специфичный фрагмент

7. Молоко, контаминированное сальмонеллами фрагмент отсутствует

8. Молоко, контаминированное листериями (100 м.к. на 1мл) специфичный фрагмент

9. ДНК из чистой культуры сальмонелл фрагмент отсутствует

10. ДНК из чистой культуры листерий специфичный фрагмент

Анализируя полученные данные, можно констатировать, о том, что ПЦР была положительной в пробах мяса, контаминированных листериями в количестве 100 и 1000 м.к. в 1 г, о чем свидетельствует наличие специфического ампликона, состоящего из 174 п.н. Аналогичный фрагмент обнаруживался и в пробах молока, инфицированных листериями, из расчета 10 и 100 м.к. на 1мл.

В пробах из мяса и молока, контаминированных сальмонеллами и неин-фицированных микробами, специфический ампликон отсутствовал.

Таким образом, ПЦР с праймерами L1 и L2 обеспечивает индикацию листерий в биологических объектах с высокой чувствительностью и специфичностью, что подтверждается не только при анализе искусственно контами-нированных листериями проб, но и при исследовании естественно инфицированных этими микроорганизмами объектов.

Результаты одного из экспериментов по ПЦР скринингу отдельных проб исследуемых объектов (без искусственной контаминации листериями) приведены на рис. 1.

Полученные данные свидетельствуют о наличии ДНК листерий в пробах молочных сосисок, рыбной муки, сыра "Сулугуни", о чем указывает появление на электрофореграммах (треки 1, 7, 8 соответственно) ампликона, состоящего из 174 п.о. Данный ампликон обнаруживался и на треке 5 электрофореграммы, куда был нанесен амплификат с ДНК, выделенной из Listeria monocytogenes штамм А-исходный (положительный контроль).

Специфичность ПЦР анализа подтверждали и результаты бактериологических исследований этих объектов, от которых были выделены культуры лис-терий.

Ml 23 4 5 6789

Рис. 1. Результаты ПЦР-анализа отдельных проб исследуемых объектов

М - маркеры длин фрагментов ДНК

1. Проба сосиски молочной

2. Проба говядины замороженной

3. Проба курятины (Россия)

4. Вода водопроводная

5. Положительный контроль

6. Вода речная

7. Рыбная мука

8. Сыр "Сулугуни"

9. Зеленая масса гороха

2.2.2. Сравнительная оценка эффективности различных питательных сред и условий культивирования при выделении Listeria monocytogenes. Для обогащения и культивирования листерий используют ряд гидроли-затных и экстрактивных питательных сред: триптозно-соевый агар, мясо-

пептонный агар и бульон, триптический фосфатный бульон "Дифко", агар для подсчета колоний MRS фирмы Oxoid и др. Однако они в большинстве имеют узко целевое назначение (И.С. Тартаковский с соавт., 2002).

При первичном выделении листерий, особенно из объектов, содержащих их в малом количестве, важны питательные среды, обеспечивающие рост микробов из единичных клеток. В связи с этим в одной серии опытов определяли эффективность отдельных питательных сред для культивирования листерий. При этом в качестве тест-культур использовали штаммы "А-исходный" и 9128.

Результаты определения минимальной посевной дозы листерий на разных средах, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что для культивирования их пригодны питательные среды, приготовленные с использованием мышечной ткани (МПБ и БХ), казеина (ПСГК) и гидролизатов сои. Как свидетельствуют полученные данные, рост листерий усиливает включение в их состав глюкозы. В частности, в МПБ при посеве 1000 микробных клеток на 1 см3 помутнение среды появлялось через 18 часов инкубации при 37°С и при посеве 100 и 10 м.к. - через 24 и 36 часов соответственно. При включении в состав МПБ 0,2% глюкозы рост листерий появлялся через 16, 18 и 24 часа в зависимости от посевной дозы и независимо от штаммовых особенностей. Рост листерий в более ранние сроки наблюдался в глюкозных средах (БХ, ПСГК и триптозно-соевом бульоне). Последние 3 среды обеспечивали рост листерий при посеве 1000, 100 и 10 м.к. через 14, 16 и 20 часов соответственно.

Таблица 2. Показатели роста листерий на разных средах при посеве определенного количества микробных клеток

№ п/п Наименование питательных сред Сроки (час) появления роста при посеве

1000 м.к. 100 м.к. 10 М.К.

А исх. 9-128 А исх. 9-128 А исх. 9-128

1. МПБ 18 18 24 24 36 36

2. МПБ + 0,2% глюкоза 16 16 16 18 24 24

3. Бульон Хоттингера (БХ) 17 17 20 20 22 22

4. БХ + 0,2% глюкоза 14 14 15 15 20 20

5. ПСГК с 0,2% глюкозой 14 14 16 16 20 20

6. Гриптоз-соевый бульон (ТСБ) 16 16 20 20 22 . 22

7. ТСБ + 0,2% глюкоза 14 14 16 16 20 20 •

Как показали результаты определения роста листерий при посеве 1000, 100 и 10 м.к. на 1 мл отечественные питательные среды (МПБ, БХ, ПСГК) обеспечивали удовлетворительный рост, не уступающий зарубежной пита-

тельной среде - триптозно-соевому бульону. Следовательно, для обогащения листерий могут быть использованы отечественные питательные среды на основе экстракта и гидролизатов мышечной ткани и казеина.

В следующей серии опытов мы оценивали эффективность элективных сред для выделения листерий: синтетическую элективную среду, разработанную А.М. Алимовым с соавт. (1980); МПА и агар Хоттингера с добавлением глюкозы и теллурита калия и Оксфорд агар.

Результаты экспериментов с использованием культур листерий, стрептококков, золотистого стафилококка, сальмонелл, кишечной палочки показали, что на МПА и агаре Хоттингера с добавлением теллурита калия вырастали Е. coli, Bact. paracoli и иногда Salmonella choleraesuis. Их колонии в отличие от листерий имели сероватый цвет, а последние - металлический черный. На синтетическом элективном агаре полностью ингибировался рост стрептококков, сальмонелл, стафилококков, но иногда вырастали единичные колонии Б. coli и Bact. paracoli. Последние отличались от листерий большими размерами и сероватым цветом, тогда как колонии листерий имели черный металлический оттенок. Аналогичная картина наблюдалась и на Оксфорд агаре. Эффективность этих элективных сред подтвердилась и в опытах с посевом суспензии листерий с добавлением 10% взвеси фекалий. При этом наиболее высокая селективная эффективность достигалась при посеве данной суспензии в жидкую синтетическую элективную среду, которую инкубировали при 37°С в течение 12-16 часов, затем делали посевы на плотную элективную среду. При использовании такой процедуры вырастали чистые культуры листерий.

При выделении листерий из патологического материала от животных, павших от листериоза, использование синтетической элективной среды и Оксфорд агара позволяло выделить этих микроорганизмов в течение первых 2-3 суток. Таким образом, проведенные исследования показали, что по эффективности выделения листерий синтетическая элективная среда не уступает Оксфорд агару. При использовании двухэтапного способа (с предварительным обогащением в жидкой синтетической элективной среде и пересевом на плотную) эффективность выделения листерий превосходила Оксфорд агар.

Полученные результаты служили основанием для использования синтетической элективной среды в жидкой и плотной формах при выделении листе-рий из исследуемых объектов в дальнейших исследованиях.

2.23. Определение сроков выживания листерий в мясных и молочных продуктах. В связи с ограниченными конкретными данными по срокам выживания листерий в мясе и молочных продуктах в одной из серий опытов мы определяли сроки выживания листерий в искусственно контаминирован-ных ими мясе и молочных продуктах. Проведенные исследования показали, что в мясе при хранении при температуре 2...4°С на 7-е сутки количество листерий снижалось на 15,7%. Затем на 14 сутки отмечалось их увеличение почти на 11% по сравнению с предыдущим сроком. В последующие сроки исследо-

ваний (21-49 дни) наблюдалось постепенное отмирание листерий и уже через 54 дня они бактериологически не обнаруживались, хотя ПНР была положительной. Подобные сведения приводит К.С. Янковский (2000), который отмечает, что содержание листерий в охлажденном мясе при хранении при температуре 4...6°С первые 13 суток снижалось на 20-30%, а через 17 суток - на 4 порядка.

В наших опытах более высокая и продолжительная выживаемость листерий наблюдалась при хранении мяса при -20°С. При этом даже через 60 суток количество живых клеток было около 64,5% от исходного уровня, что согласуется с исследованиями К.С. Янковского (2000).

В искусственно контаминированном коровьем молоке листерий достаточно близком к исходному уровню (80-85%) сохранялись в течение первых 4-х суток, затем их количество снижалось и они не высевались через 12 суток. Следует отметить, что к этому сроку молоко полностью скисало. В кефире листерий отмирали значительно быстрее по сравнению со свежим молоком как в количественном отношении, так и по срокам, что, по-видимому, обусловлено ингибирующим действием на них кисломолочных микроорганизмов.

Таким образом, нами продемонстрировано длительное выживание лис-терий в мясе и молочных продуктах, что следует учитывать при их переработке и употреблении.

2.2.4. Исследования по выявлению Listeria monocytogenes в объектах внешней среды. На контаминированность Listeria monocytogenes бактериологическим методом нами было происследовано 533 объекта внешней среды, в том числе 92 пробы сточных вод предприятий по переработке мяса и молока, животноводческих ферм и жилых объектов, 153 пробы смывов с мясо и молоко перерабатывающих предприятий и животноводческих ферм, 101 проба воды из различных источников, 80 проб почвы, 107 проб растений. Из них 208 проб параллельно исследовали на наличие ДНК листерий полимеразной цепной реакцией.

В результате проведенных исследований объектов внешней среды бактериологически было выделено 11 культур листерий, что составляет 2,03% от общего количества проб. Полимеразная цепная реакция при полном совпадении с результатами бактериологических анализов дополнительно выявляла 10 контаминированных листериями объектов внешней среды. С учетом результатов ПЦР контаминированность объектов внешней среды Listeria monocytogenes достигала 3,94%, что свидетельствует о достаточно широкой распространенности возбудителя листериоза во внешней среде. В частности, отдельные пробы сточных вод мясо- и молочных комбинатов, смывов с цехов убоя и разделки мяса и овце- и свиноферм содержали листерий. Кроме того, листерий обнаруживались в речной, озерной и прудовой воде, иле, зеленой массе ржи, кукурузы и трав заболоченных пастбищ. Следовательно, заражение листерия-ми животных в период пастьбы и водопоя вполне возможно, что необходимо

учитывать при проведении противолистериозных мероприятий. Пробы воды из колодцев, родников и водопроводов не содержали листерий.

Загрязнение объектов внешней среды возможно обусловлено вывозом на поля недостаточно обезвреженного навоза и сточных вод, выделениями животных —листерионосителей.

Полученные нами результаты согласуются с результатами других исследователей (J. Watkins et al., 1984; Н. Geuenich, H. Muller, 1984; В.И. Гершун, 1984) и свидетельствуют о циркуляции листерий во внешней среде.

