Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование и синтез низкомолекулярных лигандов, способных специфически связываться на заданных последовательностях ДНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование и синтез низкомолекулярных лигандов, способных специфически связываться на заданных последовательностях ДНК"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи УДК 577.323

НИКОЛАЕВ Виктор Александрович

конструирование и синтез низкомолекулярных лигандов, способных специфически связываться на заданных последовательностях днк

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

СПЕЦИАЛЬНОСТЬ 03.00.03 - М О Л ЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ.

Научные руководители: канд. хим. наук А. Л. ЖУЗЕ, д. ф.-м. наук Г. В. ГУРСКИЙ

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии нм. В. А. Эигельгардта РАИ.

Официальные оппоненты:

профессор, докт. хим. наук Громова Елизавета Сергеевна

Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова

докт. хим. наук Габибов Александр Габибович

Институт молекулярнй биологии им. В. А. Эигельгардта, РАН

Ведущая организация: НИИ по изысканию новых антибиотиков РАМ]

Защита состоится «.....»_ 1995 г. в_ часов на засед

нии Специализированного совета Института молекулярной биологии нм. В. А. Энгел гардта РАН по адресу:

117984, Москва, В-334, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биол гни нм. В. А. Эигельгардта РАН.

Диссертация разослана «.....» _ 1994 г.

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОГО СОВЕТА

КАНДИДАТ ХИМИЧЕСКИХ НАУК (А. М КРИЦЬП

Ajv ность проклеим.

П; ой... ма разработки иетодоь направленного воздействия на 11ун::цисл.г;'..........

ex или инь-. гчнов, как одна in оснотшич про* ien молекулярной биологии, иозч:.-г ¡меть олпим из своих решений создание новых соединений, способных избиратель*, . с и.тсской константой сплетаться с определенными, заранее зчлрсн рамнироваппыип I. .о теле ьателыюстчмн нуклеозидов на ДЖ (или [Li'i.

Во'н.чое вшаашю удаляется тучеш,а функютешфиэамы осн.-,ошс< npiipo.niw егулят..роп вссх жизненна ванных процессов - белков. Л'м успешного иоде «q.on ,и:ы реирессчрсп, рестриктаз, кеттаз и других ферментов, неносрел;-: .'.инно ьлилыл im нуклеиновые кислоты, т-обходимо тщательное изучение механизмов их связцват.нл с /1МК (РНК). Немалое значение также имеют исследования взаимодействий с ЛПК разнообразных n;i ролиих и синтетических антибиотиков, так как именно згими взаимодействиями часто обусловлено их физиологическое действие. Леглльисч: изучение комплексов таких веществ г. ДНК позволяет понять конкрепше nexju;i:-i : i связывания и впоследствии осуществлять синтез вецеств, сног.ч'них контролировать системы perv ¡лнии генной активности.

/Ня иаправ лс.лого влияния па определенные пари основан-лй в составе пук ьдшеьых К1Кмог, важнейшей частью процесса до/гаю стать ретьонг.о проблемы Beel ма точной доставки молтщикатора к месту его применения, что является непроо.I .и задачей, принимая во внимание, скажем, размеры /¡ПК. 3iy часть p>.:^'U мог Си выполнить достаточно спенирич.чий к месту воздействия (или к некг:, ■ рому соседнему уч-ютку) лпганд, синтез которого, таким образом, гр.здстзв тзет.. .1 синим из Нс-обходшпг: шагов в исследодатшлх такого рода.

2 . Uejb. рабо i ы.

Один из колкретиых возполатпх путей синтеза лигандсв, снособш.гх "читать" протяженные послед, .¡.агельности AT и ОС пар оснований в уз» •.« желобе Д11К cocr&.tr соединит! в одной молекуле блоков, узнавших специфически определенные участи (пары огновакий, отдельные ост;-ьа.шл) на носителе генетической ин-рерпацпн. -'пи стр'опте/тьные блоки могут происходить исходно из различные сое гшош-л и иметь соверлнетшо р>азные типы структур. Проблема состоит в том, чтобы суметь соединим, их в одной п . "¡екуле (и:.: некоем комплексе) и при этом сохранить их работоспособп'.сть.

Hill хол*е тост, реияпь эту задачу путем коаалентнего прпсселппе..пи к ада : r.iii

АТ-снешинчног о антибиотика нетропсина и* Шилов, способных связываться с Ч;С-нзрапи ДНК спеищ'.'чэски в ^-ассоциированной димермой форме. В иасто'шгй работе представлена пиша попытка скопструировать и синтезировать такие соединения, и проверить нэипт предположения об осуществимости такого рола проектов.

Плучмая ШЩШй 11 Практическая значимость.

• Гредставленные научные результаты имеют приоритетный характер, о ¡кривая для исследовани е новую подт рушту синтетических ДНК-специфичшж сеелименнй - гибриды пепшд-нетропсин. Выли синтезированы и изучены три новых бис-петропсина, црат менты антибиотика в которых соединены повален той Б-Э связью между остатками цистепнов пептидных трагмептов. Довольно важным является также тот факт, чю созданные повт.те гибридные молекулы оказались способны "узнавать" протяженные участки па двухстшральнмх ДНК, что было продемонстрировано в опытах с частичным г илролизом комплексов Д1Казой I.

В результате этой работ были подтверждены теоретические модели для комплексов с ДНК. А1 -снеипцтчных антибиотиков иетропелша и дистанншша Л {Заседателе!)) и пептидов в форме антипарал^лельнот о р-сдоя (Курский), разработанные в нашей лаборатории.

4. Апробация работы.

Одновременно с описываемой работой похожие соединения били исследованы другой ' 1 руинам. В статье опубликованной в 1939 году (НсЬатЬ и соавт.,), описываются синтез и изучение ртзличпых производных петропсила, в частности аналоги, содержащие от 1 до 3 остатков аллмнна, присоединенных копалепшо к С-концу антибиотика. Было найдено, что пептидные аналоги нстропсина, содержащие два и три аланшювых остатка, протвлякгг повышенную по грлвиенно с самим нетромештон специфичность к СС парам оснований. Этот результат вполне согласуется с нашими выводами.

