Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конституционные и интродуцированные факторы устойчивости растений гороха PISUM SATIVUM L. кгрибам FUSAMUM OXYSPORUM, ASCOCHYTA PISI,ASCOCHYTA PINODES.

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Конституционные и интродуцированные факторы устойчивости растений гороха PISUM SATIVUM L. кгрибам FUSAMUM OXYSPORUM, ASCOCHYTA PISI,ASCOCHYTA PINODES."

^^ На правах рукописи

ШАЛИМОВА ОКСАНА АНАТОЛЬЕВНА

КОНСТИТУЦИОННЫЕ И ИНДУЦИРОВАННЫЕ ФАКТОРЫ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ ГОРОХА PISUM SATIVUM L. К ГРИБАМ FUSARIUM OXYSPORUM, ASCOCHYTA PISI, ASCOCHYTA PINODES.

03.00.12. - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 1998

Работа выполнена в Орловской государственной сельскохозяйственной академии и во Всероссийском научно-исследовательском институте ■зернобобовых и крупяных культур.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Павловская Н.Е.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Епринцев А.Т.

кандидат биологических наук, доцент Артемова Э.К.

■ /

Ведущая организация - Орловский государственный университет

Защита состоится 1 декабря 1998г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 063.48.09 Воронежского государственного университета по адресу: 394693, Воронеж, Университетская пл., 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан " " 1998 г.

Ученый секретарь • »

диссертационного совета /г^/^-с^гт-г Брехова Л.И.

Актуальность темы. В последние десятилетня остро встала проблема экологизации сельского хозяйства. В целях повышения урожайности сельскохозяйственных культур используются разнообразные агротехнические приемы. Несмотря на это, потери урожаев из-за болезней растений весьма велики. В результате реальная урожайность значительно ниже потенциальной. К числу защитных мер против патогенов относится селекция сельскохозяйственных растений на устойчивость. Для наиболее полного раскрытия генетически обусловленного защитного потенциала растения, необходимо проводить исследования на всех уровнях: факторах пассивного (конституционного) иммунитета и активных (индуцированных) реакций.

К числу факторов конституционной устойчивости растений относятся лектины и содержание лигнина в клеточной стенке. Такие реакции растений как образование фенолов, фитоалексинов, лигнина, активизация окислительных ферментов, перекисных радикалов, ингибиторов протеин'аз, относятся к факторам индуцированной устойчивости. Но эти же реакции часто играют роль в защите от любого стресса и являются скорее следствием, чем причиной специфического узнавания.

В Нечерноземье ведущей белковой и седеративной культурой является горох. В последние годы существенные потери урожая гороха происходят из-за поражения его корневыми гнилями и аскохитозом.

Большое количество научных исследований по изучению факторов устойчивости, проводимых на этой культуре, касалось лишь отдельных реакций иммунитета. Воссоздание целостной картины последовательных биохимических реакций, начиная с момента первого контакта гриба с растением, позволит сформулировать идею о комплексно устойчивом к грибным инфекциям сорте гороха и вести направленную селекцию на иммунитет.

Вместе с тем, изучение механизмов устойчивости гороха на разных этапах патогенеза и анализ различий между поражаемыми и толерантными сортами гороха позволит создать экспресс-методы быстрой оценки устойчивости форм растений, что позволит существенно снизить материальные, земельные и временные затраты на скрининг сортообразцов на устойчивость к грибам.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение на широком спектре сортов гороха местной селекции и коллекции Бликста, различающихся по устойчивости к аскохитозу и фузариумным корневым гнилям, факторов конституционной и индуцированной устойчивости для формирования модели комплексно устойчивой к грибам-патогенам формы, а также разработка экспресс-методов быстрой оценки устойчивости сортов к грибам, вызывающим аскохитоз и корневые гнили гороха.

В процессе работы решались следующие задачи:

- изучить' реакции конституционной и индуцированной устойчивости здоровых и зараженных органов растений.гороха Pisшn Байушп Ь. Исследовали следующие факторы иммунной системы: геммаглютинирующая активность лектинов; содержание лигнина в клеточных стенках растений гороха в норме и

при патогенезе; ферментативную активность окислительных ферментов - пе-роксидазы, катал азы, о-дифенолоксидазы; множественные молекулярные формы пероксидазы; продуцирование фитоалексина пизатина, реакцию сверхчувствительности и активность ингибиторов протеин аз (трипсина и химотрипсина' в семенах. В качестве инфицирующих агентов использовали различные по специфичности патогенные грибы: облигатный паразит Fusarium oxysporun Schlecht и факультативные паразиты Ascochyta pinodes L.K. Jones и Ascochyti pisi Lib.;

- разработать экспресс-метод быстрой, оценки степени устойчивоста сортообразцов гороха к грибным инфекциям;

- сравнить результаты лабораторной оценки устойчивости сортов с данными полевых опытов.

Научная новизна и практическое значение работы. На широком спектре сортов проведено изучение защитных биохимических механизмов гороха в ответ на инфицирование различными по способу питания и паразитирования патогенными грибами. Исследования проводились на всех этапах патогенеза, начиная с реакции сверхчувствительности и до образования локальных некрозов.

Предложены экспресс-тесты для скрининга устойчивых к грибам форы гороха, основанные на анализе ряда ключевых реакций конституционного * индуцированного иммунитета.

Создана модель комплексно устойчивого сорта гороха на основе физио-лого-анатомического строения растения и биохимических защитных реакций Данные исследований имеют прикладное значение для селекционного процесса. 1

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертационное работы были доложены на заседании лаборатории индуцированного иммунитета института биохимии им. Баха РАН; симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология" (Москва, 1997); международно? конференции "Биологический и экономический потенциал зернобобовых , крупяных культур и пути его реализации" (Орел, 1997); конференции "Защита растений от вредных организмов в условиях биологизации земледелия" (Орел 1998); III Европейской конференции "Grain Legumes" (Валладолид, 1998).

