Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование методом сайт-специфического мутагенеза кассетного вектора для изучения структуры и функции генома вируса ящура

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование методом сайт-специфического мутагенеза кассетного вектора для изучения структуры и функции генома вируса ящура"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАЕЗ-^ТЫ ЖИВОТНЫХ

п Г'""

'П5

U

1 5 t'jAS» 1аЗЗ На правах рукописи

. УДК 575. 858. 43:578. 835.

АНДРЕЕВ Владимир Георгиевич

kokcikeípcbsfns estofes c.'jít-сиещгфз-^гесг'юго путлгшезл

плссзпюго ВЕИ7с?& для структуры и ъушщ

rasa ElfP'/CA 5ТДУРА.

СС. 00. Об "Вирусология'1

Автореферат диссертации ,на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Владимир - 199S

Работа столчена во Всероссийском кау-тко-исследовательском институте защиты животных.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛЕ

- ЛЕРЕВОЗЧИЕОВА Е А. - кандидат гиолсгпчгсгах наук,

старакй научный сотрудник

01-Ш1КАЛЫШЕ ОППОНЕНТ-Т:

- ^¡"ЯЕШгО Владимир Александроаич, дсктор еегеринарних яг;*:, 5с.ьзг:/<сзуЛ ^лабораторией ( Всероссийский научно-ксс-глдог.&.-ельокпй институт защиты ккеотных, г. йяа;;П:-;ир)

- Ц:-:БА1ЮВ Годном Нимьякоеич, кандидат биологических наук, еаведуавий лабораторией ( Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии я мпквобиого-п;н, г. Покров)

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЙ ' Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии, г.Ызскза.

Защита состоится _ 1993 г. в 10 '-асов ка

заседании специализированного совета К ir_-D.60.01.no заа$!те диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных по адресу: 600300, г. Владимир, п. Юрьевец, ЕГЖШ.

С диссертацией могио озкакомлтъея в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института зашиты животных. • л /;

Аг-торесбзрат разослан гУ п" февраля 1993 г.

Ученый со>чнт:гфъ специа.-щр.ярованного совета - Узшов Б. Л.

/,;:туалъ::осг7. tsmle изучение вируса япура-возбудителя болезни парнокопытных кизогных имеет большое экономическое значение л представляет несомненный научный интерес. Анализ литературных данных ' свидетельствует,что основные усилия исследователей сконцентрированы,главным образом,в области создания нового поколения вакцинных препаратов и диагностики изолятоз вируса методами молекулярной биологии.

Основные трудности- создания синтетических противоя-иуркьк препаратов генно-пнкэлеркыми методами связаны,прежде всего,с недостаточной изученностью принципов пространственной организации акт:1гс.-шшх зпктопоз и вагакомерностей образования оптимальной пространственной структуры белков. Одним из наиболее эзфектизкых путей решения этих вопросов является получение точечных" сайт-специфических мутаций с изучением влияния произведенных изменений на пространствен-. дую структуру к свойства полученных мутантов. Без осуществления подобной программы с накоплением большого фактического материала, удовлетворительно решить задачу создания' принципиально новых синтетических противояшурнын препаратов не представляется зсзмохкьм. •

Принимая во ■ зкшаяиэ-вышесказанное,целью нашей работы являлось создание простой и зысокоз^ективкой схемы сайт -специфического мутагенеза, позволяющей производить все типы мутаций в' любом участке генома вируса яцура или лкбо-го другого достаточно изученного объекта.

Используя разработанную cxei^-сайт-специфического мутагенеза, предполагается создание 'кассетного вектора для внесения -точечных мутаций или целых блоков замен,включая полное замещение■участка;в области основной антигенной де-•терминанты гена белка VP 1 вируса ящура кг1 N 550 с целью изучения структурно-функциональной организации важнейшей" антигенно - значимой ' области и конструирования антигенных гибридов при создания синтетических вакцин [Reidhaar-Olson. F. е. а. 1988, Veils J. А. е. а. 1985 ].

Весьма ценной особенностью предлагаемого кассетного

- ls -

вектора является возможность переклонировакия вариантов с измененной структурой в полноразмерную кДНК копию генома вируса яшура А 2.2. по уникальным сайтам рестрикции. Это позволит изучать влияние внесенных изменений не тал:-ко ка уровне отдельных фрагментов или химерных молекул,но так:® в составе инфекционных кДНК копий генома,РНК-транскриптов или даже цельных вирионов. В качестве примера,иллюстркрую-и:?го целесообразность и универсальность подобного подхода молшо привести исследования,проведенные с полковирусом,наиболее изученным объектом из семейства пикорнавирусов [ Kuhn R. J.e. а. 19831.

Одним из эт&пов разрабатываемой стратегии сай'.'-специ-(рического .мутагенеза является избирательная, строго специфичная амплификация генетического мате-риала в полимеразной цепной реакции. Кроме того,метод полимеразной цепной реакции с последующим анализом первичной структуры секвестрованием амплифицкрованного участка является наиболее з$фэктивньы,к,одновременно,предельно точным для идентификации различных штаммов и иаолятоз вируса.

Для этого имеются две основные предпосылки:во-первых, генетический материал в полевых образцах характеризуется очень небольшим количеством и чрезвычайной гетерогенностью, что обусловливает невозможность или проблематичность применения традиционных методов клонирования;во-вторых, пассирование, вируса через животных или культуры меток с целью наработки больших количеств. • очищенного генетического материала может привести к изменению первичной структуры (особенно вариабельных,антигенно-значимых участков) и невозможности адекватной идентификации данного изо-лята. Экспресс-диагностика.клиничёских образцов и прената-льная диагностика с применением метода полимеразной цепной реакции ухе проводится для идентификации множества инфекций, 'а тип'крование- препаратов вируса яшура, поступающих г.о Всемирную справочную лабораторию" в Пирбрайте с помощью анализа первичной структуры осуществляется с 1987 года

С Beck Е. е. а. 1987 3.

