Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование векторов для клонирования ДНК в глутаматпродуцирующих коринебактериях

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Конструирование векторов для клонирования ДНК в глутаматпродуцирующих коринебактериях"

'.ЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМ(

КОНСТРУИРОВАНИЕ ВЕКТОРОВ

ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ДНК В ГЛУТАМАТПРОДУЦИРУЮЩИХ КОРИНЕБАКТЕРИЯХ

Специальность 03.00.15.— генетика

На правах рукописи

ТОЛМАЧЕВ Олег Эдуардович

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена в лаборатории генетики и селекции п] дуцентов аминокислот Всесоюзного научно-исследовательск« института генетики и селекции промышленных микроорганизм

Научные руководители:

доктор биологических наук Жданова Н. И.

кандидат биологических наук Гусятинер М. М.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Каменева С. В.

кандидат биологических наук Лившиц В. А.

Ведущее учреждение: Институт общей генетики АН СССР

Защита диссертации состоится «21» миык. 1992 гс в 14 часов на заседании Специализированного ученого сов< Д.098.12.01 при Всесоюзном научно-исследовательском инстиг генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адре 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИге тика.

Автореферат разослан « 29» 1991 г

Ученый секретарь Специализированного ученого совета, кандидат биологических наук

В. И. Щербак

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность теш. Глутаматпродуцирующие коринебактерии 3orynebaoterium glutamicum, Brevibaoterium flavum, Brevi-icterium lactofermentum и др.) используются в микробиоло-гееской промышленности в качестве продуцентов аминокислот, последнее время для создания коринебактериальных штаммов-юдуцентов аминокислот все чаще используют генно-инженерные >дходы. В ряде работ.получены бифункциональные плазмнда, гособные к репликации как в коринебактериях, так и в удоб->м объекте генетической инженерии - Escherichia coli. Такие [азмида могут быть использованы в качестве векторов для ¡реноса генетического материала между е. ooli и коринебак-риями. Также актуальной является задача конструирования кторов для клонирования генов коринебактерий в гомологич-й системе. .

Известно, что генетические элементы фагов могут быть пользованы для создания удобных систем вектор-хозянн ohumann, 1979; Hiwa et al.f 1985). Фаги В. flavum ранее учались,'однако молекулярно-генетические данные об этих гах ограничены. В качестве доноров фаговых генетических эментов для конструирования систем молекулярного клониро-аия в в. flavum мы' выбрали фаги »BSh6 и ввы в. flavum.

Цель я задача исследования. Целью настоящей работы яв-пось создание векторов для молекулярного клонирования в ^таматпродуцирукщих коринебактериях.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие зпериментальные задачи:

изучить некоторые свойства фагов *BSh6 и ввы в. flavum, шые для успешного манипулирования этими фагами и их гоно-ш;

юказать наличие или отсутствие комплементарных однонито-с (липких) концов геномов у фагов «BSh6 и ввы, изучить ютескую структуру областей липких концов геномов фагов !ьб и ввы;

юлучить челночные векторы для бактериальной системы ooli - коринебактерии, в том числе воктори, позволяющие водить прямой отбор трансформантов с гибридными плаз!,я -И!

- получить векторы для • коринебактерий, . содерзкш oos-последоватвльность фага в. flavum; показать трансдую. в. iiavum с помощью полученных космид; .

- клонировать гены аспартаткиназы С. glutamioum в Коринебактериях с помощью одного из полученных векторов.

Новизна результатов и научно-практическое значение работы. Впервые изучена физическая структура геномов фагш ?'BSh6 и BBL1 глутаматпродуцируйдей коринебахтерии В. flaw Показано отсутствие близкого родства между фз-гдми $BSh6 и ввы. Получен делеционный мутант фага sBShß. Сс^ствлена трансфекция штамма Brevibaoterium бр. Е531 с помощью ДНК фага BBL1. Установлена экспрессия в В. сои генетического детерминанта устойчивости к Sm и Sp из плазмида pGG4 С. gJ tamicum. Путем делеционного анализа B S. coli доказана лол лизация детерминанта устойчивости к Sm и Sp на Psti-Sphi-фрагменте ДНК протяженностью г ,2. тл.н. Получвнь плазмидные векторы (в том числе челночные векторы) для кпс нирования ДНК в промышленно-вакных коринебактериях. В чает ности, получены плазмидные векторы, позволяющие проводить прямой отбор трансформантов с гибридными Елазмидаии. ПоЛу* ны космидные вектор! (содержат oos-сайт фага BBL1). С использованием космидного вектора амшш$ицированы в в. flavi гены lysCa и lyaCß с. glutamloum (детерминируют аспартатю назу), что привело к увеличению: активности аспартаткиназы более чем в 10 раз. Аспартаткиназа является ключевым ферик том в биосинтезе аминокислоты дгаина, лизин производится микробиологическим способом на отечественных предприятиях за рубеком в качестве кормовой добавки. Показана трансдую В. iiavum и Brevibaoterium ер. Е5Э1 фагом BBL1 с ПОМОЩЬЮ полученных космид.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзорг литературы, экспериментальной части (включает материалы и методы, результаты, обсуждение результатов) и'выводов; иллюстрирована 15 рисунками и 9 таблицами. Библиография соде агат 124 наименования.

Апробация. Материалы диссертационной работы были доле жены на международной конференции молодых ученых "Биотехнс логия - эксперимент, теория, практика" (Кацдалакша, 1989).

- з -

i союзной конференции молодых ученых "Актуальные вопросы •еринарной вирусологии" (Суздаль, 1990) и семинаре отдела клвдной генетики института ВНИИгенетика, а также были дставлены на конференции "Аминокислоты для сельского хо-ства, пищевой промышленности и научных исследований" еван, 198д>; конференции "Биология культивирования и био-нология микроорганизмов" (Ташкент, 1989); конференции митированиэ и ингибирование роста микроорганизмов" (Пущи-1989); симпозиуме."Молекулярные механизмы генетических цессов" (Москва, 1990); школе-семинаре "Молекулярная био-ш я медицина" (Ленинград, 1990).