Публикация результатов. По данным диссертационных исследование опубликовано 3 печатные работы, 3 находятся в печати.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 196 страницах машинописного текста, включает 8 таблиц и 26 рисунков. Состоит из введения, i глав, заключения, выводов, рекомендаций производству, списка используемое литературы (274 источника, в том числе 122 иностранных), 17 приложений.

На защиту выносятся следующие основные положения:

- механизмы устойчивости гороха к грибам-паразитам не зависят от тип; патогена и не являются специфическими;

- устойчивость растений гороха к патогенам является полигенным признаком;

- различия между устойчивыми и восприимчивыми сортами гороха заключаются в сроках инициации и протекания защитных реакций, высоте подъема и величине тангенса угла наклона кривой, описывающей данный биохимический параметр;

- количественное различие биохимических защитных реакций между сортами является маркерным признаком устойчивости или восприимчивости конкретного сорта;

- предложена биохимическая модель комплексно устойчивого к грибным болезным сорта гороха;

- разработаны экспресс-методы оценки устойчивости гороха к грибам-патогенам.

Условия и методика проведения эксперимента. Исследования проводились в течение 1996... 1998 гг. в условиях лаборатории биохимии ГНЦ ВНИИ зернобобовых и крупяных культур (г. Орел) и на кафедре кормопроизводства Орловской государственной сельскохозяйственной академии (г. Орел). Оценка сортов на устойчивость проводилась на базе полевых опытов на контрольном и провокационном фонах лаборатории иммунитета ГНЦ ВНИИ ЗБК.

Таблица 1

Характеристика устойчивости изучаемых сортов гороха к грибам, вызывающим аскохитоз и корневые гнили (0 баллов - иммунный сорт, 1 балл - высокоустойчивый сорт, 2 балла - устойчивый сорт, 3 балла - средневосприимчивый сорт, 4 балла - восприимчивый сорт, 5 баллов - сильно поражаемый сорт).

ЬЬзвание | сорта Rosacrone äs 5 к я gs Colt 'S •а гз n и o <L> 9 \ V >. o. dä s CL. I-o Й Аист Tigra X § Hja 51666 Орловчанин L-340 Орпела Орлу с Смарагд

№ по кат. 7032 6970 2194 1768 2338 351* 124* 8363 141« 8176 2438 8419 9101 237« 7481

ВИР

Уст-ть каско- 1 1 4 4 1 1 1 1 1 4 3 3 1 1 3

хиозу

Уст-ть к фу- 1 1 3 1 1 1 2 1 1 1 3 3 3 3 4

за-рио-

зу

- каталог ВНИИ ЗБК

Сбор и подготовку популяций возбудителей аскохитоза проводили летом с пораженных-листьев, стеблей, бобов, а зимой - с семян методом Овчинниковой А.М. и Гусевой H.H. (1993). При выделении грибов использовали минеральную среду Чапека (жидкую для Fusarium oxysporum и твердую для Asco-chyta pisi и Ascochyta pinodes). Для инфицирования 7-ми дневных корней проростков использовали культуральную жидкость гриба Fusarium oxysporum. Для

заражения патогенами аскохитоза использовали листья гороха в фазу цветения путем нанесения суспензии спор грибов. С целью исключения скатывания ка--пель с поверхности листа в суспензию на котике иглы вносили смачиватель ОП-7. Выбор сортов гороха определялся отношением к возбудителям болезни (табл.1).

Гемагглютинирующую активность лектинов тканей гороха изучали по методу Выскребенцевой Э.И. с соавт. (1986). Объектами исследования являлись осевые органы 5-ти суточных проростков гороха. Лектиновую активность определяли титрованием на планшетах с U-образными лунками, выражали в обратных единицах [размерность (мг/мл)'1], что соответствует минимальной концентрации белка, при которой отмечали реакцию гемагглютинации.

Лигнин 'Определяли по методике Класона с модификациями (Ермаков А.И., 1987) путем удаления целлюлозы и гемицеллюлоз гидролизом концентрированными кислотами и учетом массы остатка, представляющего собой "сырой" лигнин, содержащего минеральные вещества.

Электрофорез для определения множественных молекулярных форм пе-роксидазы (КФ 1.11.1.7) проводили по Ornstein (Ornstein L., 1964). Щелочную буферную систему готовили с учетом рекомендаций Ornstein L. и Davis B.J. (1959). Окрашивание вели в 0,2 М ацетатном буфере (pH 4,8) 0,01 М бензиди-ном, 0,1 М пирокатехином и 0,04 М Н2О2. Гелевые диски хранили в 20%-ном этаноле.

Пероксидазную и о-дифенолоксидазную (КФ 1.10.3.1) активности определяли в здоровых и инфицированных корнях 7-ми дневных проростков и листьях в фазу цветения колориметрическим методом Бояркина (Ермаков А.И. и др., 1987) с модификациями. В качестве субстрата для пероксидазы использовали 0,02 М раствор бензидина в ацетатном буфере (pH 5,4), для о-дифенол-оксидазы - 0,05 М раствор пирокатехина. Измерение оптической плотности растворов проводили, на фотоэлектроколориметре ФЭК - 56 М. Пероксидазную активность определяли при длине волны >.=590 нм, о-дифенолоксидазную активность - Х=420 нм. Активность пероксидазы и о-дифенолоксидазы выражается в относительных единицах на 1 мг сырой ткани за 1 мин.

Каталазную (КФ 1.11.1.6) активность определяли титрометрическим методом, путем расчета каталазного числа по методу Баха H.A. (Вальтер O.A. и др., 1986). Катапазное число (количество мг Н2О2, которая разлагается 1 мкл ферментной вытяжки) вычисляли умножая на 1,7 разность между количеством КМп04) израсходованного на титрование до и после действия каталазы.

Определение активности ингибиторов протеиназ проводили в семенах методом Какейда М.Л. с модификациями Бенкен И.И. (Ермаков А.И., 1987). В качестве субстрата использовали 2 %-ный казеин. Экстинкцию определяли на приборе СФ-26 при Х=280 нм. Ингибирующую активность вычисляют по формуле и выражают в заторможенных трипсиновых (химотрипсиновых) единицах на 1 г муки.

Определение фитоалексинсинтезирующей способности проводили методом капельных диффузатов листьев (Müller К.О., 1956). Инкубировали 4,12, 24,

48 часов с суспензии спор грибов A. pisi и A. pinodes. Супернатант спектрофо-тометрировали против воды при Х=309 нм и =286 нм на приборе СФ-26. Концентрацию пизатина вычисляли по формулам, преложенным Круикшанком и Перрин (Cruickshank J.A.M., Perrin D.R., 1993), выражали в мг/мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ЛЕКТИНЫ КАК ФАКТОРЫ КОНСТИТУЦИОННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ГОРОХА И ИХ РОЛЬ В УЗНАВАНИИ ПАТОГЕНА

При изучении гемагглготинирующей активности корней 5-дневных проростков было установлено, что уже в здоровых тканях гороха существует различие в уровне лектиновой активности между устойчивыми и восприимчивыми к фузариозу сортами. У устойчивых сортов уровень лектиновой активности был довольно высоким - 7-22 (мг/г)"1. Восприимчивые к грибу F. oxysporum сорта гороха имели в корнях проростков более низкую активность лектинов -1-7 (мг/г)"1. Это свидетельствует о специфичности данной защитной конституционной реакции растений гороха, где устойчивые к облигатному грибу F. oxysporum сорта гороха обладают более высокой лектиновой активностью здоровых тканей корней проростков (в первую очередь поражаемых данным видом гриба), чем неустойчивые (табл.2).

Таблица 2

Активность лектинов в корнях проростков гороха в норме и при инфицировании (через 24 часа) у различных по устойчивости к фузариозу сортов ([мг/мл]1).

ЬЬзвание сорта Rosacrone ás¡ 5 >а s i Colt -0 cd и о о и I « Z X >. о. £ а я ÍX н о й Аист Tigra и S ft Hja 51666 Орловчанин L-340 Opпела Орлус J 1 Смарагд

здоровые 14,3 10,2 6,8 7,5 16,8 18,1 30,4 22,0 15,2 13,3 11,6 7,8 5,2 3,4 1,9

инфи-

цирован. 19,9 14,6 11,4 14,7 17,6 22,3 20,8 25,0 20,1 14,4 18,7 12,2 8,6 4,6 5,5

НСРо,о5 = 0,36

При изучении лектиновой активности тканей листьев гороха в связи с устойчивостью исследуемых сортов к аскохитозу было показано, что даже при минимальной степени разведения реакция гемагглютинации не была зарегистрирована ни у одного образца. Отсутствие регистрируемой лектиновой активности в листьях гороха объясняется, видимо, низкой чувствительностью используемого метода.

При инфицировании корней проростков гороха культуральной жидкостью гриба Р. охуБрогит спустя сутки после заражения отмечали увеличение лектиновой активности у 14 исследуемых сортов (как устойчивых к корневым гнилям, так и восприимчивых). Увеличение активности у ряда восприимчивых сортов было более значительным (до 300 % у сорта Смарагд), тем не менее абсолютное значение этого биохимического показателя у восприимчивых растений гороха было ниже таковых у устойчивых. Учитывая, что устойчивые к об-лигатному грибу сорта гороха обладают более высоким уровнем лектиновой активности, на основании имеющихся литературных данных (Лахтин В.М., 1986) следует предположить, что эти же корни обладают более высокой способностью образовывать клубеньки, содержащие нитрифицирующие бактерии. Эта способность гороха может способствовать регуляции численности обли-гатного патогена Р. охузрогиш в почве путем выращивания устойчивых к данному грибу-паразиту сортов гороха.

СОДЕРЖАНИЕ ЛИГНИНА В КЛЕТОЧНЫХ СТЕНКАХ КАК ФАКТОР КОНСТИТУЦИОННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ГОРОХА К ГРИБАМ

Среди многочисленных "барьерных" полимеров растений большую роль играет содержание лигнина в растений. Анализ корней проростков гороха, атакуемых облигатным грибом Р. охуБрогшп, показал отсутствие различий в содержании лигнина между устойчивыми и восприимчивыми сортами (табл.3).

Таблица 3

Содержание лигнина в тканях растений гороха в норме и при патогенезе (24 часа после инфицирования) у различных по устойчивости к грибам-патогенам __сортов (мкг/г сырой массы).