. i'arjj и задачи ггсслэдогаггкя. Основной целью.работы явилась разработка стратегии сайт-специфического мутагенеза и конструирование кассетного сектора для изучения структурно-сункц'поналъннх взаимодействий области основной антигенной детерминанты гена белса VP/- вируса язура А53 !,'550 ( ЕЯ Asp N550). Для достижения поставленной цехи ке-обхэдшз было ресить следующие задачи:

-разработать схему сайт-специфического ¡лутагене?а;

о

-рассчитать уакверсальннэ драйверы для ¡збирательной гена белка VP^ различных типсз л н.та;.:-

i.iDB вируса;

-оптимизировать методику полимеразной цепкой реакции для получении препаративных количеств гена белка VRj вируса яшура;

-изучить возможность применения разработанной стратегии для соверпгёкствовакия методов диагностики;

-провести сзйт-специфический олпгокуклеотид - направленный мутагенез области основной антигенной детерминанты гена белка VP* ЕЯ А22, N550;.

-сконструировать вектор для проведения кассетного мутагенеза области основной' антигенной' детерминанты гена бежа VRj; ■

-получить ■ зсикзрЕкй ген белка VP4 кассетнш мутагенезом, заменив фрагкэнт основной антигенной детерминанты (130-150 а.о.) гена белка VP^ ЕЯ коо M55Q на аналогичный сшгеткчэский станма 0^ N194 и шжпелть возможность пероглонированкя антигенной ни;,¡еры в различнее экспрэсснрущне векторы; Пзучкая Еов;зиз и пргкпяссказ значимость,.

В результате проведенных исследований предлогьча ■ стратегия сайт-специфического .мутагенеза гена белка VR. вируса яаура, рассчитаны универсальна праймерн. поаколе-юцие осуществлять юггиповую ампдифшкшкп гена белка VR. . Определены оптклальнш условия проведении полимер-юно/:

- б -

цепкой реакции и показана возможность ее применения для идентификации и дифференциации различных изодятов вируса ящура. Проведен сайт-специфический олигонуклеотид-направ-ленньй мутагенез области основной антигенной детерминанты гена белка VP^ БЯ Agü N550 и получен кассетный вектор. Осуществлен кассетный катагенез фрагмента основной антигенной детерминанты гена белка VP^ ВЯ А 32 С130 - 150 а. о.) с заменой его на аналогичный синтетический штамма О N194. Показана принципиальная возможность и проведено переклонирование созданной антигенной химеры з различные зкспресск-р ■ сдие' векторы.

ЛкраоглЕз результатов кесло^оЕяий: материалы диссертации долом ны на :

- всесоюзной конференция "Научные основы промыиленно-го производства ветеринарных и биологических препаратов", г. Москва. 1991г.

- международной конференции "К новой стратегии борьбы с ящуром", г. Владимир, ,1991г.

ПуСдияэдии результатов ксйведапазшй: основные положения диссертации отражены в 4 печатных работах.

Структур?, ¿: о&bs>í работы. Диссертация содержит следу- ■ вцие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты 'и их обсуждение, выводы, список лптерату-ры, включающий 205' ссылок на источники литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста и иллюстрирована 30 рисунками и 2 таблицами.

lía зацсту выкосятся. ■ .

•1. Схема сайт-специфического мутагенеза для направленного изменения генома вируса яшура.

2. Стратегия молекулярного клонирования для сайт-специфического мутагенеза.

3. Оптимизация полиыеразной цепной реакции для быстрой Идентификации вирусных изолят-ов.

"..Метод сайт-специфической модифихаши гена белка VEf вируса ящура.

5. Вектор для проведения кассетного мутагенеза области . основной антигенной детерминанты гена белка VP/| ЕЯ

А 22 N550.

6. Метод кассетного мутагенеза у. аятигекньи гибрид гена -белка W\ ВЯ N550, несущий фрагмент антигенной детерминанты (130-150 а. о. ) гена белка VP,) ВЯ 0^K1S4.

СОБСТВЕННЫЕ КССЛЗДОВШй.

ГАТЕРИЛШ И ЬЗТОДЫ.

В работе использовали' латинизированные,культуральные в БНК - 21 и афтозные материалы штаммов вируса япура A N550, О,, N194, О., N1618, Азия ^ Н48 и полевых изолятов О л N1445 и 0>¡ N1492.

для трансформации использовались следующие штаммы Е.coli,полученные из ВНИИ генетики (г. Москва):

ÎG-1 . (lac,pro), thi, strA,supE,endA,sbcB, hsdR-,

F'fcraDSo, pro A3, lad ,z 1&5 RZÎ032 Ufr КLÎ5 РЭ/45ЕlysA(61-62)3 ,dutl,ungrl,thil, .reAl, zbd - 279: : TnlO, sup E44, amy4. arol

Для клонирования использоезлись следующие векторы: М13кр 8, pUC 9,-pUG 19, pPL ("Pharmacia") и pTNF 314 (Ко-робко В. Г.» ЙВХ. г. Москва).

Шгакмы' бактерий выращивали в питательной среде TY. Твердые среды содержали 1,5 Z агара. Елазмиды поддерживали 'в штампах клеток Е. col i добавлением в среду ампициллина (50 ккг/мл). Влгзтки серии pUC и фаги серии шр со встав-

• ками фрагментов кДНК отбирали, используя среды, содержание Х-gal и IPTG. Для отбора рекокбинзнтяых плазмид тршюфор-манты высевали ка твердый агар, содержащий 100,к«;г.':.:л vtvr,v.-

•цшина. Бри работе с нитевидны?® йагами Ш3 кспользс^ли верхний слой-0,5 Z агарозк в 0.Q9M HaCl.

Tp2Kc5apjsiipi2 iüísxok Е. calí. Компетентные клетка Е.соЬ готовили по «одифяцированному методу Козна и Ледер-

• берга [Cohen J. е. а. 1972].