2.2.5. Анализ кормов на содержание Listeria monocytogenes. При бактериологических исследованиях 357 проб грубых, сочных кормов, кормовых добавок и кормов животного происхождения листерий были выделены в четырех случаях. В частности, листерий высевались из силоса кукурузного, комби-силоса, бобового сенажа и молотой зерносмеси. Однако ПЦР дополнительно выявляла наличие ДНК листерий еще в 6 пробах (импортной мясо-костной и рыбной муке, силосе кукурузном, сенаже бобовых, бобово-злаковом сенаже, свекле сахарной).

Таким образом, полученные нами данные подтверждают складывающееся мнение (В.И. Гершун, 1988; Г.П. Сомов, В.Ю. Литвин, 1988; В.И. Пушкаре-ва с соавт., 1997; Н.И. Гуславский с соавт., 2003) об отнесении листериоза к сопронозной инфекции. Как показали проведенные исследования, хотя конта-минированы листериями только около 2,5% кормов, но необходимость контроля их безопасности для недопущения вспышки листериоза среди животных является актуальной задачей ветеринарных работников.

2.2.5. Исследования контаминации Listeria monocytogenes растительных продуктов и сырья. При изучении контаминированности листерия-

ми растительных продуктов и сырья было исследовано всего 553 пробы бактериологически, из них 197 дополнительно ПЦР. Бактериологическими исследованиями было выделено 7 культур, что составляет 1,3% от общего количества. Результаты ПЦР совпадали с бактериологическими данными, но при этом дополнительно выявлялось наличие ДНК листерий еще в 4 пробах. Таким образом, количество контаминированных листериями растительных продуктов и сырья составляло около 2%. Листерий выявлялись в перловой крупе и рисе, смеси сухофруктов, редисе, свежей и квашеной капусте, картофеле.

Вероятно загрязнение листериями круп происходило грызунами, так как в них обнаруживались единичные комочки мышиного помета. Сухофрукты могли контаминироваться также грызунами или из рук фасовщиков и продавцов. О циркуляции листерий в популяциях грызунов в овощехранилищах г. Москвы и выделении этих микроорганизмов из хранящихся в них овощей сообщали Л.В. Родина с соавт. (2002).

В редис и картофель листерий, по-видимому, попали из почвы, т.к. в одной из проб чернозема методом ПЦР был получен положительный результат.

В капусту листерии могли попасть из почвы или поливными водами, либо в процессе подготовки к квашению и при их реализации.

2.2.7. Результаты анализа на содержание Listeria monocytogenes молока и молочных продуктов. Нами было подвергнуто бактериологическим исследованиям 410 проб молока и молочных продуктов и только в двух (свежем молоке и сыре "Сулугуни") выделены листерии, в то же время ПЦР была положительной в 5 пробах. При совпадении с показателями бактериологии дополнительно ДНК листерии выявлена в масле шоколадном, пастеризованном молоке и одной пробе сыра. Однако в наших исследованиях контамини-рованность листериями молока и молочных продуктов была около 1,2% (с учетом данных ПЦР), что несколько ниже показателей, которые были установлены Р.К. Шарма (1999). Следует отметить то, что Р.К. Шарма в основном исследовал продукты импортного происхождения, поступающие из Южной Азии. Результаты наших исследований свидетельствуют о возможности передачи лис'терий через растительные и молочные продукты.

2.2.8. Определение контаминации листериями мяса и мясопродуктов. Бактериологическим исследованиям было подвергнуто 288 проб свежего и замороженного мяса разных видов животных и птицы отечественного и зарубежного происхождения, а также мясные полуфабрикаты, из них 64 пробы дополнительно анализировали ПЦР. Из исследуемых объектов выделено 12 культур листерии, в т.ч. из замороженной импортной свинины, баранины, курятины, индюшатины, куриных окорочков и фарша куриного и индейки, а также пельменей и сосисок. Свободными от листерии оказались колбасные изделия и другие готовые к употреблению мясные продукты. При совпадении с данными бактериологического исследования ПЦР позволяла дополнительно выявить наличие ДНК листерии еще в 2 пробах, а именно в свежих куриных окорочках (Россия) и импортном курином фарше.

Следует отметить довольно высокую контаминированность листериями замороженных пельменей, где из 13 исследованных проб в двух (15,4%) выявлялось наличие листерии обоими методами. Относительно высокая контами-нированность листериями была у импортной баранины, в которой из 12 исследованных проб в двух выявлялись листерии.

Значительная контаминированность листериями обнаруживалась в импортных куриных окорочках, в частности, из 17 исследованных проб в двух обнаруживалось наличие листерии.

Полученные данные о контаминированности листериями мяса и мясных полуфабрикатов дополняют и расширяют имеющиеся отрывочные сведения по этому вопросу (P. Boerlin et al., 1997; Р.К. Шарма, 1999). По данным Р.К. Шарма (1999) до 20% импортируемых сыров и до 8% мясной продукции содержали листерии, а свиной фарш и свежая сырокопченая колбаса почти во всех случаях были контаминированы последними.

Результаты наших исследований подтверждают своевременность принятия и введения в действие с 1 июля 2002 года "Гигиенических требований к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов Сан ПиН 2.3.2.107801", утвержденных ГУ Сан врачом РФ. Данный документ предусматривает проверку пищевых продуктов (мяса, молока, мясо-молочных продуктов и др.) на наличие в них возбудителя листериоза. Согласно этих требований наличие листерий в 25 г продукта не допускается.

2.2.9. Биологические свойства выделенных культур листерий. В

процессе работы за 1999-2003 годы нами было подвергнуто бактериологическим исследованиям 2141 проба различных объектов ветеринарного и медико-санитарного надзора, из них выделили 32 изолята, по предварительным анализам, сходные с листериями. Поэтому представлял интерес изучение этих изо-лятов для уточнения принадлежности к Listeria monocytogenes и определения их биологических свойств. ПЦР при полном совпадении с результатами бактериологических исследований выявила дополнительно наличие ДНК листерий еще в 22 пробах.

В результате изучения морфологических и культурально-биохимических свойств выделенных культур в сравнении с типичными представителями Listeria monocytogenes, относящихся к разным серотипам, установили, что все отобранные 32 изолята относятся к Listeria monocytogenes. В мазках из молодых культур (12-16 часов) они окрашивались по Граму положительно, имели форму коротких палочек с закругленными концами. В первых генерациях отдельных изолятов (СТВЖО, ЗМК, МК, ИК,~ОИ, СВр, Сул), выделенных из сточных вод жилого объекта, зеленой массы кукурузы, коровьего молока, курятины, индейки, сухофруктов и сыра "Сулугуни" соответственно наблюдались признаки диссоциации: в мазках они имели форму длинных нитей и тяжей, но окрашивались по Граму положительно. После 3-5 пересевов на обычных питательных средах (МПБ, МПА, БХ, агар Хоттингера) они приобретали типичную для листерий морфологию.

Одно-, двух- суточные колонии, выросшие на МПА, у большинства культур имели ровные края и гладкую поверхность. Однако у части культур (СТВЖО, ЗМК, МК, ИК, ОИ, СВр, Сул) отмечалась небольшая шероховатость краев колоний.

Наши данные подтверждают наличие полиморфизма и диссоциации у этих микроорганизмов, о чем подчеркивают ряд исследователей (X. Зеелигер. 1959; И.А. Бакулов, 1967; О.А. Котылев, 1974; И.С. Тартаковский с соавт., 2002 и др.). Это свойство листерий необходимо учитывать при первичном выделении их из разных объектов.

Все выделенные культуры, также как и известные штаммы листерий, оказались факультативными аэробами, о чем свидетельствует их рост в полужидком агаре под вазелиновым маслом в виде "нераскрытого зонта". Харак-

терной их особенностью являлось закисление среды, особенно при культивировании в питательных средах, содержащих глюкозу.

Выделенные культуры, так же как и известные штаммы интенсивно расщепляли глюкозу, фруктозу и рамнозу с образованием кислоты без газа и они относительно слабо разлагали салицин и мальтозу. Изменение цвета среды Гисса с последними углеводами наблюдалось на 2-3 сутки, а с первыми тремя

- на I сутки. Характерным для них являлась инертность в отношении ксилозы, маннита и арабинозы.

Все исследуемые вновь выделенные и известные культуры обладали подвижностью, каталазной, редуцирующей и оксидазной активностью, не проявляли уреазную, протеолитическую и ДНК-азную активность. В то же время они проявляли гемолитическую и лецитиназную активность. Все культуры не вырабатывали индол, продуцировали сероводород при культивировании в бульоне Хоттингера. Следовательно, морфологические и культурально-биохимические свойства выделенных культур соответствовали известным признакам, характерными для Listeria monocytogenes, которые описаны многими исследователями (А.А. Триполитова, Г.В. Борисова, 1965; И.А. Бакулов, 1967; Х.Н. Макаев, 1972; И.С. Тартаковский с соавт., 2002 и др.).

Значительный интерес представляло определение патогенных и агглю-тинабельных свойств выделенных культур. Для этого нами проводилось внут-рибрюшинное заражение белых мышей. Минимальная смертельная доза (МЛД) даже у вирулентных тест-штаммов варьировала в значительном диапазоне: от 62 500 до 250 000 м.к. Наиболее высокая вирулентность была у штамма А-исходный, который используется в лаборатории для контрольного заражения и периодически освежается заражением белых мышей.

У других штаммов (9-129, 9-130. 9-72), длительно хранившихся в коллекции лаборатории, МЛД оказалась на уровне 250 000 м.к., а у штамма 9-128

- 125 000 м.к. У вакцинного штамма листерий "АУФ" МЛД для белых мышей составляла 2,5 млрд. м.к.

Большинство выделенных культур вызывали гибель белых мышей при внутрибрюшинном заражении в дозах 250 000 - 500 000 м.к., а у части культур, имеющих признаки диссоциации (СТВЖО, ЗМК, СФр, ИК, Сул, ОИ), МЛД оказалась на уровне 1 млн. м.к. Следовательно, эти культуры обладают достаточно выраженной патогенностью для лабораторных животных и могут представлять опасность для животных и человека. В частности, И.А. Бакулов (1967), Х.Н. Макаев (1971), О.А. Котылев (1974) отмечали, что вирулентные штаммы листерий вызывают гибель белых мышей в дозах 250 000 - 1 млн. м.к. в зависимости от способа заражения, что согласуется с нашими данными.

При постановке конъюнктивальной пробы с отдельными изолятами на морских свинках так же была установлена их патогенность, так как они вызывали гнойный кератоконъюнктивит, характерный для возбудителя листериоза.

Определением агглютинабельных свойств выделенных культур установили, что они все хорошо агглютинировались поливалентной листериозной

сывороткой. Из 32, выделенных из разных объектов культур, 28 взаимодействовали с листериозной сывороткой I серогруппы (0-П) и лишь 4 (12,5%) изоля-та, выделенные из импортной баранины, курятины, окорочков куриного и индюшки, не реагировали с сывороткой I серогруппы и давали выраженную агглютинацию с сывороткой II серогруппы (I-V, VI).