доврши и ывгода

Штампы фагов я бактерий, плазвдда. Вирулентный фаг 16 В. ílavum был получен нами от Т.В. Леоновой (ВШИгене-I). Препараты ДНК фагов в..flavura ВВ14, НФ и ввы любезно (оставил В.З. Ахвердян (ВНИИгенетика). В работе использо-[ следупдие бактериальные штаммы ira лабораторной коллек-

В. ttávumATCCI 406? ¡Rif1".мутант штамма В. ílavum 114067; Brevibaoterium ер. Е531 (1ют, продуцент лизина); ;lütamio4j» АТСС13032; В. coli ОТ11 (Ш1г мутант штамма 2 - Манивтис а до., 1984); Rit** мутант штамма в. coil i В. ooll ОТ14 (ÍPir Nalr ßmr мутант штамма ЬЮ92); oll ЕВ101 (Ианйатис и др., 1984), В. ooli JM109 ieoh-?erron et al., 1985). От Смирнова D.B. (ВНШгенети-были получены шташы В. ooli 8НЭ09 (?" araD A(argP-lao) dfiöC pteP relA ilb A(nalA-asd) ugpA704::Tn10); E. oolt Э6М1 (thrA matllí lysC árg ilvA thiA walA syl ara mtl eupB xp В работе использовали следующие плззмиды >11 из лабораторной коллекции; RSF1010 (lnoQ Sur Smr Kob+)> КГ51 (incPß Tpr Тга+), рАСУС184 (Cmp Tcr). pUCl9 ), pUC4K (Apr Kmr). Фазмида pASDJ (Apr Asd+) была полу-07 Шредельчука и др. (ВНИИ генетика). Коринебактери-1Я плазмида pPD9 (Sn? Spr) создана во ВНИИгекеткка на >8 ПЛазмид pSR1 (Yoehihama ot al., 1985; получена о? •Itz, АВСТР8ЛЯЯ) И pCG4 (Katsuaata et al., 1984; получе-' J. Hoohoannova, Чехо-Оловакия).

Среда. Как правило все бактериальные штаммы выращивали на жидкой или агаризованной среде Хоттингера. Для коринебак-терий использовали также минимальную среду Гловера, а для 2. coli - минимальную среду Адамса. Гипертоническую среду ии готовили, как описано (Yoshihama et al., 1985). При необходимости в среды вводили соответствующие антибиотики.

Высевы бактериофага проводили двуслойным методом. В жидкой культуре фаг выращивали в бульоне Хоттингера с интенсивной аэрацией. Разведения фага готовили в фаговом буфере (10 мМ Трис-Hd, рН .7,5; 15 MM MgCl2; 100 мМ NaCl).

Выделение плазыидной ДНК из Е. coli проводили стандартным щелочным методом (Маниатис и др, 1984).

Трансформацию Б. coli проводили по Ханаану (1988).

Выделение плазыидной ДНК из коринебактерий проводили в -основном, как описано Толмачевым (1990).

Выделение ДНК фагов sBShS и BBL1 проводили с помощью модифицированного метода выделения ДНК фага лямбда (Маниатис и др., 1984).

Получение и трансформацию протопластов коринебактерий проводили в основном, как описано Yoshihama et al. (1985). Пр трансформации итаммов Brevibaoterium sp. Е5Э1 и С., glutami-ош АТСС13032 гомологичной плазмидной ДНК эффективность составляла 1 о6 трансформантов на мкг ДНК (тр./икг), а при трансформации штамма В. flavum АТСС14067 - Ю4 тр./мкг.

Трансфекцшо протопластов В. Натш проводили в основном, как описано Yeh et al. (1985).

Электронную микроскопию ДНК проводили по формамидной методике, как описано в руководстве Davie et al. (1971).

Манипуляции с ДНК. Обработку ДНК рестриктазами, электрофорез, ДНК-ДНК-гибридизацию проводили стандартным образом (Маниатис и др, 1984). Датирование ДНК в операциях клонирования и лигирование липких концов генома фага ввы проводили, как описано в руководстве (Маниатис и др, 1984). Для того, чтобы блокировать лигирование тупых концов ДНК, реакцию лигирования ДНК фага ®BSh6 осуществляли при концентрации АШФ 5 мМ (Ferrettl, Sgaramella, 1981). Обработку ДНК нуклеа-зой S1 проводили в буфере, описанным Vogt (1973). в течение 30 мин при 60° с.

Клонирование EcoRI-EcoRI-фрагаента ДНК ®BSh6 и рехомби-[ационное зондирование. Уникальный EcoRI-EcoRI-фрагмент ДНК >BSh6 (0,8 т.п.н.) клонировали в кишечной палочке в векторе IACYC184 и затем субклонировали в векторе рис19. Для обнару-©ния EooRl-фрагмента ДНК фага в процессе его клонирования и ¡убклонирования использовали метод зондирования,основанный а гомологичной рекомбинации. Зонд был получен путем незави-имого клонирования EcoRi-EcoRI-фрагмента ДНК ®BSh6 в моби-изуемой плазмиде RSF1010. Рекомбинация между плазмидой-ондом и зондируемой плазмидой делает доступной ois-функцию обилизации RSP1010 для всего коинтеграта и может быть обна-ужена измерением частоты мобилизации маркера зондируемой лазмиды. Донором коньюгативных функций была плазмида R751.

Получение делеционного «утаита фага $BSh6 проводили по етодаке, описанной для фага лямбда (Девис и др., 1984).

Трансдукцию Brevibacterium фагом BBL1 проводили в ос-овном, как описано для фага лямбда (Peiss et ai., 1982).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ °

1. Изучение фага «BSb6 В. ilavum.

Фаг »BSh6 выделили на-биохимическом заводе из культу-альной жидкости, полученной после ферментации штамма Brevi-aoterium sp. Е531. Ранее свойства этого фага не исследова-и. № предприняли' изучение фага sBSh6 для того, чтобы опре-элить возможность использования генетических элементов BSh6 для конструирования эффективных клонирующих векторов.

1.1. Спектр хозяев $BSh6.

Показали, ЧТО фаг »BSh6 размножается на Brevibaoterium р. Е531 и на В. flavum AICC1406? и не размножается на . glutamioum АТСС13032. .

1.2. Физический анализ генома 4>BSh6.