Материалы диссертации докладывались на ряде семинаров и научных конференций ИЧВ ГЛ11, а также на различных Всесоюзных п Международных симпозиумах и конференциях, в том числе: на VI Симпозиуме по кошрортпциоиным изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1985 г), на V Всесоюзном биохимическом сьездс (Киев, 1986 г), на Международный симпошуме "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках" (Пупвшо, 1980 г), на ХУ1Н Научпо-техническои

конференции молодых исследователей (Харьков, 1986 г), на IX Конференции молодых ученых "Синтез и исследование биологически активных соединений" (Рига, 1987 г), на Международном симпозиуме "Физико-химия ДНК и молекулярные механизмы Функционирования генома" (Тбилиси, 1987 г), на VII Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов (Таллин, 1987 г), на VI Конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1988 г), на 6-ом Средиземноморском Конгрессе по химиотерапии (Таормина (Италия), 19S8 г), на 20-ом Европейском пептидном симпозиуме (Тюбинген (ФРГ), 198S г), на 6-ом и 7-ом Международных совещаниях по биомолекулярной стереодинамике (Олбани (С1ПА), 1989 и 1991 гг), на Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989 г), на Ш-ей Всесоюзной конференции "Макромолекулы клетки" (Москва, 1989 г), на IV-ой Всесоюзной школе-семинаре молодых ученых "Перспективные направления и новые методы в молекулярной биологии" (Рига, 1990 г), па 8-ом Симпозиуме по химии пептидов и белков, ФРГ-СССР (Аахен (ФРГ), 1991), на 2-ои Всесоюзной конференции "Геном человека-91" (Переславль-Залесский, 1991).

5. Структура работы.

Диссертация изложена в виде печатного труда на 146 стр., содержит 30 рисунков. По материалам диссертации опубликовано 5 статей.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

III. Нистин-содержащие пептиды.

III. 1. Синтез ипстин-содержащих пептидов

Химические формулы пептидов представлены на рис. 1. Все пептиды были синтезированы в растворе. Для реакций конденсации были использованы различные методы пептидной Пептид I синтезировали методом активированных эфиров

(Схема I), исходя из бис-п-нитрофенилового эфира N.N'-дикарбобензокси-Ь-цистипа. После его конденсации с метиловым эфиром L-валина и последующего снятия М-защигы ацидолизом (НВг/АсОН) проводилась конденсация с Boc-Val-ONSu. Полученный диметиловый эфир пептапептида обрабатывали Н2И4-Н20, затем реакцией с дансилхлорилом полученный гидразид превращали п лансилгидрэзид, который, после снятия N-защит, конденсировали с Вос-L.ys (Вое) -Gly-OPfp. Пептид I! был синтезирован по подобной схеме используя на начальной стадии уже готовый

и,с

\ //

С ,)-S—Н,н2 «— Vai Cys t-Val*-Gly-<-Lys- H

| о <f>«:"'

H-Lys->Gly—► Val-* Cys -» V&l—» ПгН;—s^ у

и^с

i

II.с

Нептнп I

<\ S --Gly-Cys - Gly-H

<) I о О""

H — Gly-» Cys — Gly-^Hj-S-^J) .

Поптнд II

NH2-Gly «- Cys Gly— H

NH2-Sar *-Cys->- Gly— H

H Gly-*- Cys -> Gly-NH2 H_G|y-»c;s^Sar-MHj

Пептид III Пептид IV

HO— Gly <-Cys-»- Gly— Boc

| •

Boc — Gly-» Cys Gly— OH

Пептид V

PWcTJ. Структуры си//г ёзшроваШС^к

направление пептидных CRsizeii.

I.ys

Gly

Boc -

Boc -

Boc -

Boc -Boc-II-

-OPfp H

NaOH/EtOH

HOPfp/DCC

-OH

Val

Cys

Val

-OEt

-OEt Boc-Doc -

- OPf-p

Boc -Boc -II-

50% TFA /DCM

Z -Z -

- ONSu II -

TFA

- ONp

НВг/ЛсОН

N II -HO

— 2-4--2-

DnsCI

Схема I. Синтез соединения I.

— OMe ОМе OMe ОМе

— N Н

2 3

— N ¡1 Dns

2 2

— N I! Dns

г г

- N II Dns г 2

-МП Dns (I)

г г

дансилгидразил глицина (Схема II). Вторая конденсация проводилась о использованием Вос-С1у-0РГр. На последней стадии Вос-эашиты удалялись тригрторуксусной кислотой. Пептиды I и II подвергались очистке гель-хроматографией на сефадексе Щ-20 ли до ТоуоРеаг! Ш-40 в метаноле или в 1М уксусной кислоте.

Gly

I

Суз

Gly

Вос-Вос-Н-

-OPfp

TFA

- ОЫр

ТЕА

НВг/АсОН

- N Н Dns

2 2

■ N Н Dns

2 г

■ N Н Dns

2 2

- N Н Dns

2 2

- N Н Dns

2 2

Схема II.

Синтез соединения II.

(II)

111.2. Специфичность связывания пептида I с ДНК.

Для того, чтобы выяснить, зависит ли константа связывания пептида I от последовательности пар оснований ДНК, мы исследовали взаимодействие между пептидом и синтетическими полинуклеотидами. Растворы полипуклеотилов одинаковой концентрации (8-10 6 М) титровали пептидом. Типичные кривые флуориметрического титрования представлены на рис. 2. В области низких концентраций пептида (до

Концентрация полинуклеотидов в молях пар оснований (Р/2) для всех полинуклеотидов одинакова и равна 8-10 6 М. Условия: 0,001 М Na-какодилат, 0,1 М NaCl, pH 7, t = 20°С. IS2" интенсивность флуоресценции, измеренная при длине волны 520 нм длина волны возбуждения 380 нм, щели для возбуждения и эмисии равны 10 и 20 нм соответственно.

240

120

Ъго

CCG

ссс

ппп ттт>

GCC CGC

Пептид а растворе

0,5

1,0

СЮ1, м

Рис. 2.