Таким образом, все 32 выделенные культуры по биологическим свойствам отнесены к Listeria monocytogenes и являются патогенными для лабораторных животных.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что на территории Московской области, г. Москвы, Республики Татарстан циркулируют преимущественно л истерии, относящиеся к I серогруппе (87,5%) и лишь 12,5% культур, выделенных из импортных мясных продуктов, относятся ко II серогруппе.

Для подтверждения эпидемического и эпизоотического значения, кон-таминированных листериями отдельных объектов, нами проводились исследования по определению их опасности для лабораторных животных. Для этого естественно контаминированной листериями зерносмесью кормили белых мышей в течение 7 дней. Наблюдениями за этими животными в течение 1 месяца заболевания листериозом не установили. Поэтому в повторном эксперименте через 3 дня после начала кормления белых мышей естественно инфицированной зерносмесью, им ввели подкожно по 0,5 мл 0,1%-ного раствора дек-стран сульфата. На 17-24 дни после начала опыта из 10 белых мышей 6 пали с явлениями парезов и параличей конечностей и нервной клиникой. При бактериологических исследованиях от них выделялись культуры листерий, биологические свойства которых были сходны с исходной культурой, выделенной из зерносмеси.

В опытах на морских свинках с кормлением их естественно инфицированной рисовой крупой на фоне обработки декстран сульфатом так же была установлена возможность заражения. В частности, из трех морских свинок 2 пали от листериоза через 16 и 20 дней после начала опыта. Таким образом, нами установлена опасность контаминированных листериями кормов для животных.

Обработка декстран сульфатом животных способствовала проявлению листериоза, так как данный препарат угнетает макрофагальную систему. Ибо известно, что листериозу наиболее чувствительны.организмы со сниженной резистентностью и на фоне применения.иммуно-депрессантов (J. Rello et al., 1987). Кроме того, при постановке биопробы рекомендуется обработка лабораторных животных гидрокортизоном.

В наших экспериментах продемонстрирована эффективность использования для воспроизведения листериоза при заражении малыми дозами листе-рий декстрана сульфата 500 000.

При количественном определении контаминации листериями зерносме-си, сыра, сосисок и замороженных пельменей установили, что содержание в

них листерий не большое и составляет от 38,7±3,4 до 162,3+7,2 К0Е/100 г. По данному вопросу результаты наших исследований согласуются с данными Р.К. Шарма (1999), который при приблизительном подсчете в 16 пробах свиного фарша установил, что в 15 из них содержание листерий варьировало от 10 до 100 м.кУг и лишь в одной было свыше 1000 м.кУг.

Относительно низкое количественное содержание листерий в исследуемых объектах, по-видимому, объясняется отсутствием благоприятных условий для их размножения и возможно и частичным отмиранием в процессе хранения, либо неравномерным распределением микробных клеток в этих кормах и продуктах.

Обобщая результаты проведенных исследований, можно констатировать о том, что они позволили выявить контаминированность различных объектов возбудителем листериоза и установить циркуляцию их в природе, сырье и продуктах растительного и животного происхождения. Выделенные культуры листерий соответствовали типичным представителям возбудителя листериоза и обладали патогенностью.

При сравнительных опытах по обнаружению листерий в различных объектах установлена пригодность и эффективность синтетической элективной среды, а также высокая результативность ПНР для обнаружения ДНК листерий. Данный метод обеспечивает быстрое и надежное выявление наличия ДНК листерий в различных объектах независимо от присутствия в них посторонней микрофлоры за 4-5 часов. В связи с этим ПЦР может быть использована более широко в лабораторной практике, особенно для обнаружения контаминиро-ванности листериями пищевых продуктов и кормов.

Выводы.

1. Оптимизированы методика подготовки проб для анализа и режим ПЦР с праймерами L1 и L2, амплифицирующими фрагмент ДНК с длиной 174 п.н. гена Listeria monocytogenes hly А, кодирующего синтез гемолизина, которые обеспечивают индикацию листерий в различных объектах ветеринарного и медико-санитарного надзора за 4-5 часов с чувствительностью, эквивалентной геному 10 микробных клеток.

2. ПЦР высокоспецифична, по быстроте получения результата и по эффективности значительно превосходит бактериологический метод индикации, особенно при обнаружении листерий в сильнозагрязненных посторонней микрофлорой объектах и при низком их содержании.

3. Сроки выживания возбудителя листериоза в молочных продуктах и мясе варьируют от 8 дней до нескольких месяцев в зависимости от вида продукта и температурного режима хранения. В замороженном мясе через 2 месяца при хранении при -20°С сохраняли свою жизнеспособность 64,5% листерий от исходного уровня.

4. При исследовании 2141 различных объектов ветеринарного и медико-санитарного надзора возбудитель листериоза изолирован из 32 проб. ГЩР при полном совпадении с результатами бактериологического анализа дополнительно выявляла наличие ДНК листерий еще в 27 пробах. Листерии обнаруживались в отдельных пробах речной и озерной воды, сточных водах и смывах с животноводческих, мясо- и молокоперерабатывающих предприятий, почве, растениях, кормах, молоке и молочных продуктах, мясе и мясных полуфабрикатах. Контаминированными возбудителем листериоза оказались в среднем 2,76% исследованных проб.

5. Количественное содержание листерий в отдельных исследуемых объектах (зерносмесь молотая, сыр, сосиски, пельмени замороженные) составляло 38,7±3,4 -162,3±7,2 микробных клеток в 100 г.

6. Изучением свойств 32 выделенных из различных объектов культур установлено, что все они обладают патогенностью для лабораторных животных и по биологическим свойствам соответствуют известным представителям Listeria monocytogenes.

7. На территории Республики Татарстан, Московской области и г. Москвы циркулируют преимущественно листерии I серогруппы и лишь 12,2% из числа выделенных изолятов относились ко второй серогруппе, которые были выделены из импортного мяса и мясных полуфабрикатов.

8. Естественно контаминированные листериями объекты представляют эпизоотическую и эпидемиологическую опасность, о чем свидетельствуют данные экспериментов с кормлением их лабораторным животным (белым мышам и морским свинкам).

Практические предложения

1. Для анализа контаминированности возбудителем листериоза объектов ветеринарного и медико-санитарного надзора целесообразно проводить ГЩР согласно "Методических рекомендаций по подготовке проб для анализа" и по оптимизированному нами режиму проведения ПНР, утвержденных директором ВНИВИ (12 сентября 2000 г. и 19 августа 2002 г. соответственно).

2. При выделении листерий из различных объектов для первичного обогащения целесообразно использование синтетической элективной среды.

3. При постановке биопробы для усиления чувствительности белых мышей и морских свинок к листериозу их целесообразно обработать декстран сульфатом в дозе 0,5 и 2,5 мг/гол соответственно.

4. Полученные данные следует учитывать в борьбе с листериозом и усилить ветеринарно-санитарный и медико-санитарный мониторинг за объектами внешней среды, кормов, сырья животного и растительного происхождения, пищевых продуктов и особенно мясных полуфабрикатов.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Алимов М.А. Применение полимеразной цепной реакции для индикации возбудителя листериоза / Фаизов Т.Х., Гришкевич Н.М., Алимов М.А. // Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 50-летию Центра военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ "Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария. -Екатеринбург. -1999. -С.250.

2. Алимов М.А. Полимеразная цепная реакция: новые возможности лабораторной диагностики особо опасных инфекционных болезней / Фаизов Т.Х., Гришкевич Н.М. // Тез. докладов Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИТИБП.

3. Алимов М.А. Выделение листериозных антигенов и их иммунохими-ческая характеристика / Гришкевич Н.М., Фаизов Т.Х., Алимов М.А. // Материалы Международной конференции, посвященной 70-летию образования зооинженерного факультета. Инфекционные и инвазионные болезни. -Казань. -2000.-С.47-48.

4. Алимов М.А. Произвольные праймеры: Новые возможности идентификации бактерий / Фаизов Т.Х., Алимов М.А. // Материалы Международной конференции, посвященной 70-летию образования зооинженерного факультета. Инфекционные и инвазионные болезни. -Казань. -2000. - С. 141-142.

5. Алимов М.А. Использование ПЦР для обнаружения листерий в пищевых продуктах / Фаизов Т.Х., Алимов М.А. // Материалы научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (часть 1). -Казань. -2001. -С.92-93.

6. Алимов М.А. Контаминированность продуктов и кормов Listeria monocytogenes / Алимов М.А., Фаизов Т.Х., Сазонова ТЯ. II Материалы научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (часть 1). -Казань. -2002. -С.5-6.

7. Алимов М.А. ПЦР-анализ контаминированности продуктов и кормов Listeria monocytogenes / Алимов МА // Сб. тезисов 4-ой Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний". -Москва. -2002. -С.315.

8. Алимов М.А. Выявление Listeria monocytogenes в объектах ветеринарного надзора / Алимов М.А. // Ветеринарная патология. -2003. -№1(5). — С.141-142.

Подписано в печать Заказ №42 Тираж 100 экз.

Формат 60 х 84 1/16 Усл.печл. 1п.л.

Офсетный участок ВНИВИ (Казань)

^ 5 0 0 7

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Алимов, Марат Азатович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Современные методы индикации л истерий.

2.2. Идентификация и типирование культур Listeria monocytogenes.

2.3. Контаминированность продуктов и кормов листериями.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Материалы и методы исследований.

3.2. Результаты собственных исследований.

3.2.1. Оптимизация ПЦР для анализа проб из объектов ветеринарного надзора.

3.2.2. Сравнительная оценка эффективности различных питательных сред и условий культивирования при выделении Listeria monocytogenes.

3.2.3. Определение сроков выживания листерий в мясных и молочных продуктах.

3.2.4. Исследования по выявлению Listeria monocytogenes в объектах внешней среды.

3.2.5. Анализ кормов на содержание Listeria monocytogenes.

3.2.6. Исследования контаминации Listeria monocytogenes растительных продуктов и сырья.'.

3.2.7. Результаты анализа на содержание Listeria monocytogenes молока и молочных продуктов.

3.2.8. Определение контаминации листериями мяса и мясопродуктов.

3.2.9. Биологические свойства выделенных культур листерий.

3.2.9.1 Результаты изучения культурально-морфологических и биохимических свойств изолятов.

3.2.9.2 Определение вирулентности и агглютинабельности выделенных изолятов.