Изучение физической структуры генома 3>BSh6 начали с тределения величин фрагментов рестрикции и доказательства аличия комплементарных одяонитевых концов у генома этого зга. Одну часть препарата ДНК фага обработали нуклеазой S1

(специфически разрушает однонитевую ДНК). Другую часть препарата ДНК фага обработала полшуклеотидлигазой фага Т4. Далее оба полученных препарата ДЕК инкубировали с рвстрикта-зая Ртих, Н1паш, ЕооН1, С1а1 и хъа1. Полученные

гэдратазати наносили в 0,1 % агарозный гель и проводили электрофорез. Иол8кулярнце размеры наблюдаемых в геле агаро-зы фрагакнтов рестрикции приведены в тексте диссертации. Вмзсто фрагментов 1,3 т.п.н. и 10,3 т.п.н. ДНК, обработанной нуклеазой Б1 и рестриктазой РтГ, в ДНК, обработанной лига-зой и РуиД, имелся фрагмент 11,6 т.п.н. Очевидш., что РуоТ-фрагмента 1,3 т.п.н. иЮ,з т.п.н. до обработки нукдеа-зо;1 Б1 содержала липкие концы генома фага, а РтГ-фрагаент 11,6 т.п.н. содержит эти липкие концы в сшитой лигазой фор-кз. Аналогичным образом определили фрагменты с липкими кон-цаш генома фага в гидролизатах, полученных с помоясью другш рестршстаз. Сумма величин руи1-фрагментов ДНК «ВЭЬб состав-лязт 71,4 т.п.н, а сумма величщШпаШнйэатаентовДНК Фвгьб составляет 71.8 т.п.н. Определили размер геномафага методой электронной микроскопии.. Молекулы ДНК фага кмели линейную форму н размер 71,1 ±- 1,4 тш.н., что хорошо соответствует рвзульт&тш рестрикционного анализа. .

Геном «ВБЬб содержит 2 сайта рестрихтазы ВооЮ, причем первый ЕсоК1-сайт расположен на расстоянии 3,6 т.п.н. от соз-посЕздовательЕости^ а второй на расстояния с,8 т.п.н. от первого. -Наличие в генома «ВБЬб всего двух сайтов БооМ! их расголояевие вблизиодногонзлипких концов генома фага позволило' с типщьп метода одновременного расщепления не- '. сколькими рестрактазами построить рестриквдюняую карту области соз-тсяадовательвости «азьб для рестриктазруи!, н^лш, Ртап, хьа1, с1а1 и ВсоЫ (рис. 11). Клонировали уникальный ЕзоЫ-БзоЫ-фрагмент генома «ВБЬб (0,8 т.п.н.) в килечной палочка в составе вектора рПС19.(см."Материалы и ко года"). Подученную рекоыбинантную плазыиду обозначили риС19Р. Использовали рис19Р в качестве зонда для гибридизации по Саузерну с нЛшШХ-и Ртиитгядролизатама'фага для доказательства достоверности построенной карты ооа-области Фвзьб. - " .-. . ; • . • -У.; .';

Расцепление рвстриктазами нуклеиновой кислота фота на

пэцвфические фрагменты говорит о том, что генетическим ма-ериалом «®Sh6 является двунитевая ДНК. 1Ъном фага является инеЯным, обладает липкими концами, по данным рестрикционно-

0 анализа в электронной микроскопии имеет размер около

1 Т.П.Н. .

1v3. ДелециояныЯ мутант $BSh6.

Рестрикционный анализ ДНК одного из клоков фага, изоли-эванных после обогащения популяции «BSh6 вариантами с пош-энной устойчивостью к ЭДТА, позволил сделать вывод о налит в геноме этого клона делеции 0,3 т.п.н. Полученная деле-ш получила название <19, а соответствующий делецгонннй му-ант - «BSh6d9.

Геном sBShß содержат 2 сайта расщепления ртстряктазоЗ Lai. Первый сайт Clal расположен на расстоянии 4,9 т.п.н. с oos-тюследовательности (рис. 1 А), второй сайт Clal рас-злохен в центральной части генома фага. Заметив, что второй iflr Clal находится в тех же самых Pvull-фрагыенте я 1шШ1-фрагменте, что н сайт делении d9, ш использовали сот факт для гостроения рестрикционной карты области воз-жновения делеции d9 (рис. 1 Б). Применили метод одноврв-iHBoro расцепления двумя рестриктазами, анализировала ДНК Sh6 и 4CSh6d9. "

Полученная делеция указывает на наличие в геноме «BSh6 H, несущественной для успешного литического развития фага, также некоторую вариабельность величины ДНК, которая может яь упакована в календ «BSn6.

1.4. Родство »BShß с другими фагяш в. flatra.

Сравнение подученных нами электрофореграм» Elndlll- и ull-гндролвзатов фагов-ввгьб, ВВ14, И& а ввы показало, о значительная часть Hindin- и Ртон-фрагментов фагсв Sh6 и BB14 имеет идентичную электрофоретическую подвия-сть. Провели дот-гибридизацшо ДНК »BShfi н ДНК фагов ВВ14. , BBL1. Наблюдали наличие значительной гомологии между номами фагов «BShfi и ВВ14, а также отсутствие значительней мологии между геномом фага eBShô и геномами фагов ввы и . Таким образом, показано: 1) близкое родство фагсв

ФВБЬб и ВВ14; 2) отсутствие близкого родства между фагом Фвэьб и фагами ввы и И.

2. Изучение фага ВВЫ В.. Паут.

Фаг ВВЫ размножается на штаммах Вгеу1Ьао1;ег1ит ер. Е5Э1 и в. Патат АТСС14067. Мы выбрали для изучения фаг ВВЬ потому, что этот фаг не является близкородственным изученному нами ранее фагу ФВБЬб и, следовательно, содержит .. генетические элементы, которые отличаются от генетических элементов ФВЗИб. Действительно, ооз-сайт фага ВВЧ оказался более доступным для использования в генно-инженерных целях.

2.1. Трансфекция Вгеу1Ьасгег1ит вр.

ДНК фага ВВЫ, полученную от В.З. Ахвердяна, использовали для трансфекции штамма Вге»1ЬаоЧег1ит ер. Е53.1. Эффективность трансфекции составила 5x1 о3 БОЕ/мкг ДНК. Таким образом, доказали инфекционность ДНК фага ввы для перыис-сивного штамма Вге^1Ъао4ег1ит вр. Е5Э1.

2.2. Физический анализ генома ВВЫ.

Изучение физической структуры генома ввы начали с определения молекулярных размеров фрагментов рестрикции и доказательства наличия комплементарных однонитевых концов у генома этого фага. Препарат ДНК ВВЫ делили на три части. Первую часть Инкубировали с лигазой для ковалентной.сшивки потенциальных липких концов, вторую и третью части препарат; никак не обрабатывали. Затем все три препарата ДНК инкубиро вали с рестриктазой ВатН1. После рестрикции второй препарат инкубировали при 70° с для эффективного плавления потенциальной области липких концов генома фага, а затем быстро охлаждали до о0 С; первый и третий препараты в это время находились при комнатной температуре. Далее все три препарата ДНК наносили в гель 0,7 %. агарозы и проводили электрофорез. Анализ полученной электрофореграммы говорит о том, что Вапж-фрагмент 2,5 т.п.н. содержит оов-последовательность и после процедуры нагревания и охлаждения распадается на фрагменты 1,7 т.п.н. и а,а т.п.н. с липкими концами.генома фага Для дальнейшего рестрикционного анализа генома фага ввы

Pral Hindi IIBooRI EcoRI Hlndlll

A I

PvuII 10

г.о

Cl.al ю

2,6

4°'

3.8

Pvul Xbal . Pvutl

PTUI?