Кривьв флуориметрического титрования пептидом I различных синтетических полинуклеотидов в присутствии NaCl.

6-10 6 М) видны сильные различия в связывании пептида с различными полинуклеотидаин. Интенсивность флуоресценции комплекса цистинового пептида с noAtt(dG) -полиНС) существенна Превосходит интенсивность флуоресценции комплексов с другими полинуклеогидами.

111.3. Изотермы адсорбции пептида i на. синтетических нолинукдеотйдах

Для оценхи константы связывания пептида I с различными синтетическими полимерами были сняты кривые титрования этих полинуклеогидов пептидом, из которы можно определить интенсивность флуоресценции в расчете па моль связанного пептида.

Па рис.3 показаны зависимость r(m) (количества связанного пептида (г) в расчете на моль пар оснований от концентрации свободного пептида (ш)) (а) и изотерма адсорбции (б), рассчитаные в предположении, что можно пренебречь связыванием пептида на изолированных связывающих местах. Полученные изотермы имеют вид. характерный для кооперативного связывания. Из кривых, показанных на рис.3(a), можно определить насыщающий уровень связывания т^^. Оказалось, что г соответствует связыванию двух молекул пептида на пяти парах оснований.

адсорбции соединения I рассчитанные из криъих флуоринетрического титрования.

Теоретическая модель, наиболее хорошо описывающая экспериментальные изотермы, может быть представлена следующим образом: цистиновый пептид I взаимодействует с ДНК в виде мономера (0-слоя) и димера (/3-сэндвича); каждый из которых "накрывает" при связшании 4 пары оснований. Мономеры связываются

некооперативно, в то время как связывание димеров представляет собой кооперативный процесс, за который ответственны взаимодействия между ß-сэндвичами, адсорбированными на ближайших соседних связывающих местах.

Константы связывания цистинового пептида I на изолированном связывающем месте оказались равны: 17600 М 1 и 1800 М1 для связывания с поли(с1С)-поли(с!С) и поли(с!А) ■полиСйТ) соответственно.

Итак, подводя итоги, можно сказать, что две молекулы пептида Lys-Gly-Val-Cys-Val-N^H^-Dns, ковалентно связанные дисульфидной связью между остатками цистеина, образуют весьма прочные комплексы с ДНК и синтетическими полинуклеотидами. В присутствии 0,1 Н NaCl цистиновый пептид I обладает примерно в 10 раз большим сродством к полиМС)-поли(с1С), чем к поли(сМ)-mviH(dT). Подобно взаимодействию других малых пептидов, способных к образование антипараллелыюй /i-структуры в растворе, связывание цистинового пептида I представляет собой кооперативный процесс.

III..4. Конкуренция за связывающие места на ДНК между пептидом I и различными антибиотиками.

Чтобы выяснить, в какой бороздке ДНК связываются цистиновые пептиды', были проведены эксперименты по конкуренции с антибиотиком сибиромицином за связываюцие места на полиЫО-поли((1С). По мере увеличения количества сибиромицина, ковалентно связывающегося с полимером по узкой бороздке, количество связанного пептида I уменьшается. Пептид практически не связывается с поли(йО-поли(с1С), если на 2-3 пары оснований ДНК приходится одна молекула связанного сибиромицина. Результаты этого эксперимента обьясня» . я наиболее просто, если предположить, что пептид I, как и сибиромицин, связывается в узкой бороздке ДИК.

Конкуренция за связывающие места была также продемонстрирована в экспериментах с титрованием, дистамицином А комплексов поли(dA)-поли(dT) с различными заполнениями полимера пептидом I и флуориметрическим титрованием дистамицином А комплекса пептида I с полиЫА)-полнЫТ), для низких уровней связывания пептида, когда пептид связывается на изолИройанных связывающих местах на полимере.

Полученные нами результаты говорят в пользу того, что, цистиновый пептмд I в виде неботьшого ß-слоя связывается избирательно с GC-богатыми участками в уткой бороздке ДНК. /чэюгичные результаты были получены и для связывания пептилз II.

R

IV. ГИБРИДЫ ПЕП1ИД-НЕТР0ПСИН КАК ДНК-СПЕЦИФИЧНЫЕ ЛИГ АНДЫ

IV. 1. Пептидные аналоги нетропсина. Нами было синтезировано несколько Соединении, представдяицих собой нетропсин-пептидные гибриды, в которых нетропсиновый остаток ковалентно связан с пептидами Gly-Gly- (аналог VII) и Val-Val-Val-Gly-Gly- (аналог VIII), а также соединения, в которых две молекулы Нругг-пропильного аналога нетропсина соединены ковалентной связью с симметричными цистин-содержащими пептидами III, IV и [Gly-Cys-Gly-Gly-Gly-(получен из пептида V),- аналоги IX, X и XI соответственно, рис.4.

Аналог vil

H-oiy-Giy-Ri

Аналог VIII H-Vll-Vnl-Val-Gly-Oly-R,

1С",), ra,

Л 1С",),—С i. ♦ чнн,

М Í,--Gly«-Cyl*- Gly— Rj

Аналог IX R,-Gly-»Cy«-»Gly-NH,

NH,-Sar-*-Cyl«- Gly*- R,

Аналой JÉ fy-»Gly-»Cyi-»S«r-NH,

R1

СО-(СН4),-СО-ИИ

^ry

C0HH-(CH,),-H ■: + N' "s'cH,

ICH.I, CH,

CHjCOO"

Kj—G1y»-Gly»-Gly-^Cyl»-Gly—H

i

Аналог XI H-Gly-»Cyt-.GIy-*Gly->-Gly-»R)

Рис. 4 Структурные формулы синтезированных пептид-нетропсиновых гибридов VII - XI. Стрелками указано направление пептидных связей.

Синтез аналогов нетропсина VII и VIII (рис.4) проводили по схеме, близкой к описанной ранее (Хорлин с соавт., 1982) с небольшими модификациями. Аналог VIII образовывал ассоциаты в водном растворе, которые стабилизируются взаимодействиями между пептидными фрагментами. Форма спектров поглощения соединения VIII зависит от концентрации.