3.2.9.3 Изучение опасности контаминированных листериями объектов для лабораторных животных.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Контаминированность объектов ветеринарного надзора возбудителем листериоза и биологические свойства выделенных культур листерий"

Актуальность проблемы. Несмотря на то, что с первого установления листериоза у животных прошло более 100 лет, проблема этой инфекции привлекает все возрастающее внимание ветеринарных и медицинских работников. Это обусловлено широкой распространенностью листерий в природе, увеличением числа заболевших листериозом людей, высоким уровнем летальности при генерализированных формах инфекции, бессимптомным листерионосительст-вом, значительным экономическим ущербом от заболеваемости и падежа сельскохозяйственных животных и затратами на профилактические мероприятия (J. Evans et al., 1985; S. Ortel, 1983, 1989; I. Carnie, 1991; И.А. Бакулов с соавт., 1991, 1994; B.M. Котляров, 1999; А.В. Книзе, А.И. Бузун, 1999; В.В. Красов-ский с соавт., 2000; Г.М. Маненкова с соавт., 2000; И.И. Гуславский с соавт., 2003; Л.В. Родина с соавт., 2003).

Возбудитель листериоза выделен от более 90 видов диких и домашних животных, птиц, рыб, насекомых и клещей (P. Andre, 1966; Г.Р. Искаков, 1966; И.А. Бакулов, 1999; В.И. Гершун, 1988; И.С. Тартаковский с соавт., 2000; И.А. Бакулов, В.М. Котляров, 2003). Листерии, обладая выраженными адаптивными способностями и высокой метаболической лабильностью, могут не только длительно выживать в объектах окружающей среды и различных природных субстратах, но и размножаться в них, а также переходить от сапрофической фазы к паразитической и наоборот. В связи с этим наряду с традиционными представлениями о связи листерий с теплокровными животными отдельные исследователи рассматривают листериоз как типичную сапронозную инфекцию (Г.П. Сомов, В.Ю. Литвин, 1988, 1996; В.Ю. Литвин с соавт., 1996; В.И. Пушкарева с соавт., 1997).

Начиная с 80-х годов прошлого века в результате многолетних эпидемических вспышек и спорадических случаев листериоза среди людей в ряде высокоразвитых стран (США, Великобритания, Канада, Франция, Швейцария), возникших в результате употребления готовых пищевых продуктов, данное заболевание стали рассматривать как пищевую инфекцию (В. Gellin, С. Broome et al., 1991; J. Farber, P. Peterkin, 1991; И.А. Бакулов с соавт., 1991; И.С. Тартаков-ский с соавт., 1994).

Хотя в Российской Федерации заболеваемость людей листериозом официально регистрируется начиная с 1992 года, но отсутствие эффективной системы санитарно-эпидемиологического надзора за этой инфекцией во всех регионах страны и неудовлетворительное состояние лабораторной диагностики не позволили установить реальное значение листерий в патологии человека, так как диагностика листериоза чаще всего была связана с работой ветеринарных специалистов или энтузиазмом отдельных исследователей (Э.Ф. Опочинский с соавт., 1999; В.М. Котляров, 1999; А.В. Книзе с соавт., 1999).

Следует отметить и недостаточную изученность контаминированности возбудителем листериоза продуктов, кормов и других объектов ветеринарного и медико-санитарного надзора, о чем свидетельствуют лишь единичные сообщения в отечественной литературе (В.И. Гершун, 1983; Д.А. Васильев, 1992; И.А. Бакулов с соавт., 1997; Р.К. Шарма, 1999; Г.М. Маненкова с соавт., 2000). Они указывают на циркуляцию листерий в природе, растительной и животноводческой продукции, что свидетельствует о необходимости систематического их контроля на наличие листерий. Однако применяющиеся лабораторные исследования при обнаружении листерий основаны на бактериологических методах (Н.Э. Минаева, В.И. Ладный, 1999; Э.Ф. Опочинский с соавт., 1999). Низкая чувствительность диагностических препаратов, длительность сроков проведения анализа, высокие цены селективных питательных сред не позволяют в полной мере определять состояние инфицированности листериями продуктов и кормов и установить истинное положение и уровень заболеваемости людей и животных листериозом (Т.М. Маненкова с соавт., 2000). Поэтому разработка и внедрение в лабораторную практику высокочувствительных и экспресс-методов индикации листерий остается актуальной проблемой. В этом аспекте большой интерес представляет полимеразная цепная реакция, которая по данным отдельных авторов (S. Kholer et al., 1990; С.А. Ермолаева с соавт., 1994; А. Bubert et al., 1997; М. Monzano et al, 1997; B.B. Красовский с соавт., 2000; И.С. Тартаковский с соавт., 2001) обладает высокой чувствительностью и эффективностью. Однако ПЦР пока еще не получила практического применения из-за недостаточной ее апробации в лабораторной практике в сравнительном аспекте. Поэтому систематические исследования контаминированности объектов ветеринарного надзора листериями и изучение биологических свойств циркулирующих штаммов листерий стали насущной проблемой, решение которой может способствовать установлению эпизоотического и эпидемического значения контаминированных листериями объектов и проведению целенаправленных мероприятий по недопущению возникновения листериоза среди людей и сельскохозяйственных животных.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось определение контаминированности объектов ветеринарного надзора возбудителем листериоза бактериологическим методом и ПЦР, а также изучение биологических свойств выделенных культур.

Для достижения данной цели были выдвинуты следующие задачи:

2. Сравнительно оценить эффективность различных питательных сред для выделения возбудителя листериоза.

3. Определить сроки выживания листерий в мясных и молочных продуктах.

5. Изучить основные биологические свойства выделенных культур листерий.

Научная новизна. Впервые широкомасштабными систематическими исследованиями бактериологическим методом и полимеразной цепной реакцией установлена степень контаминированности различных объектов внешней среды, кормов, пищевых продуктов, сырья растительного и животного происхождения возбудителем листериоза и их биологическая опасность для животных. Изучением биологических свойств 32 выделенных культур Listeria monocytogenes показано, что на территории Республики Татарстан, Московской области и г. Москвы циркулируют патогенные листерии преимущественно I серогруп-пы, а с импортными мясными продуктами и полуфабрикатами попадают представители II серогруппы (12.2% от общего количества выделенных культур).

Практическая значимость. Для первичного выделения листерий из различных объектов рекомендуется синтетическая элективная питательная среда, которую можно использовать в жидкой и плотной формах, что повышает эффективность обнаружения возбудителя листериоза.

Выявленную значительную контаминированность объектов ветеринарного надзора возбудителем листериоза и их способность длительно сохраняться в продуктах, кормах и объектах внешней среды необходимо учитывать при проведении противоэпидемических и противоэпизоотических мероприятий, в процессе переработки продукции растениеводства и животноводства, а при подготовке пищи соблюдать режим термической обработки.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на: Юбилейной научной конференции, посвященной 50-летию Центра военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ (Екатеринбург, 1999); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИТИБП (Щелково, 2000); Международной научной конференции, посвященной 70-летию образования зооинженерного факультета КГАВМ (Казань, 2000); Научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2001, 2002 г.г.); IV Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" (Москва, 2002); Международной научной конференции "Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине" (Москва, 2003) и ежегодных научных отчетных сессиях ВНИВИ за 1999-2003 г.г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Выживаемость листерий в мясе и молочных продуктах при различных режимах хранения.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Работа изложена на 152 страницах, содержит 17 таблиц и 7 рисунков. Список использованной литературы включает 246 источников, в том числе 155 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Алимов, Марат Азатович

110 выводы

4. При исследовании 2141 различных объектов ветеринарного и медико-санитарного надзора возбудитель листериоза изолирован из 32 проб. ПЦР при полном совпадении с результатами бактериологического анализа дополнительно выявляла наличие ДНК листерий еще в 27 пробах. Листерии обнаруживались в отдельных пробах речной и озерной воды, сточных водах и смывах с животноводческих, мясо- и молокоперерабатывающих предприятий, почве, растениях, кормах, молоке и молочных продуктах, мясе и мясных полуфабрикатах. Контаминированными возбудителем листериоза оказались в среднем 2,76% исследованных проб.

5. Количественное содержание листерий в отдельных исследуемых объектах (зерносмесь молотая, сыр, сосиски, пельмени замороженные) составляло 38,7±3,4- 162,3±7,2 микробных клеток в 100 г.

6. Изучением свойств 32 выделенных из различных объектов культур усс тановлено, что все они обладают патогенностью для лабораторных животных и по биологическим свойствам соответствуют известным представителям Listeria monocytogenes.

7. На территории Республики Татарстан, Московской области и г. Москвы циркулируют преимущественно листерии I серогруппы и лишь 12Д% из числа выделенных изолятов относились ко второй серогруппе, которые были выделены из импортного мяса и мясных полуфабрикатов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для анализа контаминированности возбудителем листериоза объектов ветеринарного и медико-санитарного надзора целесообразно проводить ПЦР согласно "Методических рекомендаций по подготовке проб для анализа" и по оптимизированному нами режиму проведения ПЦР, утвержденных директором ВНИВИ (12 сентября 2000 г. и 19 августа 2002 г. соответственно).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алимов, Марат Азатович, Казань

1. Аксенов М.Ю., Гинцбург А.Л. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью метода полимеразной цепной реакции // Ж. Молекул, генетика, микроб., вирусол. -1993. -№4. -С.3-8.

2. Алимов A.M. Изучение аминокислотного обмена и иммунохимии листерий различной вирулентности: Автореф. дисс. канд. биол. наук. -Казань. -1974. -28с.

3. Алимов A.M., Котылев О.А. Сравнительная оценка питательных сред при культивировании листерий штамма АУФ // Ученые записки КГВИ. Том 119. -Казань. -1975. -С. 158-162.

4. Алимов A.M., Котылев О.А., Хазипов Н.З. Синтетическая элективная среда для выделения листерий. Авт. свидетельство № 784334 от 1 августа 1980г.

5. Алимов A.M., Фаизов Т.Х., Шилова В.И. Идентификация возбудителей отдельных зооантропонозов методом молекулярной гибридизации // Матер, научной конференции ВНИИВВиМ. Часть II. -Покров. -1992. -С.218.

6. Алимов A.M., Фаизов Т.Х. Молекулярная ДНК/ДНК-гибридизация для идентификации возбудителей зоонозов // Тезисы докладов. Республ. научно-произв. конф. -Казань. -1992. -СЛ.

7. Алимов A.M., Фаизов Т.Х. Молекулярно-гибридизационные тест-системы для идентификации возбудителей инфекционных болезней // Матер, научно-произв. конф. по проблемам ветеринарии и животноводства. -Казань. -1994. -С.15.

8. Алимов A.M., Фаизов Т.Х. Биотехнологические аспекты повышения эффективности диагностики и профилактики инфекционных болезней животных // Матер. Межд. научной конф., посвящ. 125-летию академии. -4.1. -Казань. -1998. -С.11-12.

9. Аскарова А.Н. ПЦР в анализе генома. Учебно-методическое пособие к занятиям по курсу "ДНК-диагностика". -Казань. -2000. -34с.

10. Бакулов И.А. Листериоз сельскохозяйственных животных. М. "Колос".-1967.-296с.

11. Бакулов И.А. Основные вехи в изучении листериоза животных и людей // Матер. Междунар. симпозиума. -Покров. -1999. -С.43-48.