ЬЬзвание сорта Rosacrone Приекуль-ский 292 Colt Шайбовый КЬльцева Неруч X s о. f-о а Аист Tigra s 1 ft Hja51666 Орловчанин L-340 td e¡ ё а Орлу с Сшрагд

В лис-гъях 1дор 8.1 7.3 4.3 5.4 10.1 11.3 8.6 12.4 11.3 10 6 6.4 4.6 7.4 2.6 6.7

Миф 10.9 11.4 7.1 8.0 12.2 14.1 11.6 15.2 13.3 12.2 9.7 6.6 8.1 6.8 7.5

В хор- 1ЯЧ Здор 16.1 11.3 13.3 10.6 11.3 20.4 11.4 12.3 12.7 12.5 11.9 12.4 12.5 12.3 5.9

Инфиц. 21.6 20.3 14.2 15.3 12.6 28.1 22.6 25.3 21.3 26.1 24.3 19.1 13.3 18.4 16.1

НСРодк = 3,02

В листьях гороха, поражаемых облигатными грибами рода АбсосЬ^э, отмечается различие в содержании лигнина в сторону большей концентрации у устойчивых сортов: 10-12 мкг/г сырого веса у не поражаемых и 2-5 мкг/г у поражаемых. Листья устойчивых к аскохитозу сортов, характеризующиеся более высоким содержанием лигнинов, имели более тонкую листовую пластинку с более тонкими слоями составляющих ее тканей: верхний и нижний эпидермис,

палисадная и губчатая паренхима. Ксероморфность тканей устойчивых к факультативным грибам сортов гороха компенсируется наличием больших количеств неразрушаемых ферментами гриба растительных полимеров (в частности лигнинов) по сравнению с восприимчивыми сортами. При инфицировании листьев гороха спорами грибов А. и А. ршос1ез (факультативы) происходило увеличение содержания лигнинов спустя 24 часа после заражения. Индукция синтеза лигнина в патогенезе была показана для всех изучаемых сортов гороха. Различия между устойчивыми и неустойчивыми к факультативному грибу сортами по содержанию лигнина в инфицированных листьях сохранялось.

Спустя сутки после заражения корней проростков гороха грибом Р. охуврогит также у всех сортов отмечено увеличение содержания лигнинов в инфицируемых органах. Однако увеличение количества лигнинов в больных органах по сравнению со здоровыми более значительное, чем таковое в листьях. Различий в содержании лигнинов в больных тканях корней у различающихся устойчивостью к фузариозу сортов, как и у здоровых растений, не установлено.

ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ В ФОРМИРОВАНИИ ИНДУЦИРОВАННЫХ ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ ГОРОХА К ГРИБАМ

Множественные молекулярные формы пероксидазы. Фермент пероксида-за (КФ 1.11.1.7) гороха, выделенная из клеток корней 7-дневных проростков гороха, в зависимости от сорта имеет 5-7 изоформ. Эти ферменты в свою очередь подразделены на фракции: малоподвижные белки (Дг 0.04-0.16), среднеподвиж-ные (1^0,24-0,49) и быстроподвижные (Яг 0,67-1,00). Фракционный состав пероксидазы в клетках листьев гороха часто не зависит от степени устойчивости сорта. Несмотря на различие в специфичности грибов-паразитов, ответная реакция растительных клеток, связанная с образованием новых изоферметов пероксидазы, неспецифична и характеризуется появлением новой зоны с Иг 0.11.

Пероксидазная активность. Устойчивые к коневым гнилям сорта имели в здоровых корнях проростков более высокую пероксидазную активность (8301200 усл. ед. на 1 мг. сырой массы за 1 мин), чем восприимчивые (110-570 усл. ед. на 1 мг. сырой массы за 1 мин). Изучение пероксидазной активности в здоровых листьях изучаемых сортов гороха в связи с устойчивостью к аскохитозу показало примерно аналогичную картину. В ходе наших исследований на здоровых тканях сортов гороха не было установлено достоверных различий в величине пероксидазной активности между устойчивыми и неустойчивыми сортами отдельно к облигату и к факультативу. Хотя имеется тенденция более высокоактивной пероксидазы у устойчивых к фузариозу растений.

Сорта гороха, характеризующиеся комплексной устойчивостью к обоим видам грибов - облигатному и факультативному - (Яояасгопе, Приекульский 292, Шустрик, Аист) обладали высокой пероксидазной активностью по сравнению с восприимчивыми к обоим грибам (Смарагд и Ь-340). Измерение пероксидазной активности здоровых тканей гороха можно применять как диагноста-

ческий метод выявления комплексной устойчивости сортообразцов гороха к специфическим и неспецифическим грибам-патогенам. Для скрининга сортов гороха на комплексную устойчивость к корневым гнилям и аскохитозу с целью сокращения сроков селекции можно использовать метод измерения перокси-дазной активности в листьях или в корнях проростков (табл. 4).

Таблица 4

Пероксидазная активность тканей гороха у различных по устойчивости к гри-

ЬЬзвание сорта Rosacrone ¡2 с; о\ ¡'I а* Colt 'i Л е ш <о о S3 'S i Нгруч и s о. н о а- Аист Tigra в i ft Hja 51666 Орловчанин L-340 § 8 а- о ч & 1 Скирагд

В ли-

стьях 112 по 119 112 144 124 119 106 106 106 90 60 84 70 64

В корнях 890 895 735 940 598 730 830 1200 590 480 420 540 570 190 570

НСРо,о5 = 5,08

Пероксидазная активность повышается уже спустя 24 часа после начала действия гриба на растение и отмечается у всех исследуемых образцов. Высокая активность фермента на протяжении всего периода патогенеза отмечается только у сортов Rosacrone и Tigra, которые являются комплексно устойчивыми к аскохитозу и фузариозу.

Нашими исследованиями продемонстрирована аналогичная картина в поведении фермента на третьем этапе болезни - проникновении патогена в клетку растения. При этом следует отметить, что динамика изменения пероксидазной активности - явление неспецифическое и является общим свойством растительной клетки реагировать на стрессор. Так, в наших опытах реакция устойчивых к неспецифическому грибу сортов гороха была аналогичной таковой у устойчивых к неспецифическому паразиту. А характер изменений пероксидазной активности в инфицированных листьях был таким же как и в корнях 10-ти дневных проростков. Разница заключается лишь в абсолютных значениях активности в каждом конкретном случае. При этом не отмечено четкой коррелятивной связи между устойчивостью сорта к грибу и активностью пероксидазы в инфицированных тканях этого растения.

О-дифенолоксидазная активность. Накапливающиеся в ходе патогенеза фенолы служат субстратом для о-дифенолоксидазы (КФ 1.10.3.1). О-дифенолоксидазная (полифенолоксидазная) активность корней проростков выше, чем таковая в листьях. Аналогичные данные распределения активности по органам были получены и для пероксидазы. Изучение о-дифенооксидазной активности у гороха показало, что уровень активности фермента в здоровых тка-

нях восприимчивых сортов гороха более высокий по сравнению с устойчивыми сортами (табл.5). Установлено, что в ходе развития болезни отмечается постепенное снижение о-дифенолоксидазной активности равно как у резистентных, так и у чувствительных форм гороха.

Таблица 5

О-дифенолоксидазная активность тканей гороха у различных по устойчивости к грибной инфекции сортов (усл. ед. на 1 мг сырой массы).

№з ванне сорта Rosacrone ¡3g S В Colt >5 л к a и о а- s вО. £ а я а. f- о & Аист Tigra к i ft Hja 51666 Орловчанин L-340 Орпела Орлус Сшрагд

В листьях 13.2 11.6 10.8 15.6 13.6 20.4 17.7 15.3 22.8 22.1 19.4 27.3 24.3 25.1 28.6

В корнях 36.0 50.1 86.9 36.7 63.3 81.6 77.7 84.6 32.9 63.6 32.3 50.6 27.3 36.9 36.1

НСРо,о5 =4,19

Снижение полифенолоксидазной активности в ответ на внедрение патогена - реакция неспецифическая и наблюдается в случае действия как облигат-ного, так и факультативного паразита. Однако, имеются некоторые отличия. В частности, абсолютное значение полифенолоксидазной активности у одних и тех же сортов было выше в корешках, инфицированных специфическим грибом Р.охузрогиш, что соответствует изначально более высокой о-дифенол-оксидазной активности здоровых тканей. В клетках листьев происходит постепенное снижение о-дифенолоксидазной активности. Более высокое значение активности о-дифенолоксидазы имеет место в клетках корней проростков, инфицируемых облигатным патогеном. Это можно объяснить двумя причинами: 1) - более высокой интенсивностью альтернативных дыхательных процессов клетки, контактирующей со специфическим грибом, что и приводит к росту активности окислительных ферментов; 2) - более высоким содержанием фенолов в корнях гороха по сравнению с тканями листьев.

Каталазная активность в здоровых и больных тканях гороха у различных по устойчивости сортов. Устойчивые к аскохитозу сорта гороха имеют более высокие значения каталазного числа клеток листьев (0,75 - 1,18) нежели восприимчивые (0,34 - 0,78). Как и при исследовании пероксидазной и о-дифенолоксидазной активности, четкое различие в уровне активности изучаемого фермента установлено между комплексно устойчивыми и комплексно восприимчивыми сортами. Анализ каталазной активности здоровых корней прростков показал более четкое различие между устойчивыми и неустойчивыми к фузариумным корневым гнилям сортов гороха.

В процессе развития болезни отмечается рост активности каталазы (КФ 1.11.1.6), что выражается в увеличении каталазного числа инфицированных клеток через 24 часа после начала воздействия патогена. И устойчивые и вос-' приимчивые растения имели более высокое каталазное число инфицированных клеток по сравнению со здоровыми. И в этом случае отмечаются различия между чувствительными и-нечувствительными формами только для облигатного гриба (табл.6).

Таблица 6

Каталазная активность тканей гороха в норме и при инфицировании (через 24 часа) у различных по устойчивости сортов (усл. ед. на 1 г сырой массы).

Название сорта Rosacrone й К? 1=1 ON О 'S я S £8 Colt л а m « о а 'S я « .5 as 6Г а, а к S р. ь о ä Аист Tigra ¡s s Ä Hja 51666 Орловчанин L-340 Орпела Орлу с Смарагд

В лис-1ЪЯХ 1дор 0.91 0.91 0.35 0.68 0.85 1.18 0.85 0.75 0.85 0.78 0.34 0.34 0.34 0.34 0.78

Инф. 1.70 0.94 0.68 0.84 1.70 1.70 0.98 1.70 0.96 0.94 0.96 1.70 0.84 0.77 0.77

В корнях Здор 1.19 0.84 0.34 0.68 0.84 0.84 0.70 0.84 0.84 0.51 0.62 0.54 0.17 0.34 0.62

Инф. 0.91 1.50 0.84 0.94 1.70 1.50 0.86 0.91 1.40 0.84 0.84 0.68 0.91 1.30 1.21

НСРо,о5 = 0,69

В процессе развития болезни отмечается рост активности фермента, что выражается в увеличении каталазного числа инфицированных клеток через 24 часа после начала воздействия патогена. Отмечаются различия между чувствительными и нечувствительными формами только в плане устойчивости к обли-гатному грибу. Обнаружена взаимосвязь между комплексной устойчивостью растений гороха к грибам-патогенам и каталазной активностью независимо от специфичности гриба как в здоровых, так и в пораженных патогеном органах гороха. Учитывая, что в инфицированных клетках параллельно происходит увеличение активности пероксидазы и синтез ее изоферментов, можно с уверенностью говорить о сопряжении в функционировании этих двух ферментов и о схожести выполняемых ими в патогенезе функций.

ФИТОАЛЕКСИНЫ И РЕАКЦИЯ СВЕРХЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

Динамика фитоалексинообразования и реакция сверхчувствительности. В нашей работе уже через 4 часа инкубирования отмечалось появление фитоалек-синов. Максимальная концентрация пизатина, зафиксированная через 24 часа после инфицирования. Через 40 часов после нанесения капли на поверхность эндокарпа отмечено снижение концентрации фитоалексина (рис.1).

Следует отметить, что лишь некоторые устойчивые сорта имели этот показатель на достаточно высоком уровне. Устойчивые же формьДемон, Неруч и Аист характеризуются низкой активностью ингибиторов трипсина, как следст-

вне, более высокой питательной ценностью, являясь хорошим исходным материалом для дальнейшей селекционной работы (рис.2).

—•— Rosacrone

•-Приекульский 292

* Неруч —О— Шустрик —Ж—Аист

• Tigra Демон Орлус

I Орпела

♦ - - Орловчанин

• -4-340 •ár - - Смарагд О - -Colt

* - -Hja 51666

♦ - - Штамбовый Мальцева

О L-4ч.

12ч. 24ч.

время инкубации, ч

40 ч.

Рисунок 1. Динамика накопления фитоалексинов в эндокарпе бобов гороха при инфицировании грибами А. А. ршос!ез (НСРо,о5= 2,89).

Через 24 часа инкубирования на поверхности эндокарпа растений ряда сортов было отмечено появление бурых четко очерченных пятен, локализованных в пределах диаметра инфекционной капли. Первые некрозные пятна появились у сортов, имеющих наибольшую концентрацию пизатина. Через 40 часов побурение, но более обширное и расплывчатое отмечено у остальных 5 сортов. Сравнительный анализ результатов об изменении активности окислительных ферментов и образованшо некрозных пятен., показал, что ранее протекает СВЧ-реакция и наблюдается она у растений, в которых изначально более высокая пероксидазная и каталазная активность и более низкая о-дифе-нолоксидазная активность.

Содержание фитоалексинов у различных по устойчивости к грибам сортов гороха. Более высокие концентрации пизатина отмечены у всех резистентных сортов, вне зависимости специфики их устойчивости, определенной в полевых условиях. Реакция сверхчувствительности протекает с большей скоростью у более устойчивых форм.

БЕЛКИ-ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕ0ЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ КАК СОСТАВНАЯ ЧАСТЬ ЗАЩИТНОЙ СИСТЕМЫ ГОРОХА

Трипсин ингибируюшая активность. В ходе проведенных исследований не было установлено четкой коррелятивной зависимости между непоражаемо-стыо гороха и трипсин ингибирующей активностью их семян.

4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1

0.5 0

3,67

2,46

1.74 1,71

1,97 1,97

1,81

1 2 3 4 5 6 7

9 10 11 12 13 14 15

Сорта гороха. Комплексно устойчивые: I .Ровасго'пе, 2.Приекульский 292, З.Неруч, 4.Шустрик, 5.Т1£га, б.Демон, Избирательно устойчивые: 7.Н]а51666, 8.Штамбовый Мальцева, 9.Аист. Комплексно восприимчивые: Ю.СоИ, 11 .Орловчанин, 12.Ь-340, 13.0рлус, 14-.Орпела, 15 Смарагд. Рисунок 2. Трипсин ингибирующая активность семян гороха различных по устойчивости к грибам-патогенам сортов (НСРо,о5 = 0,04).

Следует отметить, что лишь некоторые устойчивые сорта имели этот показатель на достаточно высоком уровне. Устойчивые же формъДемон, Неруч и Аист характеризуются низкой активностью ингибиторов трипсина, как следствие, более высокой питательной ценностью, являясь хорошим исходным материалом для дальнейшей селекционной работы (рис.2).

Химотрипсин ингибируюшая активность. Общий уровень химотрипсин ингибирующей активности семян гороха более высок , чем уровень активности белков-ингибиторов трипсина. Отмечено более высокое значение активности ингибитора химотрипсина у невосприимчивых растений по сравнению с неустойчивых (рис.3). Учитывая питательную ценность гороха, следует отметить, что среди кандидатов для селекции на устойчивость имеется ряд сортов, обладающих сравнительно низким уровнем химотрипсин ингибирующей активности (Демон, Аист, Ща 51666). Анализ результатов по активности ингибиторов трипсина и химотрипсина позволил нам выделить среди всех исследуемых сортов два - Демон и Аист. Низкий по сравнению с другими устойчивыми сортами уровень активности трипсина и химотрипсина и более высокую белковую ценность кормов, получаемых из этих сортов гороха, делает их перспективными для использования в селекционном процессе.

7

в

2,07

2,97

2,76 2,64

2 3 4 5 6 7

2,1

9 10 11 12 13 14 15

Сорта гороха. Комплексно устойчивые: 1.Яо5асгопе, 2.Приекульский 292, 3.Неруч, 4.Шустрик, 5.1^га, б.Демон, Избирательно устойчивые: 7.Ь1)а51666, 8.Штамбовый Мальцева, 9.Аист. Комплексно восприимчивые: Ю.СоИ, 11 .Орловчанин, 12Х-340, 13,Орлус, 14.0рпела, 15. Смарагд. Рисунок 3. Химотрипсин ингибирующая активность семян гороха различных по устойчивости к грибам-патогенам сортов (НСРо,о5 = 0,045).