Результаты наших экспериментов показывают, что аналог VII имеет 3 АТ-специфичных центра. Связывающие места для мономеров аналога VIII совпадают со связывавшими местами для аналога VII, а в димерной форме соединение VIII

взаимодействует преимущественно с последовательностями, содержащими два кластера

5' GG

из 3-4 ЛТ-пар, разделенных последовательностью

IV. 2. Цистин-содержащие бис-нетропсины. !5ыло решено использовать цнстиновые

димерные пептиды, где два пептидных остатка ковалентно соединены между собой, в

качестве GC-узнающих блоков при конструировании лигандов, способных

взаимодействовать с заранее определенными последовательностями пар оснований ДНК.

В молекуле каждого из бис-нетропсинов пептидные фрагменты образовывали

небольшой (3-слой, который дополнительно стабилизируется с помощью S-S связи. Как

видно из рис.4, в бис-нетропсиие XI направления амидных связей в пептидном и

нетропсиновом фрагментах совпадают; в молекулах бис-нетропсинов IX и X пептидные

Фрагменты присоединены в противоположной ориентации: М-конец пептида соединен

ковалентно с N-концом аналога нетропснна с помощью остатка янтарной кислоты.

IV. 3. Синтез пистиновых бис-нетропсиноп. Пептиды III—V (рис.1) быта

синтезированы в растворе с использованием различных методов конденсации пептидной

химии. Для синтеза пептида III (схема IV) пентахлорфениловый эфир ди-г-цистина

обрабатывали раствором бромистого водорода в уксусной кислоте, получая

активированную аминокислоту без зашит на N-конце. Поскольку скорость реакции

симметричных ангидридов с аминогруппой гораздо выше, чем в случае активированный

Эфиров, это производное цистина было успешно проацилировано симметричным

ангидридом Вос-глицина. По окончании ацилирования аминогрупп цистина, без

выделения промежуточного производного, в реакционную смесь был введен избыток

глицинамида и дополнительное количество основания для второй конденсации.

Продукты реакции включали как целевой продукт, так и защищенный амид диглицина,

которые впоследствие были разделены методом колоночной хроматографии. Защищенный I

пептид (Boc-Gly-Cys-Gly-NI^)^ оказался хорошо растворим в воде, и в процессе обработки реакционгэй смеси его пришлось извлекать из водной фазы.

Пептид IV синтезировали по измененной методике (схема V). Необходимость изменений была вызвана наличием N-метильной группы, которая усложнила аудирование. Попытки конденсации с использованием ДЦГК и метода активированных эфиров не привели к чистому дианилированию с удовлетворительным выходом. Для успешного ацилирования вторичной аминогруппы был применен бис-хлорангидрид бис-2-цийтина. Далее, после снятия обычным методом Z-защиты, пептид IV в виде бис-Вос-производного был получен после конденсации с симметричным ангидридом Вос-глицина. Защит!.! затем снимались трифгоруксусной кислотой.

Третий из исходных цистиновых пептидов (петид V, рис.1) был синтезирован из I

симметричного [2-СуБ-С1у-0Н]2 после снятия защит конденсацией с пентафторфениловым Эфиром Вос-глицина (схема VI).

Для введения в молекулы лигандов нетропсиновых фрагментов с обращенной (относительно амидных связей цистиновых пегпидов) ориентацией амидных связей был синтезирован сукцинилированный аналог нетропсина путем ацилирования янтарным ангидридом аминоамидина Арс^-ШКаМ^С^ШПМН^ (Аре - остаток 1-метил-4-аминопиррол-2-карбоновой кислоты). Бис-нетропсины IX и X (рис.'!) были синтезированы по одной общей схеме при одновременной конденсации двух сукцинилированных негропсиноподобных фрагментов с диамидами соответствующих

С1у

Су Б

(Вое -Вое — Вое — Н-

ИВг/АсОН г-

-0) О 2

ТГА

(Вое ■ Вое — Н —

-О) О

ТГА

С1у

Вое -Вое —

-ОРГр

- ОРср

- ОРср -ОРср

С1у

!

Вое ПН ТГА Н —

■МН

-нн2 (III)

г

Схема IV. Синтез пептида III. Суэ Баг

-С1

Н —— N11

НВг/АсОН

N11

I г 1— N11

г

-N1!

-МП (IV)

г

Схема V. Синтез пептида IV. I

Суэ й!у

г-

НВг-Н-

НВг/АсОН

-ОН -ОН

-он (V)

Схема VI. Синтез пептида V.

У

цпстин-содг.ржащих пептидов с помощью /I!¡ГК и 1-гнлроксибепчотриазо/|а. Гпн;; ) бпс-негрипспна XI был осуществлен конденсацией N-aaiiuimennoi о пептида П1ос-П|у-

I

Cys-Gly-OIH с дяумя мо.тькулапи аналога нетропсшга VII с помощью ДЦГК. и 1-ги.троксибензотриа.зола, с последующем удалением защит триФгоруксусной кислотой.

Соединении ТХ, X и XI очищали с помощью гель-хроматографци на се-тадексе I П-20 сначала в лиметилф-ормамиде, а затеи в метаноле. Окончательная очистка соединений IX и X проводилась на Тоуор*?аг1 11W-40 в 1 М уксусной кис/юте. Окончательная очистка соединения XI ьключала гель-хроматографию на се.|адексе 1(1-20 в 111 уксусной кислоте с последующей обрашеннофазной ВЗЖХ на полупрт-пэра тивпой колонке с Силасорбом С-18.

IV. 4. Определение KOi!£iailX см*диШШИЙ. с. ратличнипи

П1!НП2ЛН1-Р!И /ШЛ И. £iUir.QJJOgTJ4ilMíi полипуклеогидамп. Величина молярного дихроизма комплексов аналогов нетропенна VII и VIII и бис-нетропсинов (соединения IX, X и XI) с ■ ., шМА) • поли (ÜT), поли (dG )■ поли ((1С) и различными природными ДНК определялись в отдельных экспериментах, в которых использоватись столь высокие концентраты нуклеиновой кислоты, что i чалытый линейный участок кривой ттро-пания соотвегстяовал практически полному связыванию лшанда. Полярный лихретм комплексов /П¡1С с аналогами нетронсипа зависит от содержания АТ пар в ЛИК.