12. Бакулов И.А., Котляров В.М. Непрямой метод флуоресценции антител при диагностике листериоза // Ветеринария. -1968. -№8. -С. 19-21.

13. Бакулов И.А., Котляров В.М., Турова Т.П., Бакалдина И.Б., Иванова Т.Л. Идентификация листерий с помощью метода молекулярной ДНК/ДНК-гибридизации // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. -19Q8. -№7. -С.31-35.

14. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Листериоз как пищевая инфекция // Вопросы диагностики и профилактики. -Ульяновск. -1991.

15. Бакулов И.А., Котляров В.М., Душко Т.И. Листериоз пищевая инфекция (масштабы, опасность, методы индикации и меры борьбы) // Ветеринария.-1991.-№4. -С.32-36.

16. Бакулов И.А., Котляров В.М., Шестиперова Т.И. Эпидемиологические и эпизоотологические аспекты листериоза // Ж. Микробиол. -1994. -№5. -С. 100-105.

17. Белохвостов А.С. Полимеразная цепная реакция и лигазные реакции, принципы, традиционные методики и нововведения // Молекул, генетика, микроб. и вирусол. -1995. -№2. -С.21-25.

18. Берги. Определитель бактерий Берги. -М. -1997. -Т.2.

19. Булат С.А., Кабоев O.K., Мироненко Н.В., Ибатуллин Ф.М., Лучкина JI.A., Суслов А.В. ПЦР с универсальными праймерами для изучения геномов // Генетика. -1992. -№5. -С. 19-28.

20. Бутко М.П. Исследования по изысканию элективной среды для выделения возбудителя листериоза из органов и тканей убойных животных // Труды ВНИИВС. -1972. -T.XLI. -С. 126.

21. Бутко М.П. Эффективность некоторых сред и способов выделения возбудителя листериоза из биологического материала // Труды ВНИИВС. -1972.-T.XLI. -С. 114.

22. Бутко М.П. Изучение стимулирующего действия некоторых веществ на рост листерий // Труды ВНИИ вет. санитарии. -1974. -48. -С.35-44.

23. Васильев Д.А., Барышников П.И. Сравнительная оценка листериоз-ных антигенов в ИФА // Тезисы докладов научн. конф. ВНИИВВиМ и ВНИЯИ. -Владимир. -1987. -С.43-44.

24. Васильев Д.А., Белоусов В.Е., Барышников П.И. О серологической диагностике листериоза // Ветеринария. -1988. -№10. -С.61-65.

25. Васильев Д.А., Барышников П.И. Использование ИФА при диагностике листериоза//Ветеринария. -1989. -№4. -С.60-62.

26. Васильев Д.А. Вопросы эпизоотологической и эпидемиологической взаимосвязи пищевого листериоза // Тезисы докладов III Всесоюзн. конф. по эпизоотологии. -Новосибирск. -1991. -С.319-321.

27. Васильев Д.А. Роль пищевых продуктов в распространении листериоза // Ветеринария. -1992. -№4. -С.46-48.

28. Васильев Д.А. Теоретическое обоснование и разработка основных направлений в профилактике пищевого листериоза: Автореф. дисс. докт. биол. наук. -Москва. 1994. -45с.

29. Гершун В.И. Влияние температурного режима на популяцию листерий в объектах внешней среды // Ветеринария. -1983. -№8. -С.28-30.

30. Гершун В.И. Экология листерий и пути их циркуляции в природном очаге // В сб.: Экология возбудителей сапронозов. М. -1988. -С.80-85.

31. Гинцбург А.Д., Зигангирова Н.А., Романова Ю.М. Современное состояние и перспективы молекулярно-генетических методов в решении задач медицинской микробиологии // Микробиология. -1999. -№5. -С.22-26.

32. Говорун В.М. Новые направления в ДНК-диагностике // Матер. II Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт. Конф. "По-лимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний". -Москва. -1998. -С.12-14.

33. Гукасян JI.A. , Трифонов В.М. Сравнительная оценка цистин-теллурит сывороточного и кровяного теллуристого агаров в бактериологической диагностике дифтерии// Лаб. дело. -1971. -№12. -С.749-750.

34. Егорова А.П. Серологическая диагностика листериоза. Сообщ. 1. Значение реакций агглютинации и связывания комплемента в диагностике листериоза у беременных // ЖМЭИ. -1965. -№7. -С. 132-138.

35. Егорова Л.С., Березкина Г.В. Получение и испытание листериозного эритроцитарного диагностикума для РИГА // Природноочаг. болезни человека. -Омск. -1986. -С.35-39.

36. Ермолаева С.А., Зигангерова Н.А., Маракуша Б.И., Тартаковский Н.С., Прозоровсикй С.В. Видоспецифическое выявление Listeria monocytogenes методом направленной амплификации ДНК // Мол. ген., микробиол., вирусол. -1994. -№1. -С.26-30.

37. Ермолаева С.А., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С. Изменение уровня экспрессии факторов вирулентности Listeria monocytogenes под влиянием внешних условий//Мол. ген. микробиол. мирусол. -2000. -№1. -С.17-19.

38. Ермолаева С.А., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С. Свидетельства ауто-регуляции экспрессии секретируемых белков Listeria monocytogenes // ЖМЭИ. -2000. -№5. -С.3-6.

39. Жаргалова Т.Т., Котляров В.М., Цыбанов С.Ж. Современные методы типирования листерий // Сб. статей: Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных. -Покров. -2000. -С.252-255.

40. Зеелигер X. Листериоз // Перев. с немецк. Огрызкова С.Е., Балыбер-дина Н.С. -М. -1959. -303с.

41. Искаков Г.Р. Листерионосительство у ондатр // Ветеринария. -1966. -№7. -С.44-45.

42. Карликанова Н.Р., Куваева И.Б., Карликанова Н.С. Листерии в молоке и молочных продуктах // Москва. -Углич. -1999.

43. Книзе А.В., Бузун А.И. Эпизоотическая ситуация по листериозу в странах мира и России // В сб.: Листериоз на рубеже тысячелетий. -Покров. -1999. -С. 118-122.

44. Кожаева Д.К. Изучение устойчивости Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica в мясных продуктах при СВЧ-обработке: Автореф. дисс. канд. биол. наук. -Ульяновск. -2000. -20с.

45. Кольпикова Т.И., Бакулов И.А., Котляров В.М. Использование листе-риозных бактериофагов при диагностике и индикации листерий // В сб.: Листе-риоз на рубеже тысячелетий. -Покров. -1999. -С.64-67.

46. Кольпикова Т.И., Котляров В.М., Фирсова Т.Е. Опасна ли Listeria in-nocua? // Сб. статей: Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных. -Покров. -2000. -С.273-274.

47. Костенко Ю.Г., Шагова Т.С., Янковский К.С. Листерии — критерий безопасности мясных продуктов // Мясная индустрия. -1997. -№3. -С.23-24.

48. Костенко Ю.Г., Шагова Т.С., Янковский К.С. Жизнеспособность листерий под влиянием факторов производства мясных продуктов // Technologia mesa (Югославия). -1997. -№4. -С.163-165.

49. Красовский В.В., Похил С.И., Лиманский А.П., Лиманская О.Ю., Тимченко Е.Н. Разработка и апробация метода полимеразной цепной реакции для детекции возбудителя листериозной инфекции // Клиническая лаб. диагностика. -2000. -№6. -С.37-41.

50. Красовский В.В., Васильев Н.В., Деркач С.А., Похил С.И. Итоги пятилетнего изучения листериоза на Украине // Микробиология. -2000. -№3. -С.80-85.

51. Красовский В.В., Надтока B.JL, Похил С.И. Листериозное бактерионосительство: Метод санации // Микробиол. -2000. -№3. -С.18-20.

52. Кривоносова О.В., Мелехов П.П., Бакулов И.А. Изыскание элективных питательных сред для выделения листерий // Ветеринария. -1970. -№9. -С.48-50.

53. Лемешкина Л.П. Листериоз овец и меры борьбы с ним // -Алма-Ата. -"Кайнар".-1972.-78с.

54. Листериоз. Методические рекомендации (№11) Комитета здравоохранения г. Москвы. -2001.

55. Маненкова Г.М., Родина Л.В., Цвиль Л.А. Эпидемическая ситуация по листериозу в г. Москве // Сб. статей: Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных. -Покров. -2000. -С.258-264.

56. Маракуша Б.И., Дарвиш К., Тартаковский И.С. Характеристика штаммов Listeria monocytogenes, выделенных в России и их типирование с помощью пульс-электрофореза//Журн. Микробиол. -1996. -№3. -С.60-64.

57. Мартолеки Г.М. Получение и применение групповых люминесци-рующих листериозных сывороток // Тр. ВНИИ вет. санитарии. -1974. -№48. -С.45-51.

58. Методические рекомендации по лабораторной диагностике листериоза животных и людей. -М. -1987. -68с.

59. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Методические указания. МУК 4.2.1122-02. Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах. МЗ России. М. -2002. -32с.

60. Минаева Н.Э., Ладный В.И. Микробиологические аспекты эпидемиологии листериоза// Матер. Междунар. симпозиума. -Покров. -1999. -С. 137.

61. Негода К.В., Литвиненко В.В., Бирюков Н.И. Сонкина Н.А., Новосельцева Н.К. О роли бактериологических находок у коров // Тр. Калининградской научно-исслед. ветеринарной станции. -1970. -Вып.4. -С.67-71.

62. Неделичева С., Манев X., Бербатова П., Янакиева М. О контаминации листериями почв в городских условиях // Эпидемиол., микробиол. и инфекц. болезни. -1983. -№2. -С. 132-134.

63. Опочинский Э.Ф., Мохов Ю.В., Лукина З.А., Ясинский А.А. Анализ деятельности ЦГСЭН РФ по лабораторной диагностике листериоза // Материалы Международного симпозиума "Листериоз на рубеже тысячелетий". -Покров. -1999. -С.61-64.

64. Петров О.В. Серологическая типизация листерий с помощью реакции агглютинации // Бюлл. Всес. ин-та экспер. вет. -1971. -№11. -С.59-62.

65. Подкладчикова О.Н., Мишанькин Б.Н., Диконов Г.Г. ДНК-зонд для обнаружения Yersinia pestis и I сероварианта Yersinia pseudotuberculosis методом детекции специфических повторяющихся последовательностей ДНК // Мол. генетика. -1992. -С.9-10, 21-26.

66. Родина Л.В., Маненкова Г.М., Тимошков В.В. Эпидемиологические проявления эпизоотического процесса листериоза в популяциях грызунов Москвы // Эпидемиология и инфекционные болезни. -2002. -№2. -С. 12-13.

67. Родина JI.B., Маненкова Г.М., Тимошков В.В. Проблема листериоза в Москве // Тр. Межд. научно-практич. конф, поев. 45-летию института (ВНИ-ИВВиМ). Ветеринарно-медицинские аспекты зооатропонозов. -4.1. -Покров. -2003. -С.136-141.

68. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. -Минск. -1973. -319с.

69. Саики Р., Галентен У., Эрлих Г. Полимеразная цепная реакция // В кн.: Анализ генома. Методы. Под. ред. К. Дейвинга. Перев. с англ. Рудина А.В. с соавт. -М. "Мир". -1990. -С.176-190.

70. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы (Сан Пин 2.3.2.1078-01) "Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов", утв. ГУСан. врачом Российской Федерации 06.11.2001 с 1 июня 2002г.

71. Сиромашкова М., Манев X. Сравнительные данные о применении некоторых серологических реакций в диагностике листериоза // Эпидемиол., мик-робиол. и инфекц. болезни. -1983. -№2. -С. 147-150.

72. Стоянов Д., Манев X., Шиндарева И. Экспериментальное заражение белых мышей и морских свинок Listeria innocua // Эпидемиол., микробиол. и инфекц. болезни. -1981. -№4. -С.380-387.

73. Тартаковский И.С., Палей О.С., Опочинский Э.Ф., Лукина З.А., Прозоровский С.В. Листерии в инфекционной патологии человека // Современная концепция. ЗниСО. -1994. -№3. -С. 1-4.

74. Тартаковский И.С. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика // Клин, микробиол. антимикроб, химиотерапия. -2000. -2 (2). -С.20-30.

75. Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика // -М.: Медицина для всех. -2002. -200с.

76. Телишевская Л.Я., Трусова Л.Н. Влияние минеральных элементов на роль Listeria monocytogenes // Тез. докладов научно-произв. конф. (19-20 декабря 1974, ВГНКИ). -М. -1974. -С.145-147.

77. Триполитова А.А., Борисова Г.В. Листериоз // -Томск. -1965. -257с.

78. Фаизов Т.Х., Алимов A.M. Значение полимеразной цепной реакции в инфекционной патологии // Матер, научно-произв. конф. по проблемам ветеринарии и животноводства. -Казань. -1995. -С.4.

79. Шарма Р.К. Совершенствование бактериологического анализа для индикации листерий в продуктах, импортируемых в Россию: Автореф. дисс. канд. вет. наук. -Покров. -1999. -24с.

80. Шафикова Н.Э. Энергетические процессы у листерий при культивировании и взаимодействии с макрофагами in vitro: Дисс. канд. биол. наук. -Казань. -1999. -161с.

81. Щеглова М.К., Нейдбайлик И.Н. Опыт фаготипирования листерий // Ветеринария. -1968. -№6. -С.102-103.

82. Янковский К.С. Санитарно-микробиологическая оценка листерий как показателя безопасности мясных продуктов: Автореф. дисс. канд. вет. наук. -Москва. -2000. -21с.

83. Akane A., Matsubara К., Nakamura Н., Takabashi S., Kimura К. Identification of the heme compound copuriofied with DNA from bloodstains, a major ingi-bitor of PCR // J. Forensic Sci. -1994. 39: 362-372.

84. Alexander M. Listeriose Epidemiologic, Klinik und Therapie // Arztl. Lab. -1984, 30. -№10. -P.299-305.

85. Al-Ghazali M.R., Al-Azawl Salwa K. Listeria monocytogenes contamination of crops grown on soil treated with sewage sludge cake // Appl., Bacteriol. -1990. -69. -№5. -C.642-647.

86. Al-Soud W.A., Josson L., Radstrom P. Identification and characterization of immunoglobulin j blood as a major inhibitor of diagnostic PCR // J-Clin. Microbiol. -2000. 38: 345-350.

87. Andre P. Isolement de Listeria monocytogenes chez un herisson // Ann. Inst. Pasteur. -1966. -V.lll. -№2. -P.225-226.

88. Andurier A., Taylor A.J., Carbonelle В., Mehauchlin J. A phage-typing system for Listeria monocytogenes and its use in epidemiological studies // Clin Jnvest. Med. -1984. 7: 229-232.

89. Andurier A., Martin C. Phage typing of Listeria monocytogenes // Jnt. J. Food Microbiol. -1989. 8: 251-257.

90. Barza M. Listeriosis and milk // N. Engl. J. Med. -1985. 312. -№7. -P.438440.

91. Bille J. Epidemiology of human listeriosis in Europe, with special reference to the Swiss outbreak // In: A.J. Miller, J.L. Smith, and G.A. Somkuti (ed.), Foodborne listeriosis. Elsevier, New York, NY. -1990. -P.71-74.

92. Blais B.W., Turner J., Sooknonon R., Malek Z. A Nulleic Acid Sequence - Based Amplification systems for detection of Listeria monocytogenes Jflya sequences // Appl. ENVIR. Microbiology. -1997. 63: 310-313.

93. Boerlin P., Bannerman E., Jemmi Т., Bille J. Subtyping Listeria monocytogenes isolates genetically related to Swiss epidemic clone // J. Clin. Microbiol. -1996. 34: 2148-2153.

94. Boerlin P., Rocourt J., Piffaretti J.C. Taxonomy of the genus Listeria by using multilocus enzyme electrophoresis // Int. J. Syst. Bacteriol. -1991. 41: 59-64.

95. Boerlin P., Boerlinpetzold F., Bannerman E., Bille J., Jemmi T. Typing Listeria monocytogenes isolates from fish products and human Listeriosis cases // Appl. ENVIR. Microbiology. -1997. 63: 1338-1343.

96. Brosch R., Chen J., Luchansky J.B. Pulsed-field fingerprinting of Lis-teriae: identification of genomic divisions for Listeria monocytogenes and their correlation with serovar//Appl. Environ. Microbiol. -1994. -60: 2584-2592.

97. Boucher M., Yonekura M.L., Wallace R.J., Phelan J.P. Adult respiratory distress syndrome: a rare manifestation of Listeria monocytogenes infection in pregnancy // Am. J. Obstet. Gynecol. -1984. -149: 686-688.

98. Breer C., Schopfer K. Listeria and food // 1988. Lancet ii: 1022.

99. Breer C., Schopfer K. Listerien in Nahrungsmitteln // Schwiez. Med.-1989.

100. Bronka B. Further observations of changed growth of Listeria monocytogenes on salt agar// Zbl. Bacteriol., Parasitenk., Infektionskrankh. und Hyg. -1975. Abt. 1-Orig., А232/ -№2-3. -P.287-293.

101. Carnie I.A. Listeria monocytogenes legislative requirements under the new health (infectious diseases) regulations 1990 // Food Austral. -1991. -43. -№3. -C. 107-109.-Англ.

102. Cantoni C. Controllo delle listeria negli stabilimenti della carne // Ind. alim. (Ital.). -1991. -30. -№291. -C.271-273. -Ит.; рез. англ.

103. Caserlo G., Garzaroli C., Villa C. Listeria monocytogenes in wiirstel commercializzati in Italia nel 1990 // Ind. alim. (Ital.). -1991. -30. -№296. -C.729-732. -Ит.; рез. англ.

104. Cole M.B., Jones M.O., Holyozv C. The effect of pH, salt concentration and temperature on the survival and growth of Listeria monocytogenes // J. Appl. Bacteriol. -1990. 69,1: 63-72. n-25139.

105. Conner D.E., Scott Virginia N., Sumner Susan S., Bernard Dane T. Pathogenicity of foodborne, environmental and clinical isolates of Listeria monocytogenes in mice // J. Food. Sci. -1989. -54. -№6. -C. 1553-1556. -Англ.

106. Christie R., Alksins N.E., Nunch-Petersen E. A note on lytic phenomenon shown by group В streptococci // Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. -1944. -22: 197-200.

107. Curiale M.S., Leffer W. Euryne linked immunoassay for detection of Listeria monocytogenes in dairy products, seafoods, and meats: collaborative study // J. AO AC. -1994. Int. 77: 1472-1489.

108. Curtis G.D.W., Mitchell R.J., King A.F., Griffin E.J. A selective differential medium for the isolation of Listeria monocytogenes // Lett. Appl. Microbiol. -1989.-8: 95-98.

109. Datta A.R., Wentz B.A., Mill W.E. Detection of hemolytic Listeria monocytogenes by using colony hybriolization // Appl. Environ. Microbiology. -1987.-53: 2256-2259.

110. Datta A.R., Wentz B.A., Shook D. end Trucksess M. Synthetic oligode-oxyribonucleotide probes for detection of Listeria monocytogenes // Appl. Environ. Microbiology. -1988. -№54. -P.2933-2937.

111. Dener H.G., Boychuk J. Detection of Listeria monocytogenes by PCR // Appl. Environ. Microbiol. -1991. -V.57. -P.606-609.

112. Duvall R.E., Hitchins A.D. Pooling of Noncollaborative multilaboratory data for evaluation of the use of DNA-Probe test kits in identifying Listeria monocytogenes strains // J. Food Protection. -1997. -60: 995-997.

113. El-Shenawy M.A., Garcia H.S., Marth E.H. Inhibition and inactivation of Listeria monocytogenes by the lactoperoxidase system in raw-milk, buffer or a semisynthetic medium // Milchwissenschaft. -1990. -45. -№10. -C.638-641. -Англ.; рез. нем.

114. El-Gezzar Fathy E., Marth E.H. Survival of Listeria monocytogenes in a food colorant derived from red buts // J. Dairy Sci. -1991. -74. -№1. -C.81-86. -Англ.

115. El-Gezzar F. E., Marth E.H. Listeria monocytogenes, Listeriosis and responses of the pathogen to environmental conditions // Milchwissenschaft. -1991. -46. -№1. -C.14-19. -Англ.; рез. нем.

116. Ester S.A., Aurora F.M., Torres R.A. Viabilidad у multiplication de Listeria monocytogenes сера Murray frente a antimicrobianos de uso en medios selec-tivos // Rev. microbial. -1986. -17. -№1. -C.39-46.

117. Evans Jacqnelyn R., Allen Alexander C. ct al. Perinatal listeriosis: report of an outbreak // Pediat. infec. Disease. -1985. -V.4. -№3. -P.237-241.

118. Eweland W.C. Demonstration of Listeria monocytogenes in direct examination of spinal fluid by fluorescent antibody technique // J. Bacterid. -1963. -85. -№6. -P. 1448-1450.

119. Farber J.M., Sanders G.W., Johnston M.A. A survey of various foods for the presence of Listeria species // J. Food. Prot. -1989. -52: 456-458.

120. Farber J.M., Peterkin P.I. Listeria monocytogenes, a foot-borne patyhogen //Microbiol. -1991. Rev. 55: 476-511.

121. Fensterbank R., Audurier A., Godu J., Guerrault P., Malo Nicole. Etude des souches de listeria isolees d'animaux malades et de l'ensilage consomme // Ann. rech. vet. -1984. -15. -№1. -P.l 13-118.

122. Fernandez D.M., Alvarez M.M. Presencia de Listeria monocytogenes en los ganglios linfaticos mesentericos de ovinos de matadero // An. Fac. vet. Leon. -1982.-28.-P.175-179.