Еыделзнкэ 1$агоз и пяазмид. Выделение двухцепочечной

фаговой и плаамидной ДНК проводили путем разрушения клеток Е. col i щелочным лизисом. От клеточных белков ДНК очищали смесью фенол-хлороформ. Освобождение от, высокомолекулярной клеточкой РНК осуществляли высаливанием 0,3 М ацетатом натрия pH ?,0. Окончательную очистку проводили хроматографией на колонке CL-2B. При аналитическое ввделенш пробы обрабатывали РНКазой А.

Лха-кз пэршгчкон структуры. Секаенирование проводили энзимагическим методом Сэнгера [Sanger F.е. а. 1977] или методом химической модификации Кзксама-Гилберта С Махал А. М. е. a 19771.

Етп^итерный анализ. Выбор универсальных праймеров и прайме ров для мутагенеза осуществляли анализом последовательности генома вируса ящура с помощью программы парного выравнивания на основе алгоритма Нидлемана и Вуниа CNoedleman S. В. е. а. 1970]. Расчет вероятностных схем спаривания праймеров проводили по методу определения оптимальных вторичных структур Дукера tZuker № 1985] с использованием энергетических правил Слэсера [Slaser W. 1977].

Сайг-епаця.5}:чгс1ап1 ьг/тагснеа. Олигонуклеотид-направленный, сайт - специфический мутагенез с фекотипической селекцией мутантов осуществляли методом Кункеля [Kunkel Т. А. 19853. • ■

РЕЗУЛЬТАТЫ ССБСПВЕНЛЫХ ИССЛЕДСШЦШП.

Задача создания конструкции для изучения структурно-функциональных взаимоотношений области основной антигенной детерминанты гена белка VPj¡ методом "кассетного" сайт-специфического мутагенеза включает несколько самостоятельных эгапоз исследований, составляющих единый цикл осуществления, 'сайт-специфического мутагенеза генома вируса яшура.

^ Разработка стратегии. .

Сайг - специфический мутагенез - введение заданной мутации Е заранее определенное место генома представляет

• - 8 -

особый интерес для изучения связи структуры и функции.

Главные преимущества метода заключается з следующем.

1.?а5о-*кэ гипотезы о структурно-функциональных взаимоотношениях в биологических макромолекулах можно проверить строгий и прямым экспериментом.

2. Если представления о структурно-функциональной организации данной макромолекулы развиты в достаточной степени, то этим кз методом модно направленно изменить ее свойства.

3 рамках этой работы целью-наших исследований являлась ргзрзбзтка стратегии сайт-спэцифичэского луг.игеяеза и конструирований векгсрз. для проведения кассетного мутагенеза: области основной антигенной детерминанты гена белка YPд вируса гяура Л 22 !! SSO,

4x3 достий^нкл пол;; на-,к продлогзна слоду;о2;ал схема (ряс. 1). В качестве к;;пзи;< мутагенеза выбрать основную скгкгэшгуэ дегермпннпгу гена бэлка VP4 вируса ящура Ао% Н 550, а именно район ISO-160 а.о.-, как наиболее вариабельный п интересно с тащен зрешвт функциональной" значимости. ДйЗ проведения сзйт-сяощ*ачзского мутагенеза клонировать ген белкз \'Р/. ,-мллхф:шарованный з пол^м-эразной цепной реацкв о зкрусноД ?НК, в фагэ ШЗ пр8. Для амплификации гака бзлкз, УРд рзеоч;:тать структуру сннтетичзскин олпгону-¡тлоотйднчх пра&'.егов, 'фланкирую™;::; последовательность гена бэлка n позеоля1с:;;-!Х осуществлять синтез обеих цепей кДНК гашш фрагмента. Грпчзм, в:зя в вид У пригодность данной мэ-. тодк::;: для прозз^ож: 'экспресс-дипгвостлки^структура прай-мэрол должа бить по возмол-хег;: болэе универсальной, т. е. прзвогягь проводить а:,!пл1;фл!<гц:ю данного гена, как итакма И 550,таг; к других типов, подтипов к етшйюв вируса. В качества вектора шгекуаяряого (клонирования выбрята Фчг М13, как данный лектор позволяет оеусрствлять ряд методик: клонирование,цветной скрвякнг рекокбияаятов, секв'е-■ шгрованпе и сайг-сввцкфичосккй мутагенез. Такой енгокий спектр возможностей обусловлен тем, -что шаг ЮЗ представ-

ллет собой биологическую систему разделения цепей ДНК

VP 1 FMDV А22/550 tso

по

7h

+

(0.0.)

PCR \

I

Cloning M13 mp 8 \

I

Site-specific Oligonucleotid-Directed. Mutagenesis

Kpn 1 Nco 1 Sau 1 EcoR 1

UCCCXMXXXXJ&ltäCCCCMXICC СМ&ШСАСССССССМССШАССС TCAÜCCCÜCÜAÜÜCICCCC: cia.ccnccG CATGG7CCCC7GCCCCnCAiCACGCCTCCACGGTAC CCCICICCCCCCCICCATCTCCGACI CC<XCGCT(X»«CCCCCACrTCttWCCCTtM

M 13 mp 8(VP1 A22 /550)

\

'Рис.1. Стратегия конструирования кассетного вектора.

Сайт-специфический олигонуклеотид-направленный ■мутагенез проводить методом 'биологической селекции в ура-цил-репарационной системе. Методом сайт-специфического мутагенеза основной антигенной детерминанты гена белка сформировать уникальные сайты рестрикции в следующих локу-сах: 130,140,150 и 160 а. о. . Для этой цели рассчитать му-тактные -синтетические олигснуклеотиды, несущие. в своей

структуре сайты соответствующих рестриктаз. Проведя серию

о •

ыутагенезов,получить.кассетный вектор,представляющий собой рекомбинантну» ДНК фага Ml?, с клонированной в полилинкере последовательностью гена белка YP^ вируса яшура N ,550, антигенная детерминанта которого кодифицирована указанным образом. Данная конструкция позволяет ' проводить точечные

мутации.или целые блоки мутавдй(аамены,встазки,делеции) в пределах основной .антигенной детерминанты гена белка VP,|, то есть района 130-150 а. о.. Используя конструкцию,провести кассетный мутагенез,заменив фрагмент 130-150 а. о. гена белка VP/| пггамма А 2? N 550 на аналогичный синтетический штамма Од N194. Факт мутагенеза подтвердить .анализом первичной структуры указанного района.

Расчет eiscrsEKecrco: олгоггуклс-эисзоз.

Соответственно основным направлениям работы необходимо было рассчитать три группы праймеров.

1. Универсальные праймеры для а.чшлкфикгш:и гена белка

VîV

2. Мутаятнке олнгоаукяеотиды для проведения сайт-специфического мутагенеза основной антигенной детерминанты.

3. Синтетические фрагменты основной антигенной детерминанты (130-150 а.о.) гена белка VP4 вируса яшура Од N194 для осуществления кассетного мутагенеза.

Прзймзры 'для а\яшс&Есацки додляы фланкировать ген, то есть "прямой" прайме? комплементарен нуклеогилной .последовательности К-конца гена белка VP^.a "обратный"- аналогичен структуре с-козцз гена белка. Структура их определялась таким образом,чтобь^ обеспечить достаточно прочную и спенкфичкуо посадку на еозмозгко большее число патриц различных тшоз,шта5л.:0з и кзолнтов вируса.

' Вторая группа-это мугантньз олигонуклеотиды для сайт. специфического кутагепеза Исходя' из' цели работы-создания кассеты з области основной антигенной детсрминзн^'ы,необходимо было сформировать сайты рестрикции в локусах 130,140, •150 и 160. а,- о.... гена белка VP4.- Выбор сайтов определялся требованиями уникальности для клонированного участка гено-' ма и максимальным соответствием структуре места мутагенез». C'Rûberts R. J. 1S853. В результате расчетов быта определены . еледутадие сайты: КрпЩЗО а. о.), Neo I (14.0 а. о. ), Sau I (150г. о.) и EcoR I (160а о. ).

- 11.-'

Третья группа-синтетические фрагменты основной антигенной детерминанты гена белка VP^ вируса я;зура N194. Структура олигонуклеотидов,входящих в состав фрагментов точно соответствует структуре антигенной детермннан-ты гена белка VP^ 0 ^ N194. Концы фрагментов после отжига представляли собой адапторы для сайтов соответствующих рестриктаз. Кроме того,в структуре были предусмотрены маркерные сайты для контроля лигирования и отбора рекомбинан-тов. В составе фрагмента 130-140 а. о.-HincII, а на стыке мезду фрагментами 130-140 и 140-150 а. о.-Ара I.Bee олигонуклеотидные праймеры были синтезированы Н -фос-фонагным методом. Очистку олигонуклеотидов до гомогенной фракции, необходимой для секзенирования и клонирования, проводили в 20%. ПААГе, содержащем 7М мочевину з качестве денатурирующего агента.

Огшапаация услпвкй ПНР.

Выбор в качестве метода клонирования подимеразной цепной реакции до минимум?, снижает требования к количеству и качеству мРНК. ЩР позволяет амплифииировать звэлаешй участок, даже если препарат содержит сложную смесь нуклеиновых гаслот. Б результате гтого становится возможным анализ препаратор. , соде'ржащих сильно деградированный или недостаточно очищенный v материал.- Поэтому в наших экспериментах выделение мРНК. осуществлялось фенольно- детергентным методом,, после двухкратного осаждения ПЗГом, без дальнейшей очистки. Такая схема особенно привлекательна при идентификации вирусных изолягов секвенированием амплифкцированного первичного, вирус-содержащего материала. Синтез I цели кДНК проводили с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы. Количество РНК варьировало от 1 до 5 мкг.

Полимеразная цепная' реакция основана на амплификации ДНК с помощью-ДН^-полимеразы,осуществляющей синтез взаимокомплементарных цепей, начиная с двух олигонуклеотидных праймеров. Праймеры-комплементарны противоположным цепям в

участках, огракп'-лшакккх выбранную область ДНК, и ориентированы 3'-концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо аз»шлифицнрозать. 3 нашем случае такой последовательностью был ген.основного кшуногейного белка VP>¡ вируса яиура.

ЦилЛМческнЗ температурный режим в наспех экспериментах бал следующим. Каждый цикл состоял пз трех стадий: денату-ра пия ДНК. (S5 С- 1 мин.), отжиг прайме роз (55 С -1 мин.), элонгация цепи (72 С-1,5 мин.). Для предотвращения испарения . кидксстн ( стандартный сбъем'реакционной смеси 50-100 ьйл) а пробирку поверх образца наслаивалось лепете минеральное пасло в объеме равном объему реакционной смеси. 3 качестго фэрмэнга использовали термофильную ДНК-полимз-рззу С Gelfand D.l&291.

Концентрация дезокс&»уклеогвдтрл|юсфагов в реакционной смеси составляла 0,02 - 0,1 мЫ.

3 зкспери!'актах с ГЦ? мы использовали несколько буферных систем, пока не остановились на двух из них. Пэрг-зя содержала: Q7 \£á Тр::с-НС1,рН 8,8 (при 25 . С)-, 16,§ ггМ сульфата аьмэкхя; 1}5-3 гг'Л хлористого цагнт:; 1мг/мл -БОА. Вторая:. 20 :,*М Трпс-HCl, pH 8,4; 50 tó! KCl; 2,5 Ш хлористого »лагния; Iíít/ís ВС А.

Оптш<ум концентрации- аМГР варьировал около 0,1 мК. Еонпектрацкя ';-.снов мнлкия составляла примерно'1,5-2,5 мЕ Добавление з • систему ■ NáCl- пли KCl до концентрации 50 мМ снкяало выход продукта по сравнению с контролем,где реакционная смесь содержала 15,6 мМ хлористого аммония; Иэкон-ные детергенты: тритон Х-ICO, и ?вт 20 'з концентрац;ш .0>01%, 'в несколько раз увеличивают эффективность реакции. 'Оптимальное количество •• ДНК-полкмеразы.для данной системы.-ГДР соответствует 2-4 ед. активности. Увеличение количества фермента приводит к появлению неспецифического фона ДНК. Концентрация каждого пз прайузров для данной системы составляло приблизительно 0,3 мкМ, В последнем цикле ГДР стадию полимеризации проводили а течение 7-10 мин. для пол-

ной достройки цепей ДНК. Используя универсальные праймеры, нами были амплифицярованы кроме гена полипептида VP^ ВЯ А22 N550, также аналогичные гены штаммов Ол N194, Од N1618, азияд N48 и полевых изолятов N1445 и 0/j N149£.

Секвеш.-роЕшста ашшфщкроваюаах фрагаэнтол ДНК До недавнего времени процедуре секвенпрования обязательно предшествовала стадия клонирования фрагмента ДНК в плазмадннх или (фаговых векторах. Совершенствование метода полим*р8£Нсй цепкой реакции дало возшйность осуществлять прямее секвенироваяп£ амплифицированнол ДНК. Для прямого сокгекирой&аия продуктов ПЦР кслсльзоваля как химический меч од Максам?.- Гилберта [Maxam А. М. е. а. 1977 3, так и энзи-магическви метод Сзшх-ра [Sanger F.е. а. 19773.

При использовании метода Сэнгсра пригодны как двухце-почечные.так и одноцепочечные продукты амплификации. В случае двухцепочечных фрагментов проводили стадию денатурации (температурную или щелочнуш). Однако короткие линейные фрагменты ДНК-обладают большой способность» к реассо--циации. Для преодоления этого затруднения использозали неэквивалентные количества двух праймеров Г Shyomala V. е. а 19893, что позволяло синтезировать за первые 20-25 циклов двухцепочечную ДНК,а за последующие 5-10 циклов,, в условиях недостатка одного из праймеров,- одноцепочечную ДНК(при исходном соотношении затравок - 100 :1). Примерный выход одноцепочэчной ДНК составлял 5-10 рЫ (0,5 рМ - для дьухце--почечкой ДНК, Полученную одноцепочечную.матрицу секвени-ровали затем с использованием лимитирующего праймера ПЦР по обычной схеме энзиматической методики.

При химическом методе секвенировакия образцы получали введением радиоактивной метки в сайт после рестрикции Фрагмента соответствующими ферментам! или проведением ПЦР с использованием меченого праймзра.

Методики прямого секзенирования.сопр'жнные с полиме-¡аокой цепной реакцией, открывают широкие перспективы.для

типировллия и диагностики различных штаммов вируса. .:,ли-мущества метода очевидны: диагностика осуществлявв кратчайпг/е сроки, предельно точным образом и с предъявлением минимальных требований к исследуемому вирусному материалу, тем более не требуя пассирования,что всегда подразумевает более или менее значительный генетический дрейф.

Молекулярное кланираранкг.

Для проведения сайт-специфического оллгокуклс о-тид-направленного мутагенеза, амплифицпрсванный Фрдгм'.-н? кДНК,содержащий ген полипептида V?\ вируса яаура Aga. N550, клонировали в фаге М13 тр 8 по сайтам EcoRI и Kind III, расположенным в полилинкере . <1>аг М13 представляет собой биологическую систему разделения цепей ДНК и в силу этой своей особенности является идеальным Еектором для проведения о лигонуклеотид-направленного мутагенеза CZcller М J. 19833. Car М13 ир8 выращивали в штамме TG-1 £'. coli. 'Шаговую ДНК выделяли щелочной экстракцией с последующей обработкой РККагой А и хроматографией на колонке CL-23 для отделения от низкомолекулярных фракций нуклеиновых кислот, линейный вектор получали рестрикцией двухцепочечной ДНК ,эндонуклеазами EcoRI и Hind Ш. Лидирование подготовленного вектора с амплиешцированным фрагментом кДШ осуществляли в стандартной реакционной смеси. Первичный скрининг рекомбинангов проводили, отбирая бесцветные бляшки з отличие от ярко-синих ,/агивкого фага С Laridley К. Е. е. а. 19751. ДвухцепочеЧную ДНК аага выделят щелочной экстракцией и анализировали- соответствующими рес.гриктазами(EcoRI,Hind3). Всего было проанализировано 24 клона,17'из которых содержали вставку. Секвестрование рекомбинантных клонов показало соответствие 'последовательности клонированного ¿рагм-нт.'; структуре гена белка VP-j A <xi N 550.

Сайт-спещ#отес1001 мутагенез.

Б нашей работе мииенью для мутагенеза являлась одно-

цепочечная ДНК, Еыделэкная из рекомбшантного фага. Методика основана на проведении сайт-специфического мутагенеза с использованием матрицы ДНК, содержащей в цепи небольшое количество урациловых оснований вместо тимина [Kunkel Т. А.' 1985:. дНК, содерлвдэя урацкл, продуцировалась з ung(-), dut (••) ьтамие Е. coli и использовалась для получения кзьзг-лементаркой цепи, содержащей требуемые изменения. Данная^ 'комплементарная цепь, синтезированная in vitro, ухе не со-дерйалЕ: d'ükP, а только Ti?. После завершения • реакции in vitro урацкл удаляж из шгрццы с лоыоць» урацил-К-гликози-лаэы. Обработка может проводиться очкцэнкым 'бзоментом [ Schlorrai J. е. а. 19781, но легче всего путем траксфзкцик нефракциэйкроааянши продуктами реакции компетентных клеток Е.coli дикого типа ung(+)(pwc.2).

TRANSFORMADO!1 RZ1022

jj E.COÜ

íu ч-;

РМЯ POL 1 DNA LIGASE DNA POL T4 dNTF-

TRAMSFORMATION 1G-1

E. cd'i ung(i-)dut(+)'

dsM13

Рис.2. Схема сайт—специфического мутагенеза-, с Фенотип'ическоя селекцией в урацил-репарационной системе. . '

- 16 -

Урацил-содержащую матрицу ДЕК рекомбинантногс фага получали.выращивая его в ung(-), dut(-) штамме Е.coli RZ 1032 . С агаровой чакки,содержащей ».тамм RZ 1032,предварительно трансформированный рексмбинангныч фагом,стерильным наконечником скалывали одну бляшку (можно вместе с агаром) и помещали в пробирку (Eppendorf) с 1 мл стерильной питательной среды без антибиотика. Пробирку инкубировали 5 мин. при 65 С, встряхивали на миксере 1 мин. ( для высвобождения фага из агара) и центрифугировали 2 мин. (Eppendorf). Супер-натант, содержащий фаг, в объеме 100 мкл перекосили в литровую колбу, содержащую 100 мл питательной среды с 0,5мкг/ мл dUTP. Затем туда jfa добавляли 5 мл ночной культуры RZ 1032. Такие пропорции обеспечивали множественность заражения около 1, то есть все или по крайней мере большинство фаговых частиц пассировалось через штз(-),guL(-) штамм. Колбу инкубировали при 37 С в течение б или 24 часов ( 220 об/мин. ). Более короткое время инкубации предпочтительно для векторов, содержащих нестабильные зетавки. После инкубации культура центрифугировалась для осаждения клеток и фаг титровали на ungí-) и ung(+) хозяевах, 'lar, содердашдй урацил, имел нормальную биологическую активность з ung(-) штамме и в 100 ООО раз.меньшую в ung(+) штамме. Фаг осаждали из супернатанта TL ПЗГом с 250 мМ NaCl при. О С в течение часа. Осадок формировали центрифугированием в течение 15 /ли. (Eppendorf) . и растворяли в 1 мл стерильной деионйзов-;нной воды. После растворения пробирку выдерживали во льду 30'мин. и повторно центрифугировали для осаждения посторонних примесей. Зга процедура позволяет значительно снизить эндогенное неспецифическое праймирсва-ние в реакции с ДНК-полимеразой. Депротеинизацию фага осуществляли двухкратной экстракцией равным объемом фенол-хлороформа и осаадали 2 объемами этанола ь присутствии 0,3 M ацетата натрия. Осадок формировали центрифугированием, промывали 70£ этанолом и растворяли ь 100 мкл стерильной, деионизованной воды. Рыход одноцепочечной ДНК составлял

примерно 20-30 «кг.

. Лля решения • поставленной задачи '- создания системы кассет в области основной антигенной детерминанты гена' белка VFj, клонированного в фаге М13, необходимо было осуществить 9 мутаций с помощью 5 мутантных олигонуклеотидов. Чэтырл олигонуклеотнда формировали сайты рестрикции для эндонуклеаз Kpiil, H'col, Saul к EcoRI в локуеах 130,140,150 к 1С0 а. о. , а пятый npafinep элиминировал сайт для зндонук- -л-азы Kpni(90 а.с.) с одновременный формированием, сайта для учдонуклеазк BairiJIГз качестве маркера мутагенеза). Мутагенез проводили 5 два этапа. На первом - формировались сайты для Nool и EcoRI,а ее втором - сайты для Kpni, Saul С130 к 150 а. о. ) и замена сайта Kpni на BarnHI (90 а. о. ). В процессе опгимизацс методики 5ылз прозедена замена двух гуакилозьо: остатков на цктидкловые с соответствующим изменением глицина в полокзкии 14.0 а. с. (VP/) на пролкн.

0 f *

Длл синтеза комплементарной цепи мутангные слигокуклеотиды (10 нг) гибридшовали с 1 мкг урацилозой матрицы. Измене:-; -ная последовательность, содержащаяся б структуре -мутантных праймероз, принимала форму биологически активной, коваленг-но вамкнутой кольцевой молекулы ДНК в реакциях синтеза к лигирозанкя с участием фрагмента Кленова ДНК-полкмеразы I и ДКК-лигазы Все компоненты смешивали при О С, затем смесь переносили на 14 С (15 мая.) к 37 С ( 2 часа). Такая схема реакции способствовала стабилизации неполностью комплементарного ¡цупдэкса матркца-праймер на этапе инкцка-' цик синтеза. Трансформацию компетентных клеток Е. coli TG-1 (нормальная система репарации урацил-'содержащих ; матриц) проводили ЕО мкл- реакционной- смеси без предварительного фракционирования., ' Методика скрининга мутантов определялась-особенностями конкретного эксперимента. Так как в результате мутагенеза формировались сайты для уникальных" зндонук-леаз, которые могли служить маркерами мутагенеза, анализ мутантов проводили аналитическим выделением ДНК фагов к' их рестрикцией соответствующими ферментами. Было проакалй-

зирозано Э5 клоноз,29 из которых содерянли требуемые изменения. После отбора клонов, удовлетворявших рестршшионнсму анализу, осуществляли анализ их первичной структуры секве-нированием. Таким образом, создание кассет в области основной 'антигенной дерминакты гена белка VP^ подтверждалось рестрикцией и секвенированием фрагмента-мишени мутагенеза методом Сэнгера [Sanger F. е. а. 19771.

Кассетный мутагешз.

Демонстрацией пригодности вектора для кассетного мутагенеза области основной антигенной детерминанты гена белка VP^ явилось проведение соответствующего эксперимента. В рамках эксперимента фрагмент 130-150 а. о. гена белка VP1 вируса яшура штамма Ац N55° бь,л заменен на аналогичный синтетический штамма N194. Кассетный мутагенез отличается методической простотой (рис.3).

• • М13 mpB VP1 FMDV N550

' CACCCCACGCCCMJjTACTCCCCAGGTCC САТССССАСАСССССССАССТАСАССС

. CATCGTCCCCTCCCCGTTCATCAGGCGTCCACGGTAC CCCTCTGCCCCGCTCCATCTCCCACT _ . Kpnl Ncol baul

Restriction Kpnl-Saul

Synthetics Oligonucleotides *

CACCCAV,C7CCMCT7~ ХГТСДСС5ССС 140 CATCGCCMTGTGAGAGCTGACCTGCC 150 CATGGTCCCTTTGACGTrCATi, 'ACTGCCCGGGTAC ■ CGGTTACACTCTCCACTGGACGGAGT

Kpnl

Nco1

LIGATION ' LIGATION

Hindi Apa1

Saul

_ CACGGAMCTGCMGTACGriGACGCCCCCATGGCCMTGTGAGAGCTGACCTGCC CATGGTGCCT4GACGnCATGCMCTGCCCGGGTACCGGTTACACTCTCCACTGGACGG AGT

LIGATION LIGATION

Kpnl . ' Saul

CACGGAMCTCCAAGTACGTTGACGGCCCCATGGCCMTGTCACAGGTGACCTGCC CATGGTGCCTTTGACGTTCArCCAACfGCCCGCGTACCGGTIACACTCTCCACTGGACGGAGT

М1Э mp8 FMDVVP1 N550(130-150a.o.-01 N194)

Рис.3. Схема кассетного мутагенеза.

• 1.9 г . ;

Все манипуляции сводятся к подготовке вектора рестрикцией дзухцэяочэчной Д£К соогвететвузацкш фермента}-»: и лигироЕаниек подготовленного вектора с синтетическим му-таиткь'м фагменгом, содержащем на концах адапторы к сайтай ■диггепного вектора.

ухцепочечную ЗНК рекомбкнантного .фага, содержащую ген бедка VP4 вируса ящура «22 N550,основная антигенная^ детерминанта которого модифицирована методом сайт-специфического мутагенеза с формированием трех -кассет,фланкированных, «siîasci дли р-стркктаз Kpnl, Ncol, Seul к EcoRI (120,140,150 и 160 а о. ),линеархзоЕЭли рестрихтгзащ;' Kpnl и Sau 1(130 и 150 а, о, ).

Синтетический фрагмент детерминанты гена белка VP-j вируса я аура штамма N194 (130-150а. о. ) собирался из четырех синтетических олигонуклеоткдов, два из которых содержали структуру участка 13Q-14Q а. о. с адалторами к сайта:-/, Kpnl и h'ool.a два других -структуру участка 140-150 а о."с адаптерами к сайтам Kcol к Ssul.

Лет удобства анализа антигенных гибридов, в структуру саитетичэского фрагмента антигенной детерминанты гена белка VP /1 ЕЧ Од N1S4.K3, стыке мэгду учвотглм.и 133-140 - и 140-150 а. о. был введен сайт дош рестриктазы Apal. Этот ей? являлся шркером при отборе антигенных гибридов. Таким образом, процедура отбора ^кзочала авададакскоэ нара-щнЕакие клоков,ввделэнкэ''дБухцэпочэчкой ДН11 и обработку, ео зкдонуклеазой . * Из 20 произвольно отобранных клогов .14 содержали сайт Apal. Клоны, содержащие данный сайт,отбирали для анализа первичной структуры, ' чем окончательно• подтверждалось созданю антигенного гибрида. '

Создзшкэ aiœnpsceEpyîrçKX йагзрпд: ЕШнгтрргцгсЪ

F.5-k, подтверждение воз!.о;шостк использования' раврабо-тшшой стратегии и полученного вектора для создана химерных койстругддаг в целях совершенствования' генно-инженерных цроттшйуркызг,вакцкнньгх препаратов, было осуществлено кло-

кирова::;:е полненного антигенного гибрида в еостап-, различных фрагментов гена белка УР^ в следующие экспрессиру»-щяе векторы: pUC 9,?UC 19,pTNF 21Л и ?PL .

При клонировании в pUC 9, Фрагмент,содержаний ген белка УРд ВЯ А N550 с основной антигенной детерминактой (130-150 а. о. ) штамма 0^ N194,длиной 660 н. о. .получали рестрикцией кассетного вектора зндснуклеазами Pst I и Кгл1. Клонирование осуществляли в полилинкер плазмиды по сайгам Pstl и Xnal. Таким образом, химерная конструкция представляла собой антигенный гибрид гена белка VF^ , соединен:;-:': Сконцом с N-концом lac Z'белка дед котрелем lac промотора с сохранением трансляционной рамки считывания lac Z'. Клонирование в плазмиду рЬ'С 19 проводили по сайтам ВаггШ и EccRI. Фрагмент антигенного .гибрида гена белка УРд разгром ТО а.о. (SO--150 а о. бэлка VF1) также сливали с N-концом lac Z* бежа с сохранением рамки считывания.

Плазмида pTNF 314 содержит тандем промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7,полусинтетический ген фактора некроза опухоли человека с искусственным участком инициации трансляции,терминатор транскрипции фага лямбда и ген В-лактамазы. Синтез продукта осуществляется под контролем сильного . конститутивного промотора [Коробко В. Г. с соавт. 1991 1. Клонирование проводили в С-конец гена бедка некроза опухоли человека по сайтам-BstE11 и BglII. Рекомби-нанты отбирали' растрикционным • анализом эндонуклеазами BstEII и Hind III. .

Плазмида pPL получена на основе PBR322,имеет промотор PL, сайт. узнавания nutL для N-зависимой антитерминаши и кодирующий участок гена N с сайтом для встраивания Hpall. Ранний промотор фага лямбда PL является сильным промотором (в несколько раз эффективнее lac промотора). Этот промотор негативно регулируется репрессором,продуктом гена cl фага лямбда. Мутация с1857 делает репрессор температурочувстви-тельным, активным при 28 С и неактивным при 42 О. Промотор расположен непосредственно перед геном N, который узнает

- 21 -

на ДНК. особые N-сайты и изменяет Pffit-полимеразу таким обг разом,что герминаторы транскрипции,расположенные по ходу транскрипции за сайтом nut,узнаются'менее эффективно, что повышает уровень транскрипции ДНК и синтез конечного продукта. -Единственным сайтом для встройки клонируемых фрагментов является.сайт для зндонуклеазы Кpal, который расположен в N-конце гена белка N [Денхардт Д. Д. 19913. Для^ клонирования использовали фрагмент антигенного гибрида гена белка YPj\ BaiPüI-SmaI(43QH.о.). Наличие зстазки и правильность ее ориентации у рекомбкнантоз определяли рест-рикционным анализом двухцепочечной ДЕК после аналитического 'выделения. Таким образом, показана принципиальная возможность использования конструкции для создания химерных белковых продуктов и получен банк экспрессирувщих векторов, в которых под контролем различных промотороз (конститутивного, хемоиндуцкбельного и термоиндуцибельного), клонирован антигенный гибрид в' сосгазе различных фрагментов гена бедка YP.(.