Нт сравнения изотерм адсорбции (рис.5) было nai'IJi-.ij, чю специфичность связывания соединении IX и XI отличается ог специфичности связывания соединения VíT. Удобной количественной характеристикой для опенки специфичности евть.гсания лиганда может служить отношение констанш связывания с полиЫА) 'ПолиЬН ) г коистзше связывания с одной из природных ЛИК. П присутствии 0,6 И NaCl вклад HRf нешчмггеских взаимодействий и общую энергию связывания Лиганда с ЛИК ум"Ш|Шмо1ся, что создает благоприятные условия для изучения специфических взаимодействий. Наличие GC-спецчфичних реакционных центров в молеку те соединения XI проявляется в юн, чго соединение XI образует прочные комплексы с поли('JG) • поли(tiC) в присутствии 0,6 М flnCl. Это свойство соединения XI представляется весьма необтгшым, так как аналоги нотропсм>п

АГ-сг ''чтичними ЛИГЯНЛЯИЦ.

U табтипах 1 и 2 представлены экспериментальные значения констант свя чт.чтк-п сорлмнонт! VI), Vlll, IX и X в б 1-е pe Al, а также соединений VII, VIH, IX и У.1 п бутаре М с 0,3 И 0,6 И 1/aCI, раггчиганньге И! изотерм адсорбчии сое i рр i с t íujii» соединений на нолннуклеош'пх (ХАГ - до'ч Al пяр в ДНК).

С-ог-дирмте VГТ

г 10"'

Coc.mi пенна IX

' а

о

1 г

'_S.ri.iAj_2.10 1 2 rIO "

Соединение VJII

3 о

* « t , *tf ,0 о

С,5 J

г/т -10"'

U 1

J rílí

Соединение XI

г/™ -10

1 ■ - |1 s ■ £ I

Р. - - а (л • I 1

,.10 1 3 - 4 - ■ 7 2:: I А I

■л 5 - - 5 о % Л I

6 • - з 4 « Г

g 7 - ■ 2« У. ' Г

5 > О В - ■ ÜG • 1 г

с !2

«/ 7 »/1. '! i i и»

0,5 1 ,1\>

о з □ ' о D о о о 1

1»

7 t

íiLüli-l

г 10

г 10

Гч"~, 5 Изотерны адссрбшш соединений VII, VI1¡, IX ч XI на раз <ья прнгпл'ш: I! сингстичесччх ЛПК. Условия.1 буфер Al (VII и VIII слеиа, IX); бут/ч. р El, 0,3 Н КлС1 (VII и VIII справа); 6}фср Ы, 0,6 Н ИаС1 (>.!). Буфера Al и 1:1 - кпкодг.ъ-н ндгркп pll 7,0 (Л1 - 0,001 П, В1 - 0,005 И) и присутствии ЭД1Л (Л 1 - 1x10-'И, Ы -5x10-41).

На рис.6 представлена экспериментальная зависимость 1п К ог 1п ХАГ, полученная для связывания соединений VII, VIII, IX и па различных природных и ■ и'четических полпнуклеотидах. При низко!"! ионной силе зависимости для лш аилов IX и XI представляют собой пряные линии с пакленом 611, т.п. молекула рбис-чтетропсипа содержит 6 АТ-спеи'.чичньи реакционных центров. Аналогичные результат были получены дзл связывания соединения X. Молекула аналога VII имеет только 3 АТ-епеииричных цен 1 ра, что совпадает с числом амид.чых грушт в мот: г.уле.

Определение числа ДТ и. С'.С-спепитичнтк реаытуннмх цен т рев п_ но т'кулах бис-Н" т^у.чеиноп. Если лиганл с одер *ат г только ЛТ-спецщатчные реакционные центры, то сре дня я комстатпа связывания лигапда К по:»-; г быть рас .читана по формуле 1т.К^1и.0«г.-1иБлт»п-1пХ,, 11) где К0-котк. - шта, харакпризуишач вклад

пс^чччесхп.ч в чапмэлепс твттй, 5ДТ - к.-.чтет ап т а о табидьно-. ш связи мо^ту ч-лим

1<

Глбчииа I. Киисте'пы с.ич""я5а;/кя соеичнеьин VII, Г111, IX и X с рлч/нг/р'М'ч //"'I /г сннгсп1чс:г.утч{ полипуклеотидиш р бу^г/те /Ч яри М1)

лпк х А 1 VII VII I IX »

-1 " 1 уСс1! ) 1 ,00 7015 сои 200120 7,012

1 Р"Лу (.1М )];, 1 ,00 30 »3 2112 3,010,5 -

'Л рггГги^^пг 9,72 3-113 2412 3(113 2,610,5

'Лз1Г 1 /гуг."' 0.58 1512 1211 8,011 1,510,5

1'. СО I 1 0,50 1211 811 5,010,7 1,010,6

П^ПШ^ 5рес 0,36 3,3 • 0, 5 2,510,3 1,310,3

1у5оде!кНсиз 0,23 1,810,3 1,310,2 1,5±0,3

по' у(<к;) ч1о1у(л:) 0,00 - - 2,510,7

Тлбпшъ 2. Ксист-^чл свяэ*мани<! спе-чинений VII, 1411, IX н XI в бу!^рг 1:1 с /V л С" / с прнроЛ1М1'/ ¿ПК и синтстическнпч нолниуклеогидпнч при 20*0. (К'10"ь, /Г1, ьрниг! ЯТ;Л7 ога VIII)