123. Feteanu A., Darie P., Jorgielesku P. Identifizierung und typisierung von Listeria monocytogenes mit jfilfe von fluoreszierenden Antikorpern // In.: Probleme die Listeriose. symposion. 16-17 mai 1968 in Leipzig. Leipzig. -1969. -P.79-85.

124. Fleming D.W., Cochi M.D., MacDonald K.L., Brondum J., Hayes P.S., Pikaytis B.D., Holmes M.B., Audurier A., Broome C.V., Reingold A.L. Pasteurized milk as a vechicle of infection in an outbreak of listeriosis // N. Engl. J. Med. -1985. -312: 404-407.

125. Forsyth J.R.L. Listeria update and tuture implication. What is this Listeria? // Food Austral. -1991. -43. -№3. -C.99-104. -Англ.

126. Fraser J.A., Sperber W.H. Rapid detection of Listeria spp. in food and environmental sumplos by esculin hydrolysis // J. Food. Prot. -1988. -51: 762-765.

127. Fulga C., Bichirgin N. Contribution a l'ctude de 1'isolament et de 1'identification de Listeria monocytogenes // Arch, roumain. patohol. exptl. ct microbial. -1966. -25. -№2. -P.533.

128. Gagliardi M., Gagliardi C., Baronti L. Sulla presenza di anticorpi anti-listeria in una popolazione della provincia di firenze // Ann. Sclavo. -1977 (1978). -19. -№6. -P. 1233-1236.

129. Gellin B.G., Broome C.V. Listeriosis //JAMA. -1989. -261: 1313-1320.

130. Gembruch U., Niesen M., Hansmann M., Knopfle G. Listeriosis: a cause of non-immune hydrops fetalis // Prenat. Diagn. -1987. -7. -№4. -C.277-282.

131. Genigergious C.A., Oanca P., Dutulescu D. Prevalence of Listeria spp. in turkey meat at the supermarket and slaughterhouse // J. Food. Prot. -1990. -53: 282288.

132. George S.M., Lund B.M., Brockehurst T.F. The effect of pH and temperature on growth of Listeria monocytogenes // Letters, in appl. Microbiol. -1988. -Vol. 6. -№6. -P. 153-156. -Bibliogr.: p. 155-156.

133. Geuenich Hans-Helmut, Miiller Hans E. Isolierung und Keimzahlbestim-mung von Listeria monocytogenes in ungeklartem und biologisch gereinigtem Ab-wasser //Zbl. Bacteriol. -1984. -Abt. IB. -179. -№3. -P.266-273.

134. Golsteyn Thomas E.J., King R.K., Burchak J., Gannou V.P.J. Sensitive and specific detection of Listeria monocytogenes in milk and ground beef with the Polymerase Chain reaction // Appl. Environ Microbiol. -1991. -57: 2576-2580.

135. Goulet V., Lepoutre A., Rocourt J., Courtieu A.L., Dchaumont P., Viet P. Epidemie de listeriose en France: bilan final et resultants de l'enqukte epidemi-ologiquc // Bull. Epidemiol. Hebdom. -1993. -4: 13-14.

136. Grau F.H., Vanderlinde P.B. Growth of Listeria monocytogenes on vacuum package beef // In: proceedings of the 34th International Congress of Meat Sci-encc and Technology, Part B. Brisbane, Australia. -P.518-519.

137. Greenwood M.H., Roberts D., Burden P. The occurrence of Listeria spe-cics in milk and dairy products: a national survey in England and Wales // Int. J. Food Microbiol.-1991.-12: 197-206.

138. Griffiths M.W. Listeria monocytogenes: its importance in the dairy industry // J. Sc. Food. Agr. -1989. -Vol. 47. -№2. -P.133-158. -Bibliogr.: p.152-158.

139. Groves R.D., Welshimer H.J. Correlation of virulence in Listeria monocytogenes with three in vitro reactions // "Abstrs Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol., Atlantic City, N. J., 1976." -Washington, D.C. -1976. -52.

140. Hao D.Y.-Y., Beuchat L.R., Brackctt R.E. Comparison of media andmethods for detecting and enumerating Listeria monocytogenes in refrigerated cabbage // "Appl. and Environ. Microbiol." -1987. -53. -№5. -P.955-957.

141. Hart C.D., Mead G.C., Norris A.P. Effects of gaseous environment ant temperature on the storage behaviour of Listeria monocytogenes on chicken breast meat // J. Appl. Bacteriol. -1991. -70. -№1. -C.40-46.

142. Hartwign H., Morphologische und kulturelle eigenschaften von Listeria monocytogenes (L.m.) // Listeriosen simposion. 27-28 juni 1957 in Giessen. Berlin-Hamburg.-1958.-S.5-16.

143. Henry B.S. Dissociation in the genus Brucella // J. Jufect. Dis. -1933. -52: 474-402.

144. Herman P. Detection of viable and dead Listeria monocytogenes by PCR // Food Microbiology. -1997. -14: 103-110.

145. Ho J.L., Shands K.N., Friedland G., Eckind P., Fraser D.W. An outbreak of type 4b Listeria monocytogenes infection involving patients from eight Boston hospital // Arch. Intern. Med. -1986. -146: 520-524.

146. Hubner R.J., Cole E.M., Bruce J.L., McDonell C.I., Webster J.A. Types of Listeria monocytogenes predicted by the of EcoRI cleavedge sites relative to ribo-somal RNA sequences // Proc. Nalt. Acad. Sci. USA. -1995. -92: 5234-5238.

147. Jacket C., Catimel R., Brosch R. et al. Investigations related to the epidemic strain involved in the French listeriosis outbreak in 1992 // Appl. Environ Microbiol. -1995. -61: 123-125.

148. Jaton K., Sahli R., Bille J. Development of polymerase chain reaction for detection of Listeria monocytogenes in clinical cerebrospinal fluid samples // J. Clin. Microbiol.-1992.-30: 1931-1936.

149. Jemmi T. Actual knowledge of Listeria in meat and fish products // Milt. Geb. Lebens mittelunters. Hyg. -1990. -31: 144-157.

150. Jersek В., Tcherneva E., Rijpens N., Herman L. Repetitive element sequence-based PCR for spccies and strain discrimination in the genus Listeria // Lett. Appl. Microbiol. -1996. -23: 55-60.

151. Jersek В., Gilot P., Gubina M., Klun N., Mehle J., Tcherneva E., Rijpens N., Herman L. Typing of Listeria monocytogenes strains by repetitive element sequence-based PCR//J. Clin. Microbiol. -1999. -37: 103-109.

152. Joaquin P., Martiner V. Aislamiento de Listeria monocytogenes a partir de ovinos para el abasto // Vet. Мех. -1986. -17. -№3. -C.203-205.

153. Jones G.L. Isolation and identification Listeria monocytogenes // Department of health and human servis, CDC-Atlanta, Jeorgia. -1989.

154. Ke Ernahrungsprobleme was sind Listerien? // Notab. Med. -1991. -21. -№5. -C.232-233. -Нем.

155. Kempton J. Listeria monocytogenes: a protocol for rapid identification // Med. J. Austr. -1989. -150: 607.

156. Kleinlein N., Untermann F., Beissner H. Zum vorkommen von Salmonella und Yersinia Spezies sowie Listeria monocytogenes in hackfleisch // Fleischwirtschaft. -1989. -69: 1474-1476.

157. Klinger J.D. Isolation of Listeria: a review of procedures and future perspectives//Infection. -1988. -16(suppl.): 89-105.

158. Klinger J.D., Johnson A., Croan D. et al. Comparativ studies of nucleic acid hybriolization assay for Listeria monocytogenes in fools // J. Assoc. Anal. Chem.-1988. -71:669-673.

159. Kholer S., Leimeister-Wachter M., Chakraborty Т., Lottspeich F., Goebel W. The gene coding for protein p60 of Listeria monocytogenes // Infect. Jnumen. -1990. -57: 55-61.

160. Kotilainen P., Jalava J., Meurman O. et al. Diagnosis of meningococcal meningitis by brood-range bacterial PCR with cerebrospinal fluid // J. Clin. Microbiol. -1998. -36: 2205-2209.

161. Leasor S.B., Foegeding P.M. Listeria spp. in commercially broken raw liquid whole eggs // J. Food. Prot. -1989. -52: 777-780.

162. Loessner M.J., Busse M. Bacterilophage typing of Listeria species // Appl. Environ Microbiol. -1990. -54: 1912-1918.

163. Loessner M.J., Rudolf M., Scharer. Evaluation of luciferase reporter bacteriophage A511: lux AB for detection of Listeria monocytogenes in contaminated foods // Appl. Environ Microbiol. -1997. -63: 2961-2965.

164. Luppi A., Bucci G., Maini P., Rocourt J. Ecological survey of Listeria in the Ferrrara Area (Northern Italy) // Zbl. Bakteriol. Microbiol, und Hyg. A. -1988. -269. -№2. -C.266-275.

165. Manzano Marisa, Cocolin Luca, Ferroni Pierino, Cantoni Carlo and Canu Giuseppe. A simple and Fast PCR protocool to detect Listeria monocytogenes from meat // J. Sci. Food and Agric. -1997. -74: 25-30.

166. McBride M.E., Girard K.F. A selective medium for the isolation of Listeria monocytogenes from mixed bacterial populations // J. Lab. Clin. Med. -1960. -55: 153-157.

167. McLauchlin J. Human listeriosis in Butain, 1967-1985, a summary of 72 cases. 1. Listeroisis during pregnancy and in the newborn // Epidemiol. Infect. -1990. -104: 181-189.

168. McLauchin J., Audurier A., Taylor A.G. The evaluation of a phage-typing system for L. monocytogenes for use in epidemiological studies // J. Med. Microbiol. -1986. -22: 357-365.

169. McLauchlin J., Greenwood M.H., Pini P.N. The occurrence of Listeria monocytogenes in cheese from a manufacturer associated with a case of listeriosis // Int. J. Food. Microbiol. -1990. -10: 255-262.

170. Molska Irena Listeria monocytogenes niebezpieczny Drobnoustroj w zywnosci // Przem. spoz. -1988. -42. -№8-8. -C.247-248, 225, 226. -Пол.; рез. рус., англ., фр., нем.

171. Murray Е., Webb R., Swann М. Adiscase of rabbits characterised by a large mononuclear leucocytosis caused by Rither to underscribed bacillus "Bacterium monocytogenes" //J. Rath. Bacteriol. -1926. -1. -29. -P.407.

172. Nass W., Ortel S. Ergebnisse und Erfahrungen mit der Serodiagnostik der menschlichen Listeriosise Eine Befundauswertung der Jahre 1965-1965 // Z. ge-samte Hyg. -1977. -23. -№7. -P.482-485.

173. Netteh van P., Gaal van В., Mossel D.A.A. Selection, differentiation and counting of haemolytic Listeria spp. 01. PALCAM medium// Lett. Appl. Microbiol. -1991. -12. -№1. -C.20-22. -Англ.