КОНСТИТУЦИОННЫЕ И ИНДУЦИРОВАННЫЕ РЕАКЦИИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ГОРОХА В СОЗДАНИИ МОДЕЛИ КОМПЛЕКСНО УСТОЙЧИВОГО К ГРИБАМ-ПАТОГЕНАМ СОРТА

Биохимические процессы растительной клетки, индуцируемые токсинами гриба, не носят специфического характера. Различия между сортами, поражаемыми и непоражаемыми различными грибами, отмечены лишь в абсолютных значениях показателя и сроке проявления и длительности действия реакции. Комплексно устойчивые сорта раньше достигали порога летальной дозы фи-тоалексинов, а также общая концентрация пизатина была более высокой. Нек-розные клетки у растений этой группы сортов проявились ранее и имели меньшую площадь пораженной ткани. Сортов, которые бы не имели визуальных признаков болезни, то есть иммунных сортов, среди всей группы исследуемых образцов гороха, нами не обнаружено. Различия между устойчивыми и восприимчивыми растениями на уровне биохимических параметров тканей гороха представлены в табл.7.

Ни один из устойчивых сортов гороха не обладал полным набором высоких показателей всех изучаемых параметров сложной цепи последовательных превращений при патогенезе (рис. 4). Рост одних реакций компенсируется снижением других. Видимо, абсолютно устойчивого (иммунного) сорта гороха, характеризующегося высокими показателями хозяйственно ценных признаков и всех факторов, обеспечивающих иммунитет растений к болезням, найти сложно. Можно говорить о сравнительно устойчивых сортах гороха, обладающих высокими показателями полезных признаков. Полагаем, что в ходе проводимой долгие годы селекции могла произойти потеря механизмов генетической адаптации.

Процесс селекции привел к вытеснению дикарей и замене их культурными сортами гороха, что привело к потере устойчивости. Этот факт не проявляется в годы нормального развития растения. В годы эпифитотий даже устойчивые, по полевым данным, сорта гороха поражаются болезнью наряду с восприимчивыми. Это относится и к сортам местной селекции и к коллекционным. Проверенные нами исследования позволили выявить сорта гороха, обладающие комплексом реакций физиологический (но не генетической) устойчивости. Как правило, это сорта, выведенные на основе диких и полудиких форм. Комплексно устойчивый сорта гороха, обладающий достаточной толерантностью к грибным патогенам, согласно нашим исследованиям, должен иметь определейные анатомо-морфологические и биохимические . параметры (табл.8).

Таблица 7

Биохимические параметры здоровых тканей гороха, обуславливающие физиологическую устойчивость к грибам-

патогенам.

ФУЗАРИОЗ

УСТОЙЧИВЫЕ ВОСПРИИМЧИВЫЕ

КАТ ПО 0-д ФО Лигнин Лектины фа 1 хиа ТИА КАТ ПО 0-Д ФО Лигнин Лектины фа ХИА ТИА

лис кор ЛИС кор лис кор лис кор ЛИС кор 1 лис кор лис кор лис кор лис кор лис кор

Шустрик ЩЩа 0,84 112 13 25 18 22 >Ш1 Орлов чан. 0.34 0,62 106 480 63 6 и ' IV 205 1.56 т

0,85 0,84 110 »V* и 50 Шш 22 25 1.74 ь340 0.34 0,51 90 420 10 32 4 щ 8 12 207 3,53 ш

¿ист 0,84 106 15 . Г' 8 11 щг Орлус 034 03-1 84 570 'Ж 27 2 3 4 202 2,10 1.81

Леман 0,7« 0,51 119 ш ■ 15 20 Орле-ла «Л 0.17 60 540 50 5 8 213 2,76 1.71

Неруч 0,85 0,77 119 735 12 10 11 2,97 1,89 Смарагд ащ 0,62 а 570 1Ш1 36 6 5 1 5 186 1.97 1.00

ц» 51666 0,75 0,84 112 15 36 10 13 14 | 3,85 1,97

АСКОХИТОЗ

Лота-сгоге 0,85 0,84 ИЙ 730 8 11 210 2,07 ы1 СоП 034 034 106 590 32 4 6 И 2,64

Прнск. 292 598 ц 1 ••< 7 10 14 215 'Ш ■-ы Шт. Малъц 0,68 0,68 70 190 36 5 1» 7 14 152 2,58

- высокие показатели

- средние показатели

- низкие показатели

Рисунок 4. Схема формирования физиологической устойчивости тканей гороха при поражении грибами родов Ascochyta и

Fusarium (курсивом выделены изученные реакции).

Таблица 8

Модель комплексно устойчивого к грибам-паразитам сорта гороха

воспгшимчнвые устойчивые

1. Цветки белые. 1. Цветки фиолетовые, розовые, белые.

2. Энергия прорастания семян высокая. 2. Энергия прорастания семян низкая.

3. Низкорослые. 3. Стебель вытянутый, средний.

4. Листовая пластинка толстая. 4. Листовая пластинка тонкая.

5. Низкое содержание лигнинов. 5. Высокое содержание лигнинов.

6. Низкая активность лектинов. 6. Высокая активность лектинов.

7. Высокая активность о-дифенол-оксидазы. 7. Высокая активность: пероксидазы, каталазы, ингибиторов протеиназ.

8. Низкая активность фитоалексинов. 8. Фитоалексинообразование высокое.

На основании приведенных приведенных параметров нами выделены комплексно устойчивые сорта гороха: Аист, Приекульский 292, Rosacrone, Tigra.

ВЫВОДЫ

1. К конституционным признакам устойчивости растений к грибам-паразитам относятся лектины. У гороха высокая гемагглютинирующая активность лектинов выявлена у сортов, устойчивых к фузариозу. Различие между устойчивыми и восприимчивыми сортами по данному признаку сохраняются и в патогенезе. Для аскохитоза подобную закономерность не установили.

2. Устойчивые к аскохитозу сорта гороха имеют тонкие листовые пластинки с более высоким содержанием лигнина в клеточных стенках, чем восприимчивые. Заражение гороха грибами Fusarium oxysporum, Ascochyta pisi и Ascochyta pinodes приводит к индукции биосинтеза лигнинов в тканях листа и корней гороха.

3. Основу адаптационного механизма гороха к грибной инфекции составляет система окислительно-восстановительных ферментов, представленных пе-роксидазой, о-дифенолоксидазой и каталазой. Устойчивые формы гороха отличаются высоким уровнем активности утилизирующих перекиси ферментов -пероксидазы и каталазы. Отмечена более высокая активность о-дифенолоксидазы у восприимчивых к корневым гнилям и аскохитозу сортов. Эти показатели можно использовать в качестве экспресс-теста на резистентность к грибным патогенам.'

4. Изменение активности пероксидазы в ответ на действие токсинов гриба - явление неспецифическое. Отмечено увеличение количества изоформ пероксидазы в области малоподвижных белков (Rf = 0.11), которые подвержены наибольшим колебаниям при инфекции. Устойчивые и восприимчивые к грибным

болезням сорта гороха как правило не отличаются друг от друга набором молекулярных форм пероксидазы.

5. Различие сортов гороха по фитоапексинообразовательной способности согласуется с данными полевых опытов по устойчивости. Этот показатель можно использовать в качестве теста на резистентность к грибным инфекциям. Способность растений гороха синтезировать фунгитоксическое вещество в ответ на проникновение патогена является неспецифической реакцией и наблюдается у всех исследуемых сортов в ответ на инфекцию.

6. Отмечена тесная взаимосвязь синтеза фитоалексинов с другими защитными механизмами клетки. Процессы, вызывающие высокую степень лигни-фикации клеточной стенки, обусловлены большей активностью ферментных комплексов альтернативной дыхательной системы. Новообразование множественных молекулярных форм пероксидазы сопровождается ростом ее активности. Активизация других энзимов - о-дифенолоксидазы и каталазы - в комплексе с пероксидазой способствует индуцированию синтеза фитоалексинов, являющихся токсичными для гриба. Накопление их в фунгитоксических концентрациях приводит к гибели отработавшей клетки пораженного растения.

7. Установлено отсутствие четкой коррелятивной зависимости между устойчивостью гороха и ингибирующей протеиназы активностью их семян. Отмечено более высокое значение активности ингибитора химотрипсина у невосприимчивых растений по сравнению с неустойчивыми.

8. Биохимические защитные механизмы гороха против грибов-патогенов не носят специфического характера. Сорта гороха различаются лишь абсолютными значениями биохимических показателей, сроками проявления и длительностью действия реакций. Нами не выявлен абсолютно устойчивый (иммунный) сорт гороха, обладающий набором высоких хозяйственных признаков и факторов, обеспечивающих иммунитет растений к болезням. Предполагаем, что за долгие годы селекции были утрачены механизмы генетической адаптации гороха к болезням.

9. Предложена модель комплексно устойчивого сорта гороха, включающая анатомо-физиологические и биохимические параметры.

10. Предложены экспресс-методы отбора образцов для селекции на устойчивость.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. С целью сокращения сроков селекции и создания сортов гороха с заданными свойствами (высокая урожайность, устойчивость к грибам-патогенам, низкое содержание антипитательных веществ) следует использовать методы отбора не только по хозяйственно-ценным признакам, но и учитывать результаты биохимических тестов.

2. В качестве экспресс-методов оценки устойчивости сортов гороха к об-лигатным и факультативным грибам рекомендуется определение комплекса биохимических параметров растений, обуславливающих фи-

зиологическую резистентность к грибной инфекции. К таковым относятся содержание лигнина в клеточных стенках, активность окислительных ферментов пероксидазы, о-дифенолоксидазы и катал азы, ге-магтлютинирующая активность лектинов и активность сериновых ингибиторов протеиназ, фитоалексинсинтезирующая способность и реакция сверхчувствительности.

По теме диссертации опубликованы работы:

1. Эксперсс-метод отбора устойчивых к патогенным грибам сортов гороха/ Павловская Н.Е., Шалимова O.A., Азарова Е.Ф., Андрюхина P.M.// 3-ий ежегодный симпозиум «Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология», 27-28 июня 1997г. - М., 1997. - С.72.

2. Белковые ингибиторы протеиназ в защите растений от грибов, вызывающих аскохитоз и фузариоз гороха/ Павловская Н.Е., Шалимова O.A., Монахова H.A., Азарова Е.Ф., Андрюхина P.M.// Международная научно-практическая конференция «Защита растений от вредных организмов в условиях биологизации земледелия», 12-14 февраля 1998г. -Орел, 1998. -С.109-111.

3. Shalimova O.A., Pavlovskaya N.E. Biochemical aspects of fungal dis-ease//3-rd European Conference on grain legumes, 14-19 November, 1998. - Valladolid, Spain, 1998. - P.

4. Фhtoалексины гороха и устойчивость к аскохитозу/ Шалимова O.A., Павловская Н.Е., Азарова Е.Ф., Андрюхина Р.М.//Научные труды ВНИИ ЗБК. - Орел, 1998. (в печати)

5. Биохимические аспекты устойчивости гороха (Pisum sativum L.) к биогенным и абиогенным факторам окружающей среды/ Павловская Н.Е., Шалимова O.A., Азарова Е.Ф., Андрюхина P.M.// Научные труды ВНИИ ЗБК. - Орел, 1998. (в печати)

6. Павловская Н.Е., Шалимова O.A., Монахова H.A. Защитные реакции растений гороха в связи с устойчивостью к патогенным грибам// Прикл. биохимия и микробиология, (допущено к печати)

Отпечатано в отделе оперативной полиграфии Орловского областного комитета государственной статистики. Тираж^йэкз. Заказ № 13^