+ 0,3 II НаО + 0,6 М ИзС1

¿их X дг VI [ ШКК-Ю"3) IX XI

ркЬЧ-ЗЛ) -ро1у(111) 1 00 1011 1011 0 3610 05 4015 0

1ро1у(алг)], 1 0" 4,510,5 6,010 8 0 1010 02 8,012 0

С1.регГг1П£еи7 0 72 4,0 • 0,4 7,010 9 0 1210 02 6,011 5

Са1Г ihyr.ii 1$ 0 58 2,010,2 7,010 9 0 0710 02 2,010 5

Е. со! 1 0. 511 1,1+0,I 4,010 7 0 0510 01 1,210 (>

1 ¡гггыпя ьрсс 0 ЗЬ 0,510,1 1,810 4 0 0910 02 1,010 5

11. 1 у.5ос¡е1М ¡сиг 0, 2.Н 0,2210,01 0,3510 20 0 1310 02 0, «10 4

-о1у('.1а) -ро1у(11С) 0, 00 - -- -- 1 ,510 5

реакционным цент реп лмгонлл и А Г паре 11 осмив-тий ЛПК, ХАТ - лсмч ЛГ пар в /II1К Пурский и Загелател::в, 1 Зчшсимосгь 1пК ог пролог авляег со^ой грггик;

Л'ЛИИЮ, ! И КЛОП КО юрой рас «К числу РЕЛЯЦИОННЫХ ЦС'ШрСЧ П. Лобщо ГО случ.'.ч! ь 1агм'-)Л01'.стт'.ч с ЛИК лэухкгмпонентого лиганла, солср кшего АГ-спетиичнмх

1 1 { ""1 и П СС-СПСиИ^ИЧИЫХ ИОШ рои , ЗНГГ:<Ч'ИП П И П Милно О! 1рОЛС/).Н )> И" м '.клон^п ?ксл'"р,.,мгн1а.'н но получении:« пр-чь-х, ?лражэмцн;< :з;-->5И<"!1"^сч ь ) 1) У ^г И»

и

Рис. 6 Зиьис ШЮСТЬ 1п К

о

(константы связывания) Соединений -

•

.1

IX и XI о г -Ь»ХАт " ^сс Яйз-

о о

личных природных и синтетических АПК, рассчиг лннаи из из от ери ад-сорбции. Тонкие иронии линии пред-

г74

с гль/ымг теоретические заннсииосл и ^ с указанием числа /17'- (либо ОС-)

'"Ч

спе№ь1*гшш И"нтров. £

X и К от 1п (X ) в пределе, кся л'л X —>1 н X соигпотспимню

А 7 СС ' АГ СС

81

.ос V , . и I п К (1-«г—) -п - 1 на } , г; * о1 V а 1» X

о у -п АТ

АГ А I

С-5

СП

114 ! - и Т1

с) III X 2 X •> I Г.С

ос

(2) Злись И - усредненные хон-стопгы сип'чпькосн! связей, образуемых реакционными центрами типа

(3) 1 (ЛТ-огто! 1И1|>ччны1 к11 и типа ?. 1СС-специтпчпшн) с парой оснований X.

Г! присутствии М НаС1 зависимость )п К ог 1п ХАТ, для связывание

соединений IX и XI на ДОК не я.» икнся линейными, что указывает на то, чю ним Э1ИХ угл'-.пичк становится зчиешым вклад в отязыь'ШИр то только ЛГ-, по и С.С-спенп.Т'Ичнмх центров. Из /.не.6 легко видеть, что наклон кривой, описывающий зависимость 1п К ог 1п X ,. л кг связывания соединения XI равен 6 при X —>1, в то

Л т АТ

врем и как лпрнснмость 1п К ог 1пХгс при Хис—имеет наклон, равной 2. и

обра юн, соеднп"Ипе XI велот себя как двухконионешный лиганд, кот'-рмй имеет 6 ЛГ- и 2 □С-спец.т-('ПЧ1шх центра, 'ак как Н-пропитнирролкарбоксотшдные ТР«' моит К

,, л г. (1------) -п

г

бис-нетропсина служат в качестве АТ-специфичпых реакционных центров, логично было бы предположить, что пептидные Фрагменты в центральной части молекулы бис-нетропсина содержат 2 ОС-специфичных центра.

Аналогичные результата были получены для связывания соединения IX. В этом случае начальный наклон кривой, описызакхлй зависимость 1п К от 1п X при Х^—»1 равен 3. Это свидетельствует о том, что в присутствии 0,6 М КаС1 лишь один из двух нетрогслновьгх фрагментов соединения IX связывается с ДНК, в то время как другой фрагмент вытесняется из комплекса ионами .\'а+. Линейная экстраполяция кривой 1п К от 1п Хсс при Хос—>1 согласуется с тем, что соединение IX имеет 2 С.С-специфичных реакционных центра.

Рис. 7 Сравнение зависим'.слей 1п К от 1п Хлт полученных для связывания соединений VII и VIII с поли(йА)-поли(АТ) и различным природными ДНК с разные соотношением АТ и GC пар.

1пК

ХАТ Л

Соединение VIII S " буфер Al

InK

ЫХАТ л

Соединение VIII 5 " Буфер El+0,3 М NaCl

Соединение VIII буфер Б1

Соединение VII Буфер Б1+0.3 М NaCl

Различия в специфичности связывания мономерных нетропсиновых аналогов VII и VIII проявляются лучшим образом при высокой ионной силе буфера. В этом случае, однако, достаточно было использовать NaCl в концентрации 0,3 М. В таких условиях лиганд VIII проявляет свойства соединения, содержащего в своем составе как AT-, так и Ge-специфичные реакционные центры, что хорошо видно на рис. 7. При этой ионной силе экспериментальная зависимость In К от In Х^т отклоняется от прямой линии и проходит через максимум в районе содержания AT пар 50-75'/..

IV.5. Частичный гидролиз ДНКазой X комплексов соединений VII. VIII, IX и XI

с фрагментами ДНК известной нуклеотидной последовательностью. Для уточнения нуклеотидных последо?ательностей, с которыми преимущественно связываются синтезированные лиганды на реальной ДНК был проведен анализ профилей нуклеазного расщепления Фрагментов А и Б свободной ДНК (нуклеотиды 1278-1688 и 775-1171, соответственно) плазмиды pUC9, и комплексов фрагмента А с соединениями VII, VIII и IX и фрагмента Б с соединением XI.