HindiII?

Pvul? Hlndlll?

. Xbal?

PvuII?

Hlndlll

Hlndlll

Clal Xbal

Prüll I Prüll

- 1

о 8,0 1 1.0 4. 1.0

PvuII?

Xbal?

Hlndlll? Xbal?

о о Pat I

BaoHI

BglllEooRl Prüll I c?» BaoHI

0.? lo'i 1 1.7

Pat I

К о

BelliM

PvUII

1

0,6 { 0,8 о

Bemffl?

В

Pat И

Prüll? Bglll?

Рис. 1. Рестрикционные карты. Расстояния между ближайшими сайтами рестрикции указаны в т.п.н., масштаб не соблюден. Наличие и положение сайтов ряда.рестриктаз в некоторых районах карт неизвестны. А .- карта области липких концов генома фага »BSh6. В - карта области возникновения делеции d9 в геноме фага «BSh6. Делеция <J9 протяженностью о,з т.п.н. возникла в CleI-Hindlil-фрагменте 1,9 т.п.н. В - карта области липких концов генома фага ВВЫ; жирный участок карты соответствует Вашн1-фрагменту ДНК фага, клонированному в составе плазмиды рСЬР1 в в. ooii.

использовали только варианты опыта с предварительной . обработкой ДНК фага лигазой и с процедурой нагревания и охлаждения ДНК после рестрикции. Суммы размеров фрагментов рестрикции для 7 ростриктаз, определяющие размер генома фага ввы, близки к значению 41 т.п.н. Таким образом, геном фага BBL1 является линейной двуштевой молекулой ДНК протяженное-. тъю около 41 т.п.н. с комплементарными однонитевыми концами.

2.3. Клонирование сое-последовательностн ВВЫ в Е. coli. 7

Провели лигирование и расцепление рестриктазой BamHI ДНК фага ввы. После препаративного электрофореза в легкоплавкой агарозе выделили BamHI-фрагмент 2,5 т.п.н. с oos-ro-следовательностью ввы. Клонировали данный фрагмент в составе вектора pUCi9 в штамме Е. ooli Л1109 (reoAi ). Полученную рекомбинантную плазмиду назвали pCIf 1.-Определили рестрикци-онную карту клонированного BamHI-фрагмента ДНК фага. Размер картированного участка зфомосомы ввы удалось расширить, используя данные о концевых фрагментах генома (рис. 1 В).

3. Векторы для молекулярного клонирования в коринабак- . териях.

Нашими дальнейшими задачами были:. 1 > функциональное изменив в Brevibaoterium клонированных в Е. poli фрагментов ДНК фагов 5>BSh6 и ВВЫ; 2) конструирование векторов для клонирования ДНК в Brevibaoterium,. в том числе векторов с генетическими элементами фагов. Основная стратегия получения рекомбинантных плазмид Корине бактерий, использованная в дан-. ной работе, состояла из двух этапов: 1) в Е. ooli конструировали новые химерные плазмиды; 2) полученные ъ Е. ooli плазмиды 'вводили в Brevibaoterium путем трансформации.

Все полученные в данной работе векторы содержат точку начала репликации плазмиды pSRl (выделена из с. glutamioum) и, таким образом, согласно данным Morinaga et al. (1987)» являются совместимыми с векторами, обладающими точкой начала репликации плазмиды рВЫ (выделена из В. laotofermentum). Совместимость векторов создает большие возможности для генетических манипуляций: 1)'можно амшшфицировать разные гены.

клонируя их в составе совместимых плазмид; 2) клонировав один какой-то ген в совместимых векторах, можно увеличить дозу этого гена и стабильность его наследования в клетках.

3.1. Конструирование бпрепликонных плазыид pSH1, pSH2, pSH210 В pSH220.

Для конструирования бирепликонных плазмид использовали плазмиду pPD9 (6,7 т.п.н. ), которая является молекулярным гибридом: 1) ВашН1-фрагмента 3,7 т.п.н. плазмиды pCG4 С., glutamioum, содержащего детерминант Smr/Spr; 2) критической коринебактериальной плазмиды pSRi о. glutamioum, раскрытой в Bglll-сайте (Katsumata et al., 1984; Yoshihama et al., 1985). Плазмиду pFD9 разрезали в уникальном сайте рестриктазой BglU. Полученную нами ранее плазмиду pUCi9P, представляющую из себя гибрид плазмиды puci9 Е. coli (Арг) и уникального EooRI-EooRi-фрагмента ДНК фага $BSh6 протяженностью 0,8 т.п.н., разрезали в уникальном сайте рестриктазой BamHI. Линеаризованные плазмиды смешали, обработали лигазой фага Т4- и трансформировали смесью компетентные клетки

B. ooli НВ101 (Smr). Селекцию трансформантов проводили на среде с ампициллином (Ар). Трансформанты тестировали на устойчивость к Sp (50 мкг/мл), 11 клонов из 93 были устойчивы к sp. Плазмиды, выделенные из устойчивых к sp клонов, представляли собой гибрида pFD9 и PUC19P. Полученные молекулы

: обозначили pSHi и pSH2 (различные взаимные ориентации pFD9 и РТГС19Р; рис. 2 АБ). Трансформировали плазмидами pSHi и pSH2 штамм В. ooli ОТ1.1 (Sms) и показали, что данные плазмиды детерминируют также устойчивость к sm (50 мкг/мл). Таким образом, генетический детерминант Smr/Spr из плазмида pCG4

C. glutamioum экспрессировался в В. ooli.

Используя аналогичную схему конструирования, получили бирепликонные плазмиды без фрагмента ДНК фага $BSh6. Плазмиду pFD9 разрезали Bglli, а плазмиду pUCl9 разрезали BamHI, после лигирования и трансформации отбор клонов кишечной палочки с рекомбинантными плазмидами осуществляли непосредственно .на среде со-Sp. Полученные бирешшконные плазмида обозначили pSH2iO и pSH220 (различные взаимные ориентации p?D9 И PÜC19; рис. 2 ВГ).

Smal Kpnt EcoRI

Xbal Seil P«tl

sPhI Pvul I

ОГ 1

Prüll

SpHI

EooRI

Рис. 2. Рестрикционные карты бирепликонных шазмид-pSHi, pSH2, pSH2io, pSH220. Жирный участок карты соответствует ДНК фага ФВЗДб, заштрихованный участок - ДНК длазмида püCl9 е. coli, участок"без окраски или штриховки - ДНК коринабак-териальной.плазыиды pPD9..

3.2. Физическая локализация в Б. coli гокатичеспсго детерминанта Spr/anr С. glutamlcun .

Для физической локализации генетического детерминанта Smr/Spr создали.серию делеционных производных плазмиды psm. В качестве'первого шага провели конструирование делецконного производного плазмиды pSHi с помощью рестриктазы Psti. Полученную плазмиду ос5означили pSH4 (9,8 т.п.н., рис. Э). Затем трансформировали штамм в. ooli 0Т11 (Reo+) препаратом плазмиды pSHi, изолированным из штамма 0X11 pSHi. В ходе скрининга плазмидной ДНК из устойчивых к Sp трансформантов обнаружили спонтанный делеционный вариант pSHi, который назвали pSH5 (3,5 т.п.н.; рис. 3). После удаления из штзмвды pSH5 pBti-фрагмента 0,4 т.п.н. была получена плазмида pSHfr (3,1 т.п.н.; рис. з).

'. •Определили уровни устойчивости к Sm и Sp у штаммов, содержащих делеционные производные плазмиды pSHi (рис. 3). Полученные данные позволяют, сделать вывод о локализации детерминанта устойчивости к Sm и Sp на Psti-Sphl-фрагменте цротявенностью 2,2 т.п.н."

о.а 0.4 1.0 • о.6

Pst Г Pst I SphI SpUI ^

" EcoRI EcoRI

pSHi 1 1 2'7

?sm '•■•'•• ' ■,'— | mu 111 mil i ni _—в s»r sp'

lSH5 ' яшшаашя ' S®* SP*

>SH8 ___Sa Spr

■ÜC10 ' Sm* Sp'

=ис. 3. функциональный анализ делеционных вариантов плаз-татги pSHi. Расстояния между ближайшими сайтами рестрикции тсазаны в т.п.н., масштаб не соблюден. Жирные участки карт »ответствуют последовательности BaraHI-фрагмента 3,7 т.п.н. щазмиды рс04, детерминирущего устойчивость к Sp и Sm.

EcoRI EcoRI

ьи

Snir Spr

3.3. Феномен блокирования переноса бирешшконных плаз-шд из В. coll в В. ílavum вставкой EcoRI-EcoRI-фрагиента генома фага <sESh6. Взкторы pSH210, pSH220 в pSH108.

Изучили способность плазмид pSH210, pSH220, pSH1, pSH2 и pSH4 трансформировать протопласты В. ílavum АТСС14067. Трансформирующая- активность плазмид pSH2io и pSH220 составляла 1x1 о2 тр./мкг; у плазмид с EooRi-фрагментом генома фага ®BSh6 (pSHi, pSH2 и pSH4) трансформирующая активность отсутствовала (менее о,1 тр./мкг). В экспериментах по трансформации штамма Brevibaoterium sp. Е531 плазмйдами pSH1 и pSH4 получили 3 трансформанта (0,1 тр./мкг). Рестрикционный анализ плазмид из трансформантов показал, что все они содержат структурные перестройки. Обозначили эти плазмида как pSHiOi, PSH102 (получены из pSHi; 9,¿ т.п.н. и 5,9 т.п.н. соответственно) и pSH40i (получена из pSH4; рис. 4 А). Дот-гибридизация плазмид pSHioí, pSHi02, pSH40i с меченной [32Р] ДНК «BSh6 показала отсутствие фрагмента ДНК фага в составе данных плазмид.

Провели трансформацию плазмидами pSHioi и pSH40i штамма НВЮ1 е. ooll, в качестве селективного маркера использовали устойчивость к Sp. Затем плазмиды pSHioi и pSE40i ввели из Е. ooll в В. ílavum АТСС14067; трансформирующая активность этих молекул была на уровне контрольной активности pSH2lo -1X1 о2 тр./мкг. Плазмида, выделенные из трансформантов В. ílavum, в структурном плане полностью соответствовали исходным плазмидам pSHioi й рБН401.

Отсутствие переноса бирешшконных плазмид с EcoRl-фраг- • ментом ДНК «?BSh6 из Е. ooll в В.- ílavum указывает на то, что перенос блокируется вставкой в эти плазмида EooRI-фрагмента ДНК ®ESh6. Феномен блокирования наблюдается вне зависимости от ориентации и положения фрагмента ДНК фага в плазмида. Мутантные плазмида pSHi01 и pSH40i, образовавшиеся путем генетических перестроек In vivo и лишенные фрагмента ДНК фага, восстановили способность к переносу. Это подтверждает причинную роль фрагмента ДНК фага в наблюдаемом феномене. Обнаруженное отсутствие переноса бирешшконных плазмид со вставкой EooRi-фрагмента генома фага $BSh6 из Е. coli в в. ílavum может быть связано с: 1) гибелью клеток, содержа-

О

щих плазмиду с EooRl-фрагментом ДНК фага; 2) нарушением репликации плазмид с ЕооМ-<5рагментом ДНК фага в В. flavum; 3) наличием в EooRl-фрагменте ДНК фага сайтов, специфических для системы ограничения в. flavum.

Далее мы предприняли попытку локализовать последовательность нуклеотидов, определявшую феномен блокирования переноса плазмид в в. flavum. Для этого путем инверсии Xbai-фрагмента pSHi получили плазмиду pSHi09, в которой EcoRi-Xbal-субфрагменты EooRI-фрагмента ДНК фага (0,4 т.п.н. каждый) разделены последовательностью 2,7 т.п.н. нефаговой ДНК. Провели трансформацию протопластов В. flavum АТСС14067 плаз-мидой PSH109 и показали отсутствие ее переноса в в. flavum (менее о,1 тр./мкг; контрольная плазмида pSH2lo без ДНК $BSh6, выделенная из Е. cjli, трансформировала В. flavum с эффективностью 1хю2 тр./мкг). Таким образом, даже после разрыва EooRl-фрагмента генома »BSh6 в хьа1-сайте плазмида по прежнему неспособна трансформировать В. flavum. Для того, чтобы получить плазмиду с делецией одного из EooRl-Xbal-суб-фрагментов EooRI-фрагмента генома »BSh6 провели следупцие манипуляции. Один мкг ДНК плазмида pSHi разрезали рестрикта-зой Xbal, развели до концентрации ю нг/мкл, обработали ли-газой и трансформировали протопласты В." flavum АТСС14067. Трансформанты содержали плазмиду с ожидаемой структурой, полученную плазмиду назвали pSHi08 (рис. 4 Б). Молекула PSH108 (7,1 т.п.н.) лишена точки начала репликации Е. coli и одного из EooRl-Xbal-субфрагментов EooRI-фрагмента ДНК «BSh6 (А), но-содержит другой субфрагмент (В). Таким образом, после потери EooRi-xbal-субфрагмента А перенос плазмида в В. flavum становится возможным.

Полученные данные позволяют, предположить, что последовательность 0,4 т.п.н. EooRl-XbaI-субфрагмента А EooRI-фрагмента ДНК фага »BSh6 определяет генетическую функцию Biol этого фага, способную блокировать перенос изученных бирепликонных плазмид из Е. coli в в. flavum. Функцию Biol №Sh6 можно пытаться использовать для создания векторов с прямым отбором вставки (вставка должна нарушать функцию Biol s тем самым разрешать существование плазмида в в. flavum).

Изучили стабильность наследования в в. flavum АТСС14067

О

Рис. 4. Рестрикционные карта плазмид. А - карта плазмида PSH401, возникшей в результате рекомбинации in vivo. Стрелками внутри окружности указан инвертированный повтор. Б -карта плазмиды pSHi08; тарный участок карты соответствует * ДНК фага «>BSh6. В - карта бирепликонной плазмиды pCLF3; жирный участок карты соответствует ДНК фага ВВЫ, заштрихованный участок - ДНК плазмиды püci9 Е. coli. Г - карта плазмиды рУУ1; заштрихованный участок - ДНК плазмиды pUCi9.

плазмид pFD9. pSH210, pSH220, pSH401, pSH101, pSH102 И PSH108. Плазмида pSHioi при росте в неселективных условиях терялась с частотой ixio~1 на 1 поколение. Частота потери остальных плазмид составляла 1X1 о-3. Высокая нестабильность pSHi01 может быть связана с делецией значительной части генетического материала плазмида pSRi, репликон которой обеспечивает репликацию молекулярных химер в в. flavum.

Ввели плазмида pSH2io, pSH220, pSH40i и psinos в С. glutamioum путем трансформации и показали их структурную стабильность в этой глутаматпродуцирующей коринебактерии.

Итак, получены стабильные в структурном отношении (в том числе и при межвидовом переносе) и стабильно наследующиеся челночные ллазмида pSH2i0, pSH220 и pSH40l для бакте-. риальной системы Е. coli - коринебактерии. Все указанные плазмида сообщают коринебактериям и кишечной палочке устойчивость к Sm и sp, кроме того плазмида pSH2l0 и pSH220 сообщают кишечной палочке устойчивость' к Ар. Плазмида PSH210 и PSH220 содержат, уникальные сайты рестриктаз Kpnl, Sali, Smal, Xbal вне маркерных генов и участков, необходимых для репликации, и являются клонирующими векторами. Кроме того, плазмида pSH2io содержит два расположенных близка сайта Peti, которые также можно использовать для клонирования.

Перенос плазмида pSHi08 в В. flavum не блокирован тем фрагментом ДНК «BShß, который она несет. Так как фрагмент ДНК.фага »BSh6 в плазмиде pSHi08 является достаточным для гомологичной рекомбинации с фагом, то есть основание рассчитывать на возможность использования этой плазмида или ее производного для транедукции В. flavum. Плазмида pSHi08 содержит уникальные сайта Kpnl, Psti, Pvuli, Smal и Xbal вне маркера Spr/Smr и области, необходимой для репликации в ко-ринебактериях. Возможно использование плазмида pSHioe в качестве вектора при клонировании генетического материала непосредственно в коринебактериях. •

3.4. Челночные плазмида PSH401 и pSH403 - векторы для прямого отбора трансфориантов с гибридными плазмидаыи.

Представляла интерес возможность использования в качестве вектора плазмида pSH40i, возникшей в результате ре-

комбинации in vivo. Рестрикционная карта плазмида pSH40l (рис. 4 А) указывает на наличие в ее составе инвертированного повтора участка плазмида рис19 протяженностью не менее о,2 т.п.н. Известно, что плазмида с протяженными непрерванными палиндромами в Е. ooli нежизнеспособны (Hagan, Warren, 1982). Поэтому можно было предположить, что между элементами инвертированного повтора имеется область "пробела", обеспе-. чивающая жизнеспособность плазмида. Согласно рестрикционной карте эта область "пробела" расположена внутри Psti-фрагмента 0,9 т.п.н. Действительно, мы показали невозможность получения делеции. в плазмиде pSH40i с помощью рест-риктазы Pstl. Вместе с тем, нам удалось получить серию плаз-мид, в которых Psti-фрагмент 0,9 т.п.н. плазмида pSH40i был замещен на иные фрагменты ДНК. В частности, таким образом была получена плазмида pSH403, содержащая Psti-фрагмент 1,3 т.п.н. с геном устойчивости к канамицину (Km) из плазмида pUC4K (Yanish-Perron et al.* 1985). Плазмиду pSH403 ввели в в. flavum АТСС14067 путем трансформации. Отбор трансформантов вели: 1) по устойчивости к Sp и Sm; а также, парал--лельно, 2) по устойчивости к Km; эффективность трансформации в обоих вариантах опыта составила 1X1о2 тр./Мкг. Проанализировав плазмидную ДНК из 10 трансформантов, показали, что плазмида pSH403 является структурно стабильной в В. flavum.

Нежизнеспособность плазмид с протяженными инвертированными повторами без "пробела" была использована для создания векторов для прямого отбора трансформантов с рекомбинантными плазмидами в streptomyces' (Kleser, Melton, 1988) и в Strep-tooooous (Prats et al., 1985). Полученные нами челночные плазмида рвН401 и pSH403 являются векторами для прямого отбора в е. coll, а возможно и в коринвбактериях, бактериаль-.них клонов с рекомбинантными плазмидами.

3.5. Трансдукция В. fiaran фагоы BBL1 с помощью плазмид, содержащих ■ сов-последовательность BBL1. Векторы рСЕРЗ я pC£F4.

Следуя плану создания космидаого вектора, мы пытались клонировать cos-последовательность ВВЫ В Brevlbaoterium путем предварительного конструирования в Е. coli бирепликон-

них шшздад из плазмида рсъ?1 (представляет собой плазмиду PÜC19 со вставкой BamHI-фрагмента генома ввы протяженностью 2,5 т.п.н. с ооа-последовательностью, см. раздел 2.3) и ко-ринебактериальной плазмида p?D9. Однако такие химерные плазмида оказались нежизнеспособны в Б. coli. Чтобы стабилизировать бирепликонные химеры, клонировали укороченный фрагмент с сов-по'следовательностью ввы. Для этого в плазмиде рСЬР1 с помощью рестриктаз EooRl и BamHl провели внутримолекулярные перестройки, в ходе которых был утерян BamHi-EooRi-фрагмент ДНК ВВЫ 1,4 т.п.н., но сохранился BamHi-EooRI-фрагмент 1,1 т.п.н. с сов-последовательностыо BBL1. Полученную плазмиду назвали pCLF2. Для получения би-репликонной молекулы ДНК плазмиду pCbF2 разрезали в уникальном сайте BamHl, коринебактериальную плазмиду pPD9 с детерминантом Spr/Smr разрезали в уникальном сайте Bglll, полученные препараты ДНК смешали и обработали лигазой. Для трансформации лигированной смесью использовали штамм JM109 Е. coli (геоА1), отбор трансформантов вели по устойчивости к Sp. Выдоленныеиз трансформантов бирепликонные плазмида обозначили рСБРЭ (рис. 4 В) и pCLF4 (содержат различные ориентации вставка p?D9 в pCLP2). Подтвердили наличие фрагмента ДНК фага ВВЫ в плазмидах рсь?з и рсь?4 дот-гибридизацией этих плазмвд о меченной [32Р] ДНК' ввы.- Ввели рсиз и pCLP4 в штамм Brevibaoterium ер. Е531 путем трансформации (эффективность - 1x10^ тр./Мкг) и рестрикционным анализом показали структурную инвариантность этих плазмид в Е. ooli и Brevibaoterium.

Далее мы исследовали способность клонированной оов-области функционировать в качестве элемента, необходимого in ois для упаковки ДНК в капсид фага. Выращивали фаг BBL1 на содержащих плазмида рсьрз и pCLF4 клонах штамма вге-vibaoteriumsp. ©31 (табл. 1). В качестве контролей использовали штамм Brevibaoterium ер. Е5Э1, а также этот штамм с плазмидой pSH2io. Плазмида pSH2io, как и плазмида рСЬРЗ и pCL?4, является гибридом рис19 и рЯ», но, в отличие от рсыэ и рО£Р4, не содержит вставки ДНК ввы. Определяли способность полученных препаратов фага осуществлять перенос плазмвдного маркера Spr в штамм в. fiavum Ritr, т.е. транс-

Аудировать этот штамм. Рестрикционный анализ плазмидаой ДНК из трансдуктантов свидетельствовал о инвариантности структуры плазмид до и после трансдукции.

Таблица 1. Частоты трансдукции В. Пауит МГГ фагом ВВЫ.

Множественность Число инфекции трансдуктантов

на 1 БОЕ

Вгеу1Ьа<^ег1ит вр. Е531 0,02 < 1,0x10-6

Вгеу1Ьао4ег1ит вр. Е531

РБН210 0,04 < 5.0ПО-7

Brвvibaotвrium вр. Е531

рСЬРЗ' 0,02 . 1,5хЮ~4

Вгеу1Ьао1;ег1ит вр. Е531

• РСЬР4 0,02 . 1,4x10-4

Данные табл. 1 показывают, что наличие фрагмента ДНК фага ВВЫ с сов-последовательностью является необходимым условием для переноса плазмид. По-видимому трансдуцируицие частицы образуются за счет упаковки мультимерной плазмидаой ДНК в капсид фага, при этом оо'в-сайт играет роль специфического о1в-элемента, необходимого для упаковки.(Ее1вв et а1., 1982).

Далее определили стабильность наследования плазмид рсы'З, рсь?4 и контрольной плазмиды рэнгю в штамме Вгеу1-Ъао+,ег1иш ер. Е531. Все указанные плазмиды терялись с частотой 1x1о-3 на 1 поколение. Таким образом, вставка ДНК фага . ввы не оказывала дестабилизирующего влияния на наследование плазмид. .

Итак, нами получены плазмиды рСЬРЭ и рси4, которые можно переносить в в. Науит путем трансдукции фагом ВВЫ.

Донорный штамм

Плазмиды рСЬРЗ и pClF4 содержат уникальные сайты рестриктаз Xbal и Sali вне маркерных генов и участков, необходимых для репликации, и являются векторами. Кроме того, плазмида рсиз содержит два расположенных близко сайта Pstl, которые также можно использовать для клонирования. Способность вектора к переносу фагом предоставляет значительные удобства для введения клонированного генетического материала в штаммы кори-небактерий, так как трансформация протопластов коринебакте-рий является довольно длительным и трудоемким методом. Весьма перзспективно создание для фага ввы системы упаковки ДНК in vitro' и использование этой системы для упаковки рекомби-нантных космид.

3.6. Клонирование и экспрессия в В. Xlavua генов аспартатгашззы С. glutaraicura.

Перодельчук и др. .(ВНИИгенетика) клонировали в Е. ooU ген asd с. giutamiovan (детерминирует аспартатполуалъдогвд-дегидрогеназу) в составе фазмидного вектора *рЗЬ5. Одна из полученных фазмид со вставкой гена аэй получила название pasd3. Известно, что ген asd С. glutaraioum является сцепленным с генами lysftx и lyaQß (reí« lysCeß детормширувд ßcnap-таткиназу - ключевой фермент биосинтеза лизинаj kalinowski et ai.. 1990; Poiiettie et ai., 1990), Нашей задачей было субклонирование, в в. fiavum генов 1узСз£, которые возможно были клонирована в В, coli Передельчуучсм и др, в составе фазмид, отобранных по февотдау Аеа*.