вывод ы.

1. Рассчитаны унивёрсальныэ праймеры для избирательной амплификации и прямого секзенирозакия гена белка VP/¡ различных типов.вируса ясура.'

Z. Отработаны оптимальные условия проведения полммз-разной' цепной' реакции для избирательной амплификации генома. Методом ЩР с использованием универсальных праймеров амплифкцированы гены белка \'Р,\ игамшв А22 N550, О ^ N194, О 4 N1618, Азия /\ N48 и полевых изолятов О ^ N1445 и ..О V N1492.

3. Предложен метод сайт-специфического мутагенеза и осуществлена замена гЛицин-лролик в положении 140 .а. о. гена' белка VP/j БЯ Agj N550,клонированного в фаге ШЗ.

4. Методом сайт-специфического мутагенеза' области основной антигенной детерминанты гена белка VP 4 вируса яиурй А 22, N550 осуществлено 9 мутаций с формированием 3 кассет для проведения направленного мутагенеза области основной

антигенной детерминанты.

о. ТТровелен кассетный мутагенез области основной -'-.'.нти-гзансп детерминанты гена белка УРд РЛ А53. N550 с заменой Фрагмента 130-150 а. о. на аналогичный синтетический гтом-ма О ^ Ml 24.

о. Осуществлено переклонирование полученного антигенного гибрида в зкспрессирующие плазмиды: pUC 9,pUC 19,рINF 314 и pFL в целях совершенствования генно-ишкэнерных про-тивояшурккх препаратов.

ПРАКТ'ГЧЕСЕШ ПРЕДЛОЖЕНИЯ. Разработанная схема сайг-спе^лфического мутагенс-за предназначена для внесения всех .типов мутаций в Лдбсй участок генома с и.звестной первичной структурой.

Методика дмплп£ккац!Ш различных участков генома с последующим секзенированнем предназначена для диагностик;; и типирования изолятов вируса по перзичному вирус-содержащему материалу.

Сконструированный вектор предназначен для кассетного мутагенеза области основной антигенной детерминанты гена белка VPjj ВЯ А ¿2, N550. с целью изучения .структурно-функциональных взаимодействий з целом и вклада ка;*дого отдельного элемента,вплоть до конкретного ¡'¡уклеотида.

Методика кассетного мутагенеза указанной области предназначена:

-для создания гштигенно-измененных вариантов и межги-повых'антигенных п'.пидов;

-для.'переклснирования мутантных конструкций в ' зкспрессирующие плазмиды с целью получения различных белковых химер в рамках создания и совершенствования синтетических противоящурных препаратов.

Изучение структуры к функции области основной антигенной детерминанты предполагает переклонирование измененных вариантов в полноразмерную кДШ копию генома для выяснения влияния произведенных изменений на уровне икфекцкон ной кДНК копии, РЖ транскриптов или цельных вириопов.

В рззул&тагс игслгярвадкй разработана « утъаредагы

дкрекгггрои хкзгкгута елздгацие

• - "Методика молекулярного кдонирозанья фрагментов кДНР. вируса ягура в фаге Ш.З". ES. 01.1990 г.

т"Методика выделения одно- и двухцепочечных форм ДКК Фзга И13„ содеркадэго фрагменты кДШ-l вируса япура". 22.01. 1930 г. , __

-"Методика' секгекирогаякя фрагментов кдНК вируса яцу-ра в фаге ШЗ" 23.01.1990 г.

-"Методика очистки и секвенировакия синтетических олигонуклеотидов". 23. 01.1990 г.

-"Методика сайг-специфического мутагенеза гена белка VPj| вируса- яшура, клонированного в фаге ИЗ". 23.01.1990 г.

СШ:С0Г. РЛВОТ, ОПУЕЯШ&ЗАШ&К Ю Тes ДИССЕРТАЦИИ.

1. Дрыгш ЕЕ .Аминев А. Г. .Андреев Е Г.. Молекулярное клонирование 5'-конца генома вируса яшура Ай. с использованием термостабильной ¿¡НК нолимеразы. //Акт. проб. вет. виру-сол. , Владимир. 1930. с. 10-11,

2. Андреев В.Г. .Дрыгкн ЕЕ. .Батченко Г. Е ,Ампкев А. Г. , Перевозчккова Е А. , Кванющенкоз Е Н. Клонирование генов YP вируса якура ■ разных типов в фаге М13. //Научи. осн. технол. пром. произ. вет. бкол. пред. , Шсква. 1991. е. 253 -254. .

3. ■ Андреев Е П, Дрыгш Е Е , Ломакин А. К , Перевозчико-:ва ЕА. ,Ивашоцекков Е Е_ Сайт-специфический мутагенез области основной антигенной детерминанты гена белка YP^ вируса яшура А 21 N550. //Научк. осн. технол. пром. произ. вет. бкол. преп. .Москва 1991..с. 255-255. .

4. Андреев Е. Г. .Дрыгик Е Е , Перевозчикова К А. Создание методом сайт-специфического- мутагенеза кассетного вектора ддк конструирования антигенко измененных вариантов. вируса яшура. // К новой стратегии борьбы с ящуром. ,Владимир. 1991. с. 145-х4б. „ ^

■