Профили растепления нуклеазой комплексов ДНК с соединениями VII, VIII и IX, были получены после сканирования радиоавтограмм гелей на денситометре и последующего анализа с помощью ЭВМ. Обращает на себя внимание сходство профилей нуклеазного расщепления комплексов бис-нетропсина IX и аналога нетропсина VIII. Имеется защита от гидролиза ДНКазой I одних и тех же участков ДНК. Зги участки, однако, не защищаются от расщепления нуклеазой в комплексах с аналогом VII.

С другой стороны, ряд положительных пиков, соответствующих участкам ДНК, которые защищены от расщепления ДНКазой I в комплексе с аналогом нетропсина VII, обнаруживаются также на профилях нуклеазного расщепления комплексов с аналогом нетропсина VIII.

Детерминанты специфичности молекулы бис-нетропсина IX и димеров аналога VIII при низкой ионной силе являются идентичными и отличаются от детерминант специфичности связывания аналога VII.

IV. 6. Места преимущественного связывания аналогов нетропсина VI_L и VIII Я бис-нетропсина IX на ДНК. Ранее было показано, что для поиска места связывания нетропсина необходимо сместить 3'-конец защищенного от расщепления ДНКазой I участка на 3-4 нуклеотида в 5'-направлении, а 5'-конец защищенного участка на 1-2 нуклеотида в том же направлении (Скамров и соавт., 1985).

Экспериментальные результаты показывают, что аналог VII имеет 3 АТ-спеыифичных центра. Связывающие места для бис-нетропсина IX совпадают со связьтакяцими местами для димерной формы аналога VIII, а связывающие места для монсмеров аналога VIII совпадают со связывающими местами для аналога VII. Соединение IX и аналог VIII в димерной форме взаимодействуют преимущественно с последовательностями, содержащми два кластера из 3-4 АТ-пар, разделенных

с» гр

последовательно,4« V» В участках 1338-1445, 1453-1460, 1515-1522, 1535-1542

олна из АТ пар па периферии связывающего места заменена на GC пару оснований.

На ралиоавтограммах комплексов соединения XI с рестриктазным фрагментом 13 из та амиды pUC9 наблюдаются четыре участка, защищаемых соединением XI от гилролит

ДНКазой I (рис.8).

Наиболее сильное связывающее место, для которого защитный эффект наблюдается в присутствии 3-10 7 М бис-нетропсина, имеет нуклеотилну» последовательность 5'-ТАТССААА-З' (участок 3). Другие участки связывания бис-нетропсина занималггся при более высокой концентрации лиганда и содержат протяженные кластеры АТ пар. Соединения IX и XI "узнают" близкие или идентичные последовательности На ДНК.

Рис. 8. Авторадиогранма продуктов гидролиза ШКазой I фрагмента Б из ллаэ-миль' pUC9 и комплексов соединения XI с фрагментом Б.

Условия: концентрация MIK Р/2 =1,1 -10'5 ti, фермента - 5 мкг ■ м/г"', соединения XI -2,6 • 10~6 ti (1), В,7-10-1 Н (I), 2,7-Ю-1 Н (3); буфер Г (10 мН Trls-HCl pH 7,5), 5 нЛ HgCl.

Внизу: Выделены последовательно-

сти- "узнаваемых" сайтов на фрёГмепте Б:

I—1-1 910

[ I I I I

GGtAtCtTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCGCTGACT

, г-2—,, , 370

töAöCÖTCGAITTttGiGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGC

CtATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTfACGGTTCC

830 I

ДНК+аналог XI. о

;о12з

■ 1

С-

d

949 6 9370

Ж.. ö

900 А —

837G-680 -

Нами была предложена следуюшя модель комплексов такого типа, описывающая связывание синтезированных лигалдов (рис. 91.

Рис. 9. Модель комплекса соединения X1 со связывающим местом 3 фрагмента Б из плазмиды р11С9 (см. рис. 8). а) положение лиганда в узкой бороздке ДНК; б) предполагаемая схема водородных связей, возникающих при образовании комплекса.

ВЫВОДЫ

1. Синтезированы нетропсин-гюпгидныо конъюгаты, содержащие на N конце аналога нетропсина пептидные_фрагменты С1у-С1у-, \/а1-\/а1-\/а1-С1у-С1у- и 0пз-С1у-\/£11-Уа1-\/г:1-С1у-С1у-. I ГГсжмано, чгЬ 'в' ЕЮДног^^-рпстворе и ,,мётано;1о аналоги, содержащие" ^ивалин/Ч^разую1>ас^оциаты, которые находяюя в концентрацинн^зависимом^равТюоесии с мономерами. Ассоциаты образуются за ,счет взаимодействия пептидных. фрагментов, '. которые образую1-анти[1ара/1[1ельный11-спой в водно^раствЪре.| Показано, •по всгГэти соединения с2Р?мвэклся 9 ДНК. Специфичность их связывания зависит ог их агрегатного состояния. В мономорТю1Г^юр№э они обгпдпют "такой же пг.юцифичностью связывания, как и аналог и ногропоина, не

содержащие триваЛина;. они взаимо'действуют избирательно с кластерами

I --->

АТ-лар. на ДНК.^ Диморы аналогов содержат, кроме АТ-сгшцифичных реакционных центров, ещо и центры, взаимодействующие избирательно о СС-парами ДНК. Эксперйметальные результаты согласуются с предположением о том, что пептидные фрагменты образуют [¡ слой, который встраивается в узкую бороздку ДНК и взаимодействует с двумя последовательными вС-ларами ДНК, в то время как нетропсиновые фрагменты взаимодействуют избирательно с кластерами АТ-пар. \ 2. Для проверки предположения о том, что димерная форма пептида вовлечена в специфические взаимодействия с ДНК, были сконструированы, синтезированы и охарактеризованы димерные цистин-содержащио пептиды, состоящие из двух идентичных пептидных фагментов, соединенных Э-Э связью и содержащие аминокислотные остатки, часто встречающиеся в р-слоях.

37 Изучено связывание с ДИК цистин-содержащего пептида ¿.Э'-Ыз(Н-Ьуз-61у:Уа1;Суз-уа1тЫН-МН-0п8), в котором два пептидных фрагмента соединены ковалентно с помощью Э-Э связи. Показано, что в присутствии 0,1 М №С1 константа связывания пептида на изолированном связывающем месте на поли(сЮ)полй(с1С) примерно в 10 раз больше, чем на поли(йА)поли(с1Т).\/Пе'птид може! также дискриминировать гомо- и гетеро(СС) нуклеотидные последовательности. Цистиновый пептид "конкурирует за связывающие Места' на ДНК с двумя антибиотиками, связывающимися в узкой бороздке ДНК - сибиромицином и дистамицйном

А, и, очевидно, также._связывается в узкой бороздке, Форма

экспериментальных Изотерм адсорбции , пептида согласуется с предггаложениэм, что пептид связывается с ДНК как в форме мономара (Р-слой), так и в форме димера" (Р сэндвич), причем как мономер, так й диме'р занимают 4 пары оснований при связывании Связывание сэндвичей является кооперативным процессом, в го время как связывание мономеров некооперативно.

4. На основе полученных данных о специфичности связывания синтезированных олигопептидов и известных 'ранее данных о специфичности природных антибиотиков группы нетропсинз сконструированы и синтезированы соединения нового типа - бис-нетропсины, в молекулах которых об'едчнены пирролкарбоксамидные и олигопептидные фрагменты: |3,3'-Ы5(61у-Су5-С1у:мн2), Э.З'-Ь^Оу-Суз-Яаг-МН2) и 3,3'-Ыя(Н-С1у-Су5-С1у-С1у-01у). Синтезированные гибридные молекулы можно условно разбить на две группы в зависимости от взаимной

ориентации олигопептидных-и пирролкарбокса мидных фрагментов^, \ 5. Исследовано взаимодействие с ДНК различных бис-нетропсинов. Показано, что молекулы полученных соединений содержат 6 АТ-специфичных центров, Тв—то-время-как мономерный нетропсиновый .фрагмент несет 3 АТ-специфичных центра. Наибольшим сродством к ДНК обладал бис-нетропсин, содер^Шцмй;в .центральн£Й части молекулы-паптид -,8,5'-Ыз(Н-С1у-Суз-С1у-С1у-С1у), в котором направление^КГС^.гС' в пептидном фрагменте совпадает с направлением' И-С4-С2-С' в.. нетропсинавом фрагменте,1 Показано, что этот бис-нетропсин'и его аналог, содержащий ' пептид 5,8'-Ыз(С1у-Су8-С!у-ЫН2), имеют, кроме АТ-специфичных центров, реакционные центры, избирательно взаимодействующие с двумя йС-парами на ДН1С За/йаца двух амидных связей на Ы-метиламидные в • пептидном димере приводиТ\к резкому уменьшению ■ сродства бис-нетропсина к ДНК.. ' ^

6. Анализ профилей нуклеазного расщепления свободной ДНК с известной нуклеотидной последовательностью и комплексов ДНК с бис-нетропсином, содержащем в центральной части молекулы пептид 5,5'-Ыз(Н-01у-Суз-С1у-С1у-С1у), показал, что в месте преимущественного связывания бис-нетропсина на ДНК находится нуклеотидная последовательность 5'-ТАТ6СААА-3'. Предложена модель для комплекса бис-нетропсина с ДНК, согласно которой цистиновый пептидный димер и два нетропсиновых фрагмента образуют специфические контакты с парами оснований в узкой бороздке ДНК.

Искренне благодарю за дружескую помощь в работе своих научных руководителей Алексея Львовича Жузе и Георгия Валериановича Гурского, а также Сергея Львовича Гроховского и группу биофизиков: Александра Сергеевича Заседателева, Нину Юрьевну Сидорову, Тоомаса Аадоевича Лейнс.оо, Анну Никитичну Суровую, Сергея Анатольевича Стрельцова.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Т.АЛейнсоо, В.А.Николаев, С.Л.Гроховский, С.А.Стрельцов, А.С.Заседателев, А.Л.Жузе, Г.В.Гурский. Присоединение тривалина к аналогу нетропсина изменяет его специфичность связывания с ДНК. Молекулярная биология, 22 (1), 159-175 (1988).

2. Т.А.Лейнсоо, В.А.Николаев, С.Л.Гроховский, А.Н.Суровая, Н.Ю.Сидорова, С А.Стрельцов, А.С.Заседателев, А.Л.Жузе, Г.В.Гурский. Синтетические

ДНК-соязывающие лиганды, содержащие реакционные центры, специфичные к АТ и вС парам оснований. Молекулярная биология, 23 (6), 1616-1637 (1989).

3. Н.Ю.Сидорова, В.А.Николаев, А.Н.Суровая, А.Л.Жузе, Г.В.Гурский. Взаимодействие с ДНК цистин-содержащего пептида. Молекулярная биология, 25 (3), 706-716 (1991).

4. С.Л.Гроховскчй, В.А.Николаев, В.Е.Зубарев, А.Н.Суровая, А.Л.Жузе, Б.К.Чернов, Н.Ю.Сидорова, А.С.Заседателев, Г.В.Гурский. Специфическое расщепление ДНК аналогом нетропсина, содержащим хелатирующий ион меди(М) пептид С1у-С!у-Н1з. Молекулярная биология, 26 (6), 1274-1297 (1992).

5. В.А.Николаев, А.Н.Суровая, Н.Ю.Сидорова, С.Л.Гроховский, А.С.Заседателев, Г.В.Гурский, А.Л.Жузе. Лиганды, обладающие сродством к определенным последовательностям пар оснований ДНК. X. Синтез и связывание с ДНК аналогов нетропсина, содержащих хелатирующий ион меди пептид. Молекулярная биология, 27 (1), 182210 (1993).