Препарат ДИК фаэшун рАЗРЗ, выделенный нами из штамма В. ooli SH30f. содержал примесь плазмиды с низким молекулярным весом. После трансформации штамма SH309 с помощью этого препарата ДНК нам удалось выделить клоны, которые не содержали исходной фазмиды pASD3, а содержали только ее делецион-нбе производное, обозначенное нами как pYYi (рис. 4 Г). Так как плазмида pYYi сообщала штамму SH309 (asi") способность к росту без добавки диаминопимелиновой кислоты (Asd+), ген asd не был затронут делецией. Далее мы ввели плазмиду pYYi в штамм Е. ooli GZP106M1, содержащий генетические дефекты в генах, ответственных за изоферменты аспартаткиназы е. coli (thrA metlíi lysc). Комплементации этих мутаций штамма

01РЮ6М1 при введении плазмида pYYi не наблюдали. Основыва-, ясъ на рестрикционной карте Kalinowski et al. (1990), ДЛЯ клонирования в в. fiavum выбрали генетический материал Sall-BaiEHl-фрагмента pYYi протяженностью 4,1 т.П.н (рис. 4 Г). В ... качестве предварительного этапа получили делеционное производное плазмиды pYYi с помощью рестриктазы BamHI. Полученную плазмиду обозначили рУУ2 (8,0 т.п.н.). Клонировали Sall-Sali-фрагмент 4,1 т.п.н. pYY2 (содержит генетический материал saH-BamHi-фрагмента 4.1 т.п.н. рУУ1) в составе вектора рсьрз в штамме Е. ooli JM109. Полученную рекомбинантную плазмиду обозначили pCLF5- Ввали плазмиду pCli^ в вташы Brevibaoterium ер. Е5Э1 И В. fiavum Rlf1" путем трансформации. Показали, что плазмида pCLF5 сообщает штамму в. fiavum Rifrs 1) устойчивость к аналогу лизина АЭЦ (750 мкг/ыл. АЭЦ + 750 мкг/мл треонина в минимальной среде Гловера); 2) способность продуцировать лизин в ходе ферментации (около 5 г/л){ з) повышенную не менее чем в ю раз активность "ас-партаткиназы. Указанные свойства плазмиды р&ДО доказывают, что: 1) в составе этой плазмиды клонированы гены 1увСаР С. glutamioum; 2) гены lysCap с. glutamloum акспрессируются в в. fiavum. Далее показали способность фага ВВЫ переносить плазмиду рОШ с генами lysCap в В. flavum' (3x10~4 трансдук-тантов на 1 БОЕ) и Brevibaoterium sp. Е5Э1 (2*10"э трансдук-тантов на 1 БОЕ). Таким образом, способность космиды рсщрэ к переносу Фагом ввы не теряется при клонировании в данном векторе дополнительного генетического материала. Возможность : переносить путем трансдукции космиду pOXF5, несущую гены аспартаткиназы, упростит использование этой плазмиды ори создании плазмидного продуцента лизина.

вывода

1) Показано, что геномы фагов *BSh6 и BBL1 В. fiavum состоят из двуштевой ДНК, являются линейными и содержат' липкие концы. Показано отсутствие близкого родства мезду фагами ®BSh6 и BBL1. Размер генома »BSh6 - около 71 т.п.н, размер генома ВВЫ - около 41 т.п.н. Построены рестрикцион-ные карты областей оое-последовательностей фагов »BSh6 и

BBL1. Получен делеционный мутант фага фвбп6 и построена рес-трякционная карта области возникновения делеции. Осуществлена трансфекция штамма Brevlbaoterium sp. Е531 с помощью ДНК фага ввы.

. 2) Установлена экспрессия в е. ooli генетического детерминанта устойчивости к Sm и Sp из плазмида pCG4 с. gluta-mioum. Путем делеционного анализа в Е. coll доказана локализация детерминанта устойчивости к Sm и Sp на Psti-Sphl-фрагменте ДНК протяженностью 2,2 т.п.н.

3) Получены челночные векторы pSH2io и pSH220 для бактериальной системы Е. ooli - коринебактерии. Получен вектор PSH108 для клонирования генов коринебактерий в гомологичной системе. Получены челночные векторы pSH40i и pSH403 с протяженными инвертированными повторами для бактериальной системы В. ooli - коринебактерии. Плазмида PSH401 и pSH403 являются векторами с прямым отбором трансформантов Е. ooli с рекомбинантными плазмидами.

4) Показано, что определенная последовательность нукле-отидов'из уникального EooRl-EooRi-фрагмента генома фага

; *BSh6 в составе бирешшконных плазмид pSHi, pSH2, pSH4 и PSH109 блокирует перенос этих плазмид из е. ooli .в В. flavum.

5) Получены челночные векторы рСЬРЗ и рсь?4, содержащие cos-последовательность фага ввы в. flavum. Проведено клонирование в составе вектора рсьрз генов lysCa и lyscp с. giu-tamioum, детерминирующих аспартаткиназу, показана экспрессия этих генов в В. flavum. Амплификация в в. flavum генов lyeCop привела к увеличению активности аспартаткиназы более чем в ю рвз.

' 6) Показана трансдукция в. flavum фагом bbli с помощью полученных космид рсьрз и pCU4, а также космида рсьрэ со вставкой генов аспартаткиназы с. giutamioum.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ,

опубликованных по теме диссертации

1. Толмачев О.Э., Ростова Ю.Г., Гусятинер М.М.// Изучение биологических и физико-химических свойств фага $BSh6, размножающегося на Brevibaoterium riavum. Экспресс-информация Минмедмикробиопрома СССР "Микробиологическая промышленность. Отечественный производственный опыт", М., 1988, вып. з, с. 8 - 11.

2. Толмачев О.Э., Ростова Ю.Г.// Конструирование космидного вектора для продуцента аминокислот Brevibaoterium flavum. Тезисы конф. "Аминокислоты для сельского хозяйства, пищевой промышленности и научных исследований", M., 198S, с. 32 -33.

3. Толмачев О.Э.// Использование делеционного картирования

в гетерологичной системе для локализации генетических детер- • минантов Corynebaoterium glutamioum. Тезисы конф. "Биология культивирования и биотехнология микроорганизмов", Ташкент,

1989, с. 81.

4. Толмачев О.Э.// Генетические детерминанты устойчивости-

к ингибированию стрептомицином и спектиномицином из Corynebaoterium glutamioum экспрессируются в Esoheriohia ooli. Тезисы конф. "Лимитирование и ингибирование роста мгкроорга- . низмов", Пущино, 1989, с. 86.

5. Толмачев О.Э.// Метод выделения плазмидной ДНК из Corynebaoterium glutamioum и Brevibaoterium flavum. Биотехнология, '

1990, N 1, с. 25.

6. Толмачев. О.Э.// Использование рекомбинационного зондирования для обнаружения фрагмента ДНК фага. Тезисы симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов", М., 1990, с. 283.

7. Толмачев О.Э.// Изучение феномена блокирования переноса бирешшконных плазмвд последовательностью ДНК фага

s>BSh6 Brevibaoterium flavum. Тезисы конф.-"Молекулярная биология и медицина", JI., 1990, с. 41.

,8. Толмачев О.Э.// Вставка вирусной последовательности ДНК в бирепликонные плазмида блокирует их перенос. Тезисы конф. "Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии", Владимир, 1990, с. 6-7. VRZL^-ué'