174. Notermans S. Nenzeitliche problem in der lebens mittelmikrobiologie // Fleischwirtschaft. -1991.-71. -№6. -C.648-652.

175. Obiger G., Schonberg A. Verleicheude untersuchungen mit verschiedenen Nahrmedien zur bacteriologischen diagnose der Listeriose // Fleischwirtschaft. -1973. -53.-№10. -C. 1452-1456.

176. Olive D.M., Bean P. Principles and application of methods for DNA-based typing of microbial organisms // J. Clin. Microbiol. -1991. -37: 1661-1669.

177. Ortel S. Listeriose Bedeutung fur die Praxis // Med. Aktuell. -1983. -9. -№2. -C.56-57.

178. Ortel S. Neuere ergebnisse fur microbiologic und epidemiologic der men-sehlichen Listeriose in der DDR // Z. Gesamte Ityg. und Grengeb. -1989. -29. -№4. -C.236-239.

179. Oudar J. A propos des listeriosis. 8 Symposium international sur les listerioses (Madrid, 22-27 septembre 1981). "Rev. med. vet." (France). -1982. -133. -№2. -C.129-132.

180. Papageorgiou D.K., Marth E.H. Fate of Listeria monocytogenes during the manufacture, ripening and storage of fetacheese // J. Food. Prot. -1989. -52: 8287.

181. Pdll M., Danachie W., Shaw A. Temperature dependent expression of flagella of Listeria monocytogenes studied by electron microscopy, SDS-PAGE and Western blotting //J. Gen. Microbiol. -1988. -143: 2171-2178.

182. Perez-Diaz J.C., Vicente M.F., Baquero F. Plasmids in Listeria // "Plas-mid". -1982. -8. -№2. -C. 112-118.

183. Peterkin P.J., Jdzian E.S., Sharpe A.N. Detection of Listeria monocytogenes by direct colony hybridization on hydrophobic grid-membrane filters by using a chromogen labeled DNA probe // Appl. Environ Microbiol. -1991. -57: 586-591.

184. Pine L., Malcolm В., Brooks J.B., Daneshvar M.I. Physiological studies on the growth and utilization of sugars by Listeria species // Can. J. Microbiol. -1989. -35: 245-254.

185. Pinner R.W., Schuchat A., Swaminathan B. et al. Role of foods in sporadic listeriosis. II. Microbiologic and epidemiologic investigation // JAMA. -1992. -267: 2046-2050.

186. Ralovich В., Ewan E. Pauline, Emody L. Listeria. Alteration of phage-and biotypes of Listeria strains // "Acta microbiol. hung." -1986. -33. -№1. -C.19-26.

187. Rello J., Gatell J.M., Almela M., Jimenez de Anta M.J., Andreu J., Soriano E., Garcia San Miguel J. Septicemias por Listeria monocytogenes en el adulto // Med. clin. -1987. -88. -№14. -C.537-540. -Ит.; рез. англ.

188. Rivera-Alsina Manuel E., Saldanahuis R., Rohl Steve, Arias Jaran W. Listeria monocytogenes. An important pathogen in premature labor and intrauterine fetal sepsis // J. Reprod. Med. -1983. -V.28. -№.3 -P.212-214.

189. Ryser E.T., Marth E.H. Fate of Listeria monocytogenes during the manufacture and ripening of Camambert cheese // J. Food. Pro. -1987. -50: 372-378.

190. Ryser E.T., Arimi S.M., Donnely C.W. Effect of pH on distribution of Listeria Ribolypes in Corn, Hay, end Grass-silage // APP. ENVIR. Microbiology. -1997.-63:3695-3697.

191. Ryser E.T., Marth E.H. (ed.) Listeria, listeriosis and food safety. 2 ed. // Marsel Dekker Inc. New York. NY. -1999.

192. Rocourt J. The genus Listeria and Listeria monocytogenes: phylogenetic position, taxonomy, and identification. Jn: Ryser E.T. and Marth E.H. (ed.) Listeria, listeriosis and food safety. 2nd ed. // New York. -1999. -P. 1-20.

193. Rocourt J., Seeliger Heinz P.R. Distribution des espcces du genre Listeria // Zbl. Bakteriol. Microbiol, und Hyg. A. -1985. -A259. -№3. -C.317-330.

194. Rollier L., Croegaert Th., Verplaetse A., Van Hoof J. Comparison of three plating media for enumeration and three media for isolation of Listeria spp. in fermented sausages // Arch. Lebensinittelhyg. -1991. -42. -№3. -C.65-69. -Англ.; рез. нем.

195. Saito A., Sawada Т., Tonumurn J., Hondo R. Discrimination of Listeria monocytogenes strains of serotype 4B by restriction enzyme analysis of chromosomal DNA // Japanese J. Med. Sci Biology. -1997. -50: 63-71.

196. Schwartz В., Hexter D., Broome C.V. et al. Investigation of an outbreak of listeriosis: new hypotheses for the etiology of epidemic Listeria monocytogenes infections // J. Infect. Dis. -1989. -159: 680-685.

197. Seeliger H.P.R. Listeriosis // 2 end. -New York. Macmillan Publishing Company. -1961. -121pp.

198. Seeliger H.P.R., Sander F., Bockemuhl J. Zum kneturellen Nachweis von Listeria monocytogenes // Z. med. Microbiol. Immunal. -1970. Bd 155. -№4. -C.352-368.

199. Seeliger H.P.R. A listeriosis epidemiologia jonan es epizootologica janan uj sremleleti modia // Egeszsegtudomany. -1973. -V.17. -№1. -P.6-16.

200. Seeliger H.P.R., Jones D. Genus Listeria, p.1235-1245. In: Sneath P.H.A., Mair N.S., Sharpe M.E., Holt J.G. Bergey's manual of Systematic bacteriology // 9th Ed. Williams and Wilkins, Co., Baltimore. MD. -1986. -Vol.2.

201. Skalka Boris, Smola Jiri. Selective diagnostic for pathogenic Listeria spp. // J. Clin. Microbiol. -1983. -18. -№6. -C. 1432-1433.

202. Schuchat A., Swaminathan В., Broome C.V. Epidemiology of human listeriosis // Clin. Microbiol. -1991. -Rev.4: 169-183.

203. Slutsker L., Evans M.C., Schuchat A. 2000 Listeriosos, p.83-106. In: Emerging Disease 4. W.M. Sheld, W.A. Craig, J.M. Hughes (ed.). ASM Press, Washington, D.C.

204. Smola J. Possibilities of differentiation of listeriol hemolysius by siner-gistic hemolytic reactions (CAMP reaction) // Jnt. J. Food. Microbiol. -1989. -51: 596-599.

205. Swaminathan В., Hayes P.S. Sampling, isolation and rapid detection // Isolation and identification of Listeria monocytogenes. 1989 US Department of Health and Human Services. CDC. Atlanta. -P.31-37.

206. Sneath P.H.A., Mair N.S., Sharpe M.E., Holt J.G. Bergey's manual of systematic bacteriology // 9th Ed. -Vol.2. -1986. Williams and Wilkins. Co. Baltimore. MD.

207. Tenover F.C., Arbeit R.D., Goering R.V. et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing // -1995. -33: 2233-2239.

208. Ubach M., Miguel A., Puig P. Aislamientoo de Listeria monocytogenes у Listeria spp. en gueso fresco pasteurizado у negueson // Alimentaria. -1991. -28. -№223. -C.45-46. -Исп.; рез. англ.

209. U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological analytical manual, chapter 29 Listeria isolation; revised methods of analysis: notice // Fed. Registr. -1988.-53:44147-44153.

210. Van-Netten P., Perales J., Van-de-Noosdijk A., Gurtis J.D.W., Nossel D.A.A. Liquid and solid media for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and other Listeria spp // Int. J. Food Microbiol. -1989. -8: 299-316.

211. Vakni J.C., Massobrio M., Battistini F. Listeria monocytogenes XII Selective media detection of the organism in vaginal secretion // J. Batt. Virol. Jmm. -1967. -60: 256-276.

212. Vazques-Boland J.A., Camallo J.A., Ripio M.T. et al. Listeriosis animal: aspectos epidemiologicos у diagnosticos, implicacionesd en salud publica у situacion en Espana // Med. Vet. -1996. -13: 333-344.

213. Vazquez-Boland J.A., Kuhn M., Berche P., Chakraborty T. et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants // Clin. Microbiol. -2001. -14: 584-640.

214. Vines A., Reeves M.W., Hunter S., Swaminathan B. Restriction fragment length polymorphism in ofur virulence-associated genes of Listeria monocytogenes // Res. Microbiol. -1992. -143: 281-294.

215. Watkins J., Slcath Karen P. Isolation and enumeration of Listeria monocytogenes from sewage, sewage sludge and river water // J. Appl. Bacteriol. -1981. -50. -№1. -P. 1-9.

216. Weaver R.F. Morphological, physiological, and biochemical characterization, p.39-43. In: James G.L. (ed.). Isolation and identification of Listeria monocytogenes. -1989. US Department of Health and Human Services, CDC, Atlanta.

217. Wenger J.D., Pinner R., Schuchat A., Pierce R., Broome C/V. 1990. Epidemiology of human listeriosis, abstr. S-45, p.324. Program Abstr. 30th Intersci. Conf. Antimicrob. Agents Chemother. ASM, Washington, D.C.

218. Wenzel Jane M., Marth E.H. Behavior of Listeria monocytogenes at 4 and 7°C in raw milk inoculated with a commercial eulture of lactic acid bacteria // Milch wis senschaft. -1990. -45. -№12. -C.772-774. -Англ.

219. Wesley J.V., Wesley R.D., Heisick J. et al. Characterization of Listeria monocytogenes isolates by Southern blot hybridization // veterinary Microbiol. -1990. -№24. -P.341-353.

220. Wiedmann M., Bruce J.L., Knorr R., Bodis M., Cole A.M., McDowell C.J., McDonough P.L., Batt C.A. Ribotype diversity of Listeria monocytogenesstrains associated with outbreaks of listeriosis in ruminants // J. Clin. Microbiol. 1996. -34.-P. 1086-1090.

221. Wimpfheimer L., Altman N.S., Hotchkiss J.H. Growth of Listeria monocytogenes and competitive spoilage organisms in raw chicken packaged under modified atmosphere and in air // Int. J. Food. Microbiol. -1990. -11: 205-214.

222. Zaremba Maria, Kaczmarski W., Rybaezuk M., Borowski J. Wyste-powanie przeciwcial anty Listeria monocytogenes w surowicach uzyskanych od ludzi z terenu kraju w latach 1970-1974 // Prz. epidemiol. -1977. -31. -№1. -C.33-39. (польск.; рез. рус., англ.).

Информация о работе

Алимов, Марат Азатович
кандидата биологических наук
Казань, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Контаминированность объектов ветеринарного надзора возбудителем листериоза и биологические свойства выделенных культур листерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы