Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Композитные иммобилизованные биокатализаторы с частицами ферментных препаратов, включенных в матрицу криогеля поливинилового спирта

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Композитные иммобилизованные биокатализаторы с частицами ферментных препаратов, включенных в матрицу криогеля поливинилового спирта"

иЛск.асопьи'С иис

На правах рукописи

ШАСКОЛЬСКИЙ Борис Леонидович

КОМПОЗИТНЫЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ С ЧАСТИЦАМИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ, ВКЛЮЧЁННЫХ В МАТРИЦУ КРИОГЕЛЯ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА.

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва-2009

003478284

Работа выполнена в Лаборатории криохимии (био)полимеров Института элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Лозинский Владимир Иосифович

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Ямсков Игорь Александрович, кандидат технических наук, доцент Ефременко Елена Николаевна

Ведущая организация Центр "Биоинженерия" РАН

Защита состоится "20" октября 2009 г. в 10 часов 30 минут на заседании объединённого диссертационного совета ДМ 212.204.13 в РХТУ им. Д. И. Менделеева (125047 г. Москва, Миусская пл., д. 9) в аудитории 443 (конференц зал)

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ имени Д.И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан / ' сентября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212.204.13 кандидат технических наук

ШакирИ.В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из наиболее эффективных подходов к стабилизации ферментов является их иммобилизация с использованием нерастворимых носителей. Кроме того, такие системы обладают возможностью технически несложного отделения от реагентов, что позволяет применять их многократно и получать незагрязнённый ферментом продукт.

В качестве носителей для иммобилизации ферментов широко используют как органические (природные и синтетические) полимеры, так и неорганические материалы. К носителям предъявляются определённые требования: они должны быть нерастворимы в реакционной среде, обладать химической, биологической стойкостью, механической прочностью, не вызывать неспецифической адсорбции и сильных конформационных изменений молекулы белка, легко гранулироваться и активироваться.

Перспективными носителями для иммобилизованных ферментов являются криогели поливинилового спирта - макропористые вязкоупругие полимерные ге-левые материалы, получаемые в результате криогенной обработки, то есть после замораживания - выдерживания в замороженном состоянии - оттаивания водных растворов данного полимера. Полимерными криогелями называются гелевые материалы, сформированные в неглубоко замороженных растворах полимерных или мономерных предшественников. Неглубоко (умеренно) замороженными считаются системы при температурах не ниже, чем несколько десятков градусов от точки замерзания чистого растворителя. Подобные системы, как правило, являются двухфазными, они содержат поликристаллы твердой фазы, которые выполняют роль порогенов, и небольшой объем остающегося еще жидким раствора - так называемую незамерзшую жидкую микрофазу, где концентрируются растворенные вещества и происходит формирование криогелевой матрицы. Образующиеся криогели обычно имеют макропористую (от 0,1 до 10 мкм) гаи сверхмакропористую структуры (от 10 до 1000 мкм) с взаимосвязанными порами, что придает таким материалам уникальный набор физико-химических свойств, а также позволяет использовать их для решения ряда биомедицинских и биотехнологических задач.

р.

Наиболее изученными представителями криогелей с макропористой структурой являются криогели поливинилового спирта (КГПВС). Поливиниловый спирт (ЛВС) доступен, является продуктом крупнотоннажного синтеза, каждая его марка стандартизована. Благодаря высокой прочности, выраженной пористости, биосовместимости и стабильности в биологических средах КГПВС нашли широкое применение в различных областях биотехнологии. В частности, криогели ПВС были использованы в качестве носителей для ковалентного присоединения белков и ферментов при получении макропористых иммуносорбентов и ряда иммобилизованных биокатализаторов, предназначенных для ферментолиза очень высокомолекулярных субстратов или для работы в маловодных средах. В этом случае емкость криогеля ПВС как носителя, то есть содержание фермента в расчете на единицу массы или объема, составляет порядка 1-10 мг/г(мл), что характерно для крупнопористых матриц, существенная часть объёма которых приходится на поры, а количество реакционноспособных группировок полимера, расположенных в стенках этих макропор, относительно невелико. В этой связи представляют интерес иммобилизованные системы, в которых биокаталитическое действующее начало (в рассматриваемом случае - препарат фермента) включено в матрицу макропористого криогеля ПВС в виде частиц дисперсного наполнителя, распределенного по всему объёму носителя, что позволило бы значительно повысить содержание фермента в соответствующем иммобилизованном биокатализаторе. При этом важным условием является сохранение хороших физико-механических свойств композитного геля, несмотря на включение в него механически непрочного ферментного наполнителя и отсутствие препятствий в технически несложной методике получения гранулированных гелевых препаратов на основе водных растворов ПВС.

Целью работы являлось изучение возможности получения композитных биокатализаторов с матрицей из криогеля поливинилового спирта и включённым в неё биокатализатором в виде частиц мелкодисперсного наполнителя. В связи с заявленной целью решались следующие задачи:

1. Исследование физико-химических свойств криогеля поливинилового спирта (морфологических, теплофизических и физико-механических) при разных условиях получения.

2. Изучение разных вариантов формирования дисперсных ферменто-содержащих наполнителей, подходящих для включения в матрицу криогеля ПВС. Оценка каталитических свойств наполнителей.

3. Изучение физико-механических свойств и ферментативной активности композитных биокатализаторов.

Научная новизна и практическая значимость полученных результатов. В диссертационной работе показана взаимосвязь между концентрацией ПСВ в растворе и морфологией получившегося в результате криогенной обработки криогеля поливинилового спирта. Впервые показана возможность получения композитных биокатализаторов, состоящих из мелкодисперсных частиц ферментативно-активного наполнителя, включённых в матрицу криогеля поливинилового спирта. Показано, что включение наполнителя в матрицу КГПВС не приводит к ухудшению физико-механических характеристик криогеля поливинилового спирта.

Апробация работы. Основные результаты диссертации изложены в 5 печатных работах, в том числе 2 статьях в научных журналах, 3 - сборниках статей и материалах конференций. Работа была награждена дипломом за лучшее стендовое сообщение на VII научной конференции молодых учёных, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета. "Материалы и технологии XXI века".

Личный вклад автора в работах, выполненных в соавторстве и включённых в диссертацию, состоял в проведение экспериментальных исследований, обработке, интерпретации и обобщении полученных результатов.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 136 страницах печатного текста, содержит 17 рисунков, 9 таблиц и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (213 наименований)

Работа выполнена в лаборатории криохимии биополимеров ИНЭОС РАН и явилась продолжением и частью исследований, направленных на создание эффективных носителей биотехнологического назначения в рамках проектов по грантам РФФИ 05-04-08018_офи_а, РФФИ 07-04-12132_офи_а и РФФИ 07-03-96682-РА_а.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Некоторые физико-химические свойства криогелей поливинилового спирта, используемых в качестве носителей для иммобилизации ферментов.

С целью выяснения характера изменений свойств криогеля ПВС при разных условиях получения и для обеспечения возможности выбора условий, приводящих к формирования матриц данного типа с наиболее подходящими характеристиками для последующего использования в качестве носителя композитного биокатализатора, были проведены исследования влияния концентрации ПВС на свойства криогелей, образующихся в результате криотропного гелеобразования. Было показано, что с повышением концентрации гелеобразующего полимера в исходном растворе возрастали жесткость и теплостойкость получающихся криогелей (коэффициенты корреляции параметров условно-мгновенного модуля сдвига (Со) и температуры плавления геля (Ti) в диапазоне концентраций полимера 80-120 г/л оказались равными 0.99, т.е. взаимосвязь жесткости и теплостойкости таких КГПВС была очень тесной). В частности повышение начальной концентрации ПВС с 80 до 120 г/л в подвергаемом криогенной обработке растворе полимера приводило к возрастанию сдвигового модуля соответствующих криогелей от 2.6 до 10 кПа, а температура плавления КГВПС повышалась на 5.1°С (таблица 1).

Характерной особенностью строения криогелей ПВС является наличие протяженных пор со средним сечением 0.18-0.26 мкм. Следствием того, что макропоры формируются на месте расплавленных кристаллов порообразователя (льда), взаимно соприкасающихся и ограничивающих размер друг друга, является взаимосвязанность пор между собой, а также примерно одинаковый размер пор в получаемом геля. Вышеперечисленные особенности морфологии криогеля ПВС приводят к тому, что полученная таким образом матрица не создаёт дополнительных диффузионных затруднений для растворимых соединений. Исследование особенностей структуры КГПВС с помощью световой микроскопии выявило (таблица 2) некоторые различия в морфологии криогелей, сформированных из растворов с разной концентрацией полимера.

Таблица 1. Физико-механические свойства КГПВС, сформированных*1 из растворов с различной концентрацией поливинилового спирта.

Концентрация ПВС Температура

в исходном Со плавления

растворе (кПа) КГПВС ('С)

(г/л)

80 2.58 + 0.11 68.4 + 0.4

100 5.63 ± 0.41 70.9 ± 0.6

120 10.0 ±1.7 73.5 ±1.1

Температура замораживания-выдерживания: -20'С, время выдерживания в замороженном состоянии: 24 ч, скорость оттаивания: 0.3'С/мин.

Таблица 2. Данные анализа*1 изображений микрофотографий структуры КГПВС.

Концентрация ПВС в исходном растворе, (г/л) Данные морфометрии

Пористость (% от общей площади изображения) Среднее сечение пор (мкм)

80 52.2 0.253

100 55.8 0.238

120 43.8 0.180

*' Математическая обработка и анализ изображений выполнены И.И. Курочкиным (Институт системного анализа РАН) и д.х.н. И.Н. Курочкиным (Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет).

При этом наблюдалась тенденция к утолщению элементов гелевой фазы при повышении концентрации ПВС в исходном растворе, подвергаемом криообработ-ке. Кроме того, нами было обнаружено, что с повышением содержания полимера в системе имеют место изменения общей морфологии препаратов, главным образом, в отношении регулярности их пористой структуры (рис. 1).

Таким образом, проведённые исследования позволяют говорить о наличии взаимосвязи между структурой криогеля ПВС и его физико-механическими свойствами при изменении концентрации ПВС. Применение такого подхода, как повы-

Рисунок 1. Микрофотографии тонких срезов криогелей ПВС, полученных из раствора с концентрацией полимера 80 г/л - а), 100 г/л - б), 120 г/л - в).

шение концентрации исходного полимера, позволяет относительно просто улучшить механические характеристики получаемого криогеля, что важно для успешного использования иммобилизованных биокатализаторов с матрицей из криогеля ПВС.

Ферментативно-активные наполнители

Для изучения разных вариантов дисперсных ферменто-содержащих наполнителей, подходящих для включения в матрицу криогеля ПВС, и оценки биокаталии-ческих свойств наполнителей были получены наполнители трёх типов.

Первый тип наполнителей - препараты фермента, сшитого в растворе совместно с полимером, обычно синтезируют при добавлении буфункционального сшивающего агента к совместному раствору фермента и полимера, содержащего необходимые химические группировки.

Второй тип наполнителей - это поперечно-сшитые ферментные агрегаты (ПСФА). Такие препараты получают при воздействии на раствор фермента бифункциональных сшивающих агентов и осадителей, в качестве которых обычно применяются неорганические соли, органические растворители или растворы полимеров.

Третий тип наполнителей представляет собой какой-либо мелкодисперсный носитель с пришитым ферментом; далее частицы подобного иммобилизованного препарата могут быть включены в матрицу криогеля ПВС.

В качестве наполнителя первого типа в нашей работе были получены и использованы сшитые глутаровым альдегидом (ГА) гели трипсина с хитозаном. По-

еле определения критической концентрации гелеобразования для соответствующей системы «хитозан - глутаровый альдегид» ("таблица 31 были получены ферменто-содержащие дисперсные препараты.

Таблица 3. Зависимость времени образования гелевого препарата хитозана от концентрации глутарового альдегида в реакционной смеси.

Концентрация ГА в реакционной смеси (%) Концентрация хитозана в реакционной смеси (%) Время образования геля

0,01 2,3 Не образуется

0,03 2,2 Не образуется

0,06 2,2 Не образуется

0,12 2,2 Не образуется

0,2 2,1 Более 6 часов

0.3 2,1 100 минут

0,6 2,0 45 минут

0.7 2,0 20 минут

1,2 1,8 5 минут

При этом было найдено, что активность трипсина, используемого нами в качестве модельного фермента, сохраняется в тем большей степени, чем выше концентрация хитозана в реакционной смеси (таблица 4). Этот результат объясняется тем, что при добавлении в систему хитозана и сохранении концентраций трипсина и глутарового альдегида (неблагоприятно влияющего на активность ферментов) возрастает общая концентрация аминогрупп, а доля аминогрупп, приходящихся на фермент, уменьшается пропорционально повышению содержания хитозана в смеси.

Второй тип наполнителя это поперечно-сшитые ферментные агрегаты (ПСФА). Было исследовано влияние режимов сшивки и осаждения трипсина на выход ПСФА и их ферментативную активность. Было найдено, что если первоначальное воздействие ГА на раствор трипсина длилось 5 минут и более, то получить поперечно-сшитые ферментные агрегаты не удавалось. Такой результат можно объяснить тем, что ГА успевал прореагировать с большинством доступных ами-

ногрупп белка в растворе, в результате чего образование межмолекулярных связей внутри частиц коагулята, осажденного под действием ацетона или изопропанола, оказывалось невозможным. При первоначальном осаждении фермента изопропа-нолом или ацетоном, а так же при одновременном прибавлении к водному раствору фермента раствора ГА в осадителе, выход ПСФА был тем больше, чем выше была концентрация ГА в системе. Поэтому были выбраны условия, обеспечивающие количественный выход ПСФА - прибавление к раствору фермента 0,4 М раствора ГА в ацетоне или изопропаноле с последующей инкубацией реакционной системы на ледяной бане в течение 4 ч с перемешиванием.

Таблица 4. Ферментативная активность трипсина в составе сшитых гелей трипсина с хитозаном.

Сохранение

Активность Активность активности

Концентрация Концентрация Концентрация препарата фермента фермента в

хитозана трипсина ГА (ед. акг./г (ед. акт./мг составе

(мг/г) (мг/г) (мг/г) носителя) белка) ПСФА ( %)

18 0,5 7 0,6 1,2 97

7 4,3 7 2,4 0,63 46

Активность ПСФА, оцененная по кинетике гидролиза 1Ч-а-бензоил-Ь-арпшин-4-нитроанилида (БАНА), не зависела от типа осадителя и была примерно одинаковой у препаратов, полученных с использованием ацетона и изопропанола. Результаты, полученные при скоростях прибавления осадителя от 13,3 мл/с до 0,07 мл/с (в пересчёте на исходный объёма раствора фермента 4 мл) и температурах осадителя -10°С, или 0°С, или +22°С, приведены в таблице 5.

Выход ПСФА достигал количественного уровня при скорости разбавления от 13 до 0,4 мл/с. Если же добавление осадителя происходило ещё медленнее, то образования ПСФА не наблюдалось. Это объясняется тем, что после взаимодействия ГА с большинством аминогрупп растворимого фермента не остаётся аминогрупп, с которыми может провзаимодействовать свободная альдегидная группа глу-тарового альдегида, связанная одним концом молекулы с белком. Описанный выше феномен подобен близкому к нулю выходу, который имел место при таком методе

получения ПСФА, когда после длительной инкубации раствора фермента с ГА к системе добавляли осадитель.

Таблица 5. Зависимость активности ПСФА от скорости разбавления и температуры осадителя.

Температура Время прибавле- Скорость прибавления Средняя активность

осадителя ния осадителя осадителя к раствору ПСФА (ед.акт. на 1 мг

СС) (с) (мл/с) белка)

-10 3 13,33 0,052±0,005

23 1,74 0,066±0,014

46 0,87 0,056±0,016

69 0,58 0,063±0,019

92 0,43 0,054+0,011

600 0,07 не удалось определить

0 3 13,33 0,088+0,002

23 1,74 0,050±0,002

46 0,87 0,056±0,010

69 0,58 0,069±0,011

92 0,43 0,059±0,020

600 0,07 не удалось определить

22 3 13,33 0,054+0,005

23 1,74 0,050+0,006

46 0,87 0,040±0,005

69 0,58 0,059+0,003

92 0,43 0,03510,005

600 0,07 не удалось определить

Активность ПСФА максимальна при наибольшей скорости добавления осадителя с температурой 0°С. Температура 0°С обеспечивала наиболее мягкое протекание реакции, и, как следствие этого, более высокое сохранение ферментативной активности по сравнению с другими температурами.

Так как ферментативная активность трипсина при образовании ПСФА заметно падала, и, учитывая обнаруженное "защитное" влияние добавок хитозана при ковалентной иммобилизации ферментов, данный полиаминосахарид был также дополнительно введен в тот раствор фермента, из которого затем получали комплексные ПСФА на основе трипсина с добавками хитозана. Иными словами, фермент соосаждался изопропанолом совместно с хитозаном, а присутствующий в системе ГА химически сшивал такой двухкомпонентный коагулят. Данные рис. 2 показывают, что как и в случае формирования сшитых комплексных гелей трип-син/хитозан, увеличение количества добавленного в исходный раствор полиамино-сахарида в результате приводит к более высокой ферментативной активности получающихся препаратов трипсина, в данном случае - комплексных ПСФА. Вместе с тем вполне понятно, что нецелесообразно существенно повышать концентрацию хитозана в таких препаратах, поскольку это снижает содержание в них действующего каталитического начала, собственно фермента. Поэтому при последующем включении такого наполнителя в матрицу криогеля ПВС для получения композитного биокатализатора нами был использован комплексный препарат ПСФА, приготовленный при концентрации хитозана 12,8 мг/г в совместном растворе с трипсином.

Рисунок 2. Зависимость относительной активности трипсина, входящего в состав трипсин-хитозановых сшитых агрегатов, от концентрации хитозана в реакционной смеси, подвергаемой осаждению.

Невысокий уровень сохранения ферментативной активности при получении трипсиновых ПСФА, вероятно, объясняется взаимодействием ГА с активным центром трипсина. Подобное действие глутарового альдегида при получении ПСФА известно из литературы но, поскольку наша задача состояла не в получение конкретного иммобилизованного биоктализатора, а в разработке подходов, позволяющих сформировать удобные в применении композитные иммобилизованные биокатализаторы, обладающие высокой ёмкостью по биокаталитическому началу, то дальнейшая оптимизация условий получения иммобилизованного трипсина была признана нецелесообразной.

Третий тип нерастворимых препаратов трипсина, использовавшихся в качестве дисперсных наполнителей при получении композитных биокатализаторов, это - фермент, химически пришитый к мелким полимерным частицам. Для формирования такого наполнителя сначала были получены ковалентно-сшитые гели ПВС (таблица 6) при взаимодействии водных растворов ПВС и ГА в сильнокислой среде. Наиболее удобными в работе оказались образцы, при получении которых отношение количества мономерных звеньев ПВС к количеству молекул ГА составляло 1,32; это соотношение использовали в дальнейшей работе. После введения в сшитый гель ПВС дополнительных альдегидных группировок и последующего присоединения фермента были получены препараты с ёмкостью носителя 25,2 мг белка на 1 г влажного веса препарата; а его ферментативная активность была 0,01 ед. актУмг.

Таблица 6. Концентрации ГА и ПВС в реакционной смеси и мольные соотношения звеньев ПВС и ГА при получении сшитых гелей ПВС.

Концентрация ПВС в реакционной смеси (%) Концентрация ГА в реакционной смеси (%) Мольное отношение количества мономерных звеньев ПВС к количеству ГА Результат взаимодействия ГА и ПВС в указанных концентрациях

2,27 0,98 5,26 Образование геля

2,23 1,92 2,64 Образование геля

2,16 3,70 1,32 Образование геля

2,02 6,90 0,66 Образование геля

1,79 12,12 0,33 Образование геля

Композитные биокатализаторы

Для формирования композитных биокатализаторов применялась однотипная методика: соответствующий препарат трипсина измельчали до частиц размером 525 мкм, суспендировали в растворе ПВС и затем из этой суспензии на установке для получения замороженных гранул формировали композитный биокатализатор в виде частиц, близких по форме к сферическим. В работе были получены гранулы диаметром 0,7-1,5 мм (рис. 3).

а б

.. I

ЛШ %ш

ЭШштШ:^ р-ШШъШ.

ИГ ' ' -

»г*!»" :

шт.

!00}Дт

I I

Рисунок 3. Микрофотографии гранул криогеля поливинилового спирта: а) ненаполненных и 6) содержащих включённые частицы измельчённых поперечно-сшитых ферментных агрегатов.

Пористая морфология полимерного криогеля обеспечивает диффузионно-незатрудненный транспорт субстратов и продуктов биокаталитического процесса. Подтверждением этого служат приведённые на рис. 4 кривые изменения оптического поглощения раствора пара-нитроанилина, выделяющегося при гидролизе хромогенного субстрата БАНА эквивалентными количествами трипсина, входящего в состав ПСФА и композитного биокатализатора, состоящего из ПСФА, включённых в макропористую матрицу криогеля поливинилового спирта. Видно, что несмотря на наличие некоторого индукционного периода на начальных участках соответствующих кинетических кривых, связанного с необходимостью начальной диффузии субстрата через поры геля к каталитически-активным частицам, прямолинейные участки кривых имели практически одинаковый наклон, что свидетельствует об отсутствии препятствий со стороны матрицы криогеля ПВС для массопе-реноса субстрата и продуктов реакции.

I

Рисунок 4. Оптическое поглощение при 405 нм реакционных растворов при гидролизе хромогенного субстарата (БАНА) одинаковым количеством трипсина в составе поперечно-сшитых ферментных агрегатов и композитного биокатализатора, полученного путём включения поперечно-сшитых ферментных агрегатов в матрицу криогеля поливинилового спирта.

о

10

20

30

Время(мин)

—•—ПСФА

Композитный биокатализатор

Для выяснения вопроса о том не ухудшаются ли физико-механические свойства композитной системы "криогель ПВС - наполнитель" по сравнению с контрольным криогелем ПВС был приготовлен ряд препаратов с включением частиц наименее жёстких из использованных нами наполнителей - ПСФА на основе трипсина и ПСФА с хитозаном. Для этих композитов затем измерили величину условно-мгновенного сдвигового модуля (бо — характеризует упругие свойства материала) и сдвигового модуля за 30 мин действия нагрузки (С?зо - характеризует пластические свойства испытуемого объекта). Полученные результаты суммированы в таблице 7.

Анализ данных этой таблицы показывает, что при включении подобных наполнителей в матрицу криогеля ПВС физико-механические свойства сформированных таким образом композитов не только не ухудшались, а имело место даже заметное повышение жесткости соответствующих препаратов. При этом, если в случае ненаполненных (контрольных) криогелей увеличение концентрации ПВС в исходном растворе приводило к систематическому повышению значений Со и бзо, то для композитных криогелей абсолютная величина упрочняющего эффекта еще зависела и от концентрации наполнителя, и от его типа.

Отсюда следует, что, во-первых, ухудшения прочностных показателей геле-вого носителя не следует опасаться и, во-вторых, при разработке композитных биокатализаторов этого вида необходимо проводить оптимизацию такого парамет-

Таблица 7. Физико-механические свойства композитной системы «криогель ПВС — наполнитель» и контрольных образцов криогеля ПВС.

Состав исходной композиции Физико-

ПВС (г) Наполнитель (ПСФА) Вода механические ха-

(мл) рактеристики криогеля

Тип Количество (г) в0 (кПа) в30 (кПа)

7,5 - - 100 3,3 ±0,2 2,9 ±0,2

ПСФА 22,9 100 8,3 ± 1,0 5,3 ±0,6

8 - - 100 4,4 ±0,3 2,3 ± 0,1

ПСФА 25 100 7,6 ±0,4 5,2 ± 0,2

ПСФА 34,4 100 6,6 ±1,4 4,5 ± 0,6

9 - - 100 5,6 ± 0,4 3,8 ± 0,4

ПСФА 22,2 100 9,5 ± 0,7 5,6 ±0,4

8 - - 100 3,3 ±0,2 2,3 ± 0,1

ПСФА с 33,3 100 4,8 ± 0,2 1,8 ± 0,2

хитозаном

ра, как степень наполнения, чтобы в результате получить препараты с желаемым сочетанием упругих и пластических свойств.

Ферментативная активность поперечно-сшитых ферментных агрегатов

Ферментативная активность композитных биокатализаторов с включенными в криогель ПВС частицами различных наполнителей была определена в отношении гидролиза специфического для трипсина субстрата - БАНА. Поскольку содержание фермента в композитных препаратах было разным для разных наполнителей, то мы вычислили как значения общей активности каждого иммобилизованного биокатализатора в расчете на единицу массы влажного образца, так и, когда это удалось определить экспериментально, значения удельной активности в расчете на 1 мг трипсина. Полученные данные суммированы в таблице 8.

Было найдено, что активность, проявляемая композитными биокатализаторами, зависела, во-первых, от ферментативной активности включаемого в матрицу

криогеля ПВС наполнителя, во-вторых, от степени наполнения, и, в третьих, от удельной активности собственно трипсина в составе его соответствующего нерастворимого препарата. Согласно этим данным, наибольшей суммарной активностью обладал композитный биокатализатор, содержавший в качестве наполнителя ПСФА на основе трипсина без добавок, а наибольшая удельная активность самого фермента сохранялась в случае композитного биокатализатора с включенными в матрицу криогеля ПВС частицами наполнителя на основе комплексного ПСФА "трипсин-хитозан".

Таблица 8. Ферментативная активность композитных биокатализаторов.

Тип наполнителя Ферментативная активность наполнителя ** Содержание наполнителя в композите (г / г влажного препарата) Ферментативная активность композита *)

ед.акт. / г влажного препарата ед.акт. / мг белка ед.акт. / г влажного препарата ед.акт. / мг белка

Сшитые гели трипсина с хи-тозаном 2,5 0,58 0,176 0,79 0,55

Трипсиновые ПСФА 7.2 0,07 0,189 1,19 0,03

Трипсиновые ПСФА с хито-заном 4,3 0,52 0,236 0,85 0,40

Трипсин, иммобилизованный на сшитых гелях ПВС 7,7 0,31 0,196 0,32 0,06

в реакции гидролиза БАНА

Также для композитных биокатализаторов, содержащих в качестве наполнителей трипсиновые ПСФА, были изучены зависимости каталитической активности от рН среды и температуры ферментативной реакции. Оказалось, что по сравнению

с трипсином в растворе рН-оптимум для ПСФА и композитных биокатализаторов с включенным в криогель ПВ С частицами таких наполнителей несколько расширяется и сдвигается в щелочную область, соответственно, примерно на одну и две единицы (рис. 5 и 6). что скорее всего, связано с изменением баланса зарядов группировок активного центра белковой молекулы, когда они химически модифицируются в реакциях фермента с реакционноспособным носителем или кросс-агентом.

При этом, для ПСФА без добавок и соответствующего композита (рис. 6) наблюдался больший сдвиг в щелочную область рН-оптимума, чем для ПСФА с хи-тозаном и композитного биокатализатора с таким наполнителем (рис. 51. что скорее всего свидетельствует о меньшей степени модификации группировок фермента, трансформируемого в ПСФА в присутствии хитозана. Кроме того, было обнаружено, что переведение трипсина в форму ПСФА очень сильно повышает термостабильность фермента, и это свойство присуще также и композитным биокатализаторам с подобными наполнителями (рисунки 7, 8).

При изучении кинетических характеристик тех же препаратов трипсина было найдено (таблица 9). что для иммобилизованных биокатализаторов с такими наполнителями, как поперечно-сшитые агрегаты, характерно менее эффективное связывание субстрата по сравнению с растворимым ферментом, так как у иммобилизованных биокатализаторов значения константы Михаэлиса (0,63 и 0,31 ммоль/л, соответственно) были больше значения Кщ = 0,86 ммоль/л, найденного для растворимого трипсина.

Кроме того, для иммобилизованных препаратов наблюдалось заметное снижение каталитической константы, что могло быть следствием конкуренции за субстрат собственно в пределах каждой высококонцентрированной по ферменту частицы ПСФА. В пользу этого предположения свидетельствует значение к«,! = 5,0 мин"1 у композитного биокатализатора с наполнителем из трипсиновых ПСФА по сравнению с кац =9,1 мин"1 для композита с наполнителем из трипсиновых ПСФА с хитозаном, поскольку в первом случае локальная концентрация трипсина в частицах ПСФА выше, чем во втором случае, где фермент как бы "разбавлен" хитозаном.

& 7 в V 10 11

рН

—•—композите ПСФА с хитозаном

- а- нативный фермент

- - ПСФА с хитозаном

Рисунок 5. Зависимость ферментативной активности ПСФА с хитозаном, соответствующего композитного биокатализатора и растворимого трипсина от рН среды ферментативной реакции

30 35 40 45 50 55

Температура ("С) - нзтивмый фермент —•— композит с ПСФА ■ ■»■■ ПСФА

Рисунок 7. Зависимость фермента-тивной активности ПСФА, композитного биокатализатора и растворимого трипсина от температуры ферментативной реакции

О 20

10.

—I-■-1-1-1—'-1-'-1-■-I-'

в т в в 10 11 рН

—•—компсоит

- а- иатиечый фермент

•-■■-ПСФА

Рисунок 6. Зависимость ферментативной активности ПСФА, композитного биокатализатора и растворимого трипсина от рН среды ферментативной реакции.

Температура (°С)

- *- натиасый фермент

—•— композит ПСФА с хитозаном

- •■- - ПСФА с хитозаном

Рисунок 8. Зависимость ферментативной активности ПСФА с хитозаном, соответствующего композитного биокатализатора и растворимого трипсина от температуры ферментативной реакции.

Также было найдено, что при хранении все композитные препараты обладали хорошей стабильностью, сохраняя практически 90% активности после 6-ти месяцев выдерживания при 4-6 "С.

Таблица 9. Кинетические характеристики растворимого трипсина и композитных иммобилизованных биокатализаторов на основе трипсиновых ПСФА и трипсиновых ПСФА с хитозаном.

Образец (ммоль/л) V г глах (мкмоль/мин) кем (мин"1) (л/ммоль-мин)

Растворимый трипсин 0,86 62 69 80,2

Композитный биокатализатор на основе трипсиновых ПСФА, включенных в криогель ПВС 0,63 8,9 5 7,7

Композитный биокатализатор на основе трипсиновых ПСФА с хитозаном, включенных в криогель ПВС 0,31 2,5 9,1 29,4

ВЫВОДЫ

1. Исследовано влияние концентрации поливинилового спирта на физико-механические и теплофизические свойства, а также структуру гелей (криогелей), получаемых при криогенной обработке водных растворов данного полимера. Показано, что повышение концентрации полимера в растворе, подвергаемом замораживанию - выдерживанию в замороженном состоянии - оттаиванию, приводит к возрастанию жёсткости сформированных образцов, повышению температуры их плавления, к утолщению элементов гелевой фазы и к более упорядоченной макропористой морфологии образующихся криогелей.

2. Проведено изучение процессов формирования сшитых гелей трипсина с хитозаном, поперечно-сшитых ферментных агрегатов трипсина, поперечно-сшитых ферментных агрегатов трипсина с хитозаном и препаратов трипсина, иммобилизованного на сшитых гелях поливинилового спирта. Найдено, что выход поперечно-сшитых ферментных агрегатов значительно уменьшается при низких скоростях разбавления раствора фермента раствором осадителя-сшивателя или при больших временных интервалах между прибавлением к системе сшивателя и осаждением

белка; такой результат объясняется довольно быстрой модификацией аминогрупп белка, способных участвовать в реакциях межмолекулярной сшивки. Отмечено значительное стабилизирующее влияние хитозана на сохранение активности трипсина при его иммобилизации с помощью глутарового альдегида как в составе комплексных поперечно-сшитых ферментных агрегатов, так и в составе триспин-хитозановых гелей.

3. Продемонстрирована возможность получения композитных биокатализаторов на основе дисперсных ферментосодержащих препаратов, включённых в матрицу криогеля поливинилового спирта. Показано, что матрица композитного биокатализатора не создаёт серьёзных препятствий для протекания катализируемых ферментом реакций.

4. При изучении влияния ферментных наполнителей на физико-механические свойства композитных биокатализаторов найдено, что включение в матрицу криогеля поливинилового спирта дисперсных частиц ферментосодержащих наполнителей приводит к заметному повышению жёсткости сформированных композитных криогелей.

5. Показано, что композитные иммобилизованные биокатализаторы обладают повышенной температурной и рН стабильностью, а также сохраняют свою активность при длительном хранении.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах

1. Лозинский В.И. Изучение криоструктурирования полимерных систем. 27. Физико-химические свойства криогелей поливинилового спирта и особенности их макропористой морфологии / В.И. Лозинский, Л.Г. Дамшкалн, Б.Л. Шаскольский. Т.А. Бабушкина, И.Н. Курочкин, И.И. Курочкин // Коллоидный журнал. - (2007) -Т. 69-№6.-С. 798-816.

2. Шаскольский Б.Л. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. VII. Композитные иммобилизованные биокатализаторы с частицами ферментного препарата, включенного в матрицу криогеля поливинилового спирта / Б.Л. Шаскольский. М.С. Фогораси, М.Д. Станеску, В.И. Лозинский // Биотехнология. - (2009) - № 1. - С. 71-82.

3. Шаскольский Б.Л.. Поперечно-сшитые ферментные агрегаты, включённые в криогель поливинилового спирта / Б.Л. Шаскольский. Т.В. Бурова, В.Я. Гринберг, Н.В. Гринберг, В.И. Лозинский И Тез. докл. Междунар. научн. конф. "Фундаментальные и прикладные современной химии в исследовании молодых учёных". Астрахань - 2006. - С. 45.

4. Шаскольский Б.Л.. Разработка полимерных криогелей для получения материалов биотехнологического назначения / Б.Л. Шаскольский. Р.В. Иванов II Тез. докл. VII Научн. конф. молодых учёных, аспирантов и студентов "Материалы и технологии XXI века". Казань, 2007. - С. 137.

5. Шаскольский Б.Л. Композитные ферментные иммобилизованные биокатализаторы с матрицей из криогеля поливинилового спирта / Б.Л. Шаскольский. В.И. Лозинский // Материалы Международной научно-практической конференции "Новые технологи в экспериментальной биологии и медицине". Ростов-на-Дону, 2007.

-С. 158.

Бумага для множительных аппаратов. Печать офсетная. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ №835

Типография ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Шаскольский, Борис Леонидович

Список принятых сокращений и обозначений.4

ВВЕДЕНИЕ.6

ГЛАВА 1. ИММОБИЛИЗАЦИЯ БИОКАТАЛИТИЧЕСКИ АКТИВНОГО

НАЧАЛА ВКЛЮЧЕНИЕМ В ГЕЛЬ (литературный обзор).10

Введение.'.10

1.1. Ковалентные гели с включённым биокаталитически активным началом.12

1.1.1. Иммобилизованные биокатализаторы с матрицами из ковалентных гелей, полученных полимеризацией мономеров в присутствии действующего начала.12

1.1.2. Иммобилизованные биокатализаторы с матрицами из ковалентных гелей, полученных сшиванием полимеров.25

1.2. Нековалентные гели с включённым биокаталитически активным началом.30

1.2.1. Включение биокатализаторов в термообратимые гели.30

1.2.2. Включение биокаталитически активного начала в криогели.36

1.2.3. Включение биокатализаторов в ионотропные гели.39

1.3. Наполнители, подходящие для включения в гель в виде дисперсных частиц.44

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.48

2.1. Материалы.48

2.2. Методы.48

2.3. Математическая обработка результатов измерений.59

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.61

3.1. Некоторые физико-химические свойства криогелей поливинилового спирта, используемых в качестве носителей для иммобилизации ферментов.61

3.2. Ферментативно-активные наполнители.69

3.2.1. Сшитые гели трипсина с хитозаном.70

3.2.2. Поперечно-сшитые ферментные агрегаты.74

3.2.2.1. Изменение выхода и ферментативной активности поперечно-сшитых ферментных агрегатов при разных режимах их формирования.75

3.2.2.2. Калориметрические исследования поперечно-сшитых ферментных агрегатов и нативного трипсина.80

3.2.2.3. Поперечно-сшитые ферментные агрегаты трипсина с хитозаном.86

3.2.3. Трипсин, иммобилизованный на сшитом геле ПВС.86

3.3. Композитные биокатализаторы.90

3.3.1. Физикомеханические характеристики композитных систем.95

3.3.2. Ферментативная активность композитных биокатализаторов.97

ВЫВОДЫ.109

Введение Диссертация по биологии, на тему "Композитные иммобилизованные биокатализаторы с частицами ферментных препаратов, включенных в матрицу криогеля поливинилового спирта"

В связи с серьёзными экологическими и энергетическими проблемами современности особенно остро стоит вопрос о получении необходимых для экономики продуктов с минимальными отрицательными воздействиями на окружающую среду и относительно небольшими энергетическими и материальными затратами. Одним из решений вышеназванных задач является использование биотехнологических подходов. Они применяются в различных областях деятельности: в медицине и фармакологии (при производстве вакцин, антибиотиков, витаминов, инсулина, пептидных, стероидных и других гормонов); в пищевой промышленности (при получении пищевого белка, уксуса, лимонной кислоты, пищевых красителей, пищевых консервантов); сельском хозяйстве (получение ростовых гормонов, кормовых аминокислот, феромонов, антибиотиков для растений); в экологической биотехнологии для биологической очистки стоков, биокомпостирования твёрдых отходов; в энергетике для получения биогаза из органических отходов и получения моторного топлива, и др.

Важной областью биотехнологии является применение ферментов, например, использование гликозидаз при гидролизе крахмала, энзиматическом осветлении сока и вин, обработке текстильных изделий и гидролизе лактозы в молочных продуктах; применение протеаз при выделке кож и в процессах, осуществляемых при получении сыра; использование изомераз при получении глюкозо-фруктозных сиропов и т.д. Успешно применяются ферменты для модификации р-лактамных антибиотиков (задачи, трудно выполнимой для крупномасштабного химического синтеза).

Особое место в ряду методов, использующих ферменты, принадлежит процессам, происходящим при участии иммобилизованных ферментов. Биокатализаторы данного типа применяют в том случае, если субстрат растворим. Препараты, получаемые в результате иммобилизации, имеют ряд преимуществ по сравнению с растворимыми ферментами. Во-первых, гетерогенный катализатор легко отделить от реакционной смеси, что позволяет многократно использовать катализатор, и получать продукт, незагрязнённый ферментами. Кроме того, использование гетерогенных биокатализаторов позволяет осуществлять ферментативный процесс непрерывно в проточных реакторах. Поскольку при иммобилизации довольно часто наблюдается повышение стабильности иммобилизованного белка, то открывается возможность для проведения реакций в неводных средах и благодаря этому сдвигать химическое равновесие в сторону процесса, обратного тому, который происходит в клетке с участием такого фермента.

В качестве носителей для иммобилизации ферментов широко применяют как органические (природные и синтетические), так и неорганические материалы. К носителям предъявляются определённые требования: они должны быть нерастворимы в реакционной среде, иметь химическую и биологическую стойкость, механическую прочность, обладать низкой неспецифической сорбцией и не вызывать сильных конформационных изменений молекулы белка, легко гранулироваться, и в случае необходимости, активироваться.

Перспективными носителями для иммобилизованных ферментов являются криогели поливинилового спирта (ЛВС) - макропористые упруговязкие полимерные гелевые материалы, получаемые в результате криогенной обработки, то есть замораживания - выдерживания в замороженном состоянии — оттаивания водных растворов данного полимера.

Полимерными криогелями называются гелевые материалы, сформированные в неглубоко замороженных реакционных растворах полимерных или мономерных предшественников. Неглубоко (умеренно) замороженными считаются системы при температурах не ниже, чем несколько десятков градусов от точки замерзания чистого растворителя. Подобные системы, как правило, являются двухфазными, они содержат поликристаллы твердой фазы, которые выполняют роль порогенов, и небольшой объем остающегося еще жидким раствора - так называемую незамерзшую жидкую микрофазу, где концентрируются растворенные вещества и происходит формирование криогелевой матрицы. Образующиеся криогели обычно имеют макропористую (от ОД до 10 мкм) или сверхмакропористую структуры (от 10 до 1000 мкм) с взаимосвязанными порами, что придает таким материалам уникальный набор физико-химических свойств, а также позволяет использовать их для решения ряда биомедицинских и биотехнологических задач.

Наиболее изученным представителем криогелей с макропористой структурой является криогель поливинилового спирта (КГПВС). Поливиниловый спирт доступен, является продуктом крупнотоннажного синтеза (мировое производство несколько сотен тысяч тонн в год), каждая его марка стандартизована. Благодаря высокой прочности, хорошей пористости, биосовместимости и стабильности в биологических средах КГПВС нашли широкое применение в различных областях биотехнологии. В частности, криогели ПВС были использованы в качестве носителей для ковалентного присоединения белков и ферментов при получении макропористых иммуносорбентов и ряда иммобилизованных биокатализаторов, предназначенных для ферментолиза очень высокомолекулярных субстратов или для работы в маловодных средах. В этом случае емкость криогеля ПВС как носителя, то есть содержание фермента в расчете на единицу массы или объема, составляет порядка 1-10 мг/г(мл), что характерно для крупнопористых матриц, существенная часть объёма которых приходится на поры, а количество реакционноспособных группировок полимера, расположенных в стенках этих макропор, относительно невелико. В этой связи представляют интерес иммобилизованные системы, в которых биокаталитическое действующее начало (в рассматриваемом нами случае — препарат фермента) включено в матрицу макропористого криогеля ПВС в виде частиц дисперсного наполнителя, распределенного по всему объёму носителя, что, вероятно, позволило бы значительно повысить содержание фермента в соответствующем иммобилизованном биокатализаторе. При этом важным условием является сохранение хороших физико-механических свойств композитного геля, несмотря на включение в него механически непрочного ферментного наполнителя и отсутствие препятствий в технически несложной методике получения гранулированных гелевых препаратов на основе водных растворов ПВС.

В этой связи представляется весьма актуальным изучение возможности получения композитных биокатализаторов с матрицей из криогеля поливинилового спирта и включённым в неё биокатализатором в виде частиц дисперсного наполнителя. Исходя из указанной цели, в данной диссертационной работе решались следующие задачи:

1. Исследование физико-химических свойств криогеля поливинилового спирта (морфологических, теплофизических и физико-механических) при разных условиях получения.

2. Изучение разных вариантов формирования дисперсных ферменто-содержащих наполнителей, подходящих для включения в матрицу криогеля ПВС. Оценка каталитических свойств наполнителей.

3. Изучение физико-механических свойств и ферментативной активности композитных биокатализаторов.

Данная диссертационная работа выполнялась в лаборатории криохимии биополимеров ИНЭОС РАН и явилась продолжением исследований, направленных на создание эффективных носителей биотехнологического назначения в рамках проектов по грантам РФФИ 05-04-08018офиа, РФФИ 07-04-12132офиа и РФФИ 07-03-96682-РАа.

Работа состоит из введения, 3-х глав, выводов, и списка цитируемой литературы. В главе 1 рассмотрены литературные данные, касающиеся иммобилизация биокаталитически активного начала включением в гель; глава 2 содержит описание эксперимента, глава 3 посвящена описанию и обсуждению полученных в работе результатов экспериментальных исследований.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Шаскольский, Борис Леонидович

Выводы

1. Исследовано влияние концентрации поливинилового спирта на физико-механические и теплофизические свойства, а также структуру гелей (криогелей), получаемых при криогенной обработке водных растворов данного полимера. Показано, что повышение концентрации полимера в растворе, подвергаемом замораживанию — выдерживанию в замороженном состоянии — оттаиванию, приводит к возрастанию жёсткости сформированных образцов, повышению температуры их плавления, к утолщению элементов гелевой фазы и к более упорядоченной макропористой морфологии образующихся криогелей.

2. Проведено изучение процессов формирования сшитых гелей трипсина с хитозаном, поперечно-сшитых ферментных агрегатов трипсина, по-пречно-сшитых ферментных агрегатов трипсина с хитозаном и препаратов трипсина, иммобилизованного на сшитых гелях поливинилового спирта. Найдено, что выход поперечно-сшитых ферментных агрегатов значительно уменьшается при низких скоростях разбавления раствора фермента раствором осадителя-сшивателя или при больших временных интервалах между прибавлением к системе сшивателя и осаждением белка; такой результат объясняется довольно быстрой модификацией аминогрупп белка, способных участвовать в реакциях межмолекулярной сшивки. Отмечено значительное стабилизирующее влияние хитозана на сохранение активности трипсина при его иммобилизации с помощью глутарового альдегида как в составе комплексных поперечно-сшитых ферментных агрегатов, так и в составе триспин-хитозановых гелей.

3. Продемонстрирована возможность получения композитных биокатализаторов на основе дисперсных ферментосодержащих препаратов, включённых в матрицу криогеля поливинилового спирта. Показано, что матрица композитного биокатализатора не создаёт серьёзных препятствий для протекания катализируемых ферментом реакций.

4. При изучении влияния ферментных наполнителей на физико-механические свойства композитных биокатализаторов найдено, что включение в матрицу криогеля поливинилового спирта дисперсных частиц ферментосодержащих наполнителей приводит к заметному повышению жёсткости сформированных композитных криогелей.

5. Показано, что композитные иммобилизованные биокатализаторы обладают повышенной температурной и рН стабильностью, а также сохраняют свою активность при длительном хранении.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Шаскольский, Борис Леонидович, Москва

1. Cao L. Carrier-Bound 1.mobilized Enzymes Principles, Applications and Design. - Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA, 2005 - P. 563.

2. Berger J.L. Immobilization of p-galactosidases from Thermus aquaticus YT-1 for oligosaccharides synthesis / J.L. Berger, B.H. Lee, C. Lacroix // Biotechnology Techniques. (1995) - Vol. 9. - № 8. - P. 601-606.

3. Ray R.R. Immobilization of P-amylase from Bacillus megaterium B6, into gelatin film by cross-linking / R.R. Ray, S.C. Jana, G. Nanda // Journal of Applied Bacteriology. (1995) - Vol. 79. - № 2. - P. 157-162.

4. Синицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В. И., Спасов С. Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. Москва: Издательство Московского Университета. Университетское издательство им. Св. Климента Орхидско-го.-1994-288 с.

5. Lozinsky V. I. Poly(vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments / V. I. Lozinsky, F. M. Plieva // Enzyme and Microbial Technology. (1998) - Vol. 23. - № 3-4. -P. 227-242.

6. Chang Ch. Ch. Immobilization of Alcaligenes eutrophus using PVA crosslinked with sodium nitrate / Ch. Ch. Chang, S. K. Tseng // Biotechnology Techniques. -(1998) Vol. 12. - № 12. - P. 865-868.

7. Li-sheng Z. Immobilization of activated sludge using improved polyvinyl alcohol (PVA) gel / Z. Li-sheng, W. Wei-zhong, W. Jian-long // Journal of Envi-romental Sciences. (2007) - Vol. 19.-№ 11.-P. 1293-1297.

8. Fraser J.E. Entrapment in calcium alginate / J.E. Fraser, G.F. Bickerstaff // Methods in Biotechnology. 1997 — Vol. 1 — Immobilization of Enzymes and Cells. Edited by G. F. Bickerstaff. Humana Press Inc. - Totowa, NJ P. 61-66.

9. Smidsnad O. Alginate as immobilization matrix for cells / O. Smidsmd, G. S. Skjak-Braek // Trends in Biotechnology. (1990) - Vol. 8. - № 1. - P. 71-78.

10. Thu B. Alginate gels some structure-function correlations relevant to their use as immobilization matrix for cells / B. Thu, O. Smidsrad, G. Skjak-Braek //Immobilized Cells: Basics and Applications. Progress in Biotechnology. -(1996)-Vol. 11.-P. 19-30.

11. Kraewska B. Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immobilizations: a review / B. Kraewska // Enzyme and Microbial Technology. (2004) - Vol. 35. - № 2-3. - P. 126-139.

12. Cabarcos E.L. Immobilization of glucose oxidase in cross-linked poly(aciylamide/acrylic acid) microgels / E.L. Cabarcos, J. R. Retama, B. Lopez-Ruiz // Progress in Colloid and Polymer Siense. (2004) - Vol. 126. - P. 194—196.

13. Basari M. Immobilization of lipase on poly(N-vinyl-2-pyrrolidone-co-styrene) hydrogel / M. Basari, A. Harun, M. B. Ahmad, C.N.A. Razak, A.B. Salleh // Journal of Applied Polymer Science. (2001) - Vol. 82. - № 6. - P.l 404-1409.

14. Baran T. Comparison of (3-galctosidase immobilization by entrapment in and adsorption on poly(2-hydroxyethylmathacrylate) membranes / T. Baran, M. Y. Arica, A. Denizli, V. Hasirci // Polymer International. (1997) - Vol. 44. - №. 4.-P. 530-536.

15. Endo H. Enzyme sensor system for determination of total cholesterol in fish plasma / H. Endo, M. Maita, M. Takikawa, H. Ren, T. Hayashi, N.Urano, K. Mitsubayashi // Fisheries Science. (2003) - Vol. 69. - № 6. - P. 1194-1199.

16. Ichimura K. A convenient photochemical method to immobilize enzymes / K. Ichimura // Journal of Polymer Science; Polymer Chemistry Edition. (1984) -Vol. 22-№ 11.-P. 2817-2828.

17. Tanaka A. Entrapment of biocatalysts by prepolymer methods / A. Tanaka, T. Lida // Methods in Biotehnoogy. 2001 Vol. 15. Enzymes in Nonaqueous Solvents: Methods and Protocols. P. 19-30.

18. Miura Y. Epoxidation of alkanes and cycloalkanes by microbial lipases immobilized with photo-crosslinkable resin prepolymer / Y. Miura, T. Yamane // Biotechnology Letters. (1997) - Vol. 19. - № 7. - P. 611-613.

19. Muscat A. Poly(carbomoylsulfonate), a material for immobilization: synthesis, diffusion- and mechanical properties / A. Muscat, J. Beyersdorf, K-D. Vorlop // Biotechnology Techniques. (1993) - Vol. 7. -№ 8. -P.591-596.

20. Fukushima S. Hydrophilic urethane prepolymers: convenient materials for enzyme entrapment / S. Fukushima, T. Nagai, K. Fujita, A. Tanaka, S. Fukui // Biotechnology and Bioengineering. (1978) - Vol. 20. - № 9. - P. 1465-1469.

21. DeGroot A. R. Encapsulation of urease in alginate beads and protection from a-chymotrypsin with chitosan membranes / A. R. DeGroot, R. J. Neufeld // Enzyme and Microbial Technology. (2001) - Vol. 29. - № 6-7. - P.321-327.

22. Soni S. Immobilization of yeast alcohol dehydrogenase by entrapment and co-valent binding to polymeric supports / S. Soni, J.D. Desai, S. Devi // Journal of Applied Polymer Science. (2001) - Vol. 82. - № 5. - P. 1299-1305.

23. Noureddini H. Immobilization of Candida rugosa lipase by sol-gel entrapment and its application in the hydrolysis of soybean oil / H. Noureddini, X. Gao, S. Joshi // Journal of American Oil Chemists Society. (2003) - Vol.80. - № 11. -P.1077-1083.

24. Avnir D. Recent bio-applications of sol-gel materials / D. Avnir, T. Coradin, O. Lev, J. Livage // Journal of Material Chemistry. (2006) - Vol. 16. - № 11 -P. 1013-1030.

25. Chen J-P. Synthesis of geranyl acetate by esterification with lipase entrapped in hybrid sol-gel formed within nonwoven fabric / J-P. Chen, W-S. Lin, M-F. Chang // Journal of American Oil Chemical Society. (2002) - Vol. 79. - № 3. -P. 309-314.

26. Munjal N. Stability and properties of mushroom entrapped in alginate, poly-acrylamide and gelatine gels / N. Munjal, S. K. Sawhney // Enzyme and Microbial Technology. (2002) - Vol. 30 - № 4 - P. 613-619.

27. Industrial Enzymes Structure, Function and Applications. Edited by Julio Po-laina and Andrew P. MacCabe Instituto de Agroquimica у Tecnologia de Ali-mentos, CSIC, Valencia, Spain. Springer. 2007.

28. End N. Immobilized biocatalysts in industrial research and production / N. End, K.-U. Schoning // Topics in Current Chemistiy. (2004) - Vol. 242. - P. 273317.

29. Tanaka A. Application of immobilized growing cells / A. Tanaka, H. Nakajima // Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. (1990) - Vol. 42. - P. 97-131.

30. Jha S. K. Preparation of polyvinyl alcohol-polyacrylamide composite polymer membrane by y-irradiation for entrapment of urease / S. K. Jha, S. F. D Souza // Journal of Biochemical and Biophysical Methods. (2005) - Vol. 62. - №3.-P. 215-218.

31. Кабанов В.Я. Получение полимерных биоматериалов с использованием радиационно-химических методов / В.Я. Кабанов // Успехи химии. — (1998) -Т. 67.-№9.-С. 861-895.

32. Atia К. Preparation of glucose oxidase immobilized in different carriers using radiation polymerization / K. Atia, A. El-Batal // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. (2005) - Vol. 80. - № 7. - P. 805-811.

33. Schulz B. Influence of polymerization parameters and entrapment inpoly (hydroxy ethyl methacrylate) on activity and stability of GOD / B. Schulz, A. Riedel, P.U. Abel // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. (1999) -Vol. 7. -№ 1-4.-P. 85-91.

34. Кирстен M. П. Иммобилизация клеток и ферментов включением их в гель / М. П. Дж. Кирстен, М. П. Кафлэн // Глава из книги «Иммобилизованные клетки и ферменты». Методы. Под редакцией Дж. Вудворда. М.: Мир, 1988-С. 53-64.

35. Novick S.J. Protein-containing hydrophobic coatings and films / S.J. Novick, J.S. Dordick // Biomaterials. (2002) - Vol. 23. - № 2. - P. 441-448.

36. Veronese F. M. Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions / F. M. Veronese // Biomaterials. (2001) - Vol. 22. - № 5. - P.405-417.

37. Mohapatra S. C. Immobilization of a-chymotrypsin for use in batch and continuous reactions / S. C. Mohapatra, J. T. Hsu // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. (2000) - Vol. 75. - № 7. - P. 519-525.

38. Roy I. Smart biocatalysts: design and applications /1. Roy, S. Sharma, M.N. Gupta // Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology. (2003) — Vol. 86.-P. 251-310.

39. Taniguchi M. Properties of a reversible soluble-insoluble cellulase and its application to repeated hydrolysis of crystalline cellulose / M. Taniguchi, M. Ko-bayashi, M. Fujii // Biotechnology and Bioengineering. (1989) - Vol. 34. - № 8.- P.1092-1097.

40. Еремеев H.JI. Взаимосвязь степени гидратации поли-N-изопропилакриламидного геля и активности иммобилизованного в нём а-химотрипсина / H.JL Еремеев, Н.Ф. Казанская // Известия Академии наук. Серия химическая. (2001) - № 10. - С.1806-1810.

41. Гросберг А.Ю. Фазовые переходы в полимерных и биополимерных системах / А.Ю. Гросберг, А.Р. Хохлов // Успехи физических наук. (1986) -Т. 149. - Вып. 4. - С.723—726.

42. Лифшиц И.М. Объёмные взаимодействия в статистической физике полимерной макромолекулы / И.М. Лифшиц, А.Ю. Гросберг, А.Р. Хохлов // Успехи физических наук. (1979) - Т. 127. - Вып. 3. - С. 353 - 389.

43. Chen J-P. Immobilization of a-chymotiypsin to a temperature-responsive re-versibly soluble insoluble oligomer based on N-isopropylacrylamide / J-P. Chen // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. - (1998) — Vol. 73. - № 2. - P.137-143.

44. Валуев Л.И. Структура и функциональные свойства термочувствительных производных иммобилизованных белков / Л.И. Валуев, И.Л. Валуев, И.М. Шаназарова // Прикладная биохимия и микробиология. — (2006) Т. 42. — № 1. - с. 33-36.

45. Schmaljohann D. Thermo- and pH-responsive polymers in drug delivery / D. Schmaljohann// Advanced Drug Delivery. (2006) - Vol.58. - № 15. -РД655-1670.

46. Park T.G. Immobilization and characterization of p-galactosidase in thermally reversible hydrogel beads / T.G. Park, A.S. Hoffman // Journal of Biomedical Materials Research. (1990) - Vol. 24. - № 1. - P. 21-38.

47. Dong L. C. Thermally reversible hydrogels: III. Immobilization of enzymes for feedback reaction control / L. C. Dong, A. S. Hoffman // Journal of Controlled Release. (1986) - Vol. 4. - № 3. - P. 223-227.

48. Ding Z. Unusual properties of thermally sensitive oligomer—enzyme conjugates of poly(N-isopropylacrylamide)-trypsin / Z. Ding, G. Chen, A. S. Hoffman // Journal of Biomedical Materials Research. (1998) - Vol. 39. - № 3. - P.498-505.

49. Еремеев Н. Л. Температурное поведение равновесных констант ферментативных реакций при фазовом переходе в термочувствительной матрице / Н. Л. Еремеев, Л. В. Сиголаева, П. А. Симаков, Н. Ф. Казанская // Биохимия. (1995) - Том 60 - Вып. 8 - С. 1307-1317.

50. Jin W. Properties and applications of proteins encapsulated within sol-gel derived materials / W. Jin, J. D. Brennan // Analytica Chimica Acta. — (2002) — Vol. 461.-№1.-P. 1-36.

51. Soares С. M. F. Studies on immobilizd lipase in hydrophobic sol-gel / С. M. F. Soares, O. A. dos Santos, H. F. de Castro, F. F. de Moraes, G. M. Zanin // Applied Biochemistry and Biotechnology. (2004) - Vol. 113. - № 1-3. - P. 307319.

52. Ciriminna R. Recent uses of sol-gel doped catalysts in the fine chemicals and pharmaceutical industry / R. Ciriminna, M. Pagliaro // Organic Process Research & Development. (2006) - Vol. 10. - № 2. - P. 320-326.

53. Pierre A.C. The sol-gel encapsulation of enzymes / A.C. Pierre // Biocatalyst and Biotransformation. (2004) - Vol. 22. - № 3. - P. 145-170.

54. Avnir D. Enzymes and other proteins entrapped in sol-gel materials / D. Avnir, S. Braun, O. Lev, M. Ottolenghi // Chemisrty of Materials. (1994) - Vol. 6. -№ 10.-P. 1605-1614.

55. Gupta R. Entrapment of biomolecules in sol-gel matrix for applications in biosensors: problems and future prospects / R. Gupta, N.K. Chaundhury // Biosensors and Bioelectronics. (2007) - Vol. 22. - № 11. - p. 2387-2399.

56. Branyik T. Encapsulation of microbial cells into silica gel / T. Branyik, G. Kunkova // Journal of Sol-Gel Science and Technology. (1998) - Vol. 13. - № 1-3.-P. 283-287.

57. Fennouh S. Sol-gel entrapment of Escherichia coli. / S. Fennouh, S. Guyon, J. Livage, C. Roux // Journal of Sol-Gel Science and Technology. (2000) - Vol. 19. -№ 1-3.-P. 647-649.

58. Li B. New immobilization method for enzyme stabilization involving a mesoporous material and an organic/inorganic hybrid gel / B. Li, H. Takahashi // Biotechology Letters. (2000) - Vol. 22. - № 24. - P. 1953-1958.

59. Ferrer M. L. Denaturation and leaching study of horseradish peroxidase encapsulated in sol-gel matrices / M. L. Ferrer, F. del Monte, C.R. Mateo, J. Gomez, D. Levy // Journal of Sol-Gel Science and Technology. (2003) - Vol. 26. - № 1-3.-P. 1169-1172.

60. Besanger T.R. Screening of inhibitors using enzymes entrapped in sol—gel-derived materials / T.R. Besanger, Y. Chen, A.K. Deisingh, R. Hodgson, W. Jin, S. Mayer, M. A. Brook, J.D. Brennan // Analytical Chemistry. (2003) - Vol. 75.-№ 10.-P. 2382-2391.

61. Noureddini H. Characterization of sol-gel immobilized lipases / H. Noureddini, X.J. Gao // Journal of Sol-Gel Science and Technology. (2007) - Vol. 41. - № 1. —P. 31—41.

62. Reetz M.T. Efficient immobilization of lipases by entrapment in hydrophobic sol-gel materials / M.T. Reetz, A. Zonta, J. Simpelkamp // Biotechnology and Bioengineering. (1996) - Vol. 49. - № 5. - P. 527-534.

63. Ghanem A. Entrapment of Pseudomonas cepacia lipase with peracetylated p— cyclodextrin in sol-gel: application to the kinetic resolution of secondary alcohols / A. Ghanem, V. Schurig // Tetrahedron Asymmetry. (2003) - Vol. 14. -№ 17.-P. 2547-2555.

64. Tripathi V.S. Preparation of ormosil and its applications in the immobilizing biomolecules /V.S. Tripathi, V.B. Kandinalla, H. Ju // Sensors and Actuators B. -(2006)-Vol. 114.-№2.-P. 1071-1082.

65. Collinson M. M. Analytical applications of organically modified silicates / M. M. Collinson // Microchimica Acta. (1998) - Vol. 129. - № 3-4. - P. 149-165.

66. Jiirgen-Lohmann D.L. Immobilization of bovine catalase in sol-gels / D.L. Jur-gen-Lohmann, R.L. Legge // Enzyme and Microbial Technology. (2006) -Vol. 39. - № 4. - P. 626-633.

67. Yi Y. Optimization of tetramethoxysilane-derived sol gel entrapment protocol stabilizes highly active chlorophyllase / Y. Yi, R. Neufeld, S. Kermasha // Journal of Sol-Gel Science and Technology. (2006) - Vol. 38. - № 3. - P. 251259.

68. Kawakami K. Entrapment of lipase in silica glass by the sol-gel method and its esterification activity in organic media / K. Kawakami, S. Yoshida // Biotechnology Techniques. (1994) - Vol. 8. - № 6. - P. 441-446.

69. Carter C.B., Norton M.G. Ceramic Materials/Science and Engineering. Springer 2007-716 P.

70. Gill I. Bioencapsulation within synthetic polymers (part 1): sol-gel encapsulated biologicals /1. Gill, A. Ballesteros // Trends in Biotechnology. (2000) -Vol. 18. - № 7. - P. 282-296.

71. Siouffi A.M. Silica gel-based monoliths prepared by the sol-gel method: facts and figures / A.M. Siouffi // Journal of Chromatography A. (2003) - Vol. 1000. -№ 1-2. - P. 801-818.

72. Brook M. A. Sugar-modified silanes: precursors for silica monoliths / M. A. Brook, Y. Chen, K. Guo, Z. Zhang, J. Brennan // Journal of Material Chemistry. (2004) - Vol. 14. - № 9. - P. 1469-1479.

73. Wu X. J. An optical glucose biosensor based on entrapped-glucose oxidase in silicate xerogel hybridised with hydroxyethyl carboxymethyl cellulose / X. J. Wu, M. M.F. Choi // Analytica Chimica Acta. (2004) - Vol. 514. - № 2. -P.219-226.

74. Meyer M. Novel ringing silica gels that do not shrink / M. Meyer, A. Fischer, H. Hoffinann // The Journal of Physical Chemistry B. (2002) - Vol. 106. - № 7-P. 1528-1533.

75. Shchipunov Yu. A. Sol-gel-derived biomaterials of silica and carrageenans / Yu. A. Shchipunov // Journal of Colloid and Interface Science. (2003) - Vol. 268.-№ l.-P. 68-76.

76. Chen J-P. Sol-gel powders and supported sol-gel polymers for immobilization of lipase in ester synthesis / J-P. Chen, W-S. Lin // Enzyme and Microbial Technology. (2003) - Vol. 32. - № 7. - P. 801-811.

77. Paljevac M. Hydrolysis of carboxymethyl cellulose catalyzed by cellulase immobilized on silica gels at low and high pressures / M. Paljevac, M. Primozic,

78. M. Habulin, Z. Novak, Z. Knez // The Journal of Supercritical Fluids. (2007) -Vol. 43.-№ 1. - P.74-80.

79. Veum L. The first encapsulation of hydroxynitrile lyase from Hevea brasil-iensis in a sol-gel matrix / L. Veum, U. Hanefeld, A. Pierre // Tetrahedron. -(2004) Vol. 60. - № 46. - P. 10419-10425.

80. Bhatia R.B. Aqueous sol—gel process for protein encapsulation / R.B. Bhatia, C.J. Brinker, A.K. Gupta, A.K. Singh // Chemisrty of Materials. (2000) - Vol. 12.-№8.-P. 2434-2441.

81. Lin Т.—Y. Entrapment of horseradish peroxidase in sugar—modified silica monoliths: toward the development of a biocatalytic sensor / T.-Y. Lin, C.-H. Wu, J.D. Brennan // Biosensors and Bioelectronics. (2007) - Vol. 22. - № 9-10.-P. 1861-1867.

82. Gill I. Encapsulation of biologicals within silicate, siloxane, and hybrid sol-gel polymers: an efficient and generic approach /1. Gill, A. Ballesteros // Journal of American Chemical Society. (1998) -Vol. 120.-№34.-P. 8587-8598.

83. Shchipunov Yu. A. Gelling of otherwise nongelable polysaccharides / Yu. A. Shchipunov, Yu. V. Burtseva, A. V. Krekoten, I. V. Postnova // Journal of Colloid and Interface Science. (2005) - Vol. 287. - № 2. - P. 373-378.

84. Ferrer M. L. A novel and simple alcohol free sol-gel route for encapsulation of labile protein / M. L. Ferrer, F. del Monte, D. Levy // Chemisrty of Materials. - (2002) - Vol. 14. - № 9. - P. 3619-3621.

85. Karout A. Immobilization of a lipoxygenase in silica gels for application in aqueous media / A. Karout, C. Chopard, A. C. Pierre // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. (2007) - Vol. 44. - № 3-4. - P. 117-127.

86. Reetz M. T. Characterization of hydrophobic sol-gel materials containing entrapped lipases / M. T. Reetz, A. Zonta, J. Simelkamp, A. Rufinska, B. Tesche // Journal of Sol-Gel Science and Technology. (1996) - Vol. 7. - №. 1-2. - P. 35-43.

87. Reetz M. T. Second generation sol-gel encapsulated lipases: robust heterogeneous biocatalysts / M. T. Reetz, P. Tielmann, W. Wiesenhofer, W. Konen, A. Zonta // Advanced Synthesis & Catalysis. (2003) - Vol. 345. - P.717-728.

88. Keeling-Tucker T. Fluorescent probes as reporters on the local structure and dynamics in sol—gel-derived nanocomposite materials / T. Keeling-Tucker, J. D. Brennan // Chemistry of Materials. (2001) - Vol. 13. - № 10. - P. 3331-3350.

89. Besanger T. R. Entrapment of membrane proteins in sol-gel derived silica / T. R. Besanger, J. D. Brennan // Journal of Sol-Gel Science and Technology. -(2006) Vol. 40. - № 2-3. - P. 209-225.

90. Ichimura K. Method for enzyme immobilization. // US. Pat. N 4,269,941. 1981.

91. Shido Y. Network formation and swelling behavior of photosensitive poly(vinyl alcohol) gels prepared by photogenerated crosslinking / Y. Shido, N.

92. Katagiri, Т. Ebisuno, M. Hasegawa, M. Mitsuda // Die Angewandte Makro-moleculare Chemie. (1996) - Vol. 240. - № 1. - P. 231-239.

93. Vorlop K-D. Entrapment of microbial cells whitin polyurethane hydrogel beads with the advantage of low toxicity / K-D. Vorlop, A. Muscat, J. Beyers-dorf// Biotechnology Technique. (1992) - Vol. 6. - № 6. - P. 483^188.

94. Dave R. Estirification in organic solvent by lipase immobilized in polymer of PVA-alginate-boric acid / R. Dave, D. Madamwar // Process Biochemistry. -(2006) Vol. 41. - № 4. - P.951-955.

95. Cheng S. Immobilization of permeabilized whole cell penicillin G acylase from Alcaligenes faecalis using pore matrix crosslinked with glutaraldehyde / S. Cheng, D. Wei, Q. Song // Biotechnology Letters. (2006) - Vol. 28. - № 14. -P.l 129-1133.

96. Martinez-Madrid C. Degradation of limonin by entrapped Rhodococcus fas-cians cells / C. Martinez-Madrid, A. Manjon, J.L. Iborra // Biotechnology Letters. (1989) - Vol. 2. - № 9. - P. 653-658.

97. Химическая Энциклопедия в 5-ти томах. М.: «Большая Российская Энциклопедия» 1998.

98. Colby J. Immobilization of Rhodococcus AJ270 and use entrapped biocatalyst for production of acrylic acid / J. Colby, D. Snell, G. W. Black // Chemical Monthly. (2000) - Vol. 131. - № 6. - P. 655-666.

99. Ichiro C., Tetsuya Т., Isao T. Immobilized catalytically active substance and method of preparing the same. // US Patent No. 4138292 -1979.

100. Wijffels // Biotechnology and Bioengineering. (1997) - Vol. 56. - № 5. - P. 517-529.

101. Belyaeva E. Immobilization of a-chymotrypsin in к-carrageenan beads prepared with the static mixer / E. Belyaeva, D. D. Valle, D. Poncelet // Enzyme and Microbial Technology. (2004) - Vol. 34. - № 2. - P. 108-113.

102. Prud-Homme R. K. Enzyme immobilization by imbibing an enzyme solution into dehydrated hydrocolloid gel beads / R. K. Prud-Homme, C. Cukras, H. Pfeffer // US patent No. 6268191 2001.

103. Hossain K. S. Sol-gel transition behavior of pure i-carrageenan in both salt-free and added salt states / K. S. Hossain, K. Miyanaga, H. Maeda, N. Nemoto // Biomacromolecules. (2001) - Vol. 2. - № 2. - P. 442-449.

104. Mammarella E. J. Study of the deactivation of (3-galactosidase entrapped in alginate-carrageenan gels / E. J. Mammarella, A. C. Rubiolo // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. (2005) - Vol. 34. - № 1-6. - P.7-13.

105. Sahin F. A novel matrix for immobilization of acetylcholinesterase / F. Sahin, G. Demirel, H. Tumturk // International Journal of Biological Macromolecules. -(2005) Vol. 37 - № 3 - P. 148-153.

106. Chi M.-C. Characterization of Bacilus kaustophilus leucine aminopeptidase immobilized in Ca-alginate/K-carrageenan beads /M.-C. Chi, R-C. Lyu, L—L.1.n, H.-B. Huang // Biochemical Engineering Journal. (2008) - Vol. 39. - №2.-P. 376-382.

107. Fadnavis N. W. Gelatin blends with alginate: gels for lipase immobilization and purification / N. W. Fadnavis, W. Sheelu, В. M. Kumar, M.U. Bhalero, A. A. Deshpande // Biotechnology Progress. (2003) - Vol. 19. - № 2. - P. 557564.

108. Kara F. Immobilization of urease by using chitosan-alginate and poly(acrylamyde-co-acrylic acid)/K-carrageenan support / F. Kara, G. Demirel, H. Tumtiirk // Bioprocess and Biosystems Engineering. (2006) - Vol. 29. - №3. — P.207—211.

109. Богдановская B.A. Влияние способа иммобилизации на активность лак-казы / В.А. Богдановская, М.Р. Тарасевич, Ф. Шеллер, Д. Пфейфер, У. Вол-ленберг // Электрохимия. (1987) — Т. 23. - Вып. 5. - С. 666-668.

110. Li N. Reagentless biosensor for phenolic compounds based on tyrosinase entrapped within gelatine film /N. Li, M—H. Xue, H. Yao, J—J. Zhu // Analytical and Bioanalytical Chemistry (2005) - Vol. 383. - № 7-8. - P.l 127-1132.

111. Kennedy J. F. Surface immobilization and entrapping of enzymes on glu-taraldehyde crosslinked gelatin particles / J. F. Kennedy, B. Kalogerakis, J. M.S. Cabral // Enzyme and Microbial Technology. (1984) - Vol. 6. - № 3. - P. 127-131.

112. Bodalo A. A comparison of different methods of (3-galactosidase immobilization. A. Bodalo, E. Gomez, J.L. Gomez, J. Bastida, M.F. Maximo, F. Diaz // Process Biochemistry. (1991) - Vol. 26. - № 6. - P. 349-353.

113. Лозинский В.И. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения / В.И. Лозинский // Успехи химии. (2002) - Том 71 - № 6 - С. 559-585.

114. Лозинский В.И. Криотропное гелеобразование растворов поливинилового спирта / В.И. Лозинский // Успехи химии. (1998) - Т. 67. - № 7. - С. 641-655.

115. Wong F-L. Comparative stady of poly(vinyl alcohol)-based support materials for the immobilization of glucose oxidase / F-L. Wong, A. Abdul-Aziz // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. (2008) - Vol. 83. - № 1. - P. 41-46.

116. Kuo С. К. Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: Part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties / С. K. Kuo, P. X. Ma // Biomaterials. (2001) - Vol. 22. - № 6. - P.511-521.

117. Betigeri S. S. Immobilization of lipase using hydrophilic polymers in the form of hydrogel beads / S. S. Betigeri, S. H. Neau // Biomaterials. — (2002) -Vol. 23. № 17. - P. 3627-3636.

118. Simsek-Ege F. A. Matrix molecular weight cut-off for encapsulation of carbonic anhydrase in polyelectrolyte beads / F. A. Simsek-Ege, G. M. Bond, J. Stringer //Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. (2002) - Vol. 13. -№ 11.-P. 1175-1187.

119. Won K. Optimization of lipase entrapment in Ca-alginate gel beads / K. Won, S. Kim, K-J. Kim, H.W. Park, S.-J. Moon // Process Biochemistry. -(2005) Vol. 40. - № 6. - P. 2149-2154.

120. Matto M. Entrapment of porous stable concovalin A-peroxidase complex into hybrid calcium alginate-pectin gel / M. Matto, Q. Husain // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. (2006) - Vol. 81. - № 7. - P. 1316-1323.

121. Magalhaes D. В. Immobilization of p-glucosidase aggregates in calcium alginate / D. B. Magalhaes, M. H. M. da Rocha-Leao // Biomass and Bioenergy. -(1991)-Vol. l.-№4.-P. 213-216.

122. Rinaudo M. Chitin and chitosan: properties and application / M. Rinaudo // Progress in Polymer Science. (2006) - Vol. 31 - № 7 - P. 603-632.

123. Краюхина M.A. Полиэлектролитные комплексы хитозана: формирование, свойства и применение / М.А. Краюхина, Н.А. Самойлова, И. А. Ям-сков // Успехи химии. (2008) - Т. 77. - №. 9. - С. 884-869.

124. Mansfeld J. Immobilization of cells in polyelectrolyte complex / J. Mansfeld, H. Dautzenberg // Methods in Biotechnology, Vol. 1. Immobilization of Enzymes and Cells, Edited by Bicker staff G. F., Humana Press Inc Totowa, NJ 1997 P. 309-317.

125. Dimitriu S. Enzyme immobilization using chitosan-xanthan complex / S. Dimitriu, P. Vidal, E. Chornet // Methods in Biotechnology, Vol. 1. Immobilization of Enzymes and Cells, Edited by Bickerstaff G. F., Humana Press Inc Totowa, NJ 1997- P. 229-236.

126. Wong S. S. Chemical crosslinking and the stabilization of proteins and enzymes / S. S. Wong, L-J. C. Wong // Enzyme and Microbial Technology. -(1992) Vol. 14. - № 11. - P. 866 - 874.

127. Martinek K. Stabilization of enzymes by intramolecular cross-linking using bifunctional reagents / K. Martinek, V. P. Torchilin // Methods in Enzymology. -(1988)-Vol. 173.-P. 615-626.

128. Wong S. S. Chemistry of protein conjugation and cross-linking. 1991 CRC Press, Boca Raton, Florida USA 340 P.

129. Mateo C. A new mild cross-linking enzyme aggregates / C. Mateo, J. M. Palomo, L. M. van Langen, F. van Rantwijk, R. A. Sheldon // Biotechnology and Bioengineering. (2004) - Vol. 86. - № 3. - P. 273-276.

130. Kazan D. Stabilization of Escherichia coli penicillin G acylase against thermal inactivation by cross-linking with dextran dialdehyde polymers / D. Kazan, H. Ertan, A. Eraslan // Applied Microbiology and Biotechnology. (1997) -Vol. 48,-№2. P.191-197.

131. Cao L. Cross-linked enzyme aggregates: a simple and effective method for the immobilization of penicillin acylase / L. Cao, L.M. van Langen, F. van Rantwijk, R.A. Sheldon // Organic Letters. (2000) - Vol. 2. - № 10. - P. 13611364.

132. Lopez-Serrano P. Cross-linked enzyme aggregates with enhanced activity: application to lipases / P. Lopez-Serrano, L. Cao, F. van Rantwijk, R.A. Sheldon // Biotechnology Letters. (2002) - Vol. 24. - №. 16. - P. 1379 - 1383.

133. Dalai S. Preparation and characterization of combi-CLEAs catalyzing multiple non-cascade reactions / S. Dalai, M. Kapoor, M. N. Gupta // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. (2007) - Vol. 44. - № 3-4. - P. 128 - 132.

134. Gaur R. Galacto-oligosaccharide synthesis by immobilized Aspergillus oryzae |3-galactosidase / R. Gaur, H. Pant, R. Jain, S. K. Khare // Food Chemistry. (2006) - Vol. 97. - № 3. - P. 426 - 430.

135. Tyagi R. Amorphous enzyme aggregates: stability toward heat and aqueous cosolvent mixtures / Tyagi R., Batra R., M. N. Gupta // Enzyme and Microbial Technology. (1999) - Vol. 24. - № 5-6. - P. 348- 354.

136. Broun G. Chemically aggregated enzymes / G. Broun // Methods in Enzy-mology. (1976) - Vol. 44. - P. 263-280.

137. Roy I. Smart biocatalysts: design and applications /1. Roy, Sh. Sharma, M. N. Gupta // Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. (2004) - Vol. 86. -P.159-189.

138. Quicoho F.A. Intermolecular cross-linking of a protein in the crystalline state: carboxypeptidase-a / F.A. Quicoho, F. M. Richards // Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. (1964) - Vol. 52 - № 3 - P. 833-839.

139. Mateo C. Stabilisation of oxygen-labile nitrilases via co-aggregation with poly(ethyleneimine) / C. Mateo, B. Fernandes, F. van Rantwijk, A. Stolz, R. A.

140. Sheldon // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. (2006) - Vol. 38. -№3-6.-P. 154-157.

141. Bio-inorganic hybryd nanomaterials. Strategies, synthesis, characterizaion and application. Edited by Ruiz-Hitzky E., Ariga K., Lvov Yu. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA, 2008 - P. 521.

142. Bandyopadhyay A. Poly(vinyl alcohol)/silica hybryd nanocomposites by sol-gel technique: synthesis and properties / A. Bandyopadhyay, M. de Sarkar, A. K. Bhomwick // Journal of Material Sciense. (2005) - Vol. 40. - № 19. - P. 5233-5241.

143. Nadarajah K. Production of chitosan by fungi / K. Nadarajah, J. Kader, M. Mazmira, D.C. Paul // Pakistan Journal of Biological Sciences. (2001) — Vol. 4. -№ 3. - P. 263-265.

144. Goksungr Y. Optimization of the production of chitosan from beet molasses by response surface / Y. Goksungr // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. (2004) - Vol. 79. - № 9. - P.974-981.

145. Trasiv J. The specificity of porcine trypsin / J. Trasiv // Biochemical and Biophysical Research Communication (1967) - Vol. 29. - № 3. - P. 294-297.

146. Wortington Enzyme Manual. New Jersey: Freehold. - 1972 - P. 125-127.

147. Лозинский В.И., Зубов А.Л. Устройство для формирования сферических гранул из материала на основе водных систем. // Пат. РФ № 2036095 (1992); Б.И. № 15(1995).

148. Дёрфель К. Статистика в аналитической химии. М — Мир 1994 — С. 268.

149. Лозинский В.И. Приенение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. IV. Обзор литературы / В.И. Лозинский, А.В. Вакула, А.Л. Зубов // Биотехнология. (1992) - № 4. - С. 5-14.

150. Lozinsky V.I. Polymeric cryogels as promising materials of biotechnological interest / V.I. Lozinsky, I.Y. Galaev, F.M. Plieva, I.N. Savina, H. Jungvid, B. Mattiasson // Trends in Biotechnol. (2003) - Vol. 21. - № Ю. - P. 445-451.

151. Роговина Л.З. Природа студнеобразования, структура и свойства студней полимеров / Л.З. Роговина, Г.Л. Слонимский // Успехи химии. (1974) - Т. 43. - № 6. - С. 1102-1135.

152. Ross-Murphy S.B. Fundamentals of hydrogels and gelation / S.B. Ross-Murphy, H. McEvoy // British Polymer Journal. (1986) - Vol. 18. - № 1. - P. 2-7.

153. Eldridge J.E. Studies of the cross-linking process in gelatin gels. Ш. Dependence of melting point on concentration and molecular weight / J.E. Eldridge, J.D. Ferry // The Journal of Physical Chemistry. (1954) - Vol. 58. - № 11. - P. 992-995.

154. Малкин А.Я. // Энциклопедия полимеров. M.: Советская энциклопедия, 1972. Т. 1. С. 572.

155. Лозинский В.И. Применение криогелей поливинилового спрта в биотехнологии. V. Сверхмакропористые носители для иммобилизации молекул / В.И. Лозинский, Ф.М. Плиева, А.Л. Зубов // Биотехнология. — (1995) — № 12. С. 32-37.

156. Cao L. Immobilised enzymes: carrier-bound or carrier-free? / L. Cao, L. van Langen, R.A. Sheldon // Current Opinion in Biotechnology. (2003) - Vol.11. -№ 14.-P. 387-394.

157. Gaur R. Galacto-oligosaccharide synthesis by immobilized Aspergillus oryzae P-galactosidase / R. Gaur, H. Pant, R. Jain, S.K. Khare // Food Chemistry. (2006) - Vol. 97 - P. 426-430.

158. Sheldon R.A. Cross-linked enzyme aggregates (CLEA): stable and recyclable biocatalysts / R.A. Sheldon // Biochemical Society Transactions. (2007) - Vol. 35 -№ 6 — P. 1583